JP2017511334A - 糖尿病に関連する心機能不全およびうっ血性心不全を処置するためのウロコルチン−２および関連遺伝子をコードするウイルスベクターの全身送達 - Google Patents

糖尿病に関連する心機能不全およびうっ血性心不全を処置するためのウロコルチン−２および関連遺伝子をコードするウイルスベクターの全身送達 Download PDF

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Abstract

代替の実施形態において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）または糖尿病に関連する心機能不全を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法であって、転写制御配列に作動的に連結された、場合により、発現ビヒクル、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、例えば、ＡＡＶ８血清型のようなベクターに含有された、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸、転写産物もしくはメッセージ、または遺伝子を提供する工程；ならびにそれを必要とする、２型糖尿病の（Ｔ２ＤＭ）などの個体または患者に、例えば、ＩＶ投与により投与する工程を含み、それによって、該個体または患者において該Ｔ２ＤＭおよび／または該糖尿病に関連する心機能不全に対して処置する、改善する、または保護する（予防する）方法が提供される。

Description

関連出願
本願は、２０１４年４月３日に出願した米国仮特許出願（ＵＳＳＮ）第６１／９７４，６６２号の優先権の利益を主張する。前記出願は、その全体がすべての目的で、明示的に本明細書中に参考として援用される。
連邦政府によって資金供与を受けた研究の下でなされた発明に対する権利についての声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）、ＤＨＨＳによって付与された助成金番号第３０６４０２（ＨＫ０６６９４１）号、同第Ｐ０１ ＨＬ６６９４１号、同第ＨＬ０８８４２６号、同第ＨＬ０８１７４１号、および同第ＨＬ１０７２００号；および同第Ｐ０１ ＨＬ０６６９４１−１１Ａ１号；ならびにＶｅｔｅｒａｎ’ｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＶＡ） Ｍｅｒｉｔ Ｇｒａｎｔｓ、第Ｉ０１ ＢＸ００１５１５号および同第１１０１ｂＢＸ０００７８３号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
技術分野
本発明は、概して、細胞および分子生物学、遺伝子療法、ならびに医学に関し、より具体的には、糖尿病に関連する心機能不全も持つ２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する個体または患者を処置する、改善するまたは保護する（予防する）ための組成物および方法に関する。
背景
２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）は、多数の薬物および他の療法があるにも関わらず、うっ血性心不全（ＣＨＦ）を有する人の３５％を含む何百万人もの患者を冒す。それは、結果として、心筋梗塞、ＣＨＦおよび脳卒中を伴う冠動脈および末梢動脈疾患の発症の主要なリスクである。持続した高血糖は、異常な心機能にも独立して関連する。最終的に、インスリンは、処置のための中心的な療法であるが、インスリン感受性を増大し、ベータ細胞機能を保存する薬物は、早期管理において極めて重要な役割を果たす。しかしながら、多くの経口Ｔ２ＤＭ薬物は、ＣＨＦを有する被験体における有害作用を有し、体重増加に関連する。
概要
代替の実施形態において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）を有する個体もしくは患者、または糖尿病に関連する心機能不全も持つ２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する個体を処置する、改善するまたは保護する（予防する）ための方法が提供され、該方法は、転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２（ＵＣｎ−２）をコードする、ウロコルチン１（ＵＣｎ−１）をコードする、および／またはウロコルチン３（ＵＣｎ−３）をコードする核酸、転写産物もしくはメッセージ、または遺伝子；あるいは転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸、転写産物もしくはメッセージ、または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物であって、前記ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスまたは等価物を提供する工程；ならびに転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージ、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物を、それを必要とする個体または患者に投与または送達する工程を含み、それによって、前記個体または患者において２型糖尿病および糖尿病に関連する心機能不全に対して処置する、改善するまたは保護する（予防する）。組成物、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ方法が提供される。
代替の実施形態において、
うっ血性心不全（ＣＨＦ）；
２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）を持つ個体または患者；および／または
２型糖尿病および糖尿病に関連する心機能不全を持つ個体または患者
を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すための方法が提供される。
代替の実施形態において、個体または患者において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）；２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）；または２型糖尿病および糖尿病に関連する心機能不全を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すための方法が提供され、該方法は、
（ａ）（ｉ）転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸もしくは遺伝子；またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物もしくはメッセージ、ならびに前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージを細胞においてもしくはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物を提供する工程；および
（ｉｉ）転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージ、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物を、前記細胞、またはそれを必要とする個体もしくは患者に投与または送達する工程を含み、
それによって、前記個体または患者においてうっ血性心不全（ＣＨＦ）；２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）；または２型糖尿病および糖尿病に関連する心機能不全を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻す、あるいはそれによって、前記個体または患者を、前記２型糖尿病および／または関連する心臓疾患（糖尿病に関連する心機能不全）に対して処置する、改善する（その進行を遅らせることを含む）、元に戻すまたは保護する（予防する）、方法；
（ｂ）前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスまたは等価物が、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター、
ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９、
アカゲザル由来ＡＡＶ、またはアカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
臓器指向性ＡＡＶ変異体、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ変異体
であるか、またはこれを含み、
場合により、前記ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作されている、ならびに
場合により、前記ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作されている、（ａ）に記載の方法；
（ｃ）前記ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結されている、（ａ）に記載の方法；
（ｄ）前記制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、前記ウロコルチン２−、ウロコルチン１−、および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結されている、（ｃ）に記載の方法；
（ｅ）転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２−、ウロコルチン１−、および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージ、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物の、それを必要とする個体または患者への投与が、結果として、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３タンパク質を血流もしくは全身循環に放出し、または前記細胞において前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３タンパク質の増加もしくは持続した発現を生じ、
場合により、前記ウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質の前記放出または増加もしくは持続した発現が、前記ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに場合により作動可能に連結された、誘導性プロモーターの活性化、またはリプレッサーの抑制解除に依存する、（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の方法；あるいは
（ｆ）前記３型糖尿病および糖尿病に関連する心機能不全が、ｉｎ ｖｉｖｏでのウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドレベルの前記増加に対して臨床上応答性であり、場合により、心収縮機能不全またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）が、処置される、改善される、好転されるまたは予防される、（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の方法
を含む。
本発明の例示的方法の代替実施形態において、
（ａ）前記転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３の核酸、転写産物もしくは遺伝子；または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物は、経口、筋肉内（ＩＭ）注射により、静脈内（ＩＶ）注射により、皮下（ＳＣ）もしくは皮内注射により、髄腔内注射により、動脈内（ＩＡ）注射により、冠動脈内注射により、吸入により、エアロゾルにより、または微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）粒子送達システムにより、または「遺伝子銃」、エアピストルもしくはＨＥＬＩＯＳ（商標）遺伝子銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用することにより、それを必要とする個体または患者に投与または送達される；あるいは
（ｂ）前記転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、転写産物もしくは遺伝子；または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物は、それを必要とする個体または患者に、血流に隣接しているもしくは血流が流れ込む体内の任意の組織または液腔への導入により、そのコードされているタンパク質を前記組織内の細胞から分泌して血流に放出することができるように投与または送達される。
代替の実施形態において、方法は、哺乳動物強心性ペプチド、成長因子、セレラキシン、リラキシン−２、脳ナトリウム利尿ペプチド、プロスタサイクリンシンターゼ、成長ホルモン、インスリン様成長因子−１、もしくはこれらの任意の組み合わせ；またはヒト強心性ペプチド、ヒト成長因子、セレラキシン、リラキシン−２、脳ナトリウム利尿ペプチド、プロスタサイクリンシンターゼ、成長ホルモン、インスリン様成長因子−１１、もしくはこれらの任意の組み合わせをコードする核酸、転写産物または遺伝子を投与するか、または共投与する工程をさらに含む。
本発明の方法の代替実施形態において、
（ａ）前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸、転写産物もしくは遺伝子の発現を誘導する刺激もしくはシグナル、または前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸、転写産物もしくは遺伝子の発現を誘導するプロモーター（例えば、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸、転写産物もしくは遺伝子に作動可能に連結されたもの）を誘導もしくは活性化する刺激もしくはシグナルを、前記個体、患者または被験体に投与する；
（ｂ）プロモーター、場合により、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子特異的プロモーター（例えば、前記ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子に作動可能に連結されたもの）のアクチベーターの合成を誘導する刺激またはシグナルを、前記個体、患者または被験体に投与する；
（ｃ）前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子のまたは前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子特異的プロモーターの天然もしくは合成アクチベーターの合成を誘導する刺激またはシグナルを、前記個体、患者または被験体に投与し、
場合により、前記天然アクチベーターは、内因性転写因子である；
（ｄ）（ｃ）に記載の方法において、前記合成アクチベーターは、内因性または外因性標的遺伝子を特異的にかつ選択的にオンにするように設計されたジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質であり、場合により、前記内因性標的が、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３核酸もしくは遺伝子である、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３核酸もしくは遺伝子のアクチベーターである、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子に作動的に連結されたプロモーターのアクチベーターである；
（ｅ）（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の方法において、前記刺激またはシグナルは、生物学的、光、化学物質または医薬刺激物またはシグナルを含む；
（ｆ）ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の転写後アクチベーター、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子に作動的に連結されたプロモーターのアクチベーター、の発現を刺激または誘導する刺激またはシグナルを、前記個体、患者または被験体に投与する；あるいは
（ｇ）ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子の転写リプレッサーまたは転写後リプレッサーを阻害するまたはその阻害を誘導する刺激またはシグナルを、前記個体、患者または被験体に投与する。
本発明の方法の代替実施形態において、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導する、または前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子に作動的に連結された制御性もしくは誘導性プロモーターの発現を誘導する、前記化学物質または医薬は、経口抗生物質、ドキシサイクリンまたはラパマイシンである；あるいはドキシサイクリンを使用するｔｅｔ−制御システムを、前記ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子またはそれらの等価物の発現を誘導するために使用する。
本発明の方法の代替実施形態において、前記ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物は、液体、ゲル、ヒドロゲル、粉末または水性製剤中に製剤化される。
本発明の方法の代替実施形態において、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物、または前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドは、小胞、リポソーム、ナノ粒子もしくはナノ脂質粒子（ｎａｎｏｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＮＬＰ）もしくは等価物中で製剤化されるか、または小胞、リポソーム、ナノ粒子もしくはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）もしくは等価物を使用する送達のために製剤化される。
本発明の方法の代替実施形態において、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物は、単離もしくは培養された細胞中で製剤化され、または単離もしくは培養された細胞に挿入もしくはトランスフェクトされ、および場合により、前記細胞は、哺乳動物細胞、心臓細胞、またはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞である。
本発明の方法の代替実施形態において、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸、転写産物もしくは遺伝子または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物、または前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドは、医薬または滅菌製剤として製剤化される。
本発明の方法の代替実施形態において、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物、または前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドは、製品、人工臓器もしくインプラントとともに製剤化もしくは送達されるか、または製品、人工臓器もしくインプラント上で製剤化もしくは送達されるか、または製品、人工臓器もしくインプラントと組み合わせて製剤化もしくは送達される。
本発明の方法の代替実施形態において、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ポリペプチドを発現する。
代替の実施形態において、本発明の方法を実施する工程を含む、２型糖尿病に関連する、心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患；機能不全もしくはアポトーシス；および／または肺高血圧を処置する、改善するまたは保護する（予防する）ための方法が提供される。
代替の実施形態において、患者または個体において２型糖尿病または前糖尿病を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法が提供され、この方法は、
（ａ）本発明の方法を実施する工程；および
（ｂ）ウロコルチン２（ＵＣｎ−２）および／もしくはウロコルチン３（ＵＣｎ−３）ペプチドもしくはポリペプチド、またはウロコルチン２（ＵＣｎ−２）および／もしくはウロコルチン３（ＵＣｎ−３）をコードする核酸、遺伝子、メッセージまたは転写産物を、それを必要とする個体または患者に投与する工程を含み、
場合により、該ウロコルチン２（ＵＣｎ−２）および／またはウロコルチン３（ＵＣｎ−３）ペプチドまたはポリペプチドが、単離された、組み換え、合成および／またはペプチドミメティックのペプチドもしくはポリペプチド、またはそのバリアントであり、
それによって、該患者または個体において該糖尿病または前糖尿病を処置する、改善するまたは保護する（予防する）。
代替の実施形態において、
個体または患者において２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患、機能不全もしくはアポトーシス；肺高血圧；心臓、皮膚、肝臓、肺、筋肉、神経、脳もしくは腎臓の疾患；または血友病もしくは血友病Ｂを処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
患者または個体において糖尿病または前糖尿病を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、あるいは
患者または個体において肥満を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、
のための医薬の製造における、あるいは
それらのことであるか、あるいはそれを含む使用における、
− 転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；
− ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは
− ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物
の使用であって、
場合により、該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター、
ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、
アカゲザル由来ＡＡＶ、または該アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
臓器指向性ＡＡＶ、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ
であるか、あるいはそれを含み、
場合により、該ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作される、ならびに、
場合により、該ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される、
場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結される；
場合により、該制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結される、使用が提供される。
代替の実施形態において、
転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；
ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは、
ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物
を、被験体の細胞に、またはそれを必要とする被験体に、提供することおよび投与することまたは送達することを含む、
個体または患者において２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患、機能不全もしくはアポトーシス；肺高血圧；心臓、皮膚、肝臓、肺、筋肉、神経、脳もしくは腎臓の疾患；または血友病もしくは血友病Ｂを処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
患者または個体において糖尿病または前糖尿病を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、または
患者または個体において肥満を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること
のための医薬の製造における使用のための、あるいは、
それらのことにおける使用のための、
転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；あるいは、
ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは、
ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が提供され、
場合により、該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター、
ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、
アカゲザル由来ＡＡＶ、または該アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
臓器指向性ＡＡＶ、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ
であるか、またはそれを含み、
場合により、該ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作される、ならびに、
場合により、該ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される、
場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結される；
場合により、該制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結される。
代替の実施形態において、それを必要とする被験体または個体においてうっ血性心不全（ＣＨＦ）またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）の症状を処置する、改善する、または保護する（予防する）方法が提供され、該方法は、
（ａ）それを必要とする被験体または個体にウロコルチン２ポリペプチドをコードする核酸配列を送達する工程を含み、
それによって、それを必要とする該被験体または個体においてうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置するまたは改善する、方法；
（ｂ）該核酸配列がベクター中にある（例えば、ベクターに含有される）、（ａ）に記載の方法；
（ｃ）該ベクターがウイルスベクターである、（ｂ）に記載の方法；
（ｄ）該ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、（ｃ）に記載の方法；
（ｅ）該ＡＡＶが血清型ＡＡＶ８である、（ｄ）に記載の方法；
（ｆ）それを必要とする該被験体または個体が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する、（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の方法；あるいは
（ｇ）該核酸配列が静脈注射（ＩＶ）によりまたは筋肉内に投与される、（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載の方法
を含む。
本発明の１つまたは複数の実施形態についての詳細を、添付の図面および下の説明の中で示す。本発明の他の特徴、目的および利点は、その説明およびそれらの図面から、ならびに本請求項から明らかになる。
本明細書において引用するすべての出版物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に明示的に援用されている。
図１は、マウスにおけるＡＡＶ８．ＵＣｎ２の単回のＩＶ注射が、結果として、（少なくとも７カ月間持続する１）血漿ＵＣｎ２レベルの１５倍の増加を生じること、ならびにａ）２型糖尿病マウス（Ｔ２ＤＭ）の２つのモデルにおいて増大したインスリン感受性によってグルコース利用を正規化すること（図１Ａ）、およびｂ）不全心臓の機能を増大させること（図１Ｂ）を実証するデータを例証するものであり、図１Ａは、正常マウスにＡＡＶ８．ＵＣｎ２、ＩＶ、用量５×１０１１ｇｃ、または陰性対照として食塩水を受けさせ、標準的固形飼料を３週（ｗ）間、次に高脂肪食餌を８週間給餌したとき、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２を投与された動物において、グルコースレベル（「予防」、「回復」、および「糖耐性試験」）；血漿インスリン；ならびに恒常性モデル評価（homeostasis model assessment）（ＨＯＭＡ−ＩＲ）または「インスリン抵抗性」が好転されたことを実証するデータをグラフで例証するものであり、図１Ｂは、ＭＩにより誘発されたＣＨＦの１０週（ｗ）間後のマウスからのデータをグラフで例証するものであり、ＡＡＶ．ＵＣｎ２（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）（対食塩水、「ＣＨＦ」カラム）が、ＣＨＦの誘発の５週間後に送達され、ＡＡＶ．ＵＣｎ２を投与された動物が、心室収縮性評価（ｄＰ／ｄｔ）により測定された左心室（ＬＶ）の全体的な収縮性における好転を示し、これは下の実施例１において詳細に考察される。 図１は、マウスにおけるＡＡＶ８．ＵＣｎ２の単回のＩＶ注射が、結果として、（少なくとも７カ月間持続する１）血漿ＵＣｎ２レベルの１５倍の増加を生じること、ならびにａ）２型糖尿病マウス（Ｔ２ＤＭ）の２つのモデルにおいて増大したインスリン感受性によってグルコース利用を正規化すること（図１Ａ）、およびｂ）不全心臓の機能を増大させること（図１Ｂ）を実証するデータを例証するものであり、図１Ａは、正常マウスにＡＡＶ８．ＵＣｎ２、ＩＶ、用量５×１０１１ｇｃ、または陰性対照として食塩水を受けさせ、標準的固形飼料を３週（ｗ）間、次に高脂肪食餌を８週間給餌したとき、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２を投与された動物において、グルコースレベル（「予防」、「回復」、および「糖耐性試験」）；血漿インスリン；ならびに恒常性モデル評価（homeostasis model assessment）（ＨＯＭＡ−ＩＲ）または「インスリン抵抗性」が好転されたことを実証するデータをグラフで例証するものであり、図１Ｂは、ＭＩにより誘発されたＣＨＦの１０週（ｗ）間後のマウスからのデータをグラフで例証するものであり、ＡＡＶ．ＵＣｎ２（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）（対食塩水、「ＣＨＦ」カラム）が、ＣＨＦの誘発の５週間後に送達され、ＡＡＶ．ＵＣｎ２を投与された動物が、心室収縮性評価（ｄＰ／ｄｔ）により測定された左心室（ＬＶ）の全体的な収縮性における好転を示し、これは下の実施例１において詳細に考察される。 図２は、Ｔ２ＤＭおよびＬＶ機能不全の状況でＵＣｎ２発現の活性化後のＡＡＶ８．ＵＣｎ２−Ｒｅｇの効力を測定するプロトコルを模式的に例証するものであり、これは下の実施例１において詳細に考察される。 図３は、ウロコルチン−２の有益な心血管作用を示す表を例証するものである。 図４は、ウロコルチン−２（ＵＣｎ２）が、どのように２型コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）受容体と相互作用するかを模式的に例証ものである。 図５Ａ上部パネルは、本発明の例示的ＡＡＶ８ベクター、制御されていない発現ベクターのベクターマップを模式的に例証するものであり、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターは肝臓におけるメチル化を回避し、下部パネルは、血漿ＵＣｎ２が、ＡＡＶ８．ＣＢＡ．ＵＣｎ２の単回のＩＶ注射の６週（ｗ）間後に１５倍超増加したこと、ならびに肝臓およびＬＶの発現が増加したことを示すデータをグラフで例証するものであり、図５Ｂは、最適化された制御された発現系のための本発明の例示的ＡＡＶ８制御された発現ベクターを模式的に例証するものであり、これらの例示的ＡＡＶ８ベクターは、テトラサイクリン制御（マップＡ）、またはラパマイシン制御（マップＢ）下で制御された発現のマウスＵＣｎ２をコードする。 図６は、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後の正常マウスにおけるＬＶ機能のデータをグラフで例証するものであり、単離された心臓における増大した収縮および拡張機能は、遺伝子導入後の自己分泌ＵＣｎ２効果を実証した。 図７は、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後の正常マウスにおけるＬＶカルシウム（Ｃａ＋２）ハンドリングのデータをグラフで例証するものであり、図７Ａは、陰性対照と比較した、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後のＳＥＲＣ２ａレベルをグラフで例証するものであり、図７Ｂは、陰性対照と比較した、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後のＰ１６ホスホランバン（ＰＬＢ）レベルの増加を示す免疫ブロッティングデータを模式的に例証するものであり、図７Ｃは、陰性対照と比較した、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後の経時的な（秒での）ｉｎｄｏ−１比（ｉｎｄｏ−１蛍光比）（ｉｎｄｏ−１は細胞内カルシウム濃度の正確な測定のための蛍光Ｃａ＋＋指標である）を示すデータをグラフで例証するものであり、図７Ｄは、陰性対照と比較した、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後のＣａ２＋減衰（ｔ１／２、Ｔａｕ）への時間を示すデータをグラフで例証するものである。 図８は、左の模式図における研究プロトコル、および右のグラフにおける、ＬＶ ｄＰ／ｄｔを測定する、陰性対照と比較した、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後のＬＶ機能の増大を含む、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後の不全心臓における機能の増大を示すデータを例証するものである。 図９は、上部の模式図における、使用された例示的ＡＡＶ８遺伝子導入ベクター、および下部のグラフにおける、空腹時グルコースおよび用量応答性グルコース（ここで、グルコースは遺伝子導入の３〜４週間後に評価された）を含む、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後の血液グルコースに対する効果を示すデータを例証するものである。 図１０は、２型糖尿病マウス（Ｔ２ＤＭ）における空腹時グルコースの効果をグラフで例証するものであり、これは、グルコースレベル（「予防」および「回復」）、糖耐性試験データ、高脂肪食餌（ＨＦＤ）マウス、ならびに投与前および投与後マウスにおける血漿インスリン、ならびに恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を含む、ＨＦＤを給餌したＴ２ＤＭマウスにおけるＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後の空腹時グルコースに対する効果を示し、ここで、正常マウスには、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２ベクター（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）または陰性対照として食塩水を受けさせ、そして標準的固形飼料を３週間、次に、ＨＦＤ食餌を８週間給餌した。 図１１は、グルコースレベルを示す左のグラフ、および曲線下面積（ＡＵＣ）を示す右のグラフを伴い、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後の２型糖尿病マウス（Ｔ２ＤＭ）におけるグルコース利用の効果をグラフで例証するものであり、ここで、ｄｂ／ｄｂマウスは、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２ベクター（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）または陰性対照として食塩水を受け、この研究は遺伝子導入後６週間行われた。 図１２は、ＩＶ ＵＣｎ２遺伝子導入後培養された骨格筋細胞におけるグルコース利用の効果をグラフで例証するものであり、ここで、２００ｎＭインスリン、ＵＣｎ２ペプチド、または両方（Ｉ＋Ｕ）を添加し、細胞を６０分間インキュベートし、グルコース取り込みを測定した。 図１３は、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２、ＩＶ、用量５×１０１１ｇｃ、または陰性対照として食塩水を受ける前の、および受けてから（４〜８週）後のマウスにおけるグルコース利用を実証するデータをグラフで例証するものであり、グラフは、グルコースレベル（「予防」、「回復」および「糖耐性試験」）；血漿インスリン；ならびに恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）、または「インスリン抵抗性」を示す。 図１４Ａは、例示的ＡＡＶ８．ＣＢＡ．ＵＣｎ２ベクターマップを模式的に例証するものであり、図１４Ｂは、ベクターの静脈内投与についての実験プロトコルを模式的に例証するものであり、これは下の実施例２において詳細に記載される。 図１５は、ｉｎ ｖｉｖｏのＬＶ機能を示すデータをグラフで例証するものであり、図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＬＶ圧発生の速度（ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ；Ａ）および減衰の速度（ＬＶ−ｄＰ／ｄｔ；Ｂ）を測定するために行われたｉｎ ｖｉｖｏ研究からのデータをグラフで例証するものである。ＡＡＶ８．ＵＣｎ２は、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔおよびＬＶ−ｄＰ／ｄｔを遺伝子導入の５週間後に増加させ、図１５Ｃおよび図１５Ｄは、心拍数がより大きくなる傾向にあること（Ｄ）、およびＬＶに発生した圧力は、ＵＣｎ２遺伝子導入により増加すること（Ｃ）を示すデータをグラフで例証するものであり、これは下の実施例２において詳細に記載される。 図１６は、ＩＶ、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２（ＨＦ＋ＵＣｎ２）またはＩＶ、食塩水後の心不全（ＨＦ）を有するマウス由来の心筋細胞におけるサイトゾルのＣａ２＋トランジェントを示し、図１６Ａおよび図１６Ｂは、放出された基底Ｃａ２＋（収縮期−拡張期Ｃａ２＋）が、ＨＦ＋ＵＣｎ２マウス由来の心筋細胞において増加した（ｐ＝０．０００１）ことをグラフで例証するものであり、ここで、図１６Ａは、ＵＣｎ２遺伝子導入の５週間後に、心不全を有するマウスから単離した心筋細胞におけるＣａ２＋ピークの増加を示したそれぞれの群における１つの心臓からの代表的なＩｎｄｏ−１Ｃａ２＋トランジェントの記録であり、図１６Ｂは、１つの群当たり３匹のマウスからのデータをグラフで概説し、図１６Ｃおよび図１６Ｄにおいて、Ｃａ２＋減衰（ｔ１／２、Ｔａｕ）への時間が、ＵＣｎ２遺伝子導入の５週間後に、心不全を有するマウス由来の心筋細胞において短縮されたことをグラフで例証するものであり、図１６Ｃは、それぞれの群における１つの心臓由来の心筋細胞からの代表的な正規化されたＣａ２＋トランジェントであり、図１６Ｄは、１つの群当たり３匹のマウスからの概略データが示されることをグラフで例証するものであり、図１６Ｅ（上部のパネル）について、免疫ブロッティングデータ（下部のパネル）を例証するものであり、これは、ＵＣｎ２遺伝子導入が、正常マウスおよび心不全を有するマウス由来のＬＶにおいてＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を増加させたことを示し、これは下の実施例２において詳細に記載される。 図１７は、心筋細胞ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル伝達を例証するものであり、ＬＶ試料（図１７Ａ、図１７Ｃ、図１７Ｄ）、または心筋細胞（図１７Ｂ）は、心不全（ＨＦ）を有するマウス、およびＡＡＶ８．ＵＣｎ２（ＵＣｎ２）を受けたＨＦを有するマウスから得、図１７Ａは、ｃＡＭＰ産生をグラフで例証するものであり、図１７Ｂは、ＰＫＡ活性を示す免疫ブロットを例証するものであり、図１７Ｃは、ＣａｍＫ ＩＩ発現およびリン酸化をグラフで例証するものであり、ここで、ＵＣｎ２遺伝子導入は、ＣａｍＫ ＩＩのＴｈｒ２８６リン酸化の低減と関連し（左のパネル、ＧＡＰＤＨに対して正規化）、図１７Ｄは、心臓型ミオシン軽鎖キナーゼをグラフで例証するものであり、ここで、ＵＣｎ２遺伝子導入は、心臓型ミオシン軽鎖キナーゼ（ｃＭＬＣＫ）タンパク質の増加と関連し（左のパネル、ＧＡＰＤＨに対して正規化）、これは下の実施例２において詳細に記載される。 これらの様々な図面において、同様の参照記号は、同様の要素を示す。
詳細な説明
代替の実施形態において、２型糖尿病を有する被験体においてグルコース利用および心臓機能を好転させる、または２型糖尿病を有する被験体において機能障害性グルコース利用および心臓機能の発症もしくは出現を予防するための組成物ならびに方法が提供される。代替の実施形態において、ウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）および／またはウロコルチン−３（ＵＣｎ−３）の送達および制御された発現を可能にする、ベクターのような、ウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）および／またはウロコルチン−３（ＵＣｎ−３）を発現する核酸を含む組成物が提供され、結果として、２型糖尿病を有する被験体においてグルコース利用および心臓機能に対する有益な効果を有することができるペプチドを血流に放出する。代替の実施形態において、糖尿病に関連する心機能不全を持つ糖尿病を有する患者のサブセットに対して標的化された組成物および方法が提供される。代替の実施形態において、２型糖尿病および関連する心機能不全を有する患者において正常血糖を回復させ、心機能を好転させるための、かかる患者の処置のための組成物および方法が提供される。代替の実施形態において、例えば、ウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）および／またはウロコルチン−３（ＵＣｎ−３）をコードする核酸を含む、遺伝子療法ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター８型（ＡＡＶ８）の１回静脈内（ＩＶ）注射を使用して、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）の発症または出現を処置する、改善する、元に戻すまたは予防するための組成物および方法が提供される。
代替の実施形態において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）を有するそれらのＴ２ＤＭ患者の３５％を含む、Ｔ２ＤＭ患者において実施される方法が提供される。代替の実施形態において、冠動脈および末梢動脈疾患、心筋梗塞、ＣＨＦおよび／または脳卒中を発症するＴ２ＤＭ患者のリスクを低減するために実施される方法が提供される。代替の実施形態において、異常な心機能にも独立して関連する、持続した高血糖を処置するおよび／または改善するために実施される方法が提供される。代替の実施形態において、インスリン感受性を増大させ、ベータ細胞機能を保存するために実施される方法が提供され、したがって、代替の実施形態において、本発明は、Ｔ２ＤＭの早期管理において中心的な役割を果たす。
代替の実施形態において、遺伝子を発現する、発現ビヒクル、例えば、ベクターは、来院中、筋肉内注射（「ショット」の様な）により、または静脈注射により送達することができ、それによって、心臓自体における遺伝子発現が必要とされるときに遭遇する問題を回避する。血流中の所望のタンパク質の持続した分泌は、身体における非常に短い半減期を示す多くのタンパク質にとって特に問題であり得る、注入によるタンパク質の投与の困難および損失を回避する。代替の実施形態において、ウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）および／またはウロコルチン−３（ＵＣｎ−３）を発現する核酸の制御された発現が提供され、遺伝子発現を容易かつ効率的にオンにし、オフにすることができ、目的に合わせた処置を提供し、最適な安全性を保証する。
代替の実施形態において、糖尿病に関連する心機能不全を処置する、その進行を遅らせる、改善するおよび／または予防するための遺伝子導入組成物ならびに方法が提供される。代替の実施形態において、糖尿病のための標準的医学療法（通常、経口血糖降下剤およびインスリンを含む３種またはそれ超の薬物）および／または心不全のための標準的療法（通常、４種またはそれ超の薬物）と共にあるいはそれの代わりに使用することができる組成物および方法が提供される。代替の実施形態において、心機能不全を有する糖尿病の被験体において有害作用を有し得る、経口血糖降下剤と共にまたはそれの代わりに使用することができる組成物および方法が提供される。代替の実施形態において、本発明の実施は、患者が必要とする医薬の数を低減し、それによって、コストおよび副作用を低減する。代替の実施形態において、本発明の実施は、糖尿病において膵ベータ細胞機能を保存することができ、それによって、インスリンの必要を未然に防ぐ。
例示的適用において、本発明は、ウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）および／またはウロコルチン−３（ＵＣｎ−３）ペプチドの調節された発現をもたらす制御された発現系を利用する。例えば、長期ウイルス発現ベクターは、診察室において全身静脈に（または筋肉内注射により）注入することができる。４週間後、被験体は、経口抗生物質（ドキシサイクリンまたはラパマイシン）を１日１回（またはそれほど頻繁ではなく）嚥下し、それが、遺伝子の発現を活性化する。遺伝子が合成され、被験体の血液に放出され、続いて、糖尿病に関連する心機能不全を有する患者においてグルコース利用および心機能の利益を得る好ましい生理学的効果を有する。医師または被験体が処置の中止を所望するとき、被験体は、活性化する抗生物質の摂取を単に止める。
本発明の実施形態の効力を実証するために、本発明者らは、ウロコルチン−２をコードするＡＡＶベクターを使用し、静脈内送達を使用してベクターを、ＣＨＦを有するマウスに投与した。結果は、１）ベクターの静脈内送達の４〜６週間後の導入遺伝子の血清レベルの増加；２）心臓の収縮性機能（収縮期機能）に対する明白な好ましい効果；および３）心臓の弛緩（拡張期機能）に対する明白な好ましい効果を示した。さらなる研究において、本発明の実施形態の効力を実証するために、本発明者らは、２型糖尿病のげっ歯類モデルにおいてＵＣｎ２のＩＶ送達の有用性を示した。
代替の実施形態において、本発明の方法を実施するためのウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現のための発現ビヒクル、ベクター、および組換えウイルスなどが提供される。代替の実施形態において、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子を発現する発現ビヒクル、ベクター、および組換えウイルスなどが、例えば、外来として、例えば、来院中、筋肉内（ＩＭ）注射により、静脈内（ＩＶ）注射により、皮下注射により、吸入により、および微粒子銃粒子送達システム（biolistic particle delivery system）（例えば、いわゆる「遺伝子ガン」）などにより送達することができる。
代替の実施形態において、例えば、ＩＭまたはＩＶ注射された、発現ビヒクル、ベクター、および組換えウイルスなどを送達するこの「末梢」送達モードは、遺伝子または核酸が、臓器において、例えば、肝臓、骨格筋、肺、または腎臓の細胞または組織において直接発現されるときに遭遇する問題を回避することができる。血流または全身循環における所望のウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質（単数または複数）の持続分泌は、注入によりタンパク質を投与することの困難および損失も回避する。
代替の実施形態において、目的に合わせた処置および最適な安全性の保証のため、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子の発現を容易にかつ効率的にオンにするおよびオフにすることができる方法が提供される。
代替の実施形態において、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質、あるいはウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３を発現する核酸（単数または複数）または遺伝子（単数または複数）により発現されるタンパク質は、組織または臓器、例えば、心臓、血管、肺、腎臓、または他の標的に対する有益なまたは好ましい効果（例えば、治療的または予防的）を有し、それらの部位または作用部位から遠位の（例えば、解剖学的に遠隔の）血中または全身循環に分泌されるけれども、例えば、代替の実施形態において、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質は、肺、腎臓、肝臓または骨格筋組織において発現され、遠隔の組織、例えば、心臓または血管に対して有益な効果を有する。
例示的実施形態では、例えばうっ血性心不全（ＣＨＦ）または肺高血圧を処置するための方法を含むがこれらに限定されない本発明の方法を実施するために、ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン−２をコードするウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子を使用するが、他のウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子：ウロコルチン−１およびウロコルチン−３、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＣＨＦのために）、プロスタサイクリンシンターゼ（肺高血圧のために）、成長ホルモンおよび／もしくはインスリン様成長因子−１、またはこれらの任意の組み合わせ、を使用してもよい。
代替実施形態において、心臓または肺疾患、例えば、うっ血性心不全（ＣＨＦ）または肺高血圧を処置するためのウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３型遺伝子の被調節発現を提供する、制御性発現システムへの適用ならびに該発現システムのための組成物および方法が提供される。
例えば、代替実施形態において、組換えウイルス（例えば、長期ウイルスもしくはウイルスベクター）、またはベクター、または発現ベクター、およびこれらに類するものを、例えば、体静脈に（例えば、ＩＶ）、または筋肉内（ＩＭ）注射により、吸入により、または微粒子銃粒子送達システム（例えば、いわゆる「遺伝子銃」）により、例えば、外来患者として、例えば医院で注射することができる。代替実施形態では、数日または数週間後（例えば、４週間後）、その個体、患者または被験体は、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子の発現を誘導する化学物質または医薬を投与される（例えば、吸入する、注射される、または嚥下する）；例えば、経口抗生物質（例えば、ドキシサイクリンまたはラパマイシン）が１日１回（またはより高もしくは低頻度）投与され、これは、前記遺伝子の発現を活性化することになる。代替実施形態では、前記核酸または遺伝子の発現の（例えば、誘導性プロモーターによる）「活性化」または誘導後、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質が合成され、前記被験体の循環に（例えば、血液中に）放出され、そしてその後、発現されるウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質（単数または複数）に依存してその個体または患者に恩恵をもたらす（例えば、心臓、腎臓または肺機能に恩恵をもたらす）好適な生理効果、例えば、治療または予防効果を及ぼす。医師または被験体が処置の中止を望む場合、その被験体は、前記活性化化学物質または医薬、例えば抗生物質の摂取をやめる。
本発明者らは、ウロコルチン−２をコードするＡＡＶベクターを使用し、静脈内送達を用いてこのベクターをマウスに投与した。結果は、１）前記ベクターの静脈内送達の４〜６週間後、導入遺伝子の血清レベルの１７倍増大；２）心収縮機能（収縮機能）に対する好ましい顕著な効果；および３）心臓弛緩（拡張機能）に対する好ましい顕著な効果を示した。
代替の実施形態において、重篤な低駆出率心不全の処置；肺高血圧の処置；保存された駆出率を有する心不全の処置；糖尿病と関連する肺高血圧および心不全の処置のための入院および血管作用性ペプチドの持続した静脈内注入を必要とする現在の療法の置き換え；ならびに、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３型遺伝子の調節された発現を使用して、身体の遠位での好ましい効果が促進され得る、他の状態の処置を含む、２型糖尿病を有する被験体において心臓機能の処置および好転を含む適用が提供される。
核酸の生成および操作
代替の実施形態において、例示的本発明の方法を実施するために、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする単離された、合成および／または組み換え核酸または遺伝子が提供される。代替の実施形態において、本発明の方法を実施するために、例えば、ベクターまたは組換えウイルスにおける、ｉｎ ｖｉｖｏ発現のための、発現ビヒクル中に（例えば、スプライシングされた）組み換え形態のウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子が提供される。他の代替の実施形態において、例えば、所望のウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３遺伝子の発現を阻害する遺伝子またはメッセージ（ｍＲＮＡ）の発現を阻害することができる、阻害核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム）をコードする単離された、合成および／または組み換え核酸が提供される。
代替実施形態では、本発明の核酸を、例えば、ｃＤＮＡライブラリーのクローニングおよび発現、メッセージまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲによる増幅、ならびにこれらに類するものによって、作製、単離および／または操作する。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッドをはじめとする、本発明を実施するために使用する核酸および遺伝子を、様々な源から単離し、遺伝子操作し、増幅させ、および／または組換え発現／生成することができる。これらの核酸から生成される組換えポリペプチド（例えば、本発明を実施するために使用するウロコルチン２および／またはウロコルチン３キメラタンパク質）を個々に単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。例えば、ウイルス（例えば、ＡＡＶ構築物もしくはハイブリッド）細菌、真菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現システムまたは発現ビヒクルをはじめとする、任意の組換え発現システムまたは遺伝子療法送達ビヒクルを使用することができる。
あるいは、本発明を実施するために使用する核酸を、例えば、Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているような周知の化学合成法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。
本発明を実施するために使用する核酸の操作法、例えば、サブクローニング、標識プローブ（例えば、クレノウポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いる、ランダム・プライマー標識）、シークエンシング、ハイブリダイゼーションおよびこれらに類するものなどは、科学および特許文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）；ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＰＲＯＢＥＳ、第Ｉ部．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたし。
本発明の方法を実施するために使用する核酸を得るおよび操作するための別の有用な手段は、ゲノム試料からのクローニング、ならびに所望される場合には、例えばゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンから単離または増幅された挿入物のスクリーニングおよび再クローニングである。本発明の方法において使用する核酸の源としては、例えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）、例えば米国特許第５，７２１，１１８号、同第６，０２５，１５５号参照；ヒト人工染色体、例えばＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３３３−３３５参照；酵母人工染色体（ＹＡＣ）；細菌人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１人工染色体、例えばＷｏｏｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５０：３０６−３１６参照；Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣ）、例えばＫｅｒｎ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１２０−１２４参照；コスミド、組換えウイルス、ファージまたはプラスミド、に含有されるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
代替の実施形態において、本発明の方法を実施するために、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３融合タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸が使用される。
代替実施形態において、本発明を実施するために使用するタンパク質に接合または融合させる異種ペプチドまたはポリペプチドは、所望の特性、例えば蛍光検出、安定性の増大および／または単純化された精製、を付与するＮ末端識別ペプチドであり得る。本発明を実施するために使用するペプチドおよびポリペプチドを、例えば、より免疫原性の高いペプチドを生産するために、組換え合成ペプチドをより容易に単離するために、抗体および抗体を発現するＢ細胞を同定および単離するために、ならびにこれらに類することのために、１つまたは複数の追加のドメインが連結されている融合タンパク質として合成することおよび発現させることもできる。検出および精製助長ドメインとしては、例えば、固定化金属での精製を可能にする金属キレート形成性ペプチド、例えばポリヒスチジントラクトおよびヒスチジン−トリプトファンモジュール；固定化免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン；ならびにＦＬＡＧ延長部／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ、ワシントン州シアトル）において利用されるドメインが挙げられる。精製を助長するために精製ドメインとペプチドまたはポリペプチドを含むモチーフとの間に切断可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）を含めること。例えば、発現ベクターは、エピトープをコードする核酸配列であって、チオレドキシンおよびエンテロキナーゼ切断部位が後に続く６つのヒスチジン残基に連結している核酸配列を含む場合がある（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１７８７−１７９７；Ｄｏｂｅｌｉ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：４０４−４１４を参照されたし）。前記ヒスチジン残基は、検出および精製を助長し、その一方で前記エンテロキナーゼ切断部位は、その融合タンパク質の残部からエピトープを精製する手段を与える。融合タンパク質をコードするベクターに関係する技術および融合タンパク質の応用は、科学および特許文献において十分に説明されている。例えば、Ｋｒｏｌｌ（１９９３）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２：４４１−５３を参照されたし。
本発明を実施するために使用する核酸または核酸配列は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはこれらのいずれかの断片；一本鎖であってもよく、もしくは二本鎖であってもよく、およびセンス鎖を表すこともあり、もしくはアンチセンス鎖を表すこともある、ゲノムもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ；ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＰＮＡ）；または起源が天然もしくは合成の任意のＤＮＡ様もしくはＲＮＡ様材料であり得る。本発明を実施するために使用する化合物は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらのいずれかの任意の断片を含む「核酸」または「核酸配列」を含み；および一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよいゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉＲＮＡ）を含み；およびセンス鎖であることもありもしくはアンチセンス鎖であることもあり、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であることもあり、または例えばｉＲＮＡ、リボヌクレオタンパク質（例えば、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ、例えばｉＲＮＰ）をはじめとする起源が天然もしくは合成の任意のＤＮＡ様もしくはＲＮＡ様材料であることもある。本発明を実施するために使用する化合物は、天然ヌクレオチドの公知類似体を含有する核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを含む。本発明を実施するために使用する化合物は、合成主鎖を有する核酸様構造を含む。例えば、Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２−８６９８；Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：１５３−１５６を参照されたし。本発明を実施するために使用する化合物は、化学合成することができる一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２本の相補ポリデオキシヌクレオチド鎖を含む「オリゴヌクレオチド」を含む。本発明を実施するために使用する化合物は、５’ホスフェートを有さない合成オリゴヌクレオチドを含み、したがって、キナーゼの存在下でホスフェートとＡＴＰの付加がなく別のヌクレオチドにライゲートしない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片にライゲートすることができる。
代替態様において、本発明を実施するために使用する化合物は、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３の生産に関与する遺伝子、または任意のＤＮＡセグメントを含み；それは、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレイラー）はもちろん、該当する場合は、個々のコードセグメント（エキソン）間に介在配列（イントロン）も含むことがある。「作動可能に連結された」は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指すことができる。代替態様において、それは、転写制御配列と転写される配列の機能的関係を指すことができる。例えば、プロモーターは、本発明を実施するために使用する核酸などのコード配列に、それが、適切な宿主細胞または他の発現システムにおける該コード配列の転写を刺激または修飾（modulate）する場合、作動可能に連結され得る。代替態様において、プロモーター転写制御配列は、転写される配列に、それらがその転写される配列に物理的に隣接し得る場合、すなわち、それらがｃｉｓ作用性であることができる場合、作動可能に連結され得る。代替実施形態において、転写制御配列、例えばエンハンサーは、その転写をそれらが増進させるコード配列に物理的に隣接している必要はなく、極めて近接した位置にある必要もない。
代替態様において、本発明は、本発明を実施するために使用するヌクレオチド配列を含む「発現カセット」であって、かかる配列と適合性の宿主における核酸、例えば構造遺伝子または転写産物（例えば、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質をコードするもの）の発現に影響を及ぼすことが可能であり得る「発現カセット」の使用を含む。発現カセットは、ポリペプチドコード配列または阻害配列と、および１つの態様では他の配列、例えば転写終結シグナルと、動作可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含むことができる。発現を果たすのに必要なまたは役立つ追加の因子、例えばエンハンサーも使用してもよい。
代替態様において、本発明を実施するために使用する発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え型「裸のＤＮＡ」ベクター、およびこれらに類するものも含む。代替態様において、本発明を実施するために使用する「ベクター」は、細胞を感染させること、トランスフェクトすること、一過的にまたは永久に形質導入することができる、核酸を含むことができる。代替態様において本発明を実施するために使用するベクターは、裸の核酸である場合があり、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸である場合がある。代替態様において、本発明を実施するために使用するベクターは、ウイルスもしくは細菌核酸および／もしくはタンパク質、ならびに／または膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含むことができる。代替態様において、本発明を実施するために使用するベクターは、レプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を、これらに限定されないが、含むことができ、該レプリコンにＤＮＡの断片が結合され、複製されることになり得る。したがって、ベクターは、ＲＮＡ、自律自己複製性環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルス、およびこれらに類するもの、例えば米国特許第５，２１７，８７９号参照）を、これらに限定されないが、含み、および発現プラスミドと非発現プラスミドの両方を含むことができる。代替態様において、本発明を実施するために使用するベクターは、細胞により有糸分裂中に自律構造として安定して複製されることがあり、または宿主のゲノム内に組み込まれることがある。
代替態様において、本発明を実施するために使用する「プロモーター」は、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば心臓、肺、筋肉、神経または脳細胞においてコード配列の転写を駆動することが可能なすべての配列を含む。したがって、本発明の構築物において使用するプロモーターは、遺伝子の転写のタイミングおよび／または速度の制御または修飾に関与するｃｉｓ作用性転写調節エレメントおよび制御配列を含む。例えば、本発明を実施するために使用するプロモーターは、転写制御に関与する、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組込配列、５’および３’非翻訳領域またはイントロン配列をはじめとする、ｃｉｓ作用性転写調節エレメントであり得る。これらのｃｉｓ作用性配列は、典型的に、タンパク質または他の生体分子と相互作用して転写を行う（オン／オフにする、制御する、修飾するなど）。
代替実施形態において、本発明を実施するために使用する「構成的」プロモーターは、発生および細胞分化の大部分の環境条件および状況下で発現を継続的に駆動するものであり得る。代替実施形態において、本発明を実施するために使用する「誘導性」または「制御性」プロモーターは、環境条件、投与された化学薬剤または発生条件の影響下で本発明の核酸の発現を誘導することができる。
遺伝子療法および遺伝子送達ビヒクル
代替実施形態において、本発明の方法は、ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物もしくはメッセージ、のペイロードを細胞（単数または複数）にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで送達するための、例えば遺伝子療法送達ビヒクルとしての、核酸（例えば、遺伝子またはポリペプチドをコードする核酸）送達システムの使用を含む。
代替実施形態において、本発明の方法を実施するために使用する発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスまたは等価物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクターもしくはアデノウイルスベクター；ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９；アカゲザル由来ＡＡＶ、もしくはアカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２；臓器指向性ＡＡＶ；および／またはＡＡＶカプシド変異体もしくはＡＡＶハイブリッド血清型である、またはこれらを含む。代替実施形態において、前記ＡＡＶは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるようにおよび／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を改善させるように操作される。代替実施形態において、前記ハイブリッドＡＡＶは、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１つまたは複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される。野生型（ｗｔ）ウイルスを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるようにおよび対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を改善させるようにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を操作する方法は、当該技術分野において周知である；例えば、Ｗｕら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００６年９月；１４（３）：３１６−２７、Ｅｐｕｂ ２００６年７月７日；Ｃｈｏｉら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５年６月、５（３）：２９９−３１０を参照されたし。
例えば、アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２またはその等価物を使用することができ、前記アカゲザル由来ＡＡＶは、ヒトのいずれの既存免疫によっても阻害されないことがある；例えば、Ｓｏｎｄｈｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２年１０月、２３（５）：３２４−３５、Ｅｐｕｂ ２０１２年１１月６日；Ｓｏｎｄｈｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２年１０月１７日を参照されたし；これらは、ヒト用の規模に拡大可能な用量でのＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２のラットおよび非ヒト霊長類のＣＮＳへの直接投与が、許容可能な安全性プロファイルを有し、ＣＮＳにおける有意なペイロード発現を媒介することを教示している。
また、例えば、心臓遺伝子導入用に特別設計されたＡＡＶベクター（心臓指向性ＡＡＶ）、例えば、心筋層における改善された形質導入効率および特異性を有するＡＡＶＭ４１変異体、例えば、Ｙａｎｇら、Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２０１３年２月１１日；１０（１）：５０参照、を使用することができる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、霊長類の一般的な感染因子であり、それ故、健常な霊長類は、ＡＡＶ媒介遺伝子導入治療戦略を阻害するＡＡＶ特異的中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＮＡｂ）の大きなプールを有するので、本発明の方法は、個別化された処置設計を促進し、治療効力を増強するために、処置、特に、頻繁に使用されるＡＡＶ８カプシド成分での処置に先立ち、ＡＡＶ特異的ＮＡｂの候補患者のスクリーニングを含む；例えば、Ｓｕｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３年１月３１日；３８７（１−２）：１１４−２０、Ｅｐｕｂ ２０１２年１０月１１日を参照されたし。
キットおよび説明書
その使用のための指示を含めて、本発明の組成物および方法を含むキットであって、細胞、および発現ビヒクル（例えば、組み換えウイルス、ベクター）などを含むキットが提供される。
例えば、代替実施形態において、本発明を実施するために使用する組成物を含む、例えば、ウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）ペプチドもしくはポリペプチド；またはウロコルチン２をコードしているおよび／もしくはウロコルチン３をコードしている核酸、（ｂ）本発明の液体または水性製剤、あるいは（ｃ）本発明の小胞、リポソーム、ナノ粒子またはナノ脂質粒子を含む、キットが提供される。１つの態様では、キットは、本発明の任意の方法、例えば、血流中の所望のウロコルチン２をコードしているおよび／もしくはウロコルチン３レベルを増大させるための、または細胞、例えば心臓もしくは肺細胞、を保護するための、または糖尿病もしくは前糖尿病を処置する、予防するまたは改善するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法、を実施するための説明書をさらに含む。
製剤
代替実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏでウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３レベルを増大させることに使用するための組成物および方法が提供される。代替実施形態において、これらの組成物は、これらの目的のために製剤化されたウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、例えば、緩衝液中、食塩溶液中、粉末中、エマルジョン、小胞中、リポソーム中、ナノ粒子中、ナノ脂質粒子およびこれらに類するもの中の製剤化された発現ビヒクルまたはウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸を含む。
代替実施形態において、糖尿病（１型および２型、もしくは成人発症型糖尿病を含む）もしくは前糖尿病、または肥満症もしくは過体重を処置、改善もしくは予防するための、または体重減少を刺激するための、または食欲抑制剤として作用するための、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチド、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸の投与を含む方法が提供される。したがって、そのための、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチド、またはＵＣｎ−２をコードする核酸の適切な製剤および投薬量が提供される。
代替実施形態において、前記組成物（ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、の製剤を含む）を、任意の方法で製剤化することができ、所望のｉｎ ｖｉｖｏまたｅｘ ｖｉｖｏ投与方法およびこれらに類するものをはじめとする所望のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ条件に依存して、様々な濃度および形態で適用することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ製剤化および投与のための技法の詳細は、科学および特許文献において十分に説明されている。
本発明を実施するために使用する、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸のまたはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドの製剤および／または担体は、当該技術分野において周知である。本発明を実施するために使用する製剤および／または担体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたｅｘ ｖｉｖｏ適用に適する形態、例えば、錠剤、ピル、粉末、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などであり得る。
代替実施形態において、本発明を実施するために使用する、ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドは、水溶液および／もしくは緩衝溶液との混合物であることもあり、または水性および／もしくは緩衝懸濁液として存在することもあり、前記懸濁液は、例えば、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム、ならびに分散または湿潤剤、例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含む。前記水性懸濁液は、１つまたは複数の保存薬、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピルも含有することがある。例えば、適切な緩衝液の使用により、製剤の容量オスモル濃度を調整することができる。
本発明を実施する際、本発明の化合物（例えば、製剤）は、医薬的に許容され得る担体に溶解された、ウロコルチン２をコードする、ウロコルチン１をコードする核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチド、の溶液を含む場合があり、例えば、用いることができる許容され得るビヒクルおよび溶媒としては、水およびリンゲル液、等張塩化ナトリウムが挙げられる。加えて、滅菌固定油を溶媒または懸濁媒体として用いることができる。このために、合成モノもしくはジグリセリド、または脂肪酸、例えばオレイン酸をはじめとする、任意の固定油を用いることができる。１つの実施形態において、本発明を実施するために使用する溶液および製剤は無菌であり、かつ望ましくない物質を概して含まないようにそれらを製造することができる。１つの実施形態において、これらの溶液および製剤を従来の周知の滅菌法によって滅菌することができる。
本発明を実施するために使用する溶液および製剤は、必要に応じて、生理条件に近づけるための補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムおよびこれらに類するものを含むことがある。これらの製剤中の活性薬剤（例えば、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子）の濃度は非常に様々であり得、ならびに選択される特定のｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与形式、および所望の結果、例えばｉｎ ｖｉｖｏでのウロコルチン２および／またはウロコルチン３の発現の増大、に従って、主として流体体積、粘度およびこれらに類するものに基づき前記濃度を選択することができる。
本発明を実施するために使用する溶液および製剤を凍結乾燥させることができ；例えば、ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドを含む、安定した凍結乾燥製剤が提供される。１つの態様では、この製剤を、ウロコルチン２をコードする、ウロコルチン１をコードする核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドと、充填剤、例えばマンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびスクロースまたはこれらの混合物とを含む溶液を凍結乾燥させることによって作製する。安定した凍結乾燥製剤を調製するためのプロセスは、溶液：約２．５ｍｇ／ｍＬタンパク質、約１５ｍｇ／ｍＬスクロース、約１９ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌ、および５．５より高いが６．５より低いｐＨを有するクエン酸ナトリウム緩衝液、の凍結乾燥を含み得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／００２８６７０号を参照されたし。
本発明の組成物および製剤をリポソームの使用により送達することができる（下記の論考も参照されたし）。リポソームを使用することにより、特に、そのリポソームの表面が、標的細胞に対して特異的なリガンドを担持している、または特定の組織もしくは臓器タイプに別様に優先的に方向づけられている場合、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ適用での前記活性薬剤の標的細胞への送達に焦点を当てることができる。代替の実施形態では、標的細胞は、肝臓、骨格筋または肝細胞である。
ナノ粒子、ナノ脂質粒子およびリポソーム
本発明は、本発明の方法、例えば、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドを個体、患者または哺乳動物細胞にｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで送達するための方法、を実施するために使用する化合物（例えば、ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン２をコードする核酸）を含むナノ粒子、ナノ脂質粒子、小胞およびリポソーム膜も提供する。代替実施形態において、これらの組成物は、例えば、所望の細胞タイプ、例えば、哺乳動物細胞、例えば、骨格筋細胞もしくは組織、肝細胞、腎臓細胞、肺細胞、神経細胞およびこれらに類するものへの標的化のために、細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチドなどの生物学的な分子を含む分子を標的化するように設計される。
本発明を実施するために使用する化合物を含む多層リポソームであって、例えば、Ｐａｒｋら、米国特許出願公開第２００７００８２０４２号に記載されているような多層リポソームが提供される。スクアレンと、ステロールと、セラミドと、中性脂質または油と、脂肪酸と、レシチンとを含む油相成分の混合物を使用して、例えばウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子を捕捉するために、約２００から５０００ｎｍの粒径に前記多層リポソームを調製することができる。
リポソームは、活性薬剤（例えば、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドを発現するベクター）を封入することによるリポソームの製造方法であって、水溶液を第一のリザーバに提供する工程；有機脂質溶液を第二のリザーバに提供する工程；そしてその後、前記水溶液と前記有機脂質溶液を第一の混合領域で混合して、リポソーム溶液を生成する工程（ここで前記有機脂質溶液は前記水溶液と混ざり、実質的に即座に、前記活性薬剤を封入しているリポソームを生成する）；そしてその後直ちに、前記リポソーム溶液を緩衝溶液と混合して、希釈されたリポソーム溶液を生成する工程を含む方法を含む、任意の方法、例えば、Ｐａｒｋら、米国特許出願公開第２００７００４２０３１号に記載の方法を用いて作製することができる。
１つの実施形態において、本発明を実施するために使用するリポソーム組成物は、例えば米国特許出願公開第２００７０１１０７９８号に記載されているように、例えば、本発明を実施するために使用する化合物（ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子）の所望の細胞タイプへの標的化送達のために、置換アンモニウムおよび／またはポリアニオンを含む。
本発明は、本発明を実施するために使用する化合物（例えば、ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチド）を、例えば米国特許出願公開第２００７００７７２８６号に記載されているような、活性薬剤含有ナノ粒子（例えば、二次ナノ粒子）の形態で含む、ナノ粒子も提供する。１つの実施形態において、本発明の脂溶性活性薬剤、すなわち二価または三価金属塩とともに作用するような脂溶性化水溶性活性薬剤、を含むナノ粒子が提供される。
１つの実施形態では、本発明を実施するために使用する、ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドを、例えば米国特許出願公開第２００５０１３６１２１号に記載されているように、固体脂質懸濁液を使用して製剤化し、患者、個体または哺乳動物細胞にｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで送達することができる。
送達ビヒクル
代替実施形態では、任意の送達ビヒクルを使用して、本発明の方法または組成物を実施すること、例えば、ウロコルチン２をコードするおよび／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドを送達して、本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。例えば米国特許出願公開第２００６００８３７３７号に記載されているような、ポリカチオン、カチオン性ポリマーおよび／またはカチオン性ペプチド、例えばポリエチレンイミン誘導体、を含む送達ビヒクルを使用することができる。
１つの実施形態では、例えば米国特許出願公開第２００４０１５１７６６号に記載されているような、界面活性剤が非共有結合によって核酸と会合している乾燥ポリペプチド−界面活性剤複合体を使用して、本発明の組成物を製剤化する。
１つの実施形態では、本発明を実施するために使用する核酸またはポリペプチドを、例えば米国特許第７，４１３，７３９号に記載されているように、ポリマーヒドロゲルまたは水溶性コポリマーとして細胞に適用することができる；例えば、核酸およびタンパク質を、強い求核試薬と共役不飽和結合または共役不飽和基との間の求核付加による反応によって重合させることができ、この場合、各前駆体成分は、少なくとも２つの強い求核試薬または少なくとも２つの共役不飽和結合もしくは共役不飽和基を含む。
１つの実施形態では、例えば米国特許第７，３０６，７８３号、同第６，５８９，５０３号に記載されているような、細胞膜透過性ペプチドコンジュゲートを伴うビヒクルを使用して、核酸またはタンパク質を細胞に適用する。１つの態様では、前記核酸それ自体を細胞膜透過性ペプチドにコンジュゲートさせる。１つの実施形態では、核酸、タンパク質および／または送達ビヒクルを、輸送媒介ペプチド、例えば、米国特許第５，８４６，７４３号（塩基性が高くかつポリ−ホスホイノシチドに結合する輸送媒介ペプチドが記載されている）に記載されているような輸送媒介ペプチドにコンジュゲートさせる。
１つの実施形態では、ウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子を細胞に送達する主または補助手段として、例えば、任意の電子穿孔システム、例えば米国特許第７，１０９，０３４号、同第６，２６１，８１５号、同第５，８７４，２６８号に記載のものを使用する、電気的透過処理（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を用いる。
製品、インプラントおよび人工臓器
例えば、本発明の方法を実施するためのウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３タンパク質を発現するように改変された細胞を含むインプラントおよび人工臓器、バイオリアクターシステム、細胞培養システム、プレート、ディッシュ、チューブ、ボトルおよびフラスコをはじめとする、本発明の細胞（例えば、本発明の方法を実施するためのウロコルチン２をコードするおよび／またはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチドを発現するように改変された細胞）を含む製品、および本発明の方法によって作製される細胞の使用が提供される。任意のインプラント、人工臓器、バイオリアクターシステム、細胞培養システム、細胞培養プレート、ディッシュ（例えば、ペトリ皿）、細胞培養チューブおよび／または細胞培養フラスコ（例えば、ローラーボトル）を使用して、本発明を実施することができる。
代替実施形態において、本発明の方法を実施するためのウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質を発現するように改変された細胞を含む、バイオリアクター、インプラント、ステント、人工臓器または同様のデバイスが提供され、それらには、例えば、米国特許第７，３８８，０４２号、同第７，３８１，４１８号、同第７，３７９，７６５号、同第７，３６１，３３２号、同第７，３５１，４２３号、同第６，８８６，５６８号、同第５，２７０，１９２号ならびに米国特許出願公開第２００４０１２７９８７号、同第２００８０１１９９０９号（耳のインプラントを記載）、同第２００８０１１８５４９号（眼のインプラントを記載）、同第２００８００２００１５号（生理活性創傷被覆材を記載）；同第２００７０２５４００５号（心臓弁バイオプロテーゼ、血管グラフト、半月板インプラントを記載）；同第２００７００５９３３５号、同第２００６０１２８０１５号（肝臓インプラントを記載）に記載のインプラントが含まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞移植
代替実施形態において、本発明を実施するために使用する、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチド、を含むまたは発現する細胞、例えば心臓、肺または腎臓細胞、の移植または植え込みも含み；および１つの態様では、本発明の方法は、前記ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子（もしくはそれらを発現する細胞）、またはウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）ペプチドもしくはポリペプチドをｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで血管、組織または臓器に移植するまたは植え込むこと、あるいは再プログラミンされた分化細胞を、それを必要とする個体に移植するまたは植え込むことを含む方法が提供される。
任意の公知技法またはプロトコルを用いて、細胞を個体から取り出し、本発明の組成物および／または方法を用いて処置し、組織、臓器にまたはその個体に再挿入する（例えば、注射するまたは植え込む）。例えば、脱分化され再プログラミングされた細胞、または再プログラミングされ分化した細胞を、例えば米国特許第７，４４２，３８９号に記載されているようなマイクロスフェアを使用して、再び移植する（例えば、注射するまたは植え込む）ことができる；例えば、１つの態様において、前記細胞担体は、混合・送達システム内に予め負荷されている丸い平滑なポリメチルメタクリレート微粒子を含む充填剤と、これらの細胞を含む自己担体とを含む。もう１つの実施形態では、例えば米国特許出願公開第２００５００２７０７０号に記載されているような生体適合性架橋マトリックスの中の前記細胞を、組織、臓器、および／またはそれを必要とする個体に再投与する。
もう１つの実施形態では、生体適合性、非免疫原性コーティングの中のまたは該コーティングによって保護された本発明の細胞（例えば、本発明の方法を実施することによって作製された細胞）を、組織、臓器、および／またはそれを必要とする個体に再投与し（例えば、注射し、または植え込み）、前記コーティングは、例えば合成インプラントの表面にあるような、例えば米国特許第６，９６９，４００号（例えば、多数の求核基、例えば第一級アミノまたはチオール基、を含有するように修飾されたポリエチレングリコールにｃＡＭＰインコンピテントＡＣをコンジュゲートさせることができるプロトコルが記載されている）に記載されているようなものである。
１つの実施形態では、例えば米国特許第７，４４２，３９０号、同第５，７３３，５４２号によって記載されているようなグラフト方法を用いて、本発明の細胞（例えば、本発明の方法を実施することによって作製された細胞）を組織、臓器、および／またはそれを必要とする個体に投与する（例えば、注射する、または植え込む）。
ポリペプチド、核酸および／または細胞を組織または臓器（例えば、肺、腎臓、肝臓、骨格筋）に送達するための任意の方法を使用することができ、これらのプロトコルは、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許（ＵＳＰＮ）第７，５１４，４０１号に記載されており、この特許明細書には、例えば、ポリペプチド、核酸および／または細胞の心臓へのｉｎ ｓｉｔｕでの冠動脈内（ＩＣ）、静脈内（ＩＶ）および／または局所送達（心筋注射）の使用が記載されている。例えば、代替実施形態では、肺へのおよび血流へのエアロゾル薬物粒子、遺伝子療法、持続注入、反復注射および／または徐放性ポリマーを、ポリペプチド、核酸および／または細胞を組織または臓器（例えば、肺、腎臓、肝臓、骨格筋）に送達するために使用することができる。代替実施形態では、核酸および／または細胞を、カテーテルによって冠動脈にまたは制限開胸（ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｈｏｒａｃｏｔｏｍｙ）を介した直接注射によって左心房もしくは心室心筋層に与えることができ；あるいは心臓カテーテル留置中に通されるカテーテルにより心筋層に送達することができ；あるいは心膜腔に送達することができる。
代替実施形態では、組織または臓器（例えば、肺、腎臓、肝臓、骨格筋）への、本発明を実施するために使用する核酸もしくはタンパク質、または本発明を実施するために使用する核酸を含むベクター（例えば、ＡＡＶ、もしくはアデノウイルス遺伝子療法ベクター）、または本発明の小胞、リポソーム、ナノ粒子もしくはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）、およびこれらに類するもの；例えば、米国特許第７，５０１，４８６号に記載されているとおりのもの。
本発明を実施するために使用する組成物を、他の治療薬、例えば、血管形成剤、抗血栓薬、抗炎症薬、免疫抑制薬、抗不整脈薬、腫瘍壊死因子阻害剤、エンドセリン阻害剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、カルシウム拮抗薬、抗生物質製剤、抗ウイルス剤およびウイルスベクターと併用することができる。
本発明を実施するために使用する組成物を、糖尿病に関連する様々な心臓障害および心血管疾患、例えば、糖尿病に関連する心臓障害および心血管疾患、例えば、冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＡＤ）；アテローム性動脈硬化症；血栓症；再狭窄；自己免疫性およびウイルス性血管炎、例えば、結節性多発性動脈炎、チャーグ−ストラウス症候群、高安動脈炎、川崎病およびリケッチア血管炎を含む、血管炎；アテローム硬化性動脈瘤；心筋肥大；うっ血性心疾患（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＨＤ）；虚血性心疾患およびアンギナ；後天性弁膜症／心内膜疾患；心筋炎を含む、原発性心筋疾患；不整脈；ならびに移植拒絶反応；代謝性心筋疾患および心筋ミオパチー、例えば、うっ血性心筋症、肥大型心筋症および拘束型心筋症ならびに／または心臓移植、のいずれかを改善または処置するために使用することができる。代替実施形態では、本発明を実施するために使用する組成物、例えばウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）ペプチドまたはポリペプチドを、患者または個体における糖尿病もしくは前糖尿病を処置する、改善するまたは防ぐ（予防する）；あるいは患者または個体における、体重増加を抑制する、または食欲を抑制する、または体重減少を刺激するもしくは開始させる；あるいは患者または個体における糖尿病を処置する、改善するまたは防ぐ（予防する）ために使用する。
以下の実施例に関連して本発明をさらに説明する；しかし、本発明がかかる実施例に限定されないことは、理解されるはずである。
（実施例１）
ウロコルチン−２をコードするＡＡＶ８の静脈内送達は、正常マウスにおける心機能を増大する
この実施例は、本発明の例示的実施形態の有効性を実証するものである。代替の実施形態において、ウロコルチン−２（ＵＣｎ２）、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）ファミリーのペプチドをコードするアデノ随伴ウイルスベクター血清型８（ＡＡＶ８）の１回静脈内（ＩＶ）注射を使用して、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）および糖尿病性心臓疾患を処置し、改善するための組成物および方法が提供される。代替の実施形態において、ベクター（ＡＡＶ８．ＵＣｎ２）は、調節された発現を可能にするための制御された発現カセットを含む。代替の実施形態において、例示的ベクターは、例えば、外来訪問中に上腕の静脈へのＩＶ注射により送達される。
本発明者らは、マウスにおけるＡＡＶ８．ＵＣｎ２の単回のＩＶ注射が、結果として、少なくとも７カ月間持続する１、ならびにａ）Ｔ２ＤＭの２つのモデルにおいて増大したインスリン感受性によってグルコース利用を正規化する（図１Ａ）、およびｂ）不全心臓の機能を増大する（図１Ｂ）血漿ＵＣｎ２レベルの１５倍の増加を生じることを実証した。代替の実施形態において、本発明の方法は、インスリン感受性および心機能に対して有益なパラクリン効果を有するペプチドをコードするベクターのＩＶ注射を含む。
げっ歯類Ｔ２ＤＭにおける本発明者らのデータは、本発明のＵＣｎ２遺伝子導入方法が、インスリンの必要を未然に防ぐことができ、ＣＨＦを有する患者において十分に許容され、有益であり、繰返し注射を必要とせず、体重減少と関連し得ることを示す。
本発明の方法は、有益な心臓の効果を有することができ１、ＣＨＦを有する被験体において安全に使用することができ、現在の薬物が共有しない特性を有して、ＣＨＦを有するＴ２ＤＭ患者の新規処置という、満たされていない医療の必要性を満たす。
代替の実施形態において、本発明の方法の実施は、インスリンの必要を未然に防ぐことができ、故に、本発明の方法の実施は、ベータ細胞保存であり、Ｔ２ＤＭを有する患者に有益である。
代替の実施形態において、例えば、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２を使用した、本発明の方法の実施は、現在のＴ２ＤＭ剤に伴う問題である体重を増加させるよりむしろ低減する。心機能に対するＵＣｎ２の有益な効果のため１、チアゾリジンジオンと異なり、それを安全に使用して、ＣＨＦを有するＴ２ＤＭ患者を安全に処置することができる。
代替の実施形態において、本発明の療法は、ＣＨＦを有するおよび有しないＴ２ＤＭ被験体について示され、経口剤の代わりに（またはそれに加えて）使用され、一部の患者についてインスリンの必要性を遅らせることができる。
代替の実施形態において、本発明の療法は、インスリン感受性を増大する導入遺伝子を使用して、初期Ｔ２ＤＭに焦点を当てる。
代替の実施形態において、本発明の療法は、ベクター、例えば、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２、ＩＶの投与により、Ｔ２ＤＭを有する被験体に対して実施され、食餌および運動介入に失敗し、依然インスリンに依存していない個体が、理想的な候補であり得る。加えて、本発明の療法は、正常１および不全心臓の機能を増大させることができ（図１Ｂ）、一部の患者において、Ｔ２ＤＭを有する被験体において不全心臓の機能を好転させることがきる。
代替の実施形態において、ウロコルチン−２の制御された発現を有するＡＡＶ８ベクターのＩＶ（静脈注射）は、グルコース利用およびインスリン感受性を増大し、Ｔ２ＤＭにおいて心機能を好転させる。図１Ａにおいてグラフで例証する通り、正常マウスに、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２、ＩＶ、用量５×１０１１ｇｃ、または陰性対照として食塩水を受けさせ、標準的固形飼料を３週間（ｗ）、次に、高脂肪食餌を８週間給餌したとき、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２を投与した動物において、グルコースレベル（「予防」、「回復」および「糖耐性試験」）；血漿インスリン；ならびに恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）、または「インスリン抵抗性」が好転した。
代替の実施形態において、本発明の療法は、例えば、ベクター、例えば、ＵＣｎ２、ＵＣｎ１および／またはＵＣｎ３を発現する核酸、例えば、ＵＣｎ２、ＵＣｎ１および／またはＵＣｎ３遺伝子またはｃＤＮＡをコードするＡＡＶベクターの静脈内（ＩＶ）送達による、遺伝子導入、例えば、ＵＣｎ２、ＵＣｎ１および／またはＵＣｎ３遺伝子導入を含む。代替の実施形態において、全身性ベクター送達は、任意の所定のＡＡＶ用量について導入遺伝子の最高血漿レベルをもたらすので、パラクリン活性を有するペプチドの遺伝子導入における利点を有する。
代替の実施形態において、ＡＡＶは、アデノウイルスより長い導入遺伝子発現を可能にし、レトロウイルスと関連する挿入変異誘発を回避することができるので、それを使用する。ＡＡＶベクターの単回注射の数年後の大型動物において、持続性導入遺伝子発現を示した。本発明者らは、マウス（例えば、図５を参照）およびラット１１においてこれを確認した。近年の臨床試験により、一部のＡＡＶ血清型が、ＩＭ注射の後に免疫応答を刺激し１２、より新しい世代のＡＡＶベクター（ＡＡＶ５、６、８および９）が、霊長類において同様の問題を有しない１３ことが見出された。ＩＶ ＡＡＶ送達は、血漿導入遺伝子レベルに関してＩＭより優れ、ＡＡＶ９は、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６より優れている１４。既存の抗ＡＡＶ８抗体は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６（５０〜５９％）を含む他のＡＡＶ血清型程には、ヒトにおいて流行していない（１９％）１５。本発明者らのデータは、ＩＶ ＡＡＶ８が、提案した研究について血漿ＵＣｎ２の持続したレベルの増加を達するための最適なベクターおよび送達経路であることを示す（図１）１。
横紋筋において頑強であるが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターは、肝臓におけるメチル化および不活性化に感受性があり１６、本発明者らのデータは、メチル化に感受性が少ないプロモーターが優れていることを示す。実際に、ＣＭＶは、ＩＶベクター送達後にＵＣｎ２の持続した２．３倍の増加をもたらしたが、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターの使用が、結果として、血漿ＵＣｎ２の１５倍超の増加を生じた（図１）。代替の実施形態において、ＵＣｎ２、ＵＣｎ１および／またはＵＣｎ３を発現する核酸、例えば、ＵＣｎ２、ＵＣｎ１および／またはＵＣｎ３遺伝子またはｃＤＮＡは、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに作動的に連結する。
代替の実施形態において、ＵＣｎ２、ＵＣｎ１および／またはＵＣｎ３を発現する核酸は、「制御された発現」下にある。代替の実施形態において、ＡＡＶ遺伝子導入が確かにする長期発現の潜在能力のため、発現をオフにする能力は、有害な作用が発生する事象において望ましい。代替の実施形態において、制御された発現を使用し、それは、定常的導入遺伝子送達よりむしろ柔軟な断続的導入遺伝子送達を可能にし得る。代替の実施形態において、テトラサイクリンおよびラパマイシン制御系を使用し、それらを大型動物モデルにおいて試験した。
Ｔ２ＤＭの高脂肪食餌（ＨＦＤ）モデルからのデータ
ＵＣｎ２遺伝子導入は、一旦存在したら、Ｔ２ＤＭを予防し、処置した。空腹時血液グルコースおよび糖耐性試験の両方を正規化した。インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）をある程度低減した。図１Ｂ：ＭＩにより誘発されたＣＨＦ１０週（ｗ）後のマウスであって、ＡＡＶ．ＵＣｎ２（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）をＣＨＦの誘発の５週間後に送達した（対食塩水）マウスからのデータ。ＵＣｎ２遺伝子導入は、収縮期および拡張期ＬＶ機能を増大した（盲検試験）。
図２。Ｔ２ＤＭおよびＬＶ機能不全の状況でＵＣｎ２発現の活性化の２０週後のＡＡＶ８．ＵＣｎ２−Ｒｅｇ（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）の効力を試験する。本発明者らは、スプラーグドーリーラットにおいて高脂肪食餌（ＨＦＤ）およびストレプトゾトシン（ＳＴＺ；３５ｍｇ／ｋｇ ＩＰ×２）を使用する、異常なＬＶ収縮期および拡張期機能と関連するＴ２ＤＭのモデルを使用する７。連続的心エコー検査は、円周方向線維短縮速度（velocity of circumferential fiber shortening）（ＶＣＦ）機能を含むＬＶサイズ、ならびに収縮期および拡張期機能を評価する。収縮終期圧容積関係（ＥＳＰＶＲ）、壁応力、ＬＶ圧上昇および減衰の速度、ならびにＴａｕを評価するための圧容積カテーテルを使用して、１群当たり１５匹のラットの終末期研究を行う。最終的に、それぞれの動物からの１１個の組織由来の試料は、体内分布および毒性学研究に付し、ＡＡＶ要件は１．５×１０１４ｇｃである。
ＨＦＤマウス（マウスに、高脂肪食餌を１０週間、次に、５週においてＡＡＶ８．ＵＣｎ２−Ｒｅｇ（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）またはＩＶ食塩水（陰性対照）を給餌した）におけるウロコルチン−２の静脈内投与は、組織学的分析により確認されるとおり、結果として、肝臓の脂肪浸潤の７３％の低減を生じた。
図５Ａ。上部のパネル：制御されていない発現ベクターのベクターマップ。ＣＢＡプロモーターは、ＣＭＶに伴う問題である肝臓におけるメチル化を回避する。下部のパネル。血漿ＵＣｎ２は、ＡＡＶ８．ＣＢＡ．ＵＣｎ２の単回のＩＶ注射の６週間後に１５倍超、増加した。肝臓およびＬＶの発現は増加した。心臓の発現は自己分泌効果に重要であり、それはパラクリン効果を増し得る。さらなるデータ（示していない）は、遺伝子導入の７カ月後に血漿ＵＣｎ２および心機能に対する持続性および安定な効果を記述する。
図５Ｂは、最適な制御された発現系のための本発明の例示的な制御された発現ベクターを例証するものである。これらの例示的ＡＡＶ８ベクターは、テトラサイクリン制御（マップＡ）またはラパマイシン制御（マップＢ）の下、マウスＵＣｎ２の制御された発現をコードする。ＣＢＡはＲａｐと適合しないので、ベクターマップＢにおいて、ＲＳＶを使用する。これらの２個の制御された発現ベクターを試験し（目的１）、目的２および目的３の研究のためより良好なものを選択する。略称：ＩＴＲ、末端逆位配列；ＳＶｐＡ、ＳＶ４０ウイルスゲノム（双方向性）由来のポリＡ；ＵＣｎ２、ウロコルチン−２；ＴＲＥ、テトラサイクリン応答エレメント；ｒｔＴＡ２ＳＭ２、逆テトラサイクリン調節トランスアクチベーター；ＳＶ４０．ｅｎ、シミアンウイルス４０エンハンサー；ＲＳＶ Ｐｒｏｍ、ラウス肉腫ウイルスプロモーター；ＦＲＢ−ｐ６、ＦＲＡＰの一部、転写因子ＮＦ−κＢのサブユニット（ｐ６５）と結合したラパマイシン相互作用タンパク質；ＩＲＥＳ、内部転写再エントリー部位；ＺＦ、ジンクフィンガーＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン；ＦＫＢＰ、ＦＫ５０６結合タンパク質；ｐＡ、最小ポリアデニル化セグメント；ＺＢＤ、ジンクフィンガーＨＤ ＤＮＡ結合ドメイン（８コピー）。
図１３。左：Ｔ２ＤＭのＨＦＤモデルからのデータ。ＵＣｎ２遺伝子導入は、一度存在したなら、Ｔ２ＤＭ（前）を予防し、それを処置した（後：高血糖が存在した４〜８週後の遺伝子導入）。空腹時血液グルコースおよび糖耐性試験の両方を、正規化した。インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）をある程度低減した。ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、効果を確認した。上：ＭＩにより誘発されたＣＨＦの１０週間後のマウスからのデータ。ＡＡＶ．ＵＣｎ２（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）をＣＨＦの５週間後に送達し（対食塩水）、それは、収縮期および拡張期ＬＶ機能を増大した（盲検試験）。
（実施例２）
ウロコルチン−２をコードするＡＡＶ８の静脈内送達は、マウスにおいて不全心臓の機能を増大させる
この実施例は、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２の静脈内送達が不全心臓の機能を増大するという、本発明の例示的実施形態の有効性を実証するものである。要約すると、心筋梗塞（ＭＩ、冠動脈結紮による）を使用して、心不全を誘発し、それを、ＭＩの３週間後に心エコー検査により評価した。ＬＶ駆出率（ＥＦ）２５％未満を有するマウスは、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２（５×１０１１ｇｃ）または食塩水の静脈内送達を受け、５週間後、心エコー検査は、ＵＣｎ２遺伝子導入を受けたマウスにおいてＬＶ ＥＦの増加を示した（ｐ＝０．０１）。ｉｎ ｖｉｖｏ生理学的研究は、ＬＶ圧発生のピーク速度の２倍の増加（ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ；ｐ＜０．０００１）、およびＬＶ圧減衰のピーク速度の１．６倍の増加（ＬＶ−ｄＰ／ｄｔ；ｐ＝０．０００７）を示し、これは、処置したマウスにおけるＬＶ収縮期および拡張期機能の増大を示している。ＵＣｎ２遺伝子導入は、ピーク収縮期Ｃａ２＋トランジェント振幅およびＣａ２＋減衰の速度の増加、およびＳＥＲＣＡ２ａ発現の増加と関連した。加えて、ＵＣｎ２遺伝子導入は、ＣａｍキナーゼＩＩのＴｈｒ２８６リン酸化を低減し、心臓型ミオシン軽鎖キナーゼの発現を増加させ、不全心臓の機能を増大すると予測し得ることを見出した。これらの結果は、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２の単回静脈注射が、不全心臓の機能を増大させることを実証する。心機能を増大する有益なパラクリン効果を有する遺伝子をコードするベクターの静脈注射の容易さは、魅惑的な臨床ストラテジーである。
方法
ＡＡＶ８．ＵＣｎ２ベクター生成（図１４）。ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターにより駆動されるマウスウロコルチン−２（ＵＣｎ２）をコードするヘルパーウイルスフリーＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８．ＣＢＡ．ＵＣｎ２；図１４）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のベクタープラスミドｐＲｅｐ２／Ｃａｐ８およびｐＡｄ−Ｈｅｌｐｅｒプラスミドでの一過性トランスフェクションにより生成した２８。プラスミドｐＲｅｐ２／Ｃａｐ８をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅから得た。トランスフェクションの７２時間後に調製した細胞溶解物をベンゾナーゼで処理し、ウイルスを２５％スクロース−クッション超遠心分離を介して集めた。陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を介したウイルスのさらなる精製のため、ペレットを再懸濁し、２５％スクロースクッション超遠心分離により濃縮した２９、３０。続いて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３％スクロース）にペレットを再懸濁した。精製したウイルスから調製したウイルスゲノムＤＮＡを用いたリアルタイムｑＰＣＲにより、ウイルス力価を決定した。
心不全モデル。Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ＶＡ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍが研究を承認した。１０〜１２週齢、体重２６．１±０．２グラムの２３１匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）を使用した。既に詳細に記載されている３１、３２通り、本発明者らは、冠動脈閉塞を使用して、大きな前壁ＭＩおよびＣＨＦを誘発した。ＭＩサイズは計画通り大きく、ＬＶの約５０％であり、これは大部分のＬＶ自由壁を含んでいた（図１４）。結果的に、このモデルは、高い初期死亡率と関連する。冠動脈閉塞を経験した２３１匹のマウスのうち、１２５匹（５４％）が、無作為化（ＡＡＶ８．ＵＣｎ２または食塩水）の前に死亡し、これは、主にＭＩ後最初の数日以内であった。さらに４５匹のマウス（１９％）が、無作為化すべきＭＩの３週間後に十分なＬＶ機能不全を示さなかった。６１匹のマウス（２６％）が低ＬＶ駆出率（ＥＦ＜２５％）を十分に有し、それを無作為化し、これらのマウスのうち１１匹が、無作為化の５週間後の最終研究前に死亡した：４匹、ＵＣｎ２（死亡率１３％）；７匹、食塩水（死亡率２３％）。主要エンドポイントは、重篤な心不全を有するマウスにおけるＡＡＶ８．ＵＣｎ２対食塩水の静脈内送達の５週間後のＬＶ機能であった（図１４）。データを取得し、群の正体の情報なしで分析した。
ＡＡＶ８．ＵＣｎ２送達。麻酔（ノーズ・コーンを介した１．５％イソフルレン）下で、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２（５０μｌ中の５×１０１１ｇｃ）または同様の容量の食塩水（対照）の静脈内送達ため、小さく切開して頸静脈を露出させた。
ＵＣｎ２遺伝子導入の心拍数および血圧に対する効果
心不全を有する非鎮静下マウスにおいて、ＵＣｎ２遺伝子導入の心拍数および血液に対する効果を評価するために、これらの研究を行った。ＭＩの３週間後に、ＬＶ駆出率が障害されたことを確認し、マウスは静脈内ＡＡＶ８．ＵＣｎ２（５×１０１１ゲノムコピー、ｇｃ）または食塩水を受けた。非鎮静下マウスにおいて、尾カフ（Ｖｉｓｉｔｅｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｅｘ、ＮＣ）により、収縮期および拡張期血圧、ならびに心拍数を測定した。
心エコー検査。先に記載された３３通り、心エコー検査を行った。心筋梗塞の３週間後に心エコー検査を行い、ＬＶ機能（ＥＦ＜２５％）の低減を記述し、ＬＶ腔の寸法を記録した。次に、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２または食塩水の静脈内送達を受けるためにマウスを無作為化した５週間後に、心エコー検査評価を繰り返した。
ＬＶ収縮期および拡張期機能。
ペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）でマウスを麻酔し、１．４Ｆ コンダクタンス−マイクロマノメーターカテーテル（ＳＰＲ ８３９、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）を、右頸動脈を介して大動脈弁を通って、ＬＶ腔に進めた。左心室圧を記録し、先に報告された６通り、プロセシング（ＩＯＸ１．８ Ｅｍｋａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ、ＶＡ）のためデジタル処理で保存した。続いて、血液および組織試料を得た。取得後、ＬＶ圧発生（ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ）および減衰（ＬＶ−ｄＰ／ｄｔ）の一次導関数を使用して、ＬＶ収縮期および拡張期機能を評価した。データを取得し、群の正体の情報なしで分析した。
心筋細胞単離。
先に記載された３３通り、心筋細胞を単離した。
Ｃａ２＋トランジェント。先に記載したとおり改変して２７、３４Ｉｎｄｏ−１を使用して、サイトゾルのＣａ２＋トランジェントを測定した。ラミニンコートスライドガラス上に心筋細胞を蒔き、ｉｎｄｏ−１／ＡＭ（３μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）および分散剤プルロニックＦ−１２７（０．０２ｍｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を３０分間負荷した。色素を負荷後、スライドガラスを表面灌流チャンバーに載せ、すすいで、過剰なｉｎｄｏ−１−ＡＭを取り除き、モノクロメーターを介して３６５ｎｍに設定した励起波長を有するＰｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＮＪ）にインターフェースで接続した４０×対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ落射蛍光顕微鏡に載せた。蛍光発光を分け、それぞれ、４０５および４８５ｎｍに集まる、２０ｎｍのバンドパスフィルターを介して２本の光電子増倍管に誘導した。Ｆ４０５／Ｆ４８５比は、［Ｃａ２＋］ｉについての尺度を表す。これらの測定中、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）で心筋細胞を表面灌流した。０．３Ｈｚにて筋細胞を電界刺激した。６個の心臓（１群当たり３個）から得た１４４種の心筋細胞からのＣａ２＋トランジェントを記録した。拡張期および収縮期細胞内Ｃａ２＋レベルを、それぞれ、１サイクル当たりの基底および最大ｉｎｄｏ−１比から推論した。正規化したＣａ２＋トランジェントから、拡張期減衰時間（ｔａｕ）を計算した。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）および免疫ブロッティング。
ＬＶおよび肝臓試料を集め、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロッティングのため−８０℃にて保存した。ｑＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、ＬＶおよび肝臓ＲＮＡを単離し、以下の条件：９８℃にて５分、９５℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、および７２℃にて３０秒の４０サイクルで、先に記載された２７通り、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡ等価物を正規化し、それぞれの試料中のグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルを同時に決定した。下の表４にプライマーを挙げる。先に記載された３５通り、免疫ブロッティングを行った。以下の抗体を使用した：ｃＭＬＣＫ（Ａｂｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ／Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）；ｐ２８６ ＣａｍＫＩＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）；ホスホ−ＰＫＡ触媒サブユニット、ＰＫＡ触媒サブユニット、トロポニンＩ、および２２／２３−ホスホ−トロポニンＩ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ）；ＰＬＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）；Ｓｅｒ１６およびＴｈｒ１７−ホスホ−ＰＬＢ（Ｂａｄｒｉｌｌａ，Ｌｔｄ、Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ）；ＳＥＲＣＡ２ａ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ ＮＹ）。
環状ＡＭＰおよびタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）活性
イソプロテレノール（１０ｍＭ、１０分）およびＮＫＨ４７７（１０ｍＭ、１０分）で刺激前および後に、貫壁性ＬＶ試料はｃＡＭＰ測定に付し、先に記載された３６通り、Ｂｉｏｔｒａｋ Ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｃＡＭＰを測定した。先に記載された２７通り、ＰＫＡ活性を決定した。イソプロテレノール（１０μＭ、１０分）およびＮＫＨ４７７（１０μＭ、１０分）での刺激前および後に、心筋細胞はｃＡＭＰ測定に付し、続いて、緩衝液Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよびタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）においてホモジナイズし、遠心分離した（１４，０００×ｇ、５分、４℃）。上清を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でＰＫＡビオチン化ペプチド基質（ＳｉｇｎａＴＥＣＴ（登録商標）ｃＡＭＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と共にインキュベートした。ストレプトアビジンマトリックスを用いて、３２Ｐ−標識ビオチン化基質を回収し、ＰＫＡの比活性を決定した。
組織学。肝臓および梗塞していないＬＶ隔壁の貫壁性切片の試料をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。５ミクロンの切片を載せ、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにマッソントリクロームで対比染色した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ−Ｕ顕微鏡を用いて、短軸中壁ＬＶ環のＬＶ線維症画像の定量的評価を得た。ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ ３．１０ソフトウエア（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｃ．）を使用して、生存ＬＶ領域（梗塞した領域を除く）における線維症の程度の盲検分析を行った。固定し、対比染色した肝臓試料において、同様の分析プロセスを行った。
統計的分析。データは、平均値±ＳＥをあらわす；ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニｔ検定を使用して、統計学的有意性について群差を調べた。スチューデントｔ検定（対応のない、両側）を使用して、群間比較を行った。ｐ＜０．０５のとき、帰無仮説を棄却した。
結果
非鎮静下マウスにおける心拍数および血圧。ＵＣｎ２遺伝子導入の５週間後、心拍数、または収縮期、拡張期、または平均動脈圧において群差を認めなかった（表１、以下）が、心拍数は、無処置の群において非常に高い傾向にあり、ＵＣｎ２遺伝子導入を受けたマウスにおいて正常に近い傾向にあった。
ウロコルチン２発現。ＡＡＶ．ＵＣｎ２（５×１０１１ｇｃ；ｎ＝６）の静脈内送達の５週間後、ＵＣｎ２ ｍＲＮＡは、内因性ＵＣｎ２ ｍＲＮＡに対して、肝臓において１５，２６３倍（ｐ＜０．０００１）およびＬＶにおいて７０倍（ｐ＝０．０３）増加した。
心エコー検査（表２、以下）。ＨＦを有するマウスへのＡＡＶ８．ＵＣｎ２の静脈内送達は、駆出率の増加に関連し（ｐ＝０．０１）、円周方向線維短縮速度は増加したが、統計学的有意性には至らなかった（ｐ＝０．０９）。ＡＡＶ８．ＵＣｎ２を受けたマウスも、ＬＶ拡張終期径（ＥＤＤ；ｐ＜０．００１）およびＬＶ収縮終期径（ＥＳＤ；ｐ＝０．００２）の低減を示した。食塩水で処置したマウスは、ＬＶ ＥＤＤの１１％の増加を示し、一方ＵＣｎ２で処置した群は、ＬＶ ＥＤＤの２％の低減を示した。同様に、食塩水群は、ＬＶ ＥＳＤの１６％の増加を示し、一方、ＵＣｎ２群は６％の低減を経験した。ＬＶ寸法のこれらの変化は小さいようであるが、体積は径の３次関数であるので、体積変化は相当であり、ＥＳＤの６４％の増加（食塩水対ＵＣｎ２）およびＥＤＤの４６％の増加（食塩水対ＵＣｎ２）であると計算された。後部および中隔壁厚は、群差を示さなかった（表１、以下）。
ＬＶ収縮期および拡張期機能（図１５、および表３、以下）。ＬＶ圧発生のｉｎ ｖｉｖｏ評価は、ＬＶ圧発生の速度（ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ；ｐ＜０．０００１）およびＬＶ弛緩の速度（ＬＶ−ｄＰ／ｄｔ；ｐ＜０．０００７）の実質的な増加を示した（図１５、および表３、以下）。平均動脈圧の群差はなかった（表３）。麻酔下で行ったこれらの研究中の心拍数は、ＵＣｎ２遺伝子導入を受けたマウスにおいていくらか高かったが、差は統計学的有意性に至らなかった。
サイトゾルのＣａ２＋トランジェントおよび関連する遺伝子。ＵＣｎ２遺伝子導入を受けた心不全マウス由来の心筋細胞において、放出された基底Ｃａ２＋（収縮期−拡張期Ｃａ２＋）は増加した（ｐ＝０．０００１、図１６Ａおよび１６Ｂ）。ＵＣｎ２遺伝子導入の５週間後、心不全を有するマウス由来の心筋細胞において、ＵＣｎ２遺伝子導入は、低減したＣａ２＋減衰時間（ｔ１／２、Ｔａｕ）と関連した（ｐ＝０．００１、図１６Ｃおよび１６Ｄ）。正常および不全ＬＶにおいて、ＵＣｎ２の増加は、ＳＥＲＣＡ２ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の増加と関連した（図１６Ｅおよび１６Ｆ）。しかしながら、ＬＶタンパク質発現、およびホスホランバンまたはＴｎＩのリン酸化において、群差を認めなかった（データは示していない）。
環状ＡＭＰおよびＰＫＡ活性。両方の群の心臓から単離したＬＶ試料および心筋細胞は、ｃＡＭＰまたはＰＫＡ活性において差を示さなかった（図１７）。イソプロテレノールまたは、β−アドレナリン作用受容体非依存性のアデニル酸シクラーゼを独立して刺激する水溶性フォルスコリン類似体であるＮＫＨ４７７での刺激の前および後で、環状ＡＭＰ産生およびＰＫＡ活性を評価した。基底、ＩｓｏまたはＮＫＨ４７７で刺激したｃＡＭＰ産生（図４Ａ）、またはＰＫＡ活性（図１７Ｂ）において、群差を認めなかった。ＰＫＡファミリータンパク質（触媒αユニット、ならびに制御αおよびβサブユニット、ならびにそれらのリン酸化）の発現は変化しなかった（データは示していない）。
ＣａｍＫＩＩおよびｃＭＬＣＫ。ＵＣｎ２遺伝子導入により惹起した不全心臓の機能の増大を説明するメカニズムを探索するために、本発明者らは、ＬＶ発現、およびカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）のリン酸化、および心臓型ミオシン軽鎖キナーゼ３（ｃＭＬＣＫ）の発現を測定した。ＵＣｎ２遺伝子導入後のＨＦマウス由来のＬＶ試料において、Ｓｅｒ２８６におけるＣａｍＫＩＩリン酸化は低減した（４７％の低減、ｐ＝０．０４；図４Ｃ）が、総ＣａｍＫＩＩタンパク質発現は、群差を示さなかった。Ｃａ２＋に対する筋フィラメント感受性における変化を探索して、本発明者らは、ＵＣｎ２遺伝子導入後のＬＶ心臓型ミオシン軽鎖キナーゼ３（ｃＭＬＣＫ）発現を評価し、これは１．６倍の増加であることを見出した（ｐ＜０．０４）（図４Ｄ）。
剖検（表５）。肝臓、肺および体重は群差を示さなかった。ＵＣｎ２遺伝子導入は、ＬＶ重量を低減する傾向にあり、体重に対するＬＶの比は低減した（１２％の低減、ｐ＝０．０１）。
ストレス、炎症および組織損傷のマーカー（表６、以下）。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＬＶストレス、炎症および組織損傷のいくつかのマーカーの発現を調べた。ＨＦは、これらの遺伝子の大部分の発現を変化させた（表６）。ＵＣｎ２発現の増加は、ＨＦと関連する変化に影響しなかった。しかしながら、正常マウスにおいて、ＵＣｎ２発現の増加は、ＡＮＦ（ｐ＝０．００７）、ＢＮＰ（ｐ＝０．０１）、β−ＭｙＨＣ、およびα−ＳＫ−アクチン（ｐ＝０．０３）の発現の低減と関連した。
ＬＶおよび肝臓の組織学。肝臓およびＬＶの試料のヘマトキシリン・エオシン染色は、群差の証拠を示さなかった（データは示していない）。マッソントリクローム染色は、肝臓中の線維症において群差を明らかにしなかった（ｐ＝０．７９）。
考察
この研究は、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２の単回静脈注射が不全心臓の機能を増大したことを実証し、これは、心不全を処置するのに有益なパラクリン効果を有するペプチドをコードする長期発現ベクターの静脈内送達の実現可能性および有効性を実証するものであった。
心機能の２つの尺度は、重篤な機能障害性左心室を有する動物へのＩＶ ＡＡＶ８．ＵＣｎ２送達の５週間後のＬＶ機能の増大を確かにした。心エコー検査は、ＬＶ駆出率の増大、およびＬＶ体積の低減を示した（表１）。第二に、ＵＣｎ２遺伝子導入は、ピークＬＶ＋ｄＰ／ｄｔを増加させ、これはＬＶ収縮性機能の増強を示し、ＬＶ−ｄＰ／ｄｔを低減し、これはＬＶ拡張期機能の増強を示した（表３、図１５）。
ＬＶ ＥＦ変化の絶対的な程度は、たった８パーセント単位（ＨＦ：１２±１％；ＨＦ＋ＵＣｎ２：２０±４％）であったが、相対的増加は６７％であった。小さな絶対的な変化は、大きなサイズの梗塞を反映し、平均の無作為化前のＬＶ ＥＦは、両方の群において≦２０％であった。かかる大きな梗塞にも関わらず、ＵＣｎ２遺伝子導入は、ＬＶ腔拡張を減弱させ、ＥＦを増加させ、一方、食塩水で処置したマウスは、進行性ＬＶ腔拡張、さらにＬＶ ＥＦの悪化を示した。人は、ＬＶ自由壁の全体を実質的に表す、かかる大きな範囲の瘢痕に関連する問題を軽減するためのＵＣｎ２遺伝子導入を予測しないであろう。ＵＣｎ２遺伝子導入の心臓の利点は、現在のモデルにおいて、心室間隔壁を表す、ＬＶの生存可能な部分に限定されると予想される。特に、本発明者らは、駆出中に梗塞した壁のジスキネジアを観察したので、この状況における駆出率は、ＬＶ機能に対する利点を過小評価し得る。ピークＬＶ＋ｄＰ／ｄｔを使用したＬＶ収縮性機能の評価は、ＬＶ機能のより大きな絶対的な増大である、ピーク＋ＬＶ ｄＰ／ｄｔの３１２９ｍｍＨｇ／秒の増加、およびＵＣｎ２遺伝子導入により付与されるピーク−ｄＰ／ｄｔの１８５７ｍｍＨｇ／秒の増加を明らかにする。これらは、ピーク＋ＬＶ ｄＰ／ｄｔの２倍の増加、およびピーク−ｄＰ／ｄｔの１．６倍の増加を表す。臨床的な心不全におけるピークＬＶ＋ｄＰ／ｄｔの倍化は、ＬＶ収縮性機能を正常化する３７、３８。
現在の研究において示される通り、非鎮静下状態における心拍数および血圧は、正常マウス（２７）においてまたはＣＨＦを有するマウスにおいて、導入遺伝子ＵＣｎ２の持続した高レベルにも関わらず、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２の静脈内送達により影響されない。同様に、ＵＣｎ２およびストレスコピン（ＵＣｎ３に類似する）のペプチド注入の臨床試験において、心筋仕事量（rate-pressure product）は変化しない（９〜１１）。それ故、人は、ＵＣｎ２遺伝子導入と関連する心臓代謝性要求の増大を予測しないだろうが、確実にこれを知るためにより直接的な代謝性研究を行わなければならない。
本研究は、重篤な損なわれたおよび不全の心臓の状況でＡＡＶ８．ＵＣｎ２の静脈内送達の実現可能性および生理学的結果に焦点を当て、本発明者らは、明白な正の効果を見出した。本研究の主要な焦点ではないが、ＵＣｎ２遺伝子導入が有益な生理学的変化を惹起したメカニズムも調べた。
例えば、本発明者らが、正常な心臓を有するマウスにおいて先に報告２７した通り、本発明者らは、ＵＣｎ２遺伝子導入が、ａ）ＨＦマウスから単離した心筋細胞におけるピーク収縮期Ｃａ２＋トランジェント振幅の増加およびＣａ２＋減衰の速度の増加（図１６Ａ〜１６Ｄ）；ならびにｂ）ＳＥＲＣＡ２ａ発現の増加（図１６Ｅおよび１６Ｆ）と関連したことを見出した。ＬＶ ＳＥＲＣＡ２ａ発現の増加は、観察した（図１５）通り、ＬＶ収縮性機能および弛緩が増大するメカニズムをもたらす。ＳＥＲＣＡ２ａは、サイトゾルのＣａ２＋を筋小胞体に戻す。ＳＥＲＣＡ２ａの量の増加は、本発明者らが見出したものである（図１６Ｃおよび１６Ｄ）、より迅速なサイトゾルのＣａ２＋減衰を生じると予測され、その結果として、本発明者らがまた見出した（図１５Ｂ）通り、ＬＶ圧減衰の速度（ＬＶ−ｄＰ／ｄｔ）を増加させると予測される。
加えて、本発明者らは、観察した、ＵＣｎ２遺伝子導入の不全ＬＶの機能に対する有益な効果：Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）のＴｈｒ２８６リン酸化の低減、および心臓型ミオシン軽鎖キナーゼ（ｃＭＬＣＫ）のＬＶ発現の増加において機構的に重要である可能性がある２つのさらなるタンパク質のＬＶ発現における変化を見出した（図４）。ＣａＭＫＩＩ Ｔｈｒ２８６リン酸化。本発明者らのデータは、ＵＣｎ２遺伝子導入が、ＣａＭＫＩＩのＴｈｒ２８６リン酸化の低減と関連したことを示す（図１７Ｃ）。ＣａＭＫＩＩ発現および活性化は、心機能の重要な決定要因である３９。例えば、ＣａＭＫＩＩの心臓指向性発現は、結果として、マウスにおいて心不全を生じる４０。他は、マウスにおいて、ＣａＭＫＩＩ活性およびＭＩにより誘発された心不全における発現の増加を示した４１。これらの知見の臨床上の関連性は、ＬＶ ＣａＭＫＩＩの阻害が、不全ヒト心臓の機能を増大することを実証することにより、最近実証された４２。本発明者らは、ＣａＭＫＩＩのＴｈｒ２８６リン酸化の低減が、ＬＶ機能の観察した増大において機構的に重要であり得ることを予測するが、本発明者らは、ＵＣｎ２の増加がＴｈｒ２８６ ＣａＭＫＩＩリン酸化を低減する経路を決定することができなかったが、それは、進行中である培養した心筋細胞において焦点を当てた研究を必要とする。心臓型ミオシン軽鎖キナーゼ（ｃＭＬＣＫ）。本発明者らは、ＵＣｎ２遺伝子導入と関連するｃＭＬＣＫ発現の増加を見出した（図１７Ｄ）。ｃＭＬＣＫによる心臓型ミオシン軽鎖２ｖのリン酸化は、心筋細胞における架橋漸増の速度を増加させ、収縮性機能に影響する４３、４４。ｃＭＬＣＫのレベルの増加は、ＭＩにより誘発される心不全の状況でのＬＶ機能の増大と関連する４５。対照的に、ｃＭＬＣＫの欠失は、心臓の性能を低減する４６。残念なことに、ミオシン軽鎖２ｖリン酸化を評価するために利用可能な抗体は存在せず、故に、本研究において、ＵＣｎ２遺伝子導入と関連するｃＭＬＣＫの増加の生物学的重要性は、依然推測のままでなければならない。
ＵＣｎ２遺伝子導入は、ＬＶ圧発生のピーク速度（ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ；表３、および図１５）の倍化と関連した。この知見は、ＬＶ寸法および心エコー検査による機能の評価（表２）、Ｃａ２＋ハンドリングの増強（図３）、ならびにＳＥＲＣＡ２ａタンパク質発現の増加を含む、収縮性機能を増大すると予測されるＬＶのシグナル伝達変化（図１６および図１７）により支持された。単離した心筋細胞からｉｎ ｖｉｖｏ生理学まで広まったこれらの知見の一貫性のため、本発明者らは、ＬＶにおけるＢＮＰおよびＡＮＦ ｍＲＮＡの群差の非存在（表６）にあまり関心が無かった。おそらく、ＬＡにおける血漿レベルまたはＢＮＰ／ＡＮＦ発現は、ＬＶ ｍＲＮＡレベルが逃した（missed）群差を明らかにしただろう。ＬＶ収縮性機能の増大にも関わらず、全体のＬＶ自由壁の梗塞のため、ＡＮＦおよびＢＮＰ発現の進行中の刺激をもたらすための十分な持続したチャンバー拡大が存在した可能性もある。
本発明者らは、肺または肝臓重量において群差を認めなかった（表５）。肝臓重量は、正常マウスと比較して、心不全を有するマウスにおいて増加せず（２７）、故に、重篤な左心室（ＬＶ）不全にも関わらず、肝臓うっ血は存在しない。これがマウスにおいてＭＩにより誘発されたＣＨＦに固有であるかどうかは未知である。肺重量は、正常な年齢の一致するマウスに対して２３％増加した（２７）が、群差を示さなかった。本発明者らは、ＵＣｎ２遺伝子導入により付与されたＬＶ収縮性機能（ピーク＋ｄＰ／ｄｔ）の倍化（表３、および図１５）にも関わらず、処置の５週間後に持続性左側うっ血が存在していた可能性を推測する。
臨床適用。ＡＡＶ８の静脈内送達は、多くの臓器のトランスフェクションを可能にし、肝臓、骨格筋、および心臓において特に有効である４８。これらの臓器は、膨大な質量の組織を含み、それ故、大量の導入遺伝子ＵＣｎ２を放出することができるので、本発明者らが、ベクターの用量を減らすことを可能にする。実際に、１０倍少ないベクター用量（１匹のマウス当たり５×１０１０または２×１０１２ｇｃ／ｋｇ）が、ＬＶ＋ｄＰ／ｄの増加において依然有効である（２７）。血友病Ｂを有する被験体における臨床試験において、ヒト第ＩＸ因子をコードするＡＡＶ８の２×１０１２ｇｃ／ｋｇの用量が、安全にかつ有効に静脈内で送達された２。
本発明者らの知見を臨床適用まで解釈する際に考えるさらなる特性は、ＵＣｎ２発現を随意にオンにまたはオフにすることが可能である、制御された発現系の使用である５、６、９。本発明者らは、テトラサイクリンおよびラパマイシン制御系を使用してかかるＡＡＶ８ベクターをデザインし、これらの制御された発現ベクターを用いて前臨床研究を行っている。
ＬＶ Ｃａ２＋ハンドリングは、マウスにおいてとヒトにおいてで異なる４７が、ＨＦを有する患者におけるＵＣｎ２またはストレスコピン（ＵＣｎ３に類似する）のペプチド注入は、ＬＶ機能を増大する（９〜１１）。これがＣａ２＋ハンドリングを介してであるかどうかは、ヒトにおけるＵＣｎ２ペプチド注入前および後の心筋細胞または心筋層において、Ｃａ２＋トランジェントおよびＣａ２＋ハンドリングタンパク質を評価しなかったため、未知である。
最終的に、ここで、本発明者らは、ＵＣｎ２遺伝子導入が、重篤な不全心臓の機能を増大することを示したので、どのくらい長く作用が持続するか、およびそれが死亡率を低減するかどうかを決定することが重要である。良好な長期生存を伴うＣＨＦのあまり重篤でないモデルを使用したかかる研究を計画する。
これらのデータは、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２の単回静脈注射が、重篤な不全心臓の収縮期および拡張期両方の機能を増大することを実証するものである。ベクターの全身性送達は、導入遺伝子は心臓で発現されるが、循環中にも継続して放出され、それによって、そうでなければ可能でない持続した利点をもたらすことを保証する。パラクリン作用ペプチドのＩＶ注入と比較した遺伝子導入の他の利点は、カテーテルに基づく感染の低減、入院の必要がないこと、および低減されたコストを含む。
図の凡例−実施例２
図１４。ＡＡＶ８．ＣＢＡ．ＵＣｎ２マップおよび実験プロトコル
Ａ。ＡＡＶ８．ＣＢＡ．ＵＣｎ２ベクターマップ：ＩＴＲ、末端逆位配列；ＳＶｐＡ、ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のポリＡ；ＵＣｎ２、ウロコルチン−２；ＣＢＡ、ニワトリβ−アクチンプロモーター；ＣＭＶ．ｅｎ、ヒトサイトメガロウイルスエンハンサー。
Ｂ。実験プロトコル。正常マウスは、心筋梗塞（ＭＩ、近位の左冠動脈結紮）を経験して、ＨＦが誘発され、それを、ＭＩの３週間後に心エコー検査により評価した。次に、ＥＦ＜２５％を有するマウスは無作為化されて、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）またはＩＶ食塩水を受けた。５週間後、心エコー検査を使用して、ＬＶサイズおよび機能を評価した。ｉｎ ｖｉｖｏ生理学的研究を行い、ＬＶ圧発生の速度（ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ）および減衰の速度（ＬＶ−ｄＰ／ｄｔ）を評価し、ＬＶ収縮期および拡張期機能を評価した。ＬＶの横断面（中央乳頭レベル）は、梗塞が、温存された心室間隔壁のみを有するＬＶ自由壁の大部分を含み広範であることを示す。データ取得および分析は、群の処置に対して盲検であった。
図１５。Ｉｎ ＶｉｖｏのＬＶ機能
ＡおよびＢ。ＡＡＶ８．ＵＣｎ２（５×１０１１ｇｃ、ＩＶ）または食塩水（ＨＦ）の５週間後、ｉｎ ｖｉｖｏ研究を行い、ＬＶ圧発生の速度（ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ；Ａ）および減衰の速度（ＬＶ−ｄＰ／ｄｔ；Ｂ）を測定した。ＡＡＶ８．ＵＣｎ２は、遺伝子導入の５週間後に、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔおよびＬＶ−ｄＰ／ｄｔを増加させ、これは、ＵＣｎ２遺伝子導入がＬＶ収縮期機能を増大することを示している。
ＣおよびＤ。心拍数は、より高くなる傾向にあった（Ｄ）。ＬＶに発生した圧は、ＵＣｎ２遺伝子導入により増加した（Ｃ）。研究を群の正体の情報なしで行った。
Ｐ値はスチューデントｔ検定（対応のない、両側）に由来する。データは平均値±ＳＥを表し、棒中の数は群のサイズを示す。
図１６。心不全（ＨＦ）を有するマウス由来の心筋細胞におけるサイトゾルのＣａ２＋トランジェント
ＩＶ ＡＡＶ８．ＵＣｎ２ （ＨＦ＋ＵＣｎ２）またはＩＶ食塩水の５週間後。ＡおよびＢ。放出された基底Ｃａ２＋（収縮期−拡張期のＣａ２＋）は、ＨＦ＋ＵＣｎ２マウス由来の心筋細胞において増大した（ｐ＝０．０００１）。Ａ。それぞれの群における１つの心臓からの代表的なＩｎｄｏ−１Ｃａ２＋トランジェントの記録は、ＵＣｎ２遺伝子導入の５週間後に、心不全を有するマウスから単離した心筋細胞におけるＣａ２＋ピークの増加を示した。Ｂ。１群当たり３匹のマウスからの概略データを示す。ＣおよびＤ。Ｃａ２＋減衰までの時間（ｔ１／２、Ｔａｕ）は、ＵＣｎ２遺伝子導入の５週間後に、心不全を有するマウス由来の心筋細胞において短縮した。
Ｃ。それぞれの群における１つの心臓由来の心筋細胞からの代表的な正規化Ｃａ２＋トランジェント。Ｄ。１群当たり３匹のマウスからの概略データを示す。ＡおよびＣについて、それぞれの曲線は、それぞれの群からの１つの心臓由来の３０の心筋細胞の平均である。ＢおよびＤについて、１群当たり３匹の動物からの概略データは、１４４の個々の心筋細胞（８６、食塩水；６０、ＡＡＶ８．ＵＣｎ２）の分析を含む。ＢおよびＤについて、棒は平均値＋ＳＥを示し、棒中の数字は心筋細胞の数を示し、棒の上の数字はスチューデントｔ検定（対応のない、両側）からのｐ値を示す。
Ｅ。免疫ブロッティングデータ（下部パネル）の概略（上部パネル）は、ＵＣｎ２遺伝子導入が、正常マウス由来および心不全を有するマウス由来のＬＶにおいて、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を増加させたことを示す。ホスホランバン（ＰＬＢ）およびトロポニンＩ（ＴｎＩ）の発現ならびにリン酸化は影響されなかった。棒は平均値＋ＳＥを示し、棒中の数字は群のサイズを示し、棒の上の数字はスチューデントｔ検定（対応のない、両側対対照）からのものである。
図１７。心筋細胞ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル伝達。
ＬＶ試料（Ａ、Ｃ、Ｄ）、または心筋細胞（Ｂ）を、心不全（ＨＦ）を有するマウス、およびＡＡＶ８．ＵＣｎ２（ＵＣｎ２）を受けたＨＦを有するマウスから得た。未刺激（基底）状態において、およびイソプロテレノール（Ｉｓｏ、１０μＭ、１０分）での刺激後、ならびに別の実験において、β−アドレナリン作用受容体非依存性アデニル酸シクラーゼを刺激する水溶性フォルスコリン類似体であるＮＫＨ４７７（ＮＫＨ、１０μＭ、１０分）での刺激後、環状ＡＭＰおよびＰＫＡ活性を評価した。棒中の数は、群のサイズを示す。
Ａ。ｃＡＭＰ産生：基底、Ｉｓｏ、またはＮＫＨ４７７により刺激したｃＡＭＰ産生において群差を認めなかった。
Ｂ。ＰＫＡ活性：基底、Ｉｓｏ、またはＮＫＨ４７７により刺激した状態において、群差を認めなかった。
Ｃ。ＣａｍＫ ＩＩ発現およびリン酸化：ＵＣｎ２遺伝子導入は、ＣａｍＫ ＩＩのＴｈｒ２８６リン酸化の低減と関連した（左のパネル、ＧＡＰＤＨに対して正規化）。総ＣａｍＫ ＩＩは変化しなかった。
Ｄ。心臓型ミオシン軽鎖キナーゼ：ＵＣｎ２遺伝子導入は、心臓型ミオシン軽鎖キナーゼ（ｃＭＬＣＫ）タンパク質の増加と関連した（左のパネル、ＧＡＰＤＨに対して正規化）。
全てのグラフにおいて、棒は平均値＋ＳＥを示し、棒中の数は群のサイズを示し、棒の上の数字はスチューデントｔ検定（対照群に対する、対応のない両側）からのものである。
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本発明の多数の実施形態を説明した。それでもやはり、様々な変更形態を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行うことができることは、理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。
本明細書において引用するすべての出版物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に明示的に援用されている。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
個体または患者において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）；２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）；または２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）における糖尿病に関連する心機能不全を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すための方法であって、
（ａ）（ｉ）転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸もしくは遺伝子；またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスまたは等価物、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物もしくはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてもしくはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物を提供する工程；ならびに
（ｉｉ）転写制御配列に作動的に連結された、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージ、または該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物を、該細胞、またはそれを必要とする個体もしくは患者に投与または送達する工程を含み、
それによって、該個体または患者においてうっ血性心不全（ＣＨＦ）；２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）；または２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）における該糖尿病に関連する心機能不全を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、方法；
（ｂ）該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスまたは等価物が、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター、
ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９、
アカゲザル由来ＡＡＶ、またはアカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
臓器指向性ＡＡＶ、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ
であるか、またはこれを含み、
場合により、該ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作されている、ならびに
場合により、該ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作されている、（ａ）に記載の方法；
（ｃ）該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結されている、（ａ）に記載の方法；
（ｄ）該制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結されている、（ｃ）に記載の方法；
（ｅ）転写制御配列に作動的に連結された、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージ、または該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物の、それを必要とする個体または患者への投与が、結果として、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３タンパク質を血流もしくは全身循環に放出し、または該細胞において該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３タンパク質の増加もしくは持続した発現を生じ、
場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質の該放出または増加もしくは持続した発現が、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結された、誘導性プロモーターの活性化、またはリプレッサーの抑制解除に依存する、（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の方法；あるいは
（ｆ）ｉｎ ｖｉｖｏでのウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドレベルの増加に対して応答性の該疾患または状態が、心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患、機能不全、もしくはアポトーシス；肺高血圧；心臓、皮膚、肝臓、肺、筋肉、神経、脳、もしくは腎臓の疾患；または血友病もしくは血友病Ｂである、（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の方法
を含む、方法。
（項目２）
（ａ）前記転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子；または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、経口により、筋肉内（ＩＭ）注射により、静脈内（ＩＶ）注射により、皮下（ＳＣ）もしくは皮内注射により、髄腔内注射により、動脈内（ＩＡ）注射により、冠動脈内注射により、吸入により、エアロゾルにより、または微粒子銃粒子送達システムにより、または「遺伝子ガン」、エアピストル、もしくはＨＥＬＩＯＳ（商標）遺伝子ガン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用することにより、それを必要とする前記個体または患者に投与されるか、または送達され；あるいは
（ｂ）前記転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子；または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物を、前記血流に隣接しているまたは該血流が流れ込む該体内の任意の組織または流体スペースへ導入することによって、それを必要とする前記個体または患者に投与するか、または送達し、それにより、前記コードされたタンパク質が、該組織中の細胞から分泌され、該血流に放出される、
項目１に記載の方法。
（項目３）
（ａ）前記個体、患者または被験体が、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導するか、または該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導するプロモーター（例えば、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子に作動可能に連結された）を誘導するか、または活性化する刺激物またはシグナルを投与され；
（ｂ）該個体、患者、または被験体が、プロモーター、場合により、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子特異的プロモーター（例えば、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子に作動可能に連結された）のアクチベーターの合成を誘導する刺激物またはシグナルを投与され；
（ｃ）該個体、患者または被験体が、該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子特異的プロモーターの天然または合成アクチベーターの合成を誘導する刺激物またはシグナルを投与され、
場合により、該天然アクチベーターが内因性転写因子であり；
（ｄ）該合成アクチベーターが、内因性または外因性標的遺伝子を特異的および選択的にオンにするようデザインされたジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質であり、場合により、該内因性標的が、遺伝子ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子のアクチベーター、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子に作動的に連結されたプロモーターのアクチベーターである、（ｃ）に記載の方法；
（ｅ）該刺激物またはシグナルが、生物学的、光、化学物質または医薬刺激物またはシグナルを含む、（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の方法；
（ｆ）該個体、患者または被験体が、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の転写後アクチベーター、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する（urocortin 3-e7xpressing）核酸もしくは遺伝子に作動的に連結したプロモーターのアクチベーターの発現を刺激するまたは誘導する刺激物またはシグナルを投与され；あるいは
（ｇ）該個体、患者または被験体が、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の転写リプレッサーまたは転写後リプレッサーの阻害を阻害するまたは誘導する刺激物またはシグナルを投与される、
項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導するか、または該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子に作動的に連結した前記制御性もしくは誘導性プロモーターの発現を誘導する、前記化学物質または医薬が、経口抗生物質、ドキシサイクリンもしくはラパマイシンであるか；またはドキシサイクリンを使用したｔｅｔ−制御系を使用して、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、またはその等価物の発現を誘導する、項目５に記載の方法。
（項目５）
前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、液体、ゲル、ヒドロゲル、粉末、または水性もしくは食塩水製剤に製剤化される、項目１から４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、ベシクル、リポソーム、ナノ粒子、またはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）中に製剤化される、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、単離されたまたは培養された細胞中で製剤化され、場合により、該細胞が、哺乳動物細胞、心細胞、またはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞である、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、医薬または無菌として製剤化される、項目１から７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、製造品、人工臓器、またはインプラントと共に、それの上で、またはそれと併せて製剤化されるかまたは送達される、項目１から８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで発現する、項目１から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
項目１から１０のいずれかに記載の方法の実施を含む、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３応答性病理、疾患、病気または状態に対して個体または患者を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法。
（項目１２）
項目１から１１のいずれかに記載の方法を実施する工程を含む、糖尿病に関連する心収縮機能不全；糖尿病に関連するうっ血性心不全（ＣＨＦ）；糖尿病に関連する心臓線維症；糖尿病に関連する心筋細胞の疾患、機能不全もしくはアポトーシス；糖尿病に関連する肺高血圧を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法。
（項目１３）
患者または個体において糖尿病または前糖尿病を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法であって、
（ａ）項目１から１１のいずれかに記載の方法を実施する工程；または
（ｂ）ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチド、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、メッセージまたは転写産物を、それを必要とする個体または患者に投与する工程を含み、
場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ペプチドまたはポリペプチドが、単離された、組み換え、合成および／またはペプチドミメティックのペプチドもしくはポリペプチド、またはそのバリアントであり、
それによって、該患者または個体において該糖尿病または前糖尿病を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、方法。
（項目１４）
患者または個体において肥満を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法であって、
（ａ）項目１から１１のいずれかに記載の方法を実施する工程；または
（ｂ）ウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）ペプチドもしくはポリペプチド、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、メッセージもしくは転写産物を、それを必要とする個体または患者に投与する工程を含み、
場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ペプチドまたはポリペプチドが、単離された、組み換え、合成および／もしくはペプチドミメティックのペプチドもしくはポリペプチド、またはそのバリアントであり、
それによって、該患者または個体において該肥満を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、方法。
（項目１５）
前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ウロコルチン２（ＵＣｎ−２）ペプチドもしくはポリペプチドが、ベシクル、リポソーム、ナノ粒子、もしくはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）に製剤化されるか、またはベシクル、リポソーム、ナノ粒子、もしくはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）として製剤化されるか、あるいは経口投与、筋肉内（ＩＭ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、皮下（ＳＣ）もしくは皮内注射、髄腔内注射、動脈内（ＩＡ）注射、冠動脈内注射、吸入、またはエアロゾルによる投与のために製剤化される、項目１５から１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
個体または患者において２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患、機能不全もしくはアポトーシス；肺高血圧；心臓、皮膚、肝臓、肺、筋肉、神経、脳もしくは腎臓の疾患；または血友病もしくは血友病Ｂを処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
患者または個体において糖尿病または前糖尿病を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、あるいは
患者または個体において肥満を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、
のための医薬の製造における、あるいは
それらであるか、またはそれらを含む使用における、
− 転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；
− ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは
− ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物
の使用であって、
場合により、該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター、
ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、
アカゲザル由来ＡＡＶ、または該アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
臓器指向性ＡＡＶ、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ
であるか、あるいはそれを含み、
場合により、該ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作される、ならびに、
場合により、該ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される、
場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結される；
場合により、該制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結される、使用。
（項目１７）
転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；
ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは、
ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物
を、被験体の細胞に、またはそれを必要とする被験体に、提供することおよび投与することまたは送達することを含む、
個体または患者において２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患、機能不全もしくはアポトーシス；肺高血圧；心臓、皮膚、肝臓、肺、筋肉、神経、脳もしくは腎臓の疾患；または血友病もしくは血友病Ｂを処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
患者または個体において糖尿病または前糖尿病を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、または
患者または個体において肥満を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること
のための医薬の製造における使用のための、あるいは、
それらのことにおける使用のための、
転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；あるいは、
ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは、
ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物、
ここで、
場合により、該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター、
ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、
アカゲザル由来ＡＡＶ、または該アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
臓器指向性ＡＡＶ、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ
であるか、またはそれを含み、
場合により、該ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作される、ならびに、
場合により、該ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される、
場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結される；
場合により、該制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結される
。
（項目１８）
うっ血性心不全（ＣＨＦ）またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）の症状を処置する、改善する、または保護する（予防する）ことを必要とする被験体または個体において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）の症状を処置する、改善する、または保護する（予防する）方法であって、
（ａ）それを必要とする被験体または個体にウロコルチン２ポリペプチドをコードする核酸配列を送達する工程を含み、
それによって、それを必要とする該被験体または個体においてうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置するまたは改善する、方法；
（ｂ）該核酸配列がベクター中にある（例えば、ベクターに含有される）、（ａ）に記載の方法；
（ｃ）該ベクターがウイルスベクターである、（ｂ）に記載の方法；
（ｄ）該ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、（ｃ）に記載の方法；
（ｅ）該ＡＡＶが血清型ＡＡＶ８である、（ｄ）に記載の方法；
（ｆ）それを必要とする該被験体または個体が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する、（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の方法；あるいは
（ｇ）該核酸配列が静脈注射（ＩＶ）によりまたは筋肉内に投与される、（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載の方法
を含む、方法。
（項目１９）
前記核酸配列がベクター中にある（例えば、ベクターに含有される）、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ベクターがウイルスベクターである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ＡＡＶが血清型ＡＡＶ８である、項目２２に記載の方法。
（項目２３）
それを必要とする前記被験体または個体が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記核酸配列が静脈注射（ＩＶ）によりまたは筋肉内に投与される、項目１８に記載の方法。

Claims (24)

  1. 個体または患者において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）；２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）；または２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）における糖尿病に関連する心機能不全を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すための方法であって、
    （ａ）（ｉ）転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸もしくは遺伝子；またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスまたは等価物、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物もしくはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてもしくはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物を提供する工程；ならびに
    （ｉｉ）転写制御配列に作動的に連結された、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージ、または該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物を、該細胞、またはそれを必要とする個体もしくは患者に投与または送達する工程を含み、
    それによって、該個体または患者においてうっ血性心不全（ＣＨＦ）；２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）；または２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）における該糖尿病に関連する心機能不全を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、方法；
    （ｂ）該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスまたは等価物が、
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター、
    ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９、
    アカゲザル由来ＡＡＶ、またはアカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
    ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
    臓器指向性ＡＡＶ、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ
    であるか、またはこれを含み、
    場合により、該ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作されている、ならびに
    場合により、該ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作されている、（ａ）に記載の方法；
    （ｃ）該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結されている、（ａ）に記載の方法；
    （ｄ）該制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
    場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結されている、（ｃ）に記載の方法；
    （ｅ）転写制御配列に作動的に連結された、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージ、または該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物の、それを必要とする個体または患者への投与が、結果として、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３タンパク質を血流もしくは全身循環に放出し、または該細胞において該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３タンパク質の増加もしくは持続した発現を生じ、
    場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３タンパク質の該放出または増加もしくは持続した発現が、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結された、誘導性プロモーターの活性化、またはリプレッサーの抑制解除に依存する、（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の方法；あるいは
    （ｆ）ｉｎ ｖｉｖｏでのウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドレベルの増加に対して応答性の該疾患または状態が、心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患、機能不全、もしくはアポトーシス；肺高血圧；心臓、皮膚、肝臓、肺、筋肉、神経、脳、もしくは腎臓の疾患；または血友病もしくは血友病Ｂである、（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の方法
    を含む、方法。
  2. （ａ）前記転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子；または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、経口により、筋肉内（ＩＭ）注射により、静脈内（ＩＶ）注射により、皮下（ＳＣ）もしくは皮内注射により、髄腔内注射により、動脈内（ＩＡ）注射により、冠動脈内注射により、吸入により、エアロゾルにより、または微粒子銃粒子送達システムにより、または「遺伝子ガン」、エアピストル、もしくはＨＥＬＩＯＳ（商標）遺伝子ガン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用することにより、それを必要とする前記個体または患者に投与されるか、または送達され；あるいは
    （ｂ）前記転写制御配列に作動的に連結された、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸もしくは遺伝子；または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスもしくは等価物を、前記血流に隣接しているまたは該血流が流れ込む該体内の任意の組織または流体スペースへ導入することによって、それを必要とする前記個体または患者に投与するか、または送達し、それにより、前記コードされたタンパク質が、該組織中の細胞から分泌され、該血流に放出される、
    請求項１に記載の方法。
  3. （ａ）前記個体、患者または被験体が、前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導するか、または該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導するプロモーター（例えば、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子に作動可能に連結された）を誘導するか、または活性化する刺激物またはシグナルを投与され；
    （ｂ）該個体、患者、または被験体が、プロモーター、場合により、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子特異的プロモーター（例えば、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸または遺伝子に作動可能に連結された）のアクチベーターの合成を誘導する刺激物またはシグナルを投与され；
    （ｃ）該個体、患者または被験体が、該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子特異的プロモーターの天然または合成アクチベーターの合成を誘導する刺激物またはシグナルを投与され、
    場合により、該天然アクチベーターが内因性転写因子であり；
    （ｄ）該合成アクチベーターが、内因性または外因性標的遺伝子を特異的および選択的にオンにするようデザインされたジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質であり、場合により、該内因性標的が、遺伝子ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子のアクチベーター、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子に作動的に連結されたプロモーターのアクチベーターである、（ｃ）に記載の方法；
    （ｅ）該刺激物またはシグナルが、生物学的、光、化学物質または医薬刺激物またはシグナルを含む、（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の方法；
    （ｆ）該個体、患者または被験体が、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の転写後アクチベーター、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する（urocortin 3-e7xpressing）核酸もしくは遺伝子に作動的に連結したプロモーターのアクチベーターの発現を刺激するまたは誘導する刺激物またはシグナルを投与され；あるいは
    （ｇ）該個体、患者または被験体が、ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の転写リプレッサーまたは転写後リプレッサーの阻害を阻害するまたは誘導する刺激物またはシグナルを投与される、
    請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子の発現を誘導するか、または該ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子に作動的に連結した前記制御性もしくは誘導性プロモーターの発現を誘導する、前記化学物質または医薬が、経口抗生物質、ドキシサイクリンもしくはラパマイシンであるか；またはドキシサイクリンを使用したｔｅｔ−制御系を使用して、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、またはその等価物の発現を誘導する、請求項５に記載の方法。
  5. 前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、液体、ゲル、ヒドロゲル、粉末、または水性もしくは食塩水製剤に製剤化される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、ベシクル、リポソーム、ナノ粒子、またはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）中に製剤化される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、単離されたまたは培養された細胞中で製剤化され、場合により、該細胞が、哺乳動物細胞、心細胞、またはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、医薬または無菌として製剤化される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、製造品、人工臓器、またはインプラントと共に、それの上で、またはそれと併せて製剤化されるかまたは送達される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３を発現する核酸もしくは遺伝子、または前記発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、もしくは等価物が、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで発現する、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
  11. 請求項１から１０のいずれかに記載の方法の実施を含む、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３応答性病理、疾患、病気または状態に対して個体または患者を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法。
  12. 請求項１から１１のいずれかに記載の方法を実施する工程を含む、糖尿病に関連する心収縮機能不全；糖尿病に関連するうっ血性心不全（ＣＨＦ）；糖尿病に関連する心臓線維症；糖尿病に関連する心筋細胞の疾患、機能不全もしくはアポトーシス；糖尿病に関連する肺高血圧を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法。
  13. 患者または個体において糖尿病または前糖尿病を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法であって、
    （ａ）請求項１から１１のいずれかに記載の方法を実施する工程；または
    （ｂ）ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ペプチドもしくはポリペプチド、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、メッセージまたは転写産物を、それを必要とする個体または患者に投与する工程を含み、
    場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ペプチドまたはポリペプチドが、単離された、組み換え、合成および／またはペプチドミメティックのペプチドもしくはポリペプチド、またはそのバリアントであり、
    それによって、該患者または個体において該糖尿病または前糖尿病を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、方法。
  14. 患者または個体において肥満を処置する、改善するまたは保護する（予防する）方法であって、
    （ａ）請求項１から１１のいずれかに記載の方法を実施する工程；または
    （ｂ）ウロコルチン−２（ＵＣｎ−２）ペプチドもしくはポリペプチド、またはウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、メッセージもしくは転写産物を、それを必要とする個体または患者に投与する工程を含み、
    場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ペプチドまたはポリペプチドが、単離された、組み換え、合成および／もしくはペプチドミメティックのペプチドもしくはポリペプチド、またはそのバリアントであり、
    それによって、該患者または個体において該肥満を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、方法。
  15. 前記ウロコルチン２および／もしくはウロコルチン３ウロコルチン２（ＵＣｎ−２）ペプチドもしくはポリペプチドが、ベシクル、リポソーム、ナノ粒子、もしくはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）に製剤化されるか、またはベシクル、リポソーム、ナノ粒子、もしくはナノ脂質粒子（ＮＬＰ）として製剤化されるか、あるいは経口投与、筋肉内（ＩＭ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、皮下（ＳＣ）もしくは皮内注射、髄腔内注射、動脈内（ＩＡ）注射、冠動脈内注射、吸入、またはエアロゾルによる投与のために製剤化される、請求項１５から１４のいずれかに記載の方法。
  16. 個体または患者において２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
    心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患、機能不全もしくはアポトーシス；肺高血圧；心臓、皮膚、肝臓、肺、筋肉、神経、脳もしくは腎臓の疾患；または血友病もしくは血友病Ｂを処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
    患者または個体において糖尿病または前糖尿病を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、あるいは
    患者または個体において肥満を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、
    のための医薬の製造における、あるいは
    それらであるか、またはそれを含む使用における、
    − 転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；
    − ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは
    − ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物
    の使用であって、
    場合により、該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が、
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター、
    ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、
    アカゲザル由来ＡＡＶ、または該アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
    ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
    臓器指向性ＡＡＶ、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ
    であるか、あるいはそれを含み、
    場合により、該ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作される、ならびに、
    場合により、該ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される、
    場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物もしくはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結される；
    場合により、該制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
    場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結される、使用。
  17. 転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；
    ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは、
    ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物
    を、被験体の細胞に、またはそれを必要とする被験体に、提供することおよび投与することまたは送達することを含む、
    個体または患者において２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
    心収縮機能不全；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心臓線維症；心筋細胞の疾患、機能不全もしくはアポトーシス；肺高血圧；心臓、皮膚、肝臓、肺、筋肉、神経、脳もしくは腎臓の疾患；または血友病もしくは血友病Ｂを処置する、改善するまたは保護する（予防する）、その進行を遅らせるまたは元に戻すこと、
    患者または個体において糖尿病または前糖尿病を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること、または
    患者または個体において肥満を処置する、改善する、または保護するもしくは予防すること
    のための医薬の製造における使用のための、あるいは、
    それらのことにおける使用のための、
    転写制御配列に作動的に連結された、ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸または遺伝子；あるいは、
    ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸または遺伝子をその中に含有している発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物；あるいは、
    ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドを発現する核酸、転写産物またはメッセージ、ならびに該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージを細胞においてまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物、
    ここで、
    場合により、該発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物が、
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター、
    ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、
    アカゲザル由来ＡＡＶ、または該アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
    ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
    臓器指向性ＡＡＶ、場合により、肝臓指向性または骨格筋指向性ＡＡＶ
    であるか、またはそれを含み、
    場合により、該ＡＡＶが、野生型（ｗｔ）ＡＡＶを許容しない特異的細胞タイプに標的化することにおける効率を増大させるように、および／または対象となる細胞タイプのみを感染させることでの効力を好転させるように操作される、ならびに、
    場合により、該ハイブリッドＡＡＶが、１）カプシド転換、２）カプシド表面への二重特異性抗体の吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む１または複数の改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される、
    場合により、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３をコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージが、制御性または誘導性転写制御配列に作動的に連結される；
    場合により、該制御性または誘導性転写制御配列が、制御性または誘導性プロモーターであり、
    場合により、転写および／または翻訳の正の（アクチベーター）および／または負の（リプレッサー）モジュレーターが、該ウロコルチン２および／またはウロコルチン３ポリペプチドをコードする核酸、遺伝子、転写産物またはメッセージに作動可能に連結される
    。
  18. うっ血性心不全（ＣＨＦ）またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）の症状を処置する、改善する、または保護する（予防する）ことを必要とする被験体または個体において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）の症状を処置する、改善する、または保護する（予防する）方法であって、
    （ａ）それを必要とする被験体または個体にウロコルチン２ポリペプチドをコードする核酸配列を送達する工程を含み、
    それによって、それを必要とする該被験体または個体においてうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置するまたは改善する、方法；
    （ｂ）該核酸配列がベクター中にある（例えば、ベクターに含有される）、（ａ）に記載の方法；
    （ｃ）該ベクターがウイルスベクターである、（ｂ）に記載の方法；
    （ｄ）該ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、（ｃ）に記載の方法；
    （ｅ）該ＡＡＶが血清型ＡＡＶ８である、（ｄ）に記載の方法；
    （ｆ）それを必要とする該被験体または個体が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する、（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の方法；あるいは
    （ｇ）該核酸配列が静脈注射（ＩＶ）によりまたは筋肉内に投与される、（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載の方法
    を含む、方法。
  19. 前記核酸配列がベクター中にある（例えば、ベクターに含有される）、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ＡＡＶが血清型ＡＡＶ８である、請求項２２に記載の方法。
  23. それを必要とする前記被験体または個体が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する、請求項１８に記載の方法。
  24. 前記核酸配列が静脈注射（ＩＶ）によりまたは筋肉内に投与される、請求項１８に記載の方法。
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