TWI364459B - Use of flow-cytometric analysis to optimize cell banking strategies for cho cells - Google Patents

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1364459 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於在CHO細胞中生產生物醫藥。特定言之， 本發明係關於經由極冷保藏產生高品質之種源、工作及生 產後之細胞庫。更特定言之，本發明係關於極冷保藏於種 源、工作及後期生產細胞庫中細胞之繁殖及表徵。此外， 本發明係關於一種採用經膜聯蛋白v染色之細胞之流式細 胞儀（FC)分析以供高通量表徵經極冷保藏細胞庫之新穎策 略。 【先前技術】 在過去十年中，用於人類治療之生物醫藥市場以極高之 速率繼續增長。CH0細胞株為最具吸引力之關於生產、安 全及調節方面之哺乳動物表達系統之一。為確保治療產品 之統°0質’該等細胞株之細胞庫系統至關重要。CHO細 胞之種源細胞庫（MCB)、工作細胞庫（WCB)及生產後細胞 庫（PPCB)之創設為關於彼等細胞株中生物醫藥生產方法進 展中之基本步驟。由於該等細胞庫之產生不僅支持該產品 之臨床發展，而且最終支持市場之供應階段，因此該等細 胞庫之品質很關鍵。 表徵細胞庫品質之主要參數為解凍後經培養細胞之長期 存活。此外，除長期存活之外，穩固性及穩定性亦為合適 細胞庫之基本特性。自mm建立穩固生長之接種體 培養物所需之時間、遺傳穩定性及高培養物存活率對於評 胞庫之ηα質較為關鍵。最後，高品質細胞庫應確保所 105999.doc 1364459 有該等參數在庫之長期儲存期間均保持穩定β I ,孩等特 徵主要取決於極冷保藏給定生產細胞株之方法。 由於CHO細胞肴正確加工及修飾人類蛋白 艾θ艾能力，目前

曰益增加之生物醫藥係生產自CHO細胞。第—代基於ch〇 細胞之生產方法幾乎皆要求於培養基中有血清存在。在安 全性及調節上之各項益處導致新穎細胞株及培養方式之發 展，目前在整個過程中已可無血清培養細胞㈧奶如， 1999)。然而，為了自整個生產過程免除血清，亦要求細 胞儲存於無血清凍結培養基之種源及工作細胞庫中。關於 藉由使用可至少部分替代血清保護因子之低溫保護劑之細 胞之細胞庫，已有人描述了多種策略（Gr〇th等人，1991)。 然而，任一該策略之能否成功主要乃取決於細胞株、培養 基及用㈣結及解殊之程序。因此，對於方法之成功發展 而言，有必要對各種不同極冷保藏策略進行評估。

當前，藉由解較定數目之小瓶且培養細胞5·1()次來對 新產生之細胞庫進行首次評定。細胞數目及如由台盼藍排 除法（trypan blue exclusion)所測定之存活率為常規用於描 述極冷保藏後細胞恢復之參數。 聊進式細胞死亡或細胞瑪亡對於適當之胚胎發育及成 期組織穩定係至關重要之過程。漸進式細胞死亡受控於 存於所有多細胞生物體之特定分子亞群，該分子亞群將 亡誘導訊號轉移至細胞内生化過程t，其最終導致細胞 完全破壞（Vaux與K。職eyer，1999)。—旦觸發，細胞;周 即以視細胞類型而定之不同動力學進行，且以細胞破碎 105999.doc 1364459 凋亡小體形成結束。細胞凋亡之關鍵階段包括獲取最終導 致識別之死亡中細胞表面變化及經吞噬細胞攝取該等細 胞。先前已描述凋亡細胞表面之不同變化，諸如凝血因子 結合位點之表達、唾液酸殘基之遺失及磷脂（如磷脂醯絲 胺酸（ps))之曝露。磷脂非對稱分佈於質膜之内層與外層之 間’磷脂醯膽鹼及鞘磷脂曝露於脂質雙層之外層小葉上， 且主要在面向細胞液之内表面上觀察到磷脂醯絲胺酸。經 受細胞凋亡之細胞打破其質膜之磷脂非對稱性且曝露出 PS ’其移位至膜外層。此發生於凋亡細胞死亡早期，其間 細胞膜保持完整。因此，PS曝露係死亡中細胞之早期及普 遍特點。臈聯蛋白V’屬於近來發現之蛋白家族，該等具 有抗凝特性之膜聯蛋白已證明為用於偵測凋亡細胞之工 具’因其在Ca2+存在下優先結合至負電荷磷脂（如PS)上且 對填脂酿膽鹼及鞘磷脂顯示最小結合。在發生與細胞凋亡 相關聯之形態變化之前及在失去膜完整性之前，偵測到藉 由量測結合至細胞膜之膜聯蛋白V所分析之ps非對稱性之 變化。 藉由使FITC與膜聯蛋白v共輛，可能由流式細胞儀識別 及里化基於單細胞之凋亡細胞（Steensma等人，2003)。同 時以FITC-膜聯蛋白v(綠色螢光）及非致命性染料碘化丙啶 (紅色螢光）進行細胞染色使得可（雙變數分析）辨別完整細 胞（FITC-PI-)，早期凋亡（FITC+pi_)及晚期凋亡或壞死細胞 (FITC+PI+) 〇 【發明内容】 105999.doc 1364459 如背景技術部分所提及’經極冷保藏細胞庫之品質在使 用細胞庫用於生產生物醫藥中尤為關鍵。在本發明之涵義 中’品質意謂自經極冷保藏之細胞庫開始繁殖並擴展之細 胞解凍後之存活率、穩固性、表型/基因型穩定性及長期 保藏品質。本發明係基於令人驚訝之發現，即漸進式細胞 死亡，特定言之為細胞凋亡，係冷凍CH〇細胞庫中經極冷 保藏之CHO細胞解凍後細胞死亡之主要原因。其亦令人驚 訝地表明與CHO細胞庫之品質相關之自CH〇細胞之極冷保 藏細胞庫繁殖及擴展之培養物細胞凋亡之跡象，其意謂於 細胞自該細胞庫開始繁殖及擴展時所觀察之解凍後之存活 率、穩固性、表型/基因型穩定性及長期保藏品質。已進 一步表明膜聯蛋白V係適合用於偵測在極冷保藏後解東之 CHO細胞早期細胞凋亡之標記物。 因此，本發明係膜聯蛋白V在表徵CHO細胞之經極冷保 藏細胞庫中之用途。特定言之’本發明係關於膜聯蛋白、 在表徵CHO、細胞之經極冷保藏細胞庫之方法中之用途，較 佳於解凍該細胞庫之一部分細胞後不久時。根據本發明之 進一步實施例，該方法包括以下步驟：a)解凍經極冷保藏 細胞庫之一部分細胞；b)於培養基中培養該等細胞；c)u 膜聯蛋白V培育該等細胞；d)偵測細胞且量化結合至膜聯 蛋白V之細胞數目；e)偵測細胞且量化未結合至膜聯蛋白v 之細胞數目；f)計算結合膜聯蛋白V細胞與未結合膜聯蛋 白V細胞之比率。 根據進一步實施例，本發明亦係關於膜聯蛋白V在測定 105999.doc ⑧ 1364459 CHO細胞庫品質之方法中之用途，其中該方法包括以下步 驟：a)將細胞部分極冷保藏於液體培養基中作為細胞庫； b)解康該細胞庫之一部分經極冷保藏細胞；c)於培養基争 培養該等細胞；d)藉由以膜聯蛋白V染色該等細胞以確定 該等解凍細胞之存活率等級。"將細胞部分極冷保藏"於液 體培養基意謂每約0.25至3E7個細胞冷凍於一容器中之1至 2 ml液體培養基中。對於每一細胞庫，冷凍約2〇〇個容器 或小瓶。 本發明亦係關於包含膜聯蛋白V之套組在表徵解凍後 CHO細胞之細胞庫中之用途，其中膜聯蛋白v用於測定經 極冷保藏細胞解凍後之存活率等級。根據本發明之較佳實 施例，經極冷保藏細胞解殊後之存活率等級藉由包括以下 步驟之方法來測定：a)解凍經極冷保藏細胞庫之一部分細 胞；b)於培養基上培養該等細胞；c)以膜聯蛋白V培育該 等細胞；d)偵測細胞且量化結合至膜聯蛋白V之細胞數 目；e)偵測細胞且量化未結合至膜聯蛋白V之細胞數目；f) 計算結合膜聯蛋白V細胞與未結合膜聯蛋白V細胞之比 率。此外，本發明亦提供包含膜聯蛋白V之套組及包括藉 由本文所述之發明性方法使用膜聯蛋白V表徵CHO細胞之 細胞庫之資訊的說明書。 本發明進一步提供用於表徵CH0細胞庫之方法，其包括 以下步驟：a)解凍經極冷保藏細胞庫之一部分細胞；b)於 適當培養基中培養該等細胞；c)以膜聯蛋白V培育該等細 胞；d)偵測細胞且量化結合至膜聯蛋白V之細胞數目；e) 105999.doc • 10· 1364459 偵測細胞且量化未結合至膜聯蛋白v之細胞數目；f)計算 結合膜聯蛋白V細胞與未結合膜聯蛋白V細胞之比率。 根據進一步實施例，本發明亦提供用於量測解凍後CHO 細胞庫存活率等級之方法，其包括以下步驟：幻解凍經極 冷保藏細胞庫之一部分細胞；b)於適當培養基中培養該等 細胞；c)以膜聯蛋白V培育該等細胞；d)偵測細胞且量化 結合至膜聯蛋白V之細胞數目；约偵測細胞且量化未結合 至膜聯蛋白V之細胞數目；f)計算結合膜聯蛋白乂細胞與未 結合膜聯蛋白V細胞之比率。 【實施方式】 定義 術語”起始（多種）細胞培養物"係指經極冷保藏之細胞經 解凍且轉移至適合該等細胞繁殖及生長為細胞培養物之培 養條件之時間點。 術語"細胞培養物"意謂於適合細胞生長之條件下於容器 中培養之多種細跑。 術語"解凍後存活率"意謂在繼代培養時以可存活細胞與 不可存活細胞之百分比量測之自給定細胞庫繁殖之細胞解 康後恢復之時程。該參數係詩建立穩gj接種體培養物及 隨後擴大為大規模培養之時間之要素。因此，其為一關鍵 工藝參數。 術語"穩固性”描述極冷保藏後細胞培養物根據所建立解 ;東後存活率模式恢復之再現性。㈣細胞庫在其不同小瓶 之解束後效能上可導致微小差異。術語”小瓶"意謂於_容 105999.doc U ⑧ 1364459 态中冷凍之細胞數目。一小瓶通常於1至21111液體培養基中 含有約0.2 5至3 Ε 7個細胞。 術語細胞之"表型/基因型穩定性"係由RNA及蛋白表達水 平之改變而定義，該表達水平之改變係於來自特定細胞庫 中之細胞相對於特定工藝模式（例如經約1 〇〇至3〇〇次更替 繼代接種）培養一段時間後所觀察。劣質細胞庫（即低解凍 後存活率）因起始培養物時之高選擇壓力而將引起差表型/ 基因型穩定性。在本發明之涵義中，低解凍後存活率意謂 不多於50%，較佳多於30%，更佳多於2〇%，進一步更佳 多於15%之細胞在解凍後6 h内為膜聯蛋白V陽性的。換言 之，高品質細胞庫之特徵在於解凍後多於50〇/〇，較佳多於 70%，更佳多於80%，進一步更佳多於85%之細胞可存活 (其意謂解凍後6 h内膜聯蛋白v為陰性）之存活率等級。 術語"長期保藏品質"由經長期極冷保藏後（例如，約長至 20年）給定細胞庫上述三個參數之改變來定義。 發明說明 自哺乳動物細胞培養程序中（特定言之，自經培養CHO 細胞中）移除血清之必要性已導致在生產程序之不同階 段’培養物對細胞死亡之較高敏感性。提供對於在極冷保 藏後解凍CHO細胞期間細胞死亡之詳細分析。本發明之一 令人驚許之發現即漸進式細胞死亡或細胞凋亡係由CHO細 胞之極冷保藏導致之主要細胞死亡形式。早在3 h之後， 即於CHO細胞之細胞表面上令人驚訝地發現磷脂醯絲胺酸 含量增加。由填脂非對稱性之喪失導致在CHO細胞表面上 105999.doc -12· ⑧ 1364459 顯示磷脂醯絲胺酸係漸進式細胞死亡之早期特點。在該點 .上，細胞膜完整性仍完整無缺。 解凍後之早期時間點，例如解凍後3至24 h，顯示膜聯 蛋白V染色陽性之CHO細胞仍在形態學上完整無缺（如參見 前向-側向-散射圖）。在稍後時間點（約解凍後24_48 h)，大 多數膜聯蛋白V染色陽性之CH〇細胞似乎顯示收縮/膜分解 徵象，如參見前向-侧向散射分析。根據該等令人驚訝之 發現，可以碘化丙啶（PD染色之CH〇細胞之百分比僅於解 凍24 h後顯著增加。該等資料首次描述了極冷保藏後ch〇 細胞之細胞死亡的性質及時程。某些CH〇細胞在置於溫暖 培養基數小時内顯示已起始破壞程序之徵象，且隨後該等 細胞經4 8 h分解。 膜聯蛋白V最初描述為具有強抗凝特性之血管蛋白 (Reutelsberger等人，1985)。其似乎屬於由重複主結構界 定之多基因蛋白家族，其初始稱為内聯蛋白環。同時，編 碼數種膜聯蛋白V蛋白之基因序列已經識別且克隆。例如 參見NCBI蛋白質.資料庫（Protein Data Base)，登錄號 NP001145。 因此’本發明係關於膜聯蛋白V用於表徵經極冷保藏 CHO細胞庫之用途。特定言之，本發明係關於臈聯蛋白v 用於表徵CHO細胞之經極冷保藏細胞庫之方法中之用途。 根據本發明之進一步實施例，該方法包括以下步驟：勾解 凍經極冷保藏細胞庫之一部分細胞；b)於適當培養基中抹 養該等細胞；c)以膜聯蛋白V培育該等細胞；d)偵測細胞 105999.doc 1364459 且量化結合至膜聯蛋白V之細胞數目；e)偵測細胞且量化 未結合至膜聯蛋白V之細胞數目；f)計算結合臈聯蛋白v細 胞與未結合膜聯蛋白V細胞之比率。 根據進一步實施例，本發明亦係關於膜聯蛋白V在測定 CHO細胞庫品質之方法中之用途，其中該方法包括以下步 轉：a)將細胞部分極冷保藏於液體培養基中作為細胞庫； b)解凍該細胞庫之一部分經極冷保藏細胞；c)在培養基中 培養該等細胞；d)藉由以膜聯蛋白v染色該等細胞來確定 該等解柬細胞之存活率等級。.CHO細胞庫之品質標準係細 胞自該細胞庫開始繁殖並擴展時所觀察到之解凍後存活 率、穩固性、表型/基因型穩定性及長期保藏品質。該等 標準主要受經冷珠/解康過程仍存活之CHO細胞數目（即"完 整細胞"數目）影響。大量完整CHO細胞確保了初始細胞培 養物之快速生長’減少了細胞培養物擴展至大規模發酵所 必需之繼代培養步驟，且因此使得培養物可能形成及/或 控制遺傳變體之風險最小化。存活率等級較佳由膜聯蛋白 V染色進行評估，其意謂偵測及量化膜聯蛋白V結合細 胞。因此，根據本發明之更佳實施例，為評估解;東之後繁 殖及擴展之CHO細胞之存活率等級的膜聯蛋白v染色方法 包括以下步驟：a)以膜聯蛋白V培育該等解凍後之細胞； b)偵測細胞且量化結合至膜聯蛋白v之細胞數目；c)積測 細胞且量化未結合至膜聯蛋白V之細胞數目；d)計算結合 旗聯蛋白V細胞與未結合膜聯蛋白v細胞之比率。表1給出 CHO細胞之實例。 105999.doc . 14- ⑧ 1364459 表1 : CHO細胞株 離 CHO細胞株 編號 CHO ECACC No. 8505302 CH0-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX (=CHO duk-, CHO/dhfr-) ATCC CRL-9096 CHO-DUKXB1 ATCC CRL-9010 CHO-DG44 Urlaub等人，Cell 33[2]，405-412, 1983 CHO Pro-5 ATCC CRL-1781 已描述用於偵測凋亡細胞培養物之多種檢定法，包括 DNA-梯及 TUNEL 檢定（Gavrieli 等人，1992 ; Wijsman 等 人，1993)。然而，細胞凋亡偵測之流式細胞儀方法提供 優於上述技術之若干優勢，如其使得可快速量化數千細胞 之特性。使用流式細胞儀量測法使得不同策略之快速高通 量評估可為給定細胞株產生成功細胞庫。出於此原因且根 據本發明之進一步實施例，將膜聯蛋白V以螢.光素異硫氰 φ 酸酯（FITC)標記。其使得可使用流式細胞儀膜聯蛋白V親 合力檢定來估計細胞解凍後之存活率等級。因此，本發明 亦係關於在流式細胞儀檢定中以經FITC-標記之膜聯蛋白V 染色解凍細胞庫中一部分細胞後該CHO細胞庫中經極冷保 藏細胞之方法。在實例部分更進一步詳述該檢定之實例。 本文提供之結果對一般在由台盼藍排除法分析細胞存活 率監控冷凍/解凍步驟（在表徵細胞庫中反映該技術狀況之 標準方法）時可見之結果給出解釋。該等傳統解凍-對照實 105999.doc -15- ⑧ 1364459 驗通常顯示剛解凍後之大量存活細胞且存活率僅在解凍後 24 h至48 h之間減弱。對於由CHO細胞庫所獲資料之廣泛 刀析令人驚訝地揭示了該流式細胞儀膜聯蛋白V親和力檢 疋之預測值。早在解凍後6 h内量測之凋亡細胞之百 刀比提供了關於極冷保藏策略成功之資訊，其通常僅於經 2-10日時間之傳統解凍對照實驗中得到。因此，本發明亦 提供膜聯蛋白V在表徵ch〇細胞庫中或在用於測定CH〇細 胞庫品質之方法中之用途，其中在解凍及開始培養經極冷 保藏細胞後24 h，較佳為18 h，更佳為12 h，進一步更佳 為9 h’進一步更佳為6 h内進行以膜聯蛋白v之培育步 驟。就此而言，使用FITC標記之膜聯蛋白v之流式細胞儀 檢定係最佳方法。 根據進一步之實施例，本發明亦係關於包含膜聯蛋白V 之套組在表徵解凍後經極冷保藏CHO細胞庫中之用途，其 中膜聯蛋白V係用於測定經極冷保藏細胞解束後之存活率 等級。根據本發明之較佳實施例，冷藏保存細胞解凍後存 活率等級。根據本發明之較佳實施例，細胞培養物之存活 率等級藉由包括以下步驟之方法來測定：a)解凍經極冷保 藏細胞庫之一部分細胞；b)於培養基中培養該等細胞；c) 用膜聯蛋白V培育該等細胞；d)偵測細胞且量化結合至膜 聯蛋白V之細胞數目；e)偵測細胞且量化未結合至膜聯蛋 白V之細胞數目；f)計算結合膜聯蛋白v細胞與未結合膜聯 蛋白V細胞之比率。此外，本發明亦提供包含膜聯蛋白v 之套組及包括使用膜聯蛋白V表徵CHO細胞庫之資訊的說 105999.doc -16- 1364459 明書。 本發明進一步提供表徵CHO細胞庫之方法，其包括以下 步驟‘ a)解凍經極冷保藏細胞庫之一部分細胞；b)於適當 培養基中培養該等細胞；c)以膜聯蛋白v培育該等細胞； d)偵測細胞且量化結合至膜聯蛋白V之細胞數目；e)偵测 細胞且量化未結合至膜聯蛋白v之細胞數目；f)計算結合 膜聯蛋白V細胞與未結合膜聯蛋白v細胞之比率。根據進 —步之實施例，本發明亦提供量測解凍後CH〇細胞庫之存 活率等級，其包括以下步驟：a)解凍經極冷保藏細胞庫之 分細胞，b)於適當培養基中培養該等細胞；c)以膜聯 蛋白V培育該等細胞；d)偵測細胞且量化結合至膜聯蛋白v 之細胞數目；e)偵測細胞且量化未結合至膜聯蛋白v之細 胞數目；f)計算結合膜聯蛋白v細胞與未結合膜聯蛋白乂細 胞之比率。如本發明所示，早在解凍後24至6 h内量測之 阔亡CHO細胞之百分比提供了關於對ch〇細胞之極冷保藏 策略成功之資訊，其通常僅於經2_ 1 〇日時間之傳統解凍對 照實驗中得到。因此’本發明亦提供表徵Ch〇細胞庫或量 測解東後細胞庫存活率等級之方法，其中在解凍及開始培 養經極冷保藏細胞後24 h，較佳為18 h，更佳為12 h，進 一步更佳為9 h，進一步更佳為6 h内進行以膜聯蛋白V之 培育步驟。 CHO細胞可於約_196。〇下於液氮中成功長期儲存。然 而’在不添加低溫保護劑時’細胞通常不可冷凍及解凍。 即便如此，冷凍-解凍過程仍將導致細胞遺失。對於該遺 105999.doc •17· 1364459 失量之關鍵參數係用於冷凍及解凍過程之實驗程序。通常 在冷凍期間控制溫度降低有利於確保溫度以1度/分鐘之速 率下降。為成功解凍CHO細胞，要求使冷凍小瓶（經解珠 細胞）盡可能快溫至37t，即幾乎所有CHO細胞株之最佳 培養溫度。一種確保培養物解凍後之高恢復率之方法係於 含有大量血清之培養基中冷束細胞。 近來’大量工作集中於研發在冷凍培養基中不使用血清 對CHO細胞進行極冷保藏之策略。多種低溫保護劑在不存 在血清時可有助於細胞之成功長期儲藏。另外，該基礎培 養基之組合物對任何極冷保藏之成功均具有顯著影響。所 述之任何該策略之快速通道品質評估將允許顯著降低產生 用於產生新穎CHO生產細胞株之種源或工作細胞庫之可靠 實驗程序所需之研發時間。根據進一步之實施例，本發明 亦提供用於分析CHO細胞培養基關於使用該培養基極冷保 藏CHO細胞之方法，其包括以下步驟：a)於適合培養ch〇 細胞之培養基中極冷保藏該等細胞，較佳在低於_丨〇〇。〇之 溫度下’例如在液氮中；…解凍一部分或所有該等經極冷 保藏之細胞；c)於適當培養基中培養該等細胞；d)以膜聯 蛋白V培育該等細胞；e)偵測細胞且量化結合至膜聯蛋白v 之細胞數目；f)偵測細胞且量化未結合至膜聯蛋白V之細 胞數目；g)計算結合膜聯蛋白V細胞與未結合膜聯蛋白v細 胞之比率。合適培養基係基於以下市售培養基之彼等，諸 如 Ham's F12(Sigma，Deisenhofen，Germany)、RPMI-1640 (Sigma) ' Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM; 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Sigma) 、 Minimal Essential Medium(MEM; Sigma)、 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma) ' CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad, CA)、CHO-S-Invtirogen)、 無血清 CHO Medium (Sigma)及無蛋白 CHO Medium (Sigma)。根據較佳方法，該培養基包括特定低溫保護 劑，諸如DMSO、BSA、曱基纖維素或甘胺酸。根據該方 法之更佳實施例，在解凍及開始培養經極冷保藏細胞後24 h，較佳為18 h，更佳為12 h，進一步更佳為9 h，進一步 更佳為6 h内進行以膜聯蛋白V之培育步驟。在流式細胞儀 檢定中使用FITC標記之膜聯蛋白V係該發明性方法之進一 步較佳之實施例。 上述之發明通常更易於參照以下實施例理解，其包括於 本文中僅為用於說明本發明之某些實施例之目的，且不欲 以任何方式限制本發明。 實例 縮寫 BSA: 牛血清白蛋白 CHO: 中國倉鼠卵巢 DMSO: 二甲基亞砜 ELISA: 酶聯結免疫吸附劑檢定法 FACS: 螢光活化細胞篩檢器 FITC: 螢光素異硫氰酸酯 MCB: 種源細胞庫 PBS: 磷酸鹽緩衝溶液 105999.doc -19- 1364459 PCR： 聚合酶鏈式反應 ΡΙ: 碟化丙咬 PPCB： 後期生產細胞庫 PS: 磷脂醯絲胺酸 WCB: 工作細胞庫 方法 &胞培養 已研究了用於生產及研發生物醫藥之若干cho懸浮細胞 株之細胞庫。所用之所有細胞株係專有細胞株且其蛋白產 品不可揭露。所有用於生產及研發規模之細胞株保存於恆 溫箱（Thermo, Germany)中表面充氣之τ形燒瓶（价加， Denmark)或專門設計之溫度為37它且具有空氣及5% 之 恆溫室中之喷灑式旋轉燒瓶中之連續種子儲備培養物中。 每2-3日以適當分裂速率及種子密度分裂種子儲備培養 物。藉由使用血球計測定所有培養物中之細胞濃度。藉由 φ σ盼藍排除法評估存活率。該等培養物源自種源、工作或 安全細胞庫且經徹底測試其無菌性，支原體及外源因子之 存在。所有操作均於經過據空氣之實驗室中且在遵循"現 灯優良藥品製造標準（currem G〇〇d心 叫(cGMP)"之嚴格程序下發生。所用之所有培養基 均為專有培養基且其組份不可揭露。 極冷保藏 根據標準實驗程序及基本法則"冷减慢-解来快"進行冷凌 及解滚。使培養物自懸浮培養物進入指數生長期且藉由具 105999.doc -20- 1364459 有經專門設計.之冷凍程式之計算機-控制冷凍機 (Consarctic，Germany)或藉由置於·7〇°〇冷凍機中之苯乙烯

發泡體盒冷凉於1.8 mL塑料小槪中（Nunc，Demark)。在冷 凍至-100°C(冷凍機）或-70°C(苯乙烯發泡體盒）後，將該等 細胞轉移至液氮容器中。將小瓶儲存於液氮之氣相（<_ 150°C )中。冷凍小瓶中之細胞濃度為1-3E7個細胞。10%濃 度之DMSO(Merck，Germany)用作低溫保護劑。所用之詳 細冷凍培養基亦為專有冷凍培養基且其組份不可揭露。將 CHO細胞於37°C水浴中解凍’以適當培養基稀釋且於ι8〇 xg下離心分離（Thermo, France)。隨後將細胞以指定細胞濃 度接種於培養基中。 流式細胞儀 綠色膜聯蛋白V-FITC及紅色PI螢光以使用Exp〇32軟體之 Coulter Epics XL流式細胞儀（Coulter，Germany)加以量

測。以氬雷射器在488 nm處引發激發且使用標準帶通 (530士20 nm)及長通（>570 nm)濾波器加以量測β在每個樣 品中，量測到10,000項用於細胞凋亡及3,〇〇〇項用於細胞週 期分析。資料以ΕχΡ〇32分析工具加以分析》為區別死亡細 胞及凋亡細胞，將碘化丙啶（ΡΙ)染色之膜不透性DNA與膜 聯蛋白V平行添加至細胞懸浮液中。藉由該雙染色，即可 能區別活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及壞死細 胞。根據貝方之實驗程序（Bect〇n_Dickins〇n，Germany)進 行膜聯蛋白V檢定。藉由流式細胞儀分析該等細胞且量化 凋亡細胞。碘化丙啶染色進一步用於測定細胞週期分佈。 105999.doc •21 · % 1364459 樣品取自未定影之細胞懸浮液》將培養物離心分離且以 PBS(Gibco，Germany)洗滌。然後，添加ρι染色溶液 (BioSure，USA)且繼續培育30 mine隨後，藉由流式細胞 儀分析細胞。處於細胞週期每一階段之細胞比例經多週程 式（Phoenix Flow, USA)而獲得。 結果

在極冷保藏CHO細胞解凍期間定量分析細胞死亡： 儘管已知在細胞培養物於極冷保藏後重新起始時CH〇細 胞死亡，該細胞死亡之動力學及本質尚未詳細描述。為量 化在解凍後一小時内CHO細胞之細胞培養物中漸進式細胞 死亡之程度’吾人測定於CHO細胞外膜展示之碟脂醯絲胺 酸之量。CHO DG44細胞及該細胞株之衍生物廣泛用於生 產生物醫藥。吾人首先分析了產生自CH〇_衍生之生產細 胞株之220個小瓶之細胞庫。該細胞庫以無動物組份（諸如 血清）之冷凍培養基產生，且已知其關於解凍後之培養物 存活率尤為敏感。在0 h、3 h、6 h、24 h及48 h之時間點 藉由以膜聯蛋白V及碘化丙啶之雙染色分析細胞。在剛將 細胞置於培養基（Oh)中之後即偵測到高達約30%百分比之 膜聯蛋白V陽性細胞，在起初3 h内即增加至差不多5〇%且 在解凍後起初48 h内維持在40%以上。對所有至今所分析 之CHO DG44細胞庫而言，膜聯蛋白V陽性細胞在解凍後3 h至24 h間達到峰值。與此相反，^陽性細胞之量在剛解康 後保持相對較低’在解凍後24 h開始顯著增加。在細胞祠 亡之初始階段，PS展示於細胞表面且膜聯蛋白v結合至其 105999.doc -22- 1364459 標乾。在該早期階段，質膜仍可排κΡΙ且因此，細胞為膜 聯蛋白V+/PI·(圖1，左下象限）。隨後，細胞失去其質膜完 整性及其排除PI之能力。該等後期凋亡之細胞為膜聯蛋白 v+/PI+(圖1，右上象限）。因此，該等實驗表明自早期至晚 期細胞瑪亡之轉變僅發生於解凍後初期之6 h後。此亦見 於則向·側向散射圖（圖1 )，其顯示解凍後約24小時之轉變 點時極小細胞（代表破損細胞小體（圖1))之增加。 藉由膜聯蛋白γ染色作為CHO細胞庫品質之早期預測性 標記進行解東後分析： 由於可對大量樣品藉由膜聯蛋白ν染色快速進行凋亡細 胞篁化，其為不同極冷保藏方法之高通量分析提供了一種 極具吸引力之方法。吾人藉由膜聯蛋白色分析了兩種 不同CHO生產細胞之兩種CH〇細胞庫且將該等資料與在培 養物（標準解凍對照）中量測之六通道之台盼藍排除法染色 相比較。如圖2A中可見，磷脂醯絲胺酸展示細胞之量在自 兩種不同細胞庫解柬之培養物上顯著不同（解束1中為 3 5%，解凍2中為67%)。該傳統解凍對照（圖2B)在來自不 同細胞庫之培養物存活率之間顯示同樣顯著之差異。解凍 1表明在該培養物在解凍後4天恢復至多於9〇%之存活率之 前下降至83%。與此相反，僅60%之細胞在解凍2之後24 h 可存活。如由台盼藍排除法所測定，該培養物需要“天來 達到90%之存活率。該品質之細胞庫將顯然不適於商業生 產工藝。該等資料令人驚訝地表明，於其表面上展示之ps 之百分比預測了早在解凍後6 h内傳統解凍對照之結果。 105999.doc -23- ⑧ 1364459 細胞庫品質在不同細胞株、極冷保藏實驗程序及培養基 j1。質中可劇烈變化： 為測試該新賴描述之用於細胞庫品質評估之方法，吾人 分析了大量細胞庫。產生兩種CHO DG44細胞庫，一者於 冷凍培養基中含有0.8% BSA，另一者不含BSA但含有改良 性培養基與新鮮培養基之5〇:5〇混合物。如圖3中所描述， 該等細胞對兩種冷凍培養基均顯示顯著較低之早期細胞凋 亡率。此外，與於改良性培養基中儲存細胞相比，添加 0.8% BSA之有益影響僅在使用笨乙烯發泡體盒時較為明 顯。 早期解束後細胞凋亡量測法於快速通道研發策略中之用 途： 隨著臨床及市場供給成為成功發展新穎生物醫藥之關鍵 因素’對於快速通道篩選法之方法最優化及方法改良的興

趣日益增加。因4 ’測定在解;東後僅6㈣使用膜聯蛋白V

量測法之可行性以評估用於建立新穎咖生產細胞株之成 功極冷保藏之策略。 。人令人驚訝地發現，解凍後早期細胞洞亡量測法為對 原材料μ質#估之敏感工具。成功極冷保藏⑶◦細胞之基 :因素為所用培養基之品質一般而言，GMp包括用於培 養CHO細胞之培養基的明顯規定有效期限。 =^養方法相比:苛刻的料工藝條件是否可導 培養某:養基之更短時間期限。吾人使用存放期為4週之 〇來培養CHO細胞以進-步研究該問題。圖㈣^ 105999.doc ⑤ •24· 1364459 新鮮製備之培養基中（4底部）、於在4C處儲存4週之培養基 中（4頂部）及於在4C處儲存4週且在使角之前即刻補充基本 化合物之新鮮製劑之培養基中（4甲部）經極冷保藏之CHO細 胞的早期細胞凋亡資料（解凍後6 h)。該等資料顯示以該培 養基產生之細胞庫剛好在其有效期之前即出現降低之解;;東 效能。該效應可藉由添加新穎製備之相關培養基之本質組 份而顯著減少。同時對於解凍後6 h細胞週期分佈之測定 顯示4週時間之培養基無生長抑制效應。該等結果令人驚 訝地表明，關於使用培養基製劑極冷保藏CHO細胞，如何 將解凍後早期細胞凋亡量測法用於敏感性分析培養基及其 組份。 參考文獻

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Vaux DL, Korsmeyer SJ，Cell. 1999 Jan 22; 96(2): 245-54。 Steensma DP等人，Methods Mol. Med. 2003; 85:323-32 ° 【圖式簡單說明】 圖1顯示極冷保藏後CHO細胞培養物之細胞死亡指紋圖 譜。將CHO DG44細胞在2E7個細胞/ml之細胞濃度下使用 冷凍機於90%培養基及10% DMSO中冷凍。在指定時間點 由FACS分析細胞。第一排在Y轴上描繪前向散射且在X軸 105999.doc -25-

1364459 上描繪側向散射。設定閘以區別代表死細胞及活細胞之細 胞（如由其形態學所判斷）。第2排顯示相同圖形且膜聯蛋白 V陽性CHO細胞以白色顯示。第3排描繪碘化丙啶（PI)染色 對膜聯蛋白V染色。根據前向對侧向散射開啟打出灰點》 圖2顯示解凍6 h後膜聯蛋白v染色預測細胞庫品質。A. 將CHO DG44細胞在2E7個細胞/ml之細胞濃度下使用冷凍 機於90%培養基及1〇% DMSO中.冷凍。該細胞庫大小為220 個小瓶^ A)解凍6 h後經膜聯蛋白V染色細胞之FACS分 析’資料作圖如前向側向散射圖（閘如圖1中所述）且如膜聯 蛋白V強度圖。B)解凍後培養物之生長及存活率。統計每 一通道之細胞數。與此同時，藉由台盼藍排除法測定存活 〇 圖3顯示不同細胞庫顯示解凍後不同之細胞凋亡。將 CHO DG44細胞在1E7或2E7個細胞/mL之細胞濃度下使用 冷凍機於不同冷凍培養基中冷凍。該細胞庫大小為>200個 小瓶。將細胞使用冷凍機或苯乙烯發泡體盒於兩種不同冷 凍培養基中極冷保藏。解凍6 h後藉由膜聯蛋白V染色分析 培養物。 圖4顯示使用早期細胞凋亡量測法測試培養基品質。將 CHO DG44細胞在2E7個細胞/mL之細胞濃度下使用冷凍機 於90°/。培養基及1〇% DMSO中冷凍。該細胞庫大小為22〇個 小瓶。使用不同培養基配製產生三種細胞庫》在解凍6 h 後藉由FACS分析培養物以供細胞循環分佈，前向-側向散 射及膜聯蛋白V染色。 105999.doc -26 -

Claims (1)

1. 公告本 第094139284號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(101年1月） 丨月丨1日修正替換頁 十、申請專利範圍： 1. 一種針對膜聯蛋白（Annexin)V結合之表徵CHO細胞之經 極冷保藏細胞庫的方法，該方法包括： a) 將該CHO細胞之經極冷保藏細胞庫之一部分細胞解 凍； b) 於培養基中培養該等細胞； c) 以膜聯蛋白V培育該等細胞； d) 偵測細胞且量化結合至膜聯蛋白V之解凍之CHO細胞 數目； e) 偵測細胞且量化未結合至膜聯蛋白V之解凍之CHO細 胞數目；及 f) 計算結合膜聯蛋白V之解凍之CHO細胞與未結合膜聯 蛋白V之解凍之CHO細胞之比率； 其中 以膜聯蛋白V培育該等細胞之步驟係於解凍後24 h内進 行。 2. 如請求項1之方法，其中膜聯蛋白V係於解凍後6 h内與 解;東之CHO細胞一起培育。 3. 如請求項1之方法，其中該膜聯蛋白V係以螢光素異硫氰 酸酯（FITC)標記。 4. 如請求項1之方法，其中該CHO細胞之經極冷保藏細胞 庫包括於液體培養基中經極冷保藏為部分之CHO細胞。 5. 如請求項1之方法，其中該解凍之CHO細胞係自經極冷 保藏細胞庫之一部分解;東。 105999-1010117.doc