CN1303435A

CN1303435A - Tao蛋白激酶及其使用方法

Info

Publication number: CN1303435A
Application number: CN99806761A
Authority: CN
Inventors: M·考博; M·哈啻森; 陈祝; K·比尔曼
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2001-07-11
Anticipated expiration: 2019-04-14
Also published as: BR9909679A; US6586242B1; US6165461A; WO1999053076A1; CA2325824A1; AU758731B2; CN100374568C; AU3560599A; JP2002515223A; WO1999053076A9; EP1071787A1

Abstract

本发明提供了增强激活有丝分裂原的蛋白激酶p38的活性的组合物和方法。特别是,本发明提供了刺激p38的磷酸化的有丝分裂原激活蛋白激酶MEK3和其变体。这样的化合物例如可以用于治疗与p38级联有关的疾病和鉴定抗体和通过p38抑制或活化信号转导的其它药剂。

Description

TAO蛋白激酶及其使用方法

政府权益申明

根据NIH Grant GM 53032，在本发明中政府拥有某些权利。

技术领域

本发明总地涉及调节MAP/ERK激酶MEK3和/或其它MEK家族成员的活性的组合物和方法。更具体地，本发明涉及刺激MEK底物如MEK3的磷酸化和活化的TAO蛋白质和其变体。本发明进一步涉及利用这样的蛋白质在生物体中激活应激性MAP激酶途径和鉴定抗体和通过这样的途径抑制或激活信号转导的其它药剂。

本发明背景

MAP激酶途径是激活转录因子，翻译因子和其它靶分子以响应各种细胞外信号的保守信号转导途径。每个途径包括由MAP激酶或ERK,MAP/ERK激酶(MEK)和MEK激酶(MEKK)组成的MAP激酶单元。在高等真核生物中，MAP激酶途径的活化是和细胞事件如增殖，癌发生，发育和分化相关的。因此，通过这些途径调节信号转导的能力可能导致与MAP激酶途径相关的人疾病，如炎症疾病，自身免疫疾病和癌症的治疗和预防性治疗的发展。

在酿酒酵母中已经发现几个MAP激酶途径(Hunter和Plowman，生物化学科学趋势，22:18-22,1997)，根据哺乳动物ERK和酵母MAP激酶，KSSI和FUS3的序列已经鉴定了平行的哺乳动物途径(Boulton等人，科学，249:64-67,1990；Courchesne等人，细胞58:1107-1119,1989；Elion等人，细胞60:649-664,1990)。由交配信息素激活的最具特色的酵母MAP激酶途径是受体G蛋白质系统，包括Cd42小G蛋白质控制的，并且需要至少三个在MAP激酶Fus3p(Elion等人，细胞60:649-664,1990)上游的蛋白激酶，Ste20p(Leberer等人，EMBO J,11:4815-4828,1992；Ramer等人，美国国家科学院院报，90:452-456,1993),Stellp(Rhodes等人，基因发展4:1862-1874,1990)，和Ste7p(Teague等人，美国国家科学院院报，83:7371-7375,1986)。

Ste20p是从酿酒酵母中作为基因分离的，它的产物在信息素应答途径的异三聚体G蛋白质的βγ亚单位的下游而不在MAP激酶单元(MEKK,MEK,ERK)中的酶的上游起作用(Leberer等人，EMBO J.11:4815-4828,1992；Ramer等人，美国国家科学院院报，90:452-456,1993)。Ste11p,MEKK可以是Ste20p底物之一(Wu等人，生物化学杂志，270:15984-15992,1990)；所以，Ste20p样酶可以在哺乳动物MAP激酶途径中活化MEKK。人们认为Ste20p，象它的研究最深的哺乳动物的对应物，p21活化的蛋白激酶(PAKs)一样，是通过保守的Cdc42/Rac相互作用结合区，或CRIB区与Cdc42结合调节的(Burbelo等人，生物化学杂志，270:29071-29074,1995)。

Ste20p的哺乳动物相对物是各种各样的，并且包括PAK亚家族(PAK1,2,3)和混合谱系激酶(MLK)亚家族，包括双重亮氨酸拉链激酶(DLK)，生发中心激酶(GCK)，和Nck-相互作用激酶，NIK。在过去，新鉴定的Ste20p相关激酶包括MLK亚家族，SOK-1,Krs-1和-2，和MUK的成员。MUK是在MEKK同工型的筛选中分离的，但事实上它显示了与MLK更多的同一性。在转染的细胞中，正如以GCK首次所示，这些酶中的几个酶能够增强应激性激酶，特别是SAPK/JNK的活性。在NIK和GCK的情况中，它们可以通过结合MEKK起作用(Su等人，EMBO J.16:1279-1290,1997)。但是，几个这样的Ste20p相关酶也具有MEKK活性。例如，DLK磷酸化和强有力地活化位于应激性级联中的MEK。

进一步表征这些途径的成员，和鉴定其它成员是理解所涉及的信号转导途径和开发活化或钝化体内MEK和MAP激酶途径的方法的关键所在。因此，在本领域中需要调节MAP激酶途径成员的活性和治疗与这样的途径相关的疾病的改进方法。本发明满足了这些需要并且进一步提供了其它相关的优点。

发明概要

简要地说，本发明提供了调节MAP/ERK激酶如MEK3的活性，和应激性MAP激酶途径的组合物和方法。在某些方面，本发明提供了TAO多肽。在这样的一个方面内，多肽可以包括在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中提供的氨基酸序列或它们的变体，其中这些氨基酸序列磷酸化MEK3的能力基本不减弱。在一些实施方案中，这样的多肽可以包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列举的序列的区别只在于保守的取代和/或修饰不超过10％的氨基酸残基。在其它一些实施方案中，多肽可以是组成活性变体。

在其它方面，本发明提供了SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中修饰不超过10％的氨基酸残基的氨基酸序列，以致使多肽变为组成无活性的。

在另外的方面，本发明提供了能够磷酸化MEK3的多肽，其中该多肽磷酸化MEK1或MEK2是不能检测到的。

在另外的方面，本发明还提供了编码如上所述的多肽的分离的多核苷酸。同时，本发明提供了含有在SEQ ID NO:5-16的任何一个中列举的一个或多个序列的分离的多核苷酸，或其变体，其中该多核苷酸编码能够磷酸化MEK3的多肽。另外本发明也提供了由这样的多核苷酸编码的多肽。在相关的方面本发明提供了含有上面的多核苷酸的任何一个的重组表达载体，和使用这样的表达载体转化或转染的宿主细胞。

在其它方面，本发明提供了含有至少10个与如上所述的多核苷酸互补的核苷酸的反义多核苷酸。

在另外的方面，本发明提供了药物组合物，包括：(a)如上所述的多肽或多核苷酸；和(b)生理可接受载体。

在另外的方面，本发明还提供了磷酸化MEK3多肽的方法，该方法包括将MEK3多肽与如上所述的多肽接触，从而磷酸化MEK3多肽。

在另外的方面，本发明提供了在生物体中激活应激性MAP激酶途径的成员的方法，该方法包括对生物体给予如上所述的多肽，从而活化应激性AP激酶途径的成员。

在其它方面，本发明提供了磷酸化MEK3多肽的方法，包括将MEK3多肽与如上所述的多肽接触，从而磷酸化MEK3多肽。

本发明进一步提供了活化在生物体中的应激性MAP激酶途径的成员的方法，包括对生物体给予如上所述的多肽，从而活化应激性MAP激酶途径的成员。

在另外的方面，本发明提供了筛选通过应激性MAP激酶途径调节信号转导的药剂的方法，该方法包括：(a)将候选药剂与如上所述的多肽接触;和(b)随后测量多肽调节MEK3多肽的活性的能力，从而评估化合物通过应激性MAP激酶途径调节信号转导的能力。

在其它方面，本发明进一步提供特定地结合如上所述的多肽的单克隆抗体和其抗原结合片段。这样的单克隆抗体或其片段可以抑制多肽对MEK3的磷酸化。同时提供了包括：(a)如上所述的抗体或其抗原结合片段和(b)生理可接受载体的药物组合物。

在其它方面，本发明提供了治疗患有与应激性MAP激酶途径相关的疾病的患者的方法，该方法包括对患者给药调节MEK3的磷酸化的化合物。在一些实施方案中，化合物含有单克隆抗体或其抗原结合片段或核苷酸序列。在这样的方法中，化合物可以抑制MEK3的磷酸化，并且这种疾病可以是炎症，自身免疫疾病，癌症和变性疾病。或者，该化合物可以增强MEK3的磷酸化，并且该疾病可以是依赖胰岛素的糖尿病或神经变性疾病。

在其它方面，本发明提供了在样品中确定TAO激酶活性存在与否的方法，该方法包括评估样品磷酸化MEK3多肽的能力，从而确定样品中TAO激酶活性的存在与否。

在相关的方面，本发明提供了在样品中检测TAO激酶活性的试剂盒，其中包含与适当的缓冲剂结合的MEK3。

参考下面的详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将变得明朗。本文公开的所有参考文献如同单独引用一样全部引入作为参考。

附图的简要说明

图1显示了代表性的TAO1激酶的核苷酸和预测的氨基酸序列(SEQ ID NO:1和2)。

图2显示了TAO1(SEQ ID NO:2的1-273残基)，TAO2(SEQ IDNO:4的1-273残基)，STE20(SEQ ID NO:17)和雅致枝孢同系物(ceTAO)(SEQ ID NO:18)的催化区的比较。用肉眼对比催化区，并且保守氨基酸用黑体表示。用罗马数字表示这些区域。

图3A和3B是Northern印迹，表明了在各种组织中TAO1(图3A)和TAO2(图3B)的表达。如所示出的，探测了各种大鼠poly-A+RNAs。通过将印迹与肌动蛋白探针(未显示)杂交证实了等同加载的RNA。

图4A和图4B是Northern印迹，其中将从各种人脑和脊髓切片制成的RNA与TAO1特异性探针杂交。每个印迹下面显示的是其与肌动蛋白探针杂交的结果。各道如下：1，扁桃体，2，尾状核，3，胼胝体，4，海马，5，整个大脑，6，黑质，7，底丘脑核，8，丘脑，9，小脑，10，大脑皮层，11，髓质，12，脊髓，13，枕叶，14，额叶，15，颞叶，16，壳。

图5A-5C是免疫印迹。在图5A中，利用载体或pCMV5TAO1(HA)₃瞬时转染人胚胎肾293细胞，并且在24小时后，利用针对HA表位的单克隆抗体免疫印迹溶胞产物。用箭头表示TAO1。在图5B中，利用针对MRGS(H)6表位的单克隆抗体免疫印迹从Sf9细胞纯化的TAO1蛋白质。在图5C中，利用针对TAO1肽的多克隆抗血清P820免疫印迹50纳克(His)₆TAO1。利用P820的免疫前血清印迹等量的上面的物质。

图6是代表性体外联动激酶测定用来估计TAO1对MEK的活化的结果的放射自显影图。在存在Mg/ATP时，在30℃，将50纳克(His)₆MEK3与50纳克(道1和3)或250纳克(道2和4)的(His)₆TAO1(1-416)温育1小时。然后，将各反应物的一部分加入含有(His)₆p38的第二个反应物。在温育一小时后，将反应物进行SDS-PAGE和放射自显影。

图7是代表性体外联动激酶测定用来估计TAO1对MEK活化的结果的放射自显影图。其中只显示了连接测定的第二部分。除了用GSTMEK4替代了MEK3,(His)₆p38和GSTSAPKβ都用作MEK4底物外，该测定与图6中所述相同。

图8是代表性体外联动激酶测定用来估计TAO1对MEK活化的结果的放射自显影图。该测定如图6和7所述，但是利用GSTMEK6和(His)₆p38作为MEK6的底物进行。

图9是比较(His)₆TAO1(1-416)对MEK1到6的活化倍数的直方图。

图10是说明体内TAO1对MEK3的活化的放射自显影图。单独利用载体，或单独和结合利用pCMV5TAO1(HA)₃和pCMV5mycMEK3瞬时转染人胚胎肾293细胞。利用(His)₆p38作为底物，将利用针对myc表位的单克隆抗体制成的免疫沉淀物进行体外激酶测定。下面显示了利用多克隆抗MEK3抗血清检测Myc-标记的MEK3表达。在几个独立的实验中，当利用TAO1共表达时，在免疫沉淀物中的MEK3活性增强了3到4倍。

图11是说明从Sf9细胞共纯化的TAO1和内源MEK3的放射自显影图。利用针对MEK3(最上面的组)或MEK4(下面的组)的多克隆抗血清Western印迹100微克的Sf9全细胞溶胞产物，或各1微克以Sf9细胞纯化的重组TAO1蛋白质。利用抗MEK6的抗血清进行相同的Western印迹在Sf9溶胞产物或TAO制剂中都没有检测到MEK6蛋白质。

图12显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:5)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸2341-2754(query)的对比。

图13显示了人视网膜cDNA ETS(sbjct；SEQ ID NO:6)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸964-651(query)的对比。

图14显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:7)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸2792-2423(query)的对比。

图15A显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:8)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸2248-2437(query)的对比。图15B显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ IDNO:9)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的2437-2501(query)的对比。

图16显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:10)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸2087-2305(query)的对比。

图17A显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:11)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸3228-3312(query)的对比。图17B显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ IDNO:12)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸3200-3245(query)的对比。

图18显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:13)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸739-854(query)的对比。

图19A显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:14)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸526-643(query)的对比。图19B显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:15)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸187-296(query)的对比。

图20显示了人视网膜cDNA EST(sbjct；SEQ ID NO:16)与图1中提供的大鼠TAO1激酶序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸866-733(query)的对比。

本发明的详细描述

正如上面所述，本发明总地涉及调节(即，刺激或抑制)MAP/EPK家族的成员如MAP/ERK激酶MEK3的化合物和方法。激活这类MEK的化合物一般可刺激MEK磷酸化。这样的化合物包括本文称为TAO多肽的Ste20p同系物(即，保留刺激MEK3磷酸化的水平基本不低于天然蛋白质的刺激水平的能力的TAO1,TAO2或TAO1或TAO2的变体)。或者，活化MEK3的化合物可以包括编码TAO多肽的多核苷酸。在其它实施方案中，刺激MEK3磷酸化(从而活化MEK3)的组合物也可以，或者，包括刺激TAO多肽表达或激酶活性的一种或多种药剂。这样的药剂包括，但不限于胁迫诱导剂(如，DNA损伤剂)。另外，这样的药剂可以通过体外结合测定化合物和TAO多肽，和利用例如本文所述的代表性测定评估测定化合物对多肽的激酶活性的影响来鉴定。

抑制MEK的活性的组合物普遍抑制MEK磷酸化。这样的组合物可以包括抑制或阻止TAO多肽活性的一种或多种药剂，如抑制TAO多肽的激酶活性的抗体，代表TAO蛋白质的底物结合区或MEK3底物的磷酸化基序的竞争肽，干扰TAO多肽的转录和/或翻译的反义多核苷酸或核酶，通过结合多肽钝化TAO多肽的分子，结合TAO底物和防止受到TAO多肽的磷酸化的分子，或防止磷酰基从激酶转移到底物的分子。抑制TAO多肽激酶活性的药剂可以通过体外结合测定化合物和TAO多肽的和利用TAO激酶测定评估TAO多肽的活性得到鉴定。

TAO多核苷酸

本发明包括编码TAO多肽或其如上所述的部分或变体的任何多核苷酸。这样的多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链，并且可以是DNA(基因组，cDNA或合成的)或RNA分子。另外，编码序列或非编码序列，可以，但不必要存在于本发明的多核苷酸中，并且TAO多核苷酸，可以，但不必要连接到其它分子和/或支持物质上。

利用本领域普通技术人员已知的各种杂交或扩增技术可以分离天然TAO DNA序列或其部分。在这样的技术中，根据本文提供的TAO序列可以设计并且可以购买或合成探针或引物。可以筛选来自任何适当组织(例如，脑)的文库。然后，可以利用扩增部分或部分cDNA分子，通过已知的技术，从基因组DNA文库或cDNA文库分离全长的基因。或者，从多个PCR片段可以构建全长的基因。

分别在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3中提供了对应于天然大鼠TAO多肽TAO1和TAO2的核酸序列。一个优选的TAO1变体包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-416。预测的TAO1可读框编码1001个氨基酸的计算分子量的134千道尔顿的多肽。TAO1包括氨基末端催化区和具有几个区别特征的延伸的羧基末端区，其特征如可能的核苷酸结合位点和仅仅羧基末端延伸催化区至酸性序列段，以及两个富丝氨酸区。TAO1催化区延伸了从氨基酸25到288的263个氨基酸。所有11个典型的蛋白激酶亚区是保守的。在TAO1亚区Ⅱ和Ⅳ之间存在两个谷氨酸残基；包含在序列KEVK中的氨基酸76的第二个谷氨酸最可能代表亚区Ⅲ(Hanks等人，科学241:42-52,1988)。TAO1催化区的特征与蛋白激酶的丝氨酸/苏氨酸家族最相似；含有序列HRDIKAGN(SEQ ID NO:26)的亚区VIb表明TAO1可能是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

在SEQ ID NO:3和4中提供了紧密相关的基因TAO2的部分序列。TAO2具有氨基末端激酶区和长羧基末端的相似排列，但区别在于它含有羧基末端至催化区的17个谷氨酸残基的酸性插入片段，并且缺乏TAO1的推断的核苷酸结合位点。

在脑中，大鼠TAO1和TAO2转录物得到高度表达。在心脏和肺中可以观察到低水平的TAO1表达，在骨骼肌，肝脏，肾脏，睾丸，附睾和脾脏中没有可检测的信号(利用的是如本文所述的Northern印迹分析)。

本发明具体地包括本文具体列举的多核苷酸，以及含有这样的序列的全长多核苷酸，全长多核苷酸的其它部分，与这样的全长分子的全部或部分互补的序列。另外，应特别考虑的是来自其它物种的TAO同系物，这些同系物一般可以如本文对大鼠同系物所述制备。特别是，在本发明的上下文中，已经鉴定起源于视网膜mRNA的EST数据库序列是对应于人TAO1对应物的。SEQ ID NO:5-16中提供了这些EST的序列。本领域普通技术人员容易明白的是，根据这样的序列，例如利用标准杂交或扩增技术，可以鉴定全长的，天然的人TAO1多核苷酸。本发明着重研究了这样的全长TAO序列，以及这些序列编码的多肽，和如本文所讨论的天然存在的序列的变体。

列举的序列的多核苷酸变体与天然TAO多核苷酸的区别可在于一个或多个取代，缺失，插入和/或修饰。某些变体编码的多肽保留了刺激MEK3磷酸化的能力，保留的能力水平基本不低于由天然蛋白质刺激的水平。一般可以如本文所述评估对编码多肽的特性的影响。优选的变体含有核苷酸取代，缺失，插入和/或修饰的程度不超过20％，优选地不超过10％的核苷酸位置。某些变体与天然基因，或其部分或互补物基本同源。这样的多核苷酸变体在中等严格条件下能够与编码TAO蛋白质(或互补序列)的天然存在的DNA序列杂交。适宜的中等严格条件包括在5×SSC,0.5％SDS,1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃,5×SSC过夜杂交；接着在65℃，每次用含有0.1％SDS的2×,0.5×和0.2×SSC洗涤两次。这样的杂交DNA序列也在本发明的范围内。

本领域普通技术人员应认识到，作为遗传密码的简并性的结果，存在许多编码如本文所述多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。但是，本发明特别关注因密码子选择的不同而变化的多核苷酸。

如上所述，本发明进一步提供了反义多核苷酸和部分上面的任何序列。这样的多核苷酸一般可以利用任何本领域已知的方法制备，包括例如，固相亚磷酰胺化学合成的合成方法。或者，可以通过掺入适当RNA聚合酶启动子(如T3,T7，或SP6)的载体下游的DNA序列的体外或体内转录产生RNA分子。如本文所述，TAO多核苷酸的某些部分可以用于制备编码的多肽。另外，或者，其中一部分可以用作探针(例如，检测样品中的TAO表达)，可以利用各种报道基团标记该部分，这些报道基团如放射性核素，荧光染料和酶。这样的部分优选地为至少10个核苷酸长度，更优选地为至少20个核苷酸长度。在某些优选的实施方案中，用作探针的部分含有TAO基因所特有的序列。与编码序列互补的序列的一部分(即，反义多核苷酸)也可以用作探针或用于调节基因表达。可以转录成反义RNA的DNA构建体也可以导入细胞或组织以促进反义RNA的产生。

可以进一步修饰任何多核苷酸以增强在体内的稳定性。可能的修饰包括，但不限于在5’和/或3’末端加入侧翼序列；利用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是主链中的磷酸二酯键；和/或包含非常规碱基如肌苷，queosine和wybutosine,以及腺苷，胞苷，鸟苷，胸苷和尿苷的乙酰基-，甲基-，硫代-和其它修饰形式。

利用已经确立的重组DNA技术，可以将如本文所述的核苷酸序列与各种其它核苷酸序列连接。例如，可以将多核苷酸克隆进入任何种类的克隆载体，包括质粒，噬菌粒，λ噬菌体衍生物和粘粒。特别重要的载体包括表达载体，复制载体，探针生成载体和测序载体。通常，载体将含有在至少一个生物体中起作用的复制起点，方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记。也可以存在额外的起始，末端和/或间插DNA序列，例如，这些序列可促进容易表达的载体的构建。适宜的载体可以购买得到或用本领域的已知方法由所述的序列组装。可能存在于载体中的其它元件将取决于所需要的用途，并且将是本领域普通技术人员所了解的。

利用本领域已知的方法，一般可以将如本文所述的载体转染进入适当的宿主细胞，如哺乳动物细胞。这样的方法包括磷酸钙沉淀法，电穿孔法和微注射法。

TAO多肽

在本发明的范围内的多肽至少包括TAO蛋白质的一部分(例如TAO1或TAO2)或其变体，其中这部分是免疫学和/或生物学活性的。优选的变体保留了刺激MEK3磷酸化的能力，刺激的水平基本不低于由天然蛋白质刺激的水平。多肽可以进一步包含可能是或可能不是衍生于天然TAO蛋白质的附加序列。这样的序列可以(但不必)具有免疫原或抗原特性和/或生物学活性。

如本文所用，多肽“变体”是与天然蛋白质区别在于具有取代，插入，缺失和/或氨基酸修饰，但基本不减弱天然蛋白质的免疫原和/或生物特性的多肽。变体优选地保留了至少80％与天然序列的序列同一性，更优选地至少90％的同一性，和甚至更优选地至少95％的同一性。在某些优选的实施方案中，这样的变体含有不超过10％的天然多肽中的氨基酸残基的改变，所以变体刺激MEK3磷酸化的能力基本没有减弱。确定哪些和多少氨基酸残基可以被取代，插入，缺失和/或修饰而不减弱免疫和/或生物活性的指导可以用本领域已知的任何类型的方法和计算机程序发现。变体的特性一般可以通过测定变体与例如本文所述的抗体的反应性，和/或评估天然蛋白质的生物特性进行评估。

如果多肽被B细胞和/或T细胞表面抗原受体识别(即特异地结合)，在本发明的上下文中，该多肽即是“免疫学活性的”。免疫学活性通常可以利用已知的技术如Paul，基础免疫学，第3版，243-247(Raven出版社，1993)和其中所引用的参考文献中概述的技术进行评估。这样的技术包括筛选衍生于天然多肽的多肽与可以利用已知方法制备的抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。TAO蛋白质的免疫学活性部分与这样的抗血清和/或T细胞的反应水平基本不低于全长多肽的反应性(例如，在ELISA和/或T细胞反应性测定中)。利用本领域普通技术人员已知的方法，如Harlow和Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988中所述的方法通常可以进行这样的筛选。B细胞和T细胞表位也可以通过计算机分析推断。

同样，如果磷酸化MEK3和/或其它MEK的能力在如实施例3中所述的代表性体外测定中基本没有减弱，这样的多肽是具有“生物学活性的”。优选地，该多肽磷酸化MEK3的能力基本没有减弱。正如本文所用，术语“基本没有减弱”是指至少保留了天然TAO蛋白质的活性的90％。根据本领域已知的现存的测定法和本文提供的代表性测定法，可以设计评估这样的活性的适当的测定方法。

优选地，变体含有保守取代。“保守取代”是其中一个氨基酸取代了具有相似特性的另一个氨基酸的取代，从而肽化学领域的技术人员可以期望多肽的二级结构和亲水性基本未改变。氨基酸取代一般可以在极性，电荷，可溶性，疏水性，亲水性和/或残基的两亲性上的相似性的基础上进行。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有亲水性值相似的极性头基团的不带电的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。可以体现保守变化的氨基酸的其它组群包括：(1)ala,pro,gly,glu,asp,gln,asn,ser,thr；(2)cys,ser,tyr,thr；(3)val,ile,leu,met,ala,phe；(4)lys,arg,his；和(5)phe,tyr,trp,his。变体也可以，或者含有非保守变化。

通常，在非关键区，即基本没有改变TAO蛋白质的特性的天然序列的区域，可以更容易地进行修饰。通过在特定的区修饰TAO序列，和在如本文所述的利用MEK3,MEK4,MEK6或另一个MEK家族成员作为底物的激酶测定中测定得到的变体的活性可以鉴定非关键区。假如得到的变体保留了刺激MEK3磷酸化的能力和/或天然蛋白质的免疫原特性，修饰也可以在TAO蛋白质的关键区进行。修饰某些关键区可能产生无活性的蛋白质。一个关键区包含天冬氨酸169残基。修饰那个残基导致催化缺陷性突变体。另一个关键区包括赖氨酸57残基。任何修饰对变体刺激MEK3或其它MEK的磷酸化的能力的影响通常可以利用任何TAO激酶活性的测定如本文所述的代表性测定进行评估。

TAO蛋白质的变体包括组成活性蛋白质。通常，TAO蛋白质的体内活化需要刺激物如胁迫诱导剂刺激。组成活性变体展示了在缺乏这样的刺激时刺激MEK磷酸化的能力。利用本文所述的代表性TAO激酶活性的体内测定可以鉴定这样的变体。

也可以修饰TAO蛋白质以致使蛋白质变为组成无活性的(即，甚至当如上所述刺激时也不能磷酸化MEK)。利用本文叙述的代表性测定可以鉴定这样的修饰。如下文中更详细地讨论的，编码经修饰而变为组成活性或无活性的蛋白质的基因通常可以用于治疗各种疾病的替代疗法中。

在本发明范围内的变体也包括其中通过与其它多肽或化学部分如，糖基，脂，磷酸酯，乙酰基和诸如此类形成共价或聚集结合物修饰天然蛋白质的一级氨基酸结构的多肽。例如，通过将特殊功能基团连接到氨基酸链上或连接在N末端或C末端上可以制备共价衍生物。

本发明也包括与天然模式的糖基化相关或不相关的多肽。根据表达系统的不同，在酵母或哺乳动物表达系统中表达的多肽可能与天然分子在分子量和糖基化模式上相似或稍微不同。在细菌如大肠杆菌中，DNA的表达提供了非糖基化分子。利用氨基酸三联体Asn-A₁-Z表征真核蛋白质的N-糖基化位点，其中A₁是除了Pro以外的任何氨基酸，Z是Ser或Thr。利用本领域普通技术人员已知的技术如寡核苷酸合成和连接或位点特异性诱变技术可以生产具有钝化的N-糖基化位点的变体，并且是在本发明的范围内的。或者，可以将N-连接的糖基化位点加入多肽中。

如上所述，多肽可以进一步含有与内源TAO蛋白质不相关的序列。例如，可以存在N末端信号(或前导)序列，它在翻译的同时或翻译后指导多肽从它的合成位点转移到细胞膜或壁的内部或外面某一位点(例如，酵母α因子前导序列)。多肽也可以含有方便多肽的合成，纯化和鉴定的接头或其它序列(例如，聚His，血凝素，谷胱甘肽-S-转移酶或FLAG)，或增强多肽稳定性或与固体支持物结合的接头或其它序列。本发明包括的蛋白质融合体进一步包括例如，与免疫球蛋白Fc区或亮氨酸拉链区缀合的多肽。所有上面的蛋白质融合体可以通过化学键合或作为融合蛋白质制备。

也包括在本发明的范围内的是TAO蛋白质的等位基因。等位基因是由一个或多个遗传突变(可以是氨基酸缺失，添加和/或取代)产生的天然蛋白质的替代形式，产生了改变的mRNA。等位基因蛋白质可能在序列上不同，但整个结构和功能基本相似。

TAO多肽，变体或其部分通常可以利用已知的技术从编码需要的多肽的核酸制备。为了制备内源蛋白质，可以利用分离的cDNA。为了制备变体多肽，可以利用标准诱变技术，如寡核苷酸定点特异性诱变，可以除去部分DNA序列以便制备截短的多肽。

通常，可以利用本领域技术人员已知的多种表达载体中的任一种表达本发明的重组多肽。在任何适当的已经用含有编码重组多肽的DNA序列的表达载体转化或转染的宿主细胞中可以获得表达。适宜的宿主细胞包括原核生物，酵母，杆状病毒感染的昆虫细胞和动物细胞。在表达后，利用购买得到的过滤器可以首先浓缩将重组蛋白质或多肽分泌到培养基中的来自宿主/载体系统的上清液。在浓缩后，可以将浓缩物应用于适宜的纯化基质如亲和性基质或离子交换树脂。还可以利用一个或多个反相HPLC步骤进一步纯化重组多肽。

利用本领域普通技术人员已知的技术，通过合成手段也可以产生具有少于100个氨基酸的和通常少于50个氨基酸的部分和其它变体。例如，利用任何商业可得的固相技术，如将氨基酸按顺序添加到伸长的氨基酸链的Merrifield固相合成方法可以合成这样的多肽。参见，Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2146,1963。各种修饰的固相技术也是可得到的(例如，Roberge等人的方法，科学，269:202-204,1995)。自动合成多肽的仪器可以从供应商如AppliedBioSystems,Inc.(Foster City,CA)购买得到，并且可以根据制造商的指导操作。

通常，分离如本文所述的多肽和多核苷酸。“分离的”多肽或多核苷酸是从它的原始环境中移取的。例如，如果天然存在的蛋白质是从天然系统中的一些或全部共存物质中分离的，则它是分离的。优选地，分离本文提供的多肽达到至少80％(重量)的纯度，更优选地至少95％(重量)的纯度，最优选地至少99％(重量)的纯度。通常，利用例如，硫酸胺分级分离标准技术，SDS-PAGE电泳，和亲和层析可以达到这样的纯化程度。如果例如，多核苷酸被克隆进入不是天然环境一部分的载体中，则它被认为是分离的。

抗体和其片段

本发明进一步提供特异地结合TAO多肽的抗体，和其抗原结合片段。正如本文所用，如果抗体或抗原结合片段与TAO多肽以可检测的水平(例如在ELISA内)反应，并且与不相关的蛋白质没有可检测地反应，即表明它与TAO多肽“特异地结合”。抗体可以是多克隆或单克隆的。优选的抗体是那些在体内和在如本文所述的激酶测定中抑制或阻断TAO活性的抗体。其它优选的抗体(例如，可以在免疫激酶测定中利用)是免疫沉淀活性TAO1和/或TAO2的那些。

通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任一种可以制备抗体(参见，例如，Harlow和Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988)。在一个这样的技术中，开始将含有多肽的免疫原注射进入适当的动物(例如，小鼠，大鼠，兔子，绵羊和山羊)，优选地根据预定的方案，进行一次或多次加强免疫，并周期性地将动物放血。然后，例如，利用与适当固相支持物偶联的多肽的亲和层析，可以从这样的抗血清纯化特异于该多肽的多克隆抗体。

例如，利用Kohler和Milstein，欧洲免疫学杂志，6:511-519,1976，和对该技术的改进，可以制备特异于TAO多肽的单克隆抗体。简要地说，这些方法包括制备能够产生具有需要的特异性(即，与需要的多肽的反应性)的无限增殖细胞系。例如，从得自如上所述免疫的动物的脾细胞可以生产这样的细胞系。然后，例如通过与骨髓瘤细胞融合伙伴，优选地与免疫动物同基因的融合伙伴融合，使脾细胞无限增殖。例如，脾细胞与骨髓瘤细胞可以与非离子去垢剂结合几分钟，然后在支持杂交细胞，而不是骨髓瘤细胞的生长的选择性培养基上以低密度进行平板培养。优选的选择技术利用HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶)选择。在足够的时间，通常约1到2星期后，观察杂交体的集落。选择单个集落，试验对该多肽的结合活性。具有高反应性和特异性的杂交瘤是优选的。

从生长的杂交瘤集落的上清液中可以分离单克隆抗体。另外，可以利用各种技术增加产量，如在适宜的脊椎动物宿主，如小鼠的腹腔中注射杂交瘤细胞系。然后，从腹水或血液可以收获单克隆抗体。通过常规技术，如层析，凝胶过滤，沉淀，和提取可以从抗体中除去污染物。

在某些实施方案中，利用抗体的抗原结合片段是优选的。这样的片段包括Fab片段，它可以利用标准技术制备。简要地说，通过在蛋白质A小珠柱(Harlow和Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988)上的亲和层析可以从兔血清中纯化免疫球蛋白，用木瓜蛋白酶消化产生Fab和Fc片段。例如，通过在蛋白质A小珠柱上的亲和层析可以分离Fab和Fc片段。检测TAO多肽和TAO激酶活性的方法和试剂盒

本发明提供了在样品中检测TAO1和/或TAO2的水平，以及检测样品中TAO激酶活性的方法。利用结合TAO蛋白质，DNA或mRNA的试剂通常可以确定TAO多肽或多核苷酸的水平。为了检测编码TAO蛋白质的核酸，可以利用其中使用核酸探针或PCR引物的标准杂交和/或PCR技术。根据本文提供的TAO cDNA序列，本领域普通技术人员可以设计适宜的探针和引物。为了检测TAO蛋白质，该试剂通常是可以如本文所述制备的抗体。

在本领域的普通技术人员已知的测定方法中，有许多可以利用抗体检测样品中的多肽。参见，例如，Harlow和Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988。例如，在固体支持物上可以固定抗体，以致它可以结合和除去样品中的多肽。然后，利用结合抗体/肽复合物和含有可检测的报道基团的第二抗体可以检测结合多肽。或者可以利用竞争性测定，其中用报道基团标记了结合固定化抗体的多肽，并且允许多肽在抗体与样品一起温育后结合固定化抗体。样品的成分抑制标记多肽与抗体结合的程度表明了样品中多肽的水平。在这些方法中利用的适当的报道基团包括，但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶)，底物，协同因子，抑制剂，染料，放射性核素，发光基团，荧光基团和生物素。

为了检测样品中的活性TAO蛋白质，可以进行免疫激酶测定。简要地说，利用标准技术，可以产生抗独特的TAO蛋白质的序列(例如，氨基酸残基296-315,403-418,545-563或829-848)的多克隆或单克隆抗体。将待测样品，如细胞提取物与抗TAO抗体一起温育，免疫沉淀TAO蛋白质，然后将免疫沉淀的物质与底物(例如，MEK3一起)在适宜的底物磷酸化条件下温育。通常，利用如本文所述的任何种类的测定可以确定底物磷酸化的水平。

用于评估多肽变体和本文讨论的其它药剂的TAO激酶测定包括评估化合物磷酸化MEK3或其它MEK，从而使MEK变为有活性的能力(即，能够在体内磷酸化底物如p38)的任何测定。用于这样的方法的MEK如MEK3可以是内源蛋白质或其变体，可以是纯化或重组的，可以利用本领域普通技术人员了解的多种技术中的任一种制备。例如，利用聚合酶链反应(PCR)和本领域普通技术人员已知的方法，从适当的人cDNA文库通过PCR扩增可以克隆编码MEK3的cDNA。根据公开的序列(Derijard等人，科学，267:682-685,1995)，利用引物可以克隆MEK3。然后，可以将MEK3 cDNA克隆进入细菌表达载体，和利用标准技术，在细菌如大肠杆菌中生产蛋白质。细菌表达载体可以，但不必须，包括编码表位如谷胱甘肽-S转移酶蛋白质(GST)以致重组蛋白质在N末端或C末端含有表位的DNA。

通常，可以如本文所述进行TAO激酶测定。简要地说，在适当的缓冲液(如50mM HEPES pH8,10mM MgCl₂,1mM DTT,100μMATP)中，可以在30℃下将TAO多肽与MEK3和[γ-³²P]ATP一起温育60分钟。通常约50纳克到1微克的多肽和50纳克重组MEK3，与2-7cpm/fmol[γ-³²P]ATP就足够了。然后，通过SDS-PAGE在10％的凝胶上分离蛋白质，并且进行放射自显影。利用本领域普通技术人员已知的技术如磷成象仪，可以定量将[³²P]磷酸酯掺入MEK3中。为了评估多肽变体的底物特异性，通常除了利用其它MEK底物(即，MEK1,2,4或6)取代MEK3，可以如上所述进行激酶测定。

为了确定MEK3磷酸化是否导致激活，利用MEK3的底物如有或没有表位标记的P38可以进行偶联的体外激酶测定。如Han等人，生物化学杂志，271:2886-2891,1996中所述可以制备用于这样的测定中的P38。简要地说，在如上所述的MEK3磷酸化以后，在如本文所述的激酶缓冲液中，可以将MEK3(例如，0.1-10纳克)与P38(例如，10微克/毫升)和[γ-³²P]ATP一起温育。应该注意到，可以利用替代的缓冲液，并且不明显改变激酶活性，缓冲液的组成可以变化。通过SDS-PAGE可以分离反应物，并且通过放射自显影观察，和利用多种已知技术中的任一种可以定量。利用这样的测定活化的MEK3将能够磷酸化P38，其水平至少超过自然背景5％。

本发明进一步提供了检测TAO多肽和TAO激酶活性的试剂盒。这样的试剂盒可以为检测TAO多肽或多核苷酸的水平而设计，或可以在直接激酶测定或偶联激酶测定中检测MEK的磷酸化，其中磷酸化的水平和/或MEK3的激酶活性是可以确定的。在任何种类的样品，如真核细胞，细菌，病毒，从这样的生物体中制备的提取物，和在活生物体中发现的液体中可以检测TAO多肽和TAO激酶活性。通常，本发明的试剂盒包括装有各成分，如将在测定中使用的试剂或缓冲液的一个或多个容器。

用于检测TAO多肽或多核苷酸水平的试剂盒通常含有结合TAO1和/或TAO2蛋白质，DNA或RNA的试剂。为了检测编码TAO多肽的核酸，该试剂可以是核酸探针或PCR引物。为了检测TAO蛋白质，该试剂通常是抗体。试剂盒也含有适于直接或间接检测定剂的报道基团(即，报道基团可以共价地结合剂或可以结合第二分子，如蛋白质A，蛋白质G，免疫球蛋白或凝集素，该第二分子本身能够结合剂)。适宜的报道基团包括，但不限于酶，(例如，辣根过氧化物酶)，底物，协同因子，抑制剂，染料，放射性核素，发光基团，荧光基团或生物素。利用本领域普通技术人员已知的标准方法，这样的报道基团可以用于直接或间接检测定剂与样品成分的结合。

基于测量MEK3的磷酸化检测TAO激酶活性的试剂盒通常包括与适宜缓冲液结合的MEK3。基于检测MEK3激酶活性检测TAO激酶活性的试剂盒通常含有与适宜MEK3底物如p38结合的MEK3。非强制性地，试剂盒可以另外包含适宜的缓冲液和/或用于活化后和与底物结合前纯化MEK3的物质。这样的试剂盒可以用于直接或偶联激酶测定，这些测定可以如上所述进行。鉴定结合剂或调节剂的方法

本发明进一步提供了鉴定抗体和与TAO多肽结合和/或调节其活性的其它化合物的方法。为了评估候选的调节剂对TAO多肽活性的影响，除了在温育混合物中加入候选调节剂外，还可以如上所述进行激酶测定。简要地说，在足以允许各成分相互反应的条件下，将包括待测组合物和TAO多肽或编码激酶的多核苷酸的反应成分温育。随后，测定组合物对激酶活性或对编码激酶的多核苷酸的水平的影响。观察到的对激酶的影响可以是抑制性的或刺激性的。通过例如，在各成分的混合物中加入放射活性化合物如³²P-ATP，和观察在MEK3或TAO多肽的其它适宜底物中放射活性的掺入能够测量激酶活性的增加或减少，以确定化合物是抑制还是刺激激酶活性。在表达载体中可以插入编码该激酶的多核苷酸，例如通过Northern印迹分析能够测量组合物对TAO mRNA的转录的影响。

在这样的测定中，在加入ATP和底物之前可以将候选药剂与TAO多肽一起预温育。或者，在加入激酶之前可以将底物与候选药剂一起预温育。其它变化包括在加入底物之前在TAO多肽和ATP的混合物中，或在加入TAO多肽之前在底物和ATP的混合物中加入候选药剂。任何这样的测定可以通过在最初的预温育步骤之后除去候选药剂得到进一步改良。通常，用于这样的测定的适宜量的抗体或其它候选药剂的量的范围是约0.1微摩尔到约10微摩尔。然后，通过如上所述定量在MEK3中[³²P]磷酸酯的掺入，并且将掺入的水平与利用TAO多肽而没有加入候选药剂所达到的水平比较，可以评估该药剂对TAO激酶活性的影响。

在用其表达取决于MEK3的活化的报道基因转染的整个细胞中也可以测量TAO激酶的活性。例如，可以将编码TAO多肽的多核苷酸和底物(例如，MEK3)共转染进入细胞。然后，免疫沉淀该底物，在体外测定中评估它的活性。或者，可以用连接报道基因如荧光素酶的依赖ATF2的启动子转染细胞。在这样的系统中，荧光素酶基因的表达(可以利用本领域普通技术人员已知的方法容易地检测)取决于P38对ATF2的活化，通过用TAO多肽刺激MEK3可以获得这样的活化。在系统中可以加入候选调节剂，如下所述，评估它们对TAO多肽活性的影响。

或者，整个细胞系统可以只利用与适宜的DNA结合区如GHF-1或GAL4融合的ATF2的反式激活区。于是报道系统可以包含GH-荧光素酶和GAL4-荧光素酶质粒。然后，可以在系统中加入候选TAO蛋白质调节剂以评估它们对ATF2特异性基因活化的影响。

在本发明的其它方面，提供了利用磷酸化和活化MEK3的上面的多肽，其肽衍生物或其它MEK家族成员。可以如上所述制备用于这样的方法的MEK底物。在一个实施方案中，如上所述通过与TAO多肽和ATP一起在适宜的缓冲液中温育可以体外磷酸化MEK3。一般来说，反应成分的量可以在约0.1微克至大约10μg TAO多肽，约0.1微克至约10微克重组MEK3，和约100nM至约1mM(优选约100pmol-30nmol)ATP的范围。然后，通过与GSH琼脂糖结合并洗涤可以纯化磷酸化的蛋白质。通常，在试验等分试样中加入[γ-³²P]，如上所述评估MEK3磷酸化的水平通常可以监测MEK3磷酸化的程度。如上所述，利用偶联的体外激酶测定可以评估磷酸化MEK3的活性。

一旦在体外活化，例如，可以利用MEK3鉴定抑制MEK3激酶活性的药剂。利用如上所述的偶联测定可以鉴定可能是抗体或药物的抑制剂。简要地说，如上所述，候选药剂可以包括在与混合物的一个或多个成分预温育或没有预温育的MEK3和p38混合物中。通常，用于这样的测定的抗体或其它药剂的适宜量的范围是0.1μM到10μM。然后，通过如上所述定量在P38中掺入[³²P]磷酸酯的量，和比较掺入的水平和利用活化的MEK3而没有加入候选药剂获得的水平比较可以评估该药剂对MEK3激酶活性的影响。

在其它方面，可以利用TAO多肽鉴定一个或多个天然上游激酶(即，在体内磷酸化和活化TAO1和/或TAO2的激酶，或调节TAO活性的其它信号分子)。TAO多肽可以用于酵母二杂交系统以鉴定相互作用的蛋白质。或者，可以筛选表达文库以鉴定编码磷酸化TAO多肽的蛋白质的cDNA。也可以利用鉴定这样的上游激酶的其它方法，这些方法是本领域普通技术人员了解的。

药物组合物

为了对患者给药，通常可以将一个或多个多肽，多核苷酸，抗体和/或调节剂配制成药物组合物，它可以是无菌水溶液或非水溶液，悬浮液或乳液，和另外包含生理可接受载体(即，不干扰活性成分的活性的非毒性物质)。本领域普通技术人员已知的任何适当载体都可以用于药物组合物中。代表性载体包括生理盐水溶液，明胶，水，醇类，天然或合成油，糖溶液，甘油，可注射有机酯，如油酸乙酯，或这些物质的组合。这样的组合物也可以包含缓冲液(例如，中性缓冲盐水，或磷酸盐缓冲盐水)，碳水化合物(例如，葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖)，甘露醇，蛋白质，多肽或氨基酸如甘氨酸，抗氧化剂，抗微生物化合物，螯合剂如EDTA或谷胱甘肽，佐剂(例如，氢氧化铝)，惰性气体和/或防腐剂。本发明的组合物也可以配制成冻干物。药物组合物也可以含有其它化合物它们可以是有或没有生物学活性。

本文所述的组合物可以作为持续释放制剂的一部分给药(即，如在给药后缓慢释放化合物的胶囊的制剂)。这样的制剂通常可以利用已知的技术制备并且例如，通过口服，直肠或皮下植入或在需要的靶位点植入的途径给药。持续释放的制剂可以含有多肽，多核苷酸或分散在载体基质中和/或包含在由速度控制膜包围的储存器中的调节剂。用于这样的制剂中的载体是生物相容的，并且也可以是可生物降解的；优选地，该制剂提供相对恒定的释放水平。在持续释放的制剂中含有的活性化合物的量取决于植入的位点，释放的速度和预期的持续时间和待治疗或预防的病症的性质。

某些药物组合物含有编码多肽，抗体片段或其它如上所述的调节剂(以致在原位生成TAO多肽，其变体或调节剂)或抗血清多肽的DNA。在这样的药物组合物中，DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的多种递送系统中，包括，核酸，细菌和病毒表达系统，以及胶体分散系统，包括脂质体。适当的核酸表达系统含有用于在患者中表达的必要的DNA序列(如适当的启动子或终止信号)。如Ulmer等人，科学259:1745-1749,1993所述，DNA也可以是“裸露的”。

可以用于在定向患者的细胞中导入核酸序列的各种病毒载体包括，但不限于，牛痘或其它痘病毒，疱疹病毒，逆转录病毒或腺病毒。在这样的载体中掺入DNA的技术是本领域普通技术人员已知的。优选地，逆转录病毒载体是包括，但不限于，莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMuLV),Harvey小鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，小鼠乳房肿瘤病毒(MuMTV)，和Rous肉瘤病毒(RSV)的小鼠或鸟类逆转录病毒的衍生物。逆转录病毒载体可以另外转移或掺入一个选择标记的基因(辅助鉴定或选择转导细胞)和/或编码特异性靶细胞上的受体的配体(使载体成为靶特异性的)的基因。例如，通过插入编码糖，糖脂或蛋白质的核苷酸序列可以使逆转录病毒成为靶特异性的。利用本领域普通技术人员已知的方法，使用抗体也可以完成寻靶。

病毒载体通常是为了生产感染性载体颗粒需要援助的非致病性(缺陷性)，复制感受态病毒。例如，利用含有在LTR内的调节序列的控制下编码所有的逆转录病毒的结构基因的质粒，但缺失能够使包装机制识别RNA转录物以便包入胶囊内的核苷酸序列的辅助细胞系可以提供这种援助。这样的辅助细胞系包括(但不限于)ψ2,PA317和PA12。可以包装导入这样的细胞中的逆转录病毒载体，产生载体病毒粒子。然后，用这种方法产生的载体病毒粒子可以用于感染组织细胞系，如NIH 3T3细胞，以产生大量的嵌合逆转录病毒粒子。

TAO多核苷酸的另一个定向递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合物，纳米胶囊，微球体，小珠和基于脂质的系统，包括水包油乳，微团，混合微团和脂质体。用作体外和体内的递送载体的优选的胶体系统是脂质体(即，人工膜囊泡)。已经显示大小范围为0.2-4.0微米的大的单层囊泡(LUV)可以封装大量的含有大分子的含水缓冲液。在含水内部可以包入RNA,DNA和完整的病毒粒子并且可以生物活性形式递送到细胞内(Fraley，等人，生物化学科学趋势，6:77,1981)。除了哺乳动物细胞外，脂质体已经用于在植物，酵母和细菌细胞中递送多核苷酸。为了使脂质体成为有效的基因转移载体，应该具有下列特点：(1)高效率地包入需要的基因而不损害它们的生物学活性；(2)与非靶细胞相比，优先和大量结合靶细胞；(3)将囊泡中的含水内容物高效率地递送到靶细胞胞质中；和(4)准确和有效地表达遗传信息(Mannino，等人，生物技术，6:882,1988)。

根据解剖学和机械因素，可以将脂质体的寻靶作用分类。解剖学分类的基础是选择性的水平，例如，特异于器官，特异于细胞和特异于细胞器。根据它是被动的还是主动的可以区别机械寻靶作用。被动寻靶利用脂质体在含有窦样毛细血管的器官中的网状内皮细胞系统(RES)的细胞中的分布的自然趋势。在其它方面，活性靶击包括通过将脂质体与特异的配体如单克隆抗体，糖，甘油脂，或蛋白质偶联，或通过为了达到靶击器官和不是天然存在定位位点的细胞类型，改变脂质体的组成或大小。

对于不同的患者，给药的途径和频率以及多肽，调节剂或核酸剂量是不同的。通常，药物组合物可以静脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，腔内或经皮给药。每天可以给药1至6剂量。适当的剂量是足以表现出患有与应激性MAP激酶途径相关的疾病的患者的症状得到改善的多肽或DNA的量。根据相关的细胞因子的水平(如IL-2,IL-8)的确定，通过监测炎症反应(例如，水肿，移植排斥，过敏性)或通过与疾病相关的临床症状的改善可以检测这样的改善。通常，存在于一剂中的多肽的量，或由存在于一剂中的DNA原位生产的多肽的量，范围是约1微克到约250微克/千克宿主，通常是约1微克到约60微克。适宜的剂量大小将根据患者的大小而变化，但对于10-60千克的动物，通常的剂量范围是约10毫升到约500毫升。

治疗应用

上面的多肽，多核苷酸和/或调节剂可以用于在患者中磷酸化(并由此活化)MEK3，或抑制这样的磷酸化。如本文所用，“患者”可以是任何哺乳动物，包括人，可以患有与应激性MAP激酶途径相关的疾病，或可以没有可检测的疾病。因此，治疗既可以是针对现存的疾病也可以是预防性的。与应激性MAP激酶途径相关的疾病包括与TAO蛋白激酶活性病原学上相关的任何疾病，包括免疫相关疾病(例如，炎症，自身免疫疾病，恶性细胞因子产生或内毒性休克)，细胞生长相关疾病(例如，癌症，代谢性疾病，异常细胞生长和增殖或细胞周期异常)和细胞再生相关疾病(例如，癌症，变性疾病，创伤，由热，紫外线或化学药品产生的环境胁迫或发育和分化的异常)。也可以治疗免疫学相关细胞增殖性疾病如骨关节炎，局部缺血，再灌注损伤，创伤，某些癌症和病毒性疾病，和自身免疫疾病如类风湿性关节炎，糖尿病，多发性硬化，牛皮癣，肠炎疾病，和其它急性期反应。

治疗包括调节TAO1和/或TAO2的激酶活性的组合物或化合物的给药。这样的调节包括当它过度表达时，TAO表达和/或活性的抑制，或当它表达不足时，TAO表达和/或活性的增强。调节也可以包括MEK3或相关激酶的磷酸化的抑制。

如上所述，可以对患者(预防性地或为了治疗现存疾病)施用对TAO表达和/或活性具有所需的作用的多核苷酸和其它药剂以在体内调节MEK3的活化。例如，可以施用在体内降低TAO活性的药剂以预防或治疗炎症，自身免疫疾病，癌症或变性疾病。特别是，可以使用这样的药剂预防或治疗胰岛素抗性糖尿病，代谢紊乱和神经变性疾病。通常，为了对患者给药，如上所述，将抗体或其它药剂配制成药物组合物。根据上面提到的标准，这样的药剂的适当剂量是足以显示使患者受益的量。

通过说明的方式而不是限制的方式提供下面的实施例。

实施例

实施例1

克隆和测序编码TAO1和TAO2的cDNA

这一实施例说明了编码大鼠Ste20p-相关蛋白激酶TAO1和TAO2的cDNA分子的克隆和人TAO1同系物的鉴定。

在第一轮PCR中利用来自成年大属脑的第一链cDNA用作模板，简并寡核苷酸引物衍生于Ste20p序列，5-’GACGCTGGATCCAA(AG)AT(ACT)GGICA(AG)GGIGC-3’(SEQ ID NO:19)和5’-GGIGTICC(AG)TTIGTIGCIAT-3’(SEQ ID NO:20)。将这一反应的部分产物在第二轮PCR中用作模板，嵌套引物也衍生于Ste20p序列，5’-AA(AG)GA(AG)CAIATI(CA)TIAA(CT)(GA)(AG)AT-3’(SEQ IDNO:21)和5’-GACGCTGAATTCAC(CT)TCIGGIGCCATCCA-3’(SEQ ID NO:22)。利用[α-³²P]dCTP通过随机引导标记得到的420个碱基的产物，并且用于探测约1×10⁶个oligo(dT)的噬斑和从成年大鼠前脑RNA产生的随机引导的λZAP文库。获得了超过100个阳性克隆；在那些测序的阴性克隆中，所有的都含有与原始的PCR产物交迭的区域。从两个交迭的cDNA组装全长的TAO1序列，利用在核苷酸50处的SacⅠ位点插入包括核苷酸50到3003的TAO1 cDNA的片段。图1和SEQ ID NO:1显示了全长TAO1序列。

TAO1可读框编码1001个氨基酸，计算的分子量为134千道尔顿。推断的起始密码子在碱基121处开始并且在它的前面在碱基106处具有符合读框的终止密码子。获得的最长的5’UTR是600个核苷酸的长度，最长的3’UTR是1200个核苷酸。分析的克隆没有一个含有poly-A轨迹。

正如大多数蛋白激酶的情况，根据与其它蛋白激酶进行氨基酸序列比较，可以将TAO1分成几个区域。TAO1由氨基末端催化区和具有几个区别性特征如可能的核苷酸结合位点和邻接催化区的羧基末端的酸性区段的延伸性羧基末端区，以及两个富丝氨酸的区域所组成。TAO1没有显示含有在激酶MLK亚家族中发现的亮氨酸拉链基序。

TAO1催化区跨越了从氨基酸25到288的263个氨基酸，所有11个典型的蛋白激酶亚区是保守的。在TAO1亚区Ⅱ和Ⅳ之间存在两个谷氨酸残基；在序列KEVK中含有的氨基酸76处的第二个谷氨酸最有可能代表亚区Ⅲ(Hanks等人，科学，241:42-52,1988)。TAO1催化区的特征与蛋白激酶的丝氨酸/苏氨酸家族最相似；具有序列HRDIKAGN的亚区Ⅵb表明TAO1可能是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

当利用FASTA(GCG，威斯康星包)将TAO1与来自数据库的序列对比时，TAO1催化区显示与雅致枝孢推断的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(登记号为U32275)的最高度的同一性，其同一性为63％和相似性为79％。看来该序列代表了TAO1的雅致枝孢同系物，并且在图2中表示为ceTAO。TAO1催化区与Ste20p具有39％的同一性，与P21-活化的激酶PAK1和PAK2的催化区具有40％的同一性。TAO1的催化区与混合谱系激酶MLK1只有31％的同一性，与已知为MLK2的带有双重亮氨酸拉链的激酶(DLK)具有33％的同一性。所以，比起MLK家族，TAO1似乎与STE20样激酶更紧密相关。TAO1也与生发中心激酶(GCK)和哺乳动物Ste20样激酶1(MST1)相关，在催化区中的同一性分别为42％和45％。TAO1序列与MEK激酶MEKK1的序列具有相似性。虽然在TAO1和MEKK的催化区之间的整个同一性只有33％，但是它们的催化区的羧基末端一半的同一性较高(42％)。

在筛选接近TAO1的5’末端的克隆的cDNA文库的过程中，鉴定了代表第二个紧密相关的基因(TAO2)的多个克隆。在SEQ ID NO:3中提供了TAO2序列，在SEQ ID NO:4和图2中显示了预测的氨基酸序列。TAO2是与TAO1高度相关的，具有氨基末端激酶区和长的羧基末端的相似排列，但不同在于它在催化区的羧基末端含有17个谷氨酸残基的酸性插入片段，缺乏推定的TAO1的核苷酸结合位点。

来自EST数据库的衍生于视网膜mRNA的序列表明了是TAO1的人对应物。在SEQ ID NO:5-16中提供了鉴定的EST序列，在图12-20中提供了这些序列与大鼠TAO1序列的对比。

利用Fasta程序比较几个蛋白激酶催化区的氨基酸同一性的百分比，结果显示在下面的表1中。

为了评估在转染细胞中TAO1的表达，在人胚胎肾293细胞中转染了全长的，HA标记的TAO1 cDNA。通过Western印迹，利用针对HA表位的抗体可以检测约140千道尔顿的蛋白质(图5A)。观察到的蛋白质的分子量与从cDNA序列预测的分子量非常一致。

实施例2

TAO1和TAO2的体内表达

如Northern印迹分析确定的，这一实施例说明了多种成年大鼠和人组织中TAO1和TAO2的表达。

根据制造商的方案，对于具有oligo(dT)纤维素的poly-A+RNA(Collaborative Biomedical Products)选择从各种成年雄性大鼠组织分离的总RNA，将各5微克RNA进行Northern分析。通过随机引导，利用[α-³²P]dCTP标记衍生于(上述)TAO1的催化区的PCR产生的420个碱基片段并且用于探测Northern印迹。杂交温度是42℃，接着在0.2％SSC/0.1％SDS中，在55℃洗涤。通过与肌动蛋白探针杂交进一步证实了mRNA的完整性。TAO1探针主要与约12kb的mRNA种类杂交，与约10kb的另一种mRNA杂交强度低一些(图3A)。在检查的大鼠组织中，脑明显表现了最强的杂交信号。经延长曝光，心脏和肺表现出微弱的杂交信号，而在骨骼肌，肝，肾，睾丸，附睾，和脾中没有检测到信号。

为了评估TAO2的表达模式，储存大鼠组织Northern印迹直到在-80℃下，经2星期曝光没有看到TAO1的杂交信号。通过随机引导，利用[α-³²P]dCTP标记来自TAO2催化区的片段，并且在如上对TAO1所述的相同杂交和洗涤条件下用于探测Northern。

当利用TAO2的催化区的片段探测同一大鼠组织的Northern印迹时，在脑中也看到了最强的杂交信号。与TAO2探针杂交的转录物的大小比对于TAO1所看到的更小，为5kb(图3B)。

将来自TAO1的非催化羧基末端的探针(对应于TAO1的核苷酸1555到2632(参见图1))用于所有附加的Northern分析，因为它不太可能与TAO2 mRNA杂交。将来自TAO1羧基末端的这一探针用于评估在人脑(Clontech)各部分中的表达模式。在Clontech ExpressHyb缓冲液中，在68℃进行杂交，如制造商的指导在55℃洗涤。

在扁桃体，胼胝体，海马，和黑质中看到了最强的杂交信号，这些中的每一个都比整个脑中看到的杂交信号更强(图4A)。在尾状核，底丘脑核和丘脑中看到了更弱的信号。在小脑，壳，和枕叶，额叶及颞叶中，与同样的探针杂交的第二个人脑Northern显示出强杂交信号，但在大脑皮层，延脑和脊髓中的信号要弱得多(图4B)。

实施例3

TAO1的激酶活性和底物特异性

这一实施例说明了在体外和体内测定中的激酶活性和底物特异性。

为了确定TAO1是否具有作为蛋白激酶的活性，利用了两个构建体。通过将编码这些TAO1多肽的cDNA克隆进入pCMV5哺乳动物表达载体产生了pCMV5TAO1-HA₃和pCMV5TAO1(1-416)-HA₃。利用了寡核苷酸引物并以TAO1 cDNA作为模板扩增编码氨基酸1-416的1247个碱基对的DNA产物。这一片段含有所有11个激酶亚区(起始甲硫氨酸缺失)。将得到的构建体转染进入人胚胎肾293细胞，并且利用针对HA表位的抗体免疫沉淀重组的、标记的蛋白质。

通常如下进行体外激酶测定。激酶测定含有：50mMHepes,pH8,10mMMgCl₂,1mM DTT,100μMATP,[γ-³²P]ATP(终浓度为2-7cpm/fmol)，除非另外注明，在30微升体积中，在30℃温育反应物60分钟。加入蛋白激酶底物如髓鞘碱性蛋白质，终浓度是0.5毫克/毫升。加入10微升5×Laemmli缓冲液终止反应，接着煮沸，通过SDS-PAGE和放射自显影分析20微升。对于连动激酶测定，在30℃，在30微升反应体积中，将50-250纳克重组TAO1蛋白质与50纳克每种细菌表达的MEK蛋白质一起温育60分钟，然后，在含有细菌表达的(His)₆p38或GST-SAPKβ的第二反应混合物中加入上面的反应物5微升，终浓度为10微克/毫升。Andrei Khokhlatchev和MeganRobinson友好地提供了重组MEK蛋白质，并且可以如Robinson等人，生物化学杂志，271:29734-29739,1996和其中引用的参考文献所述制备。在这样的测定中，TAO1(1-416)和全长TAO1二者能够在免疫复合物激酶反应中磷酸化MBP。

为了定量更高度纯化的TAO1,TAO1(1-416)的活性，在Sf9细胞中，表达了含有氨基末端六组氨酸标记的全长TAO1和全长TAO1(D169A)。TAO1(D169A)是催化缺陷性TAO1突变体，它是通过以PCR将天冬氨酸变成丙氨酸(D169A)，并且将得到的构建体克隆进入pCMV5哺乳动物表达载体中产生的。制备的这些构建体具有位于氨基末端的单个血凝素(HA)表位标记，位于羧基末端的三联HA表位标记，或位于氨基末端的myc表位标记。

在果蝇(Sf9)细胞中表达了重组的，六组氨酸标记的TAO1,TAO1(1-416)，和TAO1(D169A)。在50mM磷酸钠，pH8.5,1mMDTT,1mMPMSF，和1毫克/毫升每种亮抑蛋白酶肽，抑胃酶肽A，和抑酶肽使细胞溶解。在30,000×g离心30分钟后，将上清液应用于用同样的缓冲液预平衡的Ni²⁺-NTA琼脂糖(Qiagen)柱上。然后，利用50个柱体积的缓冲液洗涤柱，用20毫升0到250 mM在上面的缓冲液中的咪唑梯度洗脱。通过Western印迹，利用MRGS(H)₆表位(Qiagen)的抗体，在各组分中检测含有重组TAO1蛋白质的组分，合并适当的组分，透析除去咪唑。

(His)₆TAO1(1-416)表达为单一的57千道尔顿的带(图5B)。虽然D169A突变体似乎更容易降解，但是(His)₆TAO1和(His)₆TAO1(D169A)重组蛋白质都作为140千道尔顿的带迁移。在存在1mMATP时，(His)₆TAO1(1-416)磷酸化MBP，其特异活性为1微摩尔/分钟/毫克。全长的(His)₆TAO1展示了与1-416平截突变体类似的MBP磷酸化活性，而TAO(D169A)的活性减少到90％的野生型蛋白质活性。(His)₆TAO1(1-416)也可以磷酸化α-酪蛋白，组蛋白1和组蛋白7。

为了确定TAO1是否活化了一个或多个已知的MEK，在存在Mg²⁺和[γ-³²P]ATP时，将(His)₆TAO1(1-416)与细菌产生的MEK一起温育。然后，将部分该反应物转移到含有适当的细菌表达的MEK底物的相似的反应物中，对于MEK1和MEK2是(His)₆ERK2K52R，对于MEK3和MEK6是(His)₆P38，和对于MEK4是(His)₆p38和GST-SAPKβ。在温育一小时后，通过SDS-PAGE分离磷蛋白。放射自显影显示了(His)₆TAO1(1-416)磷酸化和活化了(His)₆MEK3，并且使MEK3磷酸化P38的能力增强了约100倍(图6)。

(His)₆TAO1(1-416)对于(His)₆P38使GST-MEK4活化了5倍，对于GST-SAPKβ则活化了150倍(图7)。所看到的MEK4对于两种底物的活化倍数的不同可能反映出MEK4在体外对于P38和SAPKβ的基本激酶活性的差异。TAO1也使GST-MEK6磷酸化(His)₆P38的能力增强了5倍(图8)。重组GST-MEK5没有被(His)₆TAO1(1-416)磷酸化。

同时，检查了重组(His)₆TAO1和(His)₆TAO1(D169A)活化相同的MEK蛋白质的能力。(His)TAO1比起羧基末端平截突变体(His)₆TAO1(1-416)，显示了活化MEK3能力的降低。在多个实验中，全长TAO蛋白质展示了0到30％的(His)₆TAO1(1-416)的MEK3活化能力，而(His)₆TAO1(D169A)不能使任何MEK蛋白质活化至超过基本活性。

(His)₆TAO1(1-416)体外活化每种MEK蛋白质的程度与由细菌产生的MEKK1的氨基末端平截看到的情况是类似的(Xu等人，美国国家科学院院报92:6808-6812,1995；Robinson等人，生物化学杂志，271:29734-29739,1996)。为了区别TAO1的MEK活化能力与MEKK的MEK活化能力，评估了(His)₆TAO1(1-416)活化MEK1和MEK2的能力。如图9所示，(His)₆TAO1(1-416)完全不能在相同于TAO1活化MEK3,MEK4和MEK6的条件下，增强MEK1或MEK2对底物(His)₆ERK2的活性。所以，尽管TAO1在它的活化各种MEK的能力中展示MEKK样活性，TAO1与MEKK的不能在于它不能识别MEK1和MEK2。图9显示了TAO1对各种MEK的成倍活化。

为了评估TAO1在体内活化各种MEK的能力，将全长HA标记的TAO1与myc标记的MEK3共转染至293细胞，或者将myc标记的TAO与HA标记的MEK4或HA标记的MEK6共转染。通过在pCMV5Myc载体中插入MEK3编码序列(由密执安大学的K.L.Guan提供，可以如Robinson等人，生物化学杂志，271:29734-29739,1996所述制备)产生了pCMV5myc-MEK3构建体，以致Myc表位在MEK3的氨基末端。然后，免疫沉淀MEK并将它加入含有适当底物和Mg²⁺/ATP的免疫复合物激酶测定中。在多个实验中，myc标记的MEK3从共表达TAO的293个细胞免疫沉淀时比没有用TAO转染的细胞显示出对p38的活性高3倍(图10)。相反，TAO不能增强免疫沉淀的HA标记的MEK4对GST-SAPKβ的活性，或HA标记的MEK6对P38的活性。

在转染的细胞中，TAO1活化MEK33倍，但不活化MEK4也不活化MEK6。在转染细胞中的选择性可以从TAO1结合MEK3的能力产生。来自Sf细胞的内源性MEK3与在细胞中表达的重组TAO1共纯化。这些发现表明TAO1可能是p38途径的重要调节物。

为了确定哪些MEK3残基被TAO磷酸化，利用(His)₆TAO1(1-416)和(His)₆MEK3进行体外激酶反应；切除57千道尔顿的对应于TAO1的带和30千道尔顿的对应于MEK3的带并如上所述进行处理。通过SDS-PAGE分离磷蛋白，电泳转移到Immobilon-P膜(Millipore)上，并且通过放射自显影观察。切出需要的带，在110℃，在6M HCl中杂交60分钟。在真空下干燥水解产物，再悬浮于2.2％甲酸，12％乙酸溶液，活性为2000cpm/微升。然后，将各1微升样品与各1微克三种磷酸氨基酸标准品混合，点在纤维素薄层层析板上。在0.5％吡啶，5％乙酸中，在1200伏特下进行电泳60分钟。在空气干燥平板后，在丙酮中用 0.25％的茚三酮观察标准品。放射自显影表明了在(His)₆TAO1(1-416)和(His)₆MEK3二者中只有磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸(图11)。

实施例4

共纯化MEK3和TAO1

这一实施例显示了TAO1和MEK3的共纯化。

虽然(His)₆TAO1活化MEK3的能力总是比(His)₆TAO1(1-416)有所减弱，但是几个测定表明在联动激酶测定中，(His)₆TAO1导致P38磷酸化的增强的能力是部分地独立于MEK的加入的。(His)₆TAO1(1-416)不使P38磷酸化。所以，为了确定是否在从Sf9细胞纯化的TAO1制剂中可能存在一种或多种MEK进行了Western分析。

用特异于MEK3,MEK4和MEK6的抗血清对(His)₆TAO1,(His)₆TAO1(1-416)，和(His)₆TAO1(D169A)进行了Western分析。在兔中产生了这三种TAO1肽的四种不同的多克隆抗血清。对应于氨基酸296-315的肽TKDAVRELDNLQYRKMKKLL(SEQ ID NO:23)产生了抗血清P820。氨基酸545到563的肽KKELNSFLESQKREYKLRK(SEQ ID NO:24)产生了抗血清R562。最后，氨基酸829到848的肽RELRELEQRVSLRRALLEQK(SEQ ID NO:25)产生了抗血清R564和R565。这些肽与鲎血蓝蛋白缀合(Boulton和Cobb，细胞调节，2:357-371,1991)，并且透析进入磷酸盐缓冲盐水。总共进行5次加强免疫，然后，将兔放血并且收集血清。通过筛选抗血清在Sf9细胞中表达的重组TAO1的Western印迹的反应性。在Western印迹中发现5种抗血清一致地识别重组TAO1蛋白质。游离肽能够阻断抗血清对TAO1蛋白质的特异性识别。5种抗血清中没有一个检测到293,NIH3T3,NG-108，或COS溶胞产物中存在TAOl。

为了免疫印迹分析，对50纳克重组TAO1蛋白质或100微克溶胞产物进行SDS-PAGE，然后转移到硝酸纤维素膜上。在TBST(20毫摩尔Tris,pH8,500mM NaCl,0.05％吐温20)中用5％无脱脂奶粉封闭膜1小时，然后与多克隆抗血清在TBST加0.25％的牛奶中以1∶500的稀释度温育1小时。在用TBST洗涤3次后，将膜在TBST加0.25％的牛奶中以1∶2500的稀释度稀释辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG温育1小时。在TBST中再次洗涤膜，然后用ECL系统(Amersham)观察。

在(His)₆TAO1制剂中清楚地看到了MEK3，在(His)₆TAO1(D169A)制剂中MEK3的可观察程度较小(图11)。在Sf9溶胞产物中，而不是在TAO1制剂中检测到MEK4，而在前面两者中都没有检测到MEK6。

虽然为了说明，本文在前面已经叙述了本发明的具体实施方案，但应认识到在不背离本发明的精神和范围内可以进行各种改进。

序列表

(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：Cobb,Melanie,Hutchinson,Michele,

Chen,Zhu,

Berman,Kevin

(ⅱ)发明名称：TAO蛋白激酶及其使用方法

(ⅲ)序列的数目：26

(ⅳ)通信地址：

(A)收信人：SEED and BERRY LLP

(B)街道：第5大道701号，哥伦比亚中心6300号

(C)城市：西雅图

(D)州：华盛顿

(E)国家：美国

(F)邮编：98104

(ⅴ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0,#1.30版

(ⅵ)目前申请资料：

(A)申请号：US

(B)申请日：1998年4月14日

(C)分类：

(ⅷ)律师/代理人信息：

(A)姓名：Maki,David J.

(B)登记号：31,392

(C)档案号：860098.421

(ⅸ)电讯信息：

(A)电话：(206)622-4900

(B)电传：(206)682-6031

(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度:3312个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)定位：121.....3123

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:TCTGCAGTAT GGTAGATTAT TATTTATGCA TTTATGCCAG TGTGGCTTCA TTCATACAGA 60TGAACCAAGC TTTGGGATAG CAGTATAAAA TTAGAATCAG ACAGCTGACT GCTCAGCAGG 120ATG CCA TCA ACT AAC AGA GCA GGC AGT CTA AAG GAC CCT GAA ATC GCA 168Met Pro Ser Thr Asn Arg Ala Gly Ser Leu Lys Asp Pro Glu Ile Ala1 5 10 15GAG CTC TTC TTC AAA GAA GAT CCG GAA AAA CTC TTC ACA GAT CTC AGA 216Glu Leu Phe Phe Lys Glu Asp Pro Glu Lys Leu Phe Thr Asp Leu Arg20 25 30GAA ATC GGC CAT GGG AGC TTT GGA GCA GTT TAT TTT GCA CGA GAT GTG 264Glu Ile Gly His Gly Ser Phe Gly Ala Val Tyr Phe Ala Arg Asp Val

35 40 45CGT ACT AAT GAA GTG GTG GCC ATC AAG AAA ATG TCT TAT AGT GGA AAG 312Arg Thr Asn Glu Val Val Ala Ile Lys Lys Met Ser Tyr Ser Gly Lys

50 55 60CAG TCT ACT GAG AAA TGG CAG GAT ATT ATT AAG GAA GTC AAG TTT CTA 360Gln Ser Thr Glu Lys Trp Gln Asp Ile Ile Lys Glu Val Lys Phe Leu65 70 75 80CAA AGA ATA AAA CAT CCC AAC AGT ATA GAA TAC AAA GGC TGC TAT TTA 408Gln Arg Ile Lys His Pro Asn Ser Ile Glu Tyr Lys Gly Cys Tyr Leu

85 90 95CGT GAA CAC ACA GCA TGG CTT GTA ATG GAA TAT TGT TTA GGA TCT GCT 456Arg Glu His Thr Ala Trp Leu Val Met Glu Tyr Cys Leu Gly Ser Ala

100 105 110TCG GAT TTA CTA GAA GTT CAT AAA AAG CCA TTA CAA GAA GTG GAA ATA 504Ser Asp Leu Leu Glu Vaf His Lys Lys Pro Leu Gln Glu Val Glu Ile

115 120 125GCA GCA ATT ACA CAT GGp GCT CTC CAG GGA TTA GCT TAT TTA CAT TCT 552Ala Ala Ile Thr His Gly Ala Leu Gln Gly Leu Ala Tyr Leu His Ser

130 135 140CAT ACC ATG ATC CAT AGA GAT ATC AAA GCA GGA AAT ATC CTT CTG ACA 600His Thr Met Ile His Arg Asp Ile Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Thr145 150 155 160GAA CCA GGC CAA GTG AAA CTT GCT GAC TTT GGA TCT GCT TCC ATG GCC 648Glu Pro Gly Gln Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Ser Ala Ser Met Ala

165 170 175TCC CCT GCC AAT TCT TTT GTG GGA ACA CCA TAT TGG ATG GCC CCA GAA 696Ser Pro Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu

180 185 190GTA ATT TTA GCC ATG GAT GAA GGA CAA TAT GAT GGC AAA GTT GAT GTA 744Val Ile Leu Ala Met Asp Glu Gly Gln Tyr Asp Gly Lys Val Asp Val

195 200 205TGG TCT CTT GGA ATA ACA TGT ATT GAA TTA GCC GAG AGG AAG CCT CCT 792Trp Ser Leu Gly Ile Thr Cys Ile Glu Leu Ala Glu Arg Lys Pro Pro

210 215 220TTA TTT AAT ATG AAT GCA ATG AGT GCC TTA TAT CAC ATA GCC CAA AAT 840Leu Phe Asn Met Asn Ala Met Ser Ala Leu Tyr His Ile Ala Gln Asn225 230 235 240GAA TCC CCT ACA CTA CAG TCT AAT GAA TGG TCT GAT TAT TTT CGA AAC 888Glu Ser Pro Thr Leu Gln Ser Asn Glu Trp Ser Asp Tyr Phe Arg Asn

245 250 255TTT GTA GAT TCT TGC CTC CAG AAA ATC CCT CAA GAT CGC CCT ACA TCA 936Phe Val Asp Ser Cys Leu Gln Lys Ile Pro Gln Asp Arg Pro Thr Ser

260 265 270GAG GAA CTT TTA AAG CAC ATG TTT GTT CTT CGA GAG CGC CCT GAA ACA 984Glu Glu Leu Leu Lys His Met Phe Val Leu Arg Glu Arg Pro Glu Thr

275 280 285GTG TTA ATA GAT CTT ATT CAA AGG ACA AAG GAT GCA GTA AGA GAG CTG 1032Val Leu Ile Asp Leu Ile Gln Arg Thr Lys Asp Ala Val Arg Glu Leu

290 295 300GAC AAT CTA CAA TAT CGA AAG ATG AAG AAA CTC CTT TTC CAG GAG GCA 1080Asp Asn Leu Gln Tyr Arg Lys Met Lys Lys Leu Leu Phe Gln Glu Ala305 310 315 320CAT AAT GGA CCA GCA GTA GAA GCA CAG GAA GAA GAG GAG GAG CAA GAT 1128His Asn Gly Pro Ala Val Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Glu Gln Asp

325 330 335CAT GGT GGT GGC CGG ACA GGA ACA GTA AAT AGT GTT GGA AGC AAT CAG 1176His Gly Gly Gly Arg Thr Gly Thr Val Asn Ser Val Gly Ser Asn Gln

340 345 350TCT ATC CCC AGT ATG TCT ATC AGT GCC AGT AGC CAA AGC AGC AGT GTT 1224Ser Ile Pro Ser Met Ser Ile Ser Ala Ser Ser Gln Ser Ser Ser Val

355 360 365AAT AGT CTT CCA GAT GCA TCG GAT GAC AAG AGT GAG CTA GAC ATG ATG 1272Asn Ser Leu Pro Asp Ala Ser Asp Asp Lys Ser Glu Leu Asp Met Met

370 375 380GAG GGA GAC CAT ACA GTG ATG TCT AAC AGT TCT GTC ATC CAC TTA AAA 1320Glu Gly Asp His Thr Val Met Ser Asn Ser Ser Val Ile His Leu Lys385 390 395 400CCT GAG GAG GAA AAT TAC CAA GAA GAA GGA GAT CCT AGA ACA AGA GCA 1368Pro Glu Glu Glu Asn Tyr Gln Glu Glu Gly Asp Pro Arg Thr Arg Ala

405 410 415TCA GCT CCA CAG TCT CCA CCT CAA GTG TCT CGT CAC AAA TCA CAT TAT 1416Ser Ala Pro Gln Ser Pro Pro Gln Val Ser Arg His Lys Ser His Tyr

420 425 430CGT AAT AGA GAA CAC TTT GCA ACT ATA CGA ACA GCA TCA CTG GTT ACA 1464Arg Asn Arg Glu His Phe Ala Thr Ile Arg Thr Ala Ser Leu Val Thr

435 440 445AGA CAG ATG CAA GAA CAT GAG CAG GAC TCT GAA CTT AGA GAA CAG ATG 1512Arg Gln Met Gln Glu His Glu Gln Asp Ser Glu Leu Arg Glu Gln Met

450 455 460TCT GGT TAT AAG CGG ATG AGG CGA CAG CAT CAG AAG CAG CTG ATG ACT 1560Ser Gly Tyr Lys Arg Met Arg Arg Gln His Gln Lys Gln Leu Met Thr465 470 475 480CTG GAA AAT AAA CTG AAG GCA GAA ATG GAC GAA CAT CGG CTC AGA TTA 1608Leu Glu Asn Lys Leu Lys Ala Glu Met Asp Glu His Arg Leu Arg Leu

485 490 495GAC AAA GAT CTT GAA ACT CAG CGC AAC AAT TTC GCT GCA GAA ATG GAG 1656Asp Lys Asp Leu Glu Thr Gln Arg Asn Asn Phe Ala Ala Glu Met Glu

500 505 510AAA CTT ATT AAG AAA CAC CAA GCT TCT ATG GAA AAA GAG GCT AAA GTG 1704Lys Leu Ile Lys Lys His Gln Ala Ser Met Glu Lys Glu Ala Lys Val

515 520 525ATG GCC AAC GAG GAG AAA AAA TTC CAA CAA CAC ATT CAG GCT CAA CAG 1752Met Ala Asn Glu Glu Lys Lys Phe Gln Gln His Ile Gln Ala Gln Gln

530 535 540AAG AAA GAA CTG AAT AGC TTT TTG GAG TCT CAA AAA AGA GAA TAT AAA 1800Lys Lys Glu Leu Asn Ser Phe Leu Glu Ser Gln Lys Arg Glu Tyr Lys545 550 555 560CTT CGA AAA GAG CAG CTT AAG GAG GAG CTG AAT GAA AAC CAG AGC ACA 1848Leu Arg Lys Glu Gln Leu Lys Glu Glu Leu Asn Glu Asn Gln Ser Thr

565 570 575CCT AAA AAA GAA AAG CAG GAA TGG CTT TCA AAG CAG AAG GAG AAT ATT 1896Pro Lys Lys Glu Lys Gln Glu Trp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Asn Ile

580 585 590CAA CAT TTT CAG GCA GAA GAA GAA GCT AAT CTT CTT CGA CGT CAA AGG 1944Gln His Phe Gln Ala Glu Glu Glu Ala Asn Leu Leu Arg Arg Gln Arg

595 600 605CAG TAT CTA GAG CTA GAA TGT CGT CGC TTC AAA AGA AGA ATG TTA CTT 1992Gln Tyr Leu Glu Leu Glu Cys Arg Arg Phe Lys Arg Arg Met Leu Leu

610 615 620GGT CGG CAT AAC TTG GAA CAG GAC CTT GTC AGG GAG GAG TTA AAC AAA 2040Gly Arg His Asn Leu Glu Gln Asp Leu Val Arg Glu Glu Leu Asn Lys625 630 635 640AGG CAG ACT CAG AAG GAC TTA GAA CAT GCA ATG TTA CTG CGA CAG CAT 2088Arg Gln Thr Gln Lys Asp Leu Glu His Ala Met Leu Leu Arg Gln His

645 650 655GAA TCC ATG CAA GAA CTG GAG TTT CGC CAC CTC AAC ACT ATT CAG AAG 2136Glu Ser Met Gln Glu Leu Glu Phe Arg His Leu Asn Thr Ile Gln Lys

660 665 670ATG CGC TGT GAG TTG ATC AGA CTG CAA CAT CAA ACT GAG CTT ACT AAC 2184Met Arg Cys Glu Leu Ile Arg Leu Gln His Gln Thr Glu Leu Thr Asn

675 680 685CAG CTG GAA TAC AAT AAG AGA AGG GAA CGG GAA CTA AGA CGG AAA CAT 2232Gln Leu Glu Tyr Asn Lys Arg Arg Glu Arg Glu Leu Arg Arg Lys His

690 695 700GTC ATG GAA GTT CGA CAG CAG CCT AAG AGT TTG AAG TCT AAA GAA CTC 2280Val Met Glu Val Arg Gln Gln Pro Lys Ser Leu Lys Ser Lys Glu Leu705 710 715 720CAA ATA AAA AAG CAG TTT CAG GAT ACC TGC AAA ATT CAA ACC AGA CAG 2328Gln Ile Lys Lys Gln Phe Gln Asp Thr Cys Lys Ile Gln Thr Arg Gln

725 730 735TAC AAA GCA TTA AGG AAT CAC CTA CTG GAG ACT ACA CCA AAG AGT GAG 2376Tyr Lys Ala Leu Arg Asn His Leu Leu Glu Thr Thr Pro Lys Ser Glu

740 745 750CAC AAA GCT GTT CTG AAA AGA CTC AAG GAG GAA CAG ACT CGG AAG TTA 2424His Lys Ala Val Leu Lys Arg Leu Lys Glu Glu Gln Thr Arg Lys Leu

755 760 765GCC ATC TTG GCT GAG CAG TAT GAT CAT AGC ATT AAT GAA ATG CTC TCC 2472Ala Ile Leu Ala Glu Gln Tyr Asp His Ser Ile Asn Glu Met Leu Ser

770 775 780ACA CAA GCT CTG CGT TTG GAT GAA GCA CAG GAA GCA GAA TGC CAG GTT 2520Thr Gln Ala Leu Arg Leu Asp Glu Ala Gln Glu Ala Glu Cys Gln Val785 790 795 800TTG AAG ATG CAG CTA CAG CAG GAA CTG GAG CTG TTG AAT GCA TAT CAG 2568Leu Lys Met Gln Leu Gln Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Ala Tyr Gln

805 810 815AGC AAA ATC AAG ATG CAG GCT GAG GCC CAA CAT GAT CGA GAG CTT CGA 2616Ser Lys Ile Lys Met Gln Ala Glu Ala Gln His Asp Arg Glu Leu Arg

820 825 830GAG CTG GAA CAA AGG GTC TCC CTT CGG AGA GCA CTC TTA GAA CAG AAG 2664Glu Leu Glu Gln Arg Val Ser Leu Arg Arg Ala Leu Leu Glu Gln Lys

835 840 845ATT GAA GAA GAG ATG TTG GCT TTG CAG AAT GAA CGC ACA GAA CGA ATA 2712Ile Glu Glu Glu Met Leu Ala Leu Gln Asn Glu Arg Thr Glu Arg Ile

850 855 860CGT AGC CTG CTC GAG CGC CAG GCC AGA GAA ATT GAA GCT TTT GAC TCT 2760Arg Ser Leu Leu Glu Arg Gln Ala Arg Glu Ile Glu Ala Phe Asp Ser865 870 875 880GAA AGC ATG AGA TTA GGT TTT AGT AAC ATG GTC CTT TCT AAT CTC TCC 2808Glu Ser Met Arg Leu Gly Phe Ser Asn Met Val Leu Ser Asn Leu Ser

885 890 895CCT GAG GCA TTC AGC CAC AGC TAC CCA GGA GCT TCT AGC TGG TCT CAC 2856Pro Glu Ala Phe Ser His Ser Tyr Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ser His

900 905 910AAT CCT ACT GGG GGT TCA GGA CCT CAC TGG GGT CAT CCC ATG GGT GGC 2904Asn Pro Thr Gly Gly Ser Gly Pro His Trp Gly His Pro Met Gly Gly

915 920 925ACA CCA CAA GCT TGG-GGT CAT CCG ATG CAA GGC GGA CCC CAA CCA TGG 2952Thr Pro Gln Ala Trp Gly His Pro Met Gln Gly Gly Pro Gln Pro Trp

930 935 940GGT CAC CCC TCA GGG CCA ATG CAA GGG GTA CCT CGA GGT AGC AGT ATA 3000Gly His Pro Ser Gly Pro Met Gln Gly Val Pro Arg Gly Ser Ser Ile945 950 955 960GGA GTC CGC AAT AGC CCC CAG GCT CTG AGG CGG ACA GCT TCT GGG GGA 3048Gly Val Arg Asn Ser Pro Gln Ala Leu Arg Arg Thr Ala Ser Gly Gly

965 970 975CGG ACG GAA CAG GGC ATG AGC AGA AGC ACG AGT GTC ACT TCA CAA ATA 3096Arg Thr Glu Gln Gly Met Ser Arg Ser Thr Ser Val Thr Ser Gln Ile

980 985 990TCC AAT GGG TCA CAC ATG TCT TAC ACA TAATAATTGA AAGTGGCAAT 3143Ser Asn Gly Ser His Met Ser Tyr Thr

995 1000TCCGCTGGAG CTGTCTGCCA AAAGAAACTG CCTACAGACA TCAGCACAGC AGCCTCCTCA 3203CTTGGGTACT ACCGGGTGGA AGCTGTGCAT ATGGTATATT TTATTCGTCT TTGTAAAGCG 3263TTATGTTTTG TGTTTACTAA TTGGGATGTC ATAGTATTTG GCTGCCGGG 3312

(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1001氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Pro Ser Thr Asn Arg Ala Gly Ser Leu Lys Asp Pro Glu Ile Ala1 5 10 15Glu Leu Phe Phe Lys Glu Asp Pro Glu Lys Leu Phe Thr Asp Leu Arg

20 25 30Glu Ile Gly His Gly Ser Phe Gly Ala Val Tyr Phe Ala Arg Asp Val

35 40 45Arg Thr Asn Glu Val Val Ala Ile Lys Lys Met Ser Tyr Ser Gly Lys

50 55 60Gln Ser Thr Glu Lys Trp Gln Asp Ile Ile Lys Glu Val Lys Phe Leu65 70 75 80Gln Arg Ile Lys His Pro Asn Ser Ile Glu Tyr Lys Gly Cys Tyr Leu

85 90 95Arg Glu His Thr Ala Trp Leu Val Met Glu Tyr Cys Leu Gly Ser Ala

100 105 110Ser Asp Leu Leu Glu Val His Lys Lys Pro Leu Gln Glu Val Glu Ile

115 120 125Ala Ala Ile Thr His Gly Ala Leu Gln Gly Leu Ala Tyr Leu His Ser

130 135 140His Thr Met Ile His Arg Asp Ile Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Thr145 150 155 160Glu Pro Gly Gln Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Ser Ala Ser Met Ala

165 170 175Ser Pro Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu

180 185 190Val Ile Leu Ala Met Asp Glu Gly Gln Tyr Asp Gly Lys Val Asp Val

195 200 205Trp Ser Leu Gly Ile Thr Cys Ile Glu Leu Ala Glu Arg Lys Pro Pro

210 215 220Leu Phe Asn Met Asn Ala Met Ser Ala Leu Tyr His Ile Ala Gln Asn225 230 235 240Glu Ser Pro Thr Leu Gln Ser Asn Glu Trp Ser Asp Tyr Phe Arg Asn

245 250 255Phe Val Asp Ser Cys Leu Gln Lys Ile Pro Gln Asp Arg Pro Thr Ser

260 265 270Glu Glu Leu Leu Lys His Met Phe Val Leu Arg Glu Arg Pro Glu Thr

275 280 285Val Leu Ile Asp Leu Ile Gln Arg Thr Lys Asp Ala Val Arg Glu Leu

290 295 300Asp Asn Leu Gln Tyr Arg Lys Met Lys Lys Leu Leu Phe Gln Glu Ala305 310 315 320His Asn Gly Pro Ala Val Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Glu Gln Asp

325 330 335His Gly Gly Gly Arg Thr Gly Thr Val Asn Ser Val Gly Ser Asn Gln

340 345 350Ser Ile Pro Ser Met Ser Ile Ser Ala Ser Ser Gln Ser Ser Ser Val

355 360 365Asn Ser Leu Pro Asp Ala Ser Asp Asp Lys Ser Glu Leu Asp Met Met

370 375 380Glu Gly Asp His Thr Val Met Ser Asn Ser Ser Val Ile His Leu Lys385 390 395 400Pro Glu Glu Glu Asn Tyr Gln Glu Glu Gly Asp Pro Arg Thr Arg Ala

405 410 415Ser Ala Pro Gln Ser Pro Pro Gln Val Ser Arg His Lys Ser His Tyr

420 425 430Arg Asn Arg Glu His Phe Ala Thr Ile Arg Thr Ala Ser Leu Val Thr

435 440 445Arg Gln Met Gln Glu His Glu Gln Asp Ser Glu Leu Arg Glu Gln Met

450 455 460Ser Gly Tyr Lys Arg Met Arg Arg Gln His Gln Lys Gln Leu Met Thr465 470 475 480Leu Glu Asn Lys Leu Lys Ala Glu Met Asp Glu His Arg Leu Arg Leu

485 490 495Asp Lys Asp Leu Glu Thr Gln Arg Asn Asn Phe Ala Ala Glu Met Glu

500 505 510Lys Leu Ile Lys Lys His Gln Ala Ser Met Glu Lys Glu Ala Lys Val

515 520 525Met Ala Asn Glu Glu Lys Lys Phe Gln Gln His Ile Gln Ala Gln Gln

530 535 540Lys Lys Glu Leu Asn Ser Phe Leu Glu Ser Gln Lys Arg Glu Tyr Lys545 550 555 560Leu Arg Lys Glu Gln Leu Lys Glu Glu Leu Asn Glu Asn Gln Ser Thr

565 570 575Pro Lys Lys Glu Lys Gln Glu Trp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Asn Ile

580 585 590Gln His Phe Gln Ala Glu Glu Glu Ala Asn Leu Leu Arg Arg Gln Arg

595 600 605Gln Tyr Leu Glu Leu Glu Cys Arg Arg Phe Lys Arg Arg Met Leu Leu

610 615 620Gly Arg His Asn Leu Glu Gln Asp Leu Val Arg Glu Glu Leu Asn Lys625 630 635 640Arg Gln Thr Gln Lys Asp Leu Glu His Ala Met Leu Leu Arg Gln His

645 650 655Glu Ser Met Gln Glu Leu Glu Phe Arg His Leu Asn Thr Ile Gln Lys

660 665 670Met Arg Cys Glu Leu Ile Arg Leu Gln His Gln Thr Glu Leu Thr Asn

675 680 685Gln Leu Glu Tyr Asn Lys Arg Arg Glu Arg Glu Leu Arg Arg Lys His

690 695 700Val Met Glu Val Arg Gln Gln Pro Lys Ser Leu Lys Ser Lys Glu Leu705 710 715 720Gln Ile Lys Lys Gln Phe Gln Asp Thr Cys Lys Ile Gln Thr Arg Gln

725 730 735Tyr Lys Ala Leu Arg Asn His Leu Leu Glu Thr Thr Pro Lys Ser Glu

740 745 750His Lys Ala Val Leu Lys Arg Leu Lys Glu Glu Gln Thr Arg Lys Leu

755 760 765Ala Ile Leu Ala Glu Gln Tyr Asp His Ser Ile Asn Glu Met Leu Ser

770 775 780Thr Gln Ala Leu Arg Leu Asp Glu Ala Gln Glu Ala Glu Cys Gln Val785 790 795 800Leu Lys Met Gln Leu Gln Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Ala Tyr Gln

805 810 815Ser Lys Ile Lys Met Gln Ala Glu Ala Gln His Asp Arg Glu Leu Arg

820 825 830Glu Leu Glu Gln Arg Val Ser Leu Arg Arg Ala Leu Leu Glu Gln Lys

835 840 845Ile Glu Glu Glu Met Leu Ala Leu Gln Asn Glu Arg Thr Glu Arg Ile

850 855 860Arg Ser Leu Leu Glu Arg Gln Ala Arg Glu Ile Glu Ala Phe Asp Ser865 870 875 880Glu Ser Met Arg Leu Gly Phe Ser Asn Met Val Leu Ser Asn Leu Ser

885 890 895Pro Glu Ala Phe Ser His Ser Tyr Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ser His

900 905 910Asn Pro Thr Gly Gly Ser Gly Pro His Trp Gly His Pro Met Gly Gly

915 920 925Thr Pro Gln Ala Trp Gly His Pro Met Gln Gly Gly Pro Gln Pro Trp

930 935 940Gly His Pro Ser Gly Pro Met Gln Gly Val Pro Arg Gly Ser Ser Ile945 950 955 960Gly Val Arg Asn Ser Pro Gln Ala Leu Arg Arg Thr Ala Ser Gly Gly

965 970 975Arg Thr Glu Gln Gly Met Ser Arg Ser Thr Ser Val Thr Ser Gln Ile

980 985 990Ser Asn Gly Ser His Met Ser Tyr Thr

995 1000

(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：4296个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)定位：193.....3171

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:AGGGGAGGCT TCCCGGGCCC GCCCCTCAGG AAGGGCGAAA GCTGAGGAAG AGGTGGCGAG 60GGGGAAGGTC TCCTTGCCCC TCTCCCCGCT TGTCAGAGCA ACTGGAGTAC CCCAGGCGGA 120AGCGGAGGCG CTGGGGCACC ATAGTGACCC CTACCAGGCA AGATCCCAAT TTCAGGGCCC 180CCAGGGGCCA TC ATG CCA GCT GGG GGC CGG GCC GGG AGC CTG AAG GAC 228

Met Pro Ala Gly Gly Arg Ala Gly Ser Leu Lys Asp

1 5 10CCT GAT GTA GCT GAG CTC TTC TTC AAA GAT GAC CCT GAG AAG CTT TTC 276Pro Asp Val Ala Glu Leu Phe Phe Lys Asp Asp Pro Glu Lys Leu Phe

15 20 25TCT GAC CTC CGG GAA ATT GGC CAT GGC AGT TTT GGA GCT GTG TAC TTT 324Ser Asp Leu Arg Glu Ile Gly His Gly Ser Phe Gly Ala Val Tyr Phe

30 35 40GCC CGG GAT GTC CGG AAC AGT GAG GTG GTG GCC ATC AAG AAG ATG TCC 372Ala Arg Asp Val Arg Asn Ser Glu Val Val Ala Ile Lys Lys Met Ser45 50 55 60TAT AGT GGG AAG CAA TCA AAT GAG AAA TGG CAG GAT ATC ATC AAG GAG 420Tyr Ser Gly Lys Gln Ser Asn Glu Lys Trp Gln Asp Ile Ile Lys Glu

65 70 75GTG CGG TTC TTA CAG AAG CTA CGG CAT CCT AAT ACC ATT CAG TAC CGG 468Val Arg Phe Leu Gln Lys Leu Arg His Pro Asn Thr Ile Gln Tyr Arg

80 85 90GGC TGT TAC CTG AGG GAG CAC ACA GCT TGG CTG GTG ATG GAG TAT TGC 516Gly Cys Tyr Leu Arg Glu His Thr Ala Trp Leu Val Met Glu Tyr Cys

95 100 105CTG GGT TCA GCT TCT GAT CTT CTC GAA GTG CAC AAG AAG CCG CTG CAG 564Leu Gly Ser Ala Ser Asp Leu Leu Glu Val His Lys Lys Pro Leu Gln

110 115 120GAG GTA GAG ATT GCA GCT GTG ACC CAT GGT GCG CTT CAG GGC CTG GCC 612Glu Val Glu Ile Ala Ala Val Thr His Gly Ala Leu Gln Gly Leu Ala125 130 135 140TAT CTA CAT TCA CAC AAC ATG ATC CAT AGA GAT GTG AAG GCT GGG AAC 660Tyr Leu His Ser His Asn Met Ile His Arg Asp Val Lys Ala Gly Asn

145 150 155ATC TTG CTG TCA GAA CCA GGC TTG GTG AAA CTG GGG GAC TTT GGC TCC 708Ile Leu Leu Ser Glu Pro Gly Leu Val Lys Leu Gly Asp Phe Gly Ser

160 165 170GCA TCC ATC ATG GCA CCT GCC AAC TCA TTT GTG GGC ACT CCA TAC TGG 756Ala Ser Ile Met Ala Pro Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Pro Tyr Trp

175 180 185ATG GCT CCA GAG GTG ATC CTA GCC ATG GAT GAG GGA CAA TAT GAT GGC 804Met Ala Pro Glu Val Ile Leu Ala Met Asp Glu Gly Gln Tyr Asp Gly

190 195 200AAA GTG GAT GTC TGG TCC TTG GGG ATA ACC TGT ATT GAG CTA GCG GAG 852Lys Val Asp Val Trp Ser Leu Gly Ile Thr Cys Ile Glu Leu Ala Glu205 210 215 220CGG AAG CCA CCA CTG TTT AAC ATG AAT GCA ATG AGT GCC TTA TAC CAC 900Arg Lys Pro Pro Leu Phe Asn Met Asn Ala Met Ser Ala Leu Tyr His

225 230 235ATT GCA CAG AAT GAA TCC CCT GCT CTC CAG TCA GGA CAC TGG TCT GAG 948Ile Ala Gln Asn Glu Ser Pro Ala Leu Gln Ser Gly His Trp Ser Glu

240 245 250TAC TTC CGG AAT TTT GTT GAC TCC TGT CTT CAG AAA ATC CCT CAA GAC 996Tyr Phe Arg Asn Phe Val Asp Ser Cys Leu Gln Lys Ile Pro Gln Asp

255 260 265AGA CCA ACC TCA GAG GTT CTT TTG AAG CAC CGC TTT GTG CTC CGG GAG 1044Arg Pro Thr Ser Glu Val Leu Leu Lys His Arg Phe Val Leu Arg Glu

270 275 280CGG CCA CCC ACA GTC ATC ATG GAC CTA ATT CAG AGG ACC AAG GAT GCT 1092Arg Pro Pro Thr Val Ile Met Asp Leu Ile Gln Arg Thr Lys Asp Ala285 290 295 300GTA CGG GAA CTA GAT AAC CTG CAG TAC CGA AAG ATG AAG AAG ATA CTA 1140Val Arg Glu Leu Asp Asn Leu Gln Tyr Arg Lys Met Lys Lys Ile Leu

305 310 315TTC CAA GAG GCA CCC AAT GGC CCT GGT GCT GAG GCC CCA GAG GAA GAG 1188Phe Gln Glu Ala Pro Asn Gly Pro Gly Ala Glu Ala Pro Glu Glu Glu

320 325 330GAG GAA GCA GAA CCT TAC ATG CAC CGA GCA GGG ACA CTG ACC AGT CTA 1236Glu Glu Ala Glu Pro Tyr Met His Arg Ala Gly Thr Leu Thr Ser Leu

335 340 345GAG AGT AGC CAT TCA GTG CCC AGC ATG TCC ATC AGC GCC TCC AGC CAA 1284Glu Ser Ser His Ser Val Pro Ser Met Ser Ile Ser Ala Ser Ser Gln

350 355 360AGC AGC TCA GTC AAC AGC CTA GCA GAT GCC TCA GAT AAT GAA GAA GAG 1332Ser Ser Ser Val Asn Ser Leu Ala Asp Ala Ser Asp Asn Glu Glu Glu365 370 375 380GAG GAG GAG GAA GAG GAA GAA GAA GAG GAG GAG GAA GAA GAA GGC CCT 1380Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Pro

385 390 395GAA TCC CGA GAG ATG GCC ATG ATG CAG GAG GGG GAG CAT ACA GTC ACT 1428Glu Ser Arg Glu Met Ala Met Met Gln Glu Gly Glu His Thr Val Thr

400 405 410TCC CAC AGC TCC ATC ATC CAC CGG CTG CCG GGC TCA GAC AAC CTA TAT 1476Ser His Ser Ser Ile Ile His Arg Leu Pro Gly Ser Asp Asn Leu Tyr

415 420 425GAT GAT CCC TAC CAG CCA GAG ATG ACC CCA GGT CCA CTC CAA CCA CCT 1524Asp Asp Pro Tyr Gln Pro Glu Met Thr Pro Gly Pro Leu Gln Pro Pro

430 435 440GCA GCC CCT CCC ACC TCC ACC TCC TCC TCT TCT GCT CGC CGC AGA GCT 1572Ala Ala Pro Pro Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Arg Arg Arg Ala445 450 455 460TAT TGC CGC AAC CGA GAC CAC TTT GCC ACC ATC CGT ACT GCC TCC CTG 1620Tyr Cys Arg Asn Arg Asp His Phe Ala Thr Ile Arg Thr Ala Ser Leu

465 470 475GTC AGC CGT CAG ATC CAG GAG CAT GAG CAG GAC TCG GCC CTG CGG GAG 1668Val Ser Arg Gln Ile Gln Glu His Glu Gln Asp Ser Ala Leu Arg Glu

480 485 490CAA CTA AGT GGC TAC AAG CGG ATG CGG CGT CAG CAC CAG AAG CAA CTG 1716Gln Leu Ser Gly Tyr Lys Arg Met Arg Arg Gln His Gln Lys Gln Leu

495 500 505CTG GCC CTG GAG TCC CGT CTG AGG GGT GAA CGT GAG GAG CAC AGT GGG 1764Leu Ala Leu Glu Ser Arg Leu Arg Gly Glu Arg Glu Glu His Ser Gly

510 515 520CGG TTG CAG CGT GAA CTC GAG GCA CAG CGG GCT GGC TTT GGG ACT GAG 1812Arg Leu Gln Arg Glu Leu Glu Ala Gln Arg Ala Gly Phe Gly Thr Glu525 530 535 540GCT GAG AAG CTG GCC CGG AGG CAC CAG GCC ATT GGT GAG AAG GAA GCA 1860Ala Glu Lys Leu Ala Arg Arg His Gln Ala Ile Gly Glu Lys Glu Ala

545 550 555CGA GCT GCT CAG GCT GAG GAG CGG AAG TTC CAG CAG CAC ATC TTG GGG 1908Arg Ala Ala Gln Ala Glu Glu Arg Lys Phe Gln Gln His Ile Leu Gly

560 565 570CAG CAG AAG AAG GAA CTG GCT GCC CTG CTG GAG GCA CAG AAG CGA ACC 1956Gln Gln Lys Lys Glu Leu Ala Ala Leu Leu Glu Ala Gln Lys Arg Thr

575 580 585TAT AAG CTT CGG AAG GAG CAG TTG AAA GAG GAG CTC CAG GAG AAC CCT 2004Tyr Lys Leu Arg Lys Glu Gln Leu Lys Glu Glu Leu Gln Glu Asn Pro

590 595 600AGC ACA CCC AAA CGA GAG AAG GCT GAG TGG CTG TTG AGG CAG AAA GAG 2052Ser Thr Pro Lys Arg Glu Lys Ala Glu Trp Leu Leu Arg Gln Lys Glu605 610 615 620CAG TTG CAA CAG TGC CAG GCA GAG GAG GAG GCA GGG CTA CTG CGG AGG 2100Gln Leu Gln Gln Cys Gln Ala Glu Glu Glu Ala Gly Leu Leu Arg Arg

625 630 635CAA CGC CAG TAC TTT GAG CTT CAG TGT CGC CAA TAC AAG CGC AAG ATG 2148Gln Arg Gln Tyr Phe Glu Leu Gln Cys Arg Gln Tyr Lys Arg Lys Met

640 645 650CTA CTG GCT CGG CAC AGC CTA GAC CAG GAC CTG CTT CGA GAG GAC TTG 2196Leu Leu Ala Arg His Ser Leu Asp Gln Asp Leu Leu Arg Glu Asp Leu

655 660 665AAT AAG AAA CAG ACA CAG AAG GAC TTG GAG TGT GCT CTG CTG TTA CGG 2244Asn Lys Lys Gln Thr Gln Lys Asp Leu Glu Cys Ala Leu Leu Leu Arg

670 675 680CAG CAT GAG GCT ACC CGA GAG CTG GAG CTA CGA CAG CTC CAG GCT GTC 2292Gln His Glu Ala Thr Arg Glu Leu Glu Leu Arg Gln Leu Gln Ala Val685 690 695 700CAG CGC ACA CGT GCT GAA CTC ACC CGC CTT CAG CAC CAG ACA GAG CTA 2340Gln Arg Thr Arg Ala Glu Leu Thr Arg Leu Gln His Gln Thr Glu Leu

705 710 715GGC AAC CAG TTG GAG TAC AAC AAG CGA CGG GAG CAA GAG TTG CGG CAG 2388Gly Asn Gln Leu Glu Tyr Asn Lys Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln

720 725 730AAG CAC GCG GCC CAG GTT CGC CAG CAG CCC AAG AGC CTC AAA GTA CGT 2436Lys His Ala Ala Gln Val Arg Gln Gln Pro Lys Ser Leu Lys Val Arg

735 740 745GCA GGC CAG CTA CCC ATG GGC CTC CCT GCT ACC GGG GCT CTG GGA CCA 2484Ala Gly Gln Leu Pro Met Gly Leu Pro Ala Thr Gly Ala Leu Gly Pro

750 755 760CTC AGC ACA GGC ACC CTT AGT GAA GAG CAG CCC TGC TCA TCT GGC CAG 2532Leu Ser Thr Gly Thr Leu Ser Glu Glu Gln Pro Cys Ser Ser Gly Gln765 770 775 780GAG GCA ATC CTG GGC CAA AGG ATG CTG GGA GAG GAG GAG GAA GCA GTG 2580Glu Ala Ile Leu Gly Gln Arg Met Leu Gly Glu Glu Glu Glu Ala Val

785 790 795CCA GAG AGA ATG ATT CIG GGA AAG GAA GGG ACT ACT TTG GAG CCA GAG 2628Pro Glu Arg Met Ile Leu Gly Lys Glu Gly Thr Thr Leu Glu Pro Glu

800 805 810GAG CAG AGG ATT CTG GGG GAA GAA ATG GGA ACC TTT AGT TCC AGC CCA 2676Glu Gln Arg Ile Leu Gly Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Ser Ser Pro

815 820 825CAA AAA CAT AGG AGT CTG GTT AAT GAG GAA GAT TGG GAT ATA TCT AAA 2724Gln Lys His Arg Ser Leu Val Asn Glu Glu Asp Trp Asp Ile Ser Lys

830 835 840GAA ATG AAG GAG AGT AGA GTC CCA TCC CTG GCA TCC CAG GAG AGA AAT 2772Glu Met Lys Glu Ser Arg Val Pro Ser Leu Ala Ser Gln Glu Arg Asn845 850 855 860ATT ATT GGC CAG GAA GAG GCT GGG GCA TGG AAT CTG TGG GAG AAG GAG 2820Ile Ile Gly Gln Glu Glu Ala Gly Ala Trp Asn Leu Trp Glu Lys Glu

865 870 875CAT GGA AAC CTT GTG GAT ATG GAG TTC AAG CTT GGC TGG GTC CAG GGT 2868His Gly Asn Leu Val Asp Met Glu Phe Lys Leu Gly Trp Val Gln Gly

880 885 890CCA GTT CTG ACT CCA GTG CCT GAG GAG GAA GAG GAG GAG GAA GAG GAG 2916Pro Val Leu Thr Pro Val Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

895 900 905GGA GGG GCT CCA ATT GGA ACC CCC AGG GAC CCT GGA GAT GGC TGT CCT 2964Gly Gly Ala Pro Ile Gly Thr Pro Arg Asp Pro Gly Asp Gly Cys Pro

910 915 920TCC CCA GAT ATC CCC CCA GAG CCA CCT CCA TCA CAT CTG AGA CAG TAC 3012Ser Pro Asp Ile Pro Pro Glu Pro Pro Pro Ser His Leu Arg Gln Tyr925 930 935 940CCT GCT AGC CAG CTT CCT GGA TTC TTG TCT CAT GGC CTC CTG ACT GGC 3060Pro Ala Ser Gln Leu Pro Gly Phe Leu Ser His Gly Leu Leu Thr Gly

945 950 955CTC TCC TTT GCA GTG GGG TCC TCC TCT GGC CTC TTG CCC CTA CTA CTT 3108Leu Ser Phe Ala Val Gly Ser Ser Ser Gly Leu Leu Pro Leu Leu Leu

960 965 970CTG CTG CTA CTC CCA TTG CTG GCA CCC AGG TGG AGG TGG CTT GCA GGC 3156Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Pro Arg Trp Arg Trp Leu Ala Gly

975 980 985AGC ACT GCT GGC CCT T GAGGTAGGAC TAGTGGGCCT GGGGGCTTCA 3202Ser Thr Ala Gly Pro

990TACCTGTTCC TTTGTACAGC TCTACACCTG CCACCCAGTC TGTTCTTACT CCTGGCTCAG 3262GGCACTGCAC TGGGGGCTGT CCTTAGCCTG AGCTGGCGCA GAGGCCTTAT GGGTGTGCCT 3322CTGGGCCTTG GGGCTGCCTG GCTCCTAGCT TGGCCCAGCC TGGCTTTACC TCTGGCAGCT 3382ATGGCGGCTG GGGGCAAATG GGTACGGCAG CAAGGCCCCC AGATGCGTCG GGGCATCTCT 3442CGACTCTGGT TGCGGGTTCT GCTACGCCTG TCACCCATGG TCTTTCGGGC CCTACAGGGC 3502TGTGCGGCTG TGGGAGACCG GGGGCTGTTT GCCCTGTACC CTAAGACCAA TAAGAATGGT 3562TTCCGAAGTC GACTGCCTGT CCCTTGGCCC CGTCAGGGAA ATCCTCGCAC TACACAGCAC 3622CCACTAGCTC TGTTAGCAAG AGTTTGGGCT CTGTGCAAGG GCTGGAACTG GCGCCTAGCA 3682CGGGCTAGCC ATAGATTAGC TTCTTGTTTG CCCCCCTGGG CTGTTCATAT ACTAGCTAGC 3742TGGGGCCTGC TTAAGGGTGA AAGGCCCAGT CGGATCCCTC GGCTGCTACC GCGAAGCCAA 3802CGCCGTCTTG GGCTCTCAGC TTCCCGACAG CTACCACCAG GGACTGTAGC TGGGCGGAGA 3862TCTCAGACCC GCAGGGCCCT GCCTCCCTGG AGGTAACCAG TTCTAACCCT CCACCCAAAT 3922TTAGGGCATT GAGCACTTTA TCTCCCATGA CTCAGTAAAG TCTCTCCAGT CCCTTGGCCT 3982CTCCTCCCCT TCTGACCTTT CTTCCTCAGT ATGTTTCCCC AGGTCCAATC CCAGCCCCAG 4042ATGTAGATTT CTAGACAGGC AGCCTCCTCT ACTGTGGAGT CCAGAATGAC ACTCTTGTGT 4102TTTCCCCAGT CCCCTAAGTT ATTGCTGTCC CCTGCTGTGT GTGTGCTCAT CCTCACCCTC 4162ATCGGCTCAG GCCTGGGGCC AGGGGTGGCA GGGAGGGAAG TCATGGGGGT TTTCCCTCTT 4222TGATTTTGTT TTTCTGTCTC CCTTCCAACC TGTCCCCTTC CCCTCCACCA AAAGAGAAAA 4282AAAAAAAAAA AAAA 4296

(2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：993个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4Met Pro Ala Gly Gly Arg Ala Gly Ser Leu Lys Asp Pro Asp Val Ala1 5 10 15Glu Leu Phe Phe Lys Asp Asp Pro Glu Lys Leu Phe Ser Asp Leu Arg

20 25 30Glu Ile Gly His Gly Ser Phe Gly Ala Val Tyr Phe Ala Arg Asp Val

35 40 45Arg Asn Ser Glu Val Val Ala Ile Lys Lys Met Ser Tyr Ser Gly Lys

50 55 60Gln Ser Asn Glu Lys Trp Gln Asp Ile Ile Lys Glu Val Arg Phe Leu65 70 75 80Gln Lys Leu Arg His Pro Asn Thr Ile Gln Tyr Arg Gly Cys Tyr Leu

85 90 95Arg Glu His Thr Ala Trp Leu Val Met Glu Tyr Cys Leu Gly Ser Ala

100 105 110Ser Asp Leu Leu Glu Val His Lys Lys Pro Leu Gln Glu Val Glu Ile

115 120 125Ala Ala Val Thr His Gly Ala Leu Gln Gly Leu Ala Tyr Leu His Ser

130 135 140His Asn Met Ile His Arg Asp Val Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Ser145 150 155 160Glu Pro Gly Leu Val Lys Leu Gly Asp Phe Gly Ser Ala Ser Ile Met

165 170 175Ala Pro Ala Asn Ser phe Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu

180 185 190Val Ile Leu Ala Met Asp Glu Gly Gln Tyr Asp Gly Lys Val Asp Val

195 200 205Trp Ser Leu Gly Ile Thr Cys Ile Glu Leu Ala Glu Arg Lys Pro Pro

210 215 220Leu Phe Asn Met Asn Ala Met Ser Ala Leu Tyr His Ile Ala Gln Asn225 230 235 240Glu Ser Pro Ala Leu Gln Ser Gly His Trp Ser Glu Tyr Phe Arg Asn

245 250 255Phe Val Asp Ser Cys Leu Gln Lys Ile Pro Gln Asp Arg Pro Thr Ser

260 265 270Glu Val Leu Leu Lys His Arg Phe Val Leu Arg Glu Arg Pro Pro Thr

275 280 285Val Ile Met Asp Leu Ile Gln Arg Thr Lys Asp Ala Val Arg Glu Leu

290 295 300Asp Asn Leu Gln Tyr Arg Lys Met Lys Lys Ile Leu Phe Gln Glu Ala305 310 315 320Pro Asn Gly Pro Gly Ala Glu Ala Pro Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu

325 330 335Pro Tyr Met His Arg Ala Gly Thr Leu Thr Ser Leu Glu Ser Ser His

340 345 350Ser Val Pro Ser Met Ser Ile Ser Ala Ser Ser Gln Ser Ser Set Val

355 360 365Asn Ser Leu Ala Asp Ala Ser Asp Asn Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

370 375 380Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Pro Glu Ser Arg Glu385 390 395 400Met Ala Met Met Gln Glu Gly Glu His Thr Val Thr Ser His Ser Ser

405 410 415Ile Ile His Arg Leu Pro Gly Ser Asp Asn Leu Tyr Asp Asp Pro Tyr

420 425 430Gln Pro Glu Met Thr Pro Gly Pro Leu Gln Pro Pro Ala Ala Pro Pro

435 440 445Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Arg Arg Arg Ala Tyr Cys Arg Asn

450 455 460Arg Asp His Phe Ala Thr Ile Arg Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg Gln465 470 475 480Ile Gln Glu His Glu Gln Asp Ser Ala Leu Arg Glu Gln Leu Ser Gly

485 490 495Tyr Lys Arg Met Arg Arg Gln His Gln Lys Gln Leu Leu Ala Leu Glu

500 505 510Ser Arg Leu Arg Gly Glu Arg Glu Glu His Ser Gly Arg Leu Gln Arg

515 520 525Glu Leu Glu Ala Gln Arg Ala Gly Phe Gly Thr Glu Ala Glu Lys Leu

530 535 540Ala Arg Arg His Gln Ala Ile Gly Glu Lys Glu Ala Arg Ala Ala Gln545 550 555 560Ala Glu Glu Arg Lys Phe Gln Gln His Ile Leu Gly Gln Gln Lys Lys

565 570 575Glu Leu Ala Ala Leu Leu Glu Ala Gln Lys Arg Thr Tyr Lys Leu Arg

580 585 590Lys Glu Gln Leu Lys Glu Glu Leu Gln Glu Asn Pro Ser Thr Pro Lys

595 600 605Arg Glu Lys Ala Glu Trp Leu Leu Arg Gln Lys Glu Gln Leu Gln Gln

610 615 620Cys Gln Ala Glu Glu Glu Ala Gly Leu Leu Arg Arg Gln Arg Gln Tyr625 630 635 640Phe Glu Leu Gln Cys Arg Gln Tyr Lys Arg Lys Met Leu Leu Ala Arg

645 650 655His Ser Leu Asp Gln Asp Leu Leu Arg Glu Asp Leu Asn Lys Lys Gln

660 665 670Thr Gln Lys Asp Leu Glu Cys Ala Leu Leu Leu Arg Gln His Glu Ala

675 680 685Thr Arg Glu Leu Glu Leu Arg Gln Leu Gln Ala Val Gln Arg Thr Arg

690 695 700Ala Glu Leu Thr Arg Leu Gln His Gln Thr Glu Leu Gly Asn Gln Leu705 710 715 720Glu Tyr Asn Lys Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Lys His Ala Ala

725 730 735Gln Val Arg Gln Gln Pro Lys Ser Leu Lys Val Arg Ala Gly Gln Leu

740 745 750Pro Met Gly Leu Pro Ala Thr Gly Ala Leu Gly Pro Leu Ser Thr Gly

755 760 765Thr Leu Ser Glu Glu Gln Pro Cys Ser Ser Gly Gln Glu Ala Ile Leu

770 775 780Gly Gln Arg Met Leu Gly Glu Glu Glu Glu Ala Val Pro Glu Arg Met785 790 795 800Ile Leu Gly Lys Glu Gly Thr Thr Leu Glu Pro Glu Glu Gln Arg Ile

805 810 815Leu Gly Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Ser Ser Pro Gln Lys His Arg

820 825 830Ser Leu Val Asn Glu Glu Asp Trp Asp Ile Ser Lys Glu Met Lys Glu

835 840 845Ser Arg Val Pro Ser Leu Ala Ser Gln Glu Arg Asn Ile Ile Gly Gln

850 855 860Glu Glu Ala Gly Ala Trp Asn Leu Trp Glu Lys Glu His Gly Asn Leu865 870 875 880Val Asp Met Glu Phe Lys Leu Gly Trp Val Gln Gly Pro Val Leu Thr

885 890 895Pro Val Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Ala Pro

900 905 910Ile Gly Thr Pro Arg Asp Pro Gly Asp Gly Cys Pro Ser Pro Asp Ile

915 920 925Pro Pro Glu Pro Pro Pro Ser His Leu Arg Gln Tyr Pro Ala Ser Gln

930 935 940Leu Pro Gly Phe Leu Ser His Gly Leu Leu Thr Gly Leu Ser Phe Ala945 950 955 960Val Gly Ser Ser Ser Gly Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

965 970 975Pro Leu Leu Ala Pro Arg Trp Arg Trp Leu Ala Gly Ser Thr Ala Gly

980 985 990Pro

(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：414碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:ACGANTCACC AGTTGGAAGT TACTCCAAAG AATGAGCACA AAACAATCTT AAAGACACTG 60AAAGATGAGC AGACAAGAAA ACTTGCCATT TNGGCAGAGC AGTATGAACA GAGTATAAAT 120GAAATGATGG CCTCTCANGC GTTACGGCTA GATGAGGCTC AAGAAGCAGA ATGCCAGGCC 180TTGAGGCTAC AGCTCCAGCA GGAAATGGAG CTGCTCAACG CCTACCAGAG CAAAATCAAG 240ATGCAAACAG AGGCACAACA TGAACGTGAG CTCCAGAAGC TAGAGCAGAG AGTGTCTCTG 300CGCAGAGCAC ACCTTGAGCA GAAGATTGAA GAGGAGCTGG CTGCCCTTCA GAAGGAACGC 360AGCGAGAGAA TAAAGAACCT ATTGGAAAGG CAAGAGCGAG AGATTGGAAA CTTT 414

(2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：314个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:GAACAAAGTC ATGCCTTAAT AGTTCTGCTG ATGTTGGCCT TTCCTGAGGT ATTTTCTGCA 60AGCAGTAATC AACAAATCTC CTAAAGGAGT CTGTCCATTC ATTAGACTGT AACGTTGGGG 120AGTCATTCTG GGCAATGTGA TATAAGGCAC TCATTGCATT CATGTTGAAA AGGGGCGGCT 180TCCGTTCCGC CAATTCAATA CAAGTGATGC CAAGTGACCA AATATCAACT TTCCCATCAT 240ACTGTCCTTC ATCCATAGCT AAGATCACCT CTGGAGCCAT CCAGTAAGGT GTGCCCACGA 300AGGAGTTGGC CAGG 314

(2)SEQ ID NO:7的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：370个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:ACCAAATTCC CAAATCCCAT TCTGAGGCTC TCCATGTCAA AAGTTTCAAT CTCTCGCTCT 60TGCCTTTCCA ATAGGTTCTT TATTCTCTCG CTGCGTTCCT TCTGAAGGGC AGCCAGCTCC 120TCTTCAATCT TCTGCTCAAG GTGTGGTCTG CGCAGAGACA CTCTCTGCTC TAGCTTCTGG 180AGCTCACGTT CATGTTGTGC CTCTGTTNGN ATCTTGATTT GGNTCTGGTA GGCGTTGAGC 240AGCTCCATTT CCTGCTGGAG CTGTAGCCTC AAGGCCTGGC ATTCTGCTTC TTGAGCCTCA 300TCTAGCCGTA ACGCTTGAGA GGCCATCATT TCATTTATAC TCTGTTCATA CTGCTCTGCC 360AAAATGGCAA 370

(2)SEQ ID NO:8的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：190个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:CAACAGCAGA AAAACTTAAA GGCCATGGAA ATGCAAATTA AAAAACAGTT TCAGGACACT 60TGCAAAGTAC AGACCAAACA GTATAAAGCA CTCAAGAATC ACCAGTTGGA AGTTACTCCA 120AAGAATGAGC ACAAAACAAT CTTAAAGACA CTGAAAGATG AGCAGACAAG AAAACTTGCC 180ATTTTGGCAG 190

(2)SEQ ID NO:9的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：65个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:GAGCAGTATG AACAGAGTAT AAATGAAATG ATGGCCTCTC AAGCGTTACG GCTAGATGAG 60GCTCA 65

(2)SEQ ID NO:10的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：219个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:ACGAGTCCCC CCGAGAGCTA GAGTACAGGC AGCTGCACAC GTTACAGAAG CTACGCATGG 60ATCTGATCCG TTTACAGCAC CAGACGGAAC TGGAAAACCA GCTGGAGTAC AATAAGAGGC 120GAGAAAGAGA ACTGCACAGA AAGCATGTCA TGGAACTTCG GCAACAGCCA AAAAACTTAA 180AGGCCATGGA ANTGCAATTT AAAAAACAGT TCCAGGAAA 219

(2)SEQ ID NO:11的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：85个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:GTGCATATGG TATATTTNAT TCATTTTTGT AAAGCGTTCT GTTTTGTGTT TACTAATTGG 60GATGTCATAG TACTTGGCTG CCGGG 85

(2)SEQ ID NO:12的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：46个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:CTCACTTGGG TACTACAGTG TGGAAGCTGA GTGCATATGG TATATT 46

(2)SEQ ID NO:13的信息：

(Ⅰ)序列特征：

(A)长度：116个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13：GATATTTGGT CATTGGGTAT CACGTGTATA GAGCTGGCCG AACGTCGTCC ACCATTGTTC 60AGTATGAATG CAATGTCTGC CCTCTACCAT ATTGCTCAAA ATGATCCTCC AACTCT 116

(2)SEQ ID NO:14的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：118个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:CTGAAAGGCC TGGATTATCT GCACTCAGAG CGCAAGATCC ACCGAGATAT CAAAGCTGCC 60AACGTGCTGC TCTCGGAGCA GGGTGATGTG AAGATGGCAG ACTTCGGTGT GGCTGGCA 118

(2)SEQ ID NO:15的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：110个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:GACCCAGAGG AACTCTTCAC CAAGCTTGAC CGCATTGGCA AAGGCTCATT TGGGGAGGTG 60TACAAGGGGA TCGACAACCA CACCAAGGAA GTGGTGGCCA TCAAGATCAT 110

(2)SEQ ID NO:16的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：134个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:TCAGGATTCT GGAGCTCTGG AGTTCCATTA GTGGCTATCA GATACAATGC CCTGAGTGGA 60TTTTCATTAA GGTAAGGGGG TTCACCTTCC ACCATTTCAA TTGCCATAAT TCCAAGAGAC 120CAGATATCAA CTTT 134

(2)SEQ ID NO:17的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：278个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:Met Ala Pro Ala Val Leu Gln Lys Pro Gly Val Ile Lys Asp Pro Ser1 5 10 15Ile Ala Ala Leu Phe Ser Asn Lys Asp Pro Glu Gln Asp Leu Arg Glu

20 25 30Ile Gly His Gly Ser Phe Gly Ala Val Tyr Phe Ala Tyr Asp Lys Lys

35 40 45Asn Glu Gln Thr Val Ala Ile Lys Lys Met Asn Phe Ser Gly Lys Gln

50 55 60Ala Val Glu Lys Trp Asn Asp Ile Leu Lys Glu Val Ser Phe Leu Asn65 70 75 80Thr Val Val His Pro His Ile Val Asp Tyr Lys Ala Cys Phe Leu Lys

85 90 95Asp Thr Thr Cys Trp Leu Val Met Glu Tyr Cys Ile Gly Ser Ala Ala

100 105 110Asp Ile Val Asp Val Leu Arg Lys Gly Met Arg Glu Val Glu Ile Ala

115 120 125Ala Ile Cys Ser Gln Thr Leu Asp Ala Leu Arg Tyr Leu His Ser Leu

130 135 140Lys Arg Ile His Arg Asp Ile Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Ser Asp145 150 155 160His Ala Ile Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Ser Ala Ser Leu Val Asp

165 170 175Pro Ala Gln Thr Phe Ile Gly Thr Pro Phe Phe Met Ala Pro Glu Val

180 185 190Ile Leu Ala Met Asp Glu Gly His Tyr Thr Asp Arg Ala Asp Ile Trp

195 200 205Ser Leu Gly Ile Thr Cys Ile Glu Leu Ala Glu Arg Arg Pro Pro Leu

210 215 220Phe Ser Met Asn Ala Met Ser Ala Leu Tyr His Ile Ala Gln Asn Asp225 230 235 240Pro Pro Thr Leu Ser Pro Ile Asp Thr Ser Glu Gln Pro Glu Trp Ser

245 250 255Leu Glu Phe Val Gln Phe Ile Asp Lys Cys Leu Arg Lys Pro Ala Glu

260 265 270Glu Arg Met Ser Ala Glu

275

(2)SEQ ID NO:18的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：273个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:Arg Glu Glu Arg Glu Arg Arg Lys Lys Gln Leu Tyr Ala Lys Leu Asn1 5 10 15Glu Ile Cys Ser Asp Gly Asp Pro Ser Thr Lys Tyr Ala Asn Leu Val

20 25 30Lys Ile Gly Gln Gly Ala Ser Gly Gly Val Tyr Thr Ala Tyr Glu Ile

35 40 45Gly Thr Asn Val Ser Val Ala Ile Lys Gln Met Asn Leu Glu Lys Gln

50 55 60Pro Lys Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Ile Leu Val Met Lys Gly Ser65 70 75 80Lys His Pro Asn Ile Val Asn Phe Ile Asp Ser Tyr Val Leu Lys Gly

85 90 95Asp Leu Trp Val Ile Met Glu Tyr Met Glu Gly Gly Ser Leu Thr Val

100 105 110Asp Val Val Thr His Cys Ile Leu Thr Glu Gly Gln Ile Gly Ala Val

115 120 125Cys Arg Glu Thr Leu Ser Gly Leu Glu Phe Leu His Ser Lys Gly Val

130 135 140Leu His Arg Asp Ile Lys Ser Asp Asn Ile Leu Leu Ser Met Glu Gly145 150 155 160Asp Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gln Ile Asn Glu Leu

165 170 175Asn Leu Lys Arg Thr Thr Met Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro

180 185 190Glu Val Val Ser Arg Lys Glu Tyr Gly Pro Lys Val Asp Ile Trp Ser

195 200 205Leu Gly Ile Met Ile Ile Glu Met Ile Glu Gly Glu Pro Pro Tyr Leu

210 215 220Asn Glu Thr Pro Leu Arg Ala Leu Tyr Leu Ile Ala Thr Asn Gly Thr225 230 235 240Pro Lys Leu Lys Glu Pro Glu Asn Leu Ser Ser Ser Leu Lys Lys Phe

245 250 255Leu Asp Trp Cys Leu Cys Cys Val Glu Pro Glu Asp Arg Ala Ser Ala

260 265 270Thr

(2)SEQ ID NO:19的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅸ)特征：

(A) 名称/关键词：-

(B) 定位：24

(D) 其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：31

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(Ⅺ)序列描述：SEQ ID NO:19GACGCTGGAT CCAAAGATAC TGGNCAAGGG NGC 33

(2)SEQ ID NO:20的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位： 3

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：6

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：13

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：16

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：19

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20GGNGTNCCAG TTNGTNGCNA T 21

(2)SEQ ID NO:21的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：11

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：14

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：18

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21AAAGGAAGCA NAGNCAGNAA CGGAAGAT 28

(2)SEQ ID NO:22的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：19

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)定位：22

(D)其它信息：/注释=“其中N是肌苷”

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22GACGCTGAAT TCACCTTCNG GNGCCATCCA 30

(2)SEQ ID NO:23信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D) 拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23Thr Lys Asp Ala Val Arg Glu Leu Asp Asn Leu Gln Tyr Arg Lys Met1 5 10 15Lys Lys Leu Leu

20

(2)SEQ ID NO:24信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：19个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D) 拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24Lys Lys Glu Leu Asn Ser Phe Leu Glu Ser Gln Lys Arg Glu Tyr Lys1 5 10 15Leu Arg Lys

(2)SEQ ID NO:25信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25Arg Glu Leu Arg Glu Leu Glu Gln Arg Val Ser Leu Arg Arg Ala Leu1 5 10 15Leu Glu Gln Lys

20

(2)SEQ ID NO:26信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26His Arg Asp Ile Lys Ala Gly Asn1 5

Claims

1．含有SEQ ID NO:2中提供的氨基酸序列的多肽或其中磷酸化MEK3的能力基本不减弱的变体。

2．根据权利要求1所述的多肽，其中多肽含有的序列与SEQ IDNO:2中列举的序列的区别只在于保守取代和/或修饰不超过10％的氨基酸残基。

3．根据权利要求1所述的多肽的组成活性变体。

4．根据权利要求1所述的多肽，其中多肽含有SEQ ID NO:2的氨基酸1-416。

5．含有SEQ ID NO:2中提供的氨基酸序列的多肽，修饰的氨基酸残基不超过10％，以致使所述的多肽变为组成无活性的。

6．能够磷酸化MEK3的多肽，其中多肽不能可检测地磷酸化MEK1或MEK2。

7．含有SEQ ID NO:4中提供的氨基酸序列的多肽，或其中磷酸化MEK3的能力基本不减弱的变体。

8．根据权利要求7所述的多肽，其中多肽含有的序列与SEQ IDNO:4中列举的序列的区别在于保守取代和/或修饰的氨基酸残基不超过10％。

9．根据权利要求7所述的多肽的组成活性变体。

10．含有SEQ ID NO:4中提供的氨基酸序列的多肽，修饰的氨基酸残基不超过10％，以致使所述的多肽变为组成无活性的。

11．编码权利要求1-10的任何一个所述的多肽的分离多核苷酸。

12．根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中多核苷酸含有SEQ ID NO:1中提供的核苷酸序列。

13．根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中多核苷酸含有SEQ ID NO:3中提供的核苷酸序列。

14．根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中多核苷酸编码SEQ ID NO:2的氨基酸1-416。

15．含有权利要求11所述的多核苷酸的重组表达载体。

16．使用权利要求15所述的表达载体转化或转染的宿主细胞。

17．含有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中列举的或与其互补的至少10个核苷酸的多核苷酸。

18．含有下面成分的药物组合物：

(a)根据权利要求1-10的任何一个所述的多肽；和

(b)生理可接受载体。

19．含有下面成分的药物组合物：

(a)根据权利要求11所述的多核苷酸；和

(b)生理可接受载体。

20．含有下面成分的药物组合物：

(a)根据权利要求17所述的多核苷酸；和

(b)生理可接受载体。

21．磷酸化MEK多肽的方法，包括将MEK多肽与权利要求1或3所述的多肽接触，从而磷酸化MEK多肽，其中MEK多肽包括MEK3,MEK4或MEK6或其变体。

22．活化生物体中应激性MAP激酶途径的成员的方法，包括对生物体给药权利要求1或权利要求3所述的多肽，从而活化应激性MAP激酶途径的成员。

23．根据权利要求22所述的方法，其中应激性MAP激酶途径的成员是MEK3。

24．磷酸化MEK多肽的方法，包括将MEK多肽与权利要求7或权利要求9所述的多肽接触，从而磷酸化MEK多肽，其中MEK多肽包括MEK3,MEK4或MEK6或任何前面所述的MEK的变体。

25．活化生物体中应激性MAP激酶途径的成员的方法，包括对生物体给药权利要求7或权利要求9所述的多肽，从而活化应激性MAP激酶途径的成员。

26．根据权利要求25所述的方法，其中应激性MAP激酶途径的成员是MEK3。

27．筛选通过应激性MAP激酶途径调节信号转导的药剂的方法，包括：

(a)将候选药剂与权利要求1,3,7或9的任何一个所述的多肽接触；和

(b)随后测量所述的多肽调节MEK3多肽的活性的能力，从而评估化合物通过应激性MAP激酶途径调节信号转导的能力。

28．特异地结合权利要求1或权利要求7所述的多肽的单克隆抗体或其抗原结合片段。

29．根据权利要求28所述的单克隆抗体，其中所述的抗体抑制所述的多肽对MEK3的磷酸化。

30．含有下面成分的药物组合物：

(a)根据权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段；和

(b)生理可接受载体。

31．治疗患有与应激性MAP激酶途径相关的疾病的患者的方法，包括对患者给药调节MEK3的磷酸化的化合物。

32．根据权利要求31所述的方法，其中所述的化合物是单克隆抗体或其抗原结合片段。

33．根据权利要求31所述的方法，其中所述的化合物含有核苷酸序列。

34．根据权利要求31所述的方法，其中化合物抑制MEK3的磷酸化，疾病选自包括炎症，自身免疫疾病，癌症和变性疾病的组。

35．根据权利要求31所述的方法，其中化合物增强MEK3的磷酸化，疾病选自包括胰岛素抗性糖尿病，代谢紊乱和神经变性疾病。

36．确定样品中存在或缺乏TAO激酶活性的方法，包括评估样品磷酸化MEK3多肽的能力，从而确定样品中TAO激酶活性的存在或缺乏。

37．检测样品中TAO激酶活性的试剂盒，包括与适当缓冲剂结合的MEK3多肽。

38．含有在SEQ ID NO:5-16中的任何一个中列举的一个或多个序列的分离的多核苷酸或其变体，其中多核苷酸编码能够磷酸化MEK3的多肽。

39．根据权利要求37所述的多核苷酸，其中多核苷酸含有与SEQ IDNO:5-16的任何一个中列举的序列的区别在于保守取代和/或修饰的氨基酸残基不超过10％的序列。

40．根据权利要求38所述的多核苷酸，其中多核苷酸编码TAO多肽的组成活性变体的多肽。

41．根据权利要求38-40的任何一个所述的多核苷酸编码的多肽。

42．含有权利要求38所述的多核苷酸的重组表达载体。

43．利用权利要求42所述的表达载体转化或转染的宿主细胞。

44．含有如权利要求38所述的多核苷酸内列举的，或与其互补的至少10个核苷酸的多核苷酸。

45．含有如下成分的药物组合物：

(a)根据权利要求41所述的多肽；和

(b)生理可接受载体。

46．含有如下成分的药物组合物：

(a)根据权利要求38所述的多核苷酸；和

(b)生理可接受载体。

47．磷酸化MEK多肽的方法，包括将MEK多肽与根据权利要求41所述的多肽接触，从而磷酸化MEK多肽，其中MEK多肽包括MEK3,MEK4或MEK6或前面的任何一个MEK的变体。

48．活化生物体中应激性MAP激酶途径的成员的方法，包括对生物体给药根据权利要求41所述的多肽，从而活化应激性MAP激酶途径的成员。

49．根据权利要求48所述的方法，其中应激性MAP激酶途径的成员是MEK3。

50．筛选通过应激性MAP激酶途径调节信号转导的药剂的方法，包括：

(a)将候选药剂与权利要求41所述的多肽接触；和

51．特异地结合权利要求41所述的多肽的单克隆抗体或其抗原结合片段。

52．根据权利要求51所述的单克隆抗体，其中所述的抗体抑制所述的多肽对MEK3的磷酸化。

53．含有如下成分的药物组合物：

(a)根据权利要求51所述的抗体或其抗原结合片段；和

(b)生理可接受载体。