KR20160137908A - 당뇨병-연관 심기능 장애 및 울혈성 심부전을 치료하기 위한 우로코르틴-2 및 연관 유전자들을 인코딩하는 바이러스 벡터들의 전신 전달 - Google Patents

Abstract

일 구현예에 있어서, 하기를 포함하는, 울혈성 심부전 (CHF) 또는 당뇨병-연관 심기능 장애 (dysfunction)를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한 방법들이 제공된다: 선택적으로 아데노-연관 바이러스 (AAV), 예를 들어, AAV8 혈청형과 같은 발현 매개체 또는 벡터 내에 포함된, 선택적으로 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 전사 또는 메시지, 또는 유전자를 제공하는 것; 및 2형 당뇨병 (T2DM)과 같은, 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게, 예를 들어, 정맥 투여를 통해, 투여하고, 이로 인해 상기 개인 또는 환자의 2형 당뇨병 및/또는 당뇨병-연관 심기능 장애를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것.

Description

당뇨병-연관 심기능 장애 및 울혈성 심부전을 치료하기 위한 우로코르틴-2 및 연관 유전자들을 인코딩하는 바이러스 벡터들의 전신 전달{SYSTEMIC DELIVERY OF VIRUS VECTORS ENCODING UROCORTIN-2 AND RELATED GENES TO TREAT DIABETES-RELATED CARDIAC DYSFUNCTION AND CONGESTIVE HEART FAILURE}

[관련 출원들]

본 출원은 2014년 4월 3일에 출원된, 미국 가출원 번호 (USSN) 61/974,662에 대한 우선권을 주장한다. 상기 전술된 출원은 명백하게 그 전체에서 및 모든 목적을 위해 참조로서 본 출원에 포함된다.

[연방 지원 연구 하에 만들어진 발명들의 권리들에 관한 언급]

본 발명은, 허가 번호 306402 (HK066941), P01 HL66941, HL088426, HL081741, 및 HL107200; 및, 미국국립보건원 (NIH), DHHS에 의하여 부여된 P01 HL066941-11A1; 및 재향군인 관리국 (VA) Merit Grants가 부여한 I01 BX001515 및 1101bBX000783 하에서 정부 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 확실한 권리들을 보유한다.

[기술분야]

본 발명은 일반적으로 세포 및 분자 생물학, 유전자 치료 및 의학에 관한 것이며, 보다 구체적으로는, 당뇨병-연관 심기능 장애를 함께 가지는 2형 당뇨병 (T2DM)을 가지는 개인 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한 조성물들 및 방법들에 관한 것이다.

수많은 약물들 및 다른 치료법들에도 불구하고 2형 당뇨병 (T2DM)은 그 중 35%는 울혈성 심부전 (CHF)을 가지는 수많은 환자들에게 영향을 미친다. 이는 결과적으로 심근경색, 울혈성 심부전 및 뇌졸중을 동반하는 관상동맥 및 말초 동맥 질환의 발생에 관한 주된 위험 요소이다. 지속적인 고혈당증 또한 독립적으로 비정상적인 심기능과 연관되어 있다. 궁극적으로 인슐린은 치료를 위한 중추적인 치료법이나, 인슐린 감응성을 증가시키고 베타 세포 기능을 보존하는 약물들은 조기 관리에서 중추적인 역할을 한다. 그러나, 다수의 경구 2형 당뇨병 약물들은 울혈성 심부전을 가지는 대상들에 대해서는 역효과들을 가지며, 체중 증가와 연관되어 있다.

일 구현예에 있어서, 하기를 포함하는, 울혈성 심부전 (CHF)을 가지는 개인 또는 환자, 또는 당뇨병-연관 심기능 장애 또한 가지는 2형 당뇨병 (T2DM)을 가지는 개인을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한 방법들이 제공된다: 전사 조절 서열에 작동적으로 (operatively) 연결된, 우로코르틴 2 (UCn-2)-인코딩, 우로코르틴 1 (UCn-1)-인코딩, 및/또는 우로코르틴 3 (UCn-3)-인코딩 핵산, 전사 또는 메시지, 또는 유전자; 또는 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 전사 또는 메시지, 또는 유전자를 내포하는, 발현 매개체 (delivery vehicle), 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물이며, 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 상기 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내에서 또는 in vivo 발현할 수 있는 것; 및 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지, 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물을, 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 투여 또는 전달하고, 이로 인해 상기 개인 또는 환자의 2형 당뇨병 및 당뇨병-연관 심기능 장애를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것. 조성물들 및 in vitro 및 ex vivo 방법들이 제공된다.

일 구현예에 있어서, 하기를 가지는 개인 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전 (reverse)시키기 위한 방법들이 제공된다:

울혈성 심부전 (CHF);

2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF); 및/또는 2형 당뇨병 및 당뇨병-연관 심기능 장애를 가지는 개인 또는 환자.

일 구현예에 있어서, 하기를 포함하는, 개인 또는 환자의, 울혈성 심부전 (CHF); 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF); 또는 2형 당뇨병 및 당뇨병-연관 심기능 장애를: 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키기 위한 방법이 제공된다:

(a) (i) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지를 내포하는, 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물이며, 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내에서 또는 in vivo 발현할 수 있는 것이고; 및

(ii) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지, 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물을, 상기 세포, 또는 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 투여 또는 전달하는 것으로서,

이로 인해 상기 개인 또는 환자의, 울혈성 심부전 (CHF); 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF); 또는, 2형 당뇨병 및 당뇨병-연관 심기능 장애를 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키는 것, 또는 이로 인해 2형 당뇨병 및/또는 연관 심장 질환 (당뇨병-연관 심기능 장애)에 대하여 상기 개인 또는 환자를 치료, 개선 (진행 저지를 포함), 반전 또는 보호 (예방)하는 것이거나;

(b) 상기 (a)의 방법에 있어서, 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 하기이거나 하기를 포함하는 것으로서:

아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터,

AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9,

레서스 (rhesus)-유래 AAV, 또는 상기 레서스-유래 AAV인 AAVrh.10hCLN2,

AAV 캡시드 돌연변이 또는 AAV 하이브리드 혈청형,

장기-친화성 AAV, 선택적으로 간-친화성 또는 골격근-친화성,

여기에서 선택적으로 상기 AAV는 야생형 (wt) AAV에게 복제를 허용하지 않는 특이 세포 유형을 표적화하는 것의 효율을 증가시키기 위해 및/또는 표적 세포 유형만 감염시키는 효율을 개선하기 위해 설계된 것이고,

및 선택적으로 상기 하이브리드 AAV는 하기를 포함하는 하나 이상의 개질들에 의하여 하이브리드 혈청형으로서 재표적화 또는 설계된 것이거나: 1) 캡시드 전환 (transcapsidation), 2) 캡시드 표면에 대한 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자이크 캡시드의 설계, 및/또는 4) 키메라성 캡시드의 설계;

(c) 상기 (a)의 방법에 있어서, 상기 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지는 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 것이거나;

(d) 상기 (c)의 방법에 있어서, 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열은 조절된 또는 유도성 프로모터로서,

여기에서 선택적으로 전사 및/또는 번역의 양성 (활성제) 및/또는 음성 (억제제) 조절자가 상기 우로코르틴 2-, 우로코르틴 1-, 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지에 작동 가능하게 연결된 것이거나;

(e) 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 한 방법에 있어서, 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2-, 우로코르틴 1-, 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지, 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물을, 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 투여하는 것은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질이 상기 혈류 또는 대순환 내로 방출되는 것을 야기하거나, 또는 상기 세포 내에서 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질의 증가되거나 지속적인 발현을 야기하는 것으로서,

여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질의 상기 방출 또는 증가되거나 지속적인 발현은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지에 작동적으로 연결된, 유도성 프로모터의 활성화, 또는 억제제의 억제 해제에 의존하는 것이거나; 또는

(f) 상기 (a) 내지 (e) 중 어느 한 방법에 있어서, 상기 3형 당뇨병 및 당뇨병-연관 심기능 장애는 상기 증가된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드의 in vivo 레벨에 임상적으로 신속한 반응을 나타내는 것이고, 선택적으로 심수축성 기능장애 또는 울혈성 심부전 (CHF)이 치료, 개선, 향상 또는 예방되는 것.

본 발명의 예시적인 방법들의 일 구현예에 있어서:

(a) 상기 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 핵산, 전사 또는 유전자; 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 이를 필요로 하는 상기 개인 또는 환자에게, 경구, 근육 (IM) 주사, 정맥 (IV) 주사, 피하 (SC) 또는 피부 주사, 경막 내 주사, 동맥 (IA) 주사, 관상동맥 주사, 흡입, 또는 바이오리스틱 (biolistic) 입자 전달 시스템, 또는 "유전자 총 (gene gun)" 사용, 공기 피스톨 또는 HELIOS™ 유전자 총 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 사용에 의하여 투여 또는 전달되거나; 또는

(b) 상기 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 전사 또는 유전자; 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 이를 필요로 하는 상기 개인 또는 환자에게, 상기 혈류에 인접하거나 또는 상기 혈류에 의해 배출된 상기 체내의 임의의 조직 또는 유체 공간 내부로 도입되어, 상기 인코딩된 단백질이 상기 조직 내의 세포들로부터 분비되고 상기 혈류 내로 방출될 수 있도록 하는 것에 의하여 투여 또는 전달된다.

일 구현예에 있어서, 상기 방법들은 추가적으로 하기를 인코딩하는 핵산, 전사 또는 유전자를 투여 또는 공동-투여하는 것을 포함한다: 포유류 강심성 (cardiotonic) 펩티드, 성장 인자, 세렐락신 (Serelaxin), 릴락신-2 (Relaxin-2), 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (Brain Natriuretic Peptide), 프로스타글란딘 합성 효소 (Prostacyclin Synthase), 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 또는 이들의 임의의 조합; 또는, 인간 강심성 펩티드, 인간 성장 인자, 세릭락신, 릴락신-2, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 프로스타글란딘 합성 효소, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-11, 또는 이들의 임의의 조합.

본 발명의 방법들의 일 구현예에 있어서:

(a) 상기 개인, 환자 또는 대상은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산, 전사 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산, 전사 또는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (예를 들어, 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산, 전사 또는 유전자에 작동적으로 연결된 것)를 유도 또는 활성화하는 자극 또는 신호를 투여 받거나;

(b) 상기 개인, 환자 또는 대상은 프로모터, 선택적으로 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자-특이 프로모터 (예를 들어, 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 것)의 활성제의 합성을 유도하는 자극 또는 신호를 투여 받거나;

(c) 상기 개인, 환자 또는 대상은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자-특이 프로모터의 천연 또는 합성 활성제의 합성을 유도하는 자극 또는 신호를 투여 받거나,

여기에서 선택적으로 상기 천연 활성제는 내인성 전사 인자이며;

(d) 상기 (c)의 방법에 있어서, 상기 합성 활성제는 특이적 및 선택적으로 내인성 또는 외인성 표적 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 유전자를 개시하도록 (turn on) 설계된 징크-핑거 (zinc-finger) DNA 결합 단백질이거나, 여기에서 선택적으로 상기 내인성 표적은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 핵산 또는 유전자 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 핵산 또는 유전자의 활성제, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성제이며;

(e) 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 한 방법에 있어서, 상기 자극 또는 신호는 생물학적, 광학적, 화학적 또는 약학적 자극 또는 신호를 포함하거나;

(f) 상기 개인, 환자 또는 대상은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 사후-전사 활성제, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성제의 발현을 자극 또는 유도하는 자극 또는 신호를 투여 받거나, 또는

(g) 상기 개인, 환자 또는 대상은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 전사 억제제 또는 사후-전사 억제제의 저해를 저해하거나 유도하는 자극 또는 신호를 투여 받는다.

본 발명의 방법들의 일 구현예에 있어서: 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 조절된 또는 유도성 프로모터의 발현을 유도하는 화학적 또는 약학적인 것은, 경구 항생제, 독시사이클린 (doxycycline) 또는 라파마이신 (rapamycin)이거나; 또는 독시사이클린을 이용한 tet-조절 시스템이 상기 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 3-발현 핵산 또는 유전자, 또는 이의 등가물의 발현을 유도하기 위해 사용된다.

본 발명의 방법들의 일 구현예에 있어서: 상기 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 액체, 젤, 하이드로젤, 분말, 또는 수용액 제형 내에서 제형화된다.

본 발명의 방법들의 일 구현예에 있어서: 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물, 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드 또는 폴리펩티드는, 소포 (vesicle), 리포좀, 나노입자 또는 나노리피드 입자 (NLP) 또는 등가물들 내에서 제형화되거나, 또는 소포, 리포좀, 나노입자 또는 나노리피드 입자 (NLP) 또는 등가물들을 이용하는 전달을 위하여 제형화된다.

본 발명의 방법들의 일 구현예에 있어서: 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 단리 (isolated)되거나 배양된 세포 내에서 제형화되거나, 또는 단리되거나 배양된 세포 내로 삽입 또는 형질주입 되고 (transfected), 및 선택적으로 상기 세포는 포유류 세포, 심장 세포, 또는 인간 세포, 비-인간 영장류 세포, 원숭이 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 기니피그 세포, 토끼 세포, 햄스터 세포, 염소 세포, 소 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 또는 고양이 세포이다.

본 발명의 방법들의 일 구현예에 있어서: 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산, 전사 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물, 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드 또는 폴리펩티드는, 약학 제형 또는 멸균 제형으로서 제형화된다.

본 발명의 방법들의 일 구현예에 있어서: 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물, 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드 또는 폴리펩티드는, 생산 제품, 인공 장기 또는 임플란트와 함께, 상에, 또는 이와 결합시켜 제형화 또는 전달된다.

본 발명의 방법들의 일 구현예에 있어서: 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드를 in vitro 또는 ex vivo 발현한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법을 실시하는 것을 포함하는, 하기와 연관된 2형 당뇨병을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한 방법들이 제공된다: 심수축성 기능장애; 울혈성 심부전 (CHF); 심장 섬유증; 심근세포 질환; 기능장애 또는 세포사멸; 및/또는, 폐 고혈압.

일 구현예에 있어서, 하기를 포함하는, 환자 또는 개인에서 2형 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 방법들이 제공된다:

(a) 본 발명의 방법을 실시하고; 및

(b) 우로코르틴-2 (UCn-2) 및/또는 우로코르틴-3 (UCn-3) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 우로코르틴-2 (UCn-2) 및/또는 우로코르틴-3 (UCn-3)이 인코팅된 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사를 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 투여하는 것으로서,

여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴-2 (UCn-2) 및/또는 우로코르틴-3 (UCn-3) 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합된, 합성된 및/또는 펩티드 유사체의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이의 변형체이고,

이로 인해 상기 환자 또는 개인의 상기 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것.

일 구현예에 있어서, 약제 제조에 있어서, 하기의 용도들이 제공된다:

- 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자;

- 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 내포하는, 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물; 또는

- 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내 또는 in vivo 발현할 수 있는, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지, 및 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물, 또는,

하기이거나 하기를 포함하는 것이 제공된다:

개인 또는 환자의 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF)을 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키거나,

심수축성 기능장애; 울혈성 심부전 (CHF); 심장 섬유증; 심근세포 질환, 기능장애 또는 세포사멸; 폐 고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환; 또는, 혈우병 또는 혈우병 B형 (Hemophilia B)을 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키거나,

환자 또는 개인의 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 또는 예방하거나, 또는

환자 또는 개인의 비만을 치료, 개선 또는 보호 또는 예방하는 것으로서,

여기에서 선택적으로 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 하기이거나 하기를 포함하는 것으로서:

아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터,

AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9,

레서스 (rhesus)-유래 AAV, 또는 상기 레서스-유래 AAV인 AAVrh.10hCLN2,

AAV 캡시드 돌연변이 또는 AAV 하이브리드 혈청형,

장기-친화성 AAV, 선택적으로, 간-친화성 또는 골격근-친화성,

여기에서 선택적으로 상기 AAV는 야생형 (wt) AAV에게 복제를 허용하지 않는 특이 세포 유형을 표적화하는 것의 효율을 증가시키기 위해 및/또는 표적 세포 유형만 감염시키는 효율을 개선하기 위해 설계된 것이고,

및 선택적으로 상기 하이브리드 AAV는 하기를 포함하는 하나 이상의 개질들에 의하여 하이브리드 혈청형으로서 재표적화 또는 설계된 것이거나: 1) 캡시드 전환, 2) 캡시드 표면에 대한 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자이크 캡시드의 설계, 및/또는 4) 키메라성 캡시드의 설계;

여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지는 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 것이거나;

여기에서 선택적으로 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열은 조절된 또는 유도성 프로모터로서,

여기에서 선택적으로 전사 및/또는 번역의 양성 (활성제) 및/또는 음성 (억제제) 조절자가 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지에 작동 가능하게 연결된 것이다.

일 구현예에 있어서, 하기가 제공된다:

전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산들 또는 유전자들;

우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 내포하는, 발현 매개체들, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물; 또는

우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산들, 전사들 또는 메시지들,

여기에서 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내에서 또는 in vivo 발현할 수 있는 것이고,

상기는 약제 제조 시 이용하기 위한 것이거나, 또는

하기에 이용되는 것인:

개인 또는 환자의 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF)을 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키거나,

심수축성 기능장애; 울혈성 심부전 (CHF); 심장 섬유증; 심근세포 질환, 기능장애 또는 세포사멸; 폐 고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환; 또는, 혈우병 또는 혈우병 B형 (Hemophilia B)을 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키거나,

환자 또는 개인의 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 또는 예방하거나, 또는

환자 또는 개인의 비만을 치료, 개선 또는 보호 또는 예방하는 것,

상기 대상의 세포에게, 또는 이를 필요로 하는 대상에게, 하기를 제공 및 투여 또는 전달하는 것을 포함하는:

전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자;

우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 내포하는, 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물; 또는,

상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내에서 또는 in vivo 발현할 수 있는, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지, 및 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물;

여기에서 선택적으로 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 하기이거나 하기를 포함하는 것으로서:

아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터,

AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9,

레서스 (rhesus)-유래 AAV, 또는 상기 레서스-유래 AAV인 AAVrh.10hCLN2,

AAV 캡시드 돌연변이 또는 AAV 하이브리드 혈청형,

장기-친화성 AAV, 선택적으로, 간-친화성 또는 골격근-친화성,

여기에서 선택적으로 상기 AAV는 야생형 (wt) AAV에게 복제를 허용하지 않는 특이 세포 유형을 표적화하는 것의 효율을 증가시키기 위해 및/또는 표적 세포 유형만 감염시키는 효율을 개선하기 위해 설계된 것이고,

및 선택적으로 상기 하이브리드 AAV는 하기를 포함하는 하나 이상의 개질들에 의하여 하이브리드 혈청형으로서 재표적화 또는 설계된 것이거나: 1) 캡시드 전환, 2) 캡시드 표면에 대한 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자이크 캡시드의 설계, 및/또는 4) 키메라성 캡시드의 설계;

여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지는 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 것이거나;

여기에서 선택적으로 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열은 조절된 또는 유도성 프로모터로서,

여기에서 선택적으로 전사 및/또는 번역의 양성 (활성제) 및/또는 음성 (억제제) 조절자가 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지에 작동 가능하게 연결된 것이다.

일 구현예에 있어서, 하기가 제공된다: 이를 필요로 하는 대상 또는 개인의, 울혈성 심부전 (CHF), 또는 울혈성 심부전 (CHF)의 증상들을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한, 하기를 포함하는, 방법들:

(a) 이를 필요로 하는 대상 또는 개인에게 우로코르틴 2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 전달하고,

이로 인해 이를 필요로 하는 상기 대상 또는 개인의 울혈성 심부전 (CHF)이 치료 또는 개선되도록 하거나;

(b) 상기 (a)의 방법에 있어서, 상기 핵산 서열은 벡터 내에 (예를 들어, 내포되어) 있는 것이거나;

(c) 상기 (b)의 방법에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이거나;

(d) 상기 (c)의 방법에 있어서, 상기 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV)이거나;

(e) 상기 (d)의 방법에 있어서, 상기 AAV는 혈청형 AAV8이거나;

(f) 상기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 방법에 있어서, 이를 필요로 하는 상기 대상 또는 개인은 2형 당뇨병 (T2DM)을 가지거나;

(g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 핵산 서열은 정맥 주사 (IV) 또는 근육 내로 투여되는 것.

본 발명의 하나 이상의 구현예들의 세부 사항들을 첨부한 도면들 및 하기 발명의 상세한 설명에서 상세히 설명한다. 본 발명의 다른 특징들, 목적들, 및 이점들은 발명의 상세한 설명 및 도면들, 및 청구범위들로부터 명백할 것이다.

여기에서 인용된 모든 출판물들, 특허들, 특허 출원들은 모든 목적들에 대하여 참조로서 명백하게 통합된다.

도 1은, 마우스들에서 AAV8.UCn2의 단독 정맥 주사가 플라즈마 UCn2 레벨들에서 15 배 증가의 결과를 야기하였다는 것 (최소한 7 개월 동안 유지함¹) 및: a) 2형 당뇨병 마우스들 (T2DM)의 2 가지 모델들에서 증가된 인슐린 감응성을 통해 글루코오스 이용을 정상화시켰다는 것 (도 1a 및 도 1b) 쇠약한 심장의 기능을 증가시켰다는 것 (도 1b)을 입증하는 데이터를 나타낸 것이다: 하기 실시예 1에서 상세하게 설명된 것처럼; 도 1a는 정상 마우스들이 AAV8.UCn2를 정맥 주사를 통해 5 x 10¹¹ gc 용량으로 투여받거나, 또는 음성 대조군으로서 식염수를 투여받고, 3 주 (w) 동안 표준 식단을 먹인 후 8 주 (w) 동안 고지방 식단을 먹였을 경우: AAV8.UCn2가 투여된 동물들에서 글루코오스 레벨들 ["예방", "레졸루션 (resolution)" 및 "글루코오스 부하 검사"]; 플라즈마 인슐린; 및 항상성 모델 평가 (HOMA-IR), 또는 "인슐린 저항성"이 개선되었음을 입증하는 데이터를 그래프로서 나타낸 것이다; 또한, 도 1b는 심근경색-유도된 울혈성 심부전 후 10 주 (w)된 마우스들로부터 수득된 데이터를 그래프로서 나타낸 것이다: AAV.UCn 2 (5 x 10¹¹ gc, 정맥 주사)는 울혈성 심부전의 유도 5 주 후에 전달 (식염수 대비, "CHF" 컬럼)되었고, AAV.UCn2가 투여된 동물은 심실 수축능 평가 (dP/dt)에 의해 측정된 바와 같이 좌심실 (LV)의 전반적인 수축능의 개선을 나타내었다.
도 2는, 하기 실시예 1에서 상세하게 설명된 것처럼; 2형 당뇨병 및 좌심실 기능장애 셋팅 하에서 UCn 2 발현 활성화 후의 AAV8.UCn2-Reg의 효율을 측정하기 위한 프로토콜을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 우로코르틴-2의 이로운 심혈관 효과들을 나타내는 표를 나타낸 것이다.
도 4는, 우로코르틴-2 (UCn-2)가 부신 피질 자극 호르몬 방출 인자 (CRF) 2형 수용체들과 상호작용하는 방식을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 5: 도 5a의 상단 패널은, 비조절된 발현 벡터이고, 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터가 간의 메틸화를 회피하는, 본 발명의 예시적인 AAV8 벡터의 벡터지도를 도식적으로 나타낸 것이다; 하단 패널은, AAV8.CBA.UCn2의 단독 정맥 주사 6 주 (w) 후에 플라즈마 UCn2가 15 배 이상 증가되었다는 것, 및 간 및 좌심실 발현이 증가되었다는 것을 보여주는 데이터를 그래프로서 나타낸 것이다; 또한, 도 5b는 최적화된 조절된 발현 시스템들을 위한 본 발명의 예시적인 AAV8 조절된 발현 벡터들을 도식적으로 나타낸 것으로서, 이러한 예시적인 AAV8 벡터들은, 테트라사이클린 조절 (지도 A) 또는 라파마이신 조절 (지도 B) 하에서, 마우스 UCn2의 조절된 발현을 인코딩한다.
도 6은, 정맥 UCn2 유전자 이동 후 정상적인 마우스들에서의 좌심실 기능의 데이터를 그래프로서 나타낸 것이다; 단리된 심장들에서의 증가된 심수축능 및 심확장능은 상기 유전자 이동 후 자가 분비 UCn2 효과를 입증하였다.
도 7은, 정맥 UCn2 유전자 이동 후 정상적인 마우스들에서의 좌심실 칼슘 (Ca²⁺) 조절의 데이터를 그래프로서 나타낸다: 도 7A는 정맥 주사로 UCn2 유전자 이동 후 SERC2a 레벨들을 음성 대조군과 대비하여 그래프로서 나타낸 것이다; 도 7B는 정맥 UCn2 유전자 이동 후 P16 포스포람반 (PLB) 레벨들의 증가를 나타내는 면역 블로팅 데이터를 음성 대조군과 대비하여 도식적으로 나타낸 것이다; 도 7C는 정맥 UCn2 유전자 이동 후 초 단위의 시간 변화에 따른 indo-1 비율 (indo-1 형광 비율)을 나타내는 데이터를 음성 대조군과 대비하여 그래프로서 나타낸 것이다 (indo-1은 세포 내 칼슘 농도들의 정밀한 측정을 위한 형광 Ca++ 지표이다); 도 7D는 정맥 UCn2 유전자 이동 후 Ca^{2 +} 감소 시간 (t_1/2, Tau)을 나타내는 데이터를 음성 대조군과 대비하여 그래프로서 나타낸 것이다.
도 8은, 정맥 UCn2 유전자 이동 후 쇠약한 심장에서의 증가된 기능을 보여주는 데이터를 나타낸 것으로서; 연구 프로토콜 도식을 좌측에 포함하고; LV dP/dt를 측정한, 음성 대조군과 대비하여 정맥 UCn2 유전자 이동 후 증가된 좌심실 기능의 그래프들을 우측에 포함한다.
도 9는, 정맥 UCn2 유전자 이동 후 혈당에 대한 효과들을 나타낸 데이터를 나타낸 것으로서; 사용된 예시적인 AAV8 유전자 이동 벡터의 도식을 상단에 포함하고, 유전자 이동 3 주 내지 4 주 후에 글루코오스를 평가한 것인, 공복 혈당 및 용량-반응 혈당 그래프들을 하단에 포함한다.
도 10은, 2형 당뇨병 (T2DM) 마우스들에서의 공복 혈당 효과들을 그래프로서 나타낸 것으로서, 고지방 식단 (HFD)을 먹인 2형 당뇨병 마우스들에서의 정맥 UCn2 유전자 이동 후 공복 혈당에 대한 효과들을 나타낸 것이고, 여기에서 정상적인 마우스들은 AAV8.UCn2 벡터들 (5 x 10¹¹ gc, 정맥) 또는 음성 대조군으로서 식염수를 투여받았고, 3 주 동안 표준 식단, 이후 8 주 동안 고지방 식단을 한 것이고; 고지방 식단 마우스들, 및 예비- 및 사후-투여 마우스들에서의 글루코오스 레벨들 ("예방" 및 "레졸루션"), 글루코오스 부하 검사 데이터, 플라즈마 인슐린, 및 항상성 모델 평가 (HOMA-IR)를 포함한다.
도 11은, 정맥 UCn2 유전자 이동 후 2형 당뇨병 마우스들 (T2DM)에서의 글루코오스 이용의 효과들을 그래프로서 나타낸 것으로서, 여기에서 db/db 마우스들은 AAV8.UCn2 벡터들 (5 x 10¹¹ gc, 정맥) 또는 음성 대조군으로서 식염수를 투여받았고, 상기 연구들은 유전자 이동 6 주 후 수행되었고; 좌측 그래프는 글루코오스 레벨들을 나타낸 것이고 우측 그래프는 그래프 하단 면적 (AUC)을 나타낸 것이다.
도 12는, 정맥 UCn2 유전자 이동 후 배양된 골격근 세포들에서의 글루코오스 이용의 효과들을 그래프로서 나타낸 것으로서, 여기에서 200 nM 인슐린, UCn2 펩티드, 또는 이 둘 모두 (I+U)가 첨가되었고; 세포들은 60 분 동안 인큐베이션 되었고, 글루코오스 흡수가 측정되었다.
도 13은, AAV8.UCn2를 정맥을 통해 5 x 10¹¹ gc 용량으로 투여받거나, 또는 음성 대조군으로서 식염수를 투여받기 전 및 (4 주 내지 8 주) 후의 마우스들에서의 글루코오스 이용을 입증하는 데이터를 그래프로서 나타낸 것으로서, 상기 그래프들은 글루코오스 레벨들 ("예방", "레졸루션" 및 "글루코오스 부하 검사"); 플라즈마 인슐린; 및 항상성 모델 평가 (HOMA-IR), 또는 "인슐린 저항성"을 나타낸다.
하기 실시예 2에서 상세하게 설명된 것처럼; 도 14A는, 예시적인 AAV8.CBA.UCn2 벡터지도를 도식적으로 나타낸 것이고, 도 14B는, 상기 벡터의 정맥 투여를 위한 실험적 프로토콜을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 15는, in vivo 좌심실 기능을 입증하는 데이터를 그래프로서 나타낸 것이다: 하기 실시예 2에서 상세하게 설명된 것처럼; 도 15A 및 도 15B는, 좌심실 압력 발생 (LV +dP/dt; A) 및 소멸 (LV -dP/dt; B) 속도를 측정하기 위해 수행된 in vivo 연구들로부터 수득된 데이터를 그래프로서 나타낸 것이다. AAV8.UCn2는 유전자 이동 5 주 후 LV +dP/dt 및 LV -dP/dt를 증가시켰다; 도 15C 및 도 15D는, UCn2 유전자 이동으로 인하여 심박수는 높아지는 경향을 보였고 (D), 좌심실 발생된 압력은 증가되었음 (C)을 나타내는 데이터를 그래프로서 나타낸 것이다.
도 16은, AAV8.UCn2 (HF+UCn2) 정맥 주사 또는 식염수 정맥 주사 후 심부전 (HF)을 가진 마우스들로부터 수득된 심근세포들에서의 시토졸성 Ca^{2 +} 과도현상들 (cytosolic Ca^{2 +} transients)을 나타낸 것이다: 하기 실시예 2에서 상세하게 설명된 것처럼; 도 16A 및 도 16B는, HF+UCn2 마우스들 (p=0.0001)로부터 수득된 심근세포들에서의 기저 Ca^{2 +} 방출 (수축기-확장기 Ca^{2 +})이 증가되었음을 그래프로서 나타낸 것으로서, 여기에서 도 16A는 각 그룹 당 1 개의 심장으로부터의 대표적인 Indo-1 Ca²⁺ 과도현상 기록들로서, UCn2 유전자 이동 5 주 후에 심부전을 가진 마우스들로부터 단리된 심근세포들 내에서 증가된 Ca^{2 +} 피크를 나타내었고; 도 16B는 그룹 당 3 마리의 마우스들로부터의 데이터를 그래프로서 요약한 것이고; 도 16C 및 도 16D에서, 그래프로서 나타내어진 것은, UCn2 유전자 이동 5 주 후 심부전을 가진 마우스들로부터의 심근세포들 내에서 Ca^{2 +} 감소 시간 (T_1/2, Tau)이 짧아졌다는 것이고, 도 16C는 각 그룹 당 1 개의 심장으로부터의 심근세포들로부터의 대표적인 정규화된 Ca^{2 +} 과도현상들이고, 도 16D는 그룹 당 3 마리의 마우스들로부터의 요약 데이터를 그래프로서 나타낸 것이고; 도 16E (상단 패널)는 면역 블로팅 데이터 (하단 패널)를 나타낸 것으로서, UCn2 유전자 이동이 정상적인 마우스들로부터 및 심부전을 가지는 마우스들로부터 얻은 좌심실에서의 SERCA2a 단백질을 증가시켰음을 나타낸 것이다.
도 17은, 심근세포 cAMP-PKA 신호를 나타낸 것이다: 하기 실시예 2에서 상세하게 설명된 것처럼; 좌심실 샘플들 (도 17A, 도 17C, 도 17D) 또는 심근세포들 (도 17B)은 심부전 (HF)을 가지는 마우스들로부터 및 AAV8.UCn2 (UCn2)를 받은 심부전을 가지는 마우스들로부터 수득되었고; 도 17A는, cAMP 생산을 그래프로서 나타낸 것이고; 도 17B는, PKA 활성을 나타내는 면역 블로팅을 나타낸 것이고; 도 17C는, CamK II 발현 및 인산화를 그래프로서 나타낸 것으로서, 여기에서 UCn2 유전자 이동은 CamK II의 감소된 Thr286 인산화와 연관된 것이고 (좌측 패널, GAPDH로 정규화됨); 도 17D는, 심장 미오신 경쇄 키나아제 (light chain kinase)를 그래프로서 나타낸 것으로서, 여기에서 UCn2 유전자 이동은 증가된 심장 미오신 경쇄 키나아제 (cMLCK) 단백질과 연관된 것이다 (좌측 패널, CAPDH로 정규화됨).
다양한 도면들에서 동일한 도면 부호들은 동일한 요소들을 나타낸다.

일 구현예에 있어서, 2형 당뇨병을 가지는 대상들에서 글루코오스 이용 및 심기능을 개선하거나, 또는 2형 당뇨병을 가지는 대상들에서 기능장애성 글루코오스 이용 및 심기능의 발현 또는 발생을 예방하기 위한 조성물들 및 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 우로코르틴-2 (UCn-2) 및/또는 우로코르틴-3 (UCn-3)의 전달 및 조절된 발현을 가능하게 하는, 벡터들과 같은, 우로코르틴-2 (UCn-2) 및/또는 우로코르틴-3 (UCn-3) 발현 핵산들을 포함하는 조성물들을 제공하며, 이는 상기 펩티드가 상기 혈류 내로 방출되어 2형 당뇨병을 가지는 대상들에서 글루코오스 이용 및 심기능에 관한 이로운 효과들을 가질 수 있도록 하는 결과를 야기한다. 일 구현예에 있어서, 당뇨병-연관 심기능 장애를 가지는 당뇨병을 가지는 환자들의 부분 집합을 표적으로 하는 조성물들 및 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 이러한 환자들의 정상 혈당 (euglycemia)을 회복하고 심기능을 개선하기 위하여 2형 당뇨병 및 관련 심기능 장애를 가지는 환자들의 치료를 위한 조성물들 및 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 우로코르틴-2 (UCn-2) 및/또는 우로코르틴-3 (UCn-3)을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 예를 들어, 유전자 치료법 벡터, 예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터 8형 (AAV8)의 1 차례의 정맥 (IV) 주사를 이용하여 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF)을 치료, 개선, 반전 (reverse), 또는 발현 또는 발생을 예방하기 위한 조성물들 또는 방법들이 제공된다.

일 구현예에 있어서, 울혈성 심부전 (CHF)을 가지는 이러한 2형 당뇨병 환자들의 35%를 포함하는, 2형 당뇨병 환자들에게 실시되는 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 2형 당뇨병 환자들에게 관상 동맥 및 주변 동맥 질환, 심근경색, 울혈성 심부전 및/또는 뇌졸중이 발생할 위험성을 감소시키기 위해 실시되는 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 독립적으로 비정상적인 심기능에 또한 연관되어 있는, 지속적인 당뇨병을 치료 및/또는 개선하기 위해 실시되는 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 인슐린 감응성을 증가시키고 베타 세포 기능을 보존하기 위해 실시되는 방법들이 제공되고, 이에 따라, 일 구현예에 있어서, 본 발명은 2형 당뇨병의 조기 관리에 있어서 중추적인 역할을 수행한다.

일 구현예에 있어서, 유전자를 발현하는 발현 매개체 (delivery vehicle), 예를 들어, 벡터는, 외래 진료 동안 근육 주사 ("샷"과 유사함) 또는 정맥 주사 중 어느 것을 통해서든 전달될 수 있으며, 이로 인해 심장에서의 유전자 발현 자체가 요구되는 경우 조우하게 되는 문제점들을 피할 수 있다. 혈류에서 원하는 단백질의 지속적인 분비는 주입 (infusion)으로 인한 단백질들의 투여의 어려움들 및 비용을 회피하게 한다 - 주입은 체내에서 매우 짧은 반감기를 나타내는 다수의 단백질들에 대해 특히 문제가 될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 조절된 치료를 제공하고 최적의 안정성을 보장하는, 유전자 발현을 용이하고 효율적으로 개시 (turn on) 및 차단 (turn off)할 수 있는, 우로코르틴-2 (UCn-2) 및/또는 우로코르틴-3 (UCn-3) 발현 핵산들의 조절된 발현을 위해 제공된다.

일 구현예에 있어서, 당뇨병-연관 심기능 장애를 치료, 진행 저지, 개선 및/또는 예방하기 위한 유전자 이동 조성물들 및 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 당뇨병을 위한 표준 의학적 치료법 (일반적으로 경구 저혈당증 시약들 및 인슐린을 포함하는 3 가지 이상의 약물들) 및/또는 심부전을 위한 표준 치료법 (일반적으로 4 가지 이상의 약물들)과 함께 또는 대신 사용될 수 있는 조성물들 및 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 심기능 장애를 가지는 당뇨병 대상들에서 역효과들을 가질 수 있는, 경구 저혈당증 시약들과 함께 또는 대신 사용될 수 있는 조성물들 및 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하는 것은 환자들이 필요로 하는 약물들의 수들을 절감시키며, 이에 따라 비용들 및 부작용들을 절감한다. 일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하는 것은 당뇨병에서 췌장 베타 세포 기능을 보존할 수 있고, 이에 따라 인슐린이 요구되는 것을 미연에 방지할 수 있다.

예시적 적용들에 있어서, 본 발명은 우로코르틴-2 (UCn-2) 및/또는 우로코르틴-3 (UCn-3) 펩티드의 조절된 발현을 위해 제공되는 조절된 발현 시스템을 적용한다. 예를 들어, 장기 바이러스 발현 벡터는 내과 병원에서 전신의 정맥으로 (또는 근육 주사를 통해) 주사될 수 있다. 4주 후, 상기 대상은 상기 유전자의 발현을 활성화시킬 경구 항생제 (독시사이클린 또는 라파마이신)을 하루에 한번 (또는 그 이하) 삼킨다. 상기 유전자는 합성되고 상기 대상의 혈액으로 방출되며, 이어서 당뇨병-연관 심기능 장애를 가지는 상기 환자들에게서 글루코오스 이용 및 심기능에 이로운 유리한 생리학적 효과들을 가진다. 상기 내과 의사 또는 대상이 상기 치료의 중단을 원하는 경우, 상기 대상은 단순히 활성화시키는 항생제의 투약을 멈추면 된다.

본 발명의 일 구현예의 상기 효과를 입증하기 위하여, 본 발명자들은 우로코르틴-2를 인코딩하는 AAV 벡터를 이용하였으며 정맥 전달을 이용하여 울혈성 심부전을 가지는 마우스들에게 상기 벡터를 투여하였다. 하기 결과들이 나타났다: 1) 상기 벡터의 정맥 전달 4 주 내지 6 주 후 상기 전이유전자의 증가된 혈청 레벨들; 2) 심수축성 기능 (수축기 기능)에 관한 확연한 이로운 효과들; 및 3) 심장 이완 (확장기 기능)에 관한 확연한 이로운 효과들. 추가적인 연구들에서, 본 발명의 일 구현예의 상기 효과를 입증하기 위하여, 본 발명자들은 2형 당뇨병의 설치류 모델들에서 UCn2의 정맥 전달의 유용성을 나타내었다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들을 실시하기 위한 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자의 in vivo 발현을 위해 발현 매개체들, 벡터들, 재조합 바이러스들 등이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 상기 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 발현하는 상기 발현 매개체들, 벡터들, 재조합 바이러스들 등은 근육 (IM) 주사, 정맥 (IV) 주사, 피하 주사, 흡입, 바이오리스틱 (biolistic) 입자 전달 시스템 (예를 들어, "유전자 총"이라고 통상 불림) 등을 통해, 예를 들어, 외래 진료 동안, 예를 들어, 외래 환자에게 전달될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 전달의 이러한 "주변 (peripheral)" 모드, 예를 들어, 근육 또는 정맥 주사된 발현 매개체들, 벡터들, 재조합 바이러스들 등은, 유전자들 또는 핵산들이 장기, 예를 들어, 간, 골격근, 폐 또는 신장 세포들 또는 조직에서 직접적으로 발현되는 경우 조우하게 되는 문제점들을 피할 수 있도록 해준다. 혈류 또는 대순환에서 원하는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질(들)의 지속적인 분비는 또한 주입을 통해 단백질들을 투여하는 것의 어려움들 및 비용을 피하는 것이다.

일 구현예에 있어서, 조절된 치료들 및 최적의 안전성의 보장을 위하여 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 발현을 용이하고 효과적으로 개시 (turn on) 및 차단 (turn off)하기 위한 방법들이 제공된다.

일 구현예에 있어서, 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질 또는 상기 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산(들) 또는 유전자(들)에 의해 발현되는 단백질들은, 그들의 위치 또는 활성화되는 위치들로부터 멀리 떨어져 있는 (예를 들어, 해부학적으로 먼) 혈액 또는 대순환 내로 분비되더라도, 조직 또는 장기, 예를 들어, 심장, 혈관들, 폐들, 신장들, 또는 다른 표적들에 대해, 이로운 또는 유리한 효과들 (예를 들어, 치료적 또는 예방적)을 가지며, 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질이 폐, 신장, 간 또는 골격근 조직에서 발현되고, 떨어져 있는 조직, 예를 들어, 심장 또는 혈관;에 대해 이로운 효과를 가진다.

예시적인 구현예에 있어서, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 우로코르틴-2를 인코딩하는 유전자가 사용되었으나, 다른 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산들 또는 유전자들이 본 발명의 방법들을 실시하기 위하여 사용될 수 있고, 예를 들어, 울혈성 심부전 (CHF) 또는 폐 고혈압을 치료하기 위하여: 우로코르틴-3, 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (울혈성 심부전을 위해), 프로스타글란딘 합성 효소 (폐 고혈압을 위해), 성장 호르몬, 및/또는 인슐린-유사 성장 인자-1, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 것이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 구현예에 있어서, 심장 또는 폐 질환, 예를 들어, 울혈성 심부전 (CHF) 또는 폐 고혈압을 치료하기 위하여 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-형 유전자의 조절된 발현을 위해 제공되는 조절된 발현 시스템을 위한, 적용들, 및 조성물들 및 방법들이 제공된다.

예를 들어, 일 구현예에 있어서, 재조합 바이러스 (예를 들어, 장기 바이러스 또는 바이러스 벡터), 또는 벡터, 또는 발현 벡터 등이, 예를 들어, 전신 정맥에서 (예를 들어, 정맥), 또는 근육 (IM) 주사에 의하여, 흡입에 의하여, 또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템 (예를 들어, "유전자 총"으로 통상 불림)에 의하여, 예를 들어, 내과 병원에서, 예를 들어, 외래 환자에게, 주사될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 수 일 또는 수 주 후 (예를 들어, 4 주 후), 상기 개인, 환자 또는 대상에게, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산들 또는 유전자들의 발현을 유도하는 화학적 또는 약학적인 것이 투여된다 (예를 들어, 흡입, 주사 또는 삼킴); 예를 들어, 경구 항생제 (예를 들어, 독시사이클린 또는 라파마이신)이 하루에 한 번 (또는 그 이상 또는 그 이하) 투여되며, 이는 상기 유전자의 발현을 활성화시킬 것이다. 일 구현예에 있어서, 상기 "활성화", 또는 상기 핵산 또는 유전자의 발현의 유도 (예를 들어, 유도성 프로모터에 의함) 이후, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질이 합성되고 상기 대상의 순환계 내로 (예를 들어, 혈액 내로) 방출되며, 이어서 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질 또는 발현된 단백질들에 따라, 상기 개인 또는 환자에게 이로운 (예를 들어, 심장, 신장 또는 폐 기능을 이롭게 하는) 유용한 생리학적 효과들, 예를 들어, 치료적 또는 예방적인 효과들을 가진다. 상기 내과 의사 또는 대상이 상기 치료의 중단을 원하는 경우, 상기 대상은 단순히 활성화시키는 화학적 또는 약학적인 것, 예를 들어 항생제의 투약을 멈추면 된다.

본원의 발명자들은 우로코르틴-2를 인코딩하는 AAV 벡터를 사용하였고 상기 벡터는 정맥 전달을 이용하여 마우스들에게 투여되었다. 하기 결과들이 나타났다: 1) 상기 벡터의 정맥 전달 4 주 내지 6 주 후 전이유전자의 혈청 레벨들의 17 배 증가; 2) 심수축성 기능 (수축기 기능)에 관한 확연한 이로운 효과들; 및 3) 심장 이완 (확장기 기능)에 관한 확연한 이로운 효과들.

일 구현예에 있어서, 하기를 포함하는 적용들이 제공된다: 심각한, 낮은 박출률 심부전의 치료를 포함하는, 2형 당뇨병을 가지는 대상들에서 심기능 치료 및 개선; 폐 고혈압의 치료; 보존된 박출률을 가지는 심부전의 치료; 당뇨병-연관 폐 고혈압 및 심부전의 치료를 위한 입원 및 혈관활성 (vasoactive) 펩티드들의 지속적인 정맥 주입들을 요구하는 현재의 치료법들의 대체 요법; 및, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-형 유전자의 조절된 발현이 인체 내에서 원거리에서 유리한 효과들을 증진시키기 위하여 사용될 수 있는 다른 상태들의 치료.

핵산들의 생성 및 조작

일 구현예에 있어서, 본 발명의 예시적 방법들을 실시하기 위하여, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드들을 인코딩하는 단리된, 합성된 및/또는 재조합된 핵산들 또는 유전자들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들을 실시하기 위하여, in vivo 발현을 위한 발현 매개체, 예를 들어, 벡터 또는 재조합 바이러스 내에 재조합된 형태의 (예를 들어, 스플라이싱 된) 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산들 또는 유전자들이 제공된다. 다른 구현예에 있어서, 유전자들 또는 메시지들 (mRNA들)의 상기 발현을 저해할 수 있는 저해 핵산들 (예를 들어, siRNA, microRNA, 안티센스, 리보자임)을 인코딩하는, 원하는 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3 유전자의 발현을 저해하는, 예를 들어, 단리된, 합성된 및/또는 재조합된 핵산들이 제공된다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산들은, 예를 들어, cDNA 라이브러리들의 클로닝 (cloning) 및 발현, PCR에 의한 메시지 또는 유전체 DNA의 증폭 등에 의해 제조, 단리 및/또는 조작된다. DNA, RNA, iRNA, 안티센스 핵산, cDNA, 유전체 DNA, 벡터들, 바이러스들 또는 이들의 하이브리드들을 포함하는, 본 발명을 실시하기 위해 사용된 상기 핵산들 및 유전자들은, 다양한 소스들로부터 단리될 수 있고, 유전적으로 설계될 수 있으며, 증폭될 수 있고, 및/또는 발현될 수 있고/재조합으로 생성될 수 있다. 이러한 핵산들로부터 생성된 재조합 폴리펩티드들 (예를 들어, 본 발명을 실시하기 위해 사용된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 키메라성 단백질들)은 원하는 활성을 위하여 개별적으로 단리되거나 클로닝되고 검정될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 (예를 들어, AAV 구성물들 또는 하이브리드들), 박테리아, 곰팡이, 포유류, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템들 또는 발현 매개체들을 포함하는, 임의의 재조합 발현 시스템 또는 유전자 치료법 전달 매개체가 사용될 수 있다.

대안적으로, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산들은, 예를 들어, Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; 미국 특허등록번호 4,458,066에 기술된 바와 같은, 잘-알려진 화학적 합성 기술들에 의하여 in vitro 합성될 수 있다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산들의 조작을 위한 기술들, 예를 들어, 서브 클로닝, 표지 프로브들 [예를 들어, Klenow 중합효소, 틈(nick) 번역, 증폭을 이용한 랜덤-프라이머 표지], 서열화, 하이브리드화 등과 같은 것은, 과학 문헌 및 특허 문헌, 참조로, 예를 들어, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)에 잘 기술되어 있다.

본 발명의 방법들을 실시하기 위해 사용되는 핵산들을 수득 및 조작하는 또 다른 유용한 수단은 유전체 샘플들로부터 클로닝하는 것이며, 원하는 경우, 예를 들어, 유전체 클론들 또는 cDNA 클론들로부터 단리 또는 증폭된 삽입물들을 스크리닝하고 재-클로닝하는 것이다. 본 발명의 방법들에서 사용되는 핵산의 소스들은, 예를 들어, 포유류 인공 염색체들 (MACs), 참조로, 예를 들어, 미국 특허등록번호 5,721,118; 6,025,155; 인간 인공 염색체들, 참조로, 예를 들어, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; 이스트 인공 염색체들 (YAC); 박테리아 인공 염색체들 (BAC); P1 인공 염색체들, 참조로, 예를 들어, Woon (1998) Genomics 50:306-316; P1-유래 벡터들 (PACs), 참조로, 예를 들어, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; 코스미스들, 재조합 바이러스들, 파지들 또는 플라스미드들에 함유된 유전체 또는 cDNA 라이브러리들을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들을 실시하기 위하여, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3 융합 단백질들 및 이들을 인코딩하는 핵산들이 사용된다.

일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 단백질에 결합 또는 융합된 이종 펩티드 또는 폴리펩티드는 형광 검출, 증가된 안정성 및/또는 단순화된 정제와 같은, 원하는 특성을 부여하는 N-말단 식별 펩티드가 될 수 있다. 또한, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 펩티드들 및 폴리펩티드들이 합성되고, 예를 들어, 더 많은 면역 유전성 펩티드를 생산하기 위해 이들에 결합된 하나 이상의 추가적인 도메인들을 가지는 융합 단백질들로서 발현될 수 있으며, 이로 인해 재조합으로 합성된 펩티드를 더욱 용이하게 단리하고, 항체들 및 항체-발현 B 세포들 등을 확인 및 단리할 수 있다. 도메인들을 이용 가능하게 하는 검출 및 정제는, 예를 들어, 고정된 금속들 상에서 정제를 가능하게 하는 폴리히스티딘 트랙들 및 히스티딘-트립토판 모듈들과 같은 금속 킬레이팅 펩티드들, 고정된 면역글로불린 상에서 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인들, 및 FLAGS 확장/친화 정제 시스템 (Immunex Corp, Seattle WA)에서 이용된 상기 도메인을 포함한다. 정제를 가능하게 하기 위하여, 정제 도메인 및 상기 모티프-함유 펩티드 또는 폴리펩티드 사이에 Xa 인자 또는 엔테로키나아제 (Invitrogen, San Diego CA)와 같은 절단 가능한 링커 서열들을 포함한다. 예를 들어, 발현 벡터는 티오레독신 및 엔테로키나아제 절단 위치가 뒤를 잇는 6 개의 히스티딘 잔기들에 연결된 에피토프-인코딩 핵산 서열을 포함할 수 있다 [예를 들어, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414 참조]. 상기 엔테로키나아제 절단 위치가 상기 융합 단백질의 나머지로부터 상기 에피토프를 정제하기 위한 수단을 제공하는 한편, 상기 히스티딘 잔기들은 검출 및 정제를 가능하게 한다. 융합 단백질들을 인코딩하는 벡터들에 관련된 기술 및 융합 단백질들의 적용은 과학 문헌 또는 특허 문헌, 예를 들어, 참고로, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53에 잘 기술되어 있다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산들 또는 핵산 서열들은, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 유전체 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 펩티드 핵산(PNA), 또는 천연 또는 합성 기원의, 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질이 될 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물들은, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 임의의 것의 임의의 단편을 포함하는 "핵산들" 또는 "핵산 서열들"을 포함하며; 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있는 유전체 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA (예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA, iRNA)를 포함하며; 센스 또는 안티센스 가닥, 또는 펩티드 핵산 (PNA), 또는 예를 들어, iRNA, 리보핵산단백질들 (예를 들어, 예를 들어, 이중 가닥 iRNA들, 예를 들어, iRNP들)을 포함하는, 천연 또는 합성 기원의 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질일 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물들은, 천연 뉴클레오티드들의 알려진 유사체들을 함유하는, 핵산들, 즉, 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물들은, 합성 뼈대들 (backbones)을 가지는 핵산-유사 구조들을 포함하며, 예를 들어, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156을 참조할 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물들은 화학적으로 합성될 수 있는 단일 가닥 폴리디옥시뉴클레오티드 또는 2 개의 상동인 폴리디옥시뉴클레오티드 가닥들을 포함하는 "올리고뉴클레오티드들"을 포함한다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물들은 5' 인산염을 가지지 않는 합성 올리고뉴클레오티드들을 포함하며, 이에 따라 키나아제의 존재 하에서 ATP와 인산염의 첨가 없이 또 다른 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈인산화 되지 않은 절편과 연결될 수 있다.

대안적인 측면에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물들은 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3을 생성하는 것과 연관된 유전자들 또는 DNA의 임의의 절편을 포함한다; 이는, 적용 가능한 곳의, 개별 코딩 절편들 (엑손들) 사이의 중간 서열들 (인트론들) 뿐만 아니라 상기 코딩 영역의 이전 및 이후의 영역들 (리더 및 트레일러)을 포함할 수 있다. "작동 가능하게 연결된" 것은 둘 이상의 핵산 (예를 들어, DNA) 절편들 사이의 기능적 관계를 나타낼 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 이는 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 이것이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극 또는 조절하는 경우, 프로모터는 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산과 같은, 코딩 서열에 작동적으로 (operatively) 연결될 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 프로모터 전사 조절 서열들은 그들이 전사된 서열에 물리적으로 근접할 수 있는, 즉, 시스-활성화될 수 있는 곳에서, 전사된 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 인핸서들과 같은 전사 조절 서열들은 그들이 전사를 향상시키는 코딩 서열들에 물리적으로 근접하거나 인접하게 위치할 필요가 없다.

대안적인 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 "발현 카세트들 (expression cassettes)"의 사용을 포함하며, 이는 상기 핵산, 예를 들어, 이와 같은 서열들과 호환 가능한 숙주에서 구조 유전자 또는 전사 (예를 들어, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질을 인코딩한 것)의 발현에 영향을 미칠 수 있는 것일 수 있다. 발현 카세트들은 폴리펩티드 코딩 서열 또는 저해 서열과 작동 가능하게 연결되는 적어도 하나의 프로모터를 포함할 수 있고; 일 측면에 있어서, 다른 서열들, 예를 들어, 전사 종결 신호들과 작동 가능하게 연결되는 적어도 하나의 프로모터를 포함할 수 있다. 발현에 영향을 미치는데 필요하거나 도움을 주는 추가적인 인자들, 예를 들어, 인핸서들이 또한 사용될 수 있다.

대안적인 측면에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 발현 카세트들은 또한 플라스미드들, 발현 벡터들, 재조합 바이러스들, 재조합된 "네이키드 DNA" 벡터의 임의의 형태 등을 포함한다. 대안적인 측면에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 "벡터"는 세포를 감염, 형질주입 (transfect), 일시적으로 또는 영구적으로 형질도입 (transduce)시킬 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 벡터는 네이키드 핵산, 또는 단백질 또는 지질과 복합된 핵산일 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 벡터들은 바이러스성 또는 박테리아성 핵산들 및/또는 단백질들, 및/또는 막들 (예를 들어, 세포막, 바이러스 지질 막 등)을 포함할 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 벡터들은 DNA의 절편들이 부착되고 복제될 수 있는 레플리콘들 (예를 들어, RNA 레플리콘들, 박테리오파지들)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 벡터들은, RNA, 자율적인 자가-복제 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA (예를 들어, 플라스미드들, 바이러스들 등; 예를 들어, 미국 특허등록번호 5,217,879참조)를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 발현 또는 비-발현 플라스미드들 둘 다를 포함할 수 있다. 대안적인 측면에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 상기 벡터는 자율적인 구조로서 체세포 분열 동안 상기 세포들에 의해 안정적으로 복제될 수 있거나, 또는 상기 숙주의 유전체 내부로 혼입될 수 있다.

대안적인 측면에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 "프로모터들"은, 세포, 예를 들어, 심장, 폐, 근육, 신경 또는 뇌 세포와 같은 포유류 세포 내에서 코딩 서열의 전사를 구동할 수 있는 모든 서열들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 상기 구조물들에서 사용되는 프로모터들은 유전자의 전사 시기 및/또는 속도를 제어 또는 조절하는 것에 연관된 시스-활성화 전사 조절 요소들 및 조절 서열들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 프로모터는, 전사 조절에 연관된, 인핸서, 프로모터, 전사 종결자, 복제의 기원, 염색체 통합 서열, 5' 및 3' 미번역 영역들, 또는 인트론 서열을 포함하는, 시스-활성화 전사 조절 요소가 될 수 있다. 이러한 시스-활성화 서열들은 전형적으로 전사를 수행 [개시 (turn on)/ 차단 (turn off), 제어, 조절 등]하기 위해 단백질들 또는 다른 생물분자들과 상호작용한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 "구성적" 프로모터들은 발생 또는 세포 분화의 대부분의 환경적 조건들 및 상태들 하에서 발현을 연속적으로 구동하는 것들일 수 있다. 일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 "유도성" 또는 "조절성" 프로모터들은 환경 조건들, 투여된 화학적 시약들, 또는 발생 조건들의 영향 하에서 본 발명의 상기 핵산의 발현을 지시할 수 있다.

유전자 치료법 및 유전자 전달 매개체들

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들은 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지의 페이로드를 유전자 치료법 전달 매개체들로서 세포 또는 세포들로 in vitro, ex vivo, 또는 in vivo 전달하기 위한 핵산 (예를 들어, 핵산을 인코딩하는 유전자 또는 폴리펩티드) 전달 시스템들의 이용을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들을 실시하기 위해 사용되는 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물들은 하기이거나 하기를 포함한다: 아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터; AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9; 레서스-유래 AAV, 또는 상기 레서스-유래 AAV인 AAVrh.10hCLN2; 장기-친화성 AAV; 및/또는 AAV 캡시드 돌연변이 또는 AAV 하이브리드 혈청형. 일 구현예에 있어서, 상기 AAV는 야생형 (wt) AAV에게 복제를 허용하지 않는 특이 세포 유형을 표적화하는 것의 효율을 증가시키기 위해 및/또는 표적 세포 유형만 감염시키는 효율을 개선하기 위해 설계된다. 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 AAV는 하기를 포함하는 하나 이상의 개질들에 의하여 하이브리드 혈청형으로서 재표적화 또는 설계된다: 1) 캡시드 전환, 2) 캡시드 표면에 대한 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자이크 캡시드의 설계, 및/또는 4) 키메라성 캡시드의 설계. 야생형 (wt) 바이러스들에게 복제를 허용하지 않는 특이 세포 유형들을 표적화하는 것의 효율을 증가시키고 표적 세포 유형만 감염시키는 효율을 개선하기 위하여 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드를 설계하는 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다; 예를 들어, Wu et al., Mol. Ther. 2006 Sep; 14(3):316-27. Epub 2006 Jul 7; Choi, et al., Curr. Gene Ther. 2005 Jun; 5(3): 299-310을 참조할 수 있다.

예를 들어, 상기 레서스-유래 AAV인 AAVrh.10hCLN2 또는 이의 등가물들이 사용될 수 있으며, 여기에서 상기 레서스-유래 AAV는 인체 내에 미리-존재하고 있던 임의의 면역에 의해 저해되지 않을 수 있다; 예를 들어, Sondhi, et al., Hum Gene Ther. Methods. 2012 Oct; 23(5): 324-35, Epub 2012 Nov 6; Sondhi, et al., Hum Gene Ther. Methods. 2012 Oct 17을 참조할 수 있다; 이는, AAVrh.10hCLN2를 래트들 및 비인간 영장류들의 중추신경계 (CNS)에 인간들에게 확장 가능한 용량들로 직접 투여하는 것이 허용되는 안전 프로필 (safety profile)을 가지며 상기 중추신경계에서 중요한 페이로드 발현을 중재한다는 것을 교시한다.

또한, 예를 들어, 심장 유전자 이동 (심장 친화성 AAV)을 위해 특별히 설계된 AAV 벡터들이 사용될 수 있고, 예를 들어, 개선된 형질도입 효율 및 심근 특이성을 가지는 AAVM41 돌연변이가 사용될 수 있으며, 예를 들어, Yang, et al. Virol J. 2013 Feb 11; 10(1):50을 참조할 수 있다.

아데노-연관 바이러스들 (AAV)이 영장류들의 통상적인 감염 시약들이기 때문에, 또한 동시에, 건강한 영장류들은 AAV-매개 유전자 이동 치료적 전략들을 저해하는 AAV-특이 중화 항체들 (NAbs)의 거대 풀을 보유하기 때문에, 본 발명의 방법들은, 치료 전에, 특히 자주 사용되는 AAV8 캡시드 성분을 가지는, AAV-특이 NAbs에 대한 환자 후보자들의 스크리닝을 포함하고, 이로써 개별화된 치료 설계를 가능하게 하고 치료 효율을 증진시킨다; 예를 들어, Sun, et al., J. Immunol. Methods. 2013 Jan 31; 387(1-2):114-20, Epub 2012 Oct 11을 참조할 수 있다.

키트들 및 설명들

본 발명의 조성물들 및 방법들을 포함하며, 이들의 사용을 위한 설명들을 포함하는, 세포들을 포함하는 키트들, 발현 매개체들 (예를 들어, 재조합 바이러스들, 벡터들) 등을 포함하는, 키트들이 제공된다.

예를 들어, 일 구현예에 있어서, 예를 들어, 우로코르틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드; 또는 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, (b) 본 발명의 액체 또는 수용액 제형, 또는 (c) 본 발명의 상기 소포, 리포좀, 나노입자 또는 나노리피드 입자를 포함하는, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 조성물들을 포함하는 키트들이 제공된다. 일 측면에 있어서, 상기 키트는, 예를 들어, 원하는 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3 레벨을 혈류 내에서 증가시키기 위한, 또는 세포, 예를 들어, 심장 또는 폐 세포를 보호하기 위한; 또는 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 예방 또는 개선하기 위한, in vitro 또는 ex vivo 방법들인, 본 발명의 임의의 방법들을 실시하기 위한 설명들을 추가적으로 포함한다.

제형들

일 구현예에 있어서, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3 레벨들을 in vivo 증가시키는데 사용하기 위한 조성물들 및 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 이러한 조성물들은 이러한 목적들을 위해 제형화된 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴3-인코딩 핵산들, 예를 들어, 완충액 내에서, 식염수 내에서, 분말 내에서, 에멀젼, 소포 내에서, 리포좀 내에서, 나노입자 내에서, 나노리포 입자 등 내에서 제형화된, 발현 매개제들 또는 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 당뇨병 (1형 및 2형, 또는 성인 개시 당뇨병을 포함함) 또는 당뇨병전기, 또는 비만 또는 과체중을 치료, 개선 또는 예방하기 위한; 또는 체중 감소를 자극하기 위한, 또는 식욕 억제제로서 작용하기 위한, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들의 투여를 포함하는 방법들이 제공된다. 따라서, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들, 또는 UCn-2-인코딩 핵산들 같은 것의 적절한 제형들 및 용량들이 제공된다.

일 구현예에 있어서, (우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들을 포함하는 상기 조성물들은, 임의의 방식으로 제형화될 수 있으며, 원하는 in vivo 또는 ex vivo 투여 방법 등을 포함하는, 원하는 in vitro, in vivo 또는 ex vivo 조건들에 따라, 다양한 농도들 및 형태들로 적용될 수 있다. in vitro, in vivo 또는 ex vivo 제형들 및 투여들에 대한 상세 기술들은 과학 문헌 또는 특허 문헌에 잘 기술되어 있다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는, 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 제형들 및/또는 담체 (carrier)들은, 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 제형들 및/또는 담체들은, 정제들, 환제들, 분말들, 캡슐들, 액체들, 젤들, 시럽들, 슬러리들, 현탁액들 등과 같은, in vivo 또는 ex vivo 적용들에 대하여 적합한 형태들이 될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들은, 수용액 및/또는 완충 용액과의 혼합물 내에 있을 수 있거나, 또는, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트리가칸스 (gum tragacanth) 및 검 아카시아와 같은, 현탁제, 및 천연적으로 발생하는 인지질 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합체 (예를 들어, 헵타데카에틸렌 옥시세타놀), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노-올레이트), 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노-올레이트)와 같은, 분산제 또는 습윤제를 포함하는, 수성 현탁액 및/또는 완충 현탁액으로서 있을 수 있다. 상기 수성 현탁액은 또한 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트와 같은 하나 이상의 방부제들을 포함할 수 있다. 제형들은, 예를 들어, 적합한 완충액을 사용함으로써, 삼투압에 대해 조정될 수 있다.

본 발명을 실시함에 있어서, 본 발명의 상기 화합물들 (예를 들어, 제형들)은 약학적으로 허용된 담체, 예를 들어, 물 및 링거액 (Ringer's solution), 등장성 나트륨 클로라이드를 포함하여 적용될 수 있는 허용된 부형제들 (vehicles) 및 용매들에 용해된, 우로코르틴 2-인코딩 용액, 우로코르틴 1-인코딩 핵산들 또는 유전자들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 포함할 수 있다. 또한, 멸균 고정유 (fixed oil)들이 용매 또는 현탁 매질로서 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여 임의의 고정유는 합성 모노- 또는 다이글리세라이드들, 또는 올레산과 같은 지방산들을 포함하여 적용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 용액들 또는 제형들은 멸균되며 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없도록 제조될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 이러한 용액들 및 제형들은 종래의, 잘 알려진 멸균 기술들에 의해 멸균된다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 상기 용액들 및 제형들은, pH 조정 및 완충제들, 독성 조절제들, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 나트륨 락테이트 등과 같은 적합한 생리학적 조건들을 위해 요구되는 것과 같은 보조 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 제형들 내에서 활성제 (active agent; 예를 들어, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들)의 농도는 광범위하게 변화할 수 있고, 선택된 in vivo 또는 ex vivo 투여의 특정 모드 및 원하는 결과들, 예를 들어, in vivo 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 발현의 증가에 따라, 유체 부피, 점성 등에 기반하여 우선적으로 선택될 수 있다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 상기 용액들 또는 제형들은 동결 건조될 수 있다; 예를 들어, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 포함하는 안정한 동결 건조 제형이 제공된다. 일 측면에 있어서, 이러한 제형은, 우로코르틴 2-인코딩, 우로코르틴 1-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들, 및 증량제 (bulking agent), 예를 들어, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 및 수크로오스 또는 이들의 혼합물들을 함유하는 용액을 동결 건조함으로써 제조된다. 안정한 동결 건조 제형의 제조를 위한 공정은, 약 2.5 mg/mL의 단백질, 약 15 mg/mL의 수크로오스, 약 19 mg/mL의 NaCl, 및 5.5 초과 6.5 미만의 pH를 가지는 나트륨 시트레이트 완충 용액을 동결 건조하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원번호 20040028670이 참조될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물들 및 제형들은 리포좀들의 사용에 의하여 전달될 수 있다 (하기 논의 또한 참조). 특히 리포좀 표면이 표적 세포들에 특이적인 리간드들을 운반하거나, 또는 다른 한편으로 특정 조직 또는 기관 유형으로 우선적으로 향하는, 리포좀들을 이용함으로써, in vivo 또는 ex vivo 적용에 있어서, 표적 세포들 내로의 상기 활성제의 전달에 집중할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 표적 세포들은 간, 골격근 또는 간 세포들이다.

나노입자들, 나노리포 입자들 및 리포좀들

본 발명은 또한, 예를 들어, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들을, 개인, 환자 또는 포유류 세포들에 in vivo 또는 ex vivo 전달하기 위해, 본 발명의 방법들을 실시하기 위해 사용되는 화합물들 (예를 들어, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 2-인코딩 핵산들)을 포함하는 나노입자들, 나노리포 입자들, 소포들 및 리포좀 막들을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 이러한 조성물들은, 예를 들어, 원하는 세포 유형, 예를 들어, 골격근 세포 또는 조직, 간 세포, 신장 세포, 폐 세포, 신경 세포와 같은 포유류 세포를 표적으로 하기 위하여, 세포 표면 폴리펩티드들을 포함하는, 폴리펩티드들과 같은, 생물 분자들을 포함하는, 특정 분자들을 표적화 하도록 설계된다.

예를 들어, Park, et al., 미국 특허공개번호 20070082042에 기술된 바와 같이, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물들을 포함하는 다층 리포좀들이 제공된다. 상기 다층 리포좀들은, 예를 들어, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 가두기 위해, 약 200 nm 내지 약 5,000 nm의 입자 크기로, 스쿠알렌, 스테롤들, 세라마이드들, 중성 리피드들 또는 오일들, 지방산들 또는 레시틴들을 포함하는 오일-상 성분들의 혼합물을 이용하여 제조될 수 있다.

리포좀들은, 예를 들어, Park, et al., 미국 특허공개번호 20070042031에 기술된 것과 같은, 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 이는 활성제 (예를 들어, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 발현하는 벡터들)를 캡슐화함으로써 리포좀을 생산하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 제 1 저장소 (first reservoir)에서 수용액을 제공하고; 제 2 저장소 (second reservoir)에서 유기 리피드 용액을 제공한 후, 제 1 혼합 영역 (first mixing region)에서 상기 수용액과 상기 유기 리피드 용액을 혼합하여 리포좀 용액을 생산하고, 여기에서 상기 유기 리피드 용액은 상기 수용액과 혼합하여 실질적으로 즉각적으로 상기 활성제를 캡슐화하는 리포좀을 생산하며; 이후 즉시 상기 리포좀 용액을 완충 용액과 혼합하여 희석된 리포좀 용액을 생산하는 것을 제공하는 것을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 리포좀 조성물들은, 예를 들어, 미국 특허공개번호 20070110798에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물 (예를 들어, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들)의 원하는 세포 유형으로의 전달을 표적화하기 위하여, 치환된 암모늄 및/또는 폴리음이온들을 포함한다.

본 발명은 또한, 예를 들어, 미국 특허공개번호 20070077286에 기술된 것와 같이, 활성제-함유 나노입자들의 형태 (예를 들어, 2 차 나노입자)로, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 화합물들 (예를 들어, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들)을 포함하는 나노입자들을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 지용성 활성제 또는 2가 또는 3가의 금속 염과 함께 작용하는 지용화 (fat-solubilized) 수용성 활성제를 포함하는 나노입자들이 제공된다.

일 구현예에 있어서, 고체 지질 현탁액들은, 예를 들어, 미국 특허공개번호 20050136121에 기술된 바와 같이, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 제형화하고, 환자, 개인, 또는 포유류 세포로in vivo 또는 ex vivo 전달하기 위해 사용될 수 있다.

전달 매개체들

대안적인 구현예들에 있어서, 임의의 전달 매개체는, 예를 들어, 본 발명의 방법들을 실시하기 위하여, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 in vivo 또는 ex vivo 전달하기 위하여, 본 발명의 방법들 또는 조성물들을 실시하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리양이온들 (polycations), 양이온 고분자들 (cationic polymers) 및/또는, 폴리에틸렌이민 유도체들과 같은 양이온 펩티드들 (cationic peptides)을 포함하는 전달 매개체들은, 예를 들어, 미국 특허공개번호 20060083737에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 건조된 폴리펩티드-계면활성제 복합체는 본 발명의 조성물을 제형화하기 위해 사용되며, 여기에서 계면활성제는 예를 들어, 예를 들어, 미국 특허공개번호 20040151766에 기술된 바와 같이, 비-공유결합을 통해 핵산과 연관된다.

일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산 또는 폴리펩티드는, 예를 들어, 미국 특허등록번호 7,413,739에 기술된 바와 같이, 고분자성 하이드로젤들 또는 수용성 공중합체들로서 세포들에 적용될 수 있다; 예를 들어, 핵산 또는 단백질은, 친핵체 첨가에 의해, 강한 친핵체 및 불포화 공액 결합 또는 불포화 공액 그룹 사이의 반응을 통해 중합될 수 있으며, 여기에서 각각의 전구체 성분은 적어도 2 개의 강한 친핵체들 또는 적어도 2 개의 불포화 공액 결합들 또는 불포화 공액 그룹들을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 핵산 또는 단백질은, 예를 들어, 미국 특허등록번호 7,306,783; 6,589,503에 기술된 바와 같이, 부형제들과 함께 세포 막-투과 펩티드 결합체 (conjugate)들을 이용하여 세포들에 적용된다. 일 측면에 있어서, 상기 핵산 그 자체가 세포막-투과 펩티드와 결합된다. 일 구현예에 있어서, 핵산, 단백질, 및/또는 상기 전달 매개체는, 예를 들어, 강한 염기성이며 폴리-포스포이노시티드들 (poly-phosphoinositides)에 결합하는 수송-매개 펩티드들을 기술하는 미국 특허등록번호 5,846,743에 기술된 바와 같이, 수송-매개 펩티드에 결합된다.

일 구현예에 있어서, 전기-투과화 (electro-permeabilization)는, 예를 들어, 미국 특허등록번호 7,109,034; 6,261,815; 5,874,268에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 임의의 전기천공법 시스템 (electroporation system)을 사용하여, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들을 세포에 전달하기 위한 주요 또는 보조 수단으로서 사용된다.

제조, 임플란트들 및 인공 장기들의 생산물들

본 발명의 세포들 (예를 들어, 본 발명의 방법들을 실시하기 위하여, 우로코르틴 2-인코딩 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 발현하도록 개질된 세포들)을 포함하는 제조 생산물들, 및, 예를 들어 본 발명의 방법들을 실시하기 위하여 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질들을 발현하도록 개질된 세포들을 포함하는 임플란트들 및 인공 장기들, 생반응성 시스템들, 세포 배양 시스템들, 플레이트들, 디쉬들, 튜브들, 병들 및 플라스크들을 포함하는, 본 발명의 방법들에 의해 제조된 세포들의 용도가 제공된다. 임의의 임플란트, 인공 장기, 생반응성 시스템들, 세포 배양 시스템, 세포 배양 플레이트, 디쉬 (예를 들어, 페트리 디쉬), 세포 배양 튜브 및/또는 세포 배양 플라스크 (예를 들어, 회전병)이 본 발명을 실시하기 위하여 이용될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들을 실시하기 위하여 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질들을 발현하도록 개질된 세포들을 포함하는 생반응기 (bioreactor), 임플란트, 스텐트, 인공 장기 또는 유사 장치들이 제공된다; 예를 들어, 미국 특허등록번호 7,388,042; 7,381,418; 7,379,765; 7,361,332; 7,351,423; 6,886,568; 5,270,192; 미국 특허출원번호 20040127987; 20080119909 (귀 임플란트들이 기재됨); 20080118549 (눈 임플란트들이 기재됨); 20080020015 (생활성 상처 드레싱이 기재됨); 20070254005 (심장 밸브 생물-인공 기관들, 혈관 이식들, 메니스커스 임플란트들이 기재됨); 20070059335; 20060128015 (간 임플란트들이 기재됨)에서 기술된 것과 같은 임플란트들을 포함한다.

세포들의 in vivo 임플란트

일 구현예에 있어서, 본 발명을 실시하기 위해 사용되는, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드들 또는 폴리펩티드들을 포함하는 세포들, 예를 들어, 심장, 폐 또는 신장 세포들을 임플란트 또는 접목 (engraft)하는 것을 포함하는 방법들이 제공되며; 일 측면에 있어서, 본 발명의 방법들은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산들 또는 유전자들 (또는 이들을 발현하는 세포들), 또는 우로코르틴-2 (UCn-2) 펩티드들 또는 폴리펩티드들을, 혈관, 조직 또는 기관에서 ex vivo 또는 in vivo 임플란트 또는 접목하는 것, 또는 이를 필요로 하는 개인에게 재-프로그램된 분화된 세포를 임플란트 또는 접목하는 것을 포함한다.

세포들은 본 발명의 상기 조성물들 및/또는 방법들을 이용하여 처리된 개인으로부터 제거될 수 있으며, 임의의 알려진 기술 또는 프로토콜을 이용하여, 조직, 기관 또는 상기 개인에게 재주입 (예를 들어, 주사 또는 접목)될 수 있다. 예를 들어, 역-분화 재-프로그램된 세포들, 또는 재-프로그램된 분화 세포들은, 예를 들어, 미국 특허등록번호 7,442,389에 기술된 바와 같이, 마이크로스피어들을 이용하여, 재-임플란트 (예를 들어, 주사 또는 접목) 될 수 있다; 예를 들어, 일 측면에 있어서, 상기 세포 담체는, 혼합 및 전달 시스템과 이러한 세포들을 포함하는 자가유래 담체 (autologous carrier) 내부로 미리 로딩된 둥글고 매끄러운 폴리메틸메타크릴레이트 마이크로 입자들을 포함하는 증량제를 포함한다. 또 다른 구현예에 있어서, 예를 들어, 미국 특허출원번호 20050027070에 기술된 바와 같이, 상기 세포들은 생체적합성 가교 매트릭스 형태로 조직, 기관, 및/또는 이를 필요로 하는 개인에게 재투여된다.

또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 세포들 (예를 들어, 본 발명의 방법들을 실시함으로써 제조된 세포들)은, 예를 들어, cAMP-무력증 AC (cAMP-incompetent AC)가, 1차 아미노 또는 티올 그룹과 같은, 다중 친핵체 그룹들을 함유하도록 개질된 폴리에틸렌 글리콜에 결합될 수 있는 프로토콜을 기술하고 있는, 예를 들어, 미국 특허등록번호 6,969,400에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 합성 임플란트의 표면 상에서처럼, 생체 적합성 비면역 코팅 내에서, 또는 이에 의해 보호되어, 조직, 기관 및/또는 이를 필요로 하는 개인에게 재투여 (예를 들어, 주사 또는 접목) 된다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 세포들 (예를 들어, 본 발명의 방법들을 실시함으로써 제조된 세포들)은, 예를 들어, 미국 특허등록번호 7,442,390; 5,733,542에 기술된 것처럼 이식 방법들을 이용하여 조직, 기관 및/또는 이를 필요로 하는 개인에게 재투여 (예를 들어, 주사 또는 접목) 된다.

폴리펩티드들, 핵산들 및/또는 세포들을 조직 또는 기관 (예를 들어, 폐, 신장, 간, 골격근)에 전달하기 위한 임의의 방법들이 사용될 수 있고, 이러한 프로토콜들은, 예를 들어, 폴리펩티드들, 핵산들 및/또는 세포들의 심장으로의 in situ 관상 동맥 (IC), 정맥 (IV), 및/또는 국소 전달 (심근 주사)의 이용을 기술하고 있는, 예를 들어, 미국 특허등록번호 7,514,401에 기술된 바와 같이, 본 기술분야에 잘 알려진 것이다. 예를 들어, 일 구현예에 있어서, 폐들 및 혈류로의 에어로졸 약물 입자들, 유전자 치료, 연속 주입들, 반복 주사들 및/또는 서방성 고분자들이, 폴리펩티드들, 핵산들 및/또는 세포들을 조직 또는 기관 (예를 들어, 폐, 신장, 간, 골격근)으로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 핵산들 및/또는 세포들은 카테터를 통하여 관상동맥들로 주어질 수 있거나 또는 제한된 개흉술을 통하여 좌심방 또는 심실의 심근으로 직접 주사함으로써 주어질 수 있거나; 또는 심도자법 (cardiac catheterization) 동안 통과되는 카테터를 통하여 심근으로 전달될 수 있거나; 또는 심낭 공간 (pericardial space)으로 전달될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 예를 들어, 미국 특허등록번호 7,501,486에 기술된 바와 같이; 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산들 또는 단백질들, 또는 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들어, AAV, 또는 아데노바이러스 유전자 치료 벡터), 또는 본 발명의 소포, 리포좀, 나노입자 또는 나노리피드 입자 (NLP) 등을; 조직 또는 기관 (예를 들어, 폐, 신장, 간, 골격근)으로 전달한다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 조성물들은, 다른 치료제들, 예를 들어 혈관 형성제들, 항-혈전제들, 항-염증제들, 면역 억제제들, 항-부정맥제들, 종양괴사인자 저해제들, 엔도텔린 저해제들, 안지오텐신-전환 효소 저해제들, 칼슘 길항제들, 항생제들, 항 바이러스제들 및 바이러스 벡터들과 결합하여 사용될 수 있다.

본 발명을 실시하기 위해 사용되는 조성물들은, 임의의 다양한 당뇨병-연관 심장 또는 심혈관 질환들, 예를 들어, 당뇨병-연관 심장 및 심혈관 질환들, 예를 들어, 관상 동맥 질환 (CAD); 죽상동맥경화증; 혈전증; 재협착; 결절성 다발 동맥염, 초그-스트라우스 증후군 (Churg-Strass syndrome), 타카야스 동맥염 (Takayasu's arteritis), 가와사키병 (Kawasaki Disease) 및 리케챠 혈관염 (Rickettsial vasculitis)과 같은 자가 면역 및 바이러스성 혈관염들을 포함하는 혈관염; 동맥경화성 동맥류들; 심근 비대; 선천성 심장 질환 (CHD); 허혈성 심장 질환 및 협심증; 후천성 판막/심장 내막 질환들; 심근염을 포함하는 원발성 심근 질환들; 부정맥; 및 이식 거부들; 울혈성, 비대 또는 제한적 심근증들과 같은 대사성 심근 질환들 및 심근증들, 및/또는 심장 이식들의 개선 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 실시를 위해 사용되는 조성물들, 예를 들어, 우로코르틴-2 (UCn-2) 펩티드들 또는 폴리펩티드들은, 환자 또는 개인의 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위해; 또는 환자 또는 개인의 체중 증가를 억제하거나, 또는 식욕을 억제하거나, 또는 체중 감량을 자극 또는 개시하거나; 또는 환자 또는 개인의 당뇨병을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위해 사용된다.

본 발명은 하기 실시예들을 참조하여 추가적으로 설명될 것이다; 그러나, 본 발명은 이와 같은 실시예들에 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다.

실시예

실시예 1: 우로코르틴 -2를 인코딩하는 AAV8의 정맥 전달은 정상적인 마우스들에서 심기능을 증가시킨다.

본 실시예는 본 발명의 예시적인 구현예의 유효성을 입증한다. 일 구현예에 있어서, 우로코르틴-2 (UCn2), 부신 피질 자극 호르몬 방출 인자 (CRF) 집단의 펩티드를 인코딩하는 아데노-연관 바이러스 벡터 혈청형-8 (AAV8) 의 1 차례의 정맥 (IV) 주사를 이용하여 2형 당뇨병 (T2DM) 및 당뇨병 심장 질환을 치료 및 개선하는 조성물들 및 방법들이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 상기 벡터 (AAV8.UCn2)는 조절된 발현을 가능하게 하기 위하여 조절된 발현 카세트를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 예시적인 벡터들은, 예를 들어, 외래 진료 동안 팔 정맥으로, 정맥 주사를 통해 전달된다.

본 발명자들은, AAV8.UCn2를 마우스들에게 단독 정맥 주사하는 것이 적어도 7개월 동안 지속되는 플라즈마 UCn2 레벨들의 15 배 증가를 야기한다는 것¹, 및: a) 2형 당뇨병의 2 가지 모델들에서 증가된 인슐린 감응성을 통하여 글루코오스 이용을 정상화한다는 것 (도 1a 및 도 1b) 쇠약한 심장의 기능을 증가시킨다는 것 (도 1b)을 입증하였다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들은 인슐린 감응성 및 심기능에 대하여 이로운 근거리 분비 효과들을 가지는 펩티드를 인코딩하는 벡터의 정맥 주사를 포함한다.

설치류 2형 당뇨병에 대한 본 발명의 데이터는, 본 발명의 UCn2 유전자 이동 방법들이: 인슐린에 대한 요구를 미연에 방지할 수 있고; 울혈성 심부전을 가지는 환자들에게 잘 용인되고 이로울 수 있으며; 반복적인 주사들을 요구하지 않을 수 있으며; 또한, 체중 감소와 연관될 수 있음을 나타낸다.

이로운 심장 효과¹들을 가질 수 있는, 본 발명의 방법들은, 울혈성 심부전을 가지는 대상들에게 안전하게 사용될 수 있고, 충족되지 않은 의학적 요구: 현재의 약물들에 의해 공유되지 않는 특징들을 가지는, 울혈성 심부전을 가지는 2형 당뇨병 환자들의 신규한 치료법을 충족시킬 것이다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들을 실시하는 것은 인슐린에 대한 요구를 미연에 방지할 수 있고, 이에 따라 본 발명의 방법들을 실시하는 것은 베타 세포를 보존하는 것이고 2형 당뇨병을 가지는 환자들에게 이롭다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법들을 실시하는 것, 예를 들어, AAV8.UCn2를 이용하는 것은, 현재의 2형 당뇨병 약제들이 가지는 문제점인 체중 증가 대신 체중을 감소시킬 것이다. UCn2의 심기능에 대한 이로운 효과¹들 때문에, 티아졸리디네디온 (thiazolidinedione)들과는 달리, 이는 울혈성 심부전을 가지는 2형 당뇨병 환자들을 치료하기 위해 안전하게 사용될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 치료법들은 울혈성 심부전을 가지는 및 가지지 않는 2형 당뇨병 대상들을 위해 나타내어졌으며 경구 약제들 대신에 (또는 함께) 사용되었고; 일부 환자들에 대해 인슐린에 대한 요구를 지연시킬 수 있다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 치료법들은 인슐린 감응성을 증가시키는 전이유전자를 사용하여 초기 단계의 2형 당뇨병에 집중한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 치료법들은, 벡터들, 예를 들어 AAV8.UCn2를 정맥으로 투여함으로써 2형 당뇨병을 가지는 대상들에게 실시된다; 여기에서 다이어트 및 운동 조정에 실패하고 있고 아직 인슐린-의존적이지 않은 개인들이 이상적인 대상자들일 수 있다. 또한, 본 발명의 치료법들은 정상¹ 및 쇠약한 심장의 기능을 증가시킬 수 있고 (도 1b), 일부 환자들에서 2형 당뇨병을 가지는 대상들의 쇠약한 심장의 기능을 개선할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 우로코르틴-2의 조절된 발현을 가지는 AAV8 벡터의 IV (정맥 주사)는 글루코오스 이용 및 인슐린 감응성을 증가시킬 것이고, 2형 당뇨병에서의 심기능을 개선할 것이다. 도 1a에 그래프로서 나타낸 바와 같이, 정상 마우스들이 AAV8.UCn2를 정맥으로 5 x 10¹¹ gc 용량으로 투여받거나, 또는 음성 대조군으로서 식염수를 투여받고, 3 주 (w) 동안 표준 식단을 먹인 이후 8 주 동안 고지방 식단을 한 경우: AAV8.UCn2 투여 동물들에서 개선들은 글루코오스 레벨들 ("예방", "레졸루션" 및 "글루코오스 부하 검사"); 플라즈마 인슐린; 및 항상성 모델 평가 (HOMA-IR), 또는 "인슐린 저항성"에서 나타났다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 치료법들은, 예를 들어, UCn2, UCn1 및/또는 UCn3 발현 핵산, 예를 들어, UCn2, Ucn1 및/또는 UCn3 유전자 또는 cDNA를 인코딩하는, 벡터, 예를 들어, AAV 벡터의 정맥 (IV) 전달에 의한, 유전자 이동, 예를 들어, UCn2, UCn1 및/또는 UCn3 유전자 이동을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 전신 벡터 전달은, 이것이 임의의 주어진 AAV 용량에 대해 전이유전자의 최대 플라즈마 레벨을 제공함에 따라, 근거리 분비 활동을 가지는 펩티드들의 유전자 이동에서 장점을 가진다.

일 구현예에 있어서, AAV가 아데노바이러스에 비해 긴 전이유전자 발현을 가능하게 할 수 있고, 레트로바이러스와 연관된 삽입 돌연변이를 피할 수 있기 때문에, AAV가 이용된다. 지속적인 전이유전자 발현은 대형 동물들에서 AAV 벡터들의 단독 주사 수년 후에 나타난다. 본 발명자들은 이를 마우스들 (예를 들어, 도 5 참조) 및 래트들에서 확인하였다. ¹¹ 최근의 임상적 시도들에서 일부 AAV 혈청형들이 근육 주사 이후에 면역 반응들을 선동한다는 것이 발견되었음에도 불구하고, ¹² 더 최신 세대의 AAV 벡터들 (AAV5, 6, 8 및 9)은 영장류들에 대해 이와 유사한 문제점들을 가지지 않았다.¹³ 정맥 AAV 전달은 플라즈마 전이유전자 레벨들에 대하여 근육 대비 우수하며, AAV9 은 AAV5 및 AAV6 대비 우수하다.¹⁴ 미리-존재하는 항-AAV8 항체들은, AAV1, AAV2 및 AAV6을 포함하는 다른 AAV 혈청형들이 일반적임에 따라 (50% 내지 59%), 인간들에게서 일반적이지 않다 (19%).¹⁵ 본 발명의 데이터는 정맥 AAV8이 최적의 벡터이며 제안된 연구들에서 플라즈마 UCn2의 지속적인 증가된 레벨들을 얻기 위한 전달 루트임을 나타내었다 (도 1).¹

설치류의 횡문근임에도 불구하고, 거대세포 바이러스 (CMV) 프로모터는 간에서 메틸화 및 불활성화에 민감하며,¹⁶ 본 발명의 데이터는 메틸화에 덜 민감한 프로모터들이 우월함을 나타내었다. 실제로, CMV가 정맥 벡터 전달 후 UCn2의 지속적인 2.3 배 증가를 제공하였음에도 불구하고, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터의 이용은 플라즈마 UCn2에서 15 배를 초과하는 증가를 야기했다 (도 1). 일 구현예에 있어서, UCn2, UCn1 및/또는 UCn3 발현 핵산들, 예를 들어, UCn2, UCn1 및/또는 UCn3 유전자 또는 cDNA는, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터들에 작동적으로 연결된다.

일 구현예에 있어서, UCn2, UCn1 및/또는 UCn3 발현 핵산들은 "조절된 발현"하에 있다. 일 구현예에 있어서, AAV 유전자 이동에 의해 주어진 장기 발현에 대한 가능성 때문에, 발현을 차단 (turn off)하는 능력은 뜻밖의 효과들이 발생되는 경우에 바람직하다. 일 구현예에 있어서, 조절된 발현이 사용되며, 이는 지속적인 전이유전자 전달보다는 간헐적인 유동성을 가능하게 한다. 일 구현예에 있어서, 테트라사이클린 및 라파마이신 조절 시스템들이 사용되었다; 이들은 거대 동물 모델들에서 테스트되었다.

2형 당뇨병의 고지방 식단 (HFD) 모델로부터 수득된 데이터

UCn2 유전자 이동은 2형 당뇨병을 예방하기도 하고 일단 존재한 2형 당뇨병을 치료하기도 한다. 공복 혈당 및 글루코오스 부하 검사들은 모두 정규화되었다. 인슐린 저항성의 측정 (HOMA-IR)은 감소되었다. 도 1b: 심근경색-유도된 울혈성 심부전 10 주 (w) 후 마우스들로부터 수득된 데이터: AAV.UCn2 (5 x 10¹¹ gc, 정맥)가 울혈성 심부전의 유도 5주 후에 전달되었다 (식염수 대비). UCn2 유전자 이동이 수축기 & 확장기 좌심실 기능을 증가시켰다 (맹검 연구들).

도 2. 2형 당뇨병 & 좌심실 기능장애 셋팅 하에서 UCn2 발현의 활성화 20 주 후에 AAV8.UCn2-Reg (5 x 10¹¹ gc, 정맥)의 효율 테스트. 본 발명자들은, Sprague-Dawley 래트들에서 고지방 식단 (HFD)에 스트렙토조톡신 (STZ; 35 mg/kg IP x 2)을 더하여 사용한, 비정상적인 좌심실 수축기 & 확장기 기능과 연관된 2형 당뇨병 모델을 사용하였다.⁷ 연속적인 심장초음파는, 좌실내주 수축 속도 (VCF; velocity of circumferential fiber shortening) 기능을 포함하여, 좌심실 크기 & 수축기 & 확장기 기능을 평가할 것이다. 15 마리의 래트들/그룹에서의 말단 연구들은 상기 말단-수축기 압력 부피 관계 (ESPVR), 벽 응력, 좌심실 압력 발생 및 소멸 속도, 및 타우 (Tau)를 평가하기 위해 압력-부피 카테터들을 사용하여 수행되었다. 최종적으로, 각 동물들로부터 나온 11 개의 조직들로부터 나온 샘플들에 대해 생체 내 분포 및 독성 연구들이 수행되었다; AAV 요구량: 1.5 x 10¹⁴ gc.

HFD 마우스들 (고지방 식단을 10 주 동안 먹인 마우스들에 대한 우로코르틴-2의 정맥 투여, 이후 5 주 차의 AAV8.UCn2-Reg (5 x 10¹¹ gc, 정맥) 또는 정맥 식염수 (음성 대조군)는, 조직학적 분석에서 확인된 바와 같이, 간의 지방 침윤에서의 73% 감소의 결과를 야기하였다.

도 5a. 상단 패널: 조절되지 않은 발현 벡터의 벡터지도. CBA 프로모터는 CMV에서 문제가 되는 간에서의 메틸화를 회피한다. 하단 패널. 플라즈마 UCn2는 AAV8.CBA.UCn2.의 단독 정맥 주사 6주 후 15 배를 초과하여 증가되었다. 간 및 좌심실 발현이 증가되었다. 심장 발현은, 근거리 분비 효과들을 증가시킬 수 있는, 자가 분비 효과들과 관련하여 중요할 수 있다. 추가적인 데이터 (미도시)는 유전자 이동 7 개월 후 플라즈마 UCn2 및 심기능에 관한 지속적이고 안정적인 효과들을 기록한다.

도 5b는 본 발명의 예시적인 조절된 발현 벡터들을 나타낸 것이다: 최적의 조절된 발현 시스템들을 위함. 이러한 예시적인 AAV8 벡터들은, 테트라사이클린 조절 (지도 A) 또는 라파마이신 조절 (지도 B) 하에서, 마우스 UCn2의 조절된 발현을 인코딩한다. CBA가 Rap에 적합하지 않기 때문에, RSV가 벡터지도 B에서 사용되었다. 이러한 2 가지 조절된 발현 벡터들은 테스트될 것이며 (목적 1), 더 나은 쪽이 목적 2 및 목적 3 연구들을 위해서 선택되었다. 약어들: ITR, 역방향 말단 반복; SVpA, SV40 바이러스 유전체로부터의 폴리A (양방향성); UCn2, 우로코르틴-2; TRE, 테트라사이클린 반응 요소; rtTA2SM2, 역방향 테트라사이클린 조절된 전사 촉진제; SV40.en, 유인원 바이러스 40 인핸서; RSV Prom, 라우스 육종 바이러스 프로모터; FRB-p6, FRAP의 부분, NF-κB 전사 인자의 서브유닛에 결합된, 라파마이신 상호작용 단백질 (p65); IRES, 내부 전사 재진입 부위; ZF, 징크 핑거 HD1 DNA 결합 도메인; FKBP, FK506 결합 단백질; pA, 최소 폴리 아데닐화 절편; ZBD, 징크 핑거 HD DNA 결합 도메인 (8 복제들).

도 13. 좌측: 2형 당뇨병의 고지방 식단 모델로부터 수득된 데이터. UCn2 유전자 이동은 2형 당뇨병을 (이전에) 예방하기도 하고, 일단 존재한 그것을 치료하기도 한다 (이후: 당뇨병 존재 4 주 내지 8주 후 유전자 이동). 공복 혈당 및 글루코오스 부하 검사들은 모두 정규화되었다. 인슐린 저항성의 측정 (HOMA-IR)은 감소되었다. 효과들은 db/db 마우스들에서 확인되었다. 상단: 심근경색-유도된 울혈성 심부전 10주 후 마우스들로부터 수득된 데이터. 울혈성 심부전 5주 후에 AAV.UCn2 (5 x 10¹¹ gc, 정맥)가 전달되었고 (식염수 대비), 이는 수축기 & 확장기 좌심실 기능을 증가시켰다 (맹검 연구들).

실시예 2: 우로코르틴 -2를 인코딩하는 AAV8의 정맥 전달은 마우스들에서 쇠약한 심장의 기능을 증가시킨다

본 실시예는, AAV8.UCn2의 정맥 전달이 쇠약한 심장의 기능을 증가시킨다는, 본 발명의 예시적인 구현예의 효과를 입증한다. 요약하면, 심근경색 (MI, 관상동맥 연결에 의함)이 심부전을 유도하기 위해 사용되었으며, 심근경색 3주 후에 심장초음파를 통해 평가되었다. 좌심실 구출분획 (LV EF)이 25% 미만인 마우스들이 AAV8.UCn2 (5 x 10¹¹ gc) 또는 식염수를 정맥 내 전달 받았고, 5주 후 심장초음파는 UCn2 유전자 이동 (p=0.001)을 받은 마우스들에서 증가된 좌심실 구출분획을 나타내었다. 생리학적 in vivo 연구들은 좌심실 압력 발생에서의 피크 속도의 2 배 증가를 나타내었고 (LV +dP/dt; p <0.0001), 좌심실 압력 소멸의 피크 속도의 1.6 배 증가를 나타내었으며 (LV -dP/dt; p=0.0007), 이는 치료된 마우스들에서의 증가된 좌심실 수축기 및 확장기 기능을 나타내는 것이다. UCn2 유전자 이동은 증가된 피크 수축기 Ca^{2 +} 순간 (transient) 진폭 및 Ca^{2 +} 감소 속도 및 증가된 SERCA2a 발현과 연관되었다. 또한, UCn2 유전자 이동은 Cam 키나아제 II의 Thr286 인산화를 감소시키고, 심장 미오신 경쇄 키나아제의 발현을 증가시키며, 이는 상기 쇠약한 심장의 증가된 기능을 예견하게 하는 것일 수 있다. 이러한 결과들은 AAV8.UCn2의 단독 정맥 주사가 상기 쇠약한 심장의 기능을 증가시킴을 입증한다. 심기능을 증가시키기 위해 이로운 근거리 효과들을 가지는 유전자를 인코딩하는 벡터의 정맥 주사의 간편성은 매력적인 임상적 전략이다.

방법들

AAV8.UCn2 벡터 생산 (도 14). 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터에 의해 구동되는 뮤린 (murine) 우로코르틴-2 (UCn2)가 인코딩된 헬퍼 바이러스 프리 AAV8 벡터 (AAV8.CBA.UCn2; 도 14)는, 벡터 플라스미드 pRep2/Cap8 및 pAd-헬퍼 플라스미드와 함께 HEK293T 세포들을 일시적 형질주입 (transient transfection) 시킴으로써 생산되었다.²⁸ 플라스미드 pRep2/Cap8은 펜실베니아 대학교 벡터 코어로부터 얻었다. 형질주입 72시간 후에 제조된 세포 용해질들은 벤조나아제 (benzonase)로 처리되었으며 바이러스들은 25% 수크로오스-쿠션 초원심분리법을 통해 통합되었다. 펠렛들은 음이온-교환 컬럼 크로마토그래피 (Q-sepharose, GE Health Science)를 통해 상기 바이러스의 추가적인 정제를 위해 재현탁되었으며, 25% 수크로오스-쿠션 초원심분리법에 의해 농축되었다.^{29 , 30} 그 후, 상기 펠렛들은 10 mM Tris-HCl (pH 7.9, 1mM MgCl₂, 3% 수크로오스) 내에서 재현탁되었다. 바이러스 적정 농도 (titer)들은 정제된 바이러스로부터 제조된 바이러스 유전체 DNA와 함께 실시간 qPCR에 의해 결정되었다.

심부전 모델 VA 샌디에고 헬스케어 시스템 (VA Healthcare System)의 실험동물운영위원회 (Animal Use and Care Committee)에서 본 연구들을 승인하였다. 생후 10 주 내지 12 주 되고, 26.1±0.2 g 중량인 231 마리의 수컷 C57BL/6J 마우스들 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)이 사용되었다. 본원의 발명자들은 앞서 상세하게 기술한 바와 같이 동맥벽 (arterior wall) 심근경색 및 울혈성 심부전을 유도하기 위하여 관상동맥 폐색을 이용하였다.^{31 ,32} 심근경색 크기는 의도적으로 (deliberately) 컸으며, 대략 좌심실의 50%였고, 대부분의 좌심실 자유벽을 포함하였다 (도 14). 결과적으로, 이 모델은 높은 초기 사멸과 연관된다. 관상동맥 폐색을 갖게된 231 마리의 마우스들 중, 125 마리(54%)는 랜덤화 (AAV8.UCn2 또는 식염수) 이전에 주로 심근경색 후 최초 몇 주 내에 사망하였다. 추가적인 45 마리의 마우스들 (19%)은 심근경색 3 주 후에 랜덤화하기에 충분한 좌심실 기능장애를 나타내지 않았다. 61 마리의 마우스들 (26%)은 충분히 낮은 좌심실 구출분획 (EF<25%)을 가졌으며 랜덤화되었고, 이러한 마우스들 중 11마리는 랜덤화 5주 후 최종 연구를 하기 전에 사망하였다: 4 마리 UCn2 (사망률 13%); 7 마리 식염수 (사망률 23%). 최초 종결 포인트는 심각한 심부전을 가지는 마우스들에게 AAV8.UCn2 대비 식염수를 정맥 전달한지 5주 후의 좌심실 기능이었다 (도 14). 데이터는 그룹 정체성에 대한 인지 없이 얻어졌으며 분석되었다.

AAV8.UCn2 전달 마취 하에서 (노즈콘을 통한 1.5% 아이소플루레인), AAV8.UCn2 (50 μl 내에서 5 x 10¹¹ gc) 또는 유사 부피의 식염수 (대조군)의 정맥 전달을 위하여 목 정맥을 노출시키기 위해 작은 절개가 만들어졌다.

심박수 및 혈압에 대한 UCn2 유전자 이동의 효과들

이러한 연구들은 심부전을 가지는 진정제를 투여하지 않은 마우스들에서 심박수 및 혈액에 관한 UCn2 유전자 이동의 효과들을 평가하기 위해 수행되었다. 손상된 좌심실 구출분획이 심근경색 3주 후에 확인되었으며, 마우스들은 정맥 AAV8.UCn2 (5 x 10¹¹ 유전체 복제들, gc) 또는 식염수를 투여받았다. 수축기 및 확장기 혈압 및 심박수는 진정제를 투여하지 않은 마우스들에서 테일 커프 방법 (Visitech Systems, Apex, NC)에 의해 측정되었다.

심장초음파. 심장초음파는 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다.³³ 심장초음파는 감소된 좌심실 기능 (EF<25%)을 기록하고 좌심실 챔버 면적들을 기록하기 위하여 심근경색 3주 후에 수행되었다. 심장초음파 측정은 이후 AAV8.UCn2 또는 식염수의 정맥 내 전달을 받기 위한 마우스들의 랜덤화 5주 후에 반복되었다.

좌심실 수축기 및 확장기 기능.

마우스들은 나트륨 펜토바르비탈 (80 mg/kg, ip)로 마취되었고, 1.4F 컨덕턴스-마이크로마노미터 카테터 (SPR 839, Millaer Instruments, Houston, Texas)는 우측 경동맥을 통해 대동맥 판막을 가로질러 좌심실 공간 내부로 들어갔다. 좌심실 압력은 이전에 보고된 바와 같이 가공 (IOX1.8 Emka Technologies, Christchurch, VA)을 위해 디지털 방식으로 기록 및 저장되었다.⁶ 이어서, 혈액 및 조직 샘플들이 수득되었다. 수득 후, 좌심실 압력 발생 (LV + dP/dt) 및 소멸 (LV -dP/dt)의 제1 파생물이 좌심실 수축기 및 확장기 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 데이터는 그룹 정체성에 대한 인지 없이 얻어졌고 분석되었다.

심근세포 단리.

심근세포들은 앞서 기술된 바와 같이 단리되었다.³³

Ca ^{2 +} 과도현상들 ( transients) 시토졸성 Ca^{2 +} 과도현상들은 개질들과 함께 앞서 기술된 바와 같이^{27 ,34} Indo-1을 이용하여 측정되었다. 심근세포들은 라미닌-코팅된 글라스 커버 슬립들 상에 플레이팅 되었고 indo-1/AM (3 μM, Calbiochem, La Jolla CA) 및 분산제인 플루오닉 F-127 (0.02 mg/ml, Calbiochem, La Jolla, CA)와 함께 30 분 동안 로딩되었다. 염료 로딩에 이어서, 커버 슬립들이 과융합 (superfusion) 챔버 내에 고정되었고, 과잉 indo-1-AM을 제거하기 위해 헹궈졌으며, 모노크로메이터(monochromator)를 통해 365 nm로 여기 파장이 설정된 Photon Technologies photometry system (Birmingham NJ)에 접속된 40x 대물렌즈를 갖춘 Nikon Diapho 표면형광 (epifluorescence) 현미경 상에 고정되었다. 형광 방출은 분열되었고 각각 405 nm 및 485 nm에 집중된 20-nm 대역-통과 필터들을 통해 2 개의 광전자증배광 (photomultiplier) 튜브들로 향해졌다. 비율 F405/F485는 [Ca^{2 +}]i에 대한 측정을 나타낸다. 이러한 측정들 동안, 심근세포들은 2 mM CaCl₂를 함유하는 25 mM HEPES (pH 7.3)와 과융합 되었다. 근세포들은 0.3 Hz에서 필드-자극되었다 (field-stimulated). Ca^{2 +} 과도현상들은 6 개의 심장들 (그룹 당 3개)로부터 얻어진 144 개의 심근세포들로부터 기록되었다. 확장기 및 수축기 세포 내 Ca^{2 +} 레벨들은 각각 사이클 당 기저 및 최대 indo-1 비율로부터 추론되었다. 확장기 소멸 시간 (tau)은 정규화된 Ca²⁺ 과도현상으로부터 계산되었다.

양적 RT-PCR (qRT-PCR) 및 면역 블로팅

양적 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅을 위해 좌심실 및 간 샘플들이 수집되었고 -80℃에서 저장되었다. qRT - PCR. 좌심실 및 간 RNA는 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 단리되었고 qRT-PCR은 하기 조건들에 하에서 이전에 기술된 바와 같이²⁷ 수행되었다: 98℃에서 5분, 95℃에서 30초의 40 사이클, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 30초. RNA 등가물들은 각각의 샘플에서 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소 (GAPDH) mRNA 레벨들을 동시에 결정하기 위해서 정규화되었다. 프라이머들은 하기 표 4에 열거되었다. 면역 블로팅은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다.³⁵ 하기 항체들이 사용되었다: cMLCK (Abgen/Thermo Sientific, San Diego, CA/Waltham MA); p286 CamKII (Santa Cruz, Dallas, TX); 포스포-PKA 촉매성 서브유닛, PKA 촉매성 서브유닛, 트로포닌 I, 및 22/23-포스포-트로포닌 I (Cell Signaling Technology, Danvers MA); PLB (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA); Ser 16 및 Thr 17-포스포-PLB (badribad, Ltd, Leeds, UK); SERCA2a (Enzo Life Sciences, Farmingdale NY).

사이클릭 AMP 및 단백질 키나아제 A (PKA) 활성.

아이소프로테레놀 (10 mM, 10 분) 및 NKH477 (10 mm, 10 분)으로 자극되기 전 및 후에 경벽 (transmural) 좌심실 샘플들의 cAMP 측정이 수행되었으며, cAMP는 이전에 기술된 바와 같이 바이오트랙 효소-면역 에세이 시스템 (GE Healthcare)을 이용하여 측정되었다. ³⁶ PKA 활성은 이전에 기술된 바와 같이 확인되었다.²⁷ 아이소프로테레놀 (10 μM, 10 분) 및 NKH477 (10 μM, 10분)으로 자극되기 전 및 후에 심근세포들의 cAMP 측정이 수행되었으며, 이어서 완충액 A: 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.5 mM EGTA, 0.5 mM EDTA, 및 프로테아제 저해제 칵테일(Invitrogen, CA)에서 균질화되었고 원심분리 되었다 (14,000 x g, 5 분, 4℃). 상청액이 [γ-³²P]ATP의 존재 하에서 PKA 비오틴화된 펩티드 기질 (SignaTECT^® cAMP-Dependent Protein Kinase Assay System, Promega, Madison, WI)과 함께 인큐베이션 되었다. ³²P-표지된 비오틴화된 기질이 스트렙타비딘 매트릭스와 함께 회수되었고, PKA의 특이 활성이 확인되었다.

조직학. 간 샘플들 및 경색증이 없는 (uninfrated) 좌심실 격막의 경벽 부분들은 포르말린-고정되었고 파라핀-침지되었다. 5 마이크론 부분들이 고정되었고 헤마톡실린 및 에오신 및 메이슨 트리크롬으로 대비 염색되었다. 짧은-축 중간-벽 좌심실 고리의 좌심실 섬유증 이미지들의 양적 측정은 Nikon Eclipse Ti-U 현미경을 통해 수득되었다. 작동 가능한 (viable) 좌심실 영역 (경색된 영역 제외)에서 섬유증 정도에 대한 맹검 분석이 NIS-Elements AR 3.10 소프트웨어 (Nikon Inc.)을 이용하여 수행되었다. 유사한 분석학적 공정들이 고정되고 대비 염색된 간 샘플들에 대해 수행되었다.

통계 분석. 데이터는 평균±SE를 나타낸다; 그룹 간 차이들은 ANOVA 후 Bonferroni t 검정을 사용하여 통계적 유의도를 위해 테스트 되었다. 그룹 간의 대조들은 스튜던트 t-검정 (비쌍체, 양쪽-꼬리)을 이용하여 만들어졌다. 귀무 가설 (null hypothesis)은 p<0.05일 때 거절되었다.

결과

진정제를 투여하지 않은 마우스들에서의 심박수 및 혈압. 치료되지 않은 그룹에서 심박수들이 상당히 높은 경향이 있었고 UCn2 유전자 이동을 받은 마우스들에게서 심박수들이 정상에 보다 가까운 경향이 있었음에도 불구하고, UCn2 유전자 이동 5주 후 심박수 또는 수축기, 확장기 또는 평균 동맥 혈압에 있어서 그룹 간 차이들은 나타나지 않았다 (표 1, 하단). 우로코르틴 2 발현. AAV.UCn2 (5 x 10¹¹ gc; n=6)의 정맥 전달 5주 후, UCn2 mRNA는 내생적 UCn2 mRNA 대비 간에서 15,263 배 증가되었고 (p<0.0001) 좌심실에서 70 배 증가되었다 (p=0.03).

심장초음파 (표 2, 하단). 심부전을 가진 마우스들에 대한 AAV8.UCn2의 정맥 내 전달은 증가된 구출분획과 연관되었고 (p=0.01), 좌실내주 수축 속도는 증가되었으나 통계적 유의도에는 도달하지 않았다 (p=0.09). 또한, AAV8.UCn2를 받은 마우스들은 좌심실 말단-확장기 지름 (EDD; p<0.001) 및 좌심실 말단-수축기 지름 (ESD; p=0.002)에서의 감소들을 나타내었다. 식염수-처리된 마우스들은 좌심실 말단-확장기 지름에서 11% 증가를 나타낸 반면, UCn2-처리된 마우스들은 좌심실 말단-확장기 지름에서 2% 감소를 나타내었다. 유사하게, 상기 식염수 그룹은 좌심실 말단-수축기 지름에서 16% 증가를 나타낸 반면, UCn2 그룹은 6% 감소를 경험하였다. 좌심실 차원에서의 이러한 변화들은 작은 것으로 보임에도 불구하고, 부피는 차원의 삼차함수이기 때문에, 상기 부피 변화들은 상당한 것이다 - 말단-수축기 지름에서 64% 증가로 계산되고 (식염수 대비 UCn2) 말단-확장기 지름에서 46% 증가로 계산됨 (식염수 대비 UCn2). 후벽 및 격벽 두께는 그룹 간 차이들을 나타내지 않았다 (표 1, 하단).

좌심실 수축기 및 확장기 기능 (도 15 및 표 3, 하단). 좌심실 압력 발생의 in vivo 측정은 좌심실 압력 발생 (LV +dP/dt; p<0.0001) 및 좌심실 이완 (LV -dP/dt; p<0.0007)의 속도에서의 상당한 증가들을 나타내었다 (도 15 및 표 3, 하단). 평균 동맥 압력에 있어서 그룹 간 차이는 없었다 (표 3). 마취 하에서 수행된 이러한 연구들 동안의 심박수는, UCn2 유전자 이동을 받은 마우스들에게서 다소 높았으나, 차이는 통계적 유의도에 도달하지 않았다.

시토졸성 Ca^{2 +} 과도현상들 (transients) 및 관련된 유전자들. 방출된 기저 Ca²⁺ (수축기-확장기 Ca^{2 +})는 UCn2 유전자 이동을 받은 심부전 마우스들로부터 수득된 심근세포들에서 증가되었다 (p=0.0001, 도 16A 및 16B). 또한, UCn2 유전자 이동은 UCn2 유전자 이동 5 주 후 심부전을 가진 마우스들로부터 나온 심근세포들에서 감소된 Ca^{2 +} 감소 시간 (t_1/2, Tau)과 연관되어 있다 p=0.001, 도 16C 및 도 16D). 증가된 UCn2는 정상 및 쇠약한 좌심실에서의 SERCA2a mRNA 및 단백질의 증가된 발현과 연관되어 있다 (도 16E 및 16F). 그러나, 좌심실 단백질 발현 및 포스포람반 또는 TnI의 인산화에서 그룹 간 차이는 나타나지 않았다 (데이터 미도시)

사이클릭 AMP & PKA 활성. 양쪽 그룹들의 심장들로부터 단리된 좌심실 샘플들 및 심근세포들은 cAMP 또는 PKA 활성에서 차이들을 나타내지 않았다 (도 17). 사이클릭 AMP 생산 및 PKA 활성은 이소프로테레놀 또는, 베타-교감신경 수용체들의 아데닐산 고리화효소를 개별적으로 자극하는 수용성 포스콜린 유사체인, NKH477의 자극 전 및 후에 평가되었다. 기저, 이소 (Iso) 또는 NKH477-자극된 cAMP 생산 (도 4A) 또는 PKA 활성 (도 17B)에서 그룹 간 차이들은 나타나지 않았다. PKA 집단 단백질들 (촉매성 α 유닛 및 조절성 α 및 β 서브유닛들 및 이들의 인산화)의 발현은 변동되지 않았다 (데이터 미도시).

CamKII & cMLCK. UCn2 유전자 이동에 의해 자극된 쇠약한 심장의 증가된 기능을 설명하는 메커니즘들을 찾기 위하여, 본 발명자들은 좌심실 발현 및 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II (CamKII)의 인산화 및 심장 미오신 경쇄 키나아제 3 (cMLCK)의 발현을 측정하였다. 총 CamKII 단백질 발현이 그룹 간 차이를 나타내지 않았음에도 불구하고, Ser286에서의 CamKII 인산화는 UCn2 유전자 이동 후 심부전 마우스들로부터 수득된 좌심실 샘플들에서 감소되었다 (47% 감소, p=0.04; 도 4C). Ca^{2 +}의 근필라멘트 감응성에서의 변동들을 찾고자, 본 발명자들은 UCn2 유전자 이동 후 좌심실 심장 미오신 경쇄 키나아제 3 (cMLCK) 발현을 측정하였으며, 1.6 배 증가 (p<0.04)를 발견하였다 (도 4D).

부검 (표 5). 간, 폐 및 체중들은 그룹 간 차이들을 나타내지 않았다. UCn2 유전자 이동은 좌심실 무게를 감소시키는 경향을 보였고, 좌심실 대 체중 비율은 감소되었다 (12% 감소. P=0.01).

스트레스, 염증 및 조직 부상의 마커들 (표 6, 하단). 좌심실 스트레스, 염증 및 조직 부상의 몇몇 마커들의 발현은 RT-PCR을 이용하여 실험되었다. 심부전은 대부분의 이러한 유전자들의 발현을 변동시켰다 (표 6). 증가된 UCn2 발현은 심부전과 연관된 변동들에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 정상 마우스들에서, 증가된 UCn2 발현은 ANF (p=0.007), BNP (p=0.01), β-MyHC 및 α-SK-액틴 (p=0.03)의 감소된 발현과 연관되었다.

좌심실 및 간 조직학. 간 및 좌심실의 샘플들의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 그룹 간 차이들의 흔적을 나타내지 않았다 (데이터 미도시). 메이슨 트리크롬 염색은 간에서 섬유화에서의 그룹 간 차이들이 없음을 나타내었다 (p=0.79).

논의

본 연구는 AAV8.UCn2의 단독 정맥 주사가 쇠약한 심장의 기능을 증가시킴을 입증하였고, 심부전을 치료하기 위해 이로운 근거리 분비 효과들을 가지는 펩티드를 인코딩하는 장기 발현 벡터의 정맥 전달의 실현 가능성 및 효율을 입증하였다.

심기능의 2 가지 측정들은, 심각한 기능장애성 좌심실들을 가진 동물들로의 정맥 AAV8.UCn2의 전달 5주 후 증가된 좌심실 기능을 확인시켜주었다. 심장초음파는 좌심실 구출분획에서의 증가들을 나타내었고, 좌심실 부피들의 감소들을 나타내었다 (표 1). 둘째로, UCn2 유전자 이동은 LV +dP/dt 피크를 증가시켰고, 이는 개선된 좌심실 수축능을 나타내었으며, LV -dP/dt를 감소시켰고, 이는 개선된 좌심실 확장능을 나타내었다 (표 3, 도 15).

좌심실 구출분획 변화의 절대값은 단지 8% 유닛들이었음에도 불구하고 (HF: 12±1%; HF+UCn2: 20±4%), 상대적 증가는 67%였다. 작은 절대값 변화는 상기 경색증의 큰 사이즈를 반영한다 - 평균 예비-랜덤화 좌심실 구출분획들은 양쪽 그룹들 모두에서 20% 이하였다. 이러한 큰 경색증들에도 불구하고, UCn2 유전자 이동은 좌심실 챔버 팽창을 약화시키고 구출분획을 증가시킨 반면, 식염수-처리된 마우스들은 점진적인 좌심실 챔버 팽창 및 추가적으로 좌심실 구출분획의 악화를 나타내었다. UCn2 유전자 이동이 사실상 좌심실 자유벽에 전체적으로 나타나는 이처럼 광범위한 상처와 연관된 문제점들의 해결책이 된다는 것을 예측하지 못할 것이다. UCn2 유전자 이동의 심장의 이익들은, 최근 모델에서 심실 중격에 나타난, 좌심실의 독자 생존 가능 영역 (viable portion)에 한정되어 예측될 것이다. 특히 박출 도중의 경색된 벽의 이상운동증을 본 발명자들이 관찰하였기 때문에, 이러한 세팅에서의 구출분획은 좌심실 기능에 관한 이익들을 과소평가할 수 있다. LV +dP/dt 피크를 이용한 좌심실 수축기 기능의 평가는 좌심실 기능에서 큰 절대값 증가를 나타낸다 - UCn2 유전자 이동에 의해 유발된 +LV dP/dt 피크에서 3129 mmHg/초의 증가, 및 -dP/dt 피크에서의 1857 mmHG/초의 증가. 이들은 +LV dP/dt 피크에서의 2 배 증가, 및 -dP/dt 피크에서의 1.6 배 증가를 나타낸다. 임상적인 심부전에서의 LV +dP/dt 피크의 배가 (doubling)는 좌심실 수축기 기능을 정상화시킬 수 있다.^{37 ,38}

정상 마우스들 (27) 또는 울혈성 심부전을 가진 마우스들에서 전이유전자 UCn2의 지속적인 높은 레벨들에도 불구하고, 최근 연구에서 나타난 바와 같이, 진정제를 투여하지 않은 상태에서 심박수 및 혈압은 AAV8.UCn2의 정맥 전달에 영향을 받지 않는다. 유사하게, UCn2 및 스트레스코핀 (UCn3 유사)의 펩티드 주입들의 임상적 시도들에서 속도-압력 생성물은 바뀌지 않았다 (9-11). 그러므로, 심장 대사 수요들에서의 증가가 UCn2 유전자 이동과 연관되어 있다고 예견되지는 않을 것이나, 이에 대해 확실히 알기 위해서는 한층 더 직접적인 대사 연구들이 반드시 수행되어야 한다.

본 연구는 심각하게 약화되고 쇠약한 심장의 셋팅 하에서 AAV8.UCn2의 정맥 전달의 실현 가능성 및 생리학적 결과물들에 포커스가 맞추어졌으며, 본원의 발명자들은 확연한 양성적 효과를 발견하였다. 본 연구의 주된 포커스는 아님에도 불구하고, UCn2 유전자 이동이 이로운 생리학적 변화들을 유발한 메커니즘들 또한 검토되었다.

예를 들어, 본 발명자들은, 본 발명자들이 이전에 정상 심장들을 가진 마우스들에 대해 보고했던 바와 같이²⁷, UCn2 유전자 이동이 a) 심부전 마우스들로부터 단리된 심근세포들에서의 증가된 피크 시토졸성 Ca^{2 +} 순간 (transient) 진폭 및 증가된 Ca^{2 +} 감소 속도와 연관되어 있고 (도 16A 내지 도 16D); b) 증가된 SERCA2a 발현과 연관되어 있음 (도 16E 및 도 16F)을 발견하였다. 관찰된 바와 같이 (도 15), 증가된 좌심실 SERCA2a 발현은 이에 의해 좌심실 수축기 기능 및 완화가 증가될 수 있는 메커니즘을 제공한다. SERCA2a는 근소포체에 시토졸성 Ca^{2 +}를 되돌려준다. 본 발명자들이 발견한 바와 같이 (도 16C 및 도 16D), 증가된 SERCA2a의 함량은 한층 더 신속한 시토졸성 Ca^{2 +} 감소를 얻는 것을 예견할 수 있으며, 또한 본 발명자들이 발견한 바와 같이 (도 15B), 결과적으로 좌심실 압력 감소 (LV -dP/dt) 속도의 증가를 예견할 수 있다.

또한, 본 발명자들은, 상기 쇠약한 좌심실의 기능에 대한 UCn2 유전자 이동의 관찰된 이로운 효과들에서 기계론적인 중요성을 가지는 것으로 보이는 2가지 추가적인 단백질들의 좌심실 발현에서의 변동들을 발견하였다: Ca^{2 +}/칼모듈린-의존성 키나아제 II (CaMKII)의 감소된 Thr286 인산화, 및 심장 미오신 경쇄 키나아제 (cMLCK)의 증가된 좌심실 발현 (도 4). CaMKII Thr286 인산화. 본 발명자들의 데이터는 UCn2 유전자 이동이 CaMKII의 감소된 Thr286 인산화와 관련되었음을 나타낸다 (도 17C). CaMKII 발현 및 활성화는 심기능의 중요한 결정 요인들이다.³⁹ 예를 들어, CaMKII의 심장-직접적인 발현은 마우스들에서 심부전을 야기했다.⁴⁰ 다른 것들은 마우스들에서 심근경색-유도된 심부전에서의 증가된 CaMKII 활성 및 발현을 나타내었다.⁴¹ 이러한 발견들의 임상적 관련성은, 좌심실 CamKII의 저해가 인간의 쇠약한 심장의 기능을 증가시킨다는 것을 입증함으로써 최근 입증되었다.⁴² 본 발명자들이 CaMKII의 감소된 Thr286 인산화가 좌심실 기능에서 관찰된 증가에 대해 기계론적으로 중요할 것이라고 추정하였음에도 불구하고, 본 발명자들은 증가된 UCn2가 Thr286 CaMKII 인산화를 감소시키는 경로를 확인할 수 없었으며, 이는 움직이고 있는 배양된 심근세포들에서의 포커스가 맞춰진 연구들을 필요로 할 것이다. 심장 미오신 경쇄 키나아제 (cMLCK). 본 발명자들은 증가된 cMLCK 발현이 UCn2 유전자 이동과 연관되어 있음을 발견하였다 (도 17D). 심장 미오신 경쇄 2v의 cMLCK에 의한 인산화는 심근세포들에서 교차-다리 보충 (cross-bridge recruitment)의 속도를 증가시키고 수축능에 영향을 미친다.^{43 , 44} 증가된 레벨들 cMLCK는 심근경색-유도된 심부전의 셋팅에서 증가된 좌심실 기능과 연관되어 있다.⁴⁵ 대조적으로, cMLCK의 제거는 심장 성능을 감소시킨다.⁴⁶ 안타깝게도, 미오신 경쇄 2v 인산화를 평가하기 위한 가능한 항체가 없으며, 이에 따라 현재 연구에서 UCn2 유전자 이동과 연관된 cMLCK의 증가의 생물학적 중요성은 추측에 근거한 채로 남겨질 수밖에 없다.

UCn2 유전자 이동은 좌심실 압력 발생 (LV +dP/dt; 표 3 및 도 15)의 피크 속도에서의 배가와 연관되었다. 이러한 발견은, 심장초음파에 의한 좌심실 차원 및 기능 평가 (표 2), 증가된 Ca^{2 +} 조절 (도 3), 및 증가된 SERCA2a 단백질 발현을 포함하는, 증가된 수축능을 예견하는 좌심실에서의 신호 변화들 (도 16 및 도 17)에 의해 지지되었다. 단리된 심근세포들로부터 나온 in vivo 생리학에 대한 이러한 발견들의 일관성 때문에, 본 발명자들은 좌심실에서 BNP 및 ANF mRNA에서 그룹 간 차이들의 부재에 의해 덜 영향을 받았다 (표 6). 아마도 LA에서의 플라즈마 레벨들 또는 BNP/ANF 발현은 좌심실 mRNA 레벨들이 놓친 그룹 간 차이들을 나타낼 수도 있다. 또한, 증가된 좌심실 수축능에도 불구하고 - 전체 좌심실 자유벽의 경색 때문에 - ANF 및 BNP 발현의 지속적 자극이 제공되기 위해 충분한 지속적인 챔버 확장이 있었을 가능성이 있다.

본 발명자들은 폐 및 간 중량에서 그룹 간 차이를 발견하지 못했다 (표 5). 간 중량들은 정상 마우스들 (27) 대비 심부전을 가지는 마우스들에서 증가되지 않았고, 따라서, 심각한 좌심실부전에도 불구하고, 간 울혈은 없다. 이것이 마우스들에서 심근경색-유도된 울혈성 심부전에 국한된 것인지 여부는 알 수 없다. 폐 중량들은 정상 나이-매치된 마우스들 (27) 대비 23% 증가되었으나, 그룹 간 차이는 나타나지 않았다. 본 발명자들은, UCn2 유전자 이동에 의해 유발된 좌심실 수축능 (피크 +dP/dt)의 배가에도 불구하고, 치료 5주 후 지속적인 좌측 울혈이 있을 수 있을 것으로 추정한다.

임상적 적용. AAV8의 정맥 전달은 많은 장기들의 형질주입을 가능하게 하고 특히 간, 골격근 및 심장에 효과적이다.⁴⁸ 이러한 장기들은, 이들이 조직의 거대 질량을 포함하고 이에 따라 풍부한 전이유전자 Ucn2를 방출할 수 있기 때문에, 본 발명자들이 상기 벡터 용량을 절감할 수 있도록 해줄 것이다. 실제로, 10 배 낮은 벡터 용량 (마우스 당 5 x 10¹⁰ gc 또는 2 x 10¹² gc/kg)은 증가된 LV +dP/dt (27)에 여전히 효과적이다. 인간 인자 IX를 인코딩하는 AAV8 의 2 x 10¹² gc/kg의 용량이 헤모필리아 B를 가진 대상들의 임상적 시도에서 정맥을 통해 안전하고 효율적으로 전달되었다.²

임상적 적용들을 위해 본 발명자들의 발견들을 번역함에 있어서 고려할 추가적 특징은 조절된 발현 시스템의 사용이며,^{5 ,6,9} 이는 UCn2 발현을 자유롭게 개시 또는 차단할 수 있도록 할 수 있다. 본 발명자들은 테트라사이클린 및 라파마이신 조절 시스템들을 이용하는 이와 같은 AAV8 벡터들을 설계하였고 이러한 조절된 발현 벡터들과 함께 전임상 연구들을 수행하고 있다.

좌심실 Ca^{2 +} 조절은 마우스들에서 보다 인간들에서 상이하지만,⁴⁷ 심부전을 가진 환자들에서 UCn2 또는 스트레스코핀 (UCn3 유사)의 펩티드 주입들은 좌심실 기능을 증가시킨다 (9-11). Ca^{2 +} 과도현상들 및 Ca^{2 +} 조절 단백질들이 인간들에서 UCn2 펩티드 주입들 전 및 후에 심근세포들 또는 심근에서 측정되지 않았기 때문에, 이것이 Ca²⁺ 조절을 거치는지 여부는 알 수 없다.

결국, 본 발명자들이 UCn2 유전자 이동이 심각한 쇠약한 심장의 기능을 증가시킨다는 것을 입증하였기 때문에, 상기 효과가 얼마나 오래 지속되는지 및 이것이 사망률을 감소시키는지 여부를 확인하는 것이 중요할 것이다. 더 나은 장기 생존을 가지는 울혈성 심부전의 덜 심각한 모델을 사용한 이와 같은 연구들이 계획된다.

이들 데이터는 AAV8.UCn2의 단독 정맥 주사가 심각하게 쇠약한 심장의 수축능 및 확장능 모두를 증가시킨다는 것을 입증한다. 상기 벡터의 전신 전달은, 상기 전이유전자가 상기 심장 내에서 발현되지만, 또한 상기 순환계 내로 지속적으로 방출되며, 이에 따라 그렇지 않았다면 가능하지 않았을 지속적인 이익들을 제공한다는 것을 확인시켜 준다. 근거리 분비 활성 펩티드들의 정맥 주입과 비교할 때 유전자 이동의 다른 장점들은 카테터-기반 감염들의 감소, 입원 불필요, 및 감소된 비용들을 포함한다.

도면 설명들 - 실시예 2

도 14. AAV8.CBA.UCn2 지도 및 실험적 프로토콜

A. AAV8.CBA.UCn2 벡터지도: ITR, 역방향 말단 반복; SVpA, SV40 바이러스 유전체로부터 나온 폴리 A; UCn2, 우로코르틴-2; CBA, 닭 β-액틴 프로모터; CMV.en, 인간 거대세포 바이러스 인핸서

B. 실험적 프로토콜. 정상 마우스들이 심부전을 유도하기 위해 심근경색 (MI, 근위의 좌측 관상동맥 연결에 의함)을 겪었으며, 심근경색 3주 후에 심장초음파에 의해 평가되었다. 25% 미만의 구출분획을 가진 마우스들은 이후 AAV8.UCn2 (5 x 10¹¹ gc, 정맥) 또는 정맥 식염수를 투여받도록 랜덤화되었다. 5주 후 심장초음파가 좌심실 크기 및 기능을 측정하기 위해 사용되었다. In vivo 생리학적 연구들은, 좌심실 수축능 및 확장능을 평가하기 위하여, 좌심실 압력 발생 (LV + dP/dt) 및 소멸 (LV -dP/dt)의 속도들을 평가하기 위해 수행되었다. 좌심실의 단면들 (중간 유두상 레벨)은, 오직 상기 심실 중격만 손상되지 않은 채로, 상기 경색이 상기 좌심실 자유벽의 대부분을 포함하여 광범위함을 보여준다. 데이터의 획득 및 분석은 그룹 치료에 대해 맹검으로 수행되었다.

도 15. in vivo 좌심실 기능

A 및 B. AAV8.UCn2 (5 x 10¹¹ gc, 정맥) 또는 식염수 (HF) 5주 후에 좌심실 압력 발생 (LV +dP/dt; A) 및 소멸 (LV -dP/dt;B)의 속도를 측정하기 위해 in vivo 연구들이 수행되었다. 유전자 이동 5주 후 AAV8.UCn2는 LV +dP/dt 및 LV -dP/dt를 증가시켰으며, 이는 UCn2 유전자 이동이 좌심실 수축능을 증가시켰음을 나타내는 것이었다.

C 및 D. 심박수는 더 높아진 경향을 보였다 (D). 좌심실에서 발생된 압력은 UCn2 유전자 이동에 의해 증가되었다 (C). 연구들은 그룹 정체성에 대한 인지 없이 수행되었다.

P 값들은 스튜던트 t-검정 (비쌍체, 양쪽-꼬리)으로부터 나온다. 데이터는 평균±SE를 나타내며, 바 (bar)들에 있는 숫자들은 그룹 크기를 나타낸다.

도 16. 심부전 (HF)을 가진 마우스들로부터 나온 심근세포들에서의 수축기 Ca ²⁺ 과도현상들

정맥 AAV8.UCn2 (HF+UCn2) 또는 정맥 식염수 5주 후. A 및 B. 방출된 기저 Ca²⁺ (수축기-확장기 Ca^{2 +})는 HF+UCn2 마우스들로부터 수득된 심근세포들에서 증가되었다 (p=0.0001). A. 각 그룹 내의 1 개의 심장으로부터 수득된 대표적인 Indo-1 Ca²⁺ 과도현상 기록들은 UCn2 유전자 이동 5주 후 심부전을 가지는 마우스들로부터 단리된 심근세포들에서 증가된 피크 Ca^{2 +}를 보여준다. B. 그룹 당 3 마리의 마우스들로부터 수득된 요약 데이터를 나타내었다. C 및 D. Ca^{2 +} 감소 시간 (t_1/2, Tau)은 UCn2 유전자 이동 5주 후 심부전을 가지는 마우스들로부터 나온 심근세포들에서 단축되었다.

C. 각 그룹 당 1 개의 심장으로부터 수득된 심근세포들로부터의 대표적인 정규화된 Ca^{2 +} 과도현상들. D. 그룹 당 3 마리의 마우스들로부터의 요약 데이터를 나타내었다. A 및 C에 대하여, 각 커브는 각 그룹으로부터의 1 개의 심장으로부터 수득된 30 개의 심근세포들의 평균이다. B 및 D에 대하여, 그룹 당 3 마리의 동물들로부터 수득된 요약 데이터는 144 개의 개별적인 심근세포들의 분석을 포함한다 (86, 식염수; 60, AAV8.UCn2). B 및 D에 대하여, 막대들은 평균±SE를 나타낸다; 막대들에 있는 숫자들은 심근세포들의 수를 나타낸다; 막대 상의 숫자들은 스튜던트 t-검정으로부터의 p 값들을 나타낸다 (비쌍체, 양쪽-꼬리).

E. 면역 블로팅 데이터 (하단 패널)의 요약 (상단 패널)은, 정상 마우스들로부터 및 심부전을 가지는 마우스들로부터 수득된 좌심실에서 UCn2 유전자 이동이 SERCA2a 단백질을 증가시켰다는 것을 나타낸다. 포스포람반 (PLB) 및 트로포닌 I (TnI)의 발현 및 인산화는 영향을 받지 않았다. 막대들은 평균±SE를 나타낸다; 막대들에 있는 숫자들은 그룹 크기를 나타낸다; 스튜던트 t-검정으로부터 수득된 막대 상의 숫자들 (비쌍체, 양쪽 꼬리 대비 대조군).

도 17. 심근세포 cAMP-PKA 신호법.

좌심실 샘플들 (A, C, D) 또는 심근세포들 (B)은 심부전을 가지는 마우스들로부터 수득된 것 (HF) 및 AAV8.UCn2을 받은 심부전을 가지는 마우스들로부터 수득된 것 (UCn2) 이었다. 사이클릭 AMP 및 PKA 활성은 자극되지 않은 (기저) 상태에서 및 이소프로테레놀 (이소, 10 μM, 10 분) 및, 분리된 실험들에서, β-교감신경 수용체들의 아데닐산 고리화효소를 개별적으로 자극하는 수용성 포스콜린 유사체인, NKH477 (NKH, 10 μM, 10 분)에 의하여 자극된 후 평가되었다. 막대들에 있는 숫자들은 그룹 크기를 나타낸다.

A. cAMP 생산: 기저, 이소 (Iso) 또는 NKH477-자극된 cAMP 생산에서 그룹 간 차이들은 나타나지 않았다.

B. PKA 활성: 기저, 이소 또는 NKH477-자극된 조건들에서 그룹 간 차이들은 나타나지 않았다.

C. CamKII 발현 및 인산화: UCn2 유전자 이동은 CamKII의 감소된 Thr286 인산화와 연관되었다 (좌측 패널, GAPDH로 정규화됨). 총 CamKII는 변화되지 않았다.

D. 심장 미오신 경쇄 키나아제: UCn2 유전자 이동은 증가된 심장 미오신 경쇄 키나아제 (cMLCK) 단백질과 연관되었다 (좌측 패널, GAPDH로 정규화됨).

모든 그래프들에서, 막대들은 평균+SE를 의미한다; 막대들에 있는 숫자들은 그룹 크기를 의미하며, 막대 상의 숫자들은 스튜던트 t-검정 (비쌍체, 양쪽 꼬리 vs. 대조군들)으로부터 나온 것이다.

혈압 및 심박수 (HR)에 관한 UCn2 유전자 이동의 상기 효과들은 심부전을 가지는 진정제를 투여하지 않은 마우스들에 UCn2 유전자 이동 (HF+UCn2, 5 x 10¹¹ gc, 정맥) 또는 정맥 식염수 (HF) 처리 5주 후에 평가되었다. 수축기 및 확장기 혈압은 테일 커프 방법 및 계산된 평균 혈압에 의해 측정되었다. 심박수 또는 혈압에서 그룹 간 차이들은 관찰되지 않았다. 값들은 평균±SE을 나타낸다; p 값들은 스튜던트 t-검정 (비쌍체, 양쪽-꼬리)으로부터 나온 것이다.

HF, 심부전; UCn2, 우로코르틴-2; HR, 심박수; bpm, 분당 박동수; EDD, 좌심실 말단-확장기 지름; ESD, 좌심실 말단-수축기 지름; LVEF, 좌심실 구출; VCFs, 주변 섬유 단출 속도 (심박수를 위해 보정됨); PW Th, 말단-확장기의 후벽 두께; IVS Th, 말단-확장기의 심실간 벽 두께; 사후-예비, 식염수 또는 UCn2 유전자 이동 5주 후의 값에서 이전의 값을 뺀 것. 사후-예비 변화에서의 그룹 간 차이를 위한, 스튜던트 t-검정 (쌍체 데이터, 양쪽 꼬리)으로부터 수득된 p 값들.

심근경색 3주 후, 마우스들은 정맥으로 식염수 또는 AAV8.UCn2 (5 x 10¹¹ gc)를 투여받았다. 마우스들에 대해 5주 후에 생리학적 연구들이 수행되었다. LVP, 좌심실 발생 압력; LV, 좌심실; MAP, 평균 동맥 압력; HR, 심박수; UCn2, 우로코르틴-2 유전자 이동. 값들은 평균±SE를 나타낸다. P 값들은 스튜던트 t-검정 (비쌍체, 양쪽-꼬리)으로부터 수득된 것이다.

ANF, 심방성 나트륨이뇨 펩티드; α-MHC, 알파-미오신 중쇄; α-Cd-액틴, 알파-심장 액틴; α-SK-액틴, 알파-골격-액틴; β-MHC, 베타-미오신 중쇄; BNP, 뇌 나트륨이뇨 펩티드; Coll, 콜라겐; MMP, 기질 금속 펩티드 분해 효소 (matrix metallopeptidase); TIMP, 금속 단백 분해 효소 (metalloproteinase)들의 조직 저해제; MEF2, 근세포 인핸서 인자-2 (myocyte enhancer factor-2); UCn2, 우로코르틴 2.

심근경색 3주 후, 마우스들은 정맥으로 식염수 또는 AAV8.UCn2 (5x10¹¹ gc)를 받았다. 마우스들은 6주 후 희생되었고 부검이 수행되었다. BW, 체중; g, 그램; LV, 좌심실; UCn2, 우로코르틴-2 유전자 이동. 값들은 평균±SE를 나타낸다. p 값들은 스튜던트 t-검정 (비쌍체, 양쪽-꼬리)로부터 나왔다.

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본 발명의 다수의 구현예들이 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형들이 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현예들은 하기 청구항들의 범주 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> SYSTEMIC DELIVERY OF VIRUS VECTORS ENCODING UROCORTIN-2 AND RELATED GENES TO TREAT DIABETES-RELATED CARDIAC DYSFUNCTIONS AND CONGESTIVE HEART FAILURE <130> 0321.119397WO1/ SD2014-237-3PCT <140> to be assigned <141> 2015-04-03 <150> 61/974,662 <151> 2014-04-03 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 cctcgtcttg gccttttgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 catcttctac cggcatcttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 aaaggctgag aggaactacc 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 accagccttc tcctctgc 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 gtgttacgtc gcccttgatt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 tgaaagaggg ctggaagaga 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 gtgtcaccca caacgtgc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 agggccacat agcacagc 18 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 gctgaaagca gaaagagatt atc 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 tggagttctt ctcttctgga g 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 gaagtcctag ccagtctcc 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 cagcttgaga tatgtgtcac c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 gccaagaaga catccctgaa g 21 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 gggtccctcg actcctac 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 gcacagcagt ccaacgtaga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 tctccaaatg ggatctctgg 20 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 catgttccag tatgactcca ctc 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 ggcctcaccc catttgatgt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 gagcctcatg aaagcaggac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 gaagttctga ggtggcaagc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 gagttgcaac ctctttgtgc 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 caggtgtgta accaatgatc c 21 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 gactctggtg atttcttgct aac 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 caccatggtc tcttgagacg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 cgtcgtgatc cccacttact 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 gaacacacag ggtttgcctt c 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 gacagctttc tgcaactcgg 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 cttgtggaca tatccacaga gg 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 gcaatgcaga cgtagtgatc ag 22 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 ccttctttcc tccaacgtcc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 cttctgcaac tccgacatcg 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 cctgtcagca ggtactgg 18 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 caaggatatt cagtatgtct acacg 25 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 ctggtggtag tgatgattca gg 22 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 actcctatcc ccaccttcca 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 36 aagatccgta ggaggccaat 20

Claims (24)

1. 개인 또는 환자의, 울혈성 심부전 (CHF); 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF); 또는 2형 당뇨병 (T2DM)에서 당뇨병-연관 심기능 장애를 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전 (reverse)시키기 위한 방법으로서,
   하기를 포함하는:
   (a) (i) 전사 조절 서열에 작동적으로 (operatively) 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지를 내포하는, 발현 매개체 (delivery vehicle), 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물을 제공하는 것으로서, 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내에서 또는 in vivo 발현할 수 있는 것이고; 및
   (ii) 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지, 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물을 상기 세포, 또는 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 투여 또는 전달하는 것으로서,
   이로 인해 상기 개인 또는 환자의, 울혈성 심부전 (CHF); 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF); 또는, 2형 당뇨병 (T2DM)에서 당뇨병-연관 심기능 장애를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것이거나;
   (b) 상기 (a)의 방법에 있어서, 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 하기이거나 하기를 포함하는 것으로서:
   아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터,
   AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9,
   레서스 (rhesus)-유래 AAV, 또는 상기 레서스-유래 AAV인 AAVrh.10hCLN2,
   AAV 캡시드 돌연변이 또는 AAV 하이브리드 혈청형,
   장기-친화성 AAV, 선택적으로, 간-친화성 또는 골격근-친화성,
   여기에서 선택적으로 상기 AAV는 야생형 (wt) AAV에게 복제를 허용하지 않는 특이 세포 유형을 표적화하는 것의 효율을 증가시키기 위해 및/또는 표적 세포 유형만 감염시키는 효율을 개선하기 위해 설계된 것이고,
   및 선택적으로 상기 하이브리드 AAV는 하기를 포함하는 하나 이상의 개질들에 의하여 하이브리드 혈청형으로서 재표적화 또는 설계된 것이거나: 1) 캡시드 전환, 2) 캡시드 표면에 대한 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자이크 캡시드의 설계, 및/또는 4) 키메라성 캡시드의 설계;
   (c) 상기 (a)의 방법에 있어서, 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지는 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 것이거나;
   (d) 상기 (c)의 방법에 있어서, 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열은 조절된 또는 유도성 프로모터로서,
   여기에서 선택적으로 전사 및/또는 번역의 양성 (활성제) 및/또는 음성 (억제제) 조절자가 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지에 작동 가능하게 연결된 것이거나;
   (e) 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 한 방법에 있어서, 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지, 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물을, 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 투여하는 것은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질이 상기 혈류 또는 대순환 내로 방출되는 것을 야기하거나, 또는 상기 세포 내에서 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질의 증가되거나 지속적인 발현을 야기하는 것으로서,
   여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 단백질의 상기 방출 또는 증가되거나 지속적인 발현은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지에 작동적으로 연결된, 유도성 프로모터의 활성화, 또는 억제제의 억제 해제에 의존하는 것이거나; 또는
   (f) 상기 (a) 내지 (e) 중 어느 한 방법에 있어서, 증가된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드의 레벨에 신속한 반응을 나타내는 상기 질환 또는 상태는 심수축성 기능장애; 울혈성 심부전 (CHF); 심장 섬유증; 심근세포 질환, 기능장애 또는 세포사멸; 폐 고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환; 또는, 혈우병 또는 혈우병 B형 (Hemophilia B)인 것인,
   방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   (a) 상기 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 이를 필요로 하는 상기 개인 또는 환자에게, 경구, 근육 (IM) 주사, 정맥 (IV) 주사, 피하 (SC) 또는 피부 주사, 경막 내 주사, 동맥 (IA) 주사, 관상동맥 주사, 흡입, 에어로졸, 또는 바이오리스틱 (biolistic) 입자 전달 시스템, 또는 "유전자 총 (gene gun)" 사용, 공기 피스톨 또는 HELIOS™ 유전자 총 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 사용에 의하여 투여 또는 전달되거나; 또는
   (b) 상기 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 이를 필요로 하는 상기 개인 또는 환자에게, 상기 혈류에 인접하거나 또는 상기 혈류에 의해 배출된 상기 체내의 임의의 조직 또는 유체 공간 내부로 도입되어, 상기 인코딩된 단백질이 상기 조직 내의 세포들로부터 분비되고 상기 혈류 내로 방출될 수 있도록 하는 것에 의하여, 투여 또는 전달되는 것인, 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서:
   (a) 상기 개인, 환자 또는 대상은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (예를 들어, 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 것)를 유도 또는 활성화하는 자극 또는 신호를 투여 받거나;
   (b) 상기 개인, 환자 또는 대상은 프로모터, 선택적으로 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자-특이 프로모터 (예를 들어, 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 것)의 활성제의 합성을 유도하는 자극 또는 신호를 투여 받거나;
   (c) 상기 개인, 환자 또는 대상은 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자-특이 프로모터의 천연 또는 합성 활성제의 합성을 유도하는 자극 또는 신호를 투여 받거나,
   여기에서 선택적으로 상기 천연 활성제는 내인성 전사 인자이며;
   (d) 상기 (c)의 방법에 있어서, 상기 합성 활성제는 특이적 및 선택적으로 내인성 또는 외인성 표적 유전자를 개시하도록 (turn on) 설계된 징크-핑거 (zinc-finger) DNA 결합 단백질이거나, 여기에서 선택적으로 상기 내인성 표적은 유전자 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 활성제, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성제이며;
   (e) 상기 (a) 내지 상기 (c) 중 어느 한 방법에 있어서, 상기 자극 또는 신호는 생물학적, 광학적, 화학적 또는 약학적 자극 또는 신호를 포함하거나;
   (f) 상기 개인, 환자 또는 대상은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 사후-전사 활성제, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 활성제의 발현을 자극 또는 유도하는 자극 또는 신호를 투여 받거나, 또는
   (g) 상기 개인, 환자 또는 대상은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 전사 억제제 또는 사후-전사 억제제의 저해를 저해하거나 유도하는 자극 또는 신호를 투여 받는 것인, 방법.
4. 제 5 항에 있어서,
   상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자의 발현을 유도하거나, 또는 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자에 작동적으로 연결된 조절된 또는 유도성 프로모터의 발현을 유도하는 화학적 또는 약학적인 것은, 경구 항생제, 독시사이클린 (doxycycline) 또는 라파마이신 (rapamycin)이거나; 또는 독시사이클린을 이용한 tet-조절 시스템이 상기 우로코르틴 2 및/또는 3-발현 핵산 또는 유전자, 또는 이의 등가물의 발현을 유도하기 위해 사용되는 것인, 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 액체, 젤, 하이드로젤, 분말, 또는 수용액 또는 식염수 제형 내에서 제형화되는 것인, 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 소포 (vesicle), 리포좀, 나노입자 또는 나노리피드 입자 (NLP) 내에서 제형화되는 것인, 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 단리 (isolated) 되거나 배양된 세포 내에서 제형화되며, 및 선택적으로 상기 세포는 포유류 세포, 심장 세포, 또는 인간 세포, 비-인간 영장류 세포, 원숭이 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 기니피그 세포, 토끼 세포, 햄스터 세포, 염소 세포, 소 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 또는 고양이 세포인 것인, 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 약학 제형 또는 멸균 제형으로서 제형화되는 것인, 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은, 생산 제품, 인공 장기 또는 임플란트와 함께, 상에, 또는 이와 결합시켜 제형화 또는 전달되는 것인, 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-발현 핵산 또는 유전자 또는 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드를 in vitro 또는 ex vivo 발현하는 것인, 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법의 실시를 포함하는, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-반응 병리학, 질환 (disease), 병기 (illness), 또는 상태 (condition)에 대해 개인 또는 환자를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한, 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법의 실시를 포함하는, 당뇨병-연관 심수축성 기능장애; 당뇨병-연관 울혈성 심부전 (CHF); 당뇨병-연관 심장 섬유증; 당뇨병-연관 심근세포 질환, 기능장애 또는 세포사멸; 당뇨병-연관 폐 고혈압을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한, 방법.
13. 환자 또는 개인의 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하며, 하기를 포함하는:
    (a) 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법을 실시하거나; 또는
    (b) 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3을 인코딩하는 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사를 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 투여하는 것으로서,
    여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합된, 합성된 및/또는 펩티드 유사체의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이의 변형체이고,
    이로 인해 상기 환자 또는 개인의 상기 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것인,
    방법.
14. 환자 또는 개인의 비만을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하며, 하기를 포함하는:
    (a) 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법을 실시하거나; 또는
    (b) 우로코르틴 2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3을 인코딩하는 핵산, 유전자, 메시지 또는 전사를 이를 필요로 하는 개인 또는 환자에게 투여하는 것으로서,
    여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된, 재조합된, 합성된 및/또는 펩티드 유사체의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이의 변형체이고,
    이로 인해 상기 환자 또는 개인의 상기 비만을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하는 것인,
    방법.
15. 제 15 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 우로코르틴-2 (UCn-2) 펩티드 또는 폴리펩티드는 소포 (vesicle), 리포좀, 나노입자 또는 나노리피드 입자 (NLP) 내에서 또는 그 형태로서 제형화되는 것이거나, 또는 경구 투여, 근육 (IM) 주사, 정맥 (IV) 주사, 피하 (SC) 또는 피부 주사, 경막 내 주사, 동맥 (IA) 주사, 관상동맥 주사, 흡입, 또는 에어로졸에 의한 투여를 위하여 제형화되는 것인, 방법.
16. 약제 제조에 있어서, 하기의 용도이거나:
    - 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자;
    - 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 내포하는, 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물; 또는
    - 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내 또는 in vivo 발현할 수 있는, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지, 및 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물,
    또는,
    하기이거나 하기를 포함하는 것인 용도로서:
    개인 또는 환자의 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF)을 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키거나,
    심수축성 기능장애; 울혈성 심부전 (CHF); 심장 섬유증; 심근세포 질환, 기능장애 또는 세포사멸; 폐 고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환; 또는, 혈우병 또는 혈우병 B형 (Hemophilia B)을 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키거나,
    환자 또는 개인의 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 또는 예방하거나, 또는
    환자 또는 개인의 비만을 치료, 개선 또는 보호 또는 예방하는 것으로서,
    여기에서 선택적으로 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 하기이거나 하기를 포함하는 것으로서:
    아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터,
    AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9,
    레서스 (rhesus)-유래 AAV, 또는 상기 레서스-유래 AAV인 AAVrh.10hCLN2,
    AAV 캡시드 돌연변이 또는 AAV 하이브리드 혈청형,
    장기-친화성 AAV, 선택적으로, 간-친화성 또는 골격근-친화성,
    여기에서 선택적으로 상기 AAV는 야생형 (wt) AAV에게 복제를 허용하지 않는 특이 세포 유형을 표적화하는 것의 효율을 증가시키기 위해 및/또는 표적 세포 유형만 감염시키는 효율을 개선하기 위해 설계된 것이고,
    및 선택적으로 상기 하이브리드 AAV는 하기를 포함하는 하나 이상의 개질들에 의하여 하이브리드 혈청형으로서 재표적화 또는 설계된 것이거나: 1) 캡시드 전환, 2) 캡시드 표면에 대한 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자이크 캡시드의 설계, 및/또는 4) 키메라성 캡시드의 설계;
    여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지는 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 것이거나;
    여기에서 선택적으로 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열은 조절된 또는 유도성 프로모터로서,
    여기에서 선택적으로 전사 및/또는 번역의 양성 (활성제) 및/또는 음성 (억제제) 조절자가 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지에 작동 가능하게 연결된 것인,
    용도.
17. 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는,
    우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 내포하는, 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물; 또는,
    상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내 또는 in vivo 발현할 수 있는, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지, 및 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물로서,
    약제 제조 시 이용하기 위한 것이거나, 또는
    하기에 이용되는 것인:
    개인 또는 환자의 2형 당뇨병 (T2DM) 및 울혈성 심부전 (CHF)을 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키거나,
    심수축성 기능장애; 울혈성 심부전 (CHF); 심장 섬유증; 심근세포 질환, 기능장애 또는 세포사멸; 폐 고혈압; 심장, 피부, 간, 폐, 근육, 신경, 뇌 또는 신장 질환; 또는, 혈우병 또는 혈우병 B형 (Hemophilia B)을 치료, 개선 또는 보호 (예방), 진행 저지, 또는 반전시키거나,
    환자 또는 개인의 당뇨병 또는 당뇨병전기를 치료, 개선 또는 보호 또는 예방하거나, 또는
    환자 또는 개인의 비만을 치료, 개선 또는 보호 또는 예방하는 것,
    상기 대상의 세포에게, 또는 이를 필요로 하는 대상에게 하기를 제공 및 투여 또는 전달하는 것을 포함하는:
    전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자;
    우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 내포하는, 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물; 또는,
    상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내 또는 in vivo 발현할 수 있는, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지, 및 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스 또는 등가물,
    여기에서 선택적으로 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물은 하기이거나 하기를 포함하는 것으로서:
    아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터,
    AAV 혈청형 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9,
    레서스 (rhesus)-유래 AAV, 또는 상기 레서스-유래 AAV인 AAVrh.10hCLN2,
    AAV 캡시드 돌연변이 또는 AAV 하이브리드 혈청형,
    장기-친화성 AAV, 선택적으로, 간-친화성 또는 골격근-친화성,
    여기에서 선택적으로 상기 AAV는 야생형 (wt) AAV에게 복제를 허용하지 않는 특이 세포 유형을 표적화하는 것의 효율을 증가시키기 위해 및/또는 표적 세포 유형만 감염시키는 효율을 개선하기 위해 설계된 것이고,
    및 선택적으로 상기 하이브리드 AAV는 하기를 포함하는 하나 이상의 개질들에 의하여 하이브리드 혈청형으로서 재표적화 또는 설계된 것이거나: 1) 캡시드 전환, 2) 캡시드 표면에 대한 이중-특이성 항체의 흡착, 3) 모자이크 캡시드의 설계, 및/또는 4) 키메라성 캡시드의 설계;
    여기에서 선택적으로 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지는 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 것이거나;
    여기에서 선택적으로 상기 조절된 또는 유도성 전사 조절 서열은 조절된 또는 유도성 프로모터로서,
    여기에서 선택적으로 전사 및/또는 번역의 양성 (활성제) 및/또는 음성 (억제제) 조절자가 상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지에 작동 가능하게 연결된 것인,
    전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 유전자; 또는,
    우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산 또는 유전자를 내포하는, 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스, 또는 등가물; 또는,
    상기 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3-인코딩 핵산, 유전자, 전사 또는 메시지를 세포 내 또는 in vivo 발현할 수 있는, 우로코르틴 2 및/또는 우로코르틴 3 폴리펩티드-발현 핵산, 전사 또는 메시지, 및 상기 발현 매개체, 벡터, 재조합 바이러스 또는 등가물.
18. 이를 필요로 하는 대상 또는 개인의, 울혈성 심부전 (CHF), 또는 울혈성 심부전 (CHF)의 증상들을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한 방법으로서, 하기를 포함하는:
    (a) 이를 필요로 하는 대상 또는 개인에게 우로코르틴 2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 전달하고,
    이로 인해 이를 필요로 하는 상기 대상 또는 개인의 울혈성 심부전 (CHF)이 치료 또는 개선되도록 하거나;
    (b) 상기 (a)의 방법에 있어서, 상기 핵산 서열은 벡터 내에 (예를 들어, 내포되어) 있는 것이거나;
    (c) 상기 (b)의 방법에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이거나;
    (d) 상기 (c)의 방법에 있어서, 상기 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV)이거나;
    (e) 상기 (d)의 방법에 있어서, 상기 AAV는 혈청형 AAV8이거나;
    (f) 상기 (a) 내지 상기 (e) 중 어느 하나의 방법에 있어서, 이를 필요로 하는 상기 대상 또는 개인은 2형 당뇨병 (T2DM)을 가지거나; 또는
    (g) 상기 (a) 내지 상기 (f) 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 핵산 서열은 정맥 (IV) 주사 또는 근육 내로 투여되는 것인,
    이를 필요로 하는 대상 또는 개인의, 울혈성 심부전 (CHF), 또는 울혈성 심부전 (CHF)의 증상들을 치료, 개선 또는 보호 (예방)하기 위한, 방법.
19. 제 18 항에 있어서,
    상기 핵산 서열은 벡터 내에 (예를 들어, 내포되어) 있는 것인, 방법.
20. 제 19 항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
21. 제 20 항에 있어서,
    상기 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV)인, 방법.
22. 제 22 항에 있어서,
    상기 AAV는 혈청형 AAV8인, 방법.
23. 제 18 항에 있어서,
    이를 필요로 하는 상기 대상 또는 개인은 2형 당뇨병 (T2DM)을 가지는, 방법.
24. 제 18 항에 있어서,
    상기 핵산 서열은 정맥 (IV) 주사 또는 근육 내로 투여되는 것인, 방법.

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