CN108329392A

CN108329392A - 特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体

Info

Publication number: CN108329392A
Application number: CN201711387964.6A
Authority: CN
Inventors: 丁天兵; 王媛; 高欢
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明公开了特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体，属于生物医学技术领域。所述单克隆抗体能够与天然鼠脑和原核细胞表达的Doppel结合，特异性识别Doppel蛋白的82～90位氨基酸残基，该82～90位氨基酸残基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明克隆了1A9和1D6两株单克隆抗体的重链可变区基因，获得了重链可变区基因序列和氨基酸序列，确认了这些基因序列与蛋白序列的唯一性。鉴于识别的表位序列NYWQFPDGI在小鼠、大鼠和人Doppel蛋白完全相同，显示这2株单克隆抗体在研究Doppel蛋白功能方面有重要的应用价值。

Description

特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体重链可变区及其基因。

背景技术

小鼠Doppel蛋白发现于1999年，因为其基因位于小鼠正常朊蛋白基因(Prnp)下游16kb处、且结构与功能和小鼠、人朊蛋白(Prion)类似，因此从原始描述Prnpdownstreamprion-like protein而得名Doppel(Doppel在德语中意为“双的，双重的”，缩写为Dpl，中文译为“叠朊蛋白”)。

小鼠Doppel蛋白基因(Prnd)的序列相对保守，和鱼类、四足动物、牛、羊以及人类的基因同源性较大，其功能涉及神经元发育、生殖等重要生理作用，但具体、详尽的研究报告不多。鉴于目前尚无针对小鼠Doppel蛋白的特异性抗体，因此制备相关抗体对于深入开展小鼠和人Doppel功能研究意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供特异性识别小鼠(Mus musculus)Doppel蛋白的单克隆抗体，并获得该单克隆抗体重链可变区基因序列以及该基因编码的氨基酸序列。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够与天然鼠脑和原核细胞表达的Doppel结合，特异性识别Doppel蛋白的82～90位氨基酸残基，该82～90位氨基酸残基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述单克隆抗体包括两株，分别为抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9和抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6，抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9和抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6的重链均为IgG1亚类，轻链均为κ型。

优选地，抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9和抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6的重链可变区DNA序列同源性为99％，氨基酸序列相同，相对亲和力不同。

进一步优选地，所述抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9的相对亲和力为1×10⁵；所述抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6的相对亲和力为1×10⁴。

进一步优选地，所述抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9的重链可变区基因序列的3个互补决定区(CDR)分别为：

CDR1：GGTTATACCTTCACAGACTATGCA

CDR2：ATAAACACTGCGACTGGTGAGCCA

CDR3：GCTAGTGATGGTCGCTACTGGTACTTCGGTGTC；

对应的氨基酸序列分别为：

CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr–Ala

CDR2：Ile-Asn-Thr-Ala-Thr-Gly-Glu-Pro

CDR3：Ala-Ser-Asp-Gly-Arg-Tyr-Trp-Tyr-Phe-Gly-Val。

进一步优选地，所述抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6的重链可变区基因序列的3个互补决定区(CDR)分别为：

CDR1：GGTTATACCTTCACAGACTATGCA

CDR2：ATAAACACTGCGACTGGTGAGCCA

CDR3：GCTAGTGATGGTCGCTACTGGTACTTCGGTGTC；

对应的氨基酸序列分别为：

CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Ala

CDR2：Ile-Asn-Thr-Ala-Thr-Gly-Glu-Pro

CDR3：Ala-Ser-Asp-Gly-Arg-Tyr-Trp-Tyr-Phe-Gly-Val。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.通过连接载体，有效提升了小鼠对自身蛋白Doppel的反应原性。

2.采用免疫原(Doppel-载体蛋白)点膜(硝酸纤维素膜)然后皮下包埋的技术路径，在有效提升免疫效果的同时缩短了免疫时间，加速了单克隆抗体杂交瘤的制备过程。

3.经ELISA、Western blotting等验证，1A9和1D6均可与天然鼠脑和原核细胞表达的Doppel结合，相对亲和力分别达到1×10⁵和1×10⁴，并且识别相同的表位(82～90位氨基酸残基)，系统地确认了其识别小鼠Doppel蛋白的特异性。

4.获得了1A9和1D6的重链可变区基因及其氨基酸序列，序列分析证实了该两种单克隆抗体序列的唯一性。

5.鉴于1A9和1D6均识别小鼠Doppel蛋白的82～90位氨基酸残基，而此段蛋白质序列与人和大鼠的序列完全一致，因此，这两种单克隆抗体也可用于人和大鼠Doppel蛋白研究中，大大拓展了其应用范围。

附图说明

图1为本发明1A9和1D6识别MoDpl 27-154蛋白的鉴定结果(Western blotting)。

图2为1A9检测鼠脑天然Doppel蛋白的结果(Western blotting)。

图3为1A9单克隆抗体重链可变区基因序列IgBLAST的分析结果。

图4为1D6单克隆抗体重链可变区基因序列IgBLAST的分析结果。

图5为本发明1A9和1D6重链可变区基因同源性的分析结果。

具体实施方式

本发明公开了针对小鼠Doppel蛋白的鼠源性单克隆抗体方法：用原核细胞表达的小鼠Doppel蛋白偶联载体蛋白制成免疫原，经点膜和皮下包埋方法免疫后，筛选出2株抗小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系。该杂交瘤细胞系具有稳定分泌抗体的能力，制备腹水并纯化后的抗体能够特异性识别小鼠Doppel蛋白，并最终获得了其重链可变区的基因序列，确认了其相应蛋白序列的唯一性和CDR序列，为深入研究小鼠、人以及大鼠Doppel蛋白的功能提供了强有力的研究工具。

以下结合具体单克隆抗体的制备方法、抗体活性检测、特性鉴定以及单克隆抗体重链可变区基因序列唯一性的确定对本发明做详细说明。此说明是对本发明的解释而不是限定。

1、小鼠Doppel蛋白的原核细胞表达、纯化和再折叠

1.1小鼠Doppel蛋白的表达

小鼠Doppel蛋白27-154的DNA片段(MoDpl 27-154)经PCR扩增(N-末端引物序列59-GGGGCATATGTCTAGGGGCATAAAGCACAGG-39，C-末端引物序列59-GGGGGATCCTATCACCTTTCCAGCCAGAAATCGCA-39)，亚克隆入pRBI-PDI-T7质粒，命名为pMoDpl27-154质粒。为了减少表达蛋白在细胞质中的降解，在MoDpl 27-154质粒的N-末端引入一个丝氨酸(Ser)残基。这样，重组MoDpl 27-154质粒包含130个氨基酸残基(分子量约为15kDa)，经DNA测序证实序列无误后，最后导入大肠埃希菌(BL21)进行表达。1升LB培养基(含氨苄青霉素100mg/ml)37℃培养，生长至A₆₀₀为0.8-1.0时加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，终浓度为1mM)诱导表达，持续16小时。

1.2小鼠Doppel蛋白的纯化和再折叠

上述细菌经3000g离心10分钟，重悬于20ml悬浮缓冲液【含50mMTris-HCl(pH8.0)，1mM MgCl₂，0.4mg/ml DNA酶I，0.4mg/ml RNA酶A，1mg/ml溶菌酶，1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)】，然后分别在37℃和室温下震动2小时和1小时。细胞溶解物经4℃、39000g离心1小时，不可溶的包涵体沉淀用洗涤缓冲液【20mM Tris-HCl(pH8.0)，23％蔗糖(w/v)，0.5％Triton X-100(v/v)，1mM EDTA，1片蛋白酶混合抑制剂】洗两次，可溶的部分溶于10ml溶解缓冲液中【含10mM Tris-HCl(pH 8.0)，50mM DTT，1mM EDTA,8M尿素，1片蛋白酶混合抑制剂(Roche Molecular Biochemicals)】。22℃、39000g离心1小时，3ml上清液流经20ml SP-Sepharose层析柱(Amersham Pharmacia Biotech)，平衡液含10mM MOPS-NaOH(pH 7.0)、5mM DTT、1mM EDTA和8M尿素，恒流洗脱速率为1ml/min，按1.5ml/管分部收集(BioLogic HR层析系统，Bio-Rad)，表达产物MoDpl 27-154经线性0-0.6M NaCl梯度洗脱。

含MoDpl 27-154的分部稀释于50mM Tris-HCl(pH 8.7)和8M尿素溶液中(蛋白终浓度为0.05mg/ml)，加入CuSO₄(终浓度为1mM)，室温搅拌2小时，最后加入1mM EDTA终止氧化反应。上述溶液用双蒸水透析，再经3-kDa分子量浓缩柱浓缩(Amicon)，调整蛋白质浓度至1mg/ml，-20℃保存。

2、兔抗小鼠Doppel蛋白血清的制备和鉴定

2.1兔抗小鼠Doppel蛋白血清的制备

取上述方法制备好的MoDpl 27-154蛋白200μg，点在硝酸纤维素(NC)薄膜上，包埋在兔(雌性，1岁龄，2.34kg)颈部皮下进行初次免疫。强化免疫则采用耳静脉注射，剂量同初次免疫，前后共8次。

2.2兔抗小鼠Doppel蛋白血清的鉴定

采用静脉插管法采集兔血，然后经800转/分离心去除血细胞，上清再经辛酸-饱和硫酸铵沉淀后透析，获得纯化的IgG。兔抗Doppel多克隆抗体的活性鉴定采用Westernblotting：MoDpl 27-154经SDS-PAGE后转印至PVDF膜上，加兔抗Doppel多克隆抗体(一抗)，最后加HRP标记的羊抗兔IgG(二抗)，显色。结果显示，在15kDa和30kDa处有两条反应带，表明MoDpl 27-154可自发地形成二聚体，而且均可被兔抗Doppel多抗识别(参见图1左)。

3、免疫原的制备

MoDpl 27-154与载体蛋白经化学方法偶联后作为免疫原使用，用于后续的小鼠免疫。

载体蛋白使用KLH(Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin，Pierce，Product Number 77653)，按照Immunogen EDC Kit(Pierce，Product Number77622)使用说明书执行与MoDpl 27-154的偶联反应。即：2mg KLH溶于200μl水中，2mgMoDpl 27-154溶于500μl偶联缓冲液，再将两种溶液混合均匀。1瓶EDC反应物加1ml去离子水溶解，吸取30μl加到上述混合液中进行偶联，室温下反应2小时，在PBS中4℃透析过夜，然后用BCA法进行蛋白质浓度测定，稀释至1mg/ml，-20℃保存。

4、小鼠抗小鼠Doppel单克隆抗体的制备和鉴定

4.1小鼠抗小鼠Doppel单克隆抗体的制备

将30μg免疫原滴在NC膜上，自然干燥后将NC膜包埋于小鼠左侧腹股沟皮下进行初次免疫，两周后则包埋于右侧腹股沟皮下。后续的强化免疫均行腹腔注射等量免疫原。

无菌摘取小鼠脾脏，经研磨、过滤、洗涤和离心后与预先培养好的Sp2/0细胞常规融合，HAT筛选杂交瘤细胞，间接ELISA筛选分泌抗Doppel的杂交瘤细胞，采用有限稀释克隆化，得到杂交瘤克隆。

4.2抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体的筛选

采用间接ELISA。详细操作步骤：①包被：MoDpl 27-154直接加至包被缓冲液中，4℃过夜，终浓度为20μg/ml。②标本：细胞培养上清或纯化后的小鼠腹水。③显色：兔抗Doppel多克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，OPD显色，检测490nm处的光吸收值A，检测孔A₄₉₀/空白孔A₄₉₀≥2.0被判为阳性。

4.3两株抗小鼠Doppel单克隆抗体杂交瘤细胞系的鉴定

经过有限稀释克隆化得到了1A9和1D6两株能够稳定分泌抗Doppel抗体的杂交瘤细胞系，其分泌的抗体与MoDpl 27-154的结合活性为蛋白质印迹试验(Western blotting)所证实(见图1中右)。

4.4两株抗小鼠Doppel单克隆抗体免疫球蛋白特性的鉴定

①免疫球蛋白特性鉴定：采用ELISA方法，所用试剂盒为IsoStrip in MouseMonoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche，Basel，Switzerland)。结果显示，1A9和1D6重链均为IgG1亚类，轻链均为κ型。

②单克隆抗体相对亲和力的测定：采用间接ELISA方法。试验步骤为：MoDpl 27-154包被，加10倍稀释的纯化腹水，再先后加入兔抗Doppel多克隆抗体和HRP标记羊抗兔IgG，OPD显色，检测光吸收值A₄₉₀，阳性检测孔的最高稀释度即为相对亲和力。结果显示，1A9和1D6的相对亲和力分别为1×10⁵和1×10⁴。

4.5两株抗小鼠Doppel单克隆抗体识别表位的确定

采用肽段扫描技术(Pepscan System BV,Lelystad,Netherlands)。结果显示，1A9和1D6识别的靶肽段均为82-90位氨基酸残基，具体序列为NYWQFPDGI。此段序列对应人Doppel蛋白81～89位氨基酸残基，提示1A9和1D6也可用于人Doppel蛋白的相关研究。

4.6胚胎和成年鼠脑组织中天然Doppel蛋白的测定

采用蛋白质印迹试验(Western blotting)检查抗小鼠Doppel单克隆抗体是否具有识别鼠脑组织中天然Doppel蛋白的能力。具体操作方法如下：

①胚胎和成年鼠脑组织中Doppel蛋白的提取：常规处死孕鼠和成年BALB/c小鼠，乙醇浸泡消毒，手术取孕鼠胚胎和成年鼠脑组织。0.1g脑组织加1.0ml PBS【pH7.4，含10％10mM苯甲基磺酰氟(PMSF)】于组织匀浆器中，匀浆后行1000g 4℃离心5分钟，沉淀重悬于0.2ml细胞裂解液【20mM Tris-HCl(pH8.0)，150mMNaCl，0.5％(v/v)Triton X-100，0.5％(w/v)脱氧胆酸钠，10％(v/v)PMSF】，冰水中震荡10分钟，15000g 4℃离心10分钟，弃沉淀，上清中的蛋白质浓度经BCA测定后-20℃冻存备用。

②蛋白质印迹试验(Western blotting)：将上述制备的鼠脑组织标本定量稀释后行15％SDS-PAGE(上样量为20μg)，转至PVDF膜，加1A9(1:1000)，再加HRP标记的羊抗鼠IgG，显色。对照为小鼠Prion蛋白及其特异性单克隆抗体SAF-32(Southern Biotech，Birmingham,USA)。结果显示，1A9特异性结合胚胎和成年小鼠脑中的Doppel蛋白，并不识别与Doppel蛋白构象相似的Prion蛋白，结果参见图2。图中，Embr15、Embr20：胚胎第15天、第20天；Day2～Day15：出生后第2～第15天；2months：出生后2个月；SAF-32：针对小鼠Prion的特异性单克隆抗体(购自Southern Biotech，Birmingham,USA)；1A9：针对小鼠Doppel的特异性单克隆抗体。

5、1A9和1D6单克隆抗体重链可变区基因的克隆

5.1杂交瘤细胞的培养

按常规方法复苏杂交瘤细胞，加10％小牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5％CO₂孵箱培养。

5.2总RNA提取和cDNA链合成

使用TRIZOL试剂【TaKaRa Biomedical Technology(Beijing)Co.,Ltd.,China】，按产品说明书提取细胞总RNA。cDNA合成试剂亦购自TaKaRa公司，按产品说明书进行反转录合成cDNA。

5.3PCR扩增单克隆抗体重链可变区基因(V_H)

PCR扩增试剂盒购自TaKaRa公司。

合成的上游引物(针对FR1区)序列为：

5'-GCCTCGAGATGCAGGTGCAGTTGATGGAGTCAG-3'；

合成的下游引物(针对FR4区)序列为：

5'-GTGAATTCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3'。

以反转录合成的cDNA为模板进行PCR。反应总体积50μl，反应条件为：95℃5分钟，95℃30秒；57℃45秒；72℃45秒；循环34次，72℃10分钟。

5.4PCR扩增产物的克隆和筛选

PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒(Axgen,NewYork,USA)回收所需片段，用DNA连接试剂盒(TaKaRa)将回收片段按说明书插入pMD18-T载体(TaKaRa)，连接产物转化DH5α(TaKaRa)，用EcoRI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)筛选重组的阳性克隆。用双脱氧核酸末端终止法测序。

6、1A9和1D6单克隆抗体重链可变区基因的分析

使用在线软件IgBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析序列的特性。

结果显示，1A9单克隆抗体具有4个框架区(FR1-FR4)，同时包含V、D和J等基因区，符合小鼠免疫球蛋白重链基因的特征。重链可变区基因中含有3个特征性的互补决定区(CDR)，并与小鼠免疫球蛋白重链基因IGHV9-2-1*01重叠部分的同源性最高，达到93.2％(273/293)，氨基酸同源性达到84.5％(82/97)，结果见图3。1D6重链可变区基因亦如此，重叠部分的核苷酸和氨基酸同源性分别是93.2％和84.5％。以上结果见图4。

将1A9和1D6重链可变区基因比较，则核苷酸同源性达到99％，氨基酸序列同源性达100％，结果见图5。

综上所述，本发明公开了一种小鼠针对自身蛋白抗原Doppel的单克隆抗体，采用原核细胞表达的小鼠Doppel蛋白(MoDpl 27-154)与载体KLH偶联制成免疫原，经免疫BALB/c小鼠，制备出2株抗小鼠Doppel的鼠源性单克隆抗体1A9和1D6，鉴定出其相对亲和力分别为1×10⁵和1×10⁴，且重链和轻链均为IgG1亚类和κ型，识别同一个表位，即小鼠Doppel蛋白82–90位氨基酸残基(NYWQFPDGI)。克隆了1A9和1D6两株单克隆抗体的重链可变区基因，获得了重链可变区基因序列和氨基酸序列，确认了这些基因序列与蛋白序列的唯一性。鉴于识别的表位序列NYWQFPDGI在小鼠、大鼠和人Doppel蛋白完全相同，显示这2株单克隆抗体在研究Doppel蛋白功能方面有重要的应用价值。

Claims

1.特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能够与天然鼠脑和原核细胞表达的Doppel结合，特异性识别Doppel蛋白的82～90位氨基酸残基，该82～90位氨基酸残基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括两株，分别为抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9和抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6，抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9和抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6的重链均为IgG1亚类，轻链均为κ型。

3.根据权利要求2所述的特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体，其特征在于，抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9和抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6的重链可变区DNA序列同源性为99％，氨基酸序列相同，相对亲和力不同。

4.根据权利要求3所述的特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9的相对亲和力为1×10⁵；所述抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6的相对亲和力为1×10⁴。

5.根据权利要求2～4中任意一项所述的特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1A9的重链可变区基因序列的3个互补决定区(CDR)分别为：

CDR1:GGTTATACCTTCACAGACTATGCA

CDR2:ATAAACACTGCGACTGGTGAGCCA

CDR3:GCTAGTGATGGTCGCTACTGGTACTTCGGTGTC；

对应的氨基酸序列分别为：

CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Ala

CDR2：Ile-Asn-Thr-Ala-Thr-Gly-Glu-Pro

CDR3：Ala-Ser-Asp-Gly-Arg-Tyr-Trp-Tyr-Phe-Gly-Val。

6.根据权利要求2～4中任意一项所述的特异性识别小鼠Doppel蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述抗小鼠Doppel蛋白单克隆抗体1D6的重链可变区基因序列的3个互补决定区(CDR)分别为：

CDR1：GGTTATACCTTCACAGACTATGCA

CDR2：ATAAACACTGCGACTGGTGAGCCA

CDR3：GCTAGTGATGGTCGCTACTGGTACTTCGGTGTC；

对应的氨基酸序列分别为：

CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr–Ala

CDR2：Ile-Asn-Thr-Ala-Thr-Gly-Glu-Pro

CDR3：Ala-Ser-Asp-Gly-Arg-Tyr-Trp-Tyr-Phe-Gly-Val。