WO2023084648A1 - 薬剤相互作用解析方法 - Google Patents

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WO2023084648A1
WO2023084648A1 PCT/JP2021/041386 JP2021041386W WO2023084648A1 WO 2023084648 A1 WO2023084648 A1 WO 2023084648A1 JP 2021041386 W JP2021041386 W JP 2021041386W WO 2023084648 A1 WO2023084648 A1 WO 2023084648A1
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compound
compounds
excretion
quantitative
enzyme
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PCT/JP2021/041386
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勝弘 神田
Original Assignee
株式会社日立ハイテク
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a drug interaction analysis method for analyzing interactions when two or more drugs are used in combination.
  • Drug interactions are caused by pharmacodynamic and pharmacokinetic effects.
  • a pharmacodynamic action is pharmacologically caused by the interaction between a drug and a receptor or the like, reaction rate, concentration, and the like. Pharmacokinetic effects occur as a result of drug absorption, distribution, metabolism, and excretion processes interacting with each other.
  • Drugs are mainly metabolized by metabolic enzymes in hepatocytes. Drugs metabolized in hepatocytes are excreted into blood and bile.
  • the induction of metabolic enzymes by either drug may promote the metabolism of the drug used in combination.
  • inhibition of metabolic enzymes by either drug may inhibit metabolism of the concomitant drug.
  • the degree of enzyme induction and enzyme inhibition on such metabolic enzymes is quantitatively tested in vitro and in vivo. In a quantitative test, for example, a standard substance is administered together with the compound to be evaluated. Enzyme induction or enzyme inhibition of the compound to be evaluated is individually evaluated by quantifying the standard substance.
  • Patent Document 1 describes a high-throughput screening method that makes it possible to discover unexpected or surprising effects induced by one or more compounds, combinations of compounds, or mixtures of compounds.
  • one or more isotopically labeled substrates are administered to cells, tissues or organisms and molecular fluxes are calculated along one or more pathways of interest.
  • screening the molecular flux rates in biological systems to which the compound has been administered are compared to those in biological systems to which the compound has not been administered.
  • Patent Document 2 describes a method for determining whether a drug candidate promotes or inhibits the activity of drug-metabolizing enzymes.
  • a drug candidate substance and a plurality of index compounds are administered to highly substituted chimeric mice, and the concentrations of the index compounds in serum are measured over time.
  • the concentration of the index compound in serum when the drug candidate substance is administered is compared with the concentration of the index compound in serum when the drug candidate substance is not administered.
  • Patent Document 3 describes the amount of components excreted via hepatocyte transporters, the amount of components excreted via hepatocyte bile canaliculi, and excreted from sources other than hepatocyte transporters and bile canaliculi.
  • a component analysis method is described for analyzing the amount and amount of components that are present.
  • Patent Document 1 compares the results of various reactions in a biological system to which one or more compounds have been administered with the results of various reactions in a biological system to which one or more compounds have not been administered. It is something to do.
  • the results of reactions are measured as molecular fluxes.
  • Molecular flux rates are determined as the amount and pattern of isotope labels incorporated into molecules in metabolic pathways, and their rates of change. Since this technique compares molecular flux rates and does not analyze the behavior of compounds exposed to biological systems, it is not suitable for evaluating the pharmacokinetic processes of the compounds themselves.
  • Patent Document 2 the technique described in Patent Document 2 is that the concentration of an index compound in serum when a drug candidate substance is administered and the concentration of an index compound in serum when a drug candidate substance is not administered are compared with each other. It is for comparison.
  • This technology conducts in vivo evaluation tests using chimeric mice, and is not an invention related to in vitro tests, nor does it analyze the combined administration of the compounds to be evaluated, their interactions, and quantitative fluctuations. do not have.
  • the present invention provides a drug interaction analysis method that can comprehensively evaluate the interaction when two or more drugs are used in combination, based on the measurement results of interactions between two or more drugs. intended to
  • the drug interaction analysis method is a drug interaction analysis method for analyzing interactions when two or more drugs are used in combination, comprising: Two or more compounds to be used in combination and a standard substrate metabolized by the metabolic enzyme are administered, and quantitative changes in the compounds due to interactions in the cells, and the standard substrates due to interactions in the cells and the presence or absence of the enzyme-inducing activity of the metabolic enzyme that occurs when two or more of the compounds are used in combination, based on the measurement results of the quantitative variation, and the enzyme of the metabolic enzyme and determining the presence or absence of inhibitory activity.
  • the drug interaction analysis method it is possible to comprehensively evaluate the interaction when two or more drugs are used in combination, based on the measurement results obtained by allowing two or more drugs to interact.
  • FIG. 1 is a flow diagram showing a drug interaction analysis method according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 10 illustrates the steps of measuring quantitative variation due to interaction
  • FIG. 3 is a diagram showing a fraction recovery/quantitation step by excretion route.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of a comparison table representing patterns used for interaction determination; It is a figure which shows an example of the graph showing the amount of each component for every excretion route. It is a figure which shows an example of the graph showing the amount of each component for every excretion route.
  • the drug interaction analysis method relates to a method for analyzing interactions when two or more drugs are used in combination.
  • two or more compounds When two or more compounds are administered to humans or the like at the same time, they may interact in the process of drug metabolism or drug excretion.
  • the action of each compound can be discriminated from the interaction when two or more kinds of compounds are used in combination, and the overall picture of the interaction can be grasped from a bird's-eye view.
  • Compounds to be analyzed include compounds that constitute drugs, compounds that are candidate drugs, and compounds that are intermediate metabolites of drugs. Any number of types of compounds to be analyzed can be analyzed as long as they are two or more. Compounds to be analyzed may include compounds with known interactions as long as they include compounds with unknown interactions.
  • Interactions that occur in the process of drug metabolism include enzyme-inducing activity and enzyme-inhibiting activity for metabolic enzymes that metabolize drugs.
  • enzyme-inducing activity When two or more compounds are administered, if any of the compounds exhibits enzyme-inducing activity, metabolic enzymes may be induced to promote metabolism of the compound used in combination. In addition, if any of the compounds exhibits enzyme inhibitory activity, the metabolic enzymes may be inhibited and the metabolism of the compound used in combination may be suppressed.
  • Interactions that occur in the process of drug excretion include excretion-inducing activity and excretion-inhibiting activity from cells that metabolize the drug.
  • excretion-inducing activity When two or more compounds are administered, if any of the compounds exhibits excretion-inducing activity, excretion from cells may be induced to promote excretion of the concomitant compound.
  • excretion inhibitory activity when either compound exhibits excretion inhibitory activity, its excretion from cells may be inhibited, and the excretion of the compound used in combination may be suppressed.
  • the process of drug metabolism is evaluated as to whether or not each compound exhibits enzyme-inducing activity, enzyme-inhibiting activity, or not when two or more compounds are administered. It is determined whether or not to indicate When enzyme induction and enzyme inhibition are combined by two or more compounds, the breakdown of enzyme induction activity and enzyme inhibition activity for each compound can be determined.
  • the process of drug metabolism can be evaluated based on the quantitative results of components excreted from cells through predetermined excretion pathways. Therefore, the evaluation of enzyme-inducing activity and enzyme-inhibiting activity reflects excretion-inducing activity and excretion-inhibiting activity, and an evaluation that incorporates the kinetics of the excretion process of the drug can be obtained in the same test system. .
  • the drug interaction analysis method it is possible to analyze the tendency of excretion-inducing activity and excretion-inhibiting activity as well as the evaluation of enzyme-inducing activity and enzyme-inhibiting activity.
  • the tendency of excretion-inducing activity and excretion-inhibiting activity can be obtained as a tendency for each excretion route.
  • the enzyme-inducing activity and enzyme-inhibiting activity of each compound are determined based on the quantitative variation of the compound due to interactions in cells. Quantitative changes in compounds due to interactions are measured by in vitro quantitative tests using cells for analysis. Quantitative variation means the quantitative variation in the quantitative results of co-administration of two or more compounds relative to the quantitative results of single administration of each compound. Quantitative fluctuations are classified as increasing, decreasing, or unchanged.
  • Quantitative fluctuations of compounds due to interactions in cells are also caused by the enzyme-inducing activity/enzyme-inhibiting activity exhibited by the compound used in combination with the compound, as well as the excretion-inducing activity/excretion-inhibiting activity. Therefore, by measuring the quantitative variation for each compound and comparing the patterns of quantitative variation between compounds, it is possible to determine the presence or absence of induction, the presence or absence of inhibition, and the difference between induction and inhibition when two or more compounds are used in combination. The breakdown of complex interactions can be determined.
  • Cells for analysis are cells that produce metabolic enzymes that metabolize drugs, for example, hepatocytes that produce phase 1 metabolic enzymes such as cytochrome P450.
  • Metabolic enzymes include CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 and the like.
  • Cells for analysis may be derived from humans or animals such as mice and rats. However, from the viewpoint of avoiding the influence of species differences, it is preferably derived from humans.
  • hepatocytes As hepatocytes, cultured hepatocytes that are two-dimensionally cultured, spheroids that are three-dimensionally cultured hepatocytes, and liver organoids that are three-dimensionally cultured cell groups containing hepatocytes can be used.
  • the target is a culture method in which bile canaliculi-like structures are formed in the adhesion regions between hepatocytes. Using such cultured hepatocytes, the key dynamics of drug metabolism and excretion processes can be accurately evaluated in the same test system. Cultured hepatocytes also give rise to extracellular compartments corresponding to bile canaliculi by cell-to-cell adhesion. Therefore, it is possible to open and close compartments corresponding to bile canaliculi between cells by controlling the maintenance and disruption of cell-cell adhesion.
  • Two-dimensional cultured hepatocytes can be obtained by culturing hepatocytes on an extracellular matrix.
  • sandwich culture is preferred in which hepatocytes are cultured in a state in which extracellular matrices are layered and hepatocytes are sandwiched between them.
  • Spheroids can be obtained by culturing hepatocytes on an extracellular matrix, on a substrate, or in suspension.
  • Hepatic organoids can be obtained by co-cultivating cell groups such as hepatocytes, vascular endothelial cells, and mesenchymal cells on an extracellular matrix or substrate.
  • plates, microwells, microchannels, gel sheets and the like to which collagen, laminin, proteoglycans, glycosaminoglycans and the like are bound can be used as the base material.
  • FIG. 1 is a flow diagram showing a drug interaction analysis method according to an embodiment of the present invention.
  • the drug interaction analysis method according to the present embodiment comprises a step S10 of measuring quantitative changes due to interaction when two or more compounds are used in combination for a compound to be analyzed and a standard substrate; and a step S20 of determining induction and inhibition of metabolic enzymes and drug excretion based on the measurement results of quantitative fluctuations.
  • the step S10 of measuring quantitative changes due to interactions includes a cell culture/compound administration step S1, a cell conditioning step S2, a standard substrate administration step S3, a vascular side excreted fraction collection and quantification step S4, and an excretion route-specific step S10.
  • a fraction collection/quantification step S5, an intracellular residual fraction collection/quantification step S6, and a quantitative result comparison step S7 are included in this order.
  • step S10 of measuring quantitative changes due to interactions analysis cells used for analysis of drug interactions are prepared, and analysis cells that produce metabolic enzymes are analyzed in combination with each other.
  • One or more compounds and standard substrates that are metabolized by metabolic enzymes are administered.
  • quantitative changes in the compounds due to interactions in cells and quantitative changes in the standard substrate due to interactions in cells are measured.
  • Quantitative changes are also measured for metabolites of each compound and standard substrate.
  • step S20 for determining induction and inhibition the analysis target based on the measurement results of quantitative changes in each compound and its metabolites to be analyzed, and the measurement results of quantitative changes in the standard substrate and its metabolites.
  • the presence or absence of enzyme-inducing activity of metabolic enzymes and the presence or absence of enzyme-inhibitory activity of metabolic enzymes that occur when two or more compounds are used in combination are determined. Along with these determinations, the tendency of excretion-inducing activity and excretion-inhibiting activity can be evaluated.
  • FIG. 2 shows the steps of measuring quantitative variation due to interaction.
  • step S10 for measuring the quantitative variation due to the interaction a plurality of test plots with different compounds to be administered are provided, and a quantitative test is performed for each test plot.
  • the cells for analysis are cultured, the compound to be analyzed and the standard substrate are administered, and after metabolizing these, the parent compound and metabolites excreted outside the cells, and the residual in the cells quantify the parent compound and metabolites that Details of each step (S1 to S7) in step S10 will be described later.
  • test plots may be tested simultaneously or sequentially. Quantitation of each compound in each test area is performed, for example, by a liquid scintillation counter when the compound is isotopically labeled, by spectroscopic analysis when the compound has fluorescence, and by mass spectrometry when the compound is unlabeled or does not have fluorescence. It can be carried out. In the case of quantification by spectroscopic analysis, a microplate or the like can be divided into test sections and measured simultaneously using a plate reader or the like.
  • test group M in which two or more compounds to be analyzed are administered in combination to perform a quantitative test, and one compound out of the two or more compounds to be analyzed, is administered alone and quantified.
  • a test area N for testing is provided.
  • test group M when analyzing two types of interaction of compound A and compound B, test group M to administer compound A and compound B in combination, test group NA to administer compound A alone, and compound B administered alone
  • a test area NB can be provided. The details of each test group (M, NA, NB) will be described later.
  • test area M all compounds among the two or more compounds to be analyzed and a standard substrate are administered to cells for analysis, and the cells for analysis are cultured and metabolized, and then analyzed.
  • the parent compounds and metabolites of each compound and standard substrate excreted extracellularly for analysis and the parent compounds and metabolites of each compound and standard substrate remaining in the cells for analysis are quantified.
  • test area N one compound among the two or more compounds to be analyzed and a standard substrate were administered to the cells for analysis, and the cells for analysis were cultured and metabolized. , the parent compound and metabolites of the extracellularly excreted compound for analysis and the standard substrate, and the parent compound and metabolites of the compound remaining in the cell for analysis and the standard substrate are quantified. Through such quantitative testing, quantitative results are obtained when the individual compounds used for derivation of quantitative variation are administered alone.
  • the quantitative test of test area N is performed on multiple compounds that require evaluation for each of the two or more compounds to be analyzed. Quantitative results of individual compounds administered alone can be obtained by conventional in vitro evaluation tests in which the compounds are administered alone or by theoretical calculations, without actually conducting a quantitative test in test group N. Sometimes. If such results are available, only the quantitative test for test plot M may be performed, and the quantitative test for test plot N may be omitted.
  • standard substrates compounds that are known to be metabolized by metabolic enzymes produced by the cells for analysis are used.
  • a standard substrate can also serve as an internal standard. When the standard substrate is administered together with the compound to be analyzed, the quantification results for each test plot can be calibrated even if the absorbability to cells differs for each compound or the cell amount for each test plot differs.
  • Quantification results are corrected based on the total amount of the administered standard substrate, that is, the total amount of the parent compound and metabolites of the standard substrate.
  • the parent compound and metabolites of the standard substrate remaining in the cells for analysis and the parent compound and metabolites of the standard substrate excreted outside the cells are quantified, and the total amount thereof is calculated. By using the relative value of the amount of each compound with respect to the total amount of these, it is possible to compare the quantitative results for each test group.
  • an appropriate substrate can be used according to the quantification method and the type of metabolic enzyme to be analyzed.
  • a substrate that dissociates a fluorescent label or the like by the action of a metabolic enzyme can be used.
  • mass spectrometry it is possible to use a substrate whose structure is similar to that of the analysis target whose mass changes due to the action of metabolic enzymes, or a substrate whose mass changes due to the action of metabolic enzymes and which is easily ionized.
  • Standard substrates include Phenacetin, Bupropion, Paclitaxel, Diclofenac, S-mephenytoin, Bufuralol, Midazolam, Testosterone ( testosterone) and the like. Since these substances are metabolized by phase I metabolic enzymes such as cytochrome P450 after being absorbed by hepatocytes, they can be used as a standard for comparing quantitative results.
  • intermediate and final metabolites of each compound to be analyzed if there are intermediate and final metabolites of each compound to be analyzed, and intermediate and final metabolites of the standard substrate, these can also be quantified.
  • Multiple metabolic enzymes may be stepwise involved in the process of drug metabolism.
  • Intermediate enzymatic activity can be assessed by quantifying intermediate metabolites and comparing quantitative variations.
  • compound A when analyzing two interactions of compound A and compound B, compound A is metabolized to the X-order metabolite Amet (X), and compound B is the Y-order metabolite.
  • compound B When metabolized to Bmet(Y) and the standard substrate S is metabolized to the final metabolite Smet, in a quantitative test, compound A, Amet(1), Amet(2) . , Bmet(1), Bmet(2), .
  • the quantitative test in addition to the metabolites of the main phase 1 metabolic enzymes, it is also possible to quantify the metabolites of off-target enzymes.
  • the metabolic process may involve off-target enzymes in addition to phase 1 metabolic enzymes such as certain cytochrome P450s. Quantitation of metabolites by off-target enzymes allows for comparisons within and outside the CYP species, thus providing a more detailed assessment of the kinetics of drug metabolism.
  • the quantitative variation of the compound due to the interaction is the quantitative variation of the quantification result of the compound in test area M with respect to the quantification result of the compound in test area N. It is obtained by comparison with the quantitative results of the compound.
  • Quantitative variation of a compound is caused by the inducing activity or inhibitory activity of the compound used in combination with the compound.
  • the inducing activity and inhibitory activity of the compound itself are offset between the quantitative results and do not affect quantitative fluctuations when the compound is administered to both test plots. Therefore, by determining the quantitative variation of each compound, the interaction by compounds other than the compound in question can be evaluated.
  • the quantitative variation of the standard substrate due to the interaction is the quantitative variation of the quantification result of the standard substrate in the test plot M with respect to the quantification result of the standard substrate in the test plot N, and the quantification result of the standard substrate in the test plot M. and the quantification results of the standard substrate in test plot N.
  • the combined inducing and inhibiting activities of all compounds to be analyzed cause quantitative fluctuations depending on the test system. Therefore, when the quantitative variation of the standard substrate is obtained, it is possible to calibrate the quantification results after the drug is incorporated into the cells so that they can be compared with each other using the standard substrate as a reference.
  • the patterns of quantitative variation for each component can be compared with each other. By comparing the patterns of quantitative variation, one can discern the activity of the combined compound against a given compound, as well as their antagonizing activity. Since the interaction by two or more compounds can be decomposed into the actions of individual compounds and understood, the presence or absence of enzyme-inducing activity that occurs when two or more compounds are used in combination, the presence or absence of enzyme-inhibiting activity, It becomes possible to determine the breakdown of the combined interaction of enzyme induction and enzyme inhibition.
  • test plot M and test plot N can be further divided into test plots 1 to 3 according to excretory routes of hepatocytes, and quantitative tests can be performed on each of test plots 1 to 3. Test plots 1-3 may be tested simultaneously or sequentially.
  • FIG. 3 is a diagram showing a fraction collection and quantification step by excretion route.
  • the excretion route-specific fraction collection and quantification step S5 in order to change the hepatocyte excretion route, incubation is performed under different conditions, and fractions corresponding to each excretion route are collected. Ingredients can be quantified.
  • the excretion pathway of hepatocytes can be changed for each test group 1-3 by controlling cell-cell adhesion and transporter activity.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of the sandwich culture of hepatocytes (cross-sectional view of the hepatocyte culture).
  • reference numeral 101 denotes a hepatocyte culture, 102 a transporter, 103 a bile canaliculus, 104 a basal plane or a basolateral plane, and 105 an apical plane.
  • the transporter 102 is a membrane protein that transports substances, and is expressed on the cell membrane of hepatocytes. Transporters 102 are involved in active transport of drugs, metabolites, and the like.
  • the bile canaliculi 103 formed in the adhesion region between hepatocytes are involved in bile excretion of drugs, metabolites, and the like.
  • the basal or basolateral surface 104 of cultured hepatocytes can be considered to face blood vessels in vivo.
  • the apical surface 105 of the cultured hepatocytes can be considered to face the bile canaliculi in vivo.
  • a drug can be administered to hepatocytes by adding a buffer solution or the like in which the drug is dissolved onto the hepatocyte culture 101 . If the administered drug is absorbable, it is taken into hepatocytes from the supernatant on the hepatocyte culture 101 via a predetermined transporter 102 present on the basal or basolateral plane 104 or the cell membrane. After being metabolized in hepatocytes, the drug is excreted on the side of the basal or basolateral surface 104 corresponding to blood and the side of the apical surface 105 corresponding to bile.
  • Test area 1 is a test area in which the cell-to-cell adhesion of hepatocytes is destroyed at a normal temperature of around 37°C.
  • step S5 of test area 1 (1) the amount excreted into blood by passive transport, (2) the amount excreted into blood via transporters, and (3) the amount excreted into bile via bile canaliculi The total can be quantified.
  • step S6 of the test group 1 (4) the residual amount in the cells can be quantified.
  • Test area 2 is a test area in which the cell-to-cell adhesion of hepatocytes is maintained at a normal temperature of around 37°C.
  • step S5 of the test area 2 (1) the amount excreted into the blood by passive transport and (2) the total amount excreted into the blood via the transporter can be quantified.
  • step S6 of the test section 2 (3) bile excretion via the bile canaliculus and (4) the sum of the residual amount in cells can be quantified.
  • Test area 3 is a test area that maintains intercellular adhesion of hepatocytes at a low temperature of around 4°C.
  • step S5 of Test Group 3 (1) the amount excreted into the blood by passive transport can be quantified. If the temperature is maintained at a lower temperature than test zones 1 and 2, (2) excretion into the blood via transporters can be suppressed.
  • step S6 of Test Group 3 (2) the amount excreted into the blood via the transporter, (3) the amount excreted in the bile via the bile canaliculus, and (4) the sum of the residual amount in the cells is quantified. can do.
  • test section M is a 37 ° C. decay system test section M-1 and a 37 ° C. maintenance system. It can be divided into area M-2 and test area M-3, which is a 4°C maintenance system.
  • test area NA is a test area NA-1 that is a 37° C. decay system, a test area NA-2 that is a 37° C. maintenance system, and a test area NA that is a 4° C. maintenance system. It can be divided into -3.
  • the test section NB is a test section NB-1 that is a 37 ° C. decay system, a test section NB-2 that is a 37 ° C. maintenance system, and a test section NB that is a 4 ° C. maintenance system. It can be divided into -3.
  • test groups 1 to 3 it is possible to determine through which excretion route the parent compound and metabolites of the standard substrate excreted extracellularly are excreted, in the same manner as the evaluation of the drug metabolism process.
  • can be determined by the test system of Quantitation of the parent compound and metabolites by route of elimination allows for an assessment that incorporates the kinetics of the drug's excretion process. For example, when the quantitative variation due to the interaction of each excretion route is small, it can be determined that the excretion-inducing activity or excretion-inhibiting activity of the compound used in combination is small. On the other hand, when the quantitative variation due to the interaction of each excretion route is large, it can be determined that the excretion-inducing activity or excretion-inhibiting activity of the compound used in combination is large.
  • step S10 for measuring quantitative changes due to interactions
  • step S20 for determining induction and inhibition of metabolic enzymes
  • Step S1 Cell culture/compound administration>
  • each compound (A, B, . . . ) to be analyzed is administered to cells for analysis, and the cells are cultured.
  • Each compound to be analyzed (A, B . Amet, Bmet).
  • hepatocytes for example, adherent hepatocytes and cell lines derived from various animals including humans can be used. Hepatocytes with a viability of 85% or more are preferred for culture.
  • the isolated hepatocytes are prepared in a seeding medium to a predetermined seeding density, and then seeded uniformly in a predetermined amount and in a culture vessel such as a 24-well plate coated with collagen gel, matrigel, etc. , 5% CO 2 , 37° C., and the like. After several hours or more have passed and the cells have adhered to the bottom surface of the container, a medium added with an extracellular matrix containing basement membrane components such as collagen and laminin is overlaid. Cultivation after layering is sandwich culture under conditions such as 5% CO 2 and 37° C. for about 4 days, for example.
  • Each compound (A, B%) to be analyzed can be added to the medium used for culture, the culture supernatant on cultured hepatocytes, and the like.
  • Each compound (A, B, . The concentration and addition amount of each compound (A, B, .
  • a test buffer solution or the like containing intercellular adhesion components in which compound A and compound B are dissolved can be added to the medium of test area M.
  • a test buffer solution or the like containing the components can be added.
  • test buffer solution an appropriate buffer solution that can maintain cell functions, such as Hank's solution, can be used.
  • intercellular adhesion components include components that bind to adhesion molecules such as cadherin and integrin and participate in adhesion between cells and between cells and substrates, such as divalent metal ions such as calcium ions and magnesium ions. be done.
  • Step S2 cell acclimation>
  • cells for analysis are acclimatized in a test buffer containing intercellular adhesion components.
  • the medium used for the culture forming the supernatant on the hepatocyte culture is replaced with a test buffer solution containing intercellular adhesion components.
  • the hepatocyte culture is rinsed briefly several times with test buffer containing intercellular adhesion components.
  • the hepatocyte culture is then incubated in a test buffer containing intercellular adhesion components. Incubation can be performed, for example, for about 10 minutes under conditions such as 5% CO 2 and 37°C.
  • ⁇ Step S3 Administration of standard substrate>
  • a standard substrate (S) is administered to the cells for analysis.
  • the standard substrate (S) is added to the supernatant of hepatocytes in culture, it is taken up by the hepatocytes and at least partly metabolized into metabolites (Smet).
  • test buffer solution containing the intercellular adhesion component used for conditioning forming the supernatant on the hepatocyte culture is replaced with the test buffer solution containing the standard substrate (S) and the intercellular adhesion component.
  • the hepatocyte culture is incubated in a test buffer containing the standard substrate (S) and intercellular adhesion components to allow the standard substrate (S) to be taken up into hepatocytes and metabolized. Incubation can be performed, for example, for about 30 minutes under conditions such as 5% CO 2 and 37°C.
  • a method for stopping uptake into hepatocytes a method of cooling hepatocytes can be used.
  • a method can be used in which the supernatant on the hepatocyte culture is replaced with a test buffer containing an intercellular adhesion component cooled to a low temperature of about 4° C., and the hepatocyte culture is quickly rinsed several times. .
  • the standard substrate (S) can be added to test buffer solutions containing intercellular adhesion components, supernatants on hepatocyte cultures, and the like.
  • the standard substrate (S) can be dissolved in a test buffer containing intercellular adhesion components and added.
  • the type, concentration, and amount of standard substrate (S) to be added are not particularly limited as long as the quantification of drug metabolism and excretion processes and the quantification of each excretion route are possible.
  • test buffer solution or the like containing an intercellular adhesion component can be added.
  • Step S4 Collection and quantification of the fraction discharged from the blood vessel>
  • the vascular-side fraction (F1) excreted from the hepatocytes for analysis is collected, and each component contained in the vascular-side fraction (F1) is quantified.
  • the components to be quantified include unreacted compounds to be analyzed (A, B, . Bmet%), metabolites of standard substrates produced by metabolism (Smet).
  • Each compound to be analyzed (A, B%), standard substrate (S), metabolites of each compound (Amet, Bmet%), and metabolites of standard substrate (Smet%)
  • Methods for quantification include liquid scintillation counter when the compound is isotopically labeled, spectroscopic analysis when the compound has fluorescence, and liquid chromatography mass spectrometry (LCMS) when the compound is unlabeled or does not have fluorescence. can be used.
  • test buffer solution containing the intercellular adhesion component used for rinsing after drug uptake forming the supernatant on the hepatocyte culture was heated to around 37°C. Replace with buffer solution. Then, the hepatocyte culture is incubated for a short period of time in a test buffer solution containing an intercellular adhesion component, mainly for the purpose of removing drugs adsorbed on the cell surfaces and the like. Incubation can be performed, for example, for about 1 minute under conditions such as 5% CO 2 and 37°C.
  • the vascular-side excreted fraction (F1) is the vascular-side excreted component I that is quickly excreted from the cells for analysis while the intercellular adhesion is maintained, and the vascular-side excreted fraction (F1) that is adsorbed on the cell surface after administration.
  • the blood vessel side excreted fraction collection and quantification step S4 may be performed for the purpose of collecting and quantifying the blood vessel side excreted component I, or may be performed for the purpose of removing the component adsorbed on the cell surface or the like after administration. For example, if the incubation time is shortened, compared with the discharge of the component I discharged from the blood vessel side, only the effect of removing the adsorbed component is likely to be obtained.
  • Vascular side excretion component I corresponds to (1) 'early excretion into blood due to passive transport and (2)' early excretion into blood via transporters. .
  • the upper surface of the cultured hepatocytes corresponds to the basal or basolateral surface, and since it faces the blood vessels in vivo, the supernatant on the hepatocyte culture for analysis is discharged to the blood vessel side (blood). fraction.
  • step S4 by quantifying the components contained in the blood vessel-side excreted fraction (F1), it is possible to determine whether or not each compound to be analyzed tends to accumulate in cells.
  • the blood vessel side discharge fraction (F1) may be collected from any test section. Of the plurality of test plots, some of the test plots may be collected and quantified, or all the test plots may be collected and quantified. In addition, when it is not necessary to determine whether each compound to be analyzed easily accumulates in cells, or when it is not necessary to remove components adsorbed on the cell surface, etc., the blood vessel side discharge fraction (F1) may be omitted.
  • Step S5 Collection and quantification of fractions by excretion route>
  • the excretion route-specific fraction (F2) excreted from the hepatocytes for analysis is collected and included in each excretion route-specific fraction (F2).
  • the components to be quantified include unreacted compounds to be analyzed (A, B, . Bmet%), metabolites of standard substrates produced by metabolism (Smet).
  • Each compound to be analyzed (A, B%), standard substrate (S), metabolites of each compound (Amet, Bmet%), and metabolites of standard substrate (Smet%)
  • Methods for quantification include liquid scintillation counter when the compound is isotopically labeled, spectroscopic analysis when the compound has fluorescence, and liquid chromatography mass spectrometry (LCMS) when the compound is unlabeled or does not have fluorescence. can be used.
  • the components for each excretion route include (1) the amount excreted into blood by passive transport, (2) the amount excreted into blood via transporters, and (3) the amount excreted into bile via canaliculi. .
  • cell Intracellular residuals excluding externally excreted components are included.
  • the total blood excretion can be calculated as the sum of (1) blood excretion due to passive transport and (2) blood excretion via transporters.
  • Total blood excretion includes vascular excretion component II from the cells for analysis.
  • Extracellular excretion should be calculated as the sum of (1) blood excretion by passive transport, (2) blood excretion via transporters, and (3) bile excretion via bile canaliculi. can be done.
  • the intracellular residue can be determined as drug uptake into cells minus extracellular excretion. The intracellular residue can also be quantified in step S6.
  • test group 1 the sum of (1) excretion into blood by passive transport, (2) excretion into blood via transporters, and (3) bile excretion through bile canaliculi was quantified. do.
  • the excreted portions of (1) to (3) are recovered from the supernatant of the hepatocyte culture for analysis in a state where intercellular adhesion of hepatocytes is disrupted.
  • test buffer solution containing intercellular adhesion components used in the previous step forming the supernatant on the hepatocyte culture is replaced with a disintegration buffer solution containing no intercellular adhesion components.
  • the hepatocyte culture is incubated in a disintegration buffer solution to disintegrate intercellular adhesion and excrete each component. Incubation can be performed, for example, for about 15 minutes under conditions such as 5% CO 2 and 37°C.
  • an appropriate buffer solution capable of maintaining cell functions such as Hank's (-) solution
  • Hank's (-) solution can be used as long as it does not contain calcium ions or magnesium ions necessary for intercellular adhesion.
  • Hank's solution (-) is Hank's solution that does not contain calcium ions or magnesium ions.
  • a chelator for calcium ions and magnesium ions can be added to actively disrupt cell-to-cell adhesion.
  • Glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA) or the like can be used as the chelator.
  • the vascular side discharge fraction of the 37°C collapse system is discharged into the supernatant on the hepatocyte culture for analysis in a state where the intercellular adhesion is collapsed.
  • the cell membrane around the gap formed by cell-cell adhesion corresponds to the apical surface and faces the bile canaliculi in vivo.
  • test group 1 since this cell membrane collapses, (1) the amount excreted into the blood by passive transport, (2) the amount excreted into the blood via the transporter, and (3) the bile canaliculus Total biliary excretion is quantified.
  • (3) bile excretion via the bile canaliculi is the increased amount with respect to the state in which the cell-to-cell adhesion is maintained.
  • test section 2 37 ° C maintenance system>
  • (1) the amount excreted into blood by passive transport and (2) the total amount excreted into blood via transporters are quantified.
  • the excreted portion of (1) to (2) is collected from the supernatant of the hepatocyte culture for analysis under the condition that intercellular adhesion of hepatocytes is maintained.
  • the test buffer solution containing intercellular adhesion components used in the previous step forming the supernatant on the hepatocyte culture is replaced with the maintenance buffer solution containing intercellular adhesion components.
  • the buffer solution for maintenance an appropriate buffer solution capable of maintaining cell functions, such as Hank's solution, can be used as long as it contains calcium ions and magnesium ions necessary for intercellular adhesion.
  • the hepatocyte culture is incubated in a maintenance buffer solution to maintain cell-to-cell adhesion and excrete each component. Incubation can be performed, for example, for about 15 minutes under conditions such as 5% CO 2 and 37°C.
  • the vascular side discharge fraction of the 37°C maintenance system is discharged into the supernatant on the hepatocyte culture for analysis in a state in which cell-cell adhesion is maintained.
  • the cell membrane around the gap formed by cell-cell adhesion corresponds to the apical surface and faces the bile canaliculi in vivo.
  • test zone 2 since this cell membrane is maintained, (1) the amount excreted into blood by passive transport and (2) the amount excreted into blood via transporters are quantified.
  • the blood excretion after step S4 is quantified.
  • test section 3 4 ° C. maintenance system>
  • (1) the amount excreted into the blood by passive transport is quantified.
  • the excreted portion of (1) is recovered from the supernatant of the hepatocyte culture for analysis in a state in which intercellular adhesion of hepatocytes is maintained and transporter activity is suppressed.
  • the test buffer solution containing intercellular adhesion components used in the previous step forming the supernatant on the hepatocyte culture is replaced with the maintenance buffer solution containing intercellular adhesion components.
  • the buffer solution for maintenance an appropriate buffer solution capable of maintaining cell functions, such as Hank's solution, can be used as long as it contains calcium ions and magnesium ions necessary for intercellular adhesion.
  • the hepatocyte culture is incubated in a maintenance buffer solution to maintain cell-to-cell adhesion and excrete each component. Incubation can be performed, for example, for about 15 minutes under conditions such as 5% CO 2 and 4°C.
  • the blood vessel side discharge fraction of the 4°C maintenance system is discharged into the supernatant of the hepatocyte culture for analysis in a state in which cell-cell adhesion is maintained. Maintaining hepatocytes at a low temperature such as 4° C. suppresses transporter activity. In test group 3, the transporters involved in excretion are suppressed, and only passive transport through the cell membrane occurs. (1) The amount excreted into the blood by passive transport is quantified.
  • step S5 all of the test plots 1 to 3 may be tested, but part of the test plots 1 to 3 may also be tested. For example, we would like to compare (1) excretion into blood by passive transport, (2) excretion into blood via transporters, and (3) bile excretion through bile canaliculi. In this case, only test plots 1 and 2 can be tested. If (1) the amount excreted into the blood by passive transport and (2) the amount excreted into the blood via the transporter are to be compared with each other, it is possible to test only test groups 2 and 3. can.
  • a 4°C collapse system that maintains hepatocytes at 4°C and disrupts intercellular adhesion may be provided.
  • each component can be quantified in a state where intercellular adhesion is disrupted and transporter activity is suppressed.
  • the amount excreted to the bile canaliculi side by passive diffusion and the amount excreted to the bile canaliculi side by the transporter can be evaluated.
  • Step S6 Intracellular residual fraction collection and quantification>
  • the intracellular residual fraction (F3) remaining in the hepatocytes for analysis is collected, and each component contained in the intracellular residual fraction (F3) is quantified. do.
  • the components to be quantified include unreacted compounds to be analyzed (A, B, . Bmet%), metabolites of standard substrates produced by metabolism (Smet).
  • each compound to be analyzed (A, B%), standard substrate (S), metabolites of each compound (Amet, Bmet%), and metabolites of standard substrate (Smet%)
  • the method of quantification is liquid scintillation counter when the compound is isotopically labeled, spectroscopic analysis when the compound has fluorescence, liquid Chromatographic mass spectrometry (LCMS) or the like can be used.
  • each test buffer used in the previous step which forms the supernatant on the hepatocyte culture, is replaced with a cell lysate.
  • a cell lysate a solution containing a surfactant or the like that disrupts cell membranes can be used.
  • LCMS liquid chromatography mass spectrometry
  • cell membrane disruption with an organic solvent is preferred.
  • the hepatocyte culture is treated in a cell lysate to excrete each component out of the cells. If necessary, physical cell membrane disruption such as homogenization or ultrasonic disruption may be performed.
  • the intracellular residual fraction (F3) is excreted out of the hepatocyte culture for analysis by breaking the cell membrane.
  • step S5 among the components taken up by the cells, the components actively or passively excreted outside the cells are quantified.
  • step S6 components remaining inside the cells without being discharged outside the cells in the upstream step are quantified.
  • Step S7 Comparison of quantitative results>
  • the quantitative results of the combined administration of two or more compounds to be analyzed are compared with the quantitative results of single administration of the individual compounds to be analyzed, and the A measurement result of the quantitative variation of each compound due to the interaction in the cell and a measurement result of the quantitative variation of the standard substrate due to the interaction in the analysis cell are derived.
  • the components whose amounts are compared with each other include unreacted compounds (A, B%) to be analyzed, metabolites (Amet, Bmet%) of the compounds to be analyzed, and unreacted standard substrates. (S), metabolites (Smet%) of standard substrates produced by metabolism. Intermediate metabolite amounts may be compared when evaluating interactions on stepwise metabolic reactions. In addition to metabolites from major metabolic enzymes, the amount of metabolites from off-target enzymes may also be compared.
  • each compound (A, B%) quantified in test group M and the amount of each compound's metabolites (Amet, Bmet%) B%) and metabolites (Amet, Bmet%) of each compound. be able to.
  • the unreacted standard substrate (S) and the metabolites (Smet%) of the standard substrate produced by metabolism can be similarly compared and classified.
  • the sum of the components contained in the vascular side excreted fraction (F1), the components contained in the excretion route-specific fraction (F2), and the components contained in the intracellular residual fraction (F3) is If the component adsorbed on the cell surface or the like is removed in step S4, the amount becomes equivalent to the amount of the drug taken up by the hepatocytes after administration of the drug.
  • the sum of these components corresponds to the total amount of drugs actually taken up into hepatocytes out of the compounds and standard substrates added to the supernatant. can be used as
  • the sum of the components contained in the excretion route-specific fraction (F2) and the components contained in the intracellular residual fraction (F3) is the vascular side excreted component I
  • the measurement results of quantitative fluctuations due to interactions in the metabolic process may be obtained for the total amount of such drug uptake (F1 component + F2 component + F3 component), or the total amount of target compounds for excretion distribution evaluation (F2 component + F3 component), or both.
  • “Pattern 1” is the case where the total amount of drug uptake (F1 component + F2 component + F3 component) is used.
  • “Pattern 2” is defined as the case where the total amount (F2 component + F3 component) of the target compound for excretion distribution evaluation is used.
  • the amount of unmetabolized and unreacted standard substrate (S) and metabolites of the standard substrate produced by metabolism may be used as a reference to calibrate the quantitative results for each test section in advance.
  • Quantitative results for each test plot may have differences in drug uptake and sample errors depending on the amount of hepatocytes. By calibrating against the total amount of standard substrate, quantitative results can be accurately compared quantitatively.
  • the measurement results of quantitative fluctuations due to interactions in the process of drug metabolism show that the quantitative fluctuations of each component based on the enzymatic activity when two or more compounds are administered in combination compared to when each compound is administered alone. It can be obtained as tabular data classified into ( ⁇ ), decrease ( ⁇ ), or no change (-).
  • Such data includes compounds to be analyzed (A, B%), standard substrates (S), metabolites of each compound (Amet, Bmet%), metabolites of standard substrates (Smet... ).
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of a comparison table representing patterns used for interaction determination.
  • FIG. 4 shows a comparison table used for evaluation of interactions in the process of drug metabolism in step S20 for determining induction and inhibition.
  • the reference table showing the patterns used to determine the interaction includes each compound to be analyzed (A, B . . . ), standard substrate (S), metabolites of each compound (Amet, Bmet .
  • the collation column includes a collation column for collating the quantitative variation of each compound (A, B, . . . ) to be analyzed and a quantitative variation (increase/decrease ⁇ It is divided in the horizontal direction into a matching column for matching (no change).
  • a quantitative variation increase/decrease ⁇ It is divided in the horizontal direction into a matching column for matching (no change).
  • the unreacted standard substrate (S) and the metabolites (Smet(7) of the standard substrate produced by metabolism are also classified in the same manner.
  • These collation fields are divided vertically according to the combination of presence/absence of enzyme-inducing activity and presence/absence of enzyme-inhibiting activity.
  • the comparison table includes a collation column for one metabolite (Amet, Bmet%) for each compound (A, B%) to be analyzed.
  • the metabolite (Amet, Bmet%) collation column can be used to collate quantitative changes in the primary metabolites, or the total of all metabolites after the primary metabolites can be used depending on the purpose of analysis. It can also be used to check the quantitative variation of Also, a plurality of collation columns can be provided for each metabolite after the primary metabolite. Also, for the unreacted standard substrate (S) and the metabolites (Smet%) of the standard substrate generated by metabolism, collation columns can be similarly provided for each metabolite.
  • Combinations of presence/absence of enzyme-inducing activity and presence/absence of enzyme-inhibiting activity are each compound to be analyzed (A, B . . . ), standard substrate (S), metabolites of each compound (Amet, Bmet .
  • Each check column is classified in advance according to whether the quantitative variation of each component corresponds to an increase ( ⁇ ), decrease ( ⁇ ), or no change (-). No change (-) can be set as an arbitrary state in which there is no significant difference in increase or decrease depending on the dosage of each component, the amount of cells in each test plot, and the like.
  • step S20 for determining induction and inhibition when evaluating interactions in the process of drug metabolism, the measurement results of quantitative fluctuations due to interactions obtained in step S10 are stored in advance as in the comparison table shown in FIG. Match against categorized patterns.
  • Quantitative change (increase/decrease/no change) of certain compounds (A, B%) and their metabolites (Amet, Bmet%) among the two or more compounds to be analyzed is It is caused by the enzyme-inducing activity or enzyme-inhibiting activity of the compound used in combination with the compound. Enzyme-inducing activity and enzyme-inhibiting activity by the compound itself are offset or superimposed upon comparison. Therefore, the enzyme-inducing activity or enzyme-inhibiting activity of the compound itself can be evaluated according to the quantitative results of the compound used in combination.
  • step S10 when compound A has enzyme-inducing activity and compound B does not have enzyme-inducing activity, compound B decreases ( ⁇ ) and metabolite Bmet of compound B increases ( ⁇ ), compound A unchanged (-), and compound A metabolite Amet unchanged (-).
  • compound A has induction activity and compound B has no induction activity.
  • the standard substrate (S) and its metabolites (Smet%) are similarly classified and judged, and the activity of the compounds (A, B%) administered together with the standard substrate (S) is evaluated. can be evaluated.
  • the quantitative change of the compound other than the determination target compound used in combination with a determination target compound is compared with the quantitative results of single administration.
  • the quantitative results increase that is, the unreacted compounds (A, B%) used in combination decrease ( ⁇ ), and the metabolites (Amet, Bmet%) of the compounds used in combination increase. ( ⁇ )
  • the compound to be determined has an enzyme-inducing activity.
  • S unreacted standard substrate
  • the quantitative change of the compound other than the determination target compound used in combination with a determination target compound is compared with the quantitative results of single administration.
  • the quantitative results are decreasing, that is, the combined unreacted compounds (A, B%) increase ( ⁇ ) and the metabolites of the combined compounds (Amet, Bmet%) decrease. ( ⁇ ), it can be determined that the compound to be determined has enzyme inhibitory activity.
  • S unreacted standard substrate
  • the quantitative change of the compound other than the determination target compound used in combination with a determination target compound is compared with the quantitative results of single administration.
  • the unreacted compounds (A, B%) used in combination are unchanged (-)
  • the metabolites of the compounds used in combination (Amet, Bmet%) is unchanged (-)
  • it can be determined that the compound to be determined has no enzyme-inducing activity or enzyme-inhibiting activity.
  • Quantitative fluctuations in the unreacted standard substrate (S) and quantitative fluctuations in the metabolites (Smet%) of the standard substrate increase according to the combination of the enzymatic activities of two or more compounds to be analyzed. ( ⁇ ), decrease ( ⁇ ), or no change (-).
  • the magnitude of the quantitative variation of the standard substrate (S) and the magnitude of the quantitative variation of the metabolites (Smet%) of the standard substrate can be determined by the compounds administered together with the standard substrate (S). Depending on the combination of activities of (A, B%), they are canceled or superimposed.
  • the standard substrate (S) and its metabolites (Smet%) have smaller quantitative fluctuations, but quantitative fluctuations occur in test area N. .
  • the breakdown of such interactions as a whole can be determined, and the presence or absence of enzyme-inducing activity and the presence or absence of enzyme-inhibiting activity can be combined. can be determined for each of the two or more compounds to be determined. Even when induction and inhibition are combined by two or more compounds, it is possible to determine the breakdown of activity for each compound.
  • enzyme-inducing activity and enzyme-inhibiting activity it is possible to quantify each component contained in each excretion route-specific fraction (F2). can be performed in the same test system.
  • the components whose amounts are compared with each other include unreacted compounds (A, B, . ), metabolites of standard substrates (Smet). Intermediate metabolite amounts may be compared when evaluating interactions on stepwise metabolic reactions. In addition to metabolites from major metabolic enzymes, the amount of metabolites from off-target enzymes may also be compared.
  • the amount of components collected and quantified in test section 3 is (1) passive transport It corresponds to the amount of the component in the excretion into the blood by
  • the difference between the amount of the component recovered and quantified in Test Area 2 and the amount of the component recovered and quantified in Test Area 3 corresponds to (2) the amount of the component in the amount excreted into the blood via the transporter.
  • the difference between the amount of the component recovered and quantified in Test Group 1 and the amount of the component recovered and quantified in Test Group 2 corresponds to (3) the amount of the component in bile excretion via the bile canaliculi.
  • the amount of components to be recovered and quantified in Test Section 2 is the sum of (1) excretion into blood due to passive transport and (2) excretion into blood via transporters, that is, passive transport and It corresponds to the amount of components in total blood excretion via transporters.
  • the amounts of the components collected and quantified in test group 1 are (1) the amount excreted into the blood by passive transport, (2) the amount excreted into the blood via the transporter, and (3) the bile via the bile canaliculi. It corresponds to the total excretion, ie the amount of components in the extracellular excretion via passive transport, transporters and bile canaliculi.
  • the measurement results of the quantitative fluctuation due to the interaction in the process of excretion are the components of each of these excretion pathways, namely (1) excretion into the blood by passive transport, (2) Of the excreted portion, (3) biliary excreted portion through the bile canaliculus, total blood excreted portion ((1) + (2)), and extracellular excreted portion ((1) + (2) + (3)), It may be derived based on any one type of quantification result, or may be derived based on a plurality of types of quantification results.
  • the tendency of excretion-inducing activity and excretion-inhibiting activity can be evaluated.
  • evaluation is performed by obtaining measurement results for the total blood excretion ((1)+(2))
  • the tendency of excretion-inducing activity or excretion-inhibiting activity can be evaluated based only on the kinetics of blood excretion.
  • the measurement results for extracellular excretion ((1) + (2) + (3)) are obtained and evaluated, the influence of the kinetics of each excretion route will be eliminated, and the metabolism of the drug will be affected.
  • the trend of excretion-inducing activity or excretion-inhibiting activity can be evaluated based solely on the kinetics of the process.
  • the quantification results for each test plot may be calibrated in advance. Quantitative results for each test group may have differences in drug uptake and excretion, sample errors, etc., depending on the amount of hepatocytes. By calibrating against the total amount of standard substrate, quantitative results can be accurately compared quantitatively.
  • the amount of components in the intracellular residual fraction (F3) collected and quantified in step S6 is the amount of components taken up by the cells and the extracellular excretion ((1) + (2) + (3)). corresponds to the difference between the amount of the component in Quantifying the amount of components in the intracellular residual fraction (F3) and in the extracellular fraction ((1)+(2)+(3)) yields a standard substrate (S) taken up by the cells. and the amount of its metabolites (Smet%) can be obtained.
  • Quantitative fluctuations due to interactions in the process of drug excretion are measured.
  • the quantitative fluctuations of each component based on the excretion activity when two or more compounds are administered in combination compared to when each compound is administered alone are scored. , can be obtained as data represented by a graph or the like. Such data is obtained for each compound (A, B, .
  • FIG. 5 and 6 are diagrams showing examples of graphs representing the amount of each component for each excretion route.
  • Fig. 5 shows the measurement result of the total amount of drug intake (F1 + F2 + F3) obtained in pattern 1", and shows the distribution ratio of a predetermined component for each excretion route.
  • Fig. 6 shows excretion in "pattern 2". This is a case where the measurement result of the total amount (F2 + F3) of the target compound for distribution evaluation is obtained, and shows the distribution ratio for each excretion route of a predetermined component.
  • the measurement result of the quantitative fluctuation due to the interaction in the process of excretion of the drug is , can be evaluated by data showing such distribution ratios.
  • the graphs on the left side show the distribution ratio for each excretion route when one compound (compound A) among the two or more compounds to be analyzed is administered alone.
  • the graph on the right shows the distribution ratio for each excretion route when all compounds (compound A, compound B) among the two or more compounds to be analyzed are administered in combination.
  • the distribution ratio can be calculated as the ratio (%) of the amount of each component for each excretion route to the total amount of drug uptake (F1+F2+F3) and the total amount of target compound for excretion distribution evaluation (F2+F3) as 100%. can.
  • the vascular side excretion fraction (Extracellular Efflux by Diffusion, ExEfx-Dif) corresponds to (1) the fraction containing excretion into the blood by passive transport.
  • the vascular side excreted fraction (Extracellular Efflux by Transporter, ExEfx-TP) corresponds to (2) the fraction containing transporter-mediated excretion into the blood.
  • the ductal excretion fraction (Bile Canaliculi Efflux, BCEfx) corresponds to (3) the fraction containing biliary excretion via the bile canaliculi.
  • the intracellular residual fraction (Cell) corresponds to (4) the fraction containing the intracellular residual fraction.
  • the vascular side efflux fraction (Sup) corresponds to the fraction collected in step S4.
  • step S20 of determining induction and inhibition when evaluating the interaction in the process of drug excretion, the measurement results of the quantitative fluctuation due to the interaction obtained in step S10 are shown in the graphs of FIGS. can be visualized as 5 and 6 show graphs of the distribution ratio of compound A, which can be visualized for each compound to be analyzed, standard substrates, and metabolites thereof.
  • a certain compound (A, B%) and its metabolites (Amet, Bmet%) quantitative changes for each excretion route are analyzed in combination with the compound. It is caused by the excretion-inducing activity or excretion-inhibiting activity of the compound.
  • the excretion-inducing activity and excretion-inhibiting activity of the compound itself are offset or superimposed upon comparison. Therefore, the excretion-inducing activity or excretion-inhibiting activity of the compound itself can be evaluated according to the quantitative results of the compound used in combination.
  • the distribution ratio to ExEfx-Dif was increased in the co-administered quantitation results compared to the single administration quantitation results, indicating that ExEfx-TP, BCEfx and Cell
  • the ratio of distribution to is decreased in the quantitative result of co-administration compared to the quantitative result of single administration, (1) excretion into the blood by passive transport is induced, or (2) It can be determined that any one of (3) excretion into blood via transporters, (3) excretion into bile via canaliculi, and (4) persistence in cells is inhibited.
  • the vascular side collected in step S4 when the distribution ratio to Sup is unchanged in the quantitative results of combined administration compared to the quantitative results of single administration, the vascular side collected in step S4
  • the components contained in the excretion fraction (F1) and the components contained in the test plot 2 of the excretion route-specific fraction (F2) collected in step S5 are quantitatively equivalent to each other, and the components accumulate in the cells. It can be determined that readiness is unaffected by interactions.
  • the ratio is increased in the quantitative results of co-administrations compared to the quantitative results of single administrations, i.e., the partition ratio of the unreacted compounds (A, B .
  • the distribution ratio of the metabolites (Amet, Bmet, etc.) of the compound to be determined increases, the compound to be determined has an excretion-inducing activity on the excretion route, or the compound to be determined is excreted through a route other than the excretion route. It can be determined to have excretion inhibitory activity for the pathway.
  • the ratio is decreased in the quantitative results of co-administrations compared to the quantitative results of single administrations, i.e., the distribution ratio of unreacted compounds (A, B,
  • the distribution ratio of the metabolites (Amet, Bmet, ...) of the compound to be determined decreases, the compound to be determined has an excretion inhibitory activity on the excretion route, or the compound to be determined is excreted through a route other than the excretion route It can be determined to have excretion-inducing activity for the pathway.
  • the overall picture of the drug interaction is obtained by combining the drug metabolism process and the drug excretion process. can be grasped from a bird's-eye view.
  • the conventional enzyme induction test and enzyme inhibition test are separately conducted, the enzyme induction activity and the enzyme inhibition activity can be evaluated integrally in the same test.
  • a quantitative test on the process of drug metabolism and a quantitative test on the process of drug excretion can be performed simultaneously in the same cell. can be done. Therefore, it is possible to obtain an evaluation that reflects the actual interactions between drugs.
  • the drug interaction analysis method described above is performed by an automatic analyzer that performs an in vitro quantitative test using cultured hepatocytes manually, or an in vitro quantitative test using cultured hepatocytes semi-automatically. be able to.
  • the automated analyzer consists of, for example, a sample pretreatment/recovery unit equipped with an autosampler/dispensing mechanism for sampling the supernatant of cultured hepatocytes for each test section, and quantitative analysis such as spectroscopic analysis and mass spectrometry.
  • An analysis unit for quantifying each component a sample preparation unit for preparing a test solution such as a buffer solution for each test zone, a data analysis unit for determining the interaction by deriving the measurement results of quantitative fluctuations, and and a display unit for displaying the result of determination of the action.
  • automated analyzers include a mechanism that transports microplates with multiple wells arranged, a sampler that collects the supernatant from the wells of the microplates, and a microplate
  • a mechanism for supplying a test solution such as a buffer solution into the wells of the microplate and a temperature control mechanism for controlling the temperature inside the wells of the microplate can be provided.
  • the temperature control mechanism is preferably temperature controllable between around 37° C. for testing the disintegration system and around 4° C. for testing the maintenance system.
  • it may be in the form of a reaction disk, such as a discrete system employed in automatic clinical examination equipment.
  • the quantification part quantifies the components contained in the supernatant on the cultured hepatocytes for each test plot.
  • the data analysis unit acquires the data of the quantitative results for each test section from the quantitative unit, and calculates the quantitative fluctuations of each compound and the standard substrate due to interactions in cells.
  • the quantitative variation of each compound is calculated by calibrating the quantitative results for each test group based on the quantitative variation of the standard substrate.
  • Calculation of quantitative changes in compounds due to interactions in cells is performed by dividing the quantitative results of test group M, in which two or more compounds to be analyzed are administered in combination, into one of the two or more compounds to be analyzed. by comparing with the quantification results of Test Group N, in which the compound was administered alone.
  • the data of the quantitative results of the test group N may be stored in advance in the storage unit of the automatic analyzer, or may be quantitatively tested simultaneously with the test group M and stored.
  • the data analysis unit performs comparison and determination using an algorithm corresponding to the comparison table shown in FIG.
  • Determination of interaction can be performed for only metabolic evaluation, or for both metabolic evaluation and excretion evaluation, according to the user's instructions.
  • the metabolic evaluation the presence or absence of enzyme-inducing activity due to interaction, the presence or absence of enzyme-inhibiting activity, and the breakdown of interactions that combine induction and inhibition are determined.
  • the excretion evaluation the distribution ratio and the like for each excretion route are calculated, and the tendency of the kinetics for each excretion route evaluated in the same test system as the metabolic evaluation is evaluated.
  • the display unit displays the result of matching with respect to the matching column of the comparison table as shown in FIG. It can be displayed for each (A, B, . . . ) or for each of its metabolites (Amet, Bmet, . . . ). In addition, for each compound (A, B, . and so on.
  • a table showing distribution ratios for each excretion route, excretion-inducing activities for each excretion route, and A notation indicating the possibility of excretion inhibitory activity can be displayed.
  • the notation indicating the possibility of excretion-inducing activity or excretion-inhibiting activity can be displayed for each compound (A, B, . . . ) or its metabolites (Amet, Bmet, .
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications are possible without departing from the scope of the present invention.
  • the present invention is not necessarily limited to having all the configurations included in the above embodiments. Replacing part of the configuration of one embodiment with another configuration, adding part of the configuration of one embodiment to another form, or omitting part of the configuration of one embodiment can be done.

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Abstract

本発明は、２種以上の薬剤を相互作用させた計測結果に基づいて、２種以上の薬剤を併用する場合の相互作用を俯瞰的に評価することができる薬剤相互作用解析方法を提供するものである。薬剤相互作用解析方法は、代謝酵素を産生する細胞に、併用される２種以上の化合物と、代謝酵素によって代謝される標準基質と、を投与して、細胞における相互作用による化合物の量的変動、および、細胞における相互作用による標準基質の量的変動を計測するステップと、量的変動の計測結果に基づいて、２種以上の化合物を併用する場合に生じる代謝酵素の酵素誘導活性の有無、および、代謝酵素の酵素阻害活性の有無を判定するステップと、を含む。

Description

薬剤相互作用解析方法
　本発明は、２種以上の薬剤を併用する場合の相互作用を解析する薬剤相互作用解析方法に関する。
　創薬等の分野では、２種以上の薬物を併用する場合の薬物相互作用の評価が行われている。２種以上の薬物を投与すると、薬効の減弱、薬効の増強、副作用等が生じることがある。このような薬物相互作用を予測するために、非臨床試験段階で評価試験が行われている。薬物相互作用の評価結果に応じて、臨床試験の必要性が判断されているため、薬物相互作用を早期且つ高精度に予測することが重要になっている。
　薬物相互作用は、薬力学的作用と薬物動態学的作用によって生じる。薬力学的作用は、薬物とレセプタ等との相互作用や、反応速度、濃度等の関係で薬理的に生じる。薬物動態学的作用は、薬物の吸収の過程、分布の過程、代謝の過程、および、排泄の過程が、薬物同士で影響し合って生じる。薬物は、主に、肝細胞内の代謝酵素によって代謝されている。肝細胞内で代謝された薬物は、血中や胆汁中に排泄されている。
　２種以上の薬物を併用するとき、いずれかの薬物によって代謝酵素が誘導されると、併用される薬物の代謝が促進される場合がある。また、いずれかの薬物によって代謝酵素が阻害されると、併用される薬物の代謝が抑制される場合がある。薬物相互作用の評価では、このような代謝酵素に対する酵素誘導や酵素阻害の程度が、in vitroやin vivoで定量的に試験されている。定量試験では、例えば標準物質が評価対象化合物と共に投与されている。標準物質を定量することによって、評価対象化合物の酵素誘導あるいは酵素阻害が個別に評価されている。
　特許文献１には、１以上の化合物、化合物の組合せ、または、化合物の混合物によって誘起される予期せぬ若しくは意外な作用を発見することを可能にするハイスループットスクリーニングの方法が記載されている。この方法では、１以上の同位体標識した基質を細胞、組織または生物に投与して、目的とする１以上の経路における分子流速を算出している。スクリーニングに際しては、化合物が投与された生物系における分子流速と、化合物が投与されていない生物系における分子流速とを、互いに比較している。
　特許文献２には、医薬候補物質が、薬物代謝酵素の活性を促進または阻害するか否かを判定する方法が記載されている。この方法では、高置換キメラマウスに医薬候補物質と複数の指標化合物を投与し、血清中の指標化合物の濃度を経時的に測定している。判定に際しては、医薬候補物質を投与した時の血清中の指標化合物の濃度と、医薬候補物質を投与していない時の血清中の指標化合物の濃度とを、互いに比較している。
　また、薬物の排泄の過程を、肝細胞を用いたin vitroの評価系で予測する技術が開発されている。特許文献３には、肝細胞のトランスポータを介して排出される成分の量と、肝細胞の毛細胆管を介して排出される成分の量と、肝細胞のトランスポータ及び毛細胆管以外から排出される成分の量とを解析する成分分析方法が記載されている。
特表２００７－５２２４３７号公報 国際公開第２００６／０５４７５５号 特許第６０８７２６４号公報
　従来、薬物相互作用の評価は、非臨床試験段階における限定的な条件下で行われている。例えば、１種の薬物を投与するin vitroの評価試験が、ヒト培養肝細胞や、肝ミクロソームを用いて行われている。２種以上の薬物を併用する場合の薬物相互作用は、このような１種を単独投与した評価試験の各試験結果を踏まえて考察することによって経験的に予測されている。或いは、２種以上の薬物を併用投与するin vivoの評価試験が、マウス、ラット等を用いた動物実験によって行われている。
　従来の薬物相互作用の評価試験は、ヒトにおける体内動態を正確に評価できない点に課題がある。１種の薬物を単独投与した試験結果を組み合わせる方法では、実際の相互作用が反映されないため、評価の精度が低くなる場合が想定される。また、動物実験による方法では、種差がある場合に、薬物相互作用の評価の精度が低くなる。動物とヒトとでは、相関性が低い場合も確認されており、臨床試験段階に移行したとき、副作用等の悪影響を生じることが懸念される。
　また、特許文献１に記載された技術は、１以上の化合物が投与された生物系における諸反応の結果と、１以上の化合物が投与されていない生物系における諸反応の結果とを、互いに比較するものである。諸反応の結果は、分子流速として測定されている。分子流速は、代謝経路の分子に組み込まれた同位体標識の量や、パターンや、これらの変化速度として求められている。この技術は、分子流速同士を比較するものであり、生物系に暴露した化合物同士の挙動を解析するものではないため、化合物自体の薬物動態の過程を評価するのに適していない。
　また、特許文献２に記載された技術は、医薬候補物質を投与した時の血清中の指標化合物の濃度と、医薬候補物質を投与していない時の血清中の指標化合物の濃度とを、互いに比較するものである。この技術は、キメラマウスを用いたin vivoの評価試験を行うものであり、in vitro試験に関する発明ではないとともに、評価対象化合物の併用投与およびその相互作用や量的変動を解析しているものではない。
　薬物相互作用の評価の分野では、種差の影響を受け難く、且つ、細胞内動態を安定に評価できる点で、ヒト由来細胞を用いたin vitroの評価試験を利用する相互作用解析方法も望まれている。しかし、従来のin vitroの評価試験は、特定の評価項目に特化した評価を行うものに限られている。現在のところ、２種以上の薬物を併用投与した場合について、実際の相互作用を俯瞰的に評価可能な方法は知られていない。
　また、従来のin vitroの評価試験は、酵素誘導活性と、酵素阻害活性とを、個別に試験するものに限られている。酵素誘導試験および酵素阻害試験のいずれについても、代謝酵素によって生成された標準基質由来の代謝物の増減を定量評価している。代謝物の評価試験では、薬物の代謝の過程については評価できるが、薬物の排泄の過程については別の試験が必要になるという課題もある。
　このように薬物相互作用の評価の分野において、２種以上の薬剤を併用する場合の薬剤相互作用を、創薬の初期段階で高精度に評価可能であり、薬剤の代謝と排泄を含めた消失の過程の全体を俯瞰的に評価可能な解析方法が求められている。特許文献３に記載された技術は、薬物の排泄の過程の評価に特化している。そのため、細胞への取り込み時以降の一連の薬物動態を評価することができる新規の解析方法が望まれている。
　そこで、本発明は、２種以上の薬剤を相互作用させた計測結果に基づいて、２種以上の薬剤を併用する場合の相互作用を俯瞰的に評価することができる薬剤相互作用解析方法を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するために本発明に係る薬剤相互作用解析方法は、２種以上の薬剤を併用する場合の相互作用を解析する薬剤相互作用解析方法であって、代謝酵素を産生する細胞に、併用される２種以上の化合物と、前記代謝酵素によって代謝される標準基質と、を投与して、前記細胞における相互作用による前記化合物の量的変動、および、前記細胞における相互作用による前記標準基質の量的変動を計測するステップと、前記量的変動の計測結果に基づいて、２種以上の前記化合物を併用する場合に生じる前記代謝酵素の酵素誘導活性の有無、および、前記代謝酵素の酵素阻害活性の有無を判定するステップと、を含む。
　本発明に係る薬剤相互作用解析方法によると、２種以上の薬剤を相互作用させた計測結果に基づいて、２種以上の薬剤を併用する場合の相互作用を俯瞰的に評価することができる。
本発明の実施形態に係る薬剤相互作用解析方法を示すフロー図である。 相互作用による量的変動を計測するステップを示す図である。 排泄経路別画分回収・定量工程を示す図である。 相互作用の判定に用いるパターンを表した対照表の一例を示す図である。 排泄経路毎の各成分量を表すグラフの一例を示す図である。 排泄経路毎の各成分量を表すグラフの一例を示す図である。
　以下、本発明の一実施形態に係る薬剤相互作用解析方法について、図を参照しながら説明する。なお、以下の各図において共通する構成については同一の符号を付し、重複した説明を省略する。
　本実施形態に係る薬剤相互作用解析方法は、２種以上の薬剤を併用する場合の相互作用を解析する方法に関する。２種以上の化合物がヒト等に同時期に投与された場合、薬剤の代謝の過程や、薬剤の排泄の過程で、相互作用を生じることがある。この解析方法では、２種以上の化合物が併用された場合の相互作用から、個々の化合物の作用を判別して、相互作用の全体像の俯瞰的な把握を可能にする。
　解析対象の化合物としては、薬剤を構成する化合物、薬剤の候補である化合物、薬剤の中間代謝物である化合物等が挙げられる。解析対象の化合物としては、２種以上である限り、任意の種類数を解析することができる。解析対象の化合物は、相互作用が未知の化合物を含む限り、相互作用が既知の化合物を含んでもよい。
　薬剤の代謝の過程で生じる相互作用としては、薬剤を代謝する代謝酵素に対する酵素誘導活性や酵素阻害活性が挙げられる。２種以上の化合物が投与された場合、いずれかの化合物が酵素誘導活性を示すと、代謝酵素が誘導されて、併用される化合物の代謝が促進されることがある。また、いずれかの化合物が酵素阻害活性を示すと、代謝酵素が阻害されて、併用される化合物の代謝が抑制されることがある。
　薬剤の排泄の過程で生じる相互作用としては、薬剤を代謝する細胞からの排泄誘導活性や排泄阻害活性が挙げられる。２種以上の化合物が投与された場合、いずれかの化合物が排泄誘導活性を示すと、細胞からの排泄が誘導されて、併用される化合物の排泄が促進されることがある。また、いずれかの化合物が排泄阻害活性を示すと、細胞からの排泄が阻害されて、併用される化合物の排泄が抑制されることがある。
　本実施形態に係る薬剤相互作用解析方法では、薬剤の代謝の過程の評価として、２種以上の化合物が投与された場合に、個々の化合物が、酵素誘導活性を示すか否か、酵素阻害活性を示すか否かを判別する。２種以上の化合物によって酵素誘導と酵素阻害が複合する場合には、化合物毎の酵素誘導活性や酵素阻害活性の内訳を判別することができる。
　本実施形態に係る薬剤相互作用解析方法では、薬剤の代謝の過程の評価を、所定の排泄経路を通じて細胞から排泄される成分の定量結果に基づいて行うことができる。そのため、酵素誘導活性や酵素阻害活性の評価としては、排泄誘導活性や排泄阻害活性が反映されており、薬剤の排泄の過程の動態が織り込まれた評価を、同一の試験系において得ることができる。
　また、本実施形態に係る薬剤相互作用解析方法では、酵素誘導活性や酵素阻害活性の評価と共に、排泄誘導活性や排泄阻害活性の傾向を解析することができる。２種以上の化合物が投与された場合に、個々の化合物が、排泄誘導を受けるかどうかや、排泄阻害を受けるかどうかを評価することができる。排泄誘導活性や排泄阻害活性の傾向は、排泄経路毎の傾向として求めることができる。
　化合物毎の酵素誘導活性や酵素阻害活性は、細胞における相互作用による化合物の量的変動に基づいて判別される。相互作用による化合物の量的変動は、解析用の細胞を用いたin vitroの定量試験によって計測される。量的変動は、個々の化合物が単独投与された定量結果に対する２種以上の化合物が併用投与された定量結果の量的な変動を意味する。量的変動は、増加・減少・無変化のいずれかに分類される。
　細胞における相互作用による化合物の量的変動は、当該化合物と併用された化合物が示す酵素誘導活性・酵素阻害活性や、さらには排泄誘導活性・排泄阻害活性によっても生じる。そのため、化合物毎の量的変動を計測して、量的変動のパターンを化合物同士で比較すると、２種以上の化合物を併用する場合に生じる誘導の有無や、阻害の有無や、誘導と阻害が複合した相互作用の内訳を判別することができる。
　解析用の細胞としては、薬剤を代謝する代謝酵素を産生する細胞であって、例えば、シトクロムＰ４５０等の第１相の代謝酵素を産生する肝細胞を用いる。代謝酵素としては、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４等が挙げられる。解析用の細胞は、ヒト由来であってもよいし、マウス、ラット等の動物由来であってもよい。但し、種差の影響を避ける観点からは、ヒト由来であることが好ましい。
　肝細胞としては、二次元培養された培養肝細胞や、肝細胞が三次元培養されたスフェロイドや、肝細胞を含む細胞群が三次元培養された肝オルガノイドを用いることができる。肝細胞間の接着領域に毛細胆管様の構造が形成される培養法が対象となる。このような培養肝細胞を用いると、薬剤の代謝や排泄の過程についての主要な動態を、同一の試験系において正確に評価することができる。また、培養肝細胞は、細胞間接着によって毛細胆管に相当する細胞外区画を生じる。そのため、細胞間接着の維持と崩壊を制御することによって、細胞間の毛細胆管に相当する区画を開閉できる。
　二次元培養された培養肝細胞は、肝細胞を細胞外マトリクス上で培養することによって得ることができる。二次元培養の方法としては、細胞外マトリクスを重層して肝細胞を挟んだ状態で培養するサンドイッチ培養が好ましい。スフェロイドは、肝細胞を細胞外マトリクス上、基材上若しくは浮遊状態で培養することによって得ることができる。肝オルガノイドは、肝細胞、血管内皮細胞、間葉系細胞等の細胞群を、細胞外マトリクス上若しくは基材上で共培養することによって得ることができる。基材としては、コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン等を結合させたプレート、マイクロウェル、マイクロチャネル、ゲルシート等を用いることができる。
　図１は、本発明の実施形態に係る薬剤相互作用解析方法を示すフロー図である。
　図１に示すように、本実施形態に係る薬剤相互作用解析方法は、解析対象の化合物および標準基質について２種以上の化合物を併用する場合の相互作用による量的変動を計測するステップＳ１０と、量的変動の計測結果に基づいて代謝酵素や薬剤排泄の誘導および阻害を判定するステップＳ２０と、を含む。
　相互作用による量的変動を計測するステップＳ１０は、細胞培養・化合物投与工程Ｓ１と、細胞馴化工程Ｓ２と、標準基質投与工程Ｓ３と、血管側排出画分回収・定量工程Ｓ４と、排泄経路別画分回収・定量工程Ｓ５と、細胞内残留画分回収・定量工程Ｓ６と、定量結果比較工程Ｓ７とを、この順に含む。
　相互作用による量的変動を計測するステップＳ１０では、薬剤相互作用の解析に用いる解析用の細胞を調製し、代謝酵素を産生する解析用の細胞に対して、互いに併用される解析対象である２種以上の化合物と、代謝酵素によって代謝される標準基質と、を投与する。そして、２種以上の化合物が併用された場合について、細胞における相互作用による化合物の量的変動、および、細胞における相互作用による標準基質の量的変動を計測する。併せて、各化合物や標準基質の代謝物についても量的変動を計測する。
　誘導および阻害を判定するステップＳ２０では、解析対象である各化合物やその代謝物の量的変動の計測結果、および、標準基質やその代謝物の量的変動の計測結果に基づいて、解析対象である２種以上の化合物を併用する場合に生じる代謝酵素の酵素誘導活性の有無、および、代謝酵素の酵素阻害活性の有無を判定する。また、これらの判定と共に、排泄誘導活性や排泄阻害活性の傾向を評価することができる。
　図２は、相互作用による量的変動を計測するステップを示す図である。
　図２に示すように、相互作用による量的変動を計測するステップＳ１０では、投与する化合物を変えた複数の試験区を設けて、試験区毎に定量試験を行う。定量試験では、解析用の細胞を培養し、解析対象である化合物と標準基質とを投与し、これらを代謝させた後に、細胞外に排泄された親化合物および代謝物、並びに、細胞内に残留する親化合物および代謝物を定量する。なお、ステップＳ１０における各工程（Ｓ１～Ｓ７）の詳細は後記する。
　複数の試験区は、同時に試験してもよいし、順に試験してもよい。試験区毎の各化合物の定量は、例えば、化合物が同位体標識されている場合は液体シンチレーションカウンター、化合物が蛍光を有する場合は分光分析、無標識あるいは化合物が蛍光を有しない場合は質量分析によって行うことができる。分光分析によって定量する場合には、マイクロプレート等を試験区毎に区分けして、プレートリーダ等を用いて同時に計測することができる。
　試験区としては、解析対象である２種以上の化合物を併用投与して定量試験を行う試験区Ｍと、解析対象である２種以上の化合物のうちの１種の化合物を単独投与して定量試験を行う試験区Ｎとを設ける。例えば、化合物Ａと化合物Ｂの２種の相互作用を解析する場合、化合物Ａと化合物Ｂを併用投与する試験区Ｍと、化合物Ａを単独投与する試験区Ｎ－Ａと、化合物Ｂを単独投与する試験区Ｎ－Ｂとを設けることができる。なお、各試験区（Ｍ、Ｎ－Ａ、Ｎ－Ｂ）の詳細は後記する。
　試験区Ｍでは、解析対象である２種以上の化合物のうちの全種の化合物と、標準基質とを、解析用の細胞に投与し、解析用の細胞を培養して代謝させた後に、解析用の細胞外に排泄された各化合物や標準基質の親化合物および代謝物や、解析用の細胞内に残留する各化合物や標準基質の親化合物および代謝物を定量する。このような定量試験によって、量的変動の導出に用いる２種以上の化合物が併用投与された場合の定量結果を取得する。
　また、試験区Ｎでは、解析対象である２種以上の化合物のうちの１種の化合物と、標準基質とを、解析用の細胞に投与し、解析用の細胞を培養して代謝させた後に、解析用の細胞外に排泄された化合物や標準基質の親化合物および代謝物や、解析用の細胞内に残留する化合物や標準基質の親化合物および代謝物を定量する。このような定量試験によって、量的変動の導出に用いる個々の化合物が単独投与された場合の定量結果を取得する。
　試験区Ｎの定量試験は、解析対象である２種以上の化合物のうちの１種の化合物毎に、評価が必要な複数の化合物について行う。なお、個々の化合物が単独投与された場合の定量結果は、試験区Ｎの定量試験を実際に行わなくとも、化合物を単独投与する従来のin vitroの評価試験や、理論計算によって求めることができる場合がある。このような結果が利用できる場合は、試験区Ｍについての定量試験のみを行い、試験区Ｎについての定量試験を省略してもよい。
　標準基質としては、解析用の細胞が産生する代謝酵素によって代謝されることが既知の化合物を用いる。標準基質は、内部標準としても機能させることができる。標準基質を解析対象である化合物と共に投与すると、細胞への吸収性が化合物毎に異なる場合や、試験区毎の細胞量が互いに異なる場合であっても、試験区毎の定量結果を校正できる。
　定量結果同士の校正は、投与した標準基質の全量、すなわち、標準基質の親化合物および代謝物の合計量を基準として行う。校正を行う場合、解析用の細胞内に残留する標準基質の親化合物および代謝物と、細胞外に排泄された標準基質の親化合物および代謝物を定量し、これらの合計量を計算する。これらの合計量に対する各化合物の量の相対値を利用すると、試験区毎の定量結果を比較できる。
　標準基質としては、解析用の細胞が産生する代謝酵素によって代謝される限り、定量方法や、解析する代謝酵素の種類に応じて、適宜の基質を用いることができる。例えば、分光分析を用いる場合、代謝酵素の作用で蛍光標識等を解離する基質を用いることができる。質量分析を用いる場合、代謝酵素の作用で質量が変化する解析対象と構造が類似した基質や、代謝酵素の作用で質量が変化するイオン化し易い基質を用いることができる。
　標準基質の具体例としては、フェナセチン（Phenacetin）、ブプロピオン（Bupropion）、パクリタキセル（Paclitaxel）、ジクロフェナク（Diclofenac）、Ｓ－メフェニトイン（S-mephenytoin）、ブフラロール（Bufuralol）、ミダゾラム（Midazolam）、テストステロン（Testosterone）等が挙げられる。これらの物質は、肝細胞に吸収された後、シトクロムＰ４５０等の第１相の代謝酵素によって代謝されるため、定量結果同士を比較する基準として用いることができる。
　定量試験では、解析対象である各化合物の中間代謝物と最終代謝物や、標準基質の中間代謝物と最終代謝物が存在する場合は、これらについても定量することができる。薬剤の代謝の過程には、複数の代謝酵素が段階的に関与している場合がある。中間代謝物を定量して量的変動を比較すると、中間段階の酵素活性を評価できる。
　例えば、図２に示すように、化合物Ａと化合物Ｂの２種の相互作用を解析する場合であって、化合物ＡがＸ次代謝物Ａｍｅｔ（Ｘ）まで代謝され、化合物ＢがＹ次代謝物Ｂｍｅｔ（Ｙ）まで代謝され、標準基質Ｓが最終代謝物Ｓｍｅｔに代謝される場合、定量試験では、化合物Ａ、Ａｍｅｔ（１）、Ａｍｅｔ（２）・・・、Ａｍｅｔ（Ｘ）や、化合物Ｂ、Ｂｍｅｔ（１）、Ｂｍｅｔ（２）・・・、Ｂｍｅｔ（Ｙ）や、標準基質Ｓ、Ｓｍｅｔを定量することができる。
　また、定量試験では、主要な第１相の代謝酵素による代謝物に加え、標的外の酵素による代謝物についても定量することができる。代謝の過程には、特定のシトクロムＰ４５０等の第１相の代謝酵素の他に、標的外の酵素が関与する場合がある。標的外の酵素による代謝物を定量すると、ＣＹＰ分子種の内外で比較が可能になるため、薬剤の代謝の動態をより詳細に評価できる。
　相互作用による化合物の量的変動は、試験区Ｎにおける化合物の定量結果に対する、試験区Ｍにおける化合物の定量結果の量的な変動であり、試験区Ｍにおける化合物の定量結果と、試験区Ｎにおける化合物の定量結果との比較によって求められる。化合物の量的変動は、当該化合物と併用された化合物による誘導活性や阻害活性によって生じる。当該化合物自体による誘導活性や阻害活性は、当該化合物が両方の試験区に投与されている場合、定量結果同士で相殺されて量的変動に影響しない。そのため、各化合物の量的変動を求めると、当該化合物以外の化合物による相互作用を評価できる。
　また、相互作用による標準基質の量的変動は、試験区Ｎにおける標準基質の定量結果に対する、試験区Ｍにおける標準基質の定量結果の量的な変動であり、試験区Ｍにおける標準基質の定量結果と、試験区Ｎにおける標準基質の定量結果との比較によって求められる。既知量の標準基質を投与すると、解析対象である全ての化合物の誘導活性や阻害活性の複合によって試験系に応じた量的変動を生じる。そのため、標準基質の量的変動を求めると、標準基質を基準として、薬剤の細胞内への取り込み後の定量結果同士を比較可能な状態に校正できる。
　このような相互作用による化合物の量的変動の計測結果、および、相互作用による標準基質の量的変動の計測結果に基づくと、化合物が併用投与された場合と、化合物が単独投与された場合とで、成分毎の量的変動のパターンを互いに比較できる。量的変動のパターンを比較すると、或る化合物に対して併用された化合物の活性や、相殺された活性を判別できる。２種以上の化合物による相互作用を個々の化合物の作用に分解して把握することができるため、２種以上の化合物を併用する場合に生じる酵素誘導活性の有無や、酵素阻害活性の有無や、酵素誘導と酵素阻害が複合した相互作用の内訳を判定することが可能になる。
　図２に示すように、排泄経路別画分回収・定量工程Ｓ５では、薬剤の排泄評価を行う場合、肝細胞の排泄経路毎に試験区を設けて定量試験を行うことができる。試験区Ｍおよび試験区Ｎは、更に、肝細胞の排泄経路毎の試験区１～３に分割して、試験区１～３毎に定量試験を行うことが可能である。試験区１～３は、同時に試験してもよいし、順に試験してもよい。
　図３は、排泄経路別画分回収・定量工程を示す図である。
　図３に示すように、排泄経路別画分回収・定量工程Ｓ５では、肝細胞の排泄経路を変更するために、互いに異なる条件でインキュベーションを行い、各排泄経路に応じた画分を回収して成分を定量することができる。肝細胞の排泄経路は、細胞間接着やトランスポータ活性を制御することによって、試験区１～３毎に変更することができる。
　図３のイメージ図には、肝細胞のサンドイッチ培養時の模式図（肝細胞培養物の断面図）を示す。各試験区１～３では、このような培養肝細胞におけるin vitroの定量試験を行う。イメージ図において、符号１０１は肝細胞培養物、符号１０２はトランスポータ、符号１０３は毛細胆管、符号１０４はベーサル（Basal）面ないしバソラテラル（Basolateral）面、符号１０５はアピカル（Apical）面を示す。
　イメージ図に示すように、単離された肝細胞をマイクロプレート等でサンドイッチ培養すると、肝細胞同士が接着した単層の肝細胞培養物１０１が得られる。トランスポータ１０２は、物質輸送を担う膜タンパク質であり、肝細胞の細胞膜上に発現している。トランスポータ１０２は、薬剤や代謝物等の能動的な輸送に関与している。
　肝細胞同士の接着領域に形成される毛細胆管１０３は、薬剤や代謝物等の胆汁排泄に関与している。培養肝細胞のベーサル面ないしバソラテラル面１０４は、生体内では血管に面していると見做すことができる。培養肝細胞のアピカル面１０５は、生体内では毛細胆管に面していると見做すことができる。
　肝細胞への薬剤の投与は、薬剤を溶解したバッファ液等を肝細胞培養物１０１上に添加することによって行うことができる。投与された薬剤は、吸収性がある場合、ベーサル面ないしバソラテラル面１０４に存在する所定のトランスポータ１０２や細胞膜を介して、肝細胞培養物１０１上の上清から肝細胞内に取り込まれる。薬剤は、肝細胞内で代謝された後に、血中に相当するベーサル面ないしバソラテラル面１０４の側や、胆汁中に相当するアピカル面１０５の側に排泄される。
　肝細胞の排泄経路としては、イメージ図に矢印で示すように、（１）受動輸送による血中への排泄、（２）トランスポータを介した血中への排泄、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄が挙げられる。肝細胞によって取り込まれた薬剤取り込み分のうち、これら（１）～（３）を除いた残部は、（４）細胞内への残留分となる。肝細胞によって取り込まれた薬剤取り込み量＝（１）＋（２）＋（３）＋（４）が成り立つ。
　試験区１は、肝細胞の細胞間接着を３７℃付近の平温で崩壊させる試験区である。試験区１の工程Ｓ５では、（１）受動輸送による血中への排泄分、（２）トランスポータを介した血中への排泄分、および、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分の合計を定量することができる。試験区１の工程Ｓ６では、（４）細胞内への残留分を定量することができる。
　試験区２は、肝細胞の細胞間接着を３７℃付近の平温で維持する試験区である。試験区２の工程Ｓ５では、（１）受動輸送による血中への排泄分、および、（２）トランスポータを介した血中への排泄分の合計を定量することができる。試験区２の工程Ｓ６では、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分、および、（４）細胞内への残留分の合計を定量することができる。
　試験区３は、肝細胞の細胞間接着を４℃付近の低温で維持する試験区である。試験区３の工程Ｓ５では、（１）受動輸送による血中への排泄分を定量することができる。試験区１、２よりも低温に維持すると、（２）トランスポータを介した血中への排泄分を抑制することができる。試験区３の工程Ｓ６では、（２）トランスポータを介した血中への排泄分、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分、および、（４）細胞内への残留分の合計を定量することができる。
　例えば、図２に示すように、化合物Ａと化合物Ｂの２種の相互作用を解析する場合、試験区Ｍを、３７℃崩壊系である試験区Ｍ－１と、３７℃維持系である試験区Ｍ－２と、４℃維持系である試験区Ｍ－３に分割できる。また、試験区Ｎ－Ａを、３７℃崩壊系である試験区Ｎ－Ａ－１と、３７℃維持系である試験区Ｎ－Ａ－２と、４℃維持系である試験区Ｎ－Ａ－３に分割できる。また、試験区Ｎ－Ｂを、３７℃崩壊系である試験区Ｎ－Ｂ－１と、３７℃維持系である試験区Ｎ－Ｂ－２と、４℃維持系である試験区Ｎ－Ｂ－３に分割できる。
　このような試験区１～３を設けると、細胞外に排泄された標準基質の親化合物および代謝物が、いずれの排泄経路を経由して排泄されたかを、薬物の代謝の過程の評価と同一の試験系で判別できる。親化合物および代謝物を、排泄経路毎に定量すると、薬剤の排泄の過程の動態が織り込まれた評価が可能になる。例えば、排泄経路毎の相互作用による量的変動が小さい場合、併用された化合物による排泄誘導活性や排泄阻害活性が小さいと判定できる。一方、排泄経路毎の相互作用による量的変動が大きい場合、併用された化合物による排泄誘導活性や排泄阻害活性が大きいと判定できる。
　次に、相互作用による量的変動を計測するステップＳ１０や、代謝酵素の誘導および阻害を判定するステップＳ２０の詳細について説明する。
＜工程Ｓ１：細胞培養・化合物投与＞
　細胞培養・化合物投与工程Ｓ１では、解析用の細胞に解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）を投与して細胞の培養を行う。解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）は、培養中の肝細胞の上清に添加すると、肝細胞に取り込まれて、代謝酵素の基質である場合、少なくとも一部が代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）に代謝変換される。解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）は、化合物の特性等によっては、例えば、標準基質投与工程Ｓ３で添加しても構わない。あるいは、細胞培養工程Ｓ１から標準基質投与工程Ｓ３にかけての各工程で添加しても構わない。
　肝細胞としては、例えば、ヒトを含む各種動物由来の接着性肝細胞や細胞株を用いることができる。培養には、生存率８５％以上の肝細胞が好ましい。単離された肝細胞は、播種用の培地で所定の播種密度に調製した後に、例えば、コラーゲンゲル、マトリゲル等をコートした２４ウェルプレートのような培養容器等に所定量且つ均一に播種して、５％ＣＯ２、３７℃の条件下等で培養する。そして、数時間以上経過して細胞が容器底面に接着した後に、コラーゲン、ラミニン等の基底膜成分を含む細胞外マトリクスを添加した培地を重層する。重層後の培養は、５％ＣＯ２、３７℃の条件下等で、例えば、４日間程度を行うことでサンドイッチ培養する。
　解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）は、培養に用いる培地や、培養された肝細胞上の培養上清等に添加することができる。解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）は、細胞間接着成分を含む試験用バッファ液等に溶解して添加することができる。解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）の濃度、添加量は、解析の目的に応じて調整することが可能であり、特に限定されるものではない。
　例えば、化合物Ａと化合物Ｂの２種の相互作用を解析する場合、試験区Ｍの培地には、化合物Ａおよび化合物Ｂを溶解した細胞間接着成分を含む試験用バッファ液等を添加することができる。試験区Ｎの培地には、これと同濃度且つ同量の化合物Ａを溶解した細胞間接着成分を含む試験用バッファ液、ないし、これと同濃度且つ同量の化合物Ｂを溶解した細胞間接着成分を含む試験用バッファ液等を添加することができる。
　試験用バッファ液としては、ハンクス液等の細胞機能を維持可能な適宜のバッファ液を用いることができる。細胞間接着成分としては、カドヘリン、インテグリン等の接着分子に結合して細胞同士や細胞－基質間の接着に関与する成分、例えば、カルシウムイオンやマグネシウムイオンのような２価の金属イオン等が挙げられる。
＜工程Ｓ２：細胞馴化＞
　細胞馴化工程Ｓ２では、解析用の細胞を細胞間接着成分を含む試験用バッファ液中で馴化させる。解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）が投与された肝細胞は、肝細胞に含まれる各成分を定量する前に、細胞間接着成分を含む試験用バッファ液中で馴化させて、細胞外画分の回収に適した状態にプレインキュベーションすると共に、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）を細胞に十分作用させる。
　はじめに、肝細胞培養物上の上清を形成している培養に用いた培地を、細胞間接着成分を含む試験用バッファ液に置換する。置換に際しては、肝細胞培養物を、細胞間接着成分を含む試験用バッファ液で手早く数回リンスする。そして、肝細胞培養物を、細胞間接着成分を含む試験用バッファ液中でインキュベーションする。インキュベーションは、５％ＣＯ２、３７℃の条件下等で、例えば、１０分間程度を行うことができる。
＜工程Ｓ３：標準基質投与＞
　標準基質投与工程Ｓ３では、解析用の細胞に標準基質（Ｓ）を投与する。標準基質（Ｓ）は、培養中の肝細胞の上清に添加すると、肝細胞に取り込まれて、少なくとも一部が代謝物（Ｓｍｅｔ）に代謝変換される。
　はじめに、肝細胞培養物上の上清を形成している馴化に用いた細胞間接着成分を含む試験用バッファ液を、標準基質（Ｓ）および細胞間接着成分を含む試験用バッファ液に置換する。そして、肝細胞培養物を、標準基質（Ｓ）および細胞間接着成分を含む試験用バッファ液中でインキュベーションして、標準基質（Ｓ）を肝細胞内に取り込ませると共に代謝させる。インキュベーションは、例えば、５％ＣＯ２、３７℃の条件下等で、例えば、３０分間程度を行うことができる。
　続いて、標準基質（Ｓ）の肝細胞への取り込みを停止させる。肝細胞への取り込みを停止させる方法としては、肝細胞を冷却する方法を用いることができる。例えば、肝細胞培養物上の上清を、４℃程度の低温に冷却した細胞間接着成分を含む試験用バッファ液に置換し、肝細胞培養物を手早く数回リンスする方法を用いることができる。
　標準基質（Ｓ）は、細胞間接着成分を含む試験用バッファ液や、肝細胞培養物上の上清等に添加することができる。標準基質（Ｓ）は、細胞間接着成分を含む試験用バッファ液等に溶解して添加することができる。標準基質（Ｓ）の種類、濃度、添加量は、薬剤の代謝や排泄の過程の定量や、排泄経路毎の定量が可能である限り、特に限定されるものではない。
　例えば、化合物Ａと化合物Ｂの２種の相互作用を解析する場合、試験区Ｍ、試験区Ｎ－Ａおよび試験区Ｎ－Ｂの上清に、互いに同濃度且つ同量の標準基質Ｓを溶解した細胞間接着成分を含む試験用バッファ液等を添加することができる。
＜工程Ｓ４：血管側排出画分回収・定量＞
　血管側排出画分回収・定量工程Ｓ４では、解析用の肝細胞から排出される血管側排出画分（Ｆ１）を回収して、血管側排出画分（Ｆ１）に含まれる各成分を定量する。定量する成分としては、未反応の解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、未反応の標準基質（Ｓ）、代謝によって生成された解析対象である各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）が挙げられる。
　解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）や、標準基質（Ｓ）や、各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）や、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）を定量する方法としては、化合物が同位体標識されている場合は液体シンチレーションカウンター、化合物が蛍光を有する場合は分光分析、無標識あるいは化合物が蛍光を有しない場合は液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣＭＳ）等を用いることができる。
　はじめに、肝細胞培養物上の上清を形成している薬剤取り込み後のリンスに使用した細胞間接着成分を含む試験用バッファ液を、３７℃前後に加温した細胞間接着成分を含む試験用バッファ液に置換する。そして、細胞表面等に吸着した薬剤の除去を主目的として、肝細胞培養物を、細胞間接着成分を含む試験用バッファ液中で短時間だけインキュベーションする。インキュベーションは、５％ＣＯ２、３７℃の条件下等で、例えば、１分間程度を行うことができる。
　血管側排出画分（Ｆ１）は、工程Ｓ５とは異なり、細胞間接着が維持された状態において解析用の細胞から早期に排出される血管側排出成分Ｉや、投与後に細胞表面等に吸着した成分を含む。血管側排出画分回収・定量工程Ｓ４は、血管側排出成分Ｉを回収・定量する目的で行ってもよいし、投与後に細胞表面等に吸着した成分を除去する目的で行ってもよい。例えば、インキュベーション時間を短くすると、血管側排出成分Ｉの排出と比較して、吸着した成分を除去する作用のみが得られ易くなる。
　血管側排出成分Ｉは、（１）’受動輸送による血中への早期に排出される排泄分と、（２）’トランスポータを介した血中への早期に排出される排泄分に相当する。培養肝細胞の上面は、ベーサル面ないしバソラテラル面に相当し、生体内では血管に面している構図のため、解析用の肝細胞培養物上の上清が血管側（血中）に排出された画分となる。工程Ｓ４において、血管側排出画分（Ｆ１）に含まれる成分を定量すると、解析対象である各化合物が細胞内に溜まり易いかどうかを判別できる。
　なお、血管側排出画分（Ｆ１）は、いずれの試験区から回収してもよい。複数の試験区のうち、一部の試験区から回収して定量を行ってもよいし、全部の試験区から回収して定量を行ってもよい。また、解析対象である各化合物が細胞内に溜まり易いかどうかを判別する必要がない場合や、細胞表面等に吸着した成分の除去を必要としない場合等は、血管側排出画分（Ｆ１）の回収・定量を省略してもよい。
＜工程Ｓ５：排泄経路別画分回収・定量＞
　排泄経路別画分回収・定量工程Ｓ５では、解析用の肝細胞から排泄される排泄経路毎の排泄経路別画分（Ｆ２）を回収して、排泄経路別画分（Ｆ２）毎に含まれる各成分を定量する。定量する成分としては、未反応の解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、未反応の標準基質（Ｓ）、代謝によって生成された解析対象である各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）が挙げられる。
　解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）や、標準基質（Ｓ）や、各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）や、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）を定量する方法としては、化合物が同位体標識されている場合は液体シンチレーションカウンター、化合物が蛍光を有する場合は分光分析、無標識あるいは化合物が蛍光を有しない場合は液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣＭＳ）等を用いることができる。
　排泄経路毎の成分としては、（１）受動輸送による血中への排泄分、（２）トランスポータを介した血中への排泄分、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分が挙げられる。また、受動輸送およびトランスポータを介した血中への総血中排泄分や、受動輸送、トランスポータおよび毛細胆管を介した細胞外排泄分や、細胞によって取り込まれた薬剤取り込み分のうち、細胞外排泄分を除いた細胞内残留分が挙げられる。
　総血中排泄分は、（１）受動輸送による血中への排泄分と（２）トランスポータを介した血中への排泄分の合計として求めることができる。総血中排泄分は、解析用の細胞からの血管側排出成分ＩＩを含む。細胞外排泄分は、（１）受動輸送による血中への排泄分と（２）トランスポータを介した血中への排泄分と（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分の合計として求めることができる。細胞内残留分は、細胞への薬剤取り込み分－細胞外排泄分として求めることができる。細胞内残留分は、工程Ｓ６で定量することもできる。
＜工程Ｓ５　試験区１：３７℃崩壊系＞
　試験区１では、（１）受動輸送による血中への排泄分、（２）トランスポータを介した血中への排泄分、および、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分の合計を定量する。（１）～（３）の排泄分は、肝細胞の細胞間接着が崩壊した状態において、解析用の肝細胞培養物上の上清から回収する。
　はじめに、肝細胞培養物上の上清を形成している前工程に用いた細胞間接着成分を含む試験用バッファ液を、細胞間接着成分を含まない崩壊用バッファ液に置換する。そして、肝細胞培養物を崩壊用バッファ液中でインキュベーションし、細胞間接着を崩壊させた状態にして、各成分を排泄させる。インキュベーションは、５％ＣＯ２、３７℃の条件下等で、例えば、１５分間程度を行うことができる。
　崩壊用バッファ液としては、細胞間接着に必要なカルシウムイオンやマグネシウムイオンを含まない限り、ハンクス（－）液等の細胞機能を維持可能な適宜のバッファ液を用いることができる。ハンクス（－）液は、カルシウムイオンやマグネシウムイオンを含まないハンクス液である。細胞間接着を積極的に崩壊させたい場合は、カルシウムイオンやマグネシウムイオンに対するキレータを添加することができる。キレータとしては、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等を用いることができる。
　３７℃崩壊系の血管側排出画分は、細胞間接着が崩壊した状態において、解析用の肝細胞培養物上の上清に排出される。細胞間接着によって形成された間隙の周囲の細胞膜は、アピカル面に相当し、生体内では毛細胆管に面している。試験区１では、この細胞膜が崩壊するため、（１）受動輸送による血中への排泄分、（２）トランスポータを介した血中への排泄分、および、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分の合計が定量される。細胞間接着が維持された状態に対する増加分が、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分となる。
＜工程Ｓ５　試験区２：３７℃維持系＞
　試験区２では、（１）受動輸送による血中への排泄分、および、（２）トランスポータを介した血中への排泄分の合計を定量する。（１）～（２）の排泄分は、肝細胞の細胞間接着が維持された状態において、解析用の肝細胞培養物上の上清から回収する。
　はじめに、肝細胞培養物上の上清を形成している前工程に用いた細胞間接着成分を含む試験用バッファ液を、細胞間接着成分を含む維持用バッファ液に置換する。維持用バッファ液としては、細胞間接着に必要なカルシウムイオンやマグネシウムイオンを含む限り、ハンクス液等の細胞機能を維持可能な適宜のバッファ液を用いることができる。そして、肝細胞培養物を維持用バッファ液中でインキュベーションし、細胞間接着を維持した状態にして、各成分を排泄させる。インキュベーションは、５％ＣＯ２、３７℃の条件下等で、例えば、１５分間程度を行うことができる。
　３７℃維持系の血管側排出画分は、細胞間接着が維持された状態において、解析用の肝細胞培養物上の上清に排出される。細胞間接着によって形成された間隙の周囲の細胞膜は、アピカル面に相当し、生体内では毛細胆管に面している。試験区２では、この細胞膜が維持されるため、（１）受動輸送による血中への排泄分、および、（２）トランスポータを介した血中への排泄分が定量される。試験区２では、工程Ｓ４以降の血中排泄分が定量される。
＜工程Ｓ５　試験区３：４℃維持系＞
　試験区３では、（１）受動輸送による血中への排泄分を定量する。（１）の排泄分は、肝細胞の細胞間接着が維持されており、且つ、トランスポータ活性が抑制された状態において、解析用の肝細胞培養物上の上清から回収する。
　はじめに、肝細胞培養物上の上清を形成している前工程に用いた細胞間接着成分を含む試験用バッファ液を、細胞間接着成分を含む維持用バッファ液に置換する。維持用バッファ液としては、細胞間接着に必要なカルシウムイオンやマグネシウムイオンを含む限り、ハンクス液等の細胞機能を維持可能な適宜のバッファ液を用いることができる。そして、肝細胞培養物を維持用バッファ液中でインキュベーションし、細胞間接着を維持した状態にして、各成分を排泄させる。インキュベーションは、５％ＣＯ２、４℃の条件下等で、例えば、１５分間程度を行うことができる。
　４℃維持系の血管側排出画分は、細胞間接着が維持された状態において、解析用の肝細胞培養物上の上清に排出される。肝細胞を４℃等の低温に維持すると、トランスポータ活性が抑制される。試験区３では、排泄に関与するトランスポータが抑制されて、細胞膜を介した受動輸送のみが起こり、（１）受動輸送による血中への排泄分が定量される。
　なお、工程Ｓ５では、試験区１～３の全部を試験してもよいが、試験区１～３の一部を試験してもよい。例えば、（１）受動輸送による血中への排泄分、および、（２）トランスポータを介した血中への排泄分と、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分とを、互いに比較したい場合は、試験区１、２のみを試験することができる。また、（１）受動輸送による血中への排泄分と、（２）トランスポータを介した血中への排泄分とを、互いに比較したい場合は、試験区２、３のみを試験することができる。
　また、試験区１～３の他に、肝細胞を４℃に維持して細胞間接着を崩壊させる４℃崩壊系を設けてもよい。４℃崩壊系の試験区を設けると、細胞間接着が崩壊しており、且つ、トランスポータ活性が抑制された状態において、各成分を定量することができる。４℃崩壊系の定量結果と、４℃維持系の定量結果とを比較すると、受動拡散による毛細胆管側への排泄分と、トランスポータによる毛細胆管側への排泄分とを評価できる。
＜工程Ｓ６：細胞内残留画分回収・定量＞
　細胞内残留画分回収・定量工程Ｓ６では、解析用の肝細胞に残留している細胞内残留画分（Ｆ３）を回収して、細胞内残留画分（Ｆ３）に含まれる各成分を定量する。定量する成分としては、未反応の解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、未反応の標準基質（Ｓ）、代謝によって生成された解析対象である各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）が挙げられる。
　解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）や、標準基質（Ｓ）や、各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）や、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）を定量する方法としては、工程Ｓ４，Ｓ５と同様に、化合物が同位体標識されている場合は液体シンチレーションカウンター、化合物が蛍光を有する場合は分光分析、無標識あるいは化合物が蛍光を有しない場合は液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣＭＳ）等を用いることができる。
　はじめに、肝細胞培養物上の上清を形成している前工程に用いた各試験用バッファ液を、細胞溶解液に置換する。細胞溶解液としては、細胞膜を破壊する界面活性剤等を含む溶液を用いることができる。但し、例えば液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣＭＳ）を用いる場合は、有機溶媒による細胞膜破砕が好ましい。そして、肝細胞培養物を細胞溶解液中で処理し、各成分を細胞外に排出させる。必要に応じてホモジナイズや超音波破砕等の物理的細胞膜破砕を行ってもよい。
　細胞内残留画分（Ｆ３）は、細胞膜が破壊されることによって、解析用の肝細胞培養物外に排出される。工程Ｓ５では、細胞によって取り込まれた成分のうち、細胞外に能動的あるいは受動的に排泄された成分が定量される。これに対し、工程Ｓ６では、上流工程で細胞外に排出されずに細胞内に残留した成分が定量される。
＜工程Ｓ７：定量結果比較＞
　定量結果比較工程Ｓ７では、解析対象である２種以上の化合物を併用投与した場合の定量結果と、解析対象である個々の化合物を単独投与した場合の定量結果とを比較して、解析用の細胞における相互作用による各化合物の量的変動の計測結果、および、解析用の細胞における相互作用による標準基質の量的変動の計測結果を導出する。
＜代謝評価に用いる量的変動の計測結果＞
　薬剤の代謝の過程における相互作用を評価する場合、解析対象である２種以上の化合物を併用投与した試験区Ｍの定量結果と、解析対象である個々の化合物を単独投与した試験区Ｎの定量結果とについて、工程Ｓ４～６または工程５～６で定量された各成分の量を互いに比較する。そして、代謝の過程における相互作用による量的変動の計測結果として、成分毎の量的変動を増加・減少・無変化のいずれかに分類した結果を得る。
　量を互いに比較する成分としては、未反応の解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、解析対象である各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）、未反応の標準基質（Ｓ）、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）が挙げられる。段階的な代謝反応への相互作用を評価する場合は、中間代謝物の量を比較してもよい。また、主要な代謝酵素による代謝物に加え、標的外の酵素による代謝物の量を比較してもよい。
　試験区Ｍで定量された各化合物（Ａ，Ｂ・・・）の量や、各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）の量が、試験区Ｎで定量された各化合物（Ａ，Ｂ・・・）の量や、各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）の量と比較して、多い場合は増加、少ない場合は減少、有意差が無い場合は無変化に分類することができる。また、未反応の標準基質（Ｓ）、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）についても、同様に比較して分類することができる。
　図２に示すように、血管側排出画分（Ｆ１）に含まれる成分、排泄経路別画分（Ｆ２）に含まれる成分、および、細胞内残留画分（Ｆ３）に含まれる成分の合計は、工程Ｓ４で細胞表面等に吸着した成分を除くと、薬剤の投与後に肝細胞によって取り込まれた薬剤取り込み分と量的に同等となる。これらの成分の合計は、上清に添加された化合物や標準基質のうち、実際に肝細胞の細胞内に取り込まれた薬剤取り込み分の総量に相当するため、量的変動を求める際の計算方式として用いることができる。
　また、排泄経路別画分（Ｆ２）に含まれる成分、および、細胞内残留画分（Ｆ３）に含まれる成分の合計は、肝細胞によって取り込まれた薬剤取り込み分のうち、血管側排出成分Ｉを除いた排泄配分評価に用いられる薬剤量となる。これらの成分の合計は、肝細胞の細胞内に投与された化合物や標準基質のうち、血管側排出成分Ｉや工程Ｓ４の吸着除去等のコンディショニング相当分を除く、排泄配分評価の対象化合物の総量に相当するため、量的変動を求める際の計算方式として用いることができる。
　代謝の過程における相互作用による量的変動の計測結果は、このような薬剤取り込み分の総量（Ｆ１成分＋Ｆ２成分＋Ｆ３成分）について求めてもよいし、排泄配分評価の対象化合物の総量（Ｆ２成分＋Ｆ３成分）について求めてもよいし、これらの両方について求めてもよい。薬剤取り込み分の総量（Ｆ１成分＋Ｆ２成分＋Ｆ３成分）を用いる場合を“パターン１”とする。排泄配分評価の対象化合物の総量（Ｆ２成分＋Ｆ３成分）を用いる場合を“パターン２”とする。
　“パターン１”で薬剤取り込み分の総量（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３）についての計測結果を求めて評価を行うと、薬剤の総取り込み量基準の酵素誘導活性や酵素阻害活性を評価することができる。一方、“パターン２”で排泄配分評価の対象化合物の総量（Ｆ２＋Ｆ３）についての計測結果を求めて評価を行うと、排泄評価直前の細胞内薬剤量基準の酵素誘導活性や酵素阻害活性を評価することができる。
　試験区Ｍの定量結果と試験区Ｎの定量結果とを比較する際には、代謝されず未反応の標準基質（Ｓ）の量、および、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）の量の合計を基準として、試験区毎の定量結果同士を予め校正しても構わない。試験区毎の定量結果は、肝細胞量に応じた薬剤取り込み量差や試料誤差等を生じている場合がある。標準基質の合計量を基準として校正すると、定量結果同士を量的に正確に比較できる。
　薬剤の代謝の過程における相互作用による量的変動の計測結果は、個々の化合物を単独投与した場合に対する２種以上の化合物を併用投与した場合の酵素活性に基づく各成分の量的変動が、増加（↑）・減少（↓）・無変化（－）のいずれかに分類されたテーブル状のデータとして得ることができる。このようなデータは、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、標準基質（Ｓ）、各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）毎に得られる。
　図４は、相互作用の判定に用いるパターンを表した対照表の一例を示す図である。
　図４には、誘導および阻害を判定するステップＳ２０において薬剤の代謝の過程における相互作用の評価に用いる対照表を示す。図４に示すように、相互作用の判定に用いるパターンを表した対照表は、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、標準基質（Ｓ）、各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）毎に、相互作用による量的変動（増加・減少・無変化）を照合するための照合欄を含んでいる。
　照合欄は、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）の量的変動を照合するための照合欄と、その代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）の量的変動（増加・減少・無変化）を照合するための照合欄とに、横方向に区分けされている。また、未反応の標準基質（Ｓ）、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）についても、同様に区分けされている。これらの照合欄は、酵素誘導活性の有無および酵素阻害活性の有無の組み合わせに応じて、縦方向に区分けされている。
　なお、図４において、対照表は、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）毎に一つの代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）の照合欄を含んでいる。代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）の照合欄は、解析の目的に応じて、１次代謝物の量的変動の照合に用いることもできるし、１次代謝物以降の全代謝物の合計の量的変動の照合に用いることもできる。また、１次代謝物以降の代謝物毎に、複数の照合欄を設けることもできる。また、未反応の標準基質（Ｓ）、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）についても、同様に代謝物毎の照合欄を設けることができる。
　酵素誘導活性の有無および酵素阻害活性の有無の組み合わせ（縦方向の項目）は、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、標準基質（Ｓ）、各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）毎に設けられた照合欄に対して、一対一で対応している。各照合欄は、各成分の量的変動が、増加（↑）、減少（↓）、無変化（－）のいずれに対応するか、予め分類されている。無変化（－）は、各成分の投与量や試験区毎の細胞量等に応じて、増減の有意差を生じない任意の状態として設定することができる。
　誘導および阻害を判定するステップＳ２０では、薬剤の代謝の過程における相互作用を評価する場合、ステップＳ１０で得られた相互作用による量的変動の計測結果を、図４に示す対照表のような予め分類されたパターンと照合する。
　解析対象である２種以上の化合物のうち、或る化合物（Ａ，Ｂ・・・）や、その代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）の量的変動（増加・減少・無変化）は、当該化合物と併用された化合物の酵素誘導活性や酵素阻害活性によって生じる。当該化合物自体による酵素誘導活性や酵素阻害活性は、比較に際して相殺されるか、または、重畳される。そのため、併用される化合物の定量結果に応じて、当該化合物自体による酵素誘導活性や酵素阻害活性を評価できる。
　また、未反応の標準基質（Ｓ）や、その代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）の量的変動（増加・減少・無変化）は、解析対象である全ての化合物の誘導活性や阻害活性の複合によって生じる。標準基質は、全ての試験区に投与されるため、化合物の定量結果同士を比較する際に、影響を生じ難い。そのため、標準基質の定量結果を基準にして、化合物の組み合わせに応じた複合的な活性の評価や、排泄経路毎の評価を行うことができる。
　例えば、図４の最上段のように、化合物Ａに酵素誘導活性があり、化合物Ｂに酵素誘導活性がない場合には、化合物Ｂが減少（↓）、化合物Ｂの代謝物Ｂｍｅｔが増加（↑）、化合物Ａが無変化（－）、化合物Ａの代謝物Ａｍｅｔが無変化（－）のパターンに予め分類することができる。このようなパターンが、実際にステップＳ１０で得られた場合、化合物Ａに誘導活性が有り、化合物Ｂに誘導活性が無い、と判定することができる。また、標準基質（Ｓ）や、その代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）についても同様に分類や判定を行って、標準基質（Ｓ）と共に投与された化合物（Ａ，Ｂ・・・）の活性を評価できる。
　すなわち、解析対象である２種以上の化合物のうち、或る判定対象化合物と併用される判定対象化合物以外の化合物の量的変動が、単独投与された定量結果と比較して、併用投与された定量結果で増加しているとき、すなわち、併用される未反応の化合物（Ａ，Ｂ・・・）が減少（↓）し、併用される化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）が増加（↑）したとき、当該判定対象化合物が酵素誘導活性を有すると判定できる。また、未反応の標準基質（Ｓ）についても同様である。
　また、解析対象である２種以上の化合物のうち、或る判定対象化合物と併用される判定対象化合物以外の化合物の量的変動が、単独投与された定量結果と比較して、併用投与された定量結果で減少しているとき、すなわち、併用される未反応の化合物（Ａ，Ｂ・・・）が増加（↑）し、併用される化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）が減少（↓）したとき、当該判定対象化合物が酵素阻害活性を有すると判定できる。また、未反応の標準基質（Ｓ）についても同様である。
　また、解析対象である２種以上の化合物のうち、或る判定対象化合物と併用される判定対象化合物以外の化合物の量的変動が、単独投与された定量結果と比較して、併用投与された定量結果で変化していないとき、すなわち、併用される未反応の化合物（Ａ，Ｂ・・・）が無変化（－）であり、併用される化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）が無変化（－）であるとき、当該判定対象化合物が酵素誘導活性および酵素阻害活性を有しないと判定できる。また、未反応の標準基質（Ｓ）についても同様である。
　未反応の標準基質（Ｓ）の量的変動や、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）の量的変動は、解析対象である２種以上の化合物の酵素活性の組み合わせに応じて、増加（↑）、減少（↓）、無変化（－）のいずれかとなる。標準基質（Ｓ）の量的変動の大きさや、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）の量的変動の大きさは、図４に示すように、標準基質（Ｓ）と共に投与された化合物（Ａ，Ｂ・・・）の活性の組み合わせに応じて、相殺されるか、または、重畳される。２種以上の化合物によって誘導と阻害が複合する場合には、標準基質（Ｓ）や、その代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）の量的変動が小さくなるが、試験区Ｎにおいて量的変動を生じる。
　化合物毎に試験区Ｎの定量結果と試験区Ｍの定量結果とを比較すると、このような全体としての相互作用の内訳を判別して、酵素誘導活性の有無、酵素阻害活性の有無を、併用される２種以上の化合物のそれぞれについて判定することができる。２種以上の化合物によって誘導と阻害が複合する場合であっても、化合物毎の活性の内訳を判別することが可能である。また、酵素誘導活性や酵素阻害活性の評価に際して、排泄経路別画分（Ｆ２）毎に含まれる各成分を定量することができるため、酵素活性の評価と排泄評価（排泄の配分・振り分け評価）とを、同一の試験系で実施することができる。
＜排泄評価に用いる量的変動の計測結果＞
　薬剤の排泄の過程における相互作用を評価する場合、解析対象である２種以上の化合物を併用投与した試験区Ｍの定量結果と、解析対象である個々の化合物を単独投与した試験区Ｎの定量結果とについて、工程Ｓ５の試験区１～３で定量された排泄経路毎の各成分の量を互いに比較する。そして、排泄の過程における相互作用による量的変動の計測結果として、排泄経路毎且つ成分毎の量的変動の計測結果を得る。
　量を互いに比較する成分としては、未反応の解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、未反応の標準基質（Ｓ）、解析対象である各化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）、標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）が挙げられる。段階的な代謝反応への相互作用を評価する場合は、中間代謝物の量を比較してもよい。また、主要な代謝酵素による代謝物に加え、標的外の酵素による代謝物の量を比較してもよい。
　図２に示すように、工程Ｓ５で回収・定量する試験区１～３毎の排泄経路別画分（Ｆ２）のうち、試験区３で回収・定量する成分の量は、（１）受動輸送による血中への排泄分における成分の量に相当する。試験区２で回収・定量する成分の量と、試験区３で回収・定量する成分の量との差分は、（２）トランスポータを介した血中への排泄分における成分の量に相当する。試験区１で回収・定量する成分の量と、試験区２で回収・定量する成分の量との差分は、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分における成分の量に相当する。
　また、試験区２で回収・定量する成分の量は、（１）受動輸送による血中への排泄分と（２）トランスポータを介した血中への排泄分の合計、すなわち、受動輸送およびトランスポータを介した総血中排泄分における成分の量に相当する。試験区１で回収・定量する成分の量は、（１）受動輸送による血中への排泄分と（２）トランスポータを介した血中への排泄分と（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分の合計、すなわち、受動輸送、トランスポータおよび毛細胆管を介した細胞外排泄分における成分の量に相当する。
　排泄の過程における相互作用による量的変動の計測結果は、これらの排泄経路毎の成分、すなわち、（１）受動輸送による血中への排泄分、（２）トランスポータを介した血中への排泄分、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分、総血中排泄分（（１）＋（２））、細胞外排泄分（（１）＋（２）＋（３））のうち、いずれか一種の定量結果に基づいて導出してもよいし、複数種の定量結果に基づいて導出してもよい。
　（１）～（３）の排泄分についての計測結果を求めて評価を行うと、排泄誘導活性や排泄阻害活性の傾向を評価できる。また、総血中排泄分（（１）＋（２））についての計測結果を求めて評価を行うと、血中排泄の動態のみに基づいて排泄誘導活性や排泄阻害活性の傾向を評価できる。また、細胞外排泄分（（１）＋（２）＋（３））についての計測結果を求めて評価を行うと、排泄経路毎の動態の影響が排除されることになり、薬剤の代謝の過程の動態のみに基づいて排泄誘導活性や排泄阻害活性の傾向を評価できる。
　試験区１～３の定量結果同士を比較する際には、細胞によって取り込まれた薬剤取り込み量のうち、代謝されなかった親化合物である標準基質（Ｓ）の量、および、代謝によって生成された標準基質の代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）の量の合計を基準として、試験区毎の定量結果同士を予め校正しても構わない。試験区毎の定量結果は、肝細胞量に応じた薬剤取り込み量差、排泄量差や、試料誤差等を生じている場合がある。標準基質の合計量を基準として校正すると、定量結果同士を量的に正確に比較できる。
　なお、工程Ｓ６で回収・定量する細胞内残留画分（Ｆ３）における成分の量は、細胞によって取り込まれた成分の量と、細胞外排泄分（（１）＋（２）＋（３））における成分の量との差分に相当する。細胞内残留画分（Ｆ３）における成分の量と、細胞外排泄分（（１）＋（２）＋（３））における成分の量とを定量すると、細胞によって取り込まれた標準基質（Ｓ）や、その代謝物（Ｓｍｅｔ・・・）の量を求めることができる。
　薬剤の排泄の過程における相互作用による量的変動の計測結果は、個々の化合物を単独投与した場合に対する２種以上の化合物を併用投与した場合の排泄活性に基づく各成分の量的変動を、スコア、グラフ等で表したデータとして得ることができる。このようなデータは、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）、および、その代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）毎、且つ、肝細胞の排泄経路毎に得られる。
　図５および図６は、排泄経路毎の各成分量を表すグラフの一例を示す図である。
　図５は、パターン１”で薬剤取り込み分の総量（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３）についての計測結果を求めた場合であり、所定の成分の排泄経路毎の分配比を示す。図６は、“パターン２”で排泄配分評価の対象化合物の総量（Ｆ２＋Ｆ３）についての計測結果を求めた場合であり、所定の成分の排泄経路毎の分配比を示す。薬剤の排泄の過程における相互作用による量的変動の計測結果は、このような分配比を示すデータによって評価できる。
　図５および図６において、左側のグラフは、解析対象である２種以上の化合物のうちの１種の化合物（化合物Ａ）を単独投与した場合の排泄経路毎の分配比を示す。右側のグラフは、解析対象である２種以上の化合物のうちの全種の化合物（化合物Ａ，化合物Ｂ）を併用投与した場合の排泄経路毎の分配比を示す。分配比は、薬剤取り込み分の総量（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３）や排泄配分評価の対象化合物の総量（Ｆ２＋Ｆ３）を１００％としたとき、これらに対する排泄経路毎の各成分量の比率（％）として計算することができる。
　図５および図６において、血管側排出画分（Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif）は、（１）受動輸送による血中への排泄分を含む画分に対応する。血管側排出画分（Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP）は、（２）トランスポータを介した血中への排泄分を含む画分に対応する。管側排出画分（Bile Canaliculi Efflux、BCEfx）は、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄分を含む画分に対応する。細胞内残留画分（Cell）は、（４）細胞内への残留分を含む画分に対応する。血管側排出画分（Sup）は、工程Ｓ４で回収される画分に対応する。
　誘導および阻害を判定するステップＳ２０では、薬剤の排泄の過程における相互作用を評価する場合、ステップＳ１０で得られた相互作用による量的変動の計測結果を、図５および図６に示すグラフのように視覚化することができる。なお、図５および図６には、化合物Ａの分配比のグラフを示しているが、解析対象である各化合物や、標準基質や、これらの代謝物毎に視覚化することができる。
　解析対象である２種以上の化合物のうち、或る化合物（Ａ，Ｂ・・・）や、その代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）の排泄経路毎の量的変動は、当該化合物と併用された化合物の排泄誘導活性や排泄阻害活性によって生じる。当該化合物自体による排泄誘導活性や排泄阻害活性は、比較に際して相殺されるか、または、重畳される。そのため、併用される化合物の定量結果に応じて、当該化合物自体による排泄誘導活性や排泄阻害活性を評価できる。
　例えば、図５および図６のように、ExEfx-Difへの分配比が、単独投与された定量結果と比較して、併用投与された定量結果で増加しており、ExEfx-TP、BCEfxおよびCellへの分配比が、単独投与された定量結果と比較して、併用投与された定量結果で減少しているとき、（１）受動輸送による血中への排泄が誘導されているか、（２）トランスポータを介した血中への排泄、（３）毛細胆管を介した胆汁排泄、および、（４）細胞内への残留のうちのいずれかが阻害されていると判定することができる。
　また、図５および図６のように、Supへの分配比が、単独投与された定量結果と比較して、併用投与された定量結果で無変化であるとき、工程Ｓ４で回収された血管側排出画分（Ｆ１）に含まれる成分と工程Ｓ５で回収された排泄経路別画分（Ｆ２）のうちの試験区２に含まれる成分とが互いに量的に同等であり、細胞内への溜まり易さが相互作用による影響を受けていないと判定することができる。
　すなわち、解析対象である２種以上の化合物のうち、或る判定対象化合物と併用される判定対象化合物以外の化合物について、或る排泄経路における化合物の量的変動、例えば、或る排泄経路における分配比が、単独投与された定量結果と比較して、併用投与された定量結果で増加しているとき、すなわち、併用される未反応の化合物（Ａ，Ｂ・・・）の分配比や、併用される化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）に分配比が増加したとき、当該判定対象化合物が当該排泄経路についての排泄誘導活性を有するか、当該判定対象化合物が当該排泄経路以外の排泄経路についての排泄阻害活性を有すると判定できる。
　また、解析対象である２種以上の化合物のうち、或る判定対象化合物と併用される判定対象化合物以外の化合物について、或る排泄経路における化合物の量的変動、例えば、或る排泄経路における分配比が、単独投与された定量結果と比較して、併用投与された定量結果で減少しているとき、すなわち、併用される未反応の化合物（Ａ，Ｂ・・・）の分配比や、併用される化合物の代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）の分配比が減少したとき、当該判定対象化合物が当該排泄経路についての排泄阻害活性を有するか、当該判定対象化合物が当該排泄経路以外の排泄経路についての排泄誘導活性を有すると判定できる。
　このような本実施形態に係る薬剤相互作用解析方法によると、従来の酵素誘導試験や酵素阻害試験とは異なり、薬剤の代謝の過程と薬剤の排泄の過程とを合わせた薬剤相互作用の全体像を、俯瞰的に把握することが可能になる。また、従来の酵素誘導試験と酵素阻害試験が個別に行われているのに対し、酵素誘導活性と酵素阻害活性とを同一の試験で統合的に評価できる。毛細胆管様の構造が形成された培養肝細胞を用いると、薬剤の代謝の過程についての定量試験と、薬剤の排泄の過程についての定量試験とを、同一の細胞内で同時期に試験することができる。そのため、薬剤同士の実際の相互作用が反映された評価を得ることができる。
　前記の薬剤相互作用解析方法は、培養肝細胞を用いたin vitroの定量試験を手動で行う分析時や、培養肝細胞を用いたin vitroの定量試験を半自動的に行う自動分析装置で実行することができる。
　自動分析装置は、例えば、試験区毎の培養肝細胞上の上清をサンプリングするためのオートサンプラ・分注機構を備えたサンプル前処理・回収部と、分光分析、質量分析等の定量分析によって各成分を定量するための分析部と、試験区毎のバッファ液等の試験液を調製するサンプル調製部と、量的変動の計測結果を導出して相互作用を判定するデータ解析部と、相互作用の判定の結果を表示する表示部と、を備える。
　自動分析装置は、複数の試験区を同時に定量試験・分析に供するために、複数のウェルが配列したマイクロプレートを搬送する機構や、マイクロプレートのウェル内から上清を回収するサンプラや、マイクロプレートのウェル内にバッファ液等の試験液を供給する機構や、マイクロプレートのウェル内を温調する温調機構を備えることができる。温調機構は、崩壊系を試験する３７℃付近と、維持系を試験する４℃付近との間で温調可能であることが好ましい。あるいは、臨床自動検査装置等で採用されているディスクリート方式のような反応ディスク状でも構わない。
　定量部は、試験区毎の培養肝細胞上の上清に含まれる成分を定量する。データ解析部は、試験区毎の定量結果のデータを定量部から取得し、細胞における相互作用による各化合物の量的変動や標準基質の量的変動を演算する。標準基質を内部標準として利用する場合は、標準基質の量的変動に基づいて、試験区毎の定量結果を校正して、各化合物の量的変動を演算する。
　細胞における相互作用による化合物の量的変動の演算は、解析対象である２種以上の化合物が併用投与された試験区Ｍの定量結果を、解析対象である２種以上の化合物のうちの１種の化合物が単独投与された試験区Ｎの定量結果と比較することにより行う。試験区Ｎの定量結果のデータは、自動分析装置の記憶部に予め記憶させてもよいし、試験区Ｍと同時に定量試験して記憶させてもよい。データ解析部は、図４に示す対照表に相当するアルゴリズムで比較および判定を行う。
　相互作用の判定は、ユーザの指示等に応じて、代謝評価のみ、または、代謝評価と排泄評価の両方について行うことができる。代謝評価では、相互作用による酵素誘導活性の有無や、酵素阻害活性の有無や、誘導と阻害が複合した相互作用の内訳を判別する。排泄評価では、排泄経路毎の分配比等を演算して、代謝評価と同じ試験系で評価された排泄経路毎の動態の傾向を評価する。
　表示部は、代謝の過程における相互作用の判定の結果として、図４に示すような相互作用の判定に用いた対照表と共に、対照表の照合欄に対する照合の結果を、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）毎や、その代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）毎に表示できる。また、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）毎に、酵素誘導活性の有無や、酵素阻害活性の有無や、誘導と阻害が複合した相互作用の内訳を、言語、記号、色等を用いて表示できる。
　また、表示部は、排泄の過程における相互作用の判定の結果として、図５および図６に示すようなグラフや、排泄経路毎の分配比等を示すテーブルや、排泄経路毎の排泄誘導活性や排泄阻害活性の可能性を示す表記を表示できる。排泄誘導活性や排泄阻害活性の可能性を示す表記は、、解析対象である各化合物（Ａ，Ｂ・・・）毎や、その代謝物（Ａｍｅｔ，Ｂｍｅｔ・・・）毎に表示できる。
　以上、本発明について説明したが、本発明は、前記の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。例えば、本発明は、必ずしも前記の実施形態が備える全ての構成を備えるものに限定されない。或る実施形態の構成の一部を他の構成に置き換えたり、或る実施形態の構成の一部を他の形態に追加したり、或る実施形態の構成の一部を省略したりすることができる。
１０１　肝細胞組織
１０２　トランスポータ
１０３　毛細胆管
１０４　ベーサル（Basal）面ないしバソラテラル（Basolateral）面
１０５　アピカル（Apical）面

Claims (6)

  1. 　２種以上の薬剤を併用する場合の相互作用を解析する薬剤相互作用解析方法であって、
    　代謝酵素を産生する細胞に、併用される２種以上の化合物と、前記代謝酵素によって代謝される標準基質と、を投与して、前記細胞における相互作用による前記化合物の量的変動、および、前記細胞における相互作用による前記標準基質の量的変動を計測するステップと、
    　前記量的変動の計測結果に基づいて、２種以上の前記化合物を併用する場合に生じる前記代謝酵素の酵素誘導活性の有無、および、前記代謝酵素の酵素阻害活性の有無を判定するステップと、を含む薬剤相互作用解析方法。
  2. 　請求項１に記載の薬剤相互作用解析方法であって、
    　前記量的変動を計測するステップは、
    　前記細胞に、２種以上の前記化合物と、前記標準基質と、を投与して、前記細胞に含まれる未反応の前記化合物、未反応の前記標準基質、代謝によって生成された前記化合物の代謝物、および、代謝によって生成された前記標準基質の代謝物を定量する定量工程と、
    　２種以上の前記化合物を併用投与した場合の定量結果と、２種以上の前記化合物のうちの１種を単独投与した場合の定量結果と、を比較して、前記細胞における相互作用による前記化合物の量的変動、および、前記細胞における相互作用による前記標準基質の量的変動を導出する比較工程と、を含む薬剤相互作用解析方法。
  3. 　請求項２に記載の薬剤相互作用解析方法であって、
    　前記量的変動を計測するステップは、
    　前記細胞に、２種以上の前記化合物のうちの１種と、前記標準基質と、を投与して、前記細胞に含まれる未反応の前記化合物、未反応の前記標準基質、代謝によって生成された前記化合物の代謝物、および、代謝によって生成された前記標準基質の代謝物を定量する定量工程を含む薬剤相互作用解析方法。
  4. 　請求項２に記載の薬剤相互作用解析方法であって、
    　前記細胞は、細胞外マトリクス上で二次元培養された肝細胞、または、細胞外マトリクス上、基材上若しくは浮遊状態で三次元培養された肝細胞のスフェロイド、または、細胞外マトリクス上若しくは基材上で三次元培養された肝細胞を含む肝オルガノイドであり、
    　前記定量工程は、前記肝細胞のトランスポータを介して排出される成分、前記肝細胞の毛細胆管を介して排出される成分、および、前記肝細胞のトランスポータおよび毛細胆管以外から排出される成分のうちの一以上を定量する工程である薬剤相互作用解析方法。
  5. 　請求項４に記載の薬剤相互作用解析方法であって、
    　前記定量工程は、前記肝細胞の細胞間接着を維持した状態で測定を行う維持系の試験区、前記肝細胞の細胞間接着を崩壊させた状態で測定を行う崩壊系の試験区、および、前記肝細胞のトランスポータの活性を抑制した低温の状態で測定を行う低温維持系の試験区のうち、２種以上を定量試験する工程である薬剤相互作用解析方法。
  6. 　請求項２に記載の薬剤相互作用解析方法であって、
    　前記比較工程で導出された前記細胞における相互作用による前記化合物の量的変動が、２種以上の前記化合物のうちの判定対象化合物以外の化合物で増加しているとき、前記判定対象化合物が酵素誘導活性を有すると判定し、
    　前記比較工程で導出された前記細胞における相互作用による前記化合物の量的変動が、２種以上の前記化合物のうちの判定対象化合物以外の化合物で減少しているとき、前記判定対象化合物が酵素阻害活性を有すると判定し、
    　前記比較工程で導出された前記細胞における相互作用による前記化合物の量的変動が、２種以上の前記化合物のうちの判定対象化合物以外の化合物で無変化であるとき、前記判定対象化合物が酵素誘導活性および酵素阻害活性を有しないと判定する薬剤相互作用解析方法。
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