JP2007508019A - 活性のある治療用タンパク質を生成するための細胞系の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、2003年10月10日に出願された米国仮出願第60/510,509号の特典を主張するものである。
本発明は、米国特許商標庁の先端技術プログラムによって授与された助成金番号70−NANB7H3070で米国政府の支援によって、及びNIH中小企業経営革新支援機関の助成金からの支援(助成金番号:R143GM66480−01)によって部分的になされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
現在、臨床及び治療用途に関して承認されている多くのタンパク質は、モノクローナル抗体以外、組換えタンパク質技術によって大量生産されている。これらの製品は安全且つ有効であることが証明されてきているが、それらの全てがその本来の相当物と同一に働くわけではない。例えば、組換え型因子血液凝固因子(rF)VIII及びIXは、輸液後にそれらの血漿由来の相当物より迅速にクリアランスされる。Shapiro、A.、E.Berntorp、及びM.Morfini、「増大分回収評価、並びに組換え型第IX因子で治療した以前は未処理であった患者における体重及び年齢の影響。(Incremental recovery assessment and effects of weight and age in previously untreated patients treated with recombinant factor IX.)」、Blood、2000.96(補遺1):p.265a。
血友病A(第VIII因子欠乏症)及び血友病B(第IX因子欠乏症)は、X連鎖劣性形質として遺伝する出血障害である。したがって、両方共にほぼ全ての男性に影響を与える。血友病Aと血友病Bは、さまざまな程度の臨床的発現がある異種状態である。血友病Aはより一層一般的であり、米国では5000〜10,000人の男性中1人に発生する。Soucie、J.M.、B.Evatt、及びD.Jackson、「米国における血友病の発生。米国血液学専門誌(Hemophilia Occurrence in the United States.American Journal of Hematology)」、1998.59:p.288〜294。
(1)タンパク質をコードし発現することができるDNAを含む不死化ヒト肝細胞を用意するステップ、
(2)タンパク質をコードする1つ又は複数の遺伝子が、タンパク質が不死化肝細胞中で生成されプロセシングされるように発現されるような条件下で、不死化肝細胞を培養するステップ、及び
(3)不死化肝細胞からプロセシングされたタンパク質を単離するステップを含み、必要な場合プロセシングされグリコシル化されるようにタンパク質を発現させ、したがってそのin vivo機能がその単離後実質的に保たれる方法である。
(a)前に記載した方法に従って生成される活性タンパク質を用意するステップ、及び
(b)疾患又は状態に罹患している患者にその疾患又は状態を治療するために治療上有効量、活性タンパク質を投与するステップを含む方法である。
(1)IαIpタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードし発現することができるDNAを含むヒト肝細胞以外の真核細胞を用意するステップであって、(a)IαIpタンパク質複合体の一部であるタンパク質前駆体の少なくとも1つの遺伝子を含むDNA及び(b)少なくとも1つの前駆体遺伝子をコードするDNAと動作可能に連結して前駆体遺伝子の発現を増強させる、少なくとも1つの制御要素を含む少なくとも1つのベクターを用いて、真核細胞が形質転換又はトランスフェクトされているステップ、
(2)IαIp複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子が、IαIp複合体が生成されるように発現されるような条件下で、形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞を培養するステップ、及び
(3)形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞から発現されたIαIpタンパク質複合体を単離するステップを含む方法である。
本発明に従い本明細書で使用する、以下の用語及び略語は、他に明確に述べない限り以下の意味で定義する。これらの説明は例示のみを目的とする。これらの説明は、本明細書を通じて記載し言及する用語を制限することは目的としない。そうではなくて、これらの説明は、本明細書で記載し特許請求する用語の任意の追加的態様及び/又は実施例を含むことを意味する。
MCT=多細胞技術
MFE=多機能性増強培地
TPP=治療用血漿タンパク質
IαIp=インターα阻害剤タンパク質
SV40=シミアンウイルス40T抗原及びt抗原
AAT=α−1−抗トリプシン
本発明の一態様は、タンパク質、好ましくは治療用タンパク質、及びより好ましくは治療用血漿タンパク質を生成するための不死化ヒト肝細胞の使用法である。
(1)タンパク質をコードし発現することができるDNAを含む不死化ヒト肝細胞を用意するステップ、
(2)タンパク質をコードする1つ又は複数の遺伝子が、タンパク質が不死化肝細胞中で生成されプロセシングされるように発現されるような条件下で、不死化肝細胞を培養するステップ、及び
(3)不死化肝細胞からプロセシングされたタンパク質を単離するステップを含み、
必要な場合プロセシングされグリコシル化されるようにタンパク質を発現させ、したがってそのin vivo機能がその単離後実質的に保たれる方法である。
初代細胞の単離
ドナーであるヒト肝臓の消化は、37℃において酸素飽和状態のカルシウムを含まないバッファーの前灌流によってin vitroで行った。前灌流は肝臓が平衡状態になるまで続け、次に肝臓が完全に消化されるまで(約45分)酸素飽和状態のコラゲナーゼバッファーによって灌流を続けた。
前に記載したようにドナー肝臓から単離した、新たに単離したヒト肝細胞を、5分間50×gでの遠心分離によって3回洗浄バッファーで洗浄した。細胞ペレットは冷蔵凍結培地(無血清MFE培地:FBS:DMSO(8:1:1))に、5×106/mLの最終細胞密度で再懸濁させた。細胞懸濁液の等分試料は、Nuncクリオバイアルに移した(1.0mL/1.5mlクリオバイアル、4.5mL/5mlクリオバイアル)。クリオバイアル中の細胞は15〜30分間4℃において平衡状態にし、次いでバイアルは少なくとも3時間−80℃のスタイロフォーム(商標)容器中に置いた。次いでバイアルはLN2中に沈めた。
低温保存したヒト肝細胞を摂氏42度の水浴中で急速に解凍し、洗浄し、MFE培養培地に平板培養した。2日後、リポフェクション介在トランスフェクションによって不死化遺伝子を導入した。Ea1C−35細胞系は、SV40ゲノムの2.5kbの初期領域を含む不死化ベクターを用いたトランスフェクションから誘導したものであり、SV40ゲノムはラージT抗原とスモールt抗原の両方を含み、その発現はSV40初期プロモーターによって誘導される。この初期領域はStratagene pBluescript SKベクター骨格中に挿入し、pBlueTagと名付けた。neoプラスミドのコトランスフェクションによって選択可能なマーカーとして、ネオマイシン耐性をトランスフェクト細胞に与えた。G418含有培地中で増殖するそれらの能力に基づいて、クローンを最初に選択した。Ea1C−35細胞系を確立し、CSM培地中に保った。
(1)IαIpタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードし発現することができるDNAを含む、形質転換又はトランスフェクトされたヒト肝細胞以外の真核細胞を用意するステップ、
(2)IαIpタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子が、IαIp複合体が生成されるように発現されるような条件下で、不死化真核細胞を培養するステップ、及び
(3)発現されたIαIpタンパク質複合体を不死化真核細胞から単離するステップを含む。
(1)活性IαIpタンパク質複合体を用意するステップ、及び
(2)疾患又は状態に罹患している患者にその疾患又は状態を治療する治療活性量の活性IαIpタンパク質複合体を投与するステップを含む。
(1)患者由来の血漿サンプルを用意すること、
(2)血漿サンプル中の活性タンパク質の濃度を測定すること、及び
(3)血漿サンプル中の活性タンパク質の濃度と患者の疾患の存在又は不在を関連付けて、患者の疾患の存在又は不在を決定することを含む。
(1)患者由来の細胞のサンプルを採取すること、
(2)そのサンプルからmRNAを単離すること、
(3)タンパク質をコードするサンプル中のmRNAの量又は濃度を測定すること、及び
(4)タンパク質をコードするサンプル中のmRNAの量又は濃度と患者の疾患の存在又は不在を関連付けて、患者の疾患の存在又は不在を決定することを含む。
血漿タンパク質複合体を生成する、ウイルスにより不死化肝臓細胞系の使用の例
以下は、血漿タンパク質、より詳細にはIαIpタンパク質複合体を生成するウイルスにより不死化させた肝臓細胞系の使用である。これらの使用は、IαIpタンパク質複合体のその生成、及び他のタンパク質のその考えられる生成と関係がある。
(1)Fa2N−4及びEa1C−35からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
(2)スクリーニングする化合物に細胞系を曝すステップ、及び
(3)細胞系においてスクリーニングする化合物によって誘導される細胞毒性の程度を測定して、その化合物が化学療法活性を有するかどうか判定するステップを含む方法を含む。
(1)Fa2N−4及びEa1C−35からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
(2)スクリーニングする化合物に細胞系を曝すステップ、及び
(3)細胞系においてスクリーニングする化合物によって誘導される突然変異誘発の程度を測定して、その化合物が突然変異誘発活性を有するかどうか判定するステップを含む方法も含む。
(1)Fa2N−4及びEa1C−35からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
(2)スクリーニングする化合物に細胞系を曝すステップ、及び
(3)細胞系においてスクリーニングする化合物による抑制又は誘導効果を測定して、その化合物が遺伝子発現を誘導又は抑制する活性を有するかどうか判定するステップを含む方法も含む。
(1)Fa2N−4及びEa1C−35からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
(2)スクリーニングする化合物に細胞系を曝すステップ、及び
(3)濃度及び露出時間の片方或いは両方の関数として細胞系の生存能力を測定することによって、細胞系においてスクリーニングする化合物によって誘導される細胞毒性の程度を測定して、その化合物が細胞毒性活性を有するかどうか判定するステップを含む方法も含む。
(1)Fa2N−4及びEa1C−35からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
(2)第一の薬剤に細胞系を曝すステップ、
(3)第一の薬剤によって誘導されるシトクロムP450酵素の生成を測定することによって、第二の薬剤を代謝することができるシトクロムP450酵素の生成を第一の薬剤が誘導するかどうか判定して、第一の薬剤と第二の薬剤の間の相互作用の存在に関してスクリーニングするステップを含む。
(1)Fa2N−4及びEa1C−35からなる群から選択される肝細胞の細胞系を用意するステップ、
(2)第一の薬剤に細胞系を曝すステップ、
(3)第一の薬剤によって誘導されるMDRタンパク質の生成を測定することによって、MDRタンパク質の生成を第一の薬剤が誘導するかどうか判定して、第一の薬剤と第二の薬剤の間の相互作用の存在に関してスクリーニングするステップを含む。
不死化ヒト肝細胞の特徴付け
100を超えるヒト肝細胞のクローン細胞系を、SV40初期プロモーターの制御下でシミアンウイルス40のラージT抗原とスモールt抗原遺伝子を用いて、ヒト肝細胞をトランスフェクトすることによって確立した。Ea1C−35及びFa2N−4と表した2つの細胞系を記載する。
肝臓特異的転写因子の発現
肝臓特異的転写因子の保持は肝機能の発現に関する前提条件なので、クローン細胞系を、ヒトHNF1、HNF3、HNF4α、HNF4γ及びC/EBP及びアルブミン用のプライマーを使用するRT−PCRによって最初にスクリーニングした。簡潔には、Brennerら(55)のマイクロ単離法を使用して、それぞれのクローン細胞系の106個の細胞から全RNAを調製した。前の参照に関する情報はどこに存在するのだろうか?50μgの大腸菌rRNA(Sigma)を担体として使用して、少数の細胞からのRNAの単離を容易にした。Perkin Elmer Cetus、遺伝子増幅RNA PCRキットを使用して、RT−PCR反応を行った。供給者の使用説明書に従いランダムヘキサマー及びM−MLV逆転写酵素を使用して、1μgの全RNAを逆転写した。PCR反応はオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行い、それによってそれぞれの転写因子に特有のヌクレオチド断片を明らかにした。これらのプライマーは、Cruachem(Fisher Scientific)によって商業的に合成及び精製された。1分間58℃のアニーリング温度を使用して、30サイクルPCR反応を行った。臭化エチジウムを用いた染色後1%アガロースゲル中において、PCR産物を眼に見える状態にした。陽性対照サンプルは、新たに単離したヒト肝細胞の全RNAのRT−PCR分析物を含んでいた(示さず)。表1に以下に示したように、両方の細胞系が全部で5個の肝細胞関連転写因子を発現した。肝臓特異的な遺伝子発現の指標として、アルブミン生成を測定した。表1に以下に示したように、ヒトアルブミンを認識する抗体を使用してELISAアッセイによって検出すると、両方の細胞系が無血清調整培地にアルブミンを分泌する。
SV40介在の増殖活性
初代ヒト肝細胞は、培養時に限られた増殖活性を有する。この特性を克服するために、SV40のラージT抗原とスモールt抗原をゲノムに導入した。生成したクローン細胞系、Fa2N−4及びEa1C−35は、その後18ヶ月までの間、培養中維持した。両方の不死化細胞系が、MFE培地中に維持すると増殖及び機能し、これらは低温保存し積み重ねることができる。ラージT抗原及びアルブミンに対する多価抗体を使用する間接的免疫蛍光染色は、細胞系は核局在不死化遺伝子を発現し続け(図1a)、且つ分化機能が特徴的な肝細胞特異的遺伝子を発現し続けることを実証した(図1b)。Ea1C−35細胞系の形態は以下に示す(図1c)。
薬剤代謝データ
両方の細胞系が、モデル基質の代謝に基づいて単層培養物中の、第I相(シトクロムP450)及び第II相共役反応を触媒し続ける。最も重要な第I相酵素の1つはCYP3A4であり、これは全薬剤の約50%の代謝を担う。CYP3A4の発現は、このP450の全体的発現を誘導又は阻害する可能性がある多剤摂取を含めた、多くの要因によって調節される可能性がある。したがって、薬剤の有効な治療用量は、CYP3A4の発現によって部分的には決定される。
CYP誘導物質を同定し順位付けするための不死化肝細胞の使用
2つの系の証拠は、不死化ヒト肝細胞を使用して、「誘導能力」に基づいてCYP3A4誘導物質を同定し順位付けすることができることを示す。第一に、表4に以下に示したように、Fa2N−4細胞をリファンピン(10μM)に曝すことによって、デキサメタソン(50μM)又はフェノバルビタール(1mM)などの弱性CYP3A4誘導物質で細胞を処理するより、多量の6β−OH−テストステロン代謝産物の生成がもたらされる。第二にイムノブロット分析は、それぞれの細胞系をリファンピン又はフェノバルビタールに48〜72時間曝すことによって、媒体処理した対照と比較してCYP3A4タンパク質の発現が増大したが;しかしながらリファンピンへの露出が、CYP3A4タンパク質のより増大した発現をもたらしたことを実証した。このデータは図2中に示す。
Fa2N−4及びEa1C−35細胞系による血漿タンパク質の発現
タンパク質バイオファクトリーと同様の不死化ヒト肝細胞の使用は、大量培養中に維持すると、細胞系が増殖し血漿タンパク質を分泌し続けることを必要とする。この問題に取り組むために、これらの細胞系による血漿タンパク質の発現を分析した。これらの細胞系の高分化性は、成体肝細胞の機能特異的血漿タンパク質のその連続的な分泌によってさらに支持される(図3)。培養培地は、60mmプレート又は回転容器に接種したFa2N−4及びEa1C−35細胞から採取し、ウエスタンブロット分析によって分析した。培地は限外濾過によって50倍に濃縮し、40μgの合計タンパク質をアルブミン以外レーン毎に充填した(10μgの合計タンパク質/レーン)。アルブミン、α−1−抗トリプシン、第VIII因子及び第IX因子に対するモノクローナル抗体又は親和性精製ポリクローナル抗体と共にブロットをインキュベートし、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した二次抗体を使用して眼に見える状態にし、次にDAB基質と共にインキュベートした。図3に以下に示したように、両方の細胞系がアルブミン、α−1−抗トリプシン、及び第IX因子を発現し続ける。第VIII因子の発現はさまざまであり、細胞系及び培養条件に大きく依存した。第IX因子のプロセシングにおいて不均一性が存在し、ヒト血漿由来のタンパク質においても観察された。
定量ELISA及びトリプシン阻害アッセイ
調整培地の全体的なトリプシン阻害活性は、主要なセリンプロテアーゼ阻害剤、α−1−抗トリプシン及びIαIp由来の活性を含む。1)トリプシンなどのプロテアーゼの阻害を測定するin vitroアッセイ、及び2)モノクローナル抗体69.31、ヒトIαIp)を特異的に認識するProthera Biologics(providence、Rhode Island)からのモノクローナル抗体を使用する競合ELISAをそれぞれ使用して、IαIpを機能的且つ定量的に測定することができる。トリプシン阻害アッセイを使用して、発色性トリプシン基質L−BAPA(N(α)−ベンゾイル−L−アルギニン−4−ニトロアニリド塩酸塩、Fluka Chemicals)を使用することによって、セリンプロテアーゼ阻害剤の生物学的活性を調べる。このアッセイは、L−BAPAの加水分解を阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤の能力に基づく。410nmにおけるΔ吸光度/分の比の低下によって、阻害を調べることができる。タンパク質1ug当たりの生物学的活性に基づき、比活性を計算した。肝細胞の細胞系Fa2N4及びEa1C35の調整培地を回収し、30kD断片を有するAmicon Ultra限外濾過装置(Millipore)を使用することによって50倍に濃縮した。調整培地の全体的なトリプシン阻害活性は、主要なセリンプロテアーゼ阻害剤、α−1−抗トリプシン及びIαIp由来の活性を含み、これらはウエスタンブロット(前を参照)及びELISAアッセイ(以下参照)によって検出されたように肝細胞の調整培地中に存在した。培地中のIαIpの量も競合ELISAにおいて測定した。ELISAは以下のように行った:96ウェルImmunolon−4プレート(Dynex、USA)は、精製IαIp(300ng)を50mMの炭酸塩バッファーpH9.6に溶かしたものでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。精製したヒト血漿由来のIαIpを1%ラット血清を含むPBSに希釈した一連の希釈液を使用して、標準曲線を確立した。培養培地中のIαIpレベルの定量分析用に、50μLの培地又は連続的に希釈したIαIpを、96ウェルプレートの個々のウェルに加えた。50μLのモノクローナル抗体69.31をそれぞれのウェルに加えた後、プレートは37℃で1時間インキュベートし、次に自動プレート洗浄装置(Labsystem)を使用して洗浄した。HRP結合ヤギ抗マウスIgG(ヒト吸収性)(Biosource、Camarillo、CA、USA)を37℃で1時間加えることによって、結合したモノクローナル抗体69.31を検出した。洗浄後、100μLの1−Step ABTS(Pierce、Rockford、IL、USA)をウェルに加え、405nmにおける吸光度をELISAプレートリーダー(BioTek)で測定した。それぞれのサンプルは三連で試験した。非調整培養培地は、基本対照として使用した。これらの結果は表5中に示す:
Fa2N−4及びEa1C−35細胞系における酵素誘導
シトクロムP450(CYP)及び関連薬剤代謝酵素(輸送体含む)の誘導は、臨床上有意な薬剤相互作用の十分に認められている原因、及び薬物動態学的耐性又は自己誘導(それによって薬剤がその独自の肝臓代謝を誘導するプロセス)の原因である(1,2)。近年の証拠は、幾つかの型の薬剤誘導型肝臓毒性の重要な決定因子としての酵素誘導を示す(3)。in vitroでの酵素誘導を評価するための指針は、Tuckerら(4)及びBjorssonら(5)によって略述されている。この2つの「一致した報告」は、新たな化学物質(NCE)及び薬剤候補の酵素誘導能力を評価するための選択−価値基準−の方法としての、ヒト肝細胞の初代培養を認めている。ヒト由来の試験系に基づくこのin vitro手法は、実験動物における試験に基づくin vivo手法より優れている、何故なら薬剤は、種特異的な形式で酵素誘導を引き起こすことが知られているからである(1)。実際、この実施例中に後で記載する試験で使用した2つの原型誘導物質、即ちオメプラゾール及びリファンピンはヒトCYP1A2及びCYP3A4の有効な誘導物質であるが、それらはラット又はマウスにおいて対応する酵素は誘導しない。ヒト肝細胞の初代培養物及びFa2N−4細胞において酵素誘導の試験を行うための基本手順は、図4のフローチャートに示す。
実施例8に関する参照文献
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細胞系Fa2N−4を使用する薬剤代謝酵素及びMDR1の誘導
シトクロムP450(CYP)を含めた薬剤代謝酵素、及び輸送体は、薬剤のクリアランスと関係がある。CYPは、酸化及びヒドロキシル化を含めた、さまざまな薬剤代謝反応を行う。薬剤代謝酵素及び輸送体と関係がある薬剤−薬剤相互作用は、有害反応及び有効性の消失の報告(Baciewiczら、1987;Spinaら、1996)によって関心が高まっている。薬剤開発中に、in vitroアッセイを使用して誘導物質を回避し、肝臓によって増大した薬剤のクリアランスによる薬剤−薬剤相互作用能力を特徴付けることができる。CYPは主に肝臓中の薬剤の代謝と関係がある。CYP3A遺伝子発現の誘導はリファンピン、フェノバルビタール、クロトリマゾール、及びデキサメタソンを含めたさまざまな市販の薬剤によって引き起こされ(Meunierら、2000;Sahiら、2000、Luoら、2002;Madanら、2003)、幾つかの一般的な薬剤−薬剤相互作用の根底を表す。CYP1A2は3−メチルコランスレン、β−ナフトフラボン、及びテトラクロロジベンゾジオキシンによって誘導可能である(Liら、1998;Breinholtら、1999;Meunierら、2000;Madanら、2003)。CYP2C9はリファンピン及びフェノバルビタールによって誘導することができるが、しかしながら、その誘導の程度はCYP3A4に関する誘導の程度より低い(Liら、1997;Madanら、2003)。UGT1Aファミリーの誘導物質には、リファンピン、クリシン、及びβ−ナフトフラボンがある(Liら、1997、Abidら、1997;Breinholtら、1999)。MDR1遺伝子産物P−糖タンパク質(P−gp)は、重要な薬剤の流出輸送体である。P−gpの誘導物質にはリファンピン、フェノバルビタール、クロトリマゾール、及びデキサメタソンがある(Schuetzら、1996;Geickら、2001;Sahiら、2003)。
化学物質
フェノバルビタール(5−エチル−5−フェニル−2,4,6−トリオキソヘキサヒドロピリミジン)、デキサメタソン(9−α−フルオロ−16−α−メチルプレドニソロン)、β−ナフトフラボン(5,6−ベンゾフラボン)、リファンピン(3−[4−メチルピペラジニルイミノメチル]リファマイシンSV)、クロトリマゾール(1−[o−クロロ−α,α−ジフェニルベンジル]−イミダゾール)、及び1−シクロヘキシル−3−(モルフォリノエチル)カルボジイミドメト−p−トルエンスルホン酸塩、テストステロン、6−ヒドロキシテストステロン、7−エトキシレゾルフィン、レゾルフィン、ヒドロコルチゾン、及びジクロフェナクはSigma(St.Louis、MO)から購入した。4’−ヒドロキシジクロフェナクはGentest(Bedford、MA)から購入した。[13C6]−4’−OH−ジクロフェナクは、Pfizerにおいて内部で製造された。
この細胞系は、12才のメスのドナーから単離し、前に記載したシミアンウイルス40のラージT抗原を用いたトランスフェクションによって不死化させた、ヒト肝細胞由来のものであった。Fa2N−4細胞(図17)はMultiCell Technologies(Warwick、RI)から得て、以下のように培養した。RNA分析用に、マルチウェルプレートは、2.75mMの1−シクロヘキシル−3−(モルフォリノエチル)カルボジイミドメト−p−トルエンスルホン酸塩及び4%(v/v)Vitrogen 100精製コラーゲン(Cohesion、Palo Alto、CA)を滅菌生理食塩水(0.9%のNaCl)に溶かしたものから構成される硬質コラーゲン複合体で事前にコーティングした。過剰なコラーゲンは、細胞を平板培養する前に除去した。酵素活性の分析用に、BiocoatのI型コラーゲンプレート(Becton−Dickinson、Bedford、MA)を使用した。100単位/mLのペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び10%ウシ胎児血清(GIBCO BRL、Grand Island、NY)を補ったMFE培地(MultiCell Technologies、Warwick、RI)中に、Fa2N−4細胞を集合状態で平板培養した。細胞接着(約3時間)後に、100単位/mLのペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを補った無血清MFE培地と、培地を交換した。37℃、二酸化炭素5%、及び相対湿度95%に設定したインキュベーター中に、細胞を保った。24時間毎に、100単位/mLのペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを補った新たな無血清MFE培地と、培地を交換した。平板培養後48時間で、薬剤を用いた細胞の処理を開始した。RNAの定量化用に、細胞を薬剤に48時間曝した。酵素活性の試験用に、細胞を薬剤に72時間曝した。Fa2N4細胞は図17に示す。MFE培地(MultiCell Technologies、Warwick、RI)中、96ウェルのBiocoatのI型コラーゲンプレート(Becton Dickinson、Bedford、MA)中に平板培養した、集合状態のFa2N−4細胞の位相差顕微鏡画像を、倍率200倍で図17に示す。
製造者(Qiagen、Valencia、CA)によって提供された使用説明書に従いミニRNeasyキットを使用して、細胞から全RNAを抽出した。RNA(100ng)は、製造者(Third Wave Technologies、Madison、WI)によって提供された使用説明書に従い、Invader(登録商標)RNAアッセイ試薬キットを使用して分析した。媒体処理と比較したサンプル中の高レベルのRNAに関する統計分析は、p<0.05が有意な差を示す、2−サンプルの不対のスチューデントのt検定を使用して行った。多数の処理(>2サンプル)と比較した高レベルのRNAに関する統計分析は、多数の誘導物質を順位序列付ける目的で、p<0.05が有意な差を示すANOVA分析を使用して行った。
CYP3A4。活性は、以下の変更を加えWoodら(1983)及びSonderfanら(1987;1988)によって記載されたのとほぼ同様に質量分析法によって、テストステロンからの6β−ヒドロキシテストステロン形成の程度を測定することによって決定した。試験薬剤は添加培地を除去することによって細胞から洗浄し、新たな培地と交換し、細胞は1時間インキュベートした。洗浄培地を除去した後、200μMのテストステロンを含む250μLのMFE培地を組織培養ウェルに加えることによって、反応を開始させた。30分で、等分試料をHPLC又はLC/MS/MSによって分析用に除去した。LC/MS/MS分析用に、等分試料は250ng/mlのヒドロコルチゾンで汚染した1体積のアセトニトリルと混合させた。質量分析法は、Perkin Elmer 200 HPLC系及びMicromass Quattro II検出器を用いて行った。サンプルを注入し、70:30メタノール:トリフルオロ酢酸0.02%(v/v)、0.20ml/分(isocratic)の移動相、及びKeystone Aquasil C18、100・2.1mm、5μm粒径カラム中で、エレクトロスプレー正イオンモードを使用してイオン化した。幾つかの試験は、以下のようにテストステロン代謝に関するHPLC−UVアッセイを使用した:200μlの培地を5μlの内標準(IS)溶液(20μg/mlプレドニソロン、アセトニトリル中)と混合させ、約50μlまで蒸発させた。次いでサンプル(20μl)を、Agilent Zorbax Eclipse XDB−C8カラム(4.6×150mm)及び254nmにおいてUV検出器を使用して、Agilent 1100 HPLC系に注入した。移動相Aは10mMリン酸アンモニウム、水中からなり、移動相Bは100%アセトニトリルからなっていた。最初の状態は35%Bで3分間、65%Bに2分間増大し、次いで10分間、35%Bに戻し、合計作業時間は15分であった。保持時間はそれぞれ6−β−ヒドロキシ−テストステロン、プレドニソロン、及びテストステロンに関して2.8分、3.0分、及び7.0分であった。6−β−ヒドロキシテストステロンに関する標準曲線は、25ng/mlから少なくとも1000ng/mlまで直線的であった。6−β−ヒドロキシ−テストステロンに関するピーク領域はISに標準化し、DMSO処理細胞からの倍数の変化として報告した。
薬剤代謝酵素及び薬剤輸送体の知られている誘導物質に対するFa2N−4細胞の誘導応答
図18中に例示するように、知られている誘導物質であるリファンピン(CYP2C9、CYP3A4、UGT1A、及びMDR1を誘導する)、フェノバルビタール(CYP2C9、CYP3A4、及びMDR1を誘導する)、デキサメタソン(CYP3A4及びMDR1を誘導する)、並びにβ−ナフトフラボン(CYP1A2及びUGT1Aを誘導する)を使用して、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、UGT1A、及びMDR1を含めた幾つかの終点を調べるのにFa2N−4細胞は有用である。図18中には、Fa2N−4細胞におけるCYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、UGT1A、及びMDR1転写物の誘導を示す。Fa2N−4細胞は24−ウェルプレートに平板培養し、0.1%のDMSO媒体(白棒)、10μMのリファンピン(赤棒)、1000μMのフェノバルビタール(青棒)、50μMのデキサメタソン(緑棒)、及び10μMのβ−ナフトフラボン(黒棒)に48時間曝した。転写物のレベルは、処理した細胞から単離した全RNAから定量化した。プロットは、4連サンプルのデータからの平均±SDを表す。星印は、媒体対照処理に対する転写物の統計上有意な増大を示す(スチューデントのt検定、p<0.05)。CYP3A4誘導物質は、ANOVA分析を使用すると(p<0.05)互いに有意に異なっていた。転写物の増大は、全ての陽性対照に関して観察することができる。媒体対照と比較すると、10μMのβ−ナフトフラボンで処理した後にCYP1A2転写物は15倍増大したが、他の誘導物質では有意に増大することはなかった。CYP2C9転写物は10μMのリファンピンでは3.8倍増大し、1mMのフェノバルビタールでは2.6倍増大し、50μMのデキサメタソン、10μMのβ−ナフトフラボンを用いた処理によっては誘導されなかった。CYP3A4転写物は10μMのリファンピンでは17倍増大し、1mMのフェノバルビタールでは9.2倍増大し、50μMのデキサメタソンでは1.3倍増大した。UGT1A転写物は10μMのβ−ナフトフラボンでは2.1倍増大し、1mMのフェノバルビタール、50μMのデキサメタソンを用いた処理によっては誘導されなかった。UGT1Aのリファンピン誘導は、統計上有意ではなかった(p=0.08)。MDR1転写物は10μMのリファンピンでは3.1倍増大し、1mMのフェノバルビタールでは2.3倍増大し、50μMのデキサメタソンでは1.3倍増大し、10μMのβ−ナフトフラボンによるMDR1誘導はなかった。表8は、初代肝細胞の公開データと比較してmRNAの誘導倍数の増大として表した、3つのCYPに関するFa2N−4細胞における誘導データを要約する。
それぞれ10μMのリファンピン及び50μMのデキサメタソンによる6−β−ヒドロキシテストステロンの形成の増大によって評価すると、媒体処理対照と比較して(図19A)、CYP3A4活性は8.9倍及び2.1倍増大した。図19には、シトクロム−450酵素活性による誘導の測定を示す。0.1%のDMSO媒体(VEH)又は誘導物質に72時間曝した後の、Fa2N−4細胞におけるCYP3A4、CYP2C9、及びCYP1A2酵素活性の誘導を示す。12−ウェルプレート形式を使用して試験を行った。データは、形成された代謝産物/合計Fa2N−4タンパク質のミリグラム/親化合物とのインキュベーション1分当たりの酵素活性を表す。データは、白棒及び黒棒によって示す二連のアッセイからのものである。(A)媒体、10μMのリファンピン(RIF)、及び50μMのデキサメタソン(DEX)を用いて誘導した、細胞中のテストステロン代謝産物6−β−ヒドロキシテストステロンの形成によるCYP3A4活性の測定。(B)媒体、10μMのリファンピン(RIF)、及び1000μMのフェノバルビタール(PB)を用いて誘導した、細胞中のジクロフェナク代謝産物4’−ヒドロキシジクロフェナクの形成によるCYP2C9活性の測定。(C)媒体又は50μMのβ−ナフトフラボン(BNF)を用いて誘導した、細胞中の7−エトキシレゾルフィンのO−脱アルキル化によるCYP1A2活性の測定。CYP2C9活性の評価に関する4’−ヒドロキシジクロフェナクの形成は、10μMのリファンピン及び1mMのフェノバルビタールを用いた処理に関して約2倍増大した(図19B)。CYP1A2に関するERODアッセイ中の倍数の変化は、10μMのβ−ナフトフラボンを用いると27倍であった(図19C)。
多数回継代したFa2N−4細胞を、CYP3A4誘導に関して試験した。図21は、弱い応答性を有するCYP3A4誘導物質(50μMのデキサメタソン)、及び強い応答性を示すCYP3A4誘導物質(10μMのリファンピン)に対する、多数回継代したFa2N−4細胞の応答性を示す。図21では、さまざまな継代のFa2N−4細胞は24−ウェルプレートに平板培養し、0.1%のDMSO媒体(白棒)、50μMのデキサメタソン(縞模様棒)、及び10μMのリファンピン(黒棒)に曝した。(A)CYP3A4転写物のレベルは、単離した全RNAから定量化した。プロットは、4連サンプルのデータからの平均±SDを表す。(B)CYP3A4活性は、テストステロン代謝産物6−β−ヒドロキシテストステロンの形成によって測定した。プロットは、2連サンプルの平均を表す。全ての化合物が、媒体対照処理に対する転写物の統計上有意な増大を示した(スチューデントのt検定、p<0.05)。デキサメタソンを用いた処理によって、第21代及び第36代でそれぞれ1.6倍及び1.5倍、CYP3A4転写物が増大した。10μMのリファンピンを用いた処理によって、第21代及び第36代でそれぞれ17倍及び16倍、CYP3A4転写物が増大した(図21A)。CYP3A4酵素活性は、第28代及び第36代でそれぞれ、デキサメタソンに関して2.1倍及び2.0倍、10μMのリファンピンに関して8.9倍及び4.9倍増大した(図21B)。
図22は、さまざまなマルチウェルプレート形式を比較する。図22中には、10μMのリファンピン(黒棒)に48時間曝した後のFa2N−4細胞におけるCYP3A4転写物の誘導を、媒体(白棒)と比較して示す。データは、示したそれぞれのマルチウェルプレート形式で行った試験からのものである。プロットは、4連サンプルのデータからの平均±SDを表す。全ての化合物が、媒体対照処理に対する転写物の統計上有意な増大を示した(スチューデントのt検定、p<0.05)。プレート形式とは無関係に、Fa2N−4細胞はリファンピンに対して相当なCYP3A4誘導応答を示す。CYP3A4転写物の誘導倍数の変化は、24−ウェルプレートを使用すると17.1倍であり、24−ウェルプレートを使用すると6.6倍であり、96−ウェルプレートを使用すると5.7倍であった。
Fa2N−4細胞は、知られている誘導物質に応答して、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、UGT1A、及びMDR1のmRNAを誘導する能力を有している。終点としてCYP3A4転写物を使用することによって、我々は有効性に従い誘導物質を順位付けるアッセイの能力を実証しており、初代ヒト肝細胞において以前に観察されたのと同様の(Liら、1997;Sahiら、2000)、リファンピンに関する用量応答性を実証している。誘導物質と非誘導物質を区別することに加えて、このアッセイはCYP3A4及びCYP1A2などの幾つかの終点に関して広い動的範囲を有し、誘導能力に関する順位序列付けを可能にする。CYP3A4誘導物質に関する同一の低い能力(リファンピン>フェノバルビタール>デキサメタソン)が、mRNA及び酵素活性の終点を使用する、初代ヒト肝細胞における試験に関する文献中に以前に報告されている(Luoら、2002)。Fa2N−4細胞におけるmRNA誘導を使用する我々の結果は、Madanら(2003)による発表と十分一致し、彼らは処理済み細胞由来のミクロソーム調製物中の酵素活性を測定することによって、培養した初代ヒト肝細胞におけるCYP1A2、CYP2C9、及びCYP3A4に関する原型誘導物質の影響を報告した。不死化細胞系Fa2N−4及びmRNA測定を使用する我々の誘導結果は、初代ヒト肝細胞を使用するMadanら(2003)による発表と十分一致する。Madanらは幾つかの異なるドナー由来の肝臓を使用し、我々の試験中と同じ原型誘導物質で処理した後の、幾つかのCYPに対する酵素活性を測定した。媒体対照に対する誘導倍数として表したリファンピン及びフェノバルビタールの、CYP3A4誘導能力に関する順位序列付けは、両方の試験で同じであった。CYP3A4より低い程度であったがCYP2C9も誘導され、CYP1A2は両方の系で最も高い応答性を有していた。初代ヒト肝細胞を使用する他の試験(Sahiら、2000)は、活性アッセイを使用して、CYP3A4誘導におけるリファンピンに関するEC50を報告した。これらの結果も、Fa2N−4細胞及びmRNA測定を使用する、我々の独自のEC50結果と十分一致する。
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不死化肝細胞の細胞系をシトクロムP450の誘導物質に曝した後の、mRNA転写物の発現に関する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の分析
Ea1C−35及びFa2N−4と表す、2つの不死化ヒト肝細胞の細胞系にRT−PCR分析を行った。細胞はI型コラーゲンをコーティングした皿上で平板培養し、MultiCellの専有培地中に保った。培養細胞はリファンピン(10μM)で3日間、或いは等体積のDMSO(例えば対照)で処理した。
Fa2N4及びEa1C35細胞系による血漿タンパク質の発現に関する条件
二次元ゲル電気泳動分析を使用して、Fa2N4及びEa1C35細胞系の分泌したタンパク質を分離した。InvitrogenのZOOM IPGRunnerシステムを使用して、タンパク質の最初のIEF分離は固定pH勾配ストリップ(3〜10のpH範囲)を使用して行い、次に4〜12%のトリス−グリシンSDS−PAGEを使用して二次元分離を行った。両方の細胞系において、タンパク質の多数のスポットを、治療用タンパク質の考えられる候補として同定することができた(図31A.Fa2N4;31B、Ea1C35)。2次元ゲルの分離の後、Ea1C35細胞系の分泌したタンパク質はニトロセルロース上に移し、抗第IX因子抗体を使用するウエスタンブロット分析を行った。70kDの分子量及びpI6.5〜7.0を有する反応性タンパク質を検出した(図31C)。
治療用血漿タンパク質を生成及び発現する能力
免疫反応性のある治療用血漿タンパク質を正確に生成する我々のFa2N−4細胞系の能力を、免疫反応性のあるヒト成長ホルモン(hGH)の生成と共に例示した。一過性トランスフェクションの前の日に、10%のNBCS−MFE培地を使用して6ウェルNuncプレート中に、ウェル当たり0.5〜0.8×106個の細胞の密度でFa2N−4細胞を平板培養した。トランスフェクションの日に、細胞を1回洗浄して血清を除去し、hGHの完全cDNAを含むCMV系プラスミドは、Invitrogen Lipofectamine Plus又はQiagen Effecteneトランスフェクション試薬キットを使用してFa2N−4細胞に一過的にトランスフェクトした。製造者のプロトコルに従い、トランスフェクションを行った。
EA1C−35及びFa2N−4細胞系の免疫学的表現型の特徴付け
Ea1C−35(継代26回)とFa2N−4(継代30回)細胞系の両方を、異なる肝細胞又は胆管マーカー及びSV40不死化遺伝子に対する一群の抗体を使用する、間接的な免疫蛍光分析によって表現型を決定した。この分析からの結果は、以下の表19中に要約する。
Claims (61)
- 不死化ヒト肝細胞を使用してタンパク質を生成する方法であって、
(a)タンパク質をコードし発現することができるDNAを含む不死化ヒト肝細胞を用意するステップ、
(b)前記タンパク質をコードする1つ又は複数の遺伝子が、前記タンパク質が前記不死化肝細胞中で生成されプロセシングされるように発現されるような条件下で、前記不死化肝細胞を培養するステップ、及び
(c)前記不死化肝細胞から前記プロセシングされたタンパク質を単離するステップ
を含み、必要な場合プロセシングされグリコシル化されるように前記タンパク質を発現させ、そのin vivo機能がその単離後実質的に保たれる方法。 - 前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成される血漿タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されないタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がヒト肝細胞によって通常生成されるタンパク質のムテインである、請求項3に記載の方法。
- 前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記治療用タンパク質が治療用血漿タンパク質である、請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質が第VIII因子、第IX因子、ヒト成長ホルモン(hGH)、α−1−抗トリプシン、及び増殖因子からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記タンパク質が第VIII因子のムテイン、第IX因子のムテイン、ヒト成長ホルモンのムテイン、α−1−抗トリプシンのムテイン、及び増殖因子のムテインからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記タンパク質がIαIpタンパク質複合体である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンII、C−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンII、C−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のムテインである、請求項1に記載の方法。
- 肝細胞中に本来存在する遺伝子によってタンパク質を発現させ、前記タンパク質をコードする本来存在する遺伝子の発現が高レベルのプロモーターを前記肝細胞中に導入することによって増強される、請求項1に記載の方法。
- (1)発現させるタンパク質、発現させるタンパク質のサブユニット、又は発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子、及び(2)前記遺伝子の転写に影響を与える少なくとも1つの制御要素であって、前記遺伝子と動作可能に連結した制御要素を含む1つ又は複数の組換えベクターを使用することによって、前記発現させるタンパク質、前記発現させるタンパク質のサブユニット、又は前記発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子の多数のコピーを導入することによって発現を増強させる、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えベクターがSV40由来ベクター、ネズミポリオーマ由来ベクター、BKウイルス由来ベクター、エプスタインバーウイルス由来ベクター、アデノウイルス由来ベクター、アデノ関連ウイルス由来ベクター、バキュロウイルス由来ベクター、ヘルペスウイルス由来ベクター、レンチウイルス由来ベクター、レトロウイルス由来ベクター、アルファウイルス由来ベクター、及びワクシニアウイルス由来ベクターからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記ベクターが1つ又は複数のレポーター遺伝子を取り込む、請求項14に記載の方法。
- 前記発現したタンパク質が細胞から周囲の培養培地に分泌される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がグリコシル化される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質が翻訳後にプロセシングされる、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質が切断可能なタグと融合した形で発現される、請求項1に記載の方法。
- 前記切断可能なタグがグルタチオンS−トランスフェラーゼ、MalEマルトース結合タンパク質、及びポリヒスチジン配列からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記タンパク質が少なくとも2つの異なるサブユニットを含み、前記不死化肝細胞を少なくとも2つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトし、それぞれのベクターが(1)前記タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする少なくとも1つの遺伝子を含むDNA;及び前記タンパク質のサブユニットをコードする少なくとも1つの遺伝子をコードする前記DNAと動作可能に連結した少なくとも1つの制御要素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記不死化ヒト肝細胞をウイルスにより不死化させる、請求項1に記載の方法。
- 実質的に純粋なシミアンウイルス(SV40)のDNAを用いた形質転換又はトランスフェクションによって前記肝細胞を不死化させる、請求項22に記載の方法。
- 前記実質的に純粋なSV40のDNAがラージT抗原及びスモールt抗原(タグ)をコードする、請求項23に記載の方法。
- 前記不死化ヒト肝細胞が低温保存した初代ヒト肝細胞に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記肝細胞が、腫瘍抑制遺伝子をコードする実質的に純粋なDNAを前記肝細胞から単離し精製することができるようにDNAをコードする腫瘍抑制遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記肝細胞が、Rbをコードする実質的に純粋なDNAを前記肝細胞から単離し精製することができるようにRbをコードするDNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記肝細胞が、p53をコードする実質的に純粋なDNAを前記肝細胞から単離し精製することができるようにp53をコードするDNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記肝細胞が非腫瘍形成性であり、無血清培地中に保たれる能力を有し、血漿タンパク質を生成する、請求項1に記載の方法。
- 前記肝細胞がFa2N−4細胞系の肝細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記肝細胞がEa1C−35細胞系の肝細胞である、請求項1に記載の方法。
- ヒト肝細胞以外の真核細胞を使用してIαIpタンパク質複合体を生成する方法であって、
(a)IαIpタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードし発現することができるDNAを含むヒト肝細胞以外の真核細胞を用意するステップであって、(1)IαIpタンパク質複合体の一部であるタンパク質前駆体の少なくとも1つの遺伝子を含むDNA及び(2)少なくとも1つの前駆体遺伝子をコードする前記DNAと動作可能に連結して前記前駆体遺伝子の発現を増強させる、少なくとも1つの制御要素を含む少なくとも1つのベクターを用いて、前記真核細胞が形質転換又はトランスフェクトされているステップ、
(b)IαIp複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子が、IαIp複合体が生成されるように発現されるような条件下で、前記形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞を培養するステップ、及び
(c)前記形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞から前記発現されたIαIpタンパク質複合体を単離するステップ
を含む方法。 - 前記真核細胞がCHO細胞、COS細胞、及び酵母菌細胞からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
- 2つのベクター:(1)遺伝子H3及びAMBPを含む第一のベクター;及び(2)遺伝子H2及びH1を含む第二のベクターを用いて、前記肝細胞を形質転換又はトランスフェクトする、請求項32に記載の方法。
- タンパク質をコードし発現することができるDNAを含む不死化ヒト肝細胞であって、(1)タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を含むDNA及び(2)前記タンパク質をコードするDNAと動作可能に連結して前記タンパク質の発現を増強させる少なくとも1つの制御要素を含む少なくとも1つのベクターを用いて、形質転換又はトランスフェクトされている不死化ヒト肝細胞。
- 前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されるタンパク質である、請求項35に記載の細胞。
- 前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されないタンパク質である、請求項35に記載の細胞。
- 前記タンパク質がヒト肝細胞によって通常生成されるタンパク質のムテインである、請求項37に記載の細胞。
- 前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項35に記載の細胞。
- 前記治療用タンパク質が治療用血漿タンパク質である、請求項39に記載の細胞。
- 前記タンパク質が第VIII因子、第IX因子、ヒト成長ホルモン(hGH)、α−1−抗トリプシン、及び増殖因子からなる群から選択される治療用血漿タンパク質である、請求項40に記載の細胞。
- 前記タンパク質が第VIII因子のムテイン、第IX因子のムテイン、ヒト成長ホルモンのムテイン、α−1−抗トリプシンのムテイン、及び増殖因子のムテインからなる群から選択される血漿タンパク質である、請求項40に記載の細胞。
- 前記血漿タンパク質がIαIpタンパク質複合体である、請求項35に記載の細胞。
- 前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンII、C−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質である、請求項35に記載の細胞。
- 前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンII、C−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のムテインである、請求項45に記載の細胞。
- 疾患又は状態を治療する方法であって、
(a)請求項1に記載の方法に従って生成される活性タンパク質を用意するステップ、及び
(b)前記疾患又は状態に罹患している患者に前記疾患又は状態を治療する治療活性量の前記活性タンパク質を投与するステップ
を含む方法。 - 前記疾患又は状態が肝臓に影響を与える疾患又は状態である、請求項46に記載の方法。
- 前記肝臓に影響を与える疾患又は状態が敗血症、癌、肝炎、及び肝不全からなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
- 前記疾患又は状態が肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態である、請求項46に記載の方法。
- 前記疾患又は状態が癌、関節炎症、及び関節炎からなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
- 疾患又は状態を治療するための医薬組成物であって、
(a)疾患又は状態を治療するのに治療上有効な量の真核細胞によって生成されたIαIpタンパク質複合体、及び
(b)薬剤として許容される担体
を含む医薬組成物。 - 前記疾患又は状態が肝臓に影響を与える疾患又は状態である、請求項51に記載の医薬組成物。
- 前記肝臓に影響を与える疾患又は状態が敗血症、癌、肝炎、及び肝不全からなる群から選択される、請求項52に記載の医薬組成物。
- 前記疾患又は状態が肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態である、請求項51に記載の医薬組成物。
- 前記疾患又は状態が癌、関節炎症、及び関節炎からなる群から選択される、請求項54に記載の医薬組成物。
- 疾患又は状態を治療する方法であって、
(a)請求項1に記載の方法によって生成される活性のある血漿タンパク質を用意するステップ、及び
(b)前記疾患又は状態に罹患している患者に前記疾患又は状態を治療するための治療上有効な量の前記活性のある血漿タンパク質を投与するステップ
を含む方法。 - 前記疾患又は状態が肝臓に影響を与える疾患又は状態である、請求項56に記載の方法。
- 前記肝臓に影響を与える疾患又は状態が敗血症、癌、肝炎、及び肝不全からなる群から選択される、請求項57に記載の方法。
- 前記疾患又は状態が肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態である、請求項56に記載の方法。
- 前記疾患又は状態が癌、関節炎症、及び関節炎からなる群から選択される、請求項59に記載の方法。
- 前記活性のある血漿タンパク質が第VIII因子、第IX因子、ヒト成長ホルモン(hGH)、α−1−抗トリプシン、及び増殖因子からなる群から選択される、請求項56に記載の方法。
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