JP4620739B2

JP4620739B2 - Ｃｈｏ細胞に対する細胞保存戦略を最適化するためのフローサイトメトリ分析の使用

Info

Publication number: JP4620739B2
Application number: JP2007539586A
Authority: JP
Inventors: ヒットカウフマン; ユールゲンフィーダー; ラルフオットー
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムファルマゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツングウントコンパニーコマンディトゲゼルシャフト
Priority date: 2004-11-10
Filing date: 2005-11-07
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2025-11-07
Also published as: CY1110345T1; ATE433110T1; WO2006051065A3; ES2325931T3; TW200634161A; PL1820022T3; WO2006051065A2; US20060121444A1; US7569339B2; DK1820022T3; US20100086947A1; JP2008518611A; CA2578400C; DE602005014805D1; EP1820022A2; KR101235658B1; TWI364459B; PT1820022E; SI1820022T1; EP1820022B1

Description

本発明はCHO細胞におけるバイオ医薬品の製造に関する。特に、凍結保存による高品質のマスターセルバンク、ワーキングセルバンク、ポストプロダクションセルバンクの作成に関係する。より詳細には、マスターセルバンク、ワーキングセルバンク、ポストプロダクションセルバンクにおいて凍結保存される細胞の増殖及び特性解析に関係する。更にまた、本発明は、凍結保存した細胞バンクの高処理能力の特性解析のためにアネキシンVで染色した細胞にフローサイトメトリ(FC)分析を使う新規な戦略に関連する。

ヒト治療に用いられるバイオ医薬品のための市場は、ここ10年で非常に速い速度で成長し続けている。CHO細胞系は、生産、安全性及び調節の態様に最も魅力的な哺乳動物の発現系の1つである。均一な品質の治療製品を確実にするために、これらの細胞系の細胞保存システムは極めて重要である。CHO細胞のマスターセルバンク(MCB)、ワーキングセルバンク(WCB)及びポストプロダクションセルバンク(PPCB)の生成は、その細胞系のバイオ医薬品の製造プロセスの開発に不可欠な工程である。それらの作成が製品の臨床的開発を支えるだけでなく、最終的に市場供給段階も支えるので、これらのバンクの品質は重要である。
セルバンクの品質を特徴付ける主なパラメータは、解凍後の培養細胞の長期生存である。その上、長期生存の他に、頑丈さ及び安定性もまた、適切なセルバンクの不可欠な特性である。バイアルを解凍することから頑丈な発育、遺伝的安定性及び高い培養生存率の植込み培養を確立することまでにかかる時間は、セルバンクの品質を評価するために重要である。最後に、高品質のセルバンクは、これらのパラメータの全てがバンクの長期の貯蔵期間にわたって安定なままであることを保証しなければならない。これらの特性は全て、与えられた生産細胞系の凍結保存の方法に大きく左右される。
今日、ヒトタンパク質を正しくプロセシングするとともに修飾するその能力のために、CHO細胞から生産されるバイオ医薬品が増えつづけている。第一世代のCHO細胞ベース生産プロセスは、培養液の血清の存在を専ら必要とした。安全性と調節性の利点により、現在はプロセス全体に細胞の無血清培養が可能である新規な細胞系及び培養法の開発がもたらされた(Merten, 1999)。しかしながら、全ての生産プロセスから血清を除去するには、無血清凍結媒体を用いたマスターセルバンク及びワーキングセルバンクに細胞が保存されることが必要となる。血清の保護効果を少なくとも部分的に置き換えることができる凍結保護物質を用いた細胞の細胞保存のための種々の戦略が記載されてきた(Groth et al., 1991)。しかしながら、このようなあらゆる戦略の成功は、細胞系、媒体及び凍結及び解凍のためのプロトコールに非常に左右される。それ故、種々の凍結保存戦略の評価は、成功したプロセス開発にとって不可欠である。

現在、新しく作成されたセルバンクの最初の評価は、決められた数のバイアルを解凍し且つ5-10継代の細胞を培養することによって行われている。トリパンブルー排除によって求められる細胞数と生存率は、凍結保存後の細胞の回収を記載するために通常用いられるパラメータである。
プログラム細胞死又はアポトーシスは、適当な胚発生及び成体における組織ホメオスタシスに重要な過程である。プログラム細胞死は、死を誘発するシグナルを細胞内生化学的プロセスに変換し、最終的には細胞の完全な破壊に至る全ての多細胞生物に保存される分子の特定のサブセットによって制御される(Vaux and Korsmeyer 1999)。一旦引き金が引かれると、アポトーシスは、細胞型によっては種々の速度論で進行し、細胞破壊やアポトーシス体の形成で終わる。アポトーシスの臨界期は、死にかけている細胞による表面変化の獲得を含み、最終的には食細胞によるこれらの細胞の認識と取込みが引き起こされる。アポトーシス細胞の表面上の種々の変化、例えば、トロンボスポンジン結合部位の発現、シアル酸残基の消失、ホスファチジルセリン(PS)のようなリン脂質の露出は、以前に述べられている。リン脂質は、細胞質膜の内部と外部のリーフレットとの間に非対称的に分配され、ホスファチジルコリンとスフィンゴミエリンが脂質二重層の外部リーフレットにさらされ、ホスファチジルセリンがサイトゾルに対向する内面に主に見られる。アポトーシスを受ける細胞は、それらの細胞質膜のリン脂質非対称を分解し、PSをさらし、膜の外層に転位する。このことは、細胞膜が無傷のままであるアポトーシス細胞死の初期相に起こる。従って、PSの露出は、死にかけている細胞の初期の広範な特質である。抗凝血性をもつ、最近発見されたタンパク質、アネキシンのファミリに属するアネキシンVは、Ca²⁺の存在下にPSのような負に荷電したリン脂質に優先して結合し且つホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンに最小限の結合を示すので、アポトーシス細胞を検出するのに有効なツールであることがわかった。アポトーシスと関連している形態学的変化が起こる前に、また、膜の完全な状態が失われる前に、細胞膜に結合するアネキシンVを測定することによって分析されるPS非対称の変化を検出した。
アネキシンVにFITCを結合することによってフローサイトメトリにより単細胞に基づくアポトーシス細胞を同定し定量化することが可能である(Steensma et al., 2003)。FITC-アネキシンV(緑色蛍光)及び失活色素ヨウ化プロピジウム(赤色蛍光)による細胞の同時染色は、無傷細胞(FITC-PI-)、初期アポトーシス細胞(FITC+PI-)及び後期アポトーシス細胞又は壊死細胞(FITC+PI+)の区別を可能にする(二変形分析)。

背景技術の項で述べたように、凍結保存されたセルバンクの品質は、バイオ医薬品の製造のためのセルバンクの使用に極めて重要である。本発明の意味において、品質は、凍結保存されたセルバンクから始まって増殖し増大した、細胞の解凍後生命力、頑丈さ、表現型/遺伝子の安定性及び長期保存品質を意味する。本発明は、プログラム細胞死、特にアポトーシスが凍結CHO細胞バンクの凍結保存されたCHO細胞の解凍後の細胞死の主因であるという驚くべき所見に基づく。驚くべきことに、CHO細胞の凍結保存されたセルバンクから増殖し増大した培養物の細胞における初期アポトーシスの証拠が、細胞がこのセルバンクから始まって増殖し増大したときに見られる、解凍後生命力、頑丈さ、表現型/遺伝子の安定性及び長期保存品質において意味する、CHO細胞バンクの品質と相関することが証明された。更に、アネキシンVが凍結保存後に解凍されたCHO細胞の初期アポトーシスを検出するのに適切なマーカーであることが証明された。
それ故、本発明は、CHO細胞の凍結保存されたセルバンクの特性を解析する際のアネキシンVの使用に関係する。特に、本発明は、好ましくはこのようなセルバンクの細胞の一部を解凍した直後に、CHO細胞の凍結保存されたセルバンクの特性を解析する方法におけるアネキシンVの使用に関する。本発明の実施態様によれば、更に、前記方法は、a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程; b)前記細胞を培養液中で培養する工程; c)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程; d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程を含む。
更なる実施態様によれば、本発明は、CHO細胞バンクの品質を決定する方法におけるアネキシンVの使用であって、前記方法が、a)細胞を、部分に分けて液体培地中にセルバンクとして凍結保存する工程; b)前記セルバンクの凍結保存された細胞の一部を解凍する工程; c)培養液において前記細胞を培養する工程; d)前記細胞をアネキシンVで染色することによって前記解凍した細胞の生命率を求める工程を含む、前記使用に関係する。液体培地の“細胞を部分に分けて凍結保存する”は、約0.25〜3E7細胞が各々容器内の1〜2mlの液体培地に凍結されることを意味する。セルバンクにつき、約200の容器又はバイアルが凍結される。

本発明は、また、解凍後のCHO細胞の凍結保存セルバンクの特性解析のためのアネキシンVを含むキットの使用であって、アネキシンVが解凍後の凍結保存細胞の生命率を求めるために用いられる、前記使用に関係する。本発明の好適な実施態様によれば、解凍後の凍結保存細胞の生命率は、a)凍結保存セルバンクの細胞の一部を解凍する工程; b)前記細胞を培養液中で培養する工程; c)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程; d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程を含む方法によって求められる。更にまた、本発明は、また、アネキシンV及び本明細書に記載される本発明の方法によってCHO細胞のセルバンクの特性解析においてアネキシンVを用いる情報を含む添付文書を含むキットを提供する。
本発明は、更に、a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程; b)前記細胞を適切な培養液中で培養する工程; c)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程; d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程を含む、CHO細胞バンクの特性を解析する方法を提供する。
実施態様によれば、更に、本発明は、a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程; b)前記細胞を適切な培養液中で培養する工程; c)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程; d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞とを算出する工程を含む、解凍後のCHO細胞バンクの生命率を測定する方法を提供する。

定義
“1つ又は複数の細胞培養を開始した”という用語は、凍結保存された細胞が解凍され、増殖及び前記細胞の細胞培養物への発育に適した培養条件に移された時点を意味する。
“細胞培養物”という用語は、細胞の発育に適した条件下で1つの容器内で培養された複数の細胞を意味する。
“解凍後生命力”という用語は、継代培養時における生細胞と非生細胞とのパーセントで測定された、与えられたセルバンクから増殖した細胞の解凍後回復の時間経過を意味する。このパラメータは、頑丈な植込み培養を確立し、続いて大規模な培養に拡大するのにかかる時間に不可欠である。それ故、重要なプロセスパラメータである。
“頑丈さ”という用語は、細胞培養物が、求められた解凍後生命力パターンに従って凍結保存後に回復する再現性を記載するものである。頑丈なセルバンクは、種々のバイアルの解凍後性能の間で小さい差になる。“1つのバイアル/複数のバイアル”という用語は、1つの容器内で凍結した多くの細胞を意味する。通常、バイアルは、1〜2mlの液体培地中約0.25〜3E7細胞を含有する。
細胞の“表現型/遺伝的安定性”という用語は、与えられたセルバンクからの細胞が一定の方法形式に関連する期間にわたって、例えば、約100〜300の下位継代に培養されるときに見られるRNA及びタンパク質発現量の変化によって定義される。不十分な品質（即ち低解凍後生命力）のセルバンクは、培養が開始した場合に高選択圧により不十分な表現型/遺伝的安定性を生じることがあり得る。本発明の意味における低解凍生命力は、50％以下、好ましくは30％以下、更に好ましくは20％以下、なお更に好ましくは15％以下の細胞が解凍後6時間以内はアネキシンV陽性であることを意味する。言い換えれば、高品質セルバンクは、50％を超える、好ましくは70％を超える、更に好ましくは80％を超える、なお更に85％を超える生存可能な細胞の解凍後の生命率（即ち解凍後6時間以内はアネキシンV陰性）を特徴とする。
‘長期保存品質’という用語は、与えられたセルバンクの長期の凍結保存、例えば、約20年までにわたって3つの上記パラメータの変化によって定義される。

発明の説明
哺乳動物の細胞培養プロセスから、特にCHO細胞を培養することから血清を除去する必要性によって、生産プロセスの種々の段階で細胞死に対する培養物の感受性が高くなった。凍結保存に続くCHO細胞の解凍の間の細胞死の詳細分析が得られた。驚くべきことに、本発明の知見は、プログラム細胞死又はアポトーシスがCHO細胞の凍結保存によって引き起こされる細胞死の支配的な形であることであった。驚くべきことに、早ければ3時間後ほどで、高レベルのホスファチジルセリンがCHO細胞の細胞表面に見られた。リン脂質非対称の消失から結果としてCHO細胞の表面上にホスファチジルセリンが示されることがプログラム細胞死の初期の特質である。この点で、細胞膜健全性はまだ無傷である。
解凍後の初期の時点、例えば、解凍後3〜24時間は、アネキシンV陽性染色CHO細胞がなお形態学的に無傷であることを示した(前方向-側面プロットに見られるように)。後の時点(解凍後約24-48時間)で、アネキシンV陽性染色CHO細胞の大多数は、前方向-側面-分散分析によって見られるように縮小/膜分解の徴候を示すことがわかった。驚くべきこれらの知見によれば、ヨウ化プロピジウム(PI)で染色され得るCHO細胞の割合は、解凍後24時間経過後に初めて著しく増大した。これらのデータは、凍結保存後のCHO細胞の細胞死の性質と時間経過について初めて説明するものである。特定のCHO細胞は、温培養液中に入れた数時間以内に破壊プログラムが開始された徴候を示し、続いてこれらの細胞は48時間かけて分解する。
アネキシンVは、まず最初に強い抗凝血性をもつ血管タンパク質として記載された(Reutelsberger et al., 1985)。これは、反復モティーフ（当初はエンドネキシンループと名付けられた）によって定義されるタンパク質の多重遺伝子族に属すると思われる。その間に、いくつかの種類のアネキシンVタンパク質をコードする遺伝子配列が同定されクローン化された。例えば、NCBIタンパク質データベース受託No.NP_001145を参照のこと。
それ故、本発明は、凍結保存されたCHO細胞バンクの特性を解析する際のアネキシンVの使用に関する。特に、本発明は、CHO細胞の凍結保存されたセルバンクの特性を解析する方法におけるアネキシンVの使用に関する。本発明の更なる実施態様によれば、前記方法は、a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程; b)前記細胞を培養液中で培養する工程; c)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程; d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程を含む。

更なる実施態様によれば、本発明はまた、CHO細胞バンクの品質を決定する方法におけるアネキシンVの使用であって、前記方法が、a)セルバンクとして液体培地の部分に細胞凍結保存する工程; b)前記セルバンクの凍結保存された細胞の一部を解凍する工程; c)前記細胞を培養液中で培養する工程; d)前記細胞をアネキシンVで染色することによって前記解凍された細胞の生命率を求める工程を含む、前記使用に関係する。CHO細胞バンクの品質のための基準は、細胞がこのセルバンクから始まって増殖し増大した場合に見られる、解凍後生命力、頑丈さ、表現型/遺伝子の安定性及び長期保存品質である。これらの基準は、凍結/解凍プロセスを生き残るCHO細胞の数、言い換えれば“無傷細胞”の数が主に影響する。無傷CHO細胞が数多く存在することは、始原細胞培養物の高速発育を保証し、細胞培養物を大規模発酵まで増大させるのに必要な、それ故、遺伝子変異体が培養物を確立及び/又は支配することができるリスクを最小限にするのに必要な継代培養工程の数を減少させる。生命率は、好ましくは、アネキシンV-結合細胞の検出及び定量化を意味するアネキシンV染色によって推定する。それ故、本発明の更に好ましい実施態様によれば、解凍後に増殖及び増大するCHO細胞の生命率を推定するアネキシンV染色のプロセスは、a)解凍後細胞をアネキシンVとインキューベートする工程; b)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; c)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; d)アネキシンV結合とアネキシンV非結合細胞との比率を算出する工程を含む。CHO細胞の例を表1に示す。

表1:CHO細胞系

DNAラダリングやTUNEL分析など、アポトーシス細胞培養物の検出のための様々な分析法が説明されてきた(Gavrieli et al., et al., 1992; Wijsman et al., 1993)。しかしながら、アポトーシス検出のフローサイトメトリ法は、数千の細胞の特性の急速な定量化を可能にするので上記の技術よりいくつかの利点を与える。フローサイトメトリ計測法の使用は、種々の戦略の急速な高処理能力評価を可能にし、与えられた細胞系のための成功したセルバンクを作成する。このために、また、本発明の更なる実施態様によれば、アネキシンVは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識される。このことは、解凍後の細胞の生命率を推定するためのフローサイトメトリアネキシンV親和性分析の使用を可能にする。それ故、本発明は、また、CHO細胞バンクの凍結保存した細胞をそのセルバンクの細胞の一部を解凍した後にフローサイトメトリ分析においてFITC標識アネキシンVで染色する方法に関係する。このような分析の一例は、本明細書の実施例の項において更に詳細に示される。
本明細書に示される結果から、凍結/解凍工程が細胞生存率のトリパンブルー排除分析(セルバンクの特性解析の技術状態を反映する標準法)によってモニタされる場合に典型的に見られる結果の説明が得られる。これらの古典的な解凍-制御実験は、一般に、解凍の直後に多数の生細胞を示し、生存率は解凍後24時間〜48時間においてのみ低下する。CHO細胞バンクに得られるデータの幅広い分析は、驚くべきことに、フローサイトメトリV親和性分析の予測値を示した。早ければ解凍後6時間ほどで測定されるアポトーシスのCHO細胞の割合によって、古典的な解凍制御実験では通常2-10日間かけてようやく得られる凍結保存戦略の成功に関する情報が提供される。それ故、本発明は、また、CHO細胞バンクの特性解析における又はCHO細胞バンクの品質を決定する方法におけるアネキシンVの使用であって、アネキシンVによるインキュベーション工程が凍結保存された細胞を解凍して培養を開始した後24時間、好ましくは18時間、より好ましくは12時間、更により好ましくは9時間、更により好ましくは6時間以内に行われる、前記使用を提供する。これに関連して、FITC標識アネキシンVを用いたフローサイトメトリ分析の使用は、最も好ましい方法である。

さらなる実施態様によれば、本発明はまた、解凍後の凍結保存されたCHO細胞バンクの特性解析のためのアネキシンVを含むキットの使用であって、解凍後の凍結保存されたCHO細胞の生命率を決定するためにアネキシンVが用いられる、前記使用に関係する。本発明の好ましい実施態様によれば、細胞培養物の生命率は、a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程; b)前記細胞を培養液中で培養する工程; c)前記細胞をアネキシンVでインキューベートする工程; d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程を含む方法によって決定される。更にまた、本発明は、アネキシンV及びCHO細胞バンクの特性解析においてアネキシンVを用いる情報を含む添付文書を含むキットを提供する。
本発明は、更に、CHO細胞バンクの特性を解析する方法であって、a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程; b)前記細胞を適切な培養液の培養する工程; c)前記細胞をアネキシンVでインキューベートする工程; d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程を含む、前記方法を提供する。実施態様によれば、更にまた、本発明は、解凍後CHO細胞バンクの生命率を測定する方法であって、a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程; b)前記細胞を適切な培養液中で培養する工程; c)前記細胞をアネキシンVでインキューベートする工程; d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程を含む、前記方法を提供する。本発明によって示されるように、早ければ解凍後24〜6時間ほどで測定されるアポトーシスのCHO細胞の割合は、古典的な解凍制御実験では通常2-10日間かけてようやく得られるCHO細胞の凍結保存戦略の成功に関する情報を提供する。それ故、本発明は、また、CHO細胞バンクの特性を解析するか又は解凍後のセルバンクの生命率を測定する方法であって、アネキシンVとのインキュベーション工程が、凍結保存された細胞を解凍して培養を開始した後24時間、好ましくは18時間、より好ましくは12時間、更に好ましくは9時間、更により好ましくは6時間以内に行われる、前記方法を提供する。
CHO細胞は、液体窒素中約-196℃で長期間巧く保存され得る。しかしながら、細胞は、通常は、DMSOのような凍結保護物質を添加せずに凍結及び解凍され得ない。それでも、凍結解凍プロセスにより、細胞が消失することになる。この消失量に重要なパラメータが凍結及び解凍プロセスに用いられるプロトコールである。一般的に、毎分約1度の速度で温度が低下することを確実にするように、凍結の間、温度低下を制御することは有益である。巧くCHO細胞を解凍するために、ほとんど全てのCHO細胞のラインの最適培養温度の37℃までできるだけ速くクリオバイアル(解凍細胞)を加温することが必要である。解凍後の培養物の高い回収率を確実にする一方法は、多量の血清を含有する培地中で細胞を凍結することである。

最近、凍結媒体において血清を用いずにCHO細胞に対する凍結保存戦略を開発することに多くの仕事が集中してきた。種々の凍結保護物質は、血清を存在させずに細胞の成功した長期保存を容易にすることができる。更に、このような基礎培地の組成物は、あらゆる凍結保存の成功に対して著しく影響する。このようなあらゆる戦略の記載された迅速な品質評価は、新規なCHO生産細胞系のマスター又はワーキングセルバンクを作成する信頼できるプロトコールを生成するために必要である大幅に短縮した開発時間を可能にする。更なる実施態様によれば、本発明は、CHO細胞のための培養液をCHO細胞の凍結保存のための前記培養液の使用に関して分析する方法であって、a)CHO細胞をそれらの細胞を培養するのに適した培養液中で、好ましくは-100℃未満の温度で、例えば、液体窒素中で凍結保存する工程; b)凍結保存された細胞の一部又は全てを解凍する工程; c)前記細胞を適切な培養液中で培養する工程; d)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程; e)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程; f)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程; g)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程を含む、前記方法を提供する。適切な培養液は、市販の培地、例えば、Ham's F12(Sigma、Deisenhofen、ドイツ)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbeccoの変法Eagle培地(DMEM; Sigma)、最少必須培地(MEM; Sigma)、Iscoveの変法Dulbecco培地(IMDM; Sigma)、CD-CHO(Invitrogen、カールズバッド、カナダ)、CHO-S-Invtirogen)、無血清CHO培地(Sigma)、無タンパク質CHO培地(Sigma)に基づくものである。好ましい方法によれば、前記培地は、特定の凍結保護物質、例えば、DMSO、BSA、メチルセルロース又はグリシンを含む。この方法のより好ましい実施態様によれば、アネキシンVとのインキュベーション工程は、凍結保存された細胞を解凍して培養開始後24時間、好ましくは18時間、より好ましくは12時間、更に好ましくは9時間、更により好ましくは6時間以内に行われる。フローサイトメトリ分析におけるFITC標識アネキシンVの使用は、発明の方法の更により好ましい実施態様である。
上で一般的に記載された本発明は、これにより本発明の特定の実施態様の具体的な説明のためだけに含まれ、決して本発明を限定するためのものではない、以下の実施例によってより容易に理解される。

略語
BSA: ウシ血清アルブミン
CHO: チャイニーズハムスター卵巣
DMSO: ジメチルスルホキシド
ELISA: 酵素結合イムノソルベント分析
FACS: 蛍光染色細胞選別機
FITC: フルオレセインイソチオシアネート
MCB: マスターセルバンク
PBS: リン酸緩衝食塩水
PCR: ポリメラーゼ連鎖反応
PI: ヨウ化プロピジウム
PPCB: ポストプロダクションセルバンク
PS: ホスファチジルセリン
WCB: ワーキングセルバンク

方法
細胞培養
バイオ医薬品の製造及び開発に用いられるいくつかのCHO浮遊細胞系のセルバンクを調べた。用いられる全ての細胞系は、所有権が保持されており、それらのタンパク製品は明らかにすることができない。製造及び開発規模で用いられる全ての細胞系を、インキュベータ(Thermo、ドイツ)内の表面通気T-フラスコ(Nunc、デンマーク)中又は37℃の温度で空気と5％CO₂の適切な混合物で特別に設計されたインキュベータルーム内の拡散スピナーフラスコ(Wheaton、米国)中の連続シードストック培養物に維持した。シードストック培養物を、適切な分割比と播種密度で2-3日毎に分けた。細胞濃度を、血球計算器を用いて全ての培養において求めた。生存率をトリパンブルー排除法によって評価した。培養物は、マスター、ワーキング又は安全性セルバンクに由来し、無菌性、マイコプラズマ及び外因性物質の存在を十分に試験した。全ての操作は、空気浄化された研究室において、“一般適正製造方法(cGMP)に対応する厳しい手順下で行われた。用いられる全ての培養液は所有権が保持されており、それらの組成は明らかにすることができない。

凍結保存
凍結及び解凍は、標準プロトコール及び基本的な原理“低温凍結-高速解凍”に従って行った。培養物を、浮遊培養から指数増殖期において取り出し、特別に設計された凍結プログラムによるコンピュータ制御の冷凍機(Consarctic、ドイツ)によるか又は-70℃の冷凍庫内のスタイロフォームボックスによって1.8mLプラスチックバイアル(Nunc、デンマーク)に凍結した。-100℃(冷凍機)又は-70℃(スタイロフォームボックス)に凍結した後、細胞を液体窒素容器へ移した。バイアルを液体窒素の気相(<-150℃)に保存した。凍結バイアル中の細胞濃度は、1-3E7細胞とした。DMSO(Merck、ドイツ)を凍結保護物質として10％の濃度で用いた。用いられる詳細な凍結培地も所有権が保持されており、それらの組成は明らかにすることができない。CHO細胞を、37℃の水浴中で解凍し、適切な培地で希釈し、及び180×gで遠心分離した(Thermo、フランス)。続いて、細胞を、特定の細胞濃度で培養培地に播種した。

フローサイトメトリ
グリーンアネキシンV-FITC及びPI赤色蛍光を、Expo32ソフトウェアを用いてCoulter Epics XLフローサイトメータ(Coulter、ドイツ)によって測定した。励起は、アルゴンレーザによる488nmで誘発され、標準バンドパス(530±20nm)フィルタとロングパス(>570nm)フィルタを用いて測定した。各試料において、アポトーシスについて10.000事象及び細胞周期分析について3.000事象を測定した。データをExpo32分析ツールで分析した。死細胞とアポトーシス細胞を区別するために、膜-不浸透性DNA染色ヨウ化プロピジウム(PI)を細胞浮遊液にアネキシンVと同時に添加した。この二重染色によって、生細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞、壊死細胞を区別することが可能である。アネキシンV分析は、製造元のプロトコールに従って行った(Becton-Dickinson、ドイツ)。細胞を分析し、アポトーシスをフローサイトメトリによって定量化した。細胞周期分配を決定するために、更にヨウ化プロピジウム染色を用いた。固定せずに細胞浮遊液から試料を取り出した。培養物を遠心分離し、PBS(Gibco、ドイツ)によって洗浄した。その後、PI染色液(BioSure、米国)を添加し、インキュベーションを30分間進行させた。続いて、フローサイトメトリによって細胞を分析した。細胞周期の各相における細胞の割合をマルチサイクルプログラムによって得た(Phoenix Flow、米国)。

結果
凍結保存されたCHO細胞の解凍の間での細胞死の定量分析:
凍結保存後に細胞の培養が再開始されるときにCHO細胞が死ぬことは既知であるが、この細胞死の速度論と種類はこれまで詳細には記載されていない。解凍後の最初の数時間の間にCHO細胞の細胞培養物におけるプログラム細胞死の程度を定量化するために、我々はCHO細胞の外膜に示されるホスファチジルセリンの量を求めた。CHO DG44細胞及びこの細胞系の誘導体は、バイオ医薬品の製造に広く用いられる。我々は、最初に、CHO誘導生産細胞系のために作成された220バイアルのセルバンクを分析した。セルバンクは、動物成分、例えば、血清を含まない凍結媒体を用いて作成され、解凍後の培養生存率に関して特に感受性があることを知った。細胞を、0時間、3時間、6時間、24時間及び48時間の時点でアネキシンV及びヨ化プロピジウムによる二重染色によって分析した。約30%のアネキシンV陽性細胞の高いパーセントは、細胞が培養液に入れた直後に検出され(0時間)、最初の3時間以内にほぼ50％まで増大し、解凍後最初の48時間は40％を超えて維持した。これまで分析した全てのCHO DG44セルバンクについて、アネキシンV陽性細胞のピークレベルは解凍後3時間〜24時間に達成された。それとは対照的に、PI陽性細胞の量は解凍直後に比較的低いままであり、解凍24時間後に著しく増加した。アポトーシスの初期の相において、PSは細胞表面に示され、アネキシンVはそれを標的に結合する。この初期相において、細胞質膜は依然としてPIを除外することができるので、細胞はアネキシンV +/PI-である(図1、下の方の右の四分割)。続いて、細胞はそれらの細胞質膜完全性及びPIを除外するそれらの能力を緩める。これらの後期アポトーシス細胞は、アネキシンV +/PI+(図1、上の方の右の四分割)である。それ故、これらの実験から、解凍後の最初の6時間後にのみ初期段階から後期段階アポトーシスへの転移が起こることが証明される。このことは、また、前方向-側面散布図(図1)に見られ、非常に小さな細胞の増加が示され、解凍後約24時間の転移点で細胞体の破壊(図1)が示されている。

アネキシンV染色による解凍後分析は、CHO細胞バンク品質の予測初期マーカーとして役に立つ:
アネキシンV染色によるアポトーシスの定量化が多数の試料に対して迅速に行われ得るので、種々の凍結保存方法の高処理能力分析に魅力的な方法を与える。我々は、アネキシンV染色によって2種類の異なるCHO生産細胞の2つのCHO細胞バンクを分析し、これらのデータを培養内6継代に対して測定したトリパンブルー排除染色(標準解凍制御)と比較した。図2Aに示されるように、ホスファチジルセリンを表示細胞の量は、2種類の異なるセルバンクから解凍した培養物間で著しく異なった(解凍1の35％と解凍2の67％)。古典的な解凍制御(図2B)によって、種々のバンクからの培養生存率間に同じ著しい差が示された。解凍1は、培養物が解凍後4日間で90%を超える生存率に回復される前に83%までの低下を示した。それとは対照的に、細胞の60％だけが解凍2の24時間後に生存可能であった。この培養物は、トリパンブルー排除によって定量されるように90％の生存率に達するために11日間かかった。この品質のセルバンクは、市販の生産プロセスに適していないことは明らかである。これらのデータは、驚くべきことに、表面上にPSを示す細胞のパーセントが解凍後6時間ほどの初期に古典的な解凍制御の成果を予測することを示している。

セルバンクの品質は、種々の細胞系、凍結保存プロトコール及び培養液の品質で劇的に変動し得る:
新規に記載されたセルバンク品質評価の方法を試験するために、我々は多くのセルバンクを分析した。2つのCHO DG44セルバンクを作成した。一方は凍結媒体中に0.8％BSAを含有し、もう一方はBSAを含有しないが順化培地と新しい培地の50:50混合物を含有する。図3に示されるように、細胞は、双方の凍結媒体の初期アポトーシスの比率がかなり低いことを示した。更にまた、順化培地に細胞を保存することと比較して0.8％BSAを添加する有益な効果は、スタイロフォームボックスが用いられた場合のみ明らかであった。

迅速な開発戦略のための解凍後初期アポトーシス測定の使用:
クリニックやマーケットの供給時期が新規なバイオ医薬品の成功した開発の重要なパラメータであるので、プロセス最適化及びプロセス改善のための迅速なスクリーニング法に発展する関心がある。それ故、我々は、新規なCHO生産細胞系の成功した凍結保存を確立するための戦略を評価するために解凍後たった6時間にアネキシンV測定を用いる実行可能性を決定した。
驚くべきことに、我々は、解凍後の初期アポトーシス測定が原材料品質の評価のための高感度ツールであることがわかる。CHO細胞の成功した凍結保存のための必須の因子は、用いられる培地の品質である。一般に、GMPには、CHO細胞を培養するための培地の使用の明らかに特定された使用期限が含まれる。我々は、凍結解凍プロセスの厳しい条件によって、標準培養手順と比較して培地の使用のための時間枠がより短くなってしまうかを調べた。我々は、これを更に調べるためにCHO細胞の培養のために4週間の貯蔵寿命を有する培地を用いた。図4は、新たに調製された培地(4の下)、4Cで4週間保存された培地(4の上)及び4Cで4週間保存された培地中で凍結保存され且つ使用直前に必須化合物の新しい標品で補足された(4の中央)CHO細胞のための初期アポトーシスデータ(解凍後6時間)を示す図である。これらのデータは、有効期限の直前にこの培地によって作成された細胞バンクの解凍性能低下を示す。この効果は、関連した培地の新たに調製された必須成分を添加することによって著しく減少され得る。解凍後6時間の細胞周期分配の同時定量によって、4週後の培地が発育阻止効果を有しなかったことが示された。驚くべきことに、これらの結果は、初期解凍後アポトーシス測定がCHO細胞の凍結保存のための培地標品の使用に関して培地及びそれらの成分の高感度分析にどのように用いることができるかを示している。

参照文献
Merten OW, Dev. Biol. Stand. 1999;99 167-80.Gavrieli et al., et al., 1992. J Cell Biol. 1992 Nov;119(3): 493-501.Groth J, et al., J Immunol Methods. 1991 Jul 26;141(1): 105-9.Vaux DL, Korsmeyer SJ, Cell. 1999 Jan 22;96(2): 245-54 Steensma DP, et al., Methods Mol. Med. 2003;85:323-32.

凍結保存後のCHO細胞培養物の細胞死を示すフィンガープリントである。CHO DG44細胞を、2E7細胞/mL の細胞濃度で、90%の培養媒体と10%のDMSOの中に冷凍機を用いて凍結させた。細胞を指定された時点でFACSによって分析した。最初のレーンは、Y軸上の前方向散布とX軸上の側面散布を示す。形態によって判断されるように、死細胞又は生細胞を示す細胞を区別するためにゲートを設定した。レーン2は同じグラフを示し、アネキシンV陽性のCHO細胞は白色で示されている。レーン3は、ヨウ化プロピジウム(PI)染色プロットとアネキシンV染色を示す。ドットは、前方向散布と対側面散布ゲートに従って灰色である。解凍6時間後のアネキシンV染色がセルバンク品質を予測することを示す図である。A. CHO DG44細胞を、2E7細胞/mL の細胞濃度で、90%の培養媒体と10%のDMSOの中に冷凍機を用いて凍結させた。セルバンクのサイズは、220バイアルとした。A). 6時間解凍後のアネキシンV染色細胞のFACS分析。前方向側面散布グラフ(図1に記載されたゲート)とアネキシンV強度プロットとしてデータをプロットした。B).解凍後培養物の発育及び生存率。細胞を、継代ごとに計数した。同時に、生存率をトリパンブルー排除によって求めた。異なるセルバンクが解凍後に異なるアポトーシスを示すことを示すグラフである。CHO DG44を、1E7又は2E7細胞/mLの細胞濃度で、様々な凍結媒体に冷凍機を用いて凍結した。セルバンクのサイズは、>200のバイアルとした。細胞を、2種類の異なる凍結媒体中で冷凍機又はスタイロフォームボックスを用いて凍結保存した。培養物を、解凍6時間後にアネキシンV染色によって分析した。媒体品質の試験のための初期アポトーシス測定の使用を示す図である。CHO DG44細胞を、2E7 細胞/mL の細胞濃度で、90%の培養媒体と10%のDMSOの中に冷凍機を用いて凍結した。セルバンクのサイズは、220のバイアルとした。異なる媒体製剤を、3つのセルバンクの作成に用いた。培養物について、細胞周期分配、前方向-側面散布及びアネキシンV染色を解凍6時間後にFACSによって分析した。

Claims

解凍後のCHO細胞のセルバンクの生命率を測定する方法におけるアネキシンVの使用であって、前記方法が、
a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程;
b)前記細胞を培養液中で培養する工程;
c)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程;
d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程;
e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程;
f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程
を含む、前記使用。
CHO細胞のセルバンクの品質を決定する方法におけるアネキシンVの使用であって、前記方法が、
a)細胞を、部分に分けて液体培地中にセルバンクとして凍結保存する工程;
b)前記セルバンクの凍結保存された細胞の一部を解凍する工程;
c)前記細胞を培養液中で培養する工程;
d)前記細胞をアネキシンVで染色することによって前記解凍された細胞の生命率を求める工程
を含む、前記使用。
アネキシンV染色が
a)解凍後細胞をアネキシンVとインキューベートする工程;
b)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程;
c)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程;
d)アネキシンV結合とアネキシンV非結合細胞との比率を算出する工程
によって得られることを特徴とする、請求項2記載の使用。
解凍後のCHO細胞のセルバンクの生命率を測定するための、アネキシンVを含むキットの使用であって、アネキシンVが、解凍後の凍結保存された細胞の生命率を決定するために用いられ、生命率を決定する方法が、
a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程;
b)前記細胞を培養液中で培養する工程;
c)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程;
d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程;
e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程;
f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程
を含む、前記使用。
キットが、PBS中のヨウ化プロピジウム染色液及びアネキシンV結合緩衝液を更に含む、請求項4記載の使用。
アネキシンVによるインキュベーション工程が、細胞を解凍して培養を開始した後24時間以内に行われることを特徴とする、請求項1及び3〜5のいずれか1項に記載の使用。
アネキシンVによるインキュベーション工程が、細胞を解凍して培養を開始した後6時間以内に行われることを特徴とする、請求項6記載の使用。
アネキシンVがフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用。
解凍後のCHO細胞のセルバンクの生命率を測定する方法であって、
a)凍結保存されたセルバンクの細胞の一部を解凍する工程;
b)前記細胞を適切な培養液中で培養する工程;
c)前記細胞をアネキシンVとインキューベートする工程;
d)アネキシンVに結合する細胞を検出し、その数を定量化する工程;
e)アネキシンVに結合しない細胞を検出し、その数を定量化する工程;
f)アネキシンV-結合細胞とアネキシンV-非結合細胞との比率を算出する工程
を含む、前記方法。
アネキシンVによるインキュベーション工程が、細胞を解凍して培養を開始した後24時間以内に行われることを特徴とする、請求項9記載の使用。
アネキシンVによるインキュベーション工程が、細胞を解凍して培養を開始した後6時間以内に行われることを特徴とする、請求項10記載の使用。
細胞染色がフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識アネキシンVで行われることを特徴とする、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。