CN101188940A

CN101188940A - 用于治疗糖尿病的组合物和方法

Info

Publication number: CN101188940A
Application number: CNA2006800078029A
Authority: CN
Inventors: 尹址垣
Original assignee: BIOTECH INST FOR INTERNAT INNO
Current assignee: BIOTECH INST FOR INTERNAT INNO
Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2006-02-03
Publication date: 2008-05-28

Abstract

本发明提供了一种载体，该载体中含有可操纵性连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列的核酸，其中BTC的表达产生分泌的成熟BTC。本发明还提供一种治疗或预防糖尿病的方法，其包括施加有效量的含有所述载体的病毒颗粒。本发明也提供一种如下的载体，其含有可操纵性连接着巨细胞病毒(CMV)启动子和增强子区域、β－珠蛋白嵌合内含子、白蛋白前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及SV40多聚腺苷酸化信号序列的核酸，其中BTC的表达产生分泌的成熟BTC。本发明另外提供含有本发明载体的宿主细胞。

Description

用于治疗糖尿病的组合物和方法

技术领域

本发明主要涉及治疗和预防糖尿病的方法，更具体地，涉及用于治疗的β细胞的再生和新生(neogenesis)。

背景技术

在具有正常血液葡萄糖调控的个体中，胰腺激素胰岛素响应于升高的血糖水平而分泌。通常在饭后出现血液葡萄糖增加，其是由于胰岛素作用在外周组织比如骨骼肌和脂肪上而产生的。胰岛素刺激这些外周组织的细胞活跃地从血液中摄取葡萄糖并将其转化成储藏的形式。这一过程也被称为葡萄糖处置(glucose disposal)。个体在一天中的血液葡萄糖水平从低到正常再到高发生变化，其取决于此人是处于禁食状态、中间状态、还是摄食状态。这些水平也分别被称为低血糖、正常血糖、和高血糖。在糖尿病患者个体中，由于胰岛素分泌的缺陷或者作用的缺陷，这些葡萄糖动态平衡方面的变化失调，导致了慢性的高血糖症。

糖尿病是一种常见疾病，其发病率约为4-5％。糖尿病发生的风险随体重的增加而增加，多达90％的成年型糖尿病患者是肥胖的。因此，由于肥胖成年人的高出现率，成年型糖尿病患者的发病率在世界范围内正在升高。糖尿病分为三个主要类型。II型糖尿病是一种类型，也被称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)或者成年型糖尿病。I型糖尿病是第二种类型，其被称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)。第三种糖尿病是遗传性的，其是由于控制胰岛β细胞功能的基因发生突变造成的。尽管胰岛素的诊断基于葡萄糖检测，对所有患者进行准确分类却不总是可行的。II型糖尿病在成人中更加普遍，而I型糖尿病在儿童和十几岁的青少年中占主要。

I型和II型糖尿病都与预期寿命的缩短相关，并且与其它并发症比如心血管疾病和动脉硬化相关。为预防后期并发症，糖尿病的长期处置经常包括胰岛素治疗，而无论患者分类是I型还是II型。I型糖尿病是自身免疫性疾病，其与产生胰岛素的胰腺β细胞的几乎完全丧失有关。β细胞的这种丧失导致终生的胰岛素依赖。I型糖尿病可发生在任何年龄，并且据估计在所有剖宫产新生儿中有约0.3-1％在他们的一生中会出现此疾病。

治疗I型糖尿病和在一定程度上治疗II型糖尿病的普遍使用的方法在传统上由胰岛素维持疗法组成。此疗法的最简单的形式需要在饭后或者一天中以有规律的间隔时间，将纯化的或重组的胰岛素注射到患者体内，以维持正常的血液葡萄糖水平。这些注射最好需要以每天4次的频率进行。尽管上述治疗方法给患者提供了一些益处，但是胰岛素治疗的这种方法仍然受到对血液葡萄糖控制不足的困扰，并且需要患者极大的依从。

I型糖尿病的另一个治疗方法包括使用比如胰岛素泵的装置，其使得可以定期递送胰岛素。此方法对于上文描述的方法是优选的，因为不需要经常的注射。但是，胰岛素泵疗法的使用也有缺陷，因为其仍需要每隔三天替换一次针头。类似于胰岛素维持疗法，胰岛素泵方法也不能达到最优的葡萄糖调控，因为胰岛素的递送不是根据血液葡萄糖水平的变化来调控的。因此这些治疗糖尿病的方法是繁琐且不足的。另外，这些方法对于平均成人寿命的时间也不是完全有效的，或者显示出对于预防此疾病是有效的。

已经尝试了用于代替生物活性胰岛素进入糖尿病患者个体的多种细胞治疗方法。这些包括基因疗法、免疫疗法和人工β细胞的应用。用于胰岛素或其它多肽表达的体内基因疗法包括在动物模型中肝脏靶向的病毒介导的转导。但是，这些方法不提供葡萄糖调控的胰岛素递送，它们也不能恢复或再生产生胰岛素的β细胞，并且在患者中的应用是有限的。

对于胰岛β细胞的遗传修饰和生成人工β细胞是通过细胞疗法治疗糖尿病的方法。为表达胰岛素的异种移植以及甚至同种异体细胞递送需要细胞包囊化以防止宿主免疫应答，以及已经确定了与细胞存活和持续胰岛素递送有关的问题。也尝试了胰腺和胰岛移植作为对糖尿病的治疗。此治疗的应用显示出有限的成功，这是因为每个接受者需要从2-5个成人供体中获得匹配的组织。此方法也难以成功，部分是由于所移植的组织无法维持正常的葡萄糖调控的胰岛素分泌，也无法在一个合理的时间段内保持活力。

因此，需要有简便且更有效的可调节糖尿病患者个体中葡萄糖动态平衡、从而恢复生成胰岛素的β细胞的生理能力的方法。本发明满足了这一需求，同时也提供了相关的优点。

发明内容

本发明提供了一种含有核酸的载体，该核酸可操作性地连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(betacellulin，BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列，其中BTC的表达产生分泌的成熟BTC。也提供一种含有核酸的载体，该核酸可操作性地连接着巨细胞病毒(CMV)启动子以及增强子区域、β-珠蛋白嵌合内含子、白蛋白前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及SV40多聚腺苷酸化信号序列，其中BTC的表达产生分泌的成熟BTC。也提供含有本发明载体的宿主细胞。另外提供了治疗或预防糖尿病的方法。该方法包括对个体施用有效量的带有载体的病毒颗粒，该载体表达分泌的成熟人β细胞素(BTC)或者其功能性片段，所述载体含有这样的核酸，该核酸可操作性地连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(betacellulin，BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列。

附图说明

图1显示在STZ诱导的糖尿病NOD.scid和Balb/c小鼠中，通过全身施用rAd-CMV-BTC使得糖尿病好转。

图2显示通过rAd-CMV-BTC使糖尿病好转，其原因在于β细胞量和胰岛素增加。

图3显示ErbB-2参与了通过rAd-CMV-BTC达到的糖尿病的好转。

图4显示在使用rAd-CMV-BTC治疗的自身免疫性糖尿病NOD小鼠中糖尿病好转。

具体实施方式

本发明涉及一种用于在体内分泌治疗性多肽的重组载体，也涉及治疗或预防糖尿病的方法。所述载体对于表达和分泌用于治疗糖尿病的人β细胞素(BTC)是特别有用的。本发明的方法涉及将上述编码可分泌性BTC的重组载体导入到糖尿病患者体内，用以再生或新生生成胰岛素的胰岛β细胞，以及恢复葡萄糖动态平衡。所述载体以及其在糖尿病治疗中应用的优点是BTC经分泌进入细胞外环境，在此处它可通过它正常的细胞信号通路产生作用。如此的体内分泌使得患者的糖尿病好转或者在怀疑具有糖尿病发病风险的个体体内进行预防。

在一个实施方案中，本发明涉及表达人β细胞素(BTC)的腺病毒载体。该腺病毒载体包含巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子和BTC编码区域5’端的增强子区域、β-珠蛋白嵌合内含子、和白蛋白前导序列，以促进BTC的分泌。定位于BTC编码区域3’端的是SV40多聚腺苷酸化信号序列。编码成熟BTC的BTC[1-80]cDNA被插在5’和3’表达和调控区之间。

在另一个实施方案中，本发明涉及通过施用含有融合了白蛋白前导序列的人BTC cDNA的重组腺病毒载体来治疗糖尿病。BTC的分泌性表达使得糖尿病在两周内完全好转，而使用免疫调节物治疗的自身免疫性糖尿病NOD小鼠保持正常血糖超过一百天。糖尿病的好转是由于胰腺中BTC介导的β细胞再生，并且所述好转通过抑制ErbB-2受体而被消除，该受体是BTC的配体。

如本文所使用的，术语“糖尿病(diabetes)”意指已知为糖尿病(diabetes mellitus)的糖尿病病症。糖尿病是慢性疾病，其特征为胰岛素的相对或者绝对缺乏，导致了葡萄糖不耐性。该术语的意思包含了所有类型的糖尿病，包括，例如I型、II型以及遗传性糖尿病。I型糖尿病也被称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，其还包含例如青少年糖尿病。I型主要是由于胰腺β细胞的破坏所致。II型糖尿病也被称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)，其特征部分地在于餐后的胰岛素释放减少。胰岛素抵抗也可能是导致II型糖尿病发生的因素。遗传性糖尿病是由于突变造成的，该突变扰乱了β细胞的功能和调控。

糖尿病的特征在于禁食时血液葡萄糖的水平大于或等于约140mg/dl或者血浆葡萄糖水平大约或等于约200mg/dl，此评定是在口服约75g的葡萄糖负载量之后约2个小时作出的。术语“糖尿病”也意指包括具有高血糖的个体，包含慢性高血糖和削弱的葡萄糖耐受性。高血糖个体中的血浆葡萄糖水平包括，例如，葡萄糖浓度高于正常值，如通过可靠的诊断指标所确定的。这些高血糖个体具有发展出明显糖尿病临床症状的风险，或倾向于此。

如本文所使用的，术语“治疗”意为改善糖尿病的指示性临床症状。临床症状的改善包括，例如，在所治疗的个体中，相对于治疗之前的水平或者相对于患有糖尿病的个体，其血液葡萄糖水平下降或者葡萄糖从血液中清除的速率上升。术语“治疗”也包含在患有失调性高血糖的个体中诱导出正常血糖应答。正常血糖指临床上确立为正常的，或者在低血糖范围以上、高血糖范围以下的血液葡萄糖水平范围。因此，正常血糖应答指刺激葡萄糖摄入以降低血浆葡萄糖浓度到正常水平。对于大多数成年人，这一水平对应的浓度范围是约60-105mg/dL血液葡萄糖，优选约70-100mg/dL之间，但是取决于例如个体的性别、年龄、体重、饮食以及整体健康状况，在个体间可有所变化。对糖尿病个体的有效治疗将是例如，个体高血糖或升高的血液葡萄糖水平，降低到标准或正常血糖水平，此降低的直接原因是胰岛素的分泌。作为替代的，有效治疗应该是禁食时血液葡萄糖降低到低于或等于约140mg/dL的水平。

术语“治疗”也意指包括与糖尿病相关的病理状况或慢性并发症严重程度的降低。这些病理状况或慢性并发症被列于表1，包括例如肌肉萎缩、酮酸中毒、糖尿、多尿症、多饮、糖尿病微血管病或者小血管病、动脉粥样硬化血管病或者大血管病、神经病和白内障。

表1.与糖尿病有关的病理状况

肾脏

肾小球微血管病

弥漫性肾小球硬化症

结节性肾小球硬化症(基-威病(Kimmel-stiel-Wilson disease))

尿路感染

急性肾盂肾炎

肾衰竭

坏死性乳头炎

气性肾盂肾炎

糖原性肾病(阿-埃损伤)

眼

视网膜病

非增殖性视网膜病：毛细血管微动脉瘤、视网膜水肿渗出、和出血

增殖性视网膜病：小血管增生

视力丧失

出血性纤维化、视网膜脱落

白内障

晶状体渗透压改变造成的暂时性屈光不正

虹膜中血管增生导致的青光眼

感染

神经系统

脑血管动脉粥样硬化病：中风、死亡

外周神经病：外周感觉神经和运动神经、颅神经、自主神经

皮肤

感染：毛囊炎导致痈

糖尿病性脂性渐进性坏死：由于微血管病

黄瘤：继发于高脂血症

心血管系统

冠状动脉粥样硬化：心肌梗死、死亡

外周动脉粥样硬化：肢体缺血、坏疽

生殖系统

增高的胎儿死亡率(胎盘病、新生儿呼吸窘迫综合征、感染)

全身

对感染的敏感性增高

延缓创伤愈合

另外的并发症也包含，例如，对感染和创伤愈合的敏感性的普遍增高。术语“治疗”也意指包括糖尿病个体相比于未治疗个体而言平均预期寿命的增加。其它病理状况、慢性并发症或者疾病表型显现是本领域技术人员已知的，它们可类似的用作对糖尿病治疗的衡量，只要与所述疾病有关的这些状况、并发症或者显现的严重程度有所减轻即可。

如本文所使用的，术语“预防”意指阻止指示糖尿病的临床症状。此阻止包括，例如，在所述疾病明显症状出现之前或者诊断出所述疾病之前，维持具有发展成糖尿病风险的个体体内血液葡萄糖的正常水平。因此，术语“预防”包含对个体的预防治疗以避免它们出现糖尿病。在个体中预防糖尿病也意指包括抑制或阻止所述疾病的发展。抑制或阻止所述疾病的发展包括，例如，抑制或阻止异常葡萄糖代谢的发生例如葡萄糖从血浆到细胞转运的障碍。因此，有效的预防糖尿病包括维持葡萄糖动态平衡，其是由于在易患糖尿病的个体，例如肥胖个体或者具有糖尿病家族史的个体内葡萄糖调控的胰岛素表达所致。抑制或阻止所述疾病的发展也包括，例如，抑制或阻止与糖尿病有关的一种或多种病理状况或者慢性并发症的发展。与糖尿病有关的这些病理状况的例子在表1中列出。

如本文使用的，术语“β细胞素”或者“BTC”意指表皮生长因子家族的成员，其在成人的胰腺和肠以及在胎儿胰腺的原始导管细胞(duct cells)中表达。核苷酸及从其推出的氨基酸序列已经有过描述，例如，Sasada et al.，Biochem Biophys Res Commun.190：1173-79(1993)和Shing et al.，Science 259：1604-7(1993)。β细胞素的功能为诱导产生胰岛素的β胰岛细胞的再生和/或新生。BTC的一种核苷酸和氨基酸序列的具体实例分别如下文SEQ ID NOS：1和2所列出的，其分别对应于人BTC编码区和所推出的氨基酸序列。SEQ ID NOS：3-5分别提供了来自成人、牛和小鼠BTC的氨基酸序列，而SEQ IDNO：6提供了BTC的共有氨基酸序列。人BTC cDNA的开放读码框编码178个氨基酸的初级翻译产物，其对应于BTC前体(pro-BTC)。Pro-BTC由一系列结构域组成，包括用于定位于分泌途径的假定的信号肽(aa^13-26)，短前肽(aa^27-31)，包含EGF基元的成熟BTC(aa^32-111)，短的近膜结构域(aa^112-124)，疏水跨膜结构域(aa^125-138)以及胞质尾结构域(aa^139-178)，其包含了高度亲水的精氨酸/赖氨酸富含区(aa^146-154)。

应理解可进行较小的修饰而不破坏本发明BTC多肽或其片段的β细胞再生或新生的活性，并且可能只有一部分一级结构对于实现活性是必需的。这些修饰包括在术语BTC和其功能性片段的含义中，只要保持了β细胞再生活性或β细胞新生活性即可。另外，多种分子可与BTC或其功能性片段融合，包括例如另外的蛋白质、碳水化合物、脂类或者细胞毒剂或细胞抑制剂。这些修饰包含在所述术语的定义中。

具有至少与野生型BTC多肽大约相同的β细胞再生活性或者β细胞新生活性的肽的较小修饰包括，例如，自然存在的氨基酸的保守性取代以及掺入非自然存在氨基酸、氨基酸类似物和功能性模拟物的结构改变。例如，赖氨酸(Lys)被认为是氨基酸Arg的保守性取代。相似的，本领域技术人员会将用具有相似电荷及空间排布的有机结构取代相似的带电的类似结构，比如带正电的氨基酸Arg或Lys，视为BTC多肽、或其功能性片段的较小修饰，只要所得BTC多肽模拟物显示出与参考BTC多肽至少大约相同的β细胞再生活性或者β细胞新生活性即可。

如本文所使用的，当针对BTC多肽使用时，术语“功能性片段”意指BTC的一部分，其保持了与全长BTC相比至少大约相同的β细胞再生活性或者β细胞新生活性。这些功能性片段可包含例如被称为BTC24-76的BTC衍生物，其在N端截去23个氨基酸，在C端截去4个氨基酸。BTC24-76表现出高2.5倍的分化活性，以及十分之一的促有丝分裂活性(Watanabe et al.，J.Biol.Chem.269：9966-73(1994))。

如本文所使用的，针对BTC的核苷酸或氨基酸序列使用时，术语“基本上”或“基本上相同的”意指所述核苷酸或氨基酸序列在与参考序列对比时，显示出很大程度上、数量上或范围上的序列一致性。此序列一致性进一步被认为是显著且有意义的，以便将氨基酸序列或者编码核苷酸序列表征为来自BTC或者与BTC相关。

如本文所使用的，术语“载体”指重组DNA分子，其能够携带、增殖或者表达异源核酸。当用于腺伴随病毒载体(adeno-associatedvirus)时，此术语意指具有一些或全部腺伴随病毒DNA，同时具有非AAV DNA的重组DNA分子。非AAV DNA可编码任意期望的多肽，比如生长因子、酶、结构蛋白、抗体、或抗原。所编码的多肽可为全长多肽、或者是全长多肽的活性或免疫原性片段。非AAVDNA被置于载体内，使得其可操纵性的连接到合适的调控元件上，例如启动子、增强子等。

如本文所使用的，术语“腺病毒载体”指细小病毒组中的一员，其特征在于它们能够以稳定的方式整合入宿主的染色体。腺病毒载体是本领域公知的，可在，例如，Wivel et al.，Adenovirus Vectors.Chapter 5(p.87-110)和Friedmann T.，The Development of HumanGene Therapy.CSHL Press，NY，USA.Page 729(1999)中找到描述。此重组体内递送和表达载体家族能够感染大范围的宿主细胞和组织，并且易于操纵以达到所需功能。本发明的腺病毒载体以及可用于本发明治疗方法的腺病毒载体的一个具体例子在下文实施例1中进一步描述。

腺病毒载体的其它具体实例包括例如辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector)和腺伴随病毒。辅助病毒依赖型腺病毒载体(无内容腺病毒载体(gutless adenovirus vectors))缺失了所有病毒基因。这些腺病毒载体只含有顺式作用元件，其包含了左右反向末端重复序列以及载体基因组包装所需的包装区域。这些辅助病毒依赖型腺病毒载体保留了约600bp的腺病毒基因组。剩下的间插区域由非编码填充DNA填入。病毒DNA的去除确保了没有来自辅助依赖型腺病毒主链的病毒基因被表达。腺伴随病毒载体具有高度安全的优点，因为96％的亲代腺伴随病毒基因组缺失掉了。腺伴随载体缺乏任何病毒基因，而代之有含有感兴趣的重组基因。

如本文所使用的，术语“可操纵性的连接”或者语法上的等价说法，意指载体的组件根据公知的遗传学和细胞学原理相连接，其允许每个组件的必需的功能在它的靶核酸上实施。因此，载体上组装的一组可操纵性连接的核酸组件在载体中相连接，以使得转录、翻译和调控提及的编码区域序列。例如，当可操纵性连接时，编码区域序列按读码框融合，以确保从组成部分中翻译出所需的全长多肽。

如本文所使用的，术语“表达”意指细胞对核酸的转录和翻译。表达可以是例如组成型或者调控型，比如通过可诱导型启动子或者组织或细胞特异性启动子调控。这些核酸序列也可同时表达，或者作为替代的，独立于其它所需核酸进行表达。另外可根据待表达氨基酸或者核苷酸序列的数量和功能，使用这些共表达模式的多种组合。本领域技术人员知道，或者可确定，何种共表达模式可用于达到一个特定的目的或者满足所需的要求。一个使用CMV的组成型表达的具体例子在下文实施例1中进一步描述。

如本文所使用的，术语“分泌(secretion)”或者“分泌的(secreted)”意指基因产物表达到细胞外空间。分泌多肽应用前导肽或信号序列引导前多肽穿过细胞膜。在真核细胞中，例如，前导序列在粗面内质网中被切割下来，以产生成熟多肽，并且成熟多肽通过囊泡被运输到细胞表面。包含前导序列的嵌合基因构建物的构建是本领域中公知的，该前导序列可操纵性的连接到编码区域，以表达和分泌成熟多肽。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”指用根据本发明的载体所转化或转导的细胞。该术语也指能够被包含了本发明的载体作为其基因组的病毒颗粒感染的细胞。

如本文所使用的，当针对病毒颗粒的施用使用时，含有表达分泌的成熟人β细胞素(BTC)或者其功能性片段之载体，术语“有效量”意指施用病毒颗粒的数量足以感染靶组织以及以一定水平分泌从病毒颗粒基因组表达的治疗性基因产物，在此水平上将减轻一种或多种糖尿病症状。例如，有效量的分泌BTC的病毒颗粒由会引起血液葡萄糖水平降低或者达到葡萄糖动态平衡或者两者皆有的颗粒数量组成。另外，如上文表1所描述的，糖尿病的临床表现也可用来度量病毒颗粒的有效量。相似的，病毒颗粒的有效量意指为可施用并导致BTC以足够水平分泌的病毒颗粒的数量，从而对个体的生物或生化组分细胞或者组织产生所需的效果。例如，有效量的分泌BTC的病毒颗粒也可由一定数量颗粒组成，其将使得胰腺β细胞再生、β胰岛细胞新生或者β胰岛细胞既再生也新生。对于人类个体根据本文提供的教导和指导以及本领域技术人员熟知的知识，病毒颗粒的有效量可例如从可靠的糖尿病动物模型中外推出来。对于小鼠动物模型，病毒颗粒的有效量，例如，包括在约1×10⁸-1×10¹⁴之间，优选在约1×10⁹-8×10¹¹之间，更优选在约1×10¹⁰-1×10¹¹之间。一个特别有用的有效量是约4×10¹¹个病毒颗粒。其它有用的有效量包括，例如，在约1×10¹²-1×10¹⁴之间，特别是当使用辅助病毒依赖型腺病毒载体或者腺伴随病毒时。对于腺伴随病毒，特别有用的有效量是在约2.1×10¹²-7.0×10¹³载体基因组单位之间。

如本文所使用的，术语“药用可接受载体”意指适于施用给个体的溶液或介质。这些溶液或介质可维持化合物与多肽的稳定性，以及细胞的存活力。药用可接受载体是本领域公知的，其包括水溶液比如磷酸缓冲盐溶液或者介质。药用可接受载体也包括其它的部分、化合物和/或制剂，其增强或增加病毒颗粒靶向、附着或感染它们的体内宿主细胞或组织的能力和/或用于定时释放递送或者出于免疫保护目的。这些部分、化合物和/或制剂是本领域技术人员公知的，并且可包含，例如，受体配体、细胞外基质分子或其组分，以及化学递送制剂。

分离的分子、宿主细胞或其群体是表示分子、宿主细胞或其群体基本上不含污染物或如它们通常在自然状态下所存在的物质。群体指两种或多种分子或宿主细胞的组。组成群体的细胞可以是相同系或不同系，并且可以是均质或异质的细胞组。

本发明提供具有核酸的载体，该核酸可操纵性连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列，其中BTC的表达产生分泌的成熟BTC。

本发明使用了编码β细胞素以及分泌前导序列的核酸以产生前多肽、或者前β细胞素(前BTC)，其可在通过分泌途径表达时切割成生物活性BTC。在BTC被用作人体治疗目的时，编码核酸优选来自人类。相似的，在这些治疗应用中，分泌前导序列也优选来源于人类。在应用编码核酸用于表达和/或分泌多肽包括前多肽时，降低了外源多肽产生不必要免疫应答的可能性。但是，本领域技术人员可知，所有其它来源的BTC和分泌前导序列，包括非人来源的，可用在本发明的载体中，并且用在本发明的治疗方法中，尤其是在与人序列的序列一致性差异较小的时候。

典型的BTC编码核酸可具有与针对人BTC在SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。相似的，典型的BTC编码核酸可编码与针对人BTC在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。相似的，典型的BTC编码核酸可编码与编码如SEQ ID NO：3-6中所示的任一氨基酸序列的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。较小的修饰比如保守性取代或者相比于编码SEQID NO：2-6的核苷酸序列由于物种来源的差异也可使用在本发明的载体中，只要所编码的BTC基因产物保持有其一些或者全部β胰岛再生或新生活性即可。

本发明的编码核酸含有对应BTC编码区域的序列，或者其功能性片段，其可操纵性的与分泌前导序列相连。可操纵性连接以顺式并且以体内剪切产生生物活性BTC的形式实施。此连接可通过，例如，直接将编码前导序列融合到BTC的编码区，或者通过包含连接区域的方式来实施，只要BTC活性在剪切成为成熟多肽后不发生可察觉的降低即可。因此，信号肽的剪切信号可来源于所选择的前导序列或者来源于异源前导序列，只要对应于分泌、剪切前导肽和产生活性BTC的所有活性均发生即可。这些编码BTC和分泌前导序列的核酸序列包含在本发明的载体中，并且如下所述可操纵性的连接其它所需的表达和调控元件。

分泌前导序列可从基本上任何所需的分泌的真核生物多肽中获得。随着许多基因组的克隆和测序，包括人类，存在有大范围的真核生物前导序列可供利用。可用于本发明载体中的编码典型前导序列的核酸包括例如白蛋白前导序列，其序列为ATG AAG TGG GTA ACC TTT ATT TCC CTT CTT TTT CTC TTT AGC TCG GCTTAT TCC AGG GGT GTG TTT CGT CGA GAT(SEQ ID NO：7)和免疫球蛋白κ(Igκ)-链前导序列，其序列为ATG GAG ACA GACACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGTGAC(SEQ ID NO：8)。可用于本发明载体中的一个特别有用的分泌前导序列是白蛋白前导序列，如上文所示及在实施例中所举例的。

多种表达和调控元件中的任一种可用于本发明的载体中，以使得如上所述的载体中编码的成熟BTC的分泌得到实现。这些元件至少包括用于所编码的前-BTC多肽转录的启动子序列。其它表达元件包括例如增强子、沉默子、组织特异性转录调控元件、内含子、多聚腺苷酸化信号、转录终止信号和翻译起始位点。在需要强的连续表达时，组成型或可诱导启动子与一个或多个增强子组合使用可以是特别有用的组合。相似的，其它增强表达、稳定性或者转录、翻译或者转运效率的表达和/或调控元件也可使用，以有益的增加本发明成熟BTC多肽的表达及分泌水平。这些其它表达和/或调控元件的范围可以从包含真核生物基因中编码的通常出现的结构比如内含子或多聚腺苷酸化信号，到核苷酸序列的实质上的修饰，所述修饰使得其更适于发生表达的靶物种的密码子用法。例如，非人的比如啮齿类动物的BTC编码区可被修饰以在核苷酸序列中掺入一些或许多人密码子，但基本上不改变氨基酸序列。作为替代的，非人BTC编码区可人源化而编码基本相同的人氨基酸序列，而在核苷酸水平上有所不同。如下文进一步描述的，表达和/或调控元件的多种其它组合和变换可用在本发明的载体中，以实现成熟BTC多肽的分泌。

例如，合适的表达和/或调控元件是本领域技术人员公知的，并在Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York(1992)以及Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1992)中有所举例。这些表达和/或调控元件包括巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)类固醇诱导型启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)启动子等。也可使用提供可操纵性连接的核酸的组织特异性或可诱导型表达的表达和/或调控元件。这些可诱导系统包括，例如，四环素可诱导系统(Gossen&Bizard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)；Gossen et al.，Science，268：1766-1769(1995)；Clontech，Palo Alto，CA)；重金属可诱导的金属硫蛋白启动子；响应蜕皮激素或相关类固醇比如幕黎甾酮(muristerone)的昆虫类固醇激素(No et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351(1996)；Yaoet al.，Nature，366：476-479(1993)；Invitrogen，Carlsbad，CA)；由类固醇比如糖皮质激素和雌激素所诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)(Lee et al.，Nature，294：228-232(1981))；和由温度改变可诱导的热休克启动子。

一个具体的用于强组成型体内表达的有用的启动子是CMV启动子，并在下文实施例1中进一步举例进行阐述。其它特别有用的元件包含CMV启动子和增强子元件、β珠蛋白内含子和多聚腺苷酸化信号序列的可操纵性组合。可包括在本发明的载体中的除β珠蛋白内含子之外的内含子包括，例如，SV40大T抗原。相似的，可包括在本发明载体中的除SV40多聚腺苷酸化信号之外的多聚腺苷酸化信号包括，例如，牛生长激素(BGH)poly A信号和β珠蛋白polyA信号。所有这些元件是可从商业获得的，并且它们的应用是本领域公知的。本领域技术人员应知道或者可容易地确定用于在具体宿主细胞中表达的合适启动子。

本发明的载体可来源于许多公知的来源或者由本领域中许多公知的方法来制造。用于治疗方法时，如下文所述，所述载体被导入宿主细胞或组织，以实现从编码核酸和可操纵性连接的前导肽以及可操纵性连接的表达和/或调控元件中表达和分泌成熟的BTC。多种载体可用于此目的，包括，通过靶向基因递送来传递的表达载体，以及可用来在施用后产生感染宿主细胞的病毒颗粒的病毒载体。病毒载体在体内基因递送中是特别有用的，因为宿主细胞的特异性、表达和复制机制可以例如可有益地得到控制以在所需细胞类型或组织中达到有效的导入和强的表达。基于DNA病毒和基于逆转录病毒的载体都可用做本发明的载体，以可操纵性的连接启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段，以及多聚腺苷酸化信号序列，从而实现成熟BTC的表达和分泌。

通过基于腺病毒的载体来举例说明本发明。所述腺病毒组分可来源于例如Ad5基因组或来源于任何其它本领域中公知的基于腺病毒的载体。另一种可用作本发明载体的主链组分的基于腺病毒的载体是辅助病毒依赖型或者“无内容”腺病毒载体(HDAd)。这种HDAd基于腺病毒的载体缺乏大部分的病毒基因组，且只含有顺式作用元件(Kochanek et al.，Curr.Opin.Mol.Ther.3：454-463(2001))。它在治疗性基因产物体内递送上的应用显示出转基因的延长表达和可忽略的毒性(Schiedner et al.，Nat，Genet.18：180-183(1998)；Zou etal.，Mol.Ther.2：105-113(2000)，和Morral et al.，Hum.Gene Ther.9：2709-2716(1998))。另外，无内容腺病毒载体相比于例如重组腺伴随病毒而言，具有较高的转导效率。在下面实施例1中所描述的具体腺病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：9中所示。所述载体在核苷酸1-795位含有CMV启动子/增强子元件；在核苷酸857-989位含有β珠蛋白/IgG嵌合内含子；在核苷酸1095-1166上含有白蛋白前导序列；在核苷酸1167-1406位含有β细胞素[1-80]cDNA编码区；在核苷酸1407-1409位含有终止密码子，在核苷酸1426-1647位含有SV40晚期polyA信号。此载体或者具有基本相同核苷酸序列的载体也可用在本发明的方法中。

基于病毒的载体的更多实例包括例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒、和疱疹病毒，它们可用来表达ATX多肽到细胞中。如前文所描述的，基于病毒的系统提供了能够导入相对高水平的异源核酸到多种细胞中的优点。另外，这些病毒可将异源DNA导入到不分裂的细胞中。病毒载体包括，例如，单纯疱疹病毒载体(美国专利NO.5,501,979)，牛痘病毒载体(美国专利No.5,506,138)，巨细胞病毒载体(美国专利No.5,561,063)，经修饰的莫洛尼鼠白血病病毒载体(美国专利No.5,693,508)，腺病毒载体(美国专利No.5,700,470和5,731,172)，腺伴随病毒载体(美国专利No.5,604,090)，组成型和可调控逆转录病毒载体(分别是美国专利No.4,405,712；4,650,764和5,739,018)，乳头瘤病毒载体(美国专利No.5,674,703和5,719,054)等。

构建本发明载体的方法以及用于可操纵性连接编码序列和表达和/或调控元件的方法是本领域公知的。此处提供了作为举例的含有白蛋白分泌前导序列的可表达的BTC编码核酸序列，如SEQ IDNO：10中所示。构建编码可分泌BTC/白蛋白前-BTC的核酸序列的方法是本领域公知的，例如如Sambrook et al.，上文；Ausubel et al.，上文；Kay et al.，Hepatology 21：815-819(1995)；Stratford-Perricaudet et al.，J.Clin.Invest.，90：626-630(1992)，和Barr et al.，Gene Therapy，2：151-155(1995)所描述的。例如，编码BTC并含有分泌前导序列的核酸可通过使用聚合酶链式反应获得。来自合适生物体的组织或细胞系可用于扩增BTC或前导序列。这些方法也在下文实施例1中进一步举例说明。

一旦构建成了含有可操纵性地连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列的核酸的载体，即可使用本领域公知的方法对所述载体用于表达分泌性成熟BTC进行验证。例如，所述载体可被导入到不表达BTC的细胞中，并且使用例如ELISA或放射性免疫法(RIA)的实验来检验培养基中成熟胰岛素的存在。作为替代的，可检测表达产物诱导β细胞再生或β细胞新生的能力，或者减轻任何一种表1中所列糖尿病症状和病理状况严重程度的能力。例如，可检测所述表达产物刺激血液葡萄糖水平降低的能力，或者葡萄糖向培养的脂肪细胞或肌肉细胞的转运增加的能力。对转运进入细胞的量的测量可通过使用放射性标记的葡萄糖进行。

因此，本发明也提供载体，其具有可操作性地连接着巨细胞病毒(CMV)启动子和增强子区域、β-珠蛋白嵌合内含子、白蛋白前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及SV40多聚腺苷酸化信号序列的核酸，其中BTC的表达产生分泌的成熟BTC。所述载体的核苷酸序列与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列基本相同。

本发明另外提供含有本发明的含BTC的载体的宿主细胞。例如，本发明提供表达分泌性成熟BTC的宿主细胞或细胞群体。本发明的宿主细胞基本上可来源于任何组织或器官。对于原代细胞而言，应当选择可容易进入的，且含有表现出所需生长和表达特性的细胞的组织。选择组织来源时的其它考虑包括选择含有可被分离、培养和修饰而表达分泌性BTC的细胞的组织。组织来源的实例包括胰腺、肌肉、肝脏、或者皮肤组织、以及造血细胞来源。因此，可被修饰以表达分泌性成熟BTC的这些组织中的细胞类型可被分离并用于以下目的，其包括例如实验研究、载体保持和传代，以及用于细胞治疗方案。这些细胞类型包括，例如，β胰岛细胞、肌肉(平滑肌、骨骼肌或心肌)、成纤维细胞、肝脏细胞、脂肪细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、内分泌细胞、外分泌细胞、肾脏细胞、膀胱细胞、脾细胞、干细胞和生殖细胞。特别有用的宿主细胞是胰腺细胞，其包括能分化成β胰岛细胞的祖细胞和干细胞。其它细胞类型类似地在本领域中是已知的，其能够进行修饰而分泌成熟BTC，并且能够相似的如上文所描述的从组织来源中获得或分离得到。尽管人体组织来源对于治疗目的是有利的，细胞来源的物种可以基本上是任何哺乳动物，只要该细胞表现出允许成熟BTC表达和分泌的特征即可。

本发明也提供了治疗或预防糖尿病的方法。该方法包括给个体施用有效量的含有表达分泌性成熟人β细胞素(BTC)或其功能性片段的载体的病毒颗粒，所述载体含有可操纵性连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列的核酸。

在另一个实施方案中，本发明的载体可用于产生病毒颗粒。施用这些含有本发明载体的病毒颗粒可治疗或预防糖尿病，所述病毒颗粒在感染后能分泌成熟BTC。例如，在链脲佐菌素诱导的糖尿病NOD.scid小鼠中和用免疫调节物治疗的自身免疫性糖尿病NOD小鼠中，单一施用含有融合了白蛋白前导序列的人BTC的本发明重组腺病毒载体导致了小鼠在两周内糖尿病完全好转，并且这些小鼠保持血糖正常超过100天。糖尿病的好转是由于胰腺中BTC介导的β细胞再生，并且该好转可被ErbB-2受体的抑制所消除，该受体是BTC的配体。通过BTC基因治疗的β细胞再生可能是用于治愈人I型糖尿病的潜在方法。

本发明的方法中举例说明的病毒颗粒是腺病毒载体颗粒。但是，如前文关于所述载体的描述，按照本文提供的教导和指导，本领域技术人员将能理解，许多的病毒颗粒可用于稳定的基因递送、表达和成熟BTC的分泌。无论是腺病毒的、基于其它DNA病毒的、逆转录病毒的或其它的病毒颗粒，含有本发明的载体作为其基因组的病毒颗粒均可如下文进一步描述的用于本发明的方法中治疗或预防糖尿病。本发明的所述病毒颗粒例如使用本领域公知的用于包装病毒基因组的多种方法中的任何一种进行生产。这些方法在下文实施例1中针对含有本发明载体的腺病毒颗粒进行了举例说明。

缺乏葡萄糖动态平衡的糖尿病患者个体可使用上文所述的病毒颗粒通过多种施用途径和方法进行治疗。使用本领域中公知的糖尿病临床标准及预后指标来选择适于采用本发明方法治疗的个体。至少一种糖尿病或者如本文之前所描述的糖尿病相关病理状况的症状的确切临床诊断将准许施用本发明的细胞。在表1中列举了典型的病理症状。

根据已知的预后指标比如家族史、禁食血液葡萄糖水平或降低的葡萄糖耐受性所评估的处于发展成糖尿病的风险中的个体也准许施用经修饰而以葡萄糖调控的方式表达前胰岛素和蛋白酶的细胞。本领域技术人员应当认识到或知道如何诊断患有糖尿病或葡萄糖摄取失调的个体，并且，根据疾病的程度或严重性，可对何时施用本发明的病毒颗粒作出合适的判断，并且也可选择最适当的施用模式。例如，尽管患有长期I型糖尿病的人可能需要即刻施用病毒颗粒以便感染和分泌BTC，而患有长期II型糖尿病的人可推迟治疗，直至有迹象表明指定的其它治疗缺少有效性。

可将含有载体的病毒颗粒施用给已经确定为需要治疗糖尿病以缓解他们的疾病或者可以从中受益的个体，所述载体包含可操纵性连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列的核酸，该病毒颗粒在导入到宿主细胞后，可从其载体表达分泌性的成熟人β细胞素(BTC)或其功能性片段。所述病毒颗粒可被施用以改善糖尿病的一种或多种体征或症状。例如，可在作出疾病诊断之后对糖尿病个体施用具有编码分泌性成熟BTC的基因组的病毒颗粒。所述病毒颗粒将感染靶组织和细胞，并且通过在体内表达它的载体基因组而分泌成熟BTC或其功能性片段。BTC的分泌将导致例如胰腺中β胰岛细胞再生、胰腺中β胰岛细胞新生或者两者皆有，并且使得这些细胞得到补充以及使得葡萄糖动态平衡恢复。糖尿病得到有效治疗的个体在移植了胰岛素分泌细胞后，将显示出指示该疾病的至少一种症状严重程度的降低。症状严重程度的降低是可被检测的，且对于本领域技术人员是明显的。

也可以向患有轻度糖尿病的个体施用本发明的病毒颗粒。对这些个体是否需要治疗的判断可由本领域技术人员作出。例如，对标准治疗方法没有反应或反应不佳的糖尿病个体可使用本发明的方法进行治疗。II型糖尿病患者，例如，人已经尽力但未能成功地维持长期的体重降低或坚持锻炼方案的可通过移植本发明的细胞群体来治疗它们的胰岛素抵抗。

本发明的方法也可用于提高其它糖尿病疗法的疗效。本发明的方法可与先前存在的或其它的治疗方法相联合使用以提高其它方法的疗效或使用简便性。例如，在对接受每天注射胰岛素的患者或使用胰岛素泵的患者施用本发明的病毒颗粒后，可产生BTC分泌细胞。BTC编码病毒颗粒的施用和感染以及之后的BTC分泌可降低此类患者注射胰岛素的频率。也可对未接受胰岛素治疗但接受了行为矫治治疗例如节食和运动以减轻体重，的糖尿病个体施用本发明的病毒颗粒。在这些个体中施用BTC病毒颗粒，并联合减轻体重和锻炼方案，可以降低疾病复发的可能性或者可改善疾病的体征或症状。本发明的BTC编码病毒颗粒也可用于治疗针对内源胰岛素分泌细胞具有自身免疫反应的糖尿病患者。这些糖尿病个体经常通过针对自身免疫反应的免疫治疗性介入进行治疗。这些个体可另外通过BTC分泌和β胰岛细胞再生和/或新生来治疗，以达到相比于单独使用免疫疗法时更好的疗效。

可以将引入并表达分泌性成熟BTC的本发明病毒颗粒施用给个体，以使β胰岛细胞功能增加，由此产生胰岛素分泌的增加，从而恢复或加强葡萄糖-摄入应答。病毒颗粒基因组的整合使得葡萄糖动态平衡延长，其是由于这些功能的表达恢复所致。可向患有糖尿病的个体施用有效量的病毒颗粒以减轻或预防糖尿病。这些个体可具有约140mg/dl或更高的禁食血液葡萄糖水平。

适于植入的病毒颗粒有效量以在可获得的范围内的大小或颗粒数表示，其被调整成可操纵性的编码分泌性成熟BTC，并足以在病毒感染进入体内受益于治疗的靶细胞或组织之后表达大量分泌性成熟BTC或其功能性片段。对于人类个体来说，病毒颗粒的有效量可以是例如根据本文提供的教导和指导以及本领域技术人员公知的知识，从可靠的糖尿病动物模型中推导出来。对于小鼠动物模型，病毒颗粒的有效量例如包括在约1×10⁸-1×10¹²之间，优选在约1×10⁹-8×10¹¹之间，更优选在约1×10¹⁰-1×10¹¹之间。特别有用的有效量是约4×10¹¹个病毒颗粒。病毒颗粒数量的选择可取决于颗粒的来源、接受个体的状况、以及所需的BTC分泌水平。本领域技术人员应当知道如何使用本领域公知的方法确定产生治疗效果的病毒颗粒的合适数量。

可以采用多种途径施用本发明病毒颗粒以递送编码分泌性BTC的核酸。除静脉内注射(i.p.)之外，有效量的病毒颗粒也可通过例如肌肉内注射、皮下注射、腹膜内注射、或者注射到组织或器官位置而施用给个体。用以施用的病毒颗粒可通过本领域公知的方法获得和制备，并混悬在合适的生理载体中。例如，病毒颗粒可通过连接在含有所述颗粒的装置上的导管、所述导管插入静脉而直接注入，或者可直接注射进入组织。所述病毒颗粒在药用可接受载体中被注入，该载体在上文定义并在下文进一步讨论。所述病毒颗粒也可与其它促进递送、靶向和/或疗效的分子一起施用。病毒颗粒可以根据需要单次或多次施用，以使得分泌性成熟BTC或其功能性片段实现治疗水平的足够表达。

然后可通过检测进食后的胰岛素分泌水平来监测使用病毒颗粒治疗的个体，以观察其疗效。这一检测可由例如胰岛素血液水平的放射性免疫法检测或ELISA组成。作为替代的，对施用病毒颗粒后个体中禁食葡萄糖水平的测量可用来确定治疗效力。根据葡萄糖耐受测试所确定的葡萄糖处置速率降低也可被用来验证治疗效力。另外，至少一种与糖尿病有关的症状的减轻也可用来确定治疗效力。本领域技术人员应当知道评价和诊断治疗效力的合适方法。

本发明也可用于预防糖尿病。例如，编码可分泌BTC的病毒颗粒可作为预防药施用给具有发展成糖尿病风险或患有高血糖的个体。本发明也可用于比如遗传上易患上糖尿病的个体或具有发展成胰岛素抵抗或高血糖失调风险的肥胖个体。这些个体在临床上明显的高血糖发作之前或期间，可接受有效量的BTC编码病毒颗粒，用于感染靶细胞并且随后分泌成熟BTC。后一种情况可视为预防该疾病，但是也可视为治疗该疾病，因为在慢性高血液葡萄糖水平显示出来以前，获得了正常的葡萄糖动态平衡。

除了施用BTC编码病毒颗粒以在个体中感染和分泌BTC之外，本发明的载体也可直接施用到个体用于遗传修饰，例如用于离体或体内治疗。

含有可分泌BTC核酸的本发明的病毒颗粒或载体可直接导入到人体或配制成为药用组合物，其包含药用可接受载体。药用可接受载体是本领域公知的，包含水溶液比如水、生理缓冲盐水、或其它溶剂，或者载体比如二元醇类、甘油、油类比如橄榄油或可注射的有机酯。

药用可接受载体可包含生理可接受化合物，其用于例如稳定或增加病毒颗粒的感染、载体核酸序列的吸收、或两者皆有。本领域技术人员应当知道药用可接受载体包括生理可接受化合物的选择取决于例如施用BTC编码病毒颗粒的途径以及病毒颗粒的具体特征，例如，病毒颗粒是基于DNA病毒还是逆转录病毒。

如果需要的话，药用组合物也可被掺入水包油型乳液、微乳、胶束、混合胶束、脂质体、微球或其它多聚物基质中(Gregoriadis，Lipsome Technology，Vols.I to III，2^nd ed.，CRC Press，Boca Raton，FL(1993)；Fraley et al.，Trends Biochem Sci.，6：77(1981))。例如，由磷脂或其它脂质组成的脂质体是无毒的、生理可接受并可代谢的载体，它们的制备和施用相对简单。另外，脂质体是特别有用的，因为它们可高效率包封本发明的BTC编码载体，而不损害试剂的生物学活性，优先的并充分的结合到靶细胞，并高效的将囊泡中的水性内容物递送到靶细胞中(见Mannimo et al.，Biotechniques 6：682(1988))。

用于递送本发明载体到个体的脂质体靶向可以是被动的或主动的。被动靶向例如利用了脂质体在网状内皮系统(RES)细胞中和在器官比如肝脏中积累的趋势，肝脏中含有窦状毛细血管。这些配制成为脂质体的载体可直接输注入肝脏的门静脉，并且将有效改造肝脏细胞以表达胰岛素，这是由于肝脏中RES细胞浓度和肝脏中循环系统的窦状性质所致。含有载体的脂质体的主动靶向可通过将特异性配体与脂质体相偶联来实现。这些配体包含单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质比如靶细胞所表达的受体的配体。选择哪一种靶向方法取决于待修饰以用于胰岛素表达的细胞类型或组织的位置。

给个体施用编码可分泌BTC的病毒颗粒或载体，可以是单次治疗或者多次治疗，其取决于所需BTC分泌的水平或待修饰细胞的数量。用于递送编码多肽的核酸序列的方法是本领域已知的，例如，如Felgner et al.，美国专利No.5,580,859，1996年12月3日颁证所述。也可实施多次施用以增加修饰细胞的比例，增加每细胞的BTC拷贝数，或者在所需时期内维持修饰细胞的有效数量。如果至少一种糖尿病症状缓解或减轻，则达到了体内治疗的疗效。在所治疗的个体中，糖尿病症状严重程度的减轻可由本领域技术人员根据前文所述进行测定。

应当理解的是，不在实质上影响本发明多种实施方案功能的修改也包括在本文所提供的本发明定义中。因此，以下实施例意在举例说明而不限制本发明。

实施例1

通过β细胞素诱导的β细胞再生使得糖尿病得到长期好转

本实施例显示通过在胰腺中表达β细胞素来治疗糖尿病。

为导入胰岛素动物模型并体内表达β细胞素(BTC)，构建重组腺病毒载体。所述载体被称为rAd-CMV-BTC，其中含有位于BTC编码区域5’端的巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子和增强子区域、β-珠蛋白嵌合内含子和白蛋白前导序列，以促进BTC的分泌。定位于BTC编码区域3’端的是SV40多聚腺苷酸化信号序列。编码成熟BTC的BTC[1-80]cDNA被插在5’和3’表达调控区域之间。rAd-CMV-BTC的示意图如图1A所示。编码成熟BTC的BTC[1-80]cDNA完整的核苷酸和所推知的氨基酸序列分别如SEQID NO：1和2所示。rAd-CMV-BTC的完整核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。含有白蛋白信号序列的SEQ ID NO：9的BTC编码前肽如SEQ ID NO：10所示。

表达人BTC cDNA(rAd-BTC)的重组腺病毒如下法制备。简言之，编码该完整80个氨基酸的蛋白质的人BTC cDNA从美国典型培养物保藏中心(ATCC#1887012)购买。将所述cDNA克隆到pCR259(Qbiogene)腺病毒转移载体的SmalI和NotI位点上。然后，将白蛋白前导肽序列插入到SalI和SmaI位点，通过定点诱变除去由SmaI识别序列额外插入的6-bp序列。所得表达盒包含巨细胞病毒(CMV)启动子、β-珠蛋白/IgG嵌合内含子、猿猴病毒(SV)40polyA信号。使用Transpos-Ad^TM方法(Qbiogene)，根据制造商的说明书，构建携带此盒的腺病毒载体。所述腺病毒载体使用PacI进行线性化，然后使用lipofectamine-Plus(Invitrogen)将其转染至HEK-293细胞。转染后两周时收集病毒，并保存。通过使用保存的病毒感染HEK-293细胞来扩增病毒，然后通过如Becker et al.，Methods Cell.Biol.43 Pt A，161(1994)所描述的CsCl₂-梯度超速离心来纯化病毒。作为对照，通过使用β-半乳糖苷酶cDNA取代BTCcDNA来制得表达β-半乳糖苷酶(rAd-βgal)的重组腺病毒。病毒效价由PCR和嗜菌斑形成单位法根据Prevec，G.L.，Biotechnology 20，363(1992)所述方法来测定。

首先，在体外检测通过rAd-BTC构建体的BTC表达和分泌。使用rAd-CMV-BTC感染永生化人肝细胞系TTNT-16细胞(Okitsuet al.，Diabetes 53，105(2004))，使用抗-BTC抗体(R&D systems，USA)分别通过免疫组化染色和ELISA对BTC的生产和分泌进行检测。

图1B和C中显示了结果。简言之，图1B显示，使用5MOI的rAd-BTC或rAd-βgal感染1×10⁴个TTNT-16细胞后24小时，通过使用抗-人BTC抗体对其染色以检测BTC表达。结果显示，在rAd-BTC感染的TTNT-16细胞中，明显的产生了BTC，而在用表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒(rAd-CMV-βgal)感染的细胞中却没有产生。图1C显示了在用1或10个MOI的rAd-BTC感染1×10⁶个TTNT-16细胞并培养24小时后，分泌进入上清液的BTC水平。使用未感染的TTNT-16细胞作为对照(0MOI)。发现所分泌的BTC的量取决于rAd-CMV-BTC的剂量。综上，这些结果显示使用rAd-BTC感染的细胞有效的表达和分泌BTC。

其次，在体内检测通过rAd-CMV-BTC的BTC表达。简言之，通过两次注射链脲佐菌素(STZ；100mg/kg体重，在柠檬酸盐缓冲液中，pH4.5，i.p.)使六周大雄性非肥胖糖尿病/严重复合免疫缺陷(NOD.scid)小鼠(Jackson Labs)出现高血糖，然后，给糖尿病小鼠静脉注射rAd-CMV-BTC或作为对照的rAd-CMV-βgal。在甲氧氟烷麻醉下，通过尾静脉，给STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠或者自发性自身免疫性糖尿病NOD小鼠(血液葡萄糖＞500mg/dl)静脉注射rAd-CMV-BTC或作为对照的rAd-CMV-βgal，对于NOD.scid小鼠是2×10¹¹个颗粒，对于NOD小鼠是4×10¹¹个颗粒。血液葡萄糖水平每隔一天进行检测。为避免在自身免疫糖尿病NOD小鼠中对新产生的β细胞的免疫攻击，在病毒注射之前3天注射CFA(100μl/小鼠，单次i.p.注射)和/或hCG(50IU/小鼠，i.p.三周内每天注射)。葡萄糖耐受试验在病毒注射之后4周时实施，如Lee et al.，Nature 408，483(2000)此前所述。

在注射后4周时，使用RT-PCR在多个组织中检测BTC mRNA和胰岛素的表达，所述组织包括肝脏、胰腺、脾脏、心脏、肺和肾脏。简要地说，病毒注射后XX周时，从经过rAd-BTC治疗的STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠中取出多个组织，并使用RT-PCR分析BTC mRNA和胰岛素mRNA的表达，其使用了如下引物：对于人BTC而言为5’-AGTGGGTAACCTTTATTTCC-3’(SEQ ID NO：11)和5’-GTAAAACAAGTCAACTCTCTC-3’(SEQ ID NO：12)，对于小鼠胰岛素而言为5’-AGGCTTTTGTCAAGCAG-3’(SEQ ID NO：13)和5’-CTGATCTACAATGCCACG-3’(SEQ ID NO：14)。

体内表达结果在图1D(BTC)和E(胰岛素)中显示，其中图例符号相应为：L：肝脏，Lu：肺，K：肾脏，H：心脏，S：脾脏，P：胰腺。还检测了这些组织中胰岛素的表达，因为有报道称类胰岛细胞(islet-like cells)只在注射了表达NeuroD和BTC的无内容腺病毒的STZ诱导糖尿病小鼠的肝脏中产生(Kojima et al.，Nat.Med.9，596(2003))。HPRT的表达被用作内部对照。BTC mRNA在所有检测的组织中都被检测到，并且在肝脏中观察到较多的表达。这些结果显示，BTC明显地在使用rAd-CMV-BTC治疗的小鼠中表达。相对的，胰岛素mRNA只在rAd-BTC治疗的小鼠的胰腺组织中被检测到，而在包括肝脏在内的其它组织中却没有。

第三，对将rAd-CMV-BTC注射给STZ诱导糖尿病NOD.scid小鼠是否使得其糖尿病好转也进行了检测。结果在图1F中显示，其中将rAd-CMV-BTC(2×10¹¹个颗粒)施用给STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠(◆)和Balb/c小鼠(●)，并且检测血液葡萄糖水平。作为对照，将相同剂量的rAd-CMV-bgal施加给STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠(■)。观察到血液葡萄糖水平在注射病毒后两周内逐渐降低并达到正常水平。正常血糖维持超过100天直到研究结束。相对的，使用rAd-CMV-βgal治疗的小鼠显示出持续的高血糖并死亡。

也对经过rAd-CMV-BTC治疗后达到正常血糖的STZ诱导糖尿病小鼠实施葡萄糖耐受检验。结果在图1G中显示，其中对在rAd-CMV-BTC治疗后血液葡萄糖水平达到正常(▲)的STZ诱导糖尿病NOD.scid小鼠禁食4小时，然后注射葡萄糖(2g/kg体重，i.p.)。葡萄糖注射之后在所显示的时间点检测血液葡萄糖水平。未治疗的NOD.scid小鼠(◆)和经rAd-βgal治疗的小鼠(■)被用作对照。

结果表明，经rAd-CMV-BTC治疗的小鼠显示了与正常小鼠相同的葡萄糖清除动力学。这些结果与先前的研究相反，后者报导，在STZ诱导的糖尿病小鼠中仅仅BTC表达对血液葡萄糖水平没有影响(Kojima et al.，Nat.Med.9，596(2003))。在BTC基因疗法疗效上的差异可归因于载体和BTC基因构建以及表达模式的差异。例如，本研究使用了腺病毒载体，其表现出比之前研究中所使用的辅助病毒依赖型腺病毒载体更高的转导效率。另外，白蛋白前导序列被插入BTC cDNA的前面以促进分泌，并且巨细胞病毒启动子/增强子和β-珠蛋白嵌合内含子被用于BTC转基因的强表达。本文描述的这些结果显示了通过BTC基因治疗达到糖尿病的完全好转，这些结果也被我们中心两个不同的独立研究员所证实。

为判断使用rAd-CMV-BTC治疗糖尿病NOD.scid小鼠是否导致胰岛素生成细胞的增加，使用抗-胰岛素抗体对肝脏和胰腺切片进行染色，并检测胰岛素阳性细胞的数量。这些结果在图2A和B中显示。简言之，相STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠注射rAd-CMV-BTC(2×10¹¹个颗粒)，并且在2周(BTC-2周)或4周(BTC-4周)后处死。经rAd-CMV-βgal治疗的糖尿病NOD.scid小鼠(糖尿病)和未治疗NOD.scid的小鼠(正常)用作对照。图A显示取出胰腺，并使用苏木精和伊红(HE)或抗-胰岛素抗体(红)或抗-胰高血糖素抗体(绿)对切片染色。图B中，通过放射性免疫法ELISA测量胰腺的胰岛素含量。

如图2A和B所示，在治疗后4周时，观察到经rAd-CMV-BTC治疗的小鼠胰腺中胰岛素阳性细胞比经rAd-CMV-βgal治疗的小鼠胰腺中的高5倍，并且达到正常小鼠胰腺中胰岛素阳性细胞的约40％。在肝脏中未观察到胰岛素阳性细胞。在rAd-CMV-BTC治疗后2周时，当使用抗-胰岛素抗体和抗-胰高血糖素抗体对胰岛进行双染色时，发现胰岛素生成细胞与胰高血糖素生成α细胞散布在经rAd-CMV-BTC治疗的小鼠胰岛中，这很可能是由于在β细胞被STZ破坏之后胰高血糖素生成细胞的重新定位，以及随后出现新形成的β细胞而造成的。但是，在rAd-BTC治疗后4周时(图2A)，发现β细胞在中心成簇状并且被α细胞所围绕，如同在正常小鼠中发现的，这可能是由于新形成的β细胞在胰岛的中心区域持续增加造成的。

为确认rAd-BTC治疗导致了胰腺中胰岛素生成细胞的增加，从经rAd-BTC和rAd-βgal治疗的小鼠以及正常小鼠的胰腺或血浆中提取胰岛素，并通过如Yoon and Notkins，J.Exp.Med.143：1170(1976)和Yoon et al.，Nature 264：178(1976)描述的放射性免疫法对其浓度进行测量。结果显示在图2C和D中，其中图C显示通过ELISA在葡萄糖加载(2g/kg体重)后30分钟和处死之前测量的血清胰岛素含量。图D显示在抗-胰岛素抗体染色之后对胰岛素阳性区域的测量值，其表示为相对于正常小鼠中胰岛素阳性区域的百分比。相对于经rAd-CMV-βgal治疗的糖尿病小鼠，p＜0.01。

结果显示出经rAd-CMV-BTC治疗的小鼠胰岛素水平(269±31ng/mg胰腺)尽管低于正常小鼠(752±68ng/mg胰腺)，但显著高于经rAd-CMV-βgal治疗的小鼠(116±22ng/mg胰腺)(图2C)。在葡萄糖加载之后通过ELISA也对血浆胰岛素水平进行测量，发现rAd-CMV-BTC治疗的小鼠中血浆胰岛素水平尽管低于正常小鼠，但相比于经rAd-βgal治疗的糖尿病小鼠显著提高(图2D)。综上，这些结果显示，在经rAd-CMV-BTC治疗的小鼠胰腺中，胰岛素生成细胞明显增加，其表明通过rAd-BTC治疗达到的糖尿病的好转主要是由于胰腺中β细胞的再生。经rAd-CMV-BTC治疗的小鼠胰腺中β细胞再生中涉及的可能机制包括先前存在的β细胞的复制(Doret al.，Nature 429：41(2004))，从非β细胞到β细胞的横向分化(Watada et al.，Diabetes 45：1826(1996)；Yoshida et al.，Diabetes51：2505(2002)；Mashima et al.，Endocrinology 137：3969(1996)，andIshiyama et al.，Diabetologia 41：623(1998))，以及来自胰腺中成体干细胞/祖细胞的β细胞的新生。Trucco，M.，J.Clin.Invest.115：5(2005)；Bouwens，L.，Microsc.Res.Tech.43：332(1998)，and Weir andBonner-Weir，Nat.Biotechnol.22：1095(2004)。

已经显示BTC可结合ErbB受体并诱导受体同源或异源二聚化作用、自磷酸化、以及下游信号通路的后读激活，使得细胞增殖和分化(Riese et al.，Oncogene 12：345(1996))。ErbB-1和ErbB-4的表达已被发现主要分别存在于正常人胰腺的导管细胞(ductal cells)和胰岛中(Miyagawa et al.，Endocr.J.46：755(1999))，并且已知ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4在胎儿胰腺发育过程中的胰腺中表达(Kritzik et al.，J.Endocrinol.165：67(2000))。同样，已发现ErbB-2的表达在邻近NOD小鼠中免疫细胞浸润的区域的胰岛细胞中受到诱导。几种配体，包括BTC、表皮生长因子以及神经调节素，显示出通过与ErbB-1、ErbB-3或ErbB-4的异源二聚化作用介导ErbB-2的磷酸化和活化(Kritzik et al.，同上文)。也对经rAd-CMV-BTC治疗的糖尿病小鼠中β细胞的再生是否由ErbB受体所介导进行检测。

在这方面，正常小鼠、STZ诱导的糖尿病小鼠和经rAd-CMV-BTC治疗的糖尿病小鼠的胰岛中ErbB-1、-2、-3和-4的表达情况采用抗-ErbB抗体通过免疫组化染色进行分析。图3中显示的结果证明ErbB-2参与了由rAd-CMV-BTC引起的糖尿病好转。简言之，图A显示从经rAd-CMV-BTC治疗的和经rAd-CMV-βgal治疗的(糖尿病)STZ诱导糖尿病小鼠以及未治疗(正常)NOD.scid小鼠中制备的胰腺切片，其使用抗-ErbB-1、-2、-3或-4抗体进行染色。显示了有代表性的胰岛的光学显微照片。图B显示了使用rAd-CMV-BTC(2×10¹¹个颗粒)治疗的STZ诱导糖尿病NOD.scid小鼠。在病毒注射后三天时，使用赋形剂

AG1478(○)(其为ErbB-1受体抑制剂)，或者AG825(●)(其为ErbB-2受体抑制剂)(500μg处于Captisol中，i.p.)对小鼠处理共10天，每天2次。测量血液葡萄糖水平。

通过将胰腺固定在methacarn液(60％甲醇v/v，30％氯仿v/v，和10％冰醋酸v/v)中过夜，然后，甲醇换液处理两次，苯甲酸甲酯换液处理两次，二甲苯处理，然后用石蜡包埋，由此实施免疫组化分析。在脱蜡和重新水化之后，将组织切片置于烘箱(95℃15分钟，10mM柠檬酸盐，pH6.0)以恢复抗原，然后使用封闭液(5％山羊或马血清、1％BSA和0.05％ Tween-20，在PBS中)进行封闭。接着组织在一抗溶液中孵育；一抗包括豚鼠抗-胰岛素(DAKO，稀释度1∶500)，兔抗-胰高血糖素(DAKO，稀释度1∶200)，山羊抗-ErbB-1以及兔抗-ErbB-2、-3、和-4(Santacruz，稀释度1∶100)。二抗使用Cy3偶联的山羊抗-豚鼠IgG(Jackson ImmunoRes.，PA稀释度1∶200)和Cy2偶联的抗-兔IgG(Jackson ImmunoRes.，PA稀释度1∶200)，HRP偶联的山羊抗-兔IgG(Chemicon，稀释度1∶500)和HRP偶联的马抗-山羊IgG(Chemicon，稀释度1∶500)。使用激光扫描共聚焦荧光显微镜(Zeiss LSM 510)进行荧光成像，使用VIP作为发色团(紫色)进行过氧化物酶染色(VIP试剂盒；VectorLaboratories)。

通过对STZ诱导的糖尿病NOD.scid小鼠注射rAd-CMV-BTC(2×10¹¹个颗粒，i.v.)来实施体内酪氨酸激酶抑制剂治疗，从病毒注射后第三天开始一天两次腹膜内注射100μl 100mM Captisol(Cydex Inc.)中的酪氨酸激酶抑制剂AG1478或AG825(500μg)，共10天。单独注射赋形剂(100mM Captisol)作为对照。对于所有研究，通过Student’s t检验对各组之间差异的统计学显著性进行分析。P＜0.05的水平可视为显著的。

观察到ErbB-1在所有这些小鼠的胰岛中有弱的表达，而ErbB-3和ErbB-4的表达在所有这些小鼠的胰岛中无法检测到。相反，相比于正常小鼠，ErbB-2在经rAd-CMV-BTC治疗的和未治疗的STZ诱导糖尿病小鼠的胰岛中有高表达。因为已发现ErbB-1和ErbB-2受体在胰岛中表达，故评估它们在BTC诱导的糖尿病好转中的介入情况。从病毒注射后第三天开始给STZ诱导糖尿病的、经rAd-CMV-BTC治疗的NOD.scid小鼠注射AG1478或AG825(分别是ErbB-1和ErbB-2受体信号通路的阻断剂(Levitzke and Gazit，Science 267：1782(1995))计10天之后检测血液葡萄糖水平。发现A825的注射抵消了rAd-BTC引起的糖尿病好转。但是，当AG825注射在病毒注射后第十三天停止时，血液葡萄糖水平逐渐降低并在病毒注射后第二十三天变为正常血糖(约100mg/dl)。AG1478对于抵消BTC引起的糖尿病好转的影响要显著低于AG825的影响(图3B)。仍不清楚这一差异是由于AG1478对ErbB-1受体的不完全封闭还是由于BTC与ErbB-1和ErbB-2相互作用的功能差异造成的。尽管如此，这些结果表明，ErbB-2参与了由BTC引起的糖尿病好转。

检验rAd-CMV-BTC基因治疗在自身免疫糖尿病小鼠(人自身免疫I型糖尿病模型)中的疗效。将rAd-CMV-BTC(4×10¹¹个颗粒，i.v.)注射给新发展的糖尿病NOD小鼠(血液葡萄糖水平＞500mg/dl)，评定血液葡萄糖水平的变化。结果在图4中显示，其中图A显示自身免疫糖尿病NOD小鼠(血液葡萄糖水平＞500mg/dl)在注射rAd-BTC(2×10¹¹个颗粒)之前，皮下注射CFA(100μl)三天。◆，rAd-BTC和CFA；▲，单独用rAd-BTC；●，单独用CFA。图B显示在病毒注射后三个月时经rAd-CMV-BTC/CFA治疗的NOD小鼠胰腺的抗-胰岛素抗体染色。数个胰岛被抗-胰岛素抗体强染色，并且被T细胞所围绕，但是未发现显著的浸润。图的顶端部分对应来自未治疗的糖尿病NOD的胰岛，而底端部分对应来自rAd-CMV-BTC/CFA治疗的NOD的胰岛。图C举例说明葡萄糖耐受试验的结果。rAd-BTC/CFA治疗(◆)后的血液葡萄糖水平正常化的糖尿病NOD小鼠禁食4小时，然后注射葡萄糖(2g/kg体重，i.p.)。在葡萄糖注射后的所指示的时间点，其血液葡萄糖水平正常化。单独用CFA处理的糖尿病NOD(▲)和非糖尿病NOD(■)小鼠被用作对照。

观察到在病毒注射后4-5天时血液葡萄糖水平降低到低于300mg/dl，但是在病毒注射后两周时返回到高于500mg/dl的水平，这很可能是由于再生的胰岛素生成细胞受到自身免疫反应的再攻击所致(图4A)。已表明完全弗氏佐剂(CFA)可能是通过诱导免疫调节T细胞来预防NOD小鼠的糖尿病(Qin et al.，J.Immunol.150：2072(1993))。同样，最近研究表明在效应物与调节性T细胞之间细微调节的免疫平衡的控制导致了对NOD小鼠的自身免疫糖尿病的预防(Khil et al.，Diabetes 53(Suppl.1)，A43(2004))。因此，在使用rAd-CMV-BTC治疗之前通过注射CFA来评定糖尿病NOD小鼠中免疫平衡的控制。在将CFA(100μl，i.p.)注射进入新发展的糖尿病NOD小鼠体内并用rAd-CMV-BTC(4×10¹¹个颗粒)治疗3天后，检测血液葡萄糖水平。这些结果表明血液葡萄糖水平在病毒注射后的2-3周时正常化，并且正常血糖维持超过90天，直到实验结束。单独使用CFA治疗糖尿病NOD小鼠对血液葡萄糖水平没有影响(图4A)。

当检测病毒注射后三个月时的rAd-CMV-BTC治疗NOD小鼠的胰腺切片时，发现再生的胰岛被免疫细胞所围绕，但是没有被它们渗透(图4B)。在对这些小鼠进行葡萄糖耐受检验中发现，在注射了CFA的rAd-CMV-BTC治疗NOD小鼠与正常小鼠之间，在血液葡萄糖清除方面没有显著性差异。相反，注射了CFA的rAd-CMV-βgal治疗NOD对照小鼠血液葡萄糖水平在所有测量时间点都显著高于rAd-BTC治疗的小鼠(图4C)。这些结果显示当免疫平衡得到正确控制时，rAd-BTC基因治疗可导致自身免疫性糖尿病的完全好转。

使用两个糖尿病动物模型，即化学诱导的和自发的自身免疫性糖尿病小鼠，上文的结果显示经rAd-CMV-BTC治疗的小鼠中BTC的组成型表达和分泌通过ErbB-2受体诱导了胰腺中胰岛素生成细胞的再生，导致了糖尿病长期的、完全的好转。这一BTC基因治疗在动物模型中的成功证明了其对于治愈人体中I型糖尿病具有治疗有效性，以及阻止对再生的β细胞自身免疫攻击的免疫学策略。BTC基因治疗将克服限制移植疗法的免疫学匹配供体胰岛短缺的问题，并且不需要任何手术操作。

贯穿本申请，在括号中引用了许多出版物。这些出版物的内容以整体作为引用并入本申请，以更完整的描述本发明所属的技术领域的情况。

尽管通过公开的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当容易理解，具体的实施例和上文详述的研究只是对本发明的举例说明。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可作出各种修改。因此，本发明只受所附权利要求的限制。

序列表

<110>国际创新生物技术研究所有限公司

Yoon，Ji-Won

<120>用于治疗糖尿病的组合物和方法

<130>61359-023

<150>60/649,674

<151>2005-02-03

<150>60/671,562

<151>2005-04-15

<150>60/689,649

<151>2005-06-01

<160>14

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>240

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(240)

<400>1

gat ggg aat tcc acc aga agt cct gaa act aat ggc ctc ctc tgt gga 48

Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

gac cct gag gaa aac tgt gca gct acc acc aca caa tca aag cgg aaa 96

Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys

20 25 30

ggc cac ttc tct agg tgc ccc aag caa tac aag cat tac tgc atc aaa 144

Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys

35 40 45

ggg aga tgc cgc ttc gtg gtg gcc gag cag acg ccc tcc tgt gtc tgt 192

Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys

50 55 60

gat gaa ggc tac att gga gca agg tgt gag aga gtt gac ttg ttt tac 240

Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr

65 70 75 80

<210>2

<211>80

<212>PRT

<213>人

<400>2

Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys

20 25 30

Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys

35 40 45

Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys

50 55 60

Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr

65 70 75 80

<210>3

<211>178

<212>PRT

<213>人

<400>3

Met Asp Arg Ala Ala Arg Cys Ser Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ile Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp

20 25 30

Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp

35 40 45

Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly

50 55 60

His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly

65 70 75 80

Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp

85 90 95

Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu

100 105 110

Arg Gly Asp Arg Gly Gln Ile Leu Val Ile Cys Leu Ile Ala Val Met

115 120 125

Val Val Phe Ile Ile Leu Val Ile Gly Val Cys Thr Cys Cys His Pro

130 135 140

Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr

145 150 155 160

Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr Asn

165 170 175

Ile Ala

<210>4

<211>178

<212>PRT

<213>牛

<400>4

Met Ala Arg Ala Ala Pro Gly Ser Gly Ala Ser Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Pro Ala Leu Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp

20 25 30

Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Asp Asp Gly Leu Leu Cys Gly Asp

35 40 45

His Ala Glu Asn Cys Pro Ala Thr Thr Thr Gln Pro Lys Arg Arg Gly

50 55 60

His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly

65 70 75 80

Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp

85 90 95

Glu Gly Tyr Ala Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu

100 105 110

Arg Gly Asp Arg Gly Gln Ile Leu Val Ile Cys Leu Ile Ala Val Met

115 120 125

Val Ile Phe Ile Ile Leu Val Val Ser Ile Cys Thr Cys Cys His Pro

130 135 140

Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Arg Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr

145 150 155 160

Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Asp Asp Ile Gln Glu Thr Ser

165 170 175

Ile Ala

<210>5

<211>177

<212>PRT

<213>小鼠

<400>5

Met Asp Pro Thr Ala Pro Gly Ser Ser Val Ser Ser Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Val Ile Ala Leu Gly Leu Ala Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp

20 25 30

Gly Asn Thr Thr Arg Thr Pro Glu Thr Asn Gly Ser Leu Cys Gly Ala

35 40 45

Pro Gly Glu Asn Cys Thr Gly Thr Thr Pro Arg Gln Lys Val Lys Thr

50 55 60

His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile His Gly

65 70 75 80

Arg Cys Arg Phe Val Val Asp Glu Gln Thr Pro Ser Cys Ile Cys Glu

85 90 95

Lys Gly Tyr Phe Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu

100 105 110

Gln Gln Asp Arg Gly Gln Ile Leu Val Val Cys Leu Ile Val Val Met

115 120 125

Val Val Phe Ile Ile Leu Val Thr Gly Val Cys Thr Cys Cys His Pro

130 135 140

Leu Arg Lys His Arg Lys Lys Lys Lys Glu Glu Lys Met Glu Thr Leu

145 150 155 160

Asp Lys Asp Lys Thr Pro Ile Ser Glu Asp Ile Gln Glu Thr Asn Ile

165 170 175

Ala

<210>6

<211>128

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>BTC的共有比对序列

<400>6

Met Ala Pro Ser Ser Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Ile Leu

1 5 10 15

His Cys Val Val Ala Asp Gly Asn Thr Arg Pro Glu Gly Leu Cys Gly

20 25 30

Glu Asn Cys Thr Thr Lys His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys

35 40 45

His Tyr Cys Ile Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Glu Gln Thr Pro Ser

50 55 60

Cys Cys Gly Tyr Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Asp Arg Gly Gln Ile Leu Val Cys Leu Ile Val Met Val Phe Ile Ile

85 90 95

Leu Val Cys Thr Cys Cys His Pro Leu Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu

100 105 110

Glu Met Glu Thr Leu Lys Asp Thr Pro Ile Asp Ile Glu Thr Ile Ala

115 120 125

<210>7

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>代表性的假定前导序列-不来自任何生物

<400>7

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagat 75

<210>8

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>代表性的假定前导序列-不来自任何生物

<400>8

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gac 63

<210>9

<211>1647

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的腺病毒载体序列

<220>

<221>启动子

<222>(1)...(795)

<223>CMV启动子/增强子

<220>

<221>内含子

<222>(857)...(989)

<223>B-珠蛋白/IgG嵌合内含子

<220>

<221>polyA_信号

<222>(1426)...(1647)

<223>SV40晚期PolyA信号

<220>

<221>信号肽

<222>(1095)...(1166)

<223>白蛋白前导序列

<220>

<221>CDS

<222>(1167)...(1406)

<223>β细胞素[1-80]cDNA

<400>9

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660

cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720

tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780

tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840

gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900

actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960

tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020

aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcctc gagaattcac gcgtggtacc 1080

tctagagtcg acccatgaag tgggtaacct ttatttccct tctttttctc tttagctcgg 1140

cttattccag gggtgtgttt cgtcgagatg ggaattccac cagaagtcct gaaactaatg 1200

gcctcctctg tggagaccct gaggaaaact gtgcagctac caccacacaa tcaaagcgga 1260

aaggccactt ctctaggtgc cccaagcaat acaagcatta ctgcatcaaa gggagatgcc 1320

gcttcgtggt ggccgagcag acgccctcct gtgtctgtga tgaaggctac attggagcaa 1380

ggtgtgagag agttgacttg ttttactagg ggcggccgct tcgagcagac atgataagat 1440

acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 1500

aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca 1560

acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga gatgtgggag gttttttaaa 1620

gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggta 1647

<210>10

<211>312

<212>DNA

<213>人

<400>10

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagatgggaa ttccaccaga agtcctgaaa ctaatggcct cctctgtgga 120

gaccctgagg aaaactgtgc agctaccacc acacaatcaa agcggaaagg ccacttctct 180

aggtgcccca agcaatacaa gcattactgc atcaaaggga gatgccgctt cgtggtggcc 240

gagcagacgc cctcctgtgt ctgtgatgaa ggctacattg gagcaaggtg tgagagagtt 300

gacttgtttt ac 312

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>11

agtgggtaac ctttatttcc 20

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>12

gtaaaacaag tcaactctct c 21

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>13

aggcttttgt caagcag 17

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>14

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Claims

1.一种包含核酸的载体，该核酸可操作性地连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列，其中BTC的表达产生分泌的成熟BTC。

2.权利要求1的载体，其中所述载体包含腺病毒载体。

3.权利要求1的载体，其中所述分泌前导序列编码核酸是白蛋白或免疫球蛋白κ链前导序列。

4.权利要求1的载体，其中所述分泌前导序列编码核酸包含编码白蛋白分泌前导序列的核苷酸序列。

5.权利要求1的载体，其中所述人BTC编码核酸包含与SEQ IDNO：1所显示的基本相同的核苷酸序列。

6.权利要求1的载体，其中所述人BTC编码核酸包含编码与SEQ IDNO：2所显示的基本相同的氨基酸序列的核苷酸序列。

7.权利要求4的载体，其中所述白蛋白分泌前导序列编码核酸包含与SEQ ID NO：7基本相同的核苷酸序列。

8.权利要求4的载体，其中所述白蛋白分泌前导序列编码核酸包含编码与SEQ ID NO：10的第1-72位核苷酸基本相同的氨基酸序列的核苷酸序列。

9.一种包含核酸的载体，该核酸可操作性地连接着巨细胞病毒(CMV)启动子以及增强子区域、β-珠蛋白嵌合内含子、白蛋白前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及SV40多聚腺苷酸化信号序列，其中BTC的表达产生分泌的成熟BTC。

10.权利要求9的载体，其中所述载体包含腺病毒载体。

11.权利要求9的载体，其中所述人BTC编码核酸包含与SEQ IDNO：1所显示的基本相同的核苷酸序列。

12.权利要求9的载体，其中所述人BTC编码核酸包含编码与SEQID NO：2所显示的基本相同的氨基酸序列的核苷酸序列。

13.权利要求9的载体，其中所述白蛋白分泌前导序列编码核酸包含与SEQ ID NO：7基本相同的核苷酸序列。

14.权利要求9的载体，其中所述白蛋白分泌前导序列编码核酸包含编码与SEQ ID NO：10的第1-72位核苷酸基本相同的氨基酸序列的核苷酸序列。

15.权利要求9的载体，其包含如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

16.含有权利要求1、9或15的载体的宿主细胞。

17.一种治疗或预防糖尿病的方法，其包括对个体施用有效量的带有载体的病毒颗粒，该载体表达分泌的成熟人β细胞素(BTC)或者其功能性片段，所述载体含有核酸，该核酸可操作性地连接着启动子、内含子、分泌前导序列编码核酸、人β细胞素(BTC)编码核酸或者其功能性片段、以及多聚腺苷酸化信号序列。

18.权利要求17的方法，其中所述载体包含腺病毒载体。

19.权利要求17的方法，其中所述分泌前导序列编码核酸是白蛋白或免疫球蛋白κ链前导序列。

20.权利要求17的方法，其中所述分泌前导序列编码核酸包含编码白蛋白分泌前导序列的核苷酸序列。

21.权利要求17的方法，其中所述人BTC编码核酸包含与SEQ IDNO：1所显示的基本相同的核苷酸序列。

22.权利要求17的方法，其中所述人BTC编码核酸包含编码与SEQID NO：2所显示的基本相同的氨基酸序列的核苷酸序列。

23.权利要求20的方法，其中所述白蛋白分泌前导序列编码核酸包含与SEQ ID NO：7基本相同的核苷酸序列。

24.权利要求20的方法，其中所述白蛋白分泌前导序列编码核酸包含编码与SEQ ID NO：10的第1-72位核苷酸基本相同的氨基酸序列的核苷酸序列。

25.权利要求17的方法，其中所述载体在药用可接受载体中进行施用。