JP2007518426A - 不死化肝細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
薬物によって誘導される肝毒性は臨床上重要な問題であり、数種の薬物が稀ではあるが重篤な(致死の場合さえある)肝毒性を引き起こす特性により市場から撤退した。トランスポーターを含む、チトクロムP450(CYP)及び関係する薬物代謝酵素(DME)の誘導は、臨床上重要な薬物間相互作用の原因として良く認識されており、また効力の喪失(薬物動態学的耐性)又は自己誘導(薬物がそれ自体の肝代謝を誘導する過程)の原因でもある。創薬の際に、誘導物質を回避し、肝臓による薬物クリアランスの増大に起因する薬物間相互作用の潜在的可能性を特徴付けるためにin vitro試験を使用することができる。in vitro誘導研究では、従来から選択マーカー化合物と共に、肝細胞初代培養及び酵素活性が使用されている。
アルブミン、α1アンチトリプシン(AAT)、血液凝固第VIII因子及び第IX因子、インターαタンパク質性インヒビター(IαIP)などの治療用血漿タンパク質(TPP)に対して非常に大きな需要が存在する。細胞ベースの系によりTPPが産生されれば、ウイルス又は他の病原体による潜在的な汚染など、血液に由来する産物の有する危険が回避されるはずである。
本発明に従い本明細書において使用する時、以下の用語及び略語は、特に明記しない限り以下の意味をもつと定義される。こうした説明は例示的なものにすぎない。これらの説明は、本明細書で記載又は参照される際用語を限定することを意図するものではない。そうではなく、こうした説明は、本明細書で記載し請求する際、任意の追加の態様及び/又は用語の例を含むことを意図する。
以下の略語を本明細書で使用する。
AAT=α1アンチトリプシン
DME=薬物代謝酵素
IαIp=インターαタンパク質性インヒビター
MCT=MultiCell Technologies社
MFE=Multi−Functional Enhancing(多機能増強)培地
RT−PCR=逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
SV40=シミアンウイルス40
SV40 TAg=シミアンウイルス40T抗原及びt抗原
SV40 tAg=シミアンウイルス40t抗原
TPP=治療用血漿タンパク質
本発明は、ウイルスによって不死化された肝細胞系に関するものであり、この細胞系は、正常ヒト初代肝臓細胞に由来するものでよく、無血清培地中で増殖する能力を有し、非腫瘍形成性であり、アルブミン、α1アンチトリプシン、血液凝固第VIII因子及び第IX因子、トランスフェリン、インターαタンパク質性インヒビター(IαIp)などの内在性血漿タンパク質を産生することができるがタンパク質レベルで測定するとαフェトプロテインを発現していない。好ましい一実施形態では、非腫瘍形成性の不死化細胞系は、ブダペスト条約に従って、2003年10月6日に、米国12301メリーランド州Rockville、Parklawn DriveのATCCに寄託された、Fa2N−4(ATCC受託番号PTA−5566)及びEa1C−35(ATCC受託番号PTA−5565)細胞系を含む。
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は、無血清培地中で肝機能を保持している。好ましくは、肝機能は、酵素活性を発現し続ける能力である。より好ましくは、肝機能は、チトクロムP450(CYP)酵素活性及び無血清培地中で他の薬物代謝酵素(DME)を維持し続ける能力が含まれる。
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系はタンパク質を産生し続ける。好ましくは、この細胞系は血漿タンパク質を自然に産生し続ける。より好ましくは、この細胞系は、アルブミン、α1アンチトリプシン、血液凝固第VIII因子及び第IX因子、トランスフェリン、並びにインターαタンパク質性インヒビター(IαIP)を含む治療用血漿タンパク質を自然に産生し続ける。
本発明の細胞系を使用する他の例には、それだけには限らないが、以下のものが含まれる。
不死化ヒト肝細胞の特徴付け
ヒト肝細胞に、SV40初期プロモーターの制御下にある、SV40ラージT抗原及びスモールt抗原の遺伝子をトランスフェクトすることにより、100を越える数のヒト肝細胞クローン細胞系を樹立した。Ea1C−35及びFa2N−4と呼ばれる2つの細胞系についてを説明する。
肝臓特異的転写因子の発現
肝臓特異的転写因子を保持することは肝機能の発現に必須であるので、最初にクローン細胞系を、ヒトのHNF1、HNF3、HNF4α、HNF4γ及びC/EBP、並びにアルブミン用のプライマーを使用したRT−PCRによってスクリーニングした。簡単に言えば、Brennerら(「MAPPing(Message amplification phenotypingメッセージ増幅表現型分析):少数の細胞からの多数のmRNAを同時に測定する技法(Message amplification phenotyping(MAPPing):a technique to simultaneously measure multiple mRNAs from small numbers of cells)」,Biotechniques 7(10):1096−1103,1989)のマイクロアイソレーション法(micro−isolation method)を使用して、各クローン細胞系の106個の細胞から全RNAを調製した。50μgの大腸菌(E.coli)rRNA(Sigma社製)をキャリアとして使用して、少数の細胞からのRNAの単離を容易にした。Perkin Elmer Cetus社製GeneAmp RNA PCRキットを使用して、RT−PCR反応を実行した。供給元の使用説明書に従って、ランダムヘキサマー及び逆転写酵素M−MLVを使用して、1μgの全RNAを逆転写した。各転写因子に独特のヌクレオチド断片を定義するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、PCR反応を実施した。このプライマーは、Cruachem社(Fisher Scientific社)によって市販用に合成され精製されたものである。アニール温度58℃、1分間のPCR反応を30サイクル実施した。PCR産物を臭化エチジウムで染色した後、1%アガロースゲル中で視覚化した。陽性対照の試料を、新鮮分離したヒト肝細胞の全RNAのRT−PCR分析に含めた(示さず)。下記の表1に示すように、どちらの細胞系でも5つの肝細胞関連転写因子がすべて発現された。肝細胞特異的遺伝子発現の指標としてアルブミンの産生を測定した。下記の表1に示すように、ヒトアルブミンを認識する抗体を使用したELISA試験による検出によれば、どちらの細胞系でも無血清条件の培地中にアルブミンが分泌される。
mRNA転写物の発現についての逆転写ポリメラーゼ連鎖反応分析
Ea1C−35及びFa2N−4と呼ばれる2つの不死化ヒト肝細胞系においてRT−PCR分析を実施した。細胞をI型コラーゲンコートディッシュ上に蒔き、MFE培地中で維持した。培養細胞にリファンピン(10μM)又は等しい容量のDMSO(対照)を3日間処理した。
SV40によって媒介される増殖活性
初代ヒト肝細胞は、培養すると増殖活性が限られてくる。この特徴を克服するために、SV40ラージT抗原及びスモールt抗原をゲノム中に導入した。引き続いて、得られたクローン細胞系Fa2N−4及びEa1C−35を培養物中で最高18カ月間維持した。どちらの不死化系統も、MFE培地中で維持すると増殖及び機能しており、凍結保存し、貯蔵することができる。ラージT抗原及びアルブミンに対する多価抗体を使用した間接免疫蛍光染色により、これらの細胞系が、核に局在する不死化遺伝子を発現し(図9a)、且つ分化型の機能に特徴的な肝細胞特異的遺伝子を発現し(図9b)続けることが実証された。Ea1C−35細胞系の形態を下記に示す(図9c)。
薬物代謝データ
どちらの細胞系も、モデル物質の代謝に基づいて、単層培養物中で第I相(CYP)及び第II相の抱合反応を触媒し続ける。最も重要な第I相の酵素のうちの1つはCYP3A4であり、これは全ての薬物のうちのおよそ50%の代謝の原因である。CYP3A4の発現は、このCYPの発現を全体にわたって誘導又は阻害することができる、多剤摂取を含めた多くの要素によって調節することができる。したがって、ある薬物の治療有効量は部分的に一部がCYP3A4発現によって決まる。
*細胞をビヒクル又はリファンピンに72時間曝露した。データを、ビヒクルを処理した対照と比べて表す。
**細胞をビヒクル又はリファンピンに72時間曝露し、次いでテストステロンと共に24時間インキュベートした。6β−OH−テストステロン代謝物の産生をHPLC分析によって定量し、データを全細胞タンパク質(mg)あたりで表す。
ND=未測定
CYP誘導物質を同定及びランク付け分類するための不死化肝細胞の使用
2つの系の証拠から、不死化ヒト肝細胞を使用してCYP3A4誘導物質を「誘導能」に基づいて同定及びランク付け分類できることが示される。
初代培養物との形態的且つ機能的類似性
培養Fa2N−4細胞は、形態的にも機能的にも新鮮なヒト肝細胞の初代培養物と比類なく類似している。図12は、ヒト肝細胞(上図)とFa2N−4細胞(下図)との間の密接なこの形態的類似を示す。CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、及びCYP3A4を含めて、多数のCYPがFa2N−4細胞において誘導可能である。Fa2N−4細胞における酵素誘導を評価するための手順は、ヒト肝細胞の初代培養物のものに非常に類似している。
*Madenら、「培養ヒト肝細胞におけるチトクロムP450発現に対するミクロソーム酵素誘導物質プロトタイプに対する影響(Effects of prototypical microsomal enzyme inducers on cytochrome P450 expression in cultured human hepatocytes)」,Drug Metab.Dispos.31:421−431,2003からのデータ。
**BNF(β−ナフトフラボン)はヒト肝細胞のための誘導物質であったが、オメプラゾールはFa2N−4細胞のための誘導物質であった。
***7−エトキシ−4−トリフルオロメチルクマリンO−脱アルキル(4倍)又はS−メフェニトインN−脱メチル(13倍)に基づいたCYP2B6活性。
毒性研究における不死化肝細胞系の使用
Fa2N−4及びEa1C−35細胞は、細胞ベースの毒性試験をin vitroで実施するための、ヒト肝細胞に由来する系を提供する。図22は、毒性試験におけるFa2N−4細胞の使用を例示する。
*ヒト肝細胞よりも感受性の高いFa2N−4細胞
**ヒト肝細胞よりも感受性の低いFa2N−4細胞
したがって、こうした不死化肝細胞は、特異的なin vitro毒性スクリーニングに適している。さらに、不死化肝細胞は、再現性及び入手方法についての異なる利点を提供する。
Fa2N−4細胞系を使用した薬物代謝酵素(DME)及び多剤耐性1(MDR1)の誘導
プレーティングの48時間後にFa2N−4細胞への薬物処理を開始した。RNA定量のために、細胞を薬物に48時間曝露した。mRNA転写物を定量するための強力であるが簡単なハイスループットシステムであるインベーダーアッセイ法(Invader assay)(Third Wave Technologies社製、米国ウィスコンシン州Madison)により、Fa2N−4細胞における遺伝子発現をモニターした。既知の一群団の誘導物質で処理したFa2N−4細胞の全RNA抽出物から、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、UGT1A、及びMDR1転写物を定量し、ビヒクル対照と比較した。
Fa2N−4及びEa1C−35細胞系による血漿タンパク質の発現
こうした細胞系の十分に分化した性質は、それらの細胞系が成体肝細胞機能に特異的な血漿タンパク質を持続的に分泌することによってさらに裏付けられる(図26)。60mmプレート又はローラーボトルのいずれかに蒔いたFa2N−4及びEa1C−35細胞から培地を回収し、ウエスタンブロット分析によって解析した。限外ろ過により培地を50倍に濃縮し、アルブミン(全タンパク質10μg/レーン)を除き40μgの全タンパク質を各レーンに添加した。ブロットを、アルブミン、α1アンチトリプシン、並びに第VIII因子及び第IX因子に対する、モノクローナル抗体又はアフィニティー精製したポリクローナル抗体のいずれかと共にインキュベートし、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた2次抗体を使用し、続いてそれをDAB基質と共にインキュベートして視覚化した。下記の図26に示すように、どちらの細胞系も、プレートで維持する培養物のようにローラーボトル中で維持すると、プレートで維持する培養物のように、アルブミン、α1アンチトリプシン、及び第IX因子を1mlあたり類似のレベルで発現し続ける。第VIII因子の発現は様々で、細胞系及び培養条件に大きく依存している。第IX因子のプロセッシングは不均質であったが、これはヒト血漿由来タンパク質においても観察された。
アルブミンの産生
Fa2N−4細胞をT−150フラスコの無血清培地中で増殖させてコンフルエントにし、ELISA試験によりアルブミン産生を測定した。この試験の結果は下記の表9でみられる。継代第13代及び第16代のFa2N−4細胞では、およそ3μg/mlのアルブミンが産生された。継代第33代のFa2N−4細胞では、およそ9μg/mlのアルブミンが産生され、また継代第41代のFa2N−4細胞では、およそ6μg/mlのアルブミンが産生された。したがって、本発明の不死化肝細胞系、特にFa2N−4細胞は、TPPであるアルブミンを産生するための潜在的な供給源である。
インターαタンパク質性インヒビター(IαIp)の発現
血漿中に比較的高濃度で存在する天然のセリンプロテアーゼインヒビターである、インターαタンパク質性インヒビター(IαIp)は、炎症、創傷治癒、及び癌転移において及びいくつかの役割を果たしている。IαIpは、肝細胞によって生成及び分泌される血漿タンパク質のファミリーである。IαIpの主要な形態は、インターαインヒビター(IαI、ビクニンと呼ばれる1本の軽鎖及び2本の重鎖を含有)及びプレαインヒビター(PαI、1本の軽鎖及び1本の重鎖を含有)である。最近、Prothera Biologics社(米国ロードアイランド州Providence)の科学者により、ヒトIαIpの軽鎖を認識するモノクローナル抗体(MAb69.31)が開発された。競合ELISAにおいてMAb69.31を使用すると、重篤な敗血症患者の血漿IαIpレベルが、健常な対照に比べて有意に低下することがこうした研究者らによって実証された(Lim YP、Bendelja K、Opal SM、Siryaporn E、Hixson DC、Palardy IF、「重篤な敗血症患者の死亡率と、血漿中インターαインヒビターレベルとの相関(Correlation Between Mortality and the Levels of Inter−alpha Inhibitors in Plasma of Severely Septic Patients)」,Journal of Infectious Disease,188:919−926,2003)。
不死化ヒト肝細胞によるトランスフェリンの産生
様々な継代数のEa1C−35及びFa2N−4細胞によってトランスフェリンが生成及び分泌されるかどうかを判定するために、この細胞をトランスフェリンを含まない無血清培地中で7日間培養した。7日後、馴化条件培地を回収し、市販の抗トランスフェリン抗体を使用してイムノブロット分析を実施した。ヒト血漿を陽性対照として使用した。図27に示すように、抗トランスフェリン抗体を使用したイムノブロットにより、すべての継代の細胞でこの血漿タンパク質が発現し続けることが分かった。レーン2〜5は、様々な継代数のEalC−35細胞で、血漿由来のトランスフェリンとほぼ同一のトランスフェリンが産生されることを示す。レーン6〜9は、様々な継代数のFa2N−4細胞で、血漿由来のトランスフェリンとほぼ同じトランスフェリンが産生されることを示す。したがって、ここで特許請求する不死化肝細胞は、それだけには限らないがEa1C−35及びFa2N−4細胞系を含めて、トランスフェリンを産生するための潜在的な供給源である。
馴化条件培地中に存在するインターαタンパク質性インヒビター(IαIp)のトリプシン阻害試験及び定量
馴化条件培地の全トリプシン阻害活性には、主要なセリンプロテアーゼインヒビターであるα1アンチトリプシン及びIαIpの活性が含まれる。色素のトリプシン基質L−BAPA(N(α)−ベンゾイル−L−アルギニン−4−ニトロアニリド塩酸塩、Fluka Chemicals社製)を使用して、Ea1C−35及びFa2N−4細胞から馴化条件培地中に分泌されるトリプシン阻害活性の量を測定した(表10参照)。この試験は、セリンプロテアーゼインヒビターがL−BAPAの加水分解を阻害することができるかどうかに基づくものである。410nmでのδ吸光度/分という速度の低下により阻害をモニターすることができる。細胞内タンパク質1μgあたりの生物活性に基づいて、特異的活性を計算した。Ea1C−35細胞では115TIU/mgのタンパク質が発現し、Fa2N−4細胞では45TIU/mgのタンパク質が発現した。
二次元ゲル分析
2Dゲル電気泳動分析を使用して、Fa2N4及びEa1C35細胞系の分泌タンパク質を分離した。Invitrogen社製のZOOM IPGRunnerシステムを使用して、固定化pH勾配ストリップ(pH3〜10の範囲)を用いてタンパク質の第1のIEF分離を実施し、続いて4〜12%トリス−グリシンSDS−PAGEを用いて二次元目の分離を行った。どちらの細胞系においても、TPPの可能な候補としてタンパク質の多数のスポットを同定することができた(図28A:Fa2N4、図28B:Ea1C35)。2次元ゲル分離の後、Ea1C35細胞系の分泌タンパク質をニトロセルロース上に移し、抗第IX因子抗体を使用したウエスタンブロット分析を実施した。MWが70KDで、pIが6.5〜7.0の反応性のタンパク質を検出した(図28C)。したがって、本発明で特許請求する不死化肝細胞系は、第IX因子などのTPPの潜在的な供給源である。
細胞系の増殖、及び血漿タンパク質分泌の定量
培養不死化ヒト肝細胞を産生細胞として使用した、TPPの経済的な産生は、この細胞が培養物の塊中で増殖する場合に、こうしたTPPを生成及び分泌し続けない限り達成することができない。最初にこの問題を評価するために、Fa2N−4細胞をT25、T75、及びT150培養フラスコ中で増殖させてコンフルエントにし、ELISA試験を、アルブミン、AAT、又はIαIpを認識する捕獲抗体と組み合わせて使用して、分泌される血漿タンパク質を定量した。最初に1cm2あたりそれぞれ500万個、1500万個、及び3000万個となるように相当数の細胞を蒔いた。3日間馴化条件培地を回収し、貯蔵し、限外ろ過によって10倍に濃縮し、試験した。下記の図29に示すように、各血漿タンパク質の全発現は、ほぼ細胞数に比例していた。値は、同じ3組の平均+/−SDを表す。T150フラスコ中で3日間にわたり培養した細胞は、およそ200μgのアルブミン、500ngのIαIp、及び150ngのAATを産生した。これは、本発明において特許請求する不死化肝細胞系がTPPを産生するための潜在的な供給源であることを示す。
アルブミン分泌に対する培養期間の影響
不死化ヒト肝細胞を、TPPを市販用に産生するためのバイオファクトリーとして使用する計画がある。したがって、TPP分泌が長期間の培養で有意に減少してはならないことが必須である。この問題を評価するために、前記の実施例に記載の通りFa2N−4細胞をT25、T75、及びT150培養フラスコ中で増殖させ、アルブミン産生を全タンパク質分泌の指標として測定する研究を最近開始した。3日目に馴化条件培地を回収し、細胞に栄養を再補給し6日目にこれを試料として再回収した。ELISA試験によりアルブミン分泌を分析した。この結果から、アルブミン分泌がプレーティングのフォーマットとは無関係に6日間の回収期間にわたって増加し続けることが示される(図30参照)。特に留意すべきことは、細胞をT75及びT150フラスコ中で培養すると、アルブミンが劇的に増加することである。細胞内全タンパク質は培養の時間と共に有意に増加しないので(データは示さず)、こうした結果は、培養条件への適応の結果として産生が増強されたことが原因であり、フラスコあたりの細胞数が劇的に増加した結果ではない可能性が高いように思われる。
血漿タンパク質分泌に対する腫瘍壊死因子α(TNFα)の影響
一部の血漿タンパク質の産生は、TNFαなどの急性期タンパク質によってin vivoで調節することができる。AATの分泌に対するTNFα処理の影響を研究した。Fa2N4細胞を、特許権のある、TNFα(0、1、5、又は10ng/ml)を含有する無血清MFE培地中で3日間維持した。下記の表11に示すように、ATTの分泌は、無血清培地中に5ng/mlのTNFαを含めることによって最も顕著に増大した。値は、2組の同じ試料の平均である。したがって、このサイトカインを使用するとATT産生を増大させることができる可能性がある。したがって、本発明の不死化肝細胞系のTNFαによる処理は、TPPの産生を増大させる有効な一方法である可能性がある。
不死化ヒト肝細胞による血漿タンパク質の発現に対するデキサメタゾンの影響
アルブミン発現は一部が、デキサメタゾン誘導可能プロモーターによって部分的に調節される(Nakmuraら、J Biol Chem,261:16883−16888,1986)。不死化ヒト肝細胞によるアルブミンの産生及び分泌に対するデキサメタゾンの影響を試験するために、Fa2N−4細胞(継代第32代)をI型コラーゲンディッシュ上、デキサメタゾンを含む、又は含まない培地中で48時間培養し、ELISA試験によりアルブミン発現を測定した。値は2組の同じ試料の平均を表す。下記の表12にまとめて示すように、アルブミンの分泌は、デキサメタゾンを含まない場合に有意に減少した。
治療用血漿タンパク質(TPP)を産生及び発現できる能力
Fa2N−4細胞系で免疫反応性TPPを適切に産生できるかどうかを、免疫反応性ヒト成長ホルモン(hGH)の産生によって示した。一時的トランスフェクションの前日に、Fa2N−4細胞を、10%NBCS−MFE培地を使用したNunc社製6ウェルプレートの各ウェルに、Fa2N−4細胞を0.5〜0.8×106個の細胞密度で蒔いた。トランスフェクションの日に、この細胞を1回洗浄して血清を除去し、Invitrogen社製Lipofectamine Plus又はQiagen社製Effecteneトランスフェクション試薬キットのいずれかを使用して、hGHの完全cDNAを含む、CMVベースのプラスミドを、Fa2N−4細胞中に一時的にトランスフェクトした。製造元のプロトコール通りにトランスフェクションを実施した。
略語表
Blank=基質
Std X=Xng/mlのhGHの標準
XQLacZ Y=Qiagen社製キットを使用して、LacZ対照プラスミドを0.5×10(6)細胞中にトランスフェクトしたX日後に得られた試料Y
XQ(1:Y)Z=Qiagen社製キットを使用して、DNAとEffectene試薬を1:Yの比で0.5×10(6)細胞中にトランスフェクトしたX日後に得られた試料Z
XNeg Y’=Qiagen社製キットを使用して、DNAを含まないものを0.8×10(6)細胞中にトランスフェクトしたX日後に得られた試料Y
XQ(1:Y)Z’=Qiagen社製キットを使用して、DNAとEffectene試薬を1:Yの比で0.8×10(6)細胞中にトランスフェクトしたX日後に得られた試料Z
ILacZ X=Invitrogen社製キットを使用して、LacZ対照プラスミドを0.7×10(6)細胞中にトランスフェクトした翌日に得られた試料X
I(X)Y=Invitrogen社製キットを使用して、XugのDNAを0.7×10(6)細胞中にトランスフェクトした翌日に得られた試料Y
Blank’=緩衝液
EA1C−35及びFa2N−4細胞系の免疫表現型の特徴付け
Ea1C−35(継代第26代)及びFa2N−4(継代第30代)細胞系の表現型を、様々な肝細胞又は胆管のマーカー、並びにSV40不死化遺伝子に対する一群団の抗体を使用した間接免疫蛍光分析によって分析した。その分析結果を下記の表14にまとめて示す。
上記のすべての参考文献の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込む。本発明を好ましいその実施形態に関して具体的に示し、説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、その形態及び詳細を様々な形で変更できることは当分野の技術者であれば理解されよう。
Claims (58)
- ウイルスによって不死化された肝細胞であって、
(a)正常肝臓細胞に由来し、
(b)非腫瘍形成性であり、且つ
(c)内因性治療用血漿タンパク質(TPP)を自然に産生する
肝細胞。 - ヒト肝臓細胞に由来する、請求項1に記載の肝細胞。
- 凍結保存された初代ヒト肝細胞に由来する、請求項1に記載の肝細胞。
- 実質上純粋なシミアンウイルス40(SV40)のDNAを含む、請求項1に記載の肝細胞。
- 前記DNAが野生型SV40ラージT抗原及びスモールt抗原(TAg)をコードしている、請求項4に記載の肝細胞。
- 前記SV40 TAgが癌抑制因子と相互作用する、請求項5に記載の肝細胞。
- 前記癌抑制因子がヒトRbを含む、請求項6に記載の肝細胞。
- 前記癌抑制因子がヒトp53を含む、請求項6に記載の肝細胞。
- 無血清培地中で維持することができる、請求項1に記載の肝細胞。
- 前記無血清培地が、MCT社製無血清培地である、請求項9に記載の肝細胞。
- 前記MCT社製無血清培地が、MFE(Multi−Functional Enhancing多機能増強)培地である、請求項10に記載の肝細胞。
- 肝機能を保持する、請求項1に記載の肝細胞。
- 前記肝機能が、肝酵素活性を発現し続ける能力である、請求項12に記載の肝細胞。
- 前記肝酵素活性がチトクロムP450(CYP)酵素活性である、請求項13に記載の肝細胞。
- 前記肝細胞の前記肝酵素活性を、肝臓に対する化合物の作用を評価するために使用することができる、請求項13に記載の肝細胞。
- 前記肝細胞の前記肝酵素活性を、肝臓に対する薬物候補の作用を評価するために使用することができる、請求項13に記載の肝細胞。
- 前記肝細胞の前記肝酵素活性を、酵素誘導を評価するために使用することができる、請求項13に記載の肝細胞。
- 前記肝細胞の前記肝酵素活性を、細胞毒性を評価するために使用することができる、請求項13に記載の肝細胞。
- 前記肝細胞の前記肝酵素活性を、化合物に対する肝臓の作用を評価するために使用することができる、請求項13に記載の肝細胞。
- 前記肝細胞を、薬物代謝を評価するために使用することができる、請求項19に記載の肝細胞。
- 前記肝細胞を、種間比較を評価するために使用することができる、請求項19に記載の肝細胞。
- 前記肝機能が、アセトアミノフェン抱合物を形成する能力である、請求項12に記載の肝細胞。
- 前記TPPが、アルブミン、α1アンチトリプシン、血液凝固因子、トランスフェリン、及びインターαタンパク質性インヒビター(IαIP)からなる群から選択される、請求項1に記載の肝細胞。
- 前記TPPが、少なくとも有効な量のアルブミンからなる、請求項23に記載の肝細胞。
- 前記TPPが、少なくとも有効な量のα1アンチトリプシンからなる、請求項23に記載の肝細胞。
- 前記TPPが、少なくとも有効な量の血液凝固因子からなる、請求項23に記載の肝細胞。
- 前記血液凝固因子が第VIII因子又は第IX因子である、請求項26に記載の肝細胞。
- 前記TPPが、有効な量のトランスフェリンからなる、請求項23に記載の肝細胞。
- 前記TPPが、少なくとも有効な量のインターαタンパク質性インヒビター(IαIP)からなる、請求項23に記載の肝細胞。
- 前記肝細胞が、
(1)足場非依存性増殖、又は無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍形成などの標準の試験を使用した、化学的、物理的、且つウイルス性の作用物質、並びに癌遺伝子、及び腫瘍からの高分子量ゲノムDNAを含めた導入遺伝子による悪性転換の研究、
(2)潜在的な化学療法剤をスクリーニングするための、癌遺伝子の導入によって改変された細胞の使用、
(3)細胞増殖と外因性因子の作用と相互に関係付けた、細胞内のpH及びカルシウムレベルの変化を含めた細胞生化学の研究、
(4)増殖因子に対する細胞応答及び増殖因子の産生の研究、
(5)細胞内情報伝達の研究、
(6)細胞表面抗原の特徴付け、
(7)癌抑制活性を同定するための細胞間雑種の研究、
(8)新規遺伝子の同定、
(9)複製する肝炎ウイルス(例えば、HBV、HCV、非A非B型、HAV、及び他の肝臓親和性のウイルス、例えばCMV)の増殖、
(10)C型肝炎ウイルス(HCV)感染を治療するための新たな薬物の同定、
(11)移植の、また体外の肝移植片及び肝機能補助装置のための細胞の増殖、
(12)肝臓寄生虫の研究、
(13)肝疾患の研究、
(14)潜在的治療用薬物の同定、
(15)新たな薬物標的の同定、
(16)最終分化を誘導する生物学的薬剤及び化学的薬剤の同定、
(17)発癌物質及び他の生体異物の代謝の研究、
(18)DNA変異誘発の研究、
(19)染色体損傷作用物質の研究、
(20)薬物、化合物、発癌物質、及び生体異物の細胞毒性の研究、
(21)肝細胞由来のタンパク質の産生、並びに
(22)対象のタンパク質を産生するための組換えDNA発現ベクターの使用
からなる群から選択される手順を実施するために使用することができる、請求項1に記載の肝細胞。 - Fa2N−4(ATCC受託番号5566)である、請求項1に記載の肝細胞。
- Ea1C−35(ATCC受託番号5565)である、請求項1に記載の肝細胞。
- ウイルスによって不死化されたヒト初代肝細胞系Fa2N−4(ATCC受託番号5566)。
- ウイルスによって不死化されたヒト初代肝細胞系Ea1C−35(ATCC受託番号5565)。
- 肝臓に対する化合物の作用を評価するために、請求項1に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
- 前記化合物が薬物候補である、請求項35に記載の方法。
- 前記肝細胞が肝機能を保持する、請求項36に記載の方法。
- 前記肝機能が肝酵素活性を発現する能力を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記肝酵素活性がチトクロムP450(CYP)酵素活性を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記不死化肝細胞が、Ea1C−35細胞系(ATCC受託番号5565)及びFa2N−4細胞系(ATCC受託番号5566)からなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
- 酵素誘導を評価するために、請求項1に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
- 前記肝細胞が肝機能を保持する、請求項41に記載の方法。
- 前記肝細胞が肝酵素活性を発現する能力を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記肝酵素活性がチトクロムP450(CYP)酵素活性を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記不死化肝細胞が、Ea1C−35細胞系(ATCC受託番号5565)及びFa2N−4細胞系(ATCC受託番号5566)からなる群から選択される、請求項44に記載の方法。
- 細胞毒性を評価するために、請求項1に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
- 前記肝細胞が肝機能を保持する、請求項46に記載の方法。
- 前記肝機能が肝酵素活性を発現する能力を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記肝酵素活性がチトクロムP450(CYP)酵素活性を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記不死化肝細胞が、Ea1C−35細胞系(ATCC受託番号5565)及びFa2N−4細胞系(ATCC受託番号5566)からなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
- 化合物に対する肝臓の作用を評価するために、請求項1に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
- 前記肝細胞が肝機能を保持する、請求項51に記載の方法。
- 前記肝機能が肝酵素活性を発現する能力を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記肝酵素活性がチトクロムP450(CYP)酵素活性を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記不死化肝細胞が、Ea1C−35細胞系(ATCC受託番号5565)及びFa2N−4細胞系(ATCC受託番号5566)からなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 前記化合物に対する肝臓の作用が薬物代謝を含む、請求項51に記載の方法。
- 前記薬物代謝をアセトアミノフェン抱合物の形成によって測定する、請求項56に記載の方法。
- (1)足場非依存性増殖、又は無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍形成などの標準の試験を使用した、化学的、物理的、且つウイルス性の作用物質、並びに癌遺伝子、及び腫瘍からの高分子量ゲノムDNAを含めた導入遺伝子による悪性転換の研究、
(2)潜在的な化学療法剤をスクリーニングするための、癌遺伝子の導入によって改変された細胞の使用、
(3)細胞増殖と外因性因子の作用と相互に関係付けた、細胞内のpH及びカルシウムレベルの変化を含めた細胞生化学の研究、
(4)増殖因子に対する細胞応答及び増殖因子の産生の研究、
(5)細胞内情報伝達の研究、
(6)細胞表面抗原の特徴付け、
(7)癌抑制活性を同定するための細胞間雑種の研究、
(8)新規遺伝子の同定、
(9)複製する肝炎ウイルス(例えば、HBV、HCV、非A非B型、HAV、及び他の肝臓親和性のウイルス、例えばCMV)の増殖、
(10)C型肝炎ウイルス(HCV)感染を治療するための新たな薬物の同定、
(11)移植の、また体外の肝移植片及び肝機能補助装置のための細胞の増殖、
(12)肝臓寄生虫の研究、
(13)肝疾患の研究、
(14)潜在的治療用薬物の同定、
(15)新たな薬物標的の同定、
(16)最終分化を誘導する生物学的薬剤及び化学的薬剤の同定、
(17)発癌物質及び他の生体異物の代謝の研究、
(18)DNA変異誘発の研究、
(19)染色体損傷作用物質の研究、
(20)薬物、化合物、発癌物質、及び生体異物の細胞毒性の研究、
(21)肝細胞由来のタンパク質の産生、並びに
(22)対象のタンパク質を産生するための組換えDNA発現ベクターの使用
からなる群から選択される手順を実施するために、請求項1に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015042985A (ja) * | 2008-05-28 | 2015-03-05 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 肝酵素誘導を評価する手段及び方法 |
JP2015173635A (ja) * | 2014-03-14 | 2015-10-05 | 国立大学法人東京工業大学 | 肝炎組織体、肝炎ウイルスの感染方法、肝炎組織体の製造方法、肝炎ウイルスの増殖方法、肝炎ワクチンの製造方法、スクリーニング方法、及びキット |
JP2016508369A (ja) * | 2013-02-08 | 2016-03-22 | シャンハイ インスティチューツ フォー バイオロジカル サイエンシーズ、 チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズ | ヒト肝細胞様細胞およびその使用 |
JP2021512595A (ja) * | 2018-01-30 | 2021-05-20 | カプリコール,インコーポレイテッド | 細胞療法に適した活性化誘導組織エフェクター細胞およびそれに由来する細胞外小胞 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1980613T3 (en) * | 2006-01-12 | 2016-02-08 | Univ Tokyo Womens Medical | PROCEDURE FOR KEEPING THE FUNCTION OF Liver Tissue Cells Over a Long Time |
JP5737821B2 (ja) * | 2006-08-17 | 2015-06-17 | 一夫 大橋 | 血友病b治療剤及びその製造方法 |
US8099298B2 (en) * | 2007-02-14 | 2012-01-17 | Genelex, Inc | Genetic data analysis and database tools |
WO2009142767A1 (en) * | 2008-05-22 | 2009-11-26 | Lentigen Corporation | Lentivector-based protein production |
CN101967499A (zh) * | 2009-12-09 | 2011-02-09 | 河南东都生物科技有限公司 | 一种还原型辅酶q10的生产方法 |
WO2014121133A2 (en) | 2013-02-03 | 2014-08-07 | Genelex Corporation | Systems and methods for quantification and presentation of medical risk arising from unknown factors |
JP2015008686A (ja) * | 2013-06-28 | 2015-01-19 | 三菱レイヨン株式会社 | 肝臓細胞又はその前駆細胞に由来する細胞の状態を評価する方法、並びに、その方法に用いるプローブ又はプローブセット及びマイクロアレイ |
WO2023084648A1 (ja) * | 2021-11-10 | 2023-05-19 | 株式会社日立ハイテク | 薬剤相互作用解析方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6107043A (en) * | 1996-03-05 | 2000-08-22 | Rhode Island Hospital | Immortalized hepatocytes |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS584728A (ja) * | 1981-05-01 | 1983-01-11 | メデイカル・リサ−チ・インステイチユ−ト・オブ・サンフランシスコ・コ−ポレ−シヨン | α−1−抗トリプシンの精製 |
US5665589A (en) * | 1988-12-14 | 1997-09-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Human liver epithelial cell lines |
US5652097A (en) * | 1994-12-14 | 1997-07-29 | Universite De Montreal | In vitro test to evaluate the inhibition potency of angiotensin II antagonists on angiotensinogen |
YU8997A (sh) * | 1996-03-11 | 1999-09-27 | Bayer Corporation | Prečišćen protein koji ima serinsku proteaznu inhibitorsku aktivnost i farmaceutski preparat koji ga sadrži |
DE19711266C2 (de) * | 1997-03-05 | 1999-06-17 | Hepavec Ag Fuer Gentherapie | Neue humane Leber-Zellinie |
JP2003521216A (ja) * | 1997-08-05 | 2003-07-15 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | 90個のヒト分泌タンパク質 |
US6653105B2 (en) * | 1998-02-11 | 2003-11-25 | Vitagen, Inc. | Clonal cells and cell lines derived from C3A cells and methods of making and using them |
ATE341620T1 (de) | 1998-04-28 | 2006-10-15 | Takeda Pharmaceutical | Neue, immortalisierte leber-zelllinie humanen ursprungs |
AU6162199A (en) | 1998-09-25 | 2000-04-17 | Harvard-Mit Division Of Health Science And Technology | Reversibly immortalized hepatocytes and methods of use |
US6517830B1 (en) * | 1999-08-05 | 2003-02-11 | Emory University | Compositions and methods for the expression of factor VIII polypeptides and uses therefor |
AU2001274536A1 (en) * | 2000-06-15 | 2002-01-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Insulin-like growth factor-binding protein |
AU2001293074A1 (en) | 2000-09-25 | 2002-04-08 | Walter Reed Army Institute Of Research | Human liver cell line |
US20020187936A1 (en) * | 2001-05-17 | 2002-12-12 | Board Of Trustees For The University Of Illinois | Methods of treating liver disease and liver damage with growth hormone and foxM1B |
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2006
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6107043A (en) * | 1996-03-05 | 2000-08-22 | Rhode Island Hospital | Immortalized hepatocytes |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015042985A (ja) * | 2008-05-28 | 2015-03-05 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 肝酵素誘導を評価する手段及び方法 |
JP2016508369A (ja) * | 2013-02-08 | 2016-03-22 | シャンハイ インスティチューツ フォー バイオロジカル サイエンシーズ、 チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズ | ヒト肝細胞様細胞およびその使用 |
US9623048B2 (en) | 2013-02-08 | 2017-04-18 | Shanghai Institutes For Biological Sciences, Chinese Academy Of Sciences | Human hepatocyte-like cells and uses thereof |
JP2015173635A (ja) * | 2014-03-14 | 2015-10-05 | 国立大学法人東京工業大学 | 肝炎組織体、肝炎ウイルスの感染方法、肝炎組織体の製造方法、肝炎ウイルスの増殖方法、肝炎ワクチンの製造方法、スクリーニング方法、及びキット |
JP2021512595A (ja) * | 2018-01-30 | 2021-05-20 | カプリコール,インコーポレイテッド | 細胞療法に適した活性化誘導組織エフェクター細胞およびそれに由来する細胞外小胞 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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