JPH08506962A - Ｄｎａ結合のｔａｘ媒介増加の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）のＴax蛋白はＡＴＦに対する結合部位を介してＨＴＬＶ−Ｉプロモーターを転写的に活性化する。本明細書では、Ｔaxが、多発性ＡＴＦ多発性のin vitro ＤＮＡ結合活性を劇的に増加することを報告する。Ｔaxはまた、関連するbＺＩＰ蛋白のＤＮＡ結合を刺激するが、bＺＩＰドメインを欠く蛋白の活性には影響しない。増加したＤＮＡ結合活性は、新規なメカニズムにより起こり、そこではＴaxがＤＮＡの不存在下でのホモ二量体化を促進する。高濃度のbＺＩＰホモ二量体はＤＮＡ結合の増加をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ結合のＴＡＸ媒介増加の阻害 発明の背景 ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）は悪性成人Ｔ細胞白血病（Ａ ＴＬ）と関連するもので、最近、２つの変性神経性疾患、ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエ ロパシー（myelopathy）および多発性硬化症（multiple sclerosis）と結び付け られている。ウイルス複製は、ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲを転写的に活性化し、また 、細胞性および他のウイルス性プロモーターを活性化できるウイルス性Ｔax蛋白 に依存している。培養細胞の悪性形質転換を誘導するＨＴＬＶ−Ｉの能力はまた 、機能性Ｔax遺伝子を必要とする。 ＴaxによるＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲの転写的活性化には、Ｔax応答エレメント（ ＴＲＥ）と称される３つの２１bp反復が関与する。突然変異分析は、各２１bp反 復の決定的な部位がＡＴＦ結合部位であることを示した。ＡＴＦ蛋白（ＡＴＦｓ ）は相同性塩基性領域／ロイシンジッパーＤＮＡ結合（bＺＩＰ）ドメインを有 する細胞性転写因子の１ファミリーである。いくつかのＡＴＦsがＴＲＥ配列と 結合することが示されている。これらおよびその他の観察は、Ｔaxが、配列特異 性ＤＮＡ結合蛋白ではなく、ＡＴＦsを介して機能して転写を刺激することを示 唆している。 発明の概要 本発明は、bＺＩＰ含有蛋白（例、ＡＴＦおよびＡＰ−１）のＤＮＡ結合にお けるＴax媒介増加を阻害する方法に関する。二量体化およびその結果としてのＤ ＮＡ結合は、bＺＩＰ含有蛋白のbＺＩＰドメインへのＴax結合を妨害することに より阻害される。本発明の範囲に入る阻害分子は、ペプチド、抗体および小有機 分子（例、小分子ライブラリーの構成員）である。 ＤＮＡ結合のＴax媒介増加の阻害はＨＴＬＶ−Ｉ複製またはＨＴＬＶ−Ｉ誘導 悪性形質転換の抑制法に利用できる。bＺＩＰ含有蛋白のbＺＩＰドメインへの Ｔaxの結合を妨害する阻害分子をＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に導入する。この阻害分 子の導入はＴaxのbＺＩＰドメインへの結合を妨害し、それにより、bＺＩＰ含有 蛋白の二量体化を阻害する。この二量体化の阻害が、二量体化に伴うＤＮＡ結合 アフィニティーの増加を抑制する。 発明の詳細な記載 従前、Ｔaxによるトランス活性化（trans-activation）が、ほぼ、Ｔaxと、Ｄ ＮＡと直接相互作用して転写を刺激する活性化因子との、相互作用により媒介さ れるらしいと報告されていた。しかしながら、Ｔaxと該活性化因子との間の相互 作用の特異的性質は解明されていなかった。Ｔaxと、そのような活性化因子のb ＺＩＰドメインとの直接的相互作用の発見は、Ｔaxの該bＺＩＰドメインへの結 合を阻害することによる遺伝子発現のＴax媒介制御への介在方法を示唆している 。このような介在は二量体化およびそれに伴うＤＮＡ結合親和性の増加を防止す る。 Ｔax媒介二量体化は、例えば、Ｔax::bＺＩＰ含有蛋白結合ペア（以下、「Ｔa x::bＺＩＰ結合ペア」と称する）の構成員の少なくとも１つと、ＴaxのbＺＩＰ ドメインへの結合を妨害する阻害分子とを接触させることにより阻害できる。後 の実施例の項に記載する実験は、最小のbＺＩＰペプチドが、Ｔax蛋白が直接相 互作用するＡＴＦ２蛋白のアミノ酸３５０〜４１５からなることを明らかにして いる。実施例はまた、転写因子のbＺＩＰ含有ＡＰ−１ファミリーがＴax応答性 であることを示している。ＡＰ−１ファミリーの２つの特に重要な構成員は、オ ンコプロテインとして知られるc−junおよびc−fos蛋白である。他の公知のＤＮ Ａ結合蛋白の活性はＴax蛋白と共にインキュベートしても影響されなかった。す なわち、ＴaxによるＤＮＡ結合活性の剌激はbＺＩＰモチーフを含有する蛋白に 特異的である。 阻害分子は、例えば、ペプチドとすることができる。Ｔax蛋白が、ＡＴＦのb ＺＩＰドメインと直接相互作用することが示されたので、bＺＩＰドメインを模 造したペプチドもＴaxの二量体促進活性を阻害するのに使用できる。ＴaxとbＺ ＩＰ含有部分（moiety）のインキュベーション混合物に模造ペプチドを導入する と、ペプチドはＴaxのbＺＩＰ含有部分との結合と競合する。成功裏に競合 した模造ペプチドはインキュベーション混合物における二量体化の促進を妨害す る機能をする。 ペプチドに加えて、小有機分子も成功の高い確率をもって阻害活性をテストで きる。小有機分子のライブラリーは、しばしば、作働剤または拮抗剤の同定のた めに製薬会社により採用されている。天然物抽出物または培養細胞の増殖からの 粗製ブロスが、阻害分子存在を試験するための他の源となる。 抗体もＴax::bＺＩＰ結合ペアの形成を妨害するために使用できる。好ましく は、この目的に使用する抗体はモノクローナル抗体である。常套の方法がこの目 的に使用するモノクローナル抗体の発生およびスクリーニングのために使用でき る。 阻害分子の同定は高効率スクリーニング分析（high throughput screening as say）を用いて容易に行える。このような分析は大量の分子を効率よくスクリー ニングするように設計することができる。例えば、bＺＩＰ含有部分はマルチ・ ウエル・プレートのウエルに固定できる。インキュベーション混合物は、適宜緩 衝された溶液と、検出できる（例、蛍光的に標識された）Ｔax蛋白を添加するこ とにより、ウエル内で形成できる。可能性のある阻害分子を、適宜の濃度で個々 のインキュベーション混合物に添加し、添加した分子の、ＴaxのbＺＩＰ含有部 分への結合に対する影響をモニターすることにより該分子がスクリーニングされ る。 Ｔax::bＺＩＰ結合ペアの形成を妨害する能力についてテストした分子が、実 際、所望の性質を有していれば、観察される結果は、インキュベーション混合物 における標識Ｔax蛋白の、結合bＺＩＰ含有部分に対する結合レベルの減少とな る。Ｔax::bＺＩＰ結合ペアの構成員と結合しない分子は、上記した結合分析に おける固定bＺＩＰ部分へのＴaxの結合に何の影響も持たないと言い得る。 このタイプのスクリーニング法で同定された阻害分子は、Ｔax::bＺＩＰ結合 ペアのいずれかの構成員と結合することによって機能することができることを認 識すべきである。Ｔax::bＺＩＰ結合ペアのいずれかの構成員と結合する阻害分 子は二量体化およびＤＮＡ結合を阻害することにより機能するが、阻害分子はＴ ax蛋白に結合することが好ましい。望ましい細胞性機能において役割を演じるら しいbＺＩＰ含有蛋白が直接影響されないところから、Ｔax結合が好ましい。 このようにして同定された阻害分子は種々の方法で使用できる。例えば、本明 細書に示したように、Ｔaxのトランス活性化作用はbＺＩＰ含有蛋白の二量体化 の結果であるので、二量体化の妨害はＴaxのトランス活性化能を抑制すると言え る。すなわち、上記した方法により同定された阻害分子またはそのような分子の 誘導体は、それをＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に導入することにより、ＨＴＬＶ−Ｉ複 製またはＨＴＬＶ−Ｉ誘導悪性形質転換誘導を抑制する方法に利用できる。その ような分子を感染細胞に導入する方法は当該分野でよく知られている。 実施例 Ｔaxは多発性ＡＴＦsのＤＮＡ結合活性を増加させる。 ＴaxのＡＴＦ ＤＮＡ結合活性に対する可能な影響を調べるため、３つのＡＴ Ｆs（ＡＴＦ−１、ＡＴＦ−２およびＣＲＥＢ）を、まず、グルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合蛋白として精製し、ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲの 最も末梢のＴＲＥエレメントを含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドに対する結合 を分析した。ＤＮＡ結合反応は、Ｔaxの不存在下で低レベルのＤＮＡ結合を起こ させるような蛋白濃度を用いて行った。さらに詳細には、結合反応は、約５０ng のアフィニティー精製融合蛋白および約２００ngの精製Ｔax蛋白を含む。 このＤＮＡ結合分析条件下、精製Ｔaxの添加がＤＮＡ結合を大いに増加させた。 ＤＮＡ結合は、無関係な蛋白またはＴaxの加熱処理後の添加によっては増加しな かった。予期したとおり、精製ＴaxとＤＮＡの間の検知しうる相互作用はなかっ た。ヒスタミン−ＡＴＦ２および最小bＺＩＰペプチドのようなＧＳＴ部分を欠 くＡＴＦ誘導体のＤＮＡ結合はＴaxによって匹敵するほどに高められ、これによ り、ＧＳＴ部分がＴax媒介ＤＮＡ結合の増加に関与している可能性が排除された 。 Ｔaxは最小bＺＩＰドメインを介して機能する。 Ｔax応答性に必要なＡＴＦ部分を明らかにするため、いくつかのＧＳＴ−ＡＴ Ｆ２欠失を分析した。最小bＺＩＰドメイン（アミノ酸３５０〜４１５）を含有 するＧＳＴ−ＡＴＦ２融合がＤＮＡ結合のＴax媒介増加を支持した。この結 果は、Ｔaxが多発性ＡＴＦsのＤＮＡ結合を増加させた事実と一致しており、bＺ ＩＰはＡＴＦ蛋白の内で、顕著なホモロジーのある唯一の領域である。 ＴaxはbＺＩＰ−ＤＮＡ複合体と相互作用する。 ＤＮＡ結合分析において、ＴaxがＤＮＡ結合を増加させるが、ＡＴＦ−ＤＮＡ 複合体の電気泳動における泳動度はＴaxの存在下、不存在下で同じであることが 顕著に観察された。この結果の１つのもっともらしい理由は、非変性ゲルにおけ る電気泳動の間にＴaxがＡＴＦ−ＤＮＡ複合体から解離したということである。 この可能性に注目して、いくつかの他の非変性ゲル形でＤＮＡ結合を分析した。 トリス−グリシン緩衝液中で、Ｔaxの添加は電気泳動の泳動の減少した第２のＤ ＮＡ−蛋白複合体を生じさせた。この「スーパーシフトした（super-shifted） 」複合体を、Ｔaxの加熱失活後に除いた。同様な結合がＧＳＴ−ＡＴＦ１および ＧＳＴ−ＡＴＦ２でも得られた。 実際にＴaxがＡＴＦ−ＤＮＡ複合体の成分であることを確認するため、共免疫 沈降（coimmunoprecipitaion）実験を行った。ＤＮＡ結合反応は、Ｔaxの存在下 および不存在下で、³²Ｐ−標識ＤＮＡプローブおよび最小ＡＴＦ−２bＺＩＰド メインが含まれるように用意した。インキュベーションの後、α−Ｔax抗体を加 え、³²Ｐ−標識ＤＮＡプローブを免疫沈降させた。この結果は、α−Ｔax抗体が 、ＴaxおよびＡＴＦ−２bＺＩＰの両方が存在する場合のみ、³²Ｐ−標識ＤＮＡ プローブを免疫沈降させることができることを示した。³²Ｐ−標識ＤＮＡプロー ブの免疫沈降は対照血清を用いると観察されなかった。これらの結果を合わせる と、ＤＮＡ−結合bＺＩＰ蛋白およびＴaxを含有する三元複合体の存在を明確に 示している。ＤＮＡse Ｉ保護および紫外線架橋実験ではＴaxとＤＮＡの相互作 用を示すことができなかった。これらの結果と、上記および以下に示すデータを 合わせると、該三元複合体において、Ｔaxが、主として（または専ら）直接、最 小bＺＩＰドメインと相互作用していることを示している。 ＤＮＡ結合のＴax媒介促進はbＺＩＰ蛋白に特異的である。 ＤＮＡ結合のＴax媒介促進の特異性を評価するため、電気泳動泳動度シフト分 析を用いて、いくつかの、他のよく特徴づけられた転写因子をテストした。転写 因子のＡＰ−１ファミリーはＡＴＦ蛋白と密接に関係している［エンジェルおよ びカリン、バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Angel and Karin,Bioc himica et Biophysica Acta）、１０７２：１２９（１９９１）により概説］。 ＡＰ−１蛋白もbＺＩＰドメインを含有し、ＤＮＡ配列（５'−ＴＧＡＣＴＣＡ− ３'）と結合し、これはＡＴＦコンセンサス部位（５'−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３' ）と１つの位置で相違するだけである。酵母転写因子ＧＣＮ４はプロトタイプＡ Ｐ−１蛋白である。ＧＣＮ４ bＺＩＰドメインを含むペプチドのＤＮＡ結合活性 は、細菌が発現したＡＴＦsと同様な方法でＴaxに応答する。対照的に、ＧＳＴ −ミオゲニン融合蛋白、ヘリックス−ループ−ヘリックス蛋白のＤＮＡ結合も、 ＧＡＬ４−ＡＨ、ジンクフィンガー型蛋白の結合も、Ｔaxによって顕著に増加さ れなかった。すなわち、ＴaxによるＤＮＡ結合活性の剌激はbＺＩＰモチーフを 含有する蛋白に特異的なものと見える。 Ｔax媒介ＤＮＡ結合増加はbＺＩＰの濃度に依存する。 bＺＩＰ濃度の役割を調べるため、Ｔaxの影響を、０．０４nＭから４０nＭの 範囲のＧＣＮ４濃度で測定した。さらに詳細には、ＧＣＮ４ペプチドを、濃度を 変えて、そのＴaxの不存在下および存在下での、コラーゲンＴＲＥオリゴヌクレ オチドに対する結合を分析した。ＤＮＡ結合反応はホスホルイメージャー（Phos phorImager：Molecular Dynamics）およびイメージクアント（Imagequant（商標 ））ソフトウエアーを用いて評価した。ＤＮＡ結合の最大刺激は４nＭ以下のペ プチド濃度で観察され、より高い蛋白濃度では、ＴaxはＤＮＡ結合を著しく増加 させなかった。高ＧＣＮ４濃度でＤＮＡ結合を増加しないことは、制限的なＴax によるものではなく、Ｔax濃度の増加は、より高いペプチド濃度におけるＤＮＡ 結合に影響しなかった。これらの結果は、通常、ＤＮＡ結合の程度を制限する濃 度依存性段階をＴaxが克服することを示唆している。 ＴaxはＤＮＡの不存在下でbＺＩＰホモ二量体の形成を増加させる。 bＺＩＰ蛋白は二量体としてＤＮＡと結合し、二量体化はＤＮＡ結合の前に起 こり、ＤＮＡ結合にとって必要条件である。したがって、Ｔaxは、bＺＩＰの二 量体化か、その後のbＺＩＰホモ二量体とＤＮＡの相互作用のいずれかを増加さ せる。ＴaxのbＺＩＰドメインの二量体化への影響を、よく記載されている化学 的架橋分析を用いて測定した。以前の研究では、bＺＩＰ二量体のサブユニット を相互に、二官能性架橋剤であるグルタールアルデヒドで架橋できることが示さ れている。ＧＳＴ−ＡＴＦ２（１００〜２００ng）をＴax（２００ng）の存在下 または不存在下でインキュベートし、ついで、グルタールアルデヒド（０．０２ ％最終濃度）を添加し、生成物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル上で分画し 、ＧＳＴ特異性ポリクーナル抗血清でイムノブロッティングして分析した。低蛋 白濃度では、ＧＳＴ−ＡＴＦ２は主として単量体であり、予想どおり、高ＧＳＴ −ＡＴＦ２濃度では、ホモ二量体の形成が増加した。特に、Ｔaxの添加はＡＴＦ −２ホモ二量体の量を劇的に増加させた。高グルタールアルデヒド濃度では、さ らなる架橋生成物が検出され、それにはＴaxが含まれていた。 ＴaxはＤＮＡ結合の会合速度を増加させる。 ＤＮＡ結合の速度論に如何にＴaxが影響するかを調べるため、Ｔaxの存在下お よび不存在下におけるbＺＩＰ−ＤＮＡ複合体の会合および解離速度を測定した 。５０ng精製ＧＳＴ−ＡＴＦ２蛋白を含有する結合反応を、２００ngのＴax蛋白 の存在下または不存在下にインキュベートし、０．５×ＴＢＥ／５％ポリアクリ ルアミド・ゲル上で分析した。Ｔaxの不存在下、ＧＳＴ−ＡＴＦ２のＤＮＡへの 結合は１５分までで最高のレベルに達した。Ｔaxの存在下、予想どおり、総ＤＮ Ａ結合は増加し、わずか１分後に平衡が達成された。同様な結果はＧＣＮ４ペプ チドを用いても観察された。これらの結果は、ＴaxがＤＮＡ結合のオン速度（on -rate）を増加させることを示している。 bＺＩＰ−ＤＮＡ複合体の解離速度を測定するため、反応混合物を平衡に到達 させ、５０倍過剰の特異的競合ＤＮＡ（非標識ＬＴＲオリゴヌクレオチド）を添 加し、残存するbＺＩＰ−ＤＮＡ複合体の量を時間の関数として測定した。この 実験で得られたデータは、Ｔaxの存在下および不存在下で、結合ＡＴＦ−２が匹 敵する速度でＤＮＡから解離したことを示している。これらの結果は、Ｔaxが、 オフ速度（off-rate）に著しい影響なしに、bＺＩＰ−ＤＮＡ複合体のオン速度 を増加させ、かくして、ＤＮＡ結合の増加が見られることを示している。 その他の観察 ＤＮＡ結合のレベルにおける調節転写因子は、遺伝子発現制御の１つの重要な 手段であり、いくつかの別個のメカニズムが記載されている。例えば、いくつか のＡＰ−１蛋白のin vitro ＤＮＡ結合活性は、bＺＩＰの塩基性領域における保 存システイン残基が関与するレドックス（reduction-oxidation）により調節で きる。したがって、ＤＴＴのような還元剤は、イー・コリ（E．coli）誘導junお よびfos蛋白のＤＮＡ結合を大いに促進させる。しかしながら、ＤＮＡ結合のＴa x媒介刺激はＤＴＴの不存在下または存在下で区別できない。また、上記の実験 で使用したＧＣＮ４ペプチドはシステイン残基を欠き、レドックス調節が除外さ れている。いくつかの蛋白のＤＮＡ結合活性は、蛋白ホスホリル化によって刺激 できる。しかしながら、ＴaxはＭｇ²⁺およびＡＴＰの不存在下でＤＮＡ結合を増 加させ、これはホスホリル化が関与していないことを示した。 ＤＮＡ結合の調節における補助因子の影響が、いくつかの哺乳類の転写因子の 研究から明らかになった。例えば、ホメオドメイン蛋白のＨＮＦ−１αの二量体 化はコファクターＤＣoＨによって刺激される。しかし、これはＨＮＦ−１αの 転写活性に影響するもので、そのＤＮＡ結合活性ではない。 ＴaxのＡＴＦ結合への影響は、いくつかの点でＳＲＦおよびＰhox１で見られ るＤＮＡ結合の誘導を思いおこさせる。しかし、１つの重要な相異は、Ｔaxの会 合および解離速度への影響に関する。Ｐhox１はＳＲＦ／ＳＲＥ複合体の会合お よび解離速度の両方を増加させることが報告されており、また、その結合部位に おけるＳＲＦ交換の増加が過渡ミトゲン信号に対するより早い応答を可能にする ことが提案されている。Ｔaxは、bＺＩＰ−ＤＮＡの解離速度に影響なく、bＺＩ ＰとＤＮＡの会合速度を増加させる。これらの影響の合計がＤＮＡ結合の促進を もたらす。 均等物 当業者は、日常の実験以上のものを用いることなく、本明細書に記載した本発 明の特定の具体例の多くの均等物を認識または確認できるであろう。そのよな均 等物も以下に列挙する請求項に包含されるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｔax::bＺＩＰ結合ペアの構成員を、ＴaxのbＺＩＰドメインへの結合を妨 害する阻害分子と接触させることを特徴とするＤＮＡ結合のＴax媒介増加を阻害 する方法。 ２．阻害分子がペプチドである請求項１記載の方法。 ３．ペプチドがbＺＩＰ模造ペプチドである請求項２記載の方法。 ４．阻害分子が抗体である請求項１記載の方法。 ５．阻害分子が小有機分子である請求項１記載の方法。 ６．bＺＩＰ含有蛋白がＡＴＦおよびＡＰ−１蛋白からなる群から選ばれる請 求項１記載の方法。 ７．ＡＰ−１蛋白がc-fosおよびc-junからなる群から選ばれる請求項６記載の 方法。 ８．ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に、bＺＩＰ含有蛋白におけるbＺＩＰドメインに対 するＴaxの結合を妨害する阻害分子を導入することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ複 製またはＨＴＬＶ−Ｉ誘導悪性形質転換の抑制方法。 ９．阻害分子がペプチドである請求項８記載の方法。 １０．ペプチドがbＺＩＰ模造ペプチドである請求項９記載の方法。 １１．阻害分子が抗体である請求項８記載の方法。 １２．阻害分子が小有機分子である請求項８記載の方法。 １３．bＺＩＰ含有蛋白がＡＴＦおよびＡＰ−１蛋白からなる群から選ばれる 請求項８記載の方法。 １４．ＡＰ−１蛋白がc-fosおよびc-junからなる群から選ばれる請求項１３記 載の方法。