JP2007522437A - 生物系における作用、特に予期せぬ治療効果又は毒作用、を発見及び定量するための、化合物及び化合物の組合せのハイスループットスクリーニング方法 - Google Patents

生物系における作用、特に予期せぬ治療効果又は毒作用、を発見及び定量するための、化合物及び化合物の組合せのハイスループットスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2007522437A
JP2007522437A JP2006541461A JP2006541461A JP2007522437A JP 2007522437 A JP2007522437 A JP 2007522437A JP 2006541461 A JP2006541461 A JP 2006541461A JP 2006541461 A JP2006541461 A JP 2006541461A JP 2007522437 A JP2007522437 A JP 2007522437A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compounds
labeled
isotope
molecule
synthesis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006541461A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2007522437A5 (ja
Inventor
ヘラースタイン，マーク，ケー．
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of JP2007522437A publication Critical patent/JP2007522437A/ja
Publication of JP2007522437A5 publication Critical patent/JP2007522437A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本発明は、予期せぬ又は意外な生物学的作用を検出するための、生物系における化合物のハイスループットスクリーニングを可能にする。本発明はまた、承認薬に関する新たな指標のスクリーニング、検出及び確認を可能にする。化合物の毒作用のスクリーニング及び検出も本発明の方法を用いることによって実行することができる。この方法は、疾患に関与すると考えられる代謝経路を介した流速を表すように、同位体標識した基質を生物系に投与することによって標識を分子に組み込むことを含む。化合物に曝露された生物系と曝露されていない生物系との比較は、代謝経路を介した流速への化合物の作用を表す。化合物の組合せ又は混合物は、同様に、予期せぬ又は意外な生物学的作用（相乗作用を含む）を検出するために系統的にスクリーニングすることができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は米国仮特許出願第60/525,261号（出願日2003年11月25日）の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
発明の分野
本発明は、生物系における作用について、化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物（すなわち、新規又は既知の化学物質及び新規又は既知の生物学的因子を含む薬剤及び薬剤候補）をスクリーニングする方法に関する。開示する方法は、薬剤作用の標的として、代謝経路（合成及び崩壊又は分子のプールへの投入若しくは分子のプールからの除去速度）を介して分子の流速をin vivoで測定かつ定量する。開示する方法は、ハイスループット、大規模の、自動化の適用が可能である。この方法は特に、創薬、薬剤開発及び薬剤承認（DDDA）の間に、薬剤又は薬剤候補の予期せぬ又は偶然の作用を検出及び確立することに適用可能である。本明細書に開示する方法は、第2治療クレーム（「新規用途」又は「新規指標（indications）」）を確立すること及び既知の化合物及び新規化合物の毒性を判定するのに特に適切である。
発明の背景
創薬、薬剤開発及び薬剤承認（DDDA）の現代のシステムは、非常に具体的でありかつ標的を対象とするものである。このシステムは目的とする生化学的作用及び分子作用のモデル上に構築される。新規化合物（すなわち、化学物質及び生物学的因子）は、目的とする治療標的へのその作用に基づいて同定され、最適化されかつ評価される。これらの目的とする治療標的は典型的には、目的の疾患プロセスに関与すると考えられるタンパク質又は遺伝子である（薬剤標的）。他の細胞高分子も薬剤標的としてますます重要になっている（例えばmRNA）。
薬剤標的に対する作用は、ハイスループットスクリーニング（HTS）アッセイ（これはタンパク質若しくは遺伝子標的の活性又は状態を測定する）の使用によって、大量の化合物に対して評価される。薬剤標的への潜在的に有用な活性を示す化合物はリード化合物（「薬剤リード」としても知られる）と呼ばれる。一旦同定されれば、薬剤リードはフィルター処理され、標的とされる疾患プロセス（最終的には臨床的エンドポイント）に対するその活性に基づいて選択される。FDA承認は最終的には単一の十分に定義された臨床的指標（特定の疾患で予め同定され、定義されかつ試験される）に対して与えられる。
したがって、薬剤リードは、目的とする作用のモデル上に構築されたプロトコールの非常に強制的なセットとの関連で発見され、かつ開発される。薬剤標的は具体的でありかつ発見の第一歩のために予め同定される。つまり、薬剤リードのFDA承認は、ランダムな種々の内科的疾患を有する様々な人に化合物を、該薬剤が該内科的疾患を有する患者を助けるか否かを確かめるために投与することによっては得られず、特定の疾患状態において予め定義された効果の明確な枠内で生じる。
この現代のDDDAアプローチは重大な欠点を有する。第一に、ある疾患に関与すると仮定された分子標的に対するHTSアッセイによって「ヒット」を同定することは、この疾患に対する活性を実際には確立又は証明しない。疾患に対する活性は依然として独立に確認されるべきである。実際、薬剤リードの本当のin vivo活性及び有効性は、HTS分子アッセイによって不確かに又は誤認的に評価され得る。第2に、疾患の生理学的モデルに対する薬剤リードのこれ以後の認証は、しばしば現在の薬剤調査の主要な治療標的である慢性症状に関してかなり非効率的なままであり、その結果、フィルター処理の工程で、DDDAシステムの下流妨害（downstream roadblock）に導く。第3に、薬剤の偶然の毒作用はこのアプローチによって同定されない。第4に、偶然の又は第2治療作用（すなわちスクリーニングされた特異的な分子標的への効果以外の他の作用）もこのアプローチによっては効率的に同定されず、その結果、製薬会社が既に開発に時間及び資金を投資している化合物の他の潜在的な治療上の用途を検出及び発見をし損なう。第5に、併用療法の疾患プロセスへの相乗効果（疾患経路において、異なる生化学的工程に作用する化合物間の相互作用によって生じる）は、疾患経路において同時にある工程を測定するだけのスクリーニングアプローチによっては検出できない。
したがって、特有の目的とする分子作用に関するスクリーニングを介して発見した化合物の偶然の作用及び機能的重要性の問題に対する理想的な解決策は明らかである。すなわち、化合物、化合物の組合せ及び化合物の混合物の、偶然の作用及び機能的結果を測定及び同定する系統的方法である。したがって、機能的に関連のある生物学的プロセスに対する化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物の偶然の作用の、効率的なハイスループット発見及び確認のための系統的手順の有用性は、DDDAプロセス全体を根本的に改変するだろう。目的のプロセスに作用する化合物、化合物の組合せ及び化合物の混合物をスクリーニングしかつ比較する方法に加えて、そのような方法が本明細書に開示される。
発明の概要
本発明は、1以上の化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物に対する曝露に応答して、目的の1以上の代謝経路内の分子流速を測定かつ定量する方法に関し、この方法は1以上の化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物によって誘起される予期せぬ若しくは意外な作用（又はその両方）を研究者が発見することを可能にする。本発明の方法は、ハイスループットスクリーニングアッセイを含む。本発明の一実施形態では、予期せぬ又は意外な作用は治療作用である。本発明の別の実施形態では、予期せぬ又は意外な作用は毒作用である。本発明の方法は、1以上の代謝経路の代謝流速を改変する化合物の同定を可能にする。
本発明においては、同位体標識が目的とする少なくとも1つの標的代謝経路における1以上の標的分子に組み込まれるのに十分な期間で、1以上の同位体標識した基質（すなわち、代謝前駆体）が細胞、組織又は生物に投与される。2以上の同位体標識が投与されてもよい。1以上の標的分子中の、同位体含量及び/若しくはパターン又は同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度の測定は、目的とする1以上の経路における分子流速を算出することで実施される。1以上の化合物が生物系に投与され（曝露すること）、分子流速は曝露の存在及び不在下で測定される。
本発明の別の実施形態では、分子流速は特定の用量の又は特定の用量範囲の1以上の化合物に応じて測定される。本発明の別の実施形態では、分子流速は化合物の組合せへの曝露に応じて測定される。本発明のさらに別の実施形態では、分子流速は化合物の混合物への曝露に応じて測定される。
1以上の化合物は、新規化学物質、化学物質薬剤リード（すなわち、「小分子」薬剤リード）、又は既知の化学物質薬剤（すなわち「小分子」薬剤）、例えばPhysician’s Desk Reference(PDR)又はメルクインデックスに列挙される、既に承認された薬剤（例えばFDA又は米国外のこれに相当する他の政府機関によって承認された薬剤）であってよい。1以上の化合物はまた、新規生物学的因子又は既知の生物学的因子（既に承認された生物学的因子薬剤を含む）であり得る。1以上の化合物は、ランダムに又は具体的な生化学的論拠（1以上の疾患の分子病態における仮定の役割に関する）に基づいて選択することができる。
本発明は、曝露された生物系の細胞、組織又は生物から測定した分子流速と、曝露されていない生物系の細胞、組織又は生物から測定した分子流速との比較を可能にする。曝露型の分子流速及び非曝露型の分子流速間の差異が同定され、次いでこの情報が、1以上の化合物（又は化合物の組合せ又は化合物の混合物）が、曝露された細胞、組織又は生物における目的とする1以上の経路に対する代謝作用を誘起するか否かを判定するのに使用される。曝露された細胞、組織又は生物に対する、化合物（又は化合物の組合せ又は化合物の混合物）の代謝作用は、（その経路内の化合物及び分子の流動について最も一般的に知られる生化学的知識及び概念に基づいて）予期されないか若しくは意外であってもよいし、又は予期若しくは予想されてもよい。1以上の化合物（又は化合物の組合せ又は化合物の混合物）は哺乳動物に投与することができ、同一種の暴露されていない哺乳動物から算出された分子流速に対して分子流速が算出かつ評価される。哺乳動物はヒトであってもよい。
本発明の別の実施形態では、分子流速は疾患の分子病態に関与する1以上の代謝経路で測定される。別の実施形態では、1以上の代謝経路は疾患の原因であるか又は疾患の開始、進行、活性、病理的帰結、症状若しくは重篤性に寄与する。
本発明の別の実施形態では、1以上の代謝経路からの分子流速が同時に測定される。別の実施形態では、分子流速は適切な同位体標識技術を用いて測定される。安定な同位体標識には、生体分子中に存在する元素の特定の重同位体を含み得る（2H、13C、15N、18O、33S、34S等）。別の実施形態では、分子流速は放射性同位体標識技術を用いて測定される。放射性同位体標識には3H、14C、35S、125I、131Iが含まれ得る。
同位体標識した前駆体には、これに限定されるものではないが、2H20、H2 18O、3H2O、15NH3、13CO2、H13C03、2H標識したアミノ酸、13C標識したアミノ酸、15N標識したアミノ酸、18O標識したアミノ酸、34S又は33S標識したアミノ酸、3H標識したアミノ酸及び14C標識したアミノ酸が含まれる。
同位体基質は、2H2O、2H-グルコース、2H標識したアミノ酸、13C標識したアミノ酸、2H標識した有機分子、13C標識した有機分子及び15N標識した有機分子標識水から選択し得る。同位体基質は、標識水（例えば2H2O、H2 18O又は3H2O）であってもよい。標識水は2H2Oであり得る。
安定同位体標識基質は、1以上の目的とする代謝経路の1以上の分子に組み込まれる。こうして、分子流速は特定の時間間隔にわたって標的分子中の同位体含量及び/若しくはパターン又は同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度を、例えば質量分析法を用いて測定することによって決定することができ、1以上の目的とする代謝経路内の分子流速の測定を当該技術分野で公知の分析法及び算出法の使用によって可能にする。
あるいは、放射性標識した基質の使用が本発明における使用に考慮され、その際、放射性標識した基質は1以上の目的とする代謝経路の1以上の分子に組み込まれる。こうして、分子流速は、1以上の目的とする代謝経路内の目的の標的分子の放射線及び/又は放射活性を、当該技術分野で周知の技術（シンチレーション計測等）を用いて測定することによって決定することができる。次いで、1以上の目的とする代謝経路内の分子流速が当該技術分野で公知の方法を用いて算出される。
本発明の別の実施形態では、単離された同位体摂動型分子（isotopically perturbed molecules）が提供される（同位体摂動型分子は1以上の同位体を含む）。単離された同位体摂動型分子は、本明細書に記載される標識方法の生成物である。単離された同位体摂動型分子は、当該技術分野で公知のサンプリング技術によって収集され、適当な分析手法を用いて分析される。本発明の一実施形態では、単離された同位体摂動型分子は1以上の安定同位体から構成される。別の実施形態では、単離された同位体摂動型分子は1以上の放射性同位体から構成される。
本発明のさらに別の実施形態では、同位体標識した前駆体及びそれらを使用するための指示書を含む1以上のキットが提供される。キットは安定同位体で標識した前駆体若しくは放射性同位体で標識した前駆体又はその両方を含み得る。安定同位体で標識した前駆体及び放射性同位体で標識した前駆体は1つのキットで提供されてもよく、又はこれらが2以上のキットに分けられて提供されてもよい。キットはさらに、同位体標識した前駆体を投与するための1以上の手段をさらに含んでもよい。キットはまた、被験者からサンプルを収集するための1以上の手段を含んでもよい。
本発明のさらに別の実施形態では、本発明の方法から作製されたデータを含む、1以上の情報記憶装置が提供される。このデータは分析されても、部分的に分析されても、又は分析されなくてもよい。このデータは、記憶及び表示のために、紙媒体、プラスチック媒体、磁性媒体、光学媒体又は他の媒体に転写されてもよい。
本発明のさらに別の実施形態では、本発明の方法によって同定されかつ少なくとも部分的に特徴付けられた1以上の化合物、化合物の組み合わせ又は化合物の混合物が意図される。
発明の詳細な説明
本発明は、生物系における化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物（例えば、新規化学物質、既に承認された小分子化合物を含む既知の薬剤、新規生物学的因子、又は既に承認された生物学的因子を含む既知の生物学的因子）の作用（特に偶然の又は予期せぬ作用）を、目的の代謝経路内の分子流速（すなわち、合成及び崩壊又は投入及び除去速度）を測定することによって検出する方法に関する。標的の代謝経路内の分子流速は、化合物の作用を確立しかつ定量するためのバイオマーカーとして使用される。同位体標識した基質分子は生物系の1以上の細胞、組織又は生物に投与されるか又は接触される（すなわち、1以上の細胞、組織又は生物を同位体標識した基質分子に曝露することによって、該1以上の細胞、組織又は生物への暴露を構成する）。次いで、目的とする1以上の代謝経路内の分子流速を決定するために、目的とする1以上の代謝経路内の1以上の標的分子の、同位体含量及び/若しくはパターン又は同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度が、質量分析法の使用によって最適に測定される。
化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物も1以上の細胞、組織又は生物に投与又は接触される。次いで、1以上の細胞、組織又は生物における、目的とする1以上の経路を介した分子流速が測定され、その化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物に曝露されていない1以上の細胞、組織又は生物における該経路を介した分子流速と比較される。既知の薬剤（小分子薬剤及び生物学的因子を含む）の組合せ又は混合物を含む、化合物の組合せ又は混合物が、特定の組合せの相乗作用又は拮抗作用を同定しかつ定量するために、目的の経路を介した分子流速に対するその効果について試験される。このように、化合物又は化合物の組合せの偶然の作用を同定するための又は生物学的重要性を確認するための、系統的なハイスループット法が提供され、その結果、化合物の単一の対象の分子作用を測定するのみであるDDDAの現在の制限を克服する。したがって、出願人は、完全にアセンブルした任意の生体系で、薬剤効果（予期せぬ若しくは偶然の、又は生物学的重要性を確認すること）の測定を可能にする方法（すなわち、生物系において同時かつ独立に、複数の代謝経路における分子流速を測定する能力）を見出した。
本発明の方法は、化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物のハイスループットスクリーニングを可能にし、その結果、他の作用について開発又は承認された治療薬の全体クラスの第2作用又は予期せぬ作用の系統的発見を可能にする（すなわち、これによって既知の薬剤又は作用物質の新規使用のためにPhysician Desk Reference又はメルクインデックスを「検索する（mining）」方法、「薬剤再創出（drug repositioning）」又は「薬剤再目的化（drug repurposing）」と称するプロセスを提供する）。本発明の方法は、化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物の予期せぬ毒作用の発見も可能にする。
本発明は創薬、薬剤開発及び薬剤承認、並びにその後の患者の医学的診断、臨床管理及び疾患の予防での適用がある。
I．一般的技術
本発明の実行には、特に示唆がない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学（これらは当業者の技術的範囲内である）の従来技術が採用されよう。そのような技術はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(Sambrookら, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait,編, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis,編, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney,編, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture ( J.P. Mather及びP.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths,及びD.G. Newell編., 1993-8) J. Wiley及びSons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及びC.C. Blackwell編); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及びM.P. Calos編, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら編, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullisら編, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coliganら編, 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及びSons, 1999);並びにHellerstein及びNeeseによるMass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic and experimental considerations(Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39) E1146-E1162, 1999)等の文献で十分に説明される。さらに、特に断りがない限り、市販のアッセイキット及び試薬を用いる手順は、典型的には、製造者に定義されるプロトコールに従って使用されよう。
II．定義
特に定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語、記号及び他の科学的専門用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解される意味を有するものとする。一部の場合では、共通して理解された意味を有する用語が明確に及び/又は容易に参照できるように本明細書で定義され、本明細書でそのような定義を含むことにより、必然的に当該技術分野で一般的に理解されているものを超えて実質的な差異を表すように解釈されるべきではない。本明細書で記載又は引用される技術及び手順は、当業者によって一般的に十分理解され、従来の方法論（例えばHellerstein及びNeeseによるMass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic and experimental considerations(Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39) E1146-E1162, 1999等）を用いて共通して使用される。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順が、特に断りがない限り、製造者が定義するプロトコール及び/又はパラメーターに従って一般的に実施される。
「分子流速」は、細胞、組織又は生物内の分子の合成及び/又は崩壊の速度を指す。「分子流速」はまた、分子のプールへの分子の投入(input)又は該プールからの分子の除去をも指し、したがって分子の該プールへの流入及び該プールからの流出と同義である。
「代謝経路」は、生物系における2以上の生化学的ステップの任意の結合した系を指し、その最終結果は一分子又は複数の分子の化学的、空間的又は物理的変換である。代謝経路はこの経路を含む生化学ステップを介した分子の方向及び流れによって定義される。代謝経路内の分子は任意の生化学的クラスのものであり得、例えば非限定的に、脂質、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、核酸、ポリヌクレオチド、ポルフィリン、グリコサミノグリカン、糖脂質、中間代謝物質、無機物、イオン等が含まれる。
「代謝経路を介した流速」は、規定の代謝経路を介した分子変換の速度を指す。経路を介した流速の単位は時間毎の化学的質量である（例えば１分当たりのモル、1時間当たりのグラム）。代謝経路を介した流速は、最適には明確に定義された生化学的出発点から明確に定義された生化学的終点までの変換速度を指し、目的とする規定の代謝経路中の全ての段階が含まれる。
「同位体」は、同数の陽子を含み、それ故同じ元素であるが、異なる中性子数を有する原子を指す（例えば1Hに対して2H又はD）。
「アイソトポログ（isotopologue）」は、同位体ホモログ又は同一の元素組成及び化学組成を有するが、同位体含量が異なる分子種を指す（例えば、上記例ではCH3NH2に対してCH3NHD）。アイソトポログはその同位体組成によって定義されるため、各アイソトポログは固有の正確な質量を有するが、固有の構造を有しなくてもよい。アイソトポログは通常、同位体の分子上の位置が異なる同位体異性体（アイソトポマー）のファミリーからなる（例えば、CH3NHD及びCH2DNH2は同一のアイソトポログであるが異なるアイソトポマーである）。
「同位体標識水」又は「重水」は、水素又は酸素のいずれかの1以上の特定の重同位体で標識した水を含む。同位体標識水の具体的な例には2H2O、3H2O及びH2 18Oが含まれる。
「作用」にはある化合物によって生物系で誘導される任意の生物学的プロセス又は生物学的事象が含まれる。
「予期せぬ又は偶然の作用」には、ある化合物の設計又は開発の結果判定法として（例えば、酵素標的のハイスループットスクリーニングアッセイ、酵素活性部位のコンピューターシミュレーションモデル、又は改変型プロセスのin vivoでの生理学的モデルにおいて）以前は使用されなかった、この化合物によって生物系で誘導される任意の生物学的プロセス又は生物学的事象が含まれ、したがって、説得力のある生化学的証拠から、合理的論拠に基づいて明確に予期されておらず、特定の化合物への曝露から期待される作用として教示されないものである。
「化合物」は、潜在的な治療薬として投与され、承認され若しくは試験中であるか、又は既知の治療薬である、化学物質又は生物学的因子を含む物質の任意の組成物を記載すべく、本明細書で使用される。したがって、この用語は以下に定義される化学物質及び生物学的因子を包含する。
「化学物質」は、新規（すなわち「新規化学物質」又はNCE）であろうと既知（例えば、小分子薬剤リード又は既に承認された小分子薬剤）であろうと、潜在的治療薬（薬剤）としてのその使用を見出すという目標に向かって、生物学的または生化学的活性についてこれをスクリーニングするために、1以上の細胞、組織又は生物に投与される任意の化学物質を含む。
本明細書で使用される「生物学的因子」は、潜在的な治療薬（薬剤）としてのその使用を見出すという目標に向かって、生物学的又は生化学的活性についてこれをスクリーニングするために、1以上の細胞、組織又は生物に投与される、生物系によって産生される任意の化合物を指す。生物学的因子の例には、これに限定されるものではないが、抗体、ホルモン、酵素、酵素補助因子、ペプチド、分泌タンパク質、細胞内タンパク質、膜結合タンパク質、脂質、リン脂質、炭水化物、脂肪酸、アミノ酸、核酸（デオキシリボ核酸及びリボ核酸を含む）、ステロイド等が含まれる。生物学的因子には、後に（例えば実験室技術によって）改変され、修飾され、最適化されている生物系によって産生される化合物も含まれる。
「薬剤リード」又は「薬剤候補」は、本明細書で、潜在的な治療薬（薬剤）として前臨床的に又は臨床的に評価されつつある化合物として定義される。
「既知の薬剤」又は「既知の作用物質」は、米国でヒト又は動物における薬剤としての治療上の使用が承認されている化合物を指す。
「ハイスループットスクリーニング」は、非常に多くの化合物の、潜在的な作用に関する迅速かつ効率的なスクリーニングを意味する。
「生物系」には、これに限定されるものではないが、細胞、細胞系、組織、疾患の動物モデル、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、他の愛玩動物、マウス、ラット、非ヒト霊長類及びヒトが含まれる。
「生物学的サンプル」は、細胞、組織、生物又は個体から取得される任意のサンプルを包含する。この定義は、侵襲的手法（例えば外科手術、直視下生検、内視鏡生検、及び無視できない危険を伴う他の手順）又は低侵襲的若しくは非侵襲的アプローチ（例えば、尿収集、採血、針吸引、及び最小のリスク、不快感若しくは労力を伴う他の手順）によるサンプリングを介して生物から入手しやすい、血液及び生体起源の他の液体サンプルを包含する。この定義はまた、入手後に、試薬による処理、可溶化又は特定の成分（タンパク質若しくは有機代謝産物等）の富化等によって、多少なりとも操作されているサンプルも含む。「生物学的サンプル」という用語は、臨床サンプル（血清、血漿、他の生体液又は組織サンプル等）をも包含し、培養中の細胞、細胞上清及び細胞溶解物も含む。
「生体液」は、これに限定されるものではないが、尿、血液、間質液、浮腫液、唾液、涙液、炎症性滲出液、滑液、膿瘍、蓄膿症若しくは他の感染した体液、脳脊髄液、汗、気道内分泌液（痰）、精液、排泄物、胆汁、腸内分泌液又は他の生体液を指す。
「正確な質量」とは、分子式の全ての同位体の正確な質量を加算することによって算出した質量を指す（例えば、CH3NHDについては32.04847）。
「見掛けの質量」とは、ある分子の正確な質量を四捨五入することによって取得される整数の質量を指す。
「質量アイソトポマー」は、同位体組成というよりむしろ見掛けの質量に基づいてグループ分けした同位体異性体のファミリーを指す。質量アイソトポマーは、アイソトポログとは異なり、異なる同位体組成の分子を含み得る（例えばCH3NHD、13CH3NH2、CH3 15NH2は同一の質量アイソトポマーの一種であるが、異なるアイソトポログである）。操作上の用語において、質量アイソトポマーは質量分析計によって分析されていないアイソトポログのファミリーである。四重極質量分析計に関して、これは典型的には質量アイソトポマーが見掛けの質量を共有するアイソトポログのファミリーであることを指す。したがって、アイソトポログCH3NH2及びCH3NHDは見掛けの質量の点で異なり、異なる質量アイソトポマーとして区別されるが、アイソトポログCH3NHD、CH2DNH2、13CH3NH2及びCH3 15NH2は全て同一の見掛けの質量であり、それ故、同一の質量アイソトポマーである。したがって、各質量アイソトポマーは典型的には2以上のアイソトポログからなり、かつ2以上の正確な質量を有する。アイソトポログと質量アイソトポマーとの間の差異は実際に有用である。というのも、異なる全てのアイソトポログは四重極質量分析計を用いて分析されず、より高い質量分析をもたらす質量分析計を用いても分析され得ないため、質量分析データからの算出はアイソトポログよりもむしろ豊富な質量アイソトポマーで行われるべきだからである。質量が最小の質量アイソトポマーはM0として表され、大部分の有機分子に関して、これは12C、1H、16O、14N等の全てを含む種である。他の質量アイソトポマーは、M0とのその質量差異によって区別される（M1、M2等）。所与の質量アイソトポマーに関して、その分子内の同位体の配置又は位置は明記されず、変化してもよい（すなわち「位置アイソトポマー」は区別されない）。
「質量アイソトポマーエンベロープ」は、モニターされる各分子またはイオン断片と会合したファミリーを含む、質量アイソトポマーのセットを指す。
「同位体含量」は、天然の（すなわち、同位体標識した前駆体サブユニットの投与又は接触前の）分子又は分子集団中の含量と相対的な、分子又は分子集団中の同位体の含量を指す。「同位体富化」という用語は、本明細書で同位体含量と同義的に使用される。
「同位体パターン」は、分子又は分子集団内の同位体標識の内部関係（例えば、異なる同位体含量を有する分子種の相対的な割合、分子構造内の異なる化学的座位に同位体標識を有する分子の相対的な割合、又は分子中の同位体の絶対含量というよりむしろ他の態様の内部パターン）を指す。
「質量アイソトポマーパターン」は、ある分子の質量アイソトポマーの存在量のヒストグラムを指す。慣習的に、このパターンは、全ての存在量を最も豊富な質量アイソトポマーの量に対して正規化した場合の相対量として表される；最も豊富なアイソトポマーを100％という。しかし、質量アイソトポマー分布解析（MIDA）等の確率分析を含む用途に好適な形態は、それぞれの種が全体の存在量に寄与する画分が使用される場合には、割合又は画分量である。「同位体パターン」という用語は、「質量アイソトポマーパターン」と同義的に使用し得る。
「モノアイソトープ質量」は、1H、12C、14N、16O、32S等の全てを含む分子種の正確な質量を指す。C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br及びIからなるアイソトポログに関して、最小質量を有するアイソトポログの同位体組成は固有かつ明白である。なぜならこれらの元素の最も豊富な同位体も質量が最小だからである。モノアイソトピック質量はm0と略記され、他の質量アイソトポマーの質量はm0からのその質量差異によって同定される（m1、m2等）。
「同位体摂動型（isotopically perturbed）」は、本来的に存在量の低い同位体が過剰に（富化）又は不足（枯渇）して存在するかどうか、天然に最も共通して見られる分布と異なる同位体の分布を有する元素又は分子の明確な組込みから生じる元素又は分子の状態を指す。
「目的の分子」は、非限定的に、生物系の代謝経路内に存在するアミノ酸、炭水化物、脂肪酸、ペプチド、糖、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、グリコサミノグリカン、ポリペプチド又はタンパク質を含む、任意の分子（ポリマー及び/又はモノマー）を指す。
「モノマー」は、ポリマーの合成中に結合し、かつポリマー中に2度以上存在する化学的ユニットを指す。
「ポリマー」は、モノマーの2個以上の繰返しから合成される分子及びモノマーの2個以上を含む分子を指す。
「タンパク質」は、アミノ酸のポリマーを指す。本明細書で使用される「タンパク質」は、ペプチド等の短いポリマーのみならず、長いアミノ酸ポリマーをも意味し得る。
「アミノ酸」は、アミノ基（すなわちNH2）を含む任意の両性有機酸を指す。この用語は20種の一般的な（当該技術分野でしばしば「標準的な」と称され、時に「天然の」と称される）アミノ酸及び一般的ではない（当該技術分野でしばしば「標準的でない」アミノ酸と称される）アミノ酸を包含する。20種の一般的なアミノ酸の例には、α位置にアミノ基を有し、一般的に式RCH-(NH2)-COOHを有するアルファ-アミノ酸（又はα-アミノ酸）を含む。α-アミノ酸はタンパク質のモノマー構成ブロックであり、加水分解を介してタンパク質から取得し得る。標準的でないアミノ酸の例は、非限定的にγ-アミノ酪酸、ドーパミン、ヒスタミン、チロキシン、シトルリン、オルニチン、ホモシステイン及びS-アデノシルメチオニンを含む。
「脂質」は、脂肪と、不水溶性であること及び非極性（又は有機）溶媒（アルコール、エーテル、クロロホルム、ベンゼン等）で抽出可能であることによって特徴付けられる脂肪様物質（fatlike substance）との、任意の不均質な群を指す。これらは全て主要な構成要素として脂肪族炭化水素を含む。体内で容易に貯蔵され、エネルギー源として資する脂質は、細胞構造の重要な構成要素であり、他の生物学的機能に役立つ。脂質は、これに限定されるものではないが、脂肪酸、中性脂肪（例えば、トリアシルグリセロール）、ろう及びステロイド（例えばコレステロール）が含まれる。複合脂質は糖脂質、リポタンパク質及びリン脂質を含む。
「脂肪酸」は、長鎖炭化水素側鎖基を有するカルボン酸である。これらは有機的な一塩基酸からなり、メチル基のアルコール、アルデヒド、そしてその後の酸への酸化によって炭化水素から誘導される。
「DNA」は、二本鎖又は一本鎖形態（弛緩状又はスーパーコイル状のいずれか）の、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）のポリマー形態を指す。この用語は、この分子の一次構造と二次構造のみを指し、特定の三次形態に限定しない。したがって、この用語は、とりわけ線状DNA分子（例えば制限断片）、ウイルス、プラスミド及び染色体中に見られる一本鎖及び二本鎖DNAを含む。この用語は、4種の塩基であるアデニン、グアニン、チミン又はシトシンを含む分子、及び当該技術分野で公知の塩基アナログを含む分子を捉える。
「核酸」配列はDNA又はRNA配列を指す。この用語は、DNA及びRNAの任意の公知の塩基アナログ（非限定的に、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクエオシン(mannosylqueosine)、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン（oxybutoxosine）、プソイドウラシル、クエオシン(queosine)、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン(queosine)、2-チオシトシン及び2,6-ジアミノプリン等）を含む配列を捉える。
「炭水化物」は、炭素、酸素及び水素の任意の化合物（一般式Cx(H2O)y）を指し、糖（単糖及び二糖）及びその誘導体、並びにデンプン及びセルロース等の多糖を含む。
「糖」は任意の甘く、透明で単純な炭水化物（多価アルコールのアルデヒド又はケトン誘導体である）の一般名を指す。糖は主にスクロースなどの二糖及びフルクトース又はグルコースなどの単糖であり、全て希釈アルコール又は水に溶け、純粋な形態で白色である。この用語は、単糖、二糖、三糖、異糖又は多糖（単糖類残基からなる）を包含する。単糖はグルコース（D-グルコース及びL-グルコースの両方）、マンノース、フルクトース、ガラクトース及び糖誘導体（これに限定されるものではないが、N-アセチルムラミン酸、N-アセチルノイラミン酸及び他のシアル酸、N-アセチルマンノサミン、グルクロン酸、グルコサミン等を含む）を含む。多糖は二糖（ショ糖等）、マルトース及びラクトース並びにより長鎖の糖分子（デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン等）を含む。「オリゴ糖」は、共有結合した少数の単糖モノマーからなる分子を指す。
「グリコサミノグリカン」は、アミノ基糖を含む二糖の反復ユニット（その少なくとも1つは負に帯電した側鎖基（カルボン酸塩又はスルフェート）を有する）から構成される長い非分岐鎖のネットワークからなるポリマーを指す。グリコサミノグリカンの例には、これに限定されるものではないがヒアルロナート（D-グルクロン酸-N-アセチル-D-グルコサミン：最大1000万MW）、コンドロイチン硫酸（D-グルクロン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン-4又は6-硫酸）、デルマタン硫酸（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン）、ケラタン硫酸（D-ガラクトース-N-アセチル-D-グルコサミン硫酸）、及びヘパラン硫酸（D-グルクロン酸又はL-イズロン酸-N-アセチル-D-グルコサミン）が含まれる。「ムコ多糖」はグリコサミノグリカンと同義的な用語である。
「糖タンパク質」は、1以上の炭水化物分子が共有結合したタンパク質又はポリペプチドを指す。糖タンパク質には、プロテオグリカン、及び多くの（大部分ではないが）重要な膜内在性タンパク質（外側リーフレット（exterior leaflet）を介して細胞外空間へ突き出ている）、並びに多くの（大部分ではないが）分泌タンパク質が含まれる。
「プロテオグリカン」は、タンパク質とグリコサミノグリカンとを含む高分子の様々な群のいずれかを指す。「ムコタンパク質」はプロテオグリカンと同義的な用語である。
「同位体標識した基質」には、生物系の目的の分子に組み込まれ得る任意の同位体標識型前駆体分子が含まれる。同位体標識した基質の例には、非限定的に2H2O、3H2O、H2 18O、2H-グルコース、2H標識したアミノ酸、3H標識したアミノ酸、2H標識した有機分子、3H標識した有機分子、13C標識した有機分子、14C標識した有機分子、13CO2、14CO2、15N標識した有機分子及び15NH3が含まれる。
「標識した糖」は、1以上の安定同位体又は放射性同位体を組み込んだ糖を指す。本明細書で使用されるように、「標識した糖」という用語は、「同位体標識した糖」と同義的に使用される。
「標識した脂肪酸」は、1以上の安定同位体又は放射性同位体を組み込んだ脂肪酸を指す。本明細書で使用されるように、「標識した脂肪酸」という用語は、「同位体標識した脂肪酸」と同義的に使用される。
「標識水」又は「重水」には、水素又は酸素のいずれかの特定の重同位体の1以上で標識した水が含まれる。標識水の具体例には、これに限定されるものではないが2H2O、3H2O及びH2 18Oが含まれる。本明細書で使用されるように、「標識水」は「同位体標識した水」と同義的に使用される。
「重水素化水」は1以上の2H同位体を組み込んだ水を指す。
「標識したグルコース」は1以上の安定同位体又は放射性同位体で標識したグルコースを指す。標識したグルコース又は2H標識したグルコースの具体例には、これに限定されるものではないが、[6,6-2H2]グルコース、[1-2H1]グルコース及び[1,2,3,4,5,6-2H7]グルコースが含まれる。
「投与する(される)」には、生物系が化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物に曝露されることが含まれる。上記曝露は、非限定的に、動物又は他の高等生物における局所適用、経口摂取、吸入、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射及び動脈内注射であり得る。
「第2治療作用」は、化合物、化合物の組合せまたは化合物の混合物に対する予期せぬ又は偶然の生物学的応答を指す。大抵、化合物に対する生物学的応答は、既に確立されているか若しくは明確に予期され、又は経験に基づくデータ若しくは他の情報源から合理的に予測することができ、又は化合物を発見及び/若しくは開発するための基礎として使用した。本発明に関連して、第2治療作用は、明確に確立若しくは予期されていないか、または既存の経験に基づくデータ若しくは他の情報源から明確に予期し得ないものである。かかる第2治療作用は、他の治療作用が既に検出され又は確立されている場合にはこの化合物の「新規用途」又は「新規指標（indication）」を構成し得る。
「毒作用」は生物系のある化合物に対する副作用を指す。本発明に関連して、毒作用は化合物に応じて予期しないか又は意外なもの、及び化合物の治療用途及び/又は潜在的使用に影響し得るものである。
「個体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
「哺乳動物」は、哺乳網の任意のメンバーを指し、非限定的にヒト及び非ヒト霊長類（チンパンジー並びに他の類人猿及びサル種）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ等の家畜；イヌ及びネコ等の家庭動物；マウス、ラット及びモルモット等の齧歯動物を含む実験動物等を含む。この用語は、特定の年齢又は性別を示さない。したがって、成体及び新生の対象、並びに胎児がオスであるかメスであるかに関らず含まれるものとする。
創薬及び薬剤開発との関連で、「少なくとも部分的に同定された」とは、化合物の少なくとも1つの臨床的に関連する薬理学的特徴が本発明の1以上の方法を用いて同定されていることを指す。この特徴は所望のもの（例えば、疾患プロセスに寄与する代謝経路を介した分子流速の増加又は減少、疾患に関連する代謝経路の活性を改変するシグナル伝達経路又は細胞表面レセプターの改変、酵素の活性化の阻害等）であり得る。あるいは、化合物の薬理学的特徴は所望でないもの（例えば、1以上の毒作用の産生）であり得る。当業者に周知の、非常に多くの所望の及び所望でない化合物の特徴が存在し、それぞれ開発中の特定の化合物及び標的の疾患との関連で調査されよう。もちろん、薬剤開発経路に沿う特定の道標決定点を支持するのに十分な幾つかの特徴（所望な若しくは所望でない又はその両方）が同定されている場合には、化合物は少なくとも部分的な同定以上であり得る。かかる道標には、これに限定されるものではないが、in vitroからin vivoへの移行のための臨床前決定、IND提出前の成功/失敗（go/no go）の決定、フェーズIからフェーズIIへの移行、フェーズIIaからフェーズIIbへの移行、フェーズIIからフェーズIIIへの移行、NDA提出、及びマーケティングのためのFDA承認が含まれる。したがって、「少なくとも部分的に」同定されたには、創薬/薬剤開発プロセスにおいて化合物を評価する際に有用な1以上の薬理学的特徴の同定が含まれる。薬理学者若しくは医師又は他の研究者は、その治療指数を確立するために、化合物の同定された所望の及び所望でない特徴の全て又は一部を評価し得る。これは当該技術分野で周知の手順を用いて達成し得る。
本発明との関連で「化合物を製造すること」には、生成物としてある化合物を作製するために使用される当業者に周知の任意の手法が含まれる。生成物は最終的に承認される治療薬に限定されず、DDDAプロセスにおける非最終化合物、例えば、プロドラッグ又は化学的中間物（すなわち更なる最適化のためにアウトライセンスされているリード化合物）を構成してもよく、その製造は商業的必要性に応じている。製造プロセスには、これに限定されるものではないが、医薬の化学合成（すなわち有機合成化学）、コンビナトリアルケミストリー、ハイブリドーマモノクローナル抗体の作出等のバイオテクノロジー方法、組み換えDNA技術、及び当業者に周知の他の技術が含まれる。かかる生成物は、組合せ生成物の一部分であろうと単一の生成物であろうと、治療上の使用のために市販される最終薬剤、治療上の使用のために市販される組合せ生成物の成分、又は最終的な薬剤製品の開発に使用される任意の中間生成物であり得る。
III．発明の方法
本発明は、生物系における化合物の作用、特に偶然の又は意外な作用を、生物系内の目的とする1以上の代謝経路の1以上の分子の分子流速を測定することによって検出する方法に関する。第1に、少なくとも1つの同位体標識した基質分子が、1以上の標的代謝経路内の目的とする1以上の標的分子にin vivoで組み込まれるのに十分な期間で、1以上の細胞、組織又は生物に投与される。一実施形態では、同位体標識した基質分子は1以上の安定同位体（すなわち非放射性同位体）で標識される。別の実施形態では、同位体標識した基質分子は1以上の放射性同位体で標識される。さらに別の実施形態では、安定同位体及び放射性同位体の両方が、1以上の同位体標識基質分子を標識するために使用される。
目的の標的分子は、生化学的単離手順によって、1以上の細胞、組織又は生物から取得され、質量分析法、液体シンチレーションによって、又は当該技術分野で公知の他の手法によって同定される。目的とする同定された各分子に対応する質量アイソトポマーエンベロープ内のイオンの相対存在量及び絶対存在量（すなわち分子の同位体含量及び/若しくはパターン又は分子の同位体含量及び/若しくはパターンの変化の速度）が定量される。一実施形態では、目的とする同定された各分子に対応する質量アイソトポマーエンベロープ内のイオンの相対存在量及び絶対存在量は質量分析法によって定量される。次いで、目的とする標的代謝経路を介した分子流速が当該技術分野で公知でありかつ下記で議論される式を用いて算出される。目的とする標的代謝経路を介した分子流速は、1以上の化合物、化合物の組合せ若しくは化合物の混合物への曝露の存在下若しくは不在下で比較されるか、又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物への異なるレベルでの曝露に応じて比較される。
A．同位体標識した前駆体の投与
本発明の方法の第1ステップとして、同位体標識した前駆体が投与される。
１．同位体標識した前駆体分子の投与
1以上の同位体標識した基質の投与様式は、同位体標識した基質の吸収性及び各化合物が標的化する特定の生合成プールに応じて変化し得る。前駆体は生物、植物及び動物（ヒトを含む）へin vivo分析のために直接投与され得る。さらに、前駆体はin vitroで生細胞又はex vivoで組織若しくは器官に投与され得る。生細胞の具体的な型には肝細胞、脂肪細胞、筋細胞、繊維芽細胞、ニューロン、膵臓β細胞、腸上皮細胞、白血球、リンパ球、赤血球、微生物細胞、並びにin vitroで生存及び機能を維持し得る他の任意の細胞型が含まれる。
一般的に、適当な投与様式は、生合成プール内に及び/又はそのようなプールを供給する貯蔵器官中に少なくとも一時的な期間で定常状態レベルの前駆体をもたらすものである。投与の血管内経路又は経口経路が上記前駆体を生物（ヒトを含む）に投与するために一般的に使用される。他の投与経路（皮下投与又は筋肉内投与等）も、随意的に徐放性前駆体組成物、製剤又は技術と併用される際には適当である。注射用の組成物は一般的には滅菌の医薬品賦形剤中で調製される。
a．標識した前駆体分子
(1)同位体標識
分子流速を測定する際の第1ステップは、1以上の同位体標識した前駆体分子を1以上の細胞、組織又は生物に投与することを含む。同位体標識した前駆体分子は、安定同位体又は放射性同位体を含み得る。本発明の方法に従って使用することができる同位体標識には、これに限定されるものではないが2H、13C、15N、18O、3H、14C、35S、32P、125I、131I又は有機体システムに存在する元素の他の同位体が含まれる。これらの同位体及び他の同位体は、本発明の使用に想定される全てのクラスの化学物質（すなわち前駆体分子）に適切である。かかる前駆体分子には、これに限定されるものではないが、アミノ酸前駆体、タンパク質前駆体、脂質前駆体、炭水化物前駆体、核酸前駆体、ポルフィリン前駆体、グリコサミノグリカン前駆体及びプロテオグリカン前駆体（下記のそれぞれの例を参照）が含まれる。
一実施形態では、同位体標識は2Hである。
(2)前駆体分子（同位体標識した基質）
前駆体分子は、生物系の代謝経路をin vivoで通過することによって目的の分子内に組み込まれる同位体標識を有する任意の分子であり得る。使用し得る前駆体分子は、非限定的にH2O；CO2；NH3；アセチルCoA(コレステロール、脂肪酸を生じる);リボ核酸(RNAを生じる)；デオキシリボ核酸(DNAを生じる)；グルコース(グリコーゲンを生じる)；アミノ酸(ペプチド/タンパク質を生じる)；ホスホエノールピルビン酸(グルコース/UDP-グルコースを生じる);及びグリシン/スクシナート(ポルフィリン誘導体を生じる)を含む。同位体標識は、本明細書に開示される全ての前駆体分子を修飾して同位体標識した前駆体分子を形成させるために使用し得る。
完全な前駆体分子が代謝経路内の目的とする1以上の分子内に組み込まれ得る。あるいは、前駆体分子の一部が目的とする1以上の分子内に組み込まれ得る。
1以上の同位体標識した基質（すなわち1以上の前駆体分子）が投与される個体は哺乳動物であり得る。一つの変形では、哺乳動物は齧歯動物（ラット若しくはマウス）、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌ又はブタであり得る。哺乳動物は野生型であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は操作された動物（これに限定されるものではないが、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物又は遺伝子ノックイン動物を含む）であり得る。一実施形態では、哺乳動物は健康であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は疾患又は病状を有し得る。疾患または病状を有する哺乳動物は、先天性の疾患若しくは病状又は後天性の疾患若しくは病状を有し得る。先天性の疾患若しくは病状又は後天性の疾患若しくは病状のいずれかを有する哺乳動物の例は当業者に周知である。
さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得る。
i．タンパク質前駆体
タンパク質前駆体分子は当該技術分野で公知の任意のタンパク質前駆体分子であり得る。これらの前駆体分子はアミノ酸、CO2、NH3、グルコース、ラクテート、H2O、アセテート及び脂肪酸であり得る。
同位体標識は、生体分子中に存在する元素の特定の重同位体（2H、13C、15N、18O、33S、34S）を含んでもよく、又は生体分子中に存在する元素の他の同位体（3H、14C、35S、125I若しくは131I）を含んでもよい。
タンパク質の前駆体分子は1以上のアミノ酸を含み得る。この前駆体は任意のアミノ酸であり得る。この前駆体分子は一つの又は複数の重水素化アミノ酸であり得る。この前駆体分子は1以上の、13C-リシン、15N-ヒスチジン、13C-セリン、13C-グリシン、2H-ロイシン、15N-グリシン、13C-ロイシン、2H5-ヒスチジン及び任意の重水素化アミノ酸であり得る。一例として、同位体標識したタンパク質前駆体には、これに限定されるものではないが、2H20、H2 18O、15NH3、13CO2、H13C03、2H標識したアミノ酸、13C標識したアミノ酸、15N標識したアミノ酸、18O標識したアミノ酸、33S若しくは34S標識したアミノ酸、3H2O、3H標識したアミノ酸並びに14C標識したアミノ酸が含まれる。標識したアミノ酸は、例えば標識されていないアミノ酸で希釈されずに又は希釈されて投与され得る。同位体標識した全ての前駆体は、例えばCambridge Isotope Labs (Andover, MA)から購入し得る。
タンパク質前駆体分子はまた、翻訳後又は翻訳前に修飾されるアミノ酸の任意の前駆体を含み得る。これらの前駆体には、これに限定されるものではないが、メチル化の前駆体（グリシン、セリン又はH2O等）；ヒドロキシル化の前駆体（H2O又はO2等）；リン酸化の前駆体（ホスフェート、H2O又はO2等）；プレニル化の前駆体（脂肪酸、アセテート、H2O、エタノール、ケトン体、グルコース又はフルクトース）；カルボキシル化の前駆体（CO2、O2、H2O又はグルコース）；アセチル化の前駆体（アセテート、エタノール、グルコース、フルクトース、ラクテート、アラニン、H2O、CO2又はO2等）；並びに当該技術分野で公知の他の翻訳前又は翻訳後修飾が含まれる。
遊離アミノ酸に存在する標識化の程度は実験的に測定してもよいし、又はアミノ酸中の標識部位の数に基づいて評価してもよい。例えば、水素同位体を標識として用いる際には、遊離アミノ酸のC-H結合、又はより具体的にはtRNA-アミノ酸に存在する標識化が、体内水中の2H2Oへの曝露中に同定され得る。各非必須アミノ酸中のC-H結合の総数は公知である（例えばアラニンは4つ、グリシンは2つ等）。
タンパク質の前駆体分子は水であり得る。C-H結合の水素原子は、タンパク質のO-H及びN-H結合が水溶液中で不安定であるため、2H2Oからのタンパク質合成を測定するのに有用なアミノ酸の水素原子である。したがって、2H2Oからの2H標識の、O-H又はN-H結合への交換は、上述されるように遊離アミノ酸からのタンパク質の合成なく生じる。C-H結合は、特定の酵素で触媒される中間の代謝反応の間に、H2Oから遊離アミノ酸への組込みを経る。したがって、2H2O投与後のタンパク質結合アミノ酸のC-H結合中の2H標識の存在は、このタンパク質が2H2O曝露の期間中に遊離形態であったアミノ酸からアセンブルされたことを指す（すなわち、タンパク質が新たに合成されることを指す）。分析的に、使用されるアミノ酸誘導体は全てのC-H結合を含まなければならないが、全ての潜在的な汚染N-H及びO-H結合を取り除かなければならない。
体内水からの水素原子は遊離アミノ酸に組み込まれ得る。標識水（すなわち、2H2O又は3H2O）由来の2H又は3Hは、中間の代謝反応を介して細胞中で遊離アミノ酸に入ることができるが、2H又は3Hはペプチド結合中に存在するか又は運搬RNAに結合しているアミノ酸に入ることはできない。遊離の必須アミノ酸は、早急な可逆的アミノ基転移反応を介して、体内水由来の単一の水素原子をα炭素C-H結合へ組み込み得る。遊離の非必須アミノ酸は、大量の代謝交換可能なC-H結合を含むため、新たに合成されたタンパク質において、2H2O又は3H2Oからの1分子当たりのより高い同位体富化を示すことが当然に予想される。
当業者は、体内水に由来する標識した水素原子が他の生化学経路を介して他のアミノ酸に組み込まれ得ることを理解するだろう。例えば、水由来の水素原子が、クエン酸回路中の前駆体α-ケトグルタル酸の合成を介してグルタミン酸に組み込まれ得ることは当該技術分野で公知である。グルタミン酸は順にグルタミン、プロリン及びアルギニンの生化学的前駆体であることが知られる。別の例として、体内水由来の水素原子は翻訳後修飾されたアミノ酸（3-メチル-ヒスチジンのメチル基、ヒドロキシプロリン又はヒドロキシリシンのヒドロキシル基等）に組み込まれ得る。他のアミノ酸合成経路は当業者に公知である。
酸素原子（H2 18O）も酵素触媒反応を介してアミノ酸に組み込まれ得る。例えばアミノ酸のカルボン酸部分への酸素交換が酵素触媒反応中に起こり得る。標識した酸素のアミノ酸への組込みは当業者に公知である。酸素原子も酵素触媒反応を介して18O2からアミノ酸に組み込まれ得る（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン又は他の翻訳後修飾されたアミノ酸を含む）。
標識水由来の水素及び酸素標識はまた、翻訳後修飾を介してアミノ酸に組み込まれ得る。一実施形態では、翻訳後修飾は、翻訳後修飾前の生合成経路を介して、標識した水素又は酸素を予め含み得る。別の実施形態では、翻訳後修飾は、翻訳後修飾ステップ（例えば、メチル化、ヒドロキシル化、リン酸化、プレニル化、硫酸化、カルボキシル化、アセチル化又は他の公知の翻訳後修飾）の前又は後のいずれかで体内水由来の自由に交換される標識水素を含む代謝誘導体由来の標識した水素、酸素、炭素又は窒素を組み込み得る。
被験者への投与に適当なタンパク質前駆体には、タンパク質中で見られる標準的なアミノ酸に加えて、これに限定されるものではないがH2O、CO2、NH3及びHCO3が含まれる。
タンパク質前駆体が投与される個体は哺乳動物であり得る。1つの変形では、哺乳動物は齧歯動物（ラット若しくはマウス）、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌ又はブタであり得る。哺乳動物は野生型であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は操作された動物（これに限定されるものではないが、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物又は遺伝子ノックイン動物を含む）であり得る。一実施形態では、哺乳動物は健康であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は疾患又は病状を有し得る。疾患を有するか又は病状を有する哺乳動物は、先天性の疾患若しくは病状又は後天性の疾患若しくは病状を有し得る。先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状を有する哺乳動物の例は当業者に周知である。
さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得る。
ii．有機代謝産物の前駆体
有機代謝産物の前駆体は、有機代謝経路に入ることが可能な任意の前駆体分子であり得る。有機代謝産物及び有機代謝産物前駆体には、これに限定されるものではないが、H2O、CO2、NH3、HCO3、アミノ酸、単糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、核酸、解糖系の中間体、酢酸及びトリカルボン酸回路の中間体が含まれる。
同位体標識した有機代謝産物の前駆体には、これに限定されるものではないが、2H2O、15NH3、13CO2、H13CO3、2H標識したアミノ酸、13C標識したアミノ酸、15N標識したアミノ酸、H2 18O、18O標識したアミノ酸、33S又は34S標識したアミノ酸、3H2O、3H標識したアミノ酸、14C標識したアミノ酸、14CO2及びH14CO2が含まれる。
有機代謝産物の前駆体は直接投与してもよい。有機代謝産物の前駆体の質量同位体標識化に有用であり得る質量同位体には、これに限定されるものではないが、2H、3H、13C、14C、15N、18O、33S、34S、35S、32P、125I、131I又は有機体システム中に存在する元素の他の同位体が含まれる。同位体標識の代謝による減失を回避するために、同位体標識した原子が被験者内で比較的で安定であるか又は少なくとも予測可能な様式で作用することがしばしば望まれる。生合成プールに同位体標識した前駆体を投与することによって、同位体標識した前駆体を該プールで形成された有機代謝産物内に直接組み込むことができる。
有機代謝産物の前駆体が投与される個体は哺乳動物であり得る。1つの変形では、哺乳動物は齧歯動物（ラット若しくはマウス）、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌ又はブタであり得る。哺乳動物は野生型であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は操作された動物（これに限定されるものではないが、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物又は遺伝子ノックイン動物を含む）であり得る。一実施形態では、哺乳動物は健康であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は疾患又は病状を有し得る。疾患を有するか又は病状を有する哺乳動物は、先天性の疾患若しくは病状又は後天性の疾患若しくは病状を有し得る。先天性の疾患若しくは病状又は後天性の疾患若しくは症状を有する哺乳動物の例は当業者に周知である。
さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得る。
iii．核酸の前駆体
核酸の前駆体（すなわち、RNA、DNA）は、RNA及び/又はDNA合成経路への組込みに適当な任意の基質である。DNAのデオキシリボース環を標識する際に有用な基質の例には、これに限定されるものではないが[6,6-2H2]グルコース、[U-13C6]グルコース及び[2-13C1]グリセロール(参照により本明細書に組み入れる米国特許第6,461,806号参照)が含まれる。DNAにおいて、デオキシリボースの標識化は、これは可変的な希釈供給源を避けるため、窒素塩基を保有する情報の標識化よりも優れている。安定同位体標識は質量分析技術によって容易に検出可能である。
一実施形態では、安定同位体標識は、DNAのデオキシリボース環をグルコース、グルコース-6-リン酸の前駆体又はリボース-5-リン酸の前駆体から標識するために使用される。グルコースが出発物質として使用される実施形態において、適当な標識には、これに限定されるものではないが、ジウテリウム標識したグルコース（[6,6-2H2]グルコース、[1-2H1]グルコース、[3-2H1]グルコース、[2H7]グルコース等）;13C-1標識したグルコース（[1-13C1]グルコース、[U-13C6]グルコース等）;及び18O-標識したグルコース（[1-18O2]グルコース等）等が含まれる。
グルコース-6-リン酸前駆体又はリボース-5-リン酸前駆体が所望である実施形態において、グルコース-6-リン酸又はリボース-5-リン酸へ変換可能な、糖新生前駆体又は代謝物質を使用することができる。糖新生前駆体には、これに限定されるものではないが、13C標識したグリセロール（[2-13C1]グリセロール等）、13C標識したアミノ酸、重水素化水(2H2O)及び13C標識したラクテート、アラニン、ピルベート、プロピオナート又は糖新生のための他の非アミノ酸前駆体が含まれる。グルコース-6-リン酸又はリボース-5-リン酸へ変換される代謝産物には、これに限定されるものではないが、標識した(2H又は13C)ヘキソース（[1-2H1]ガラクトース、[U-13C]フルクトース等）;標識した(2H又は13C)ペントース（[1-13C1]リボース、[1-2H1]キシリトール等）、標識した(2H又は13C)ペントースリン酸経路の代謝産物（[1-2H1]セデュヘプタロース(seduheptalose)等）、及び標識した(2H又は13C)アミノ糖（[U-13C]グルコサミン、[1-2H1]N-アセチル-グルコサミン等）等が含まれる。
本発明はまた、デノボヌクレオチド合成経路を介してDNAのプリン塩基及びピリミジン塩基を標識する、安定同位体標識をも包含する。内生的プリン合成のための様々な構成ブロックを、プリンを標識するために使用することができ、これには非限定的に、15N標識したアミノ酸（[15N]グリシン、[15N]グルタミン、[15N]アスパルテート等）、13C標識した前駆体（[1-13C1]グリコン、[3-13C1]アセテート、[13C]HCO3、[13C]メチオニン等）、及びH標識した前駆体（2H2O等）が含まれる。内生的ピリミジン合成のための様々な構成ブロックを、ピリミジンを標識するために使用することができ、これには非限定的に、15N標識したアミノ酸（[15N]グルタミン等）、13C標識した前駆体（[13C]HCO3、[U-13C4]アスパルテート等）、及び2H標識した前駆体(例えば2H2O)等が含まれる。
上述のリストに加えて、DNAの内生的標識化を生じさせる任意の経路についての基質又は前駆体である他の安定同位体標識も本発明の範囲に包含されることは当業者に理解される。本発明における使用に適した標識は、一般的には市販されているか又は当該技術分野で周知の方法によって合成することができる。
核酸前駆体が投与される個体は哺乳動物であり得る。1つの変形において、哺乳動物は齧歯動物（ラット又はマウス）、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌ又はブタであり得る。哺乳動物は野生型であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は操作された動物（これに限定されるものではないが、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物又は遺伝子ノックイン動物を含む）を含み得る。一実施形態では、哺乳動物は健康であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は疾患又は病状を有し得る。疾患を有するか又は病状を有する動物は、先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状を有し得る。先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状のいずれかを有する哺乳動物の例は当業者に周知である。
さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得る。
iv．前駆体分子としての水
水はタンパク質及び多くの有機代謝産物の前駆体である。したがって、標識水は本明細書で教示される方法において前駆体として役立つ。
H2Oの有用性は、おそらく細胞における生合成反応を決して制限しないことであるが（なぜならH2Oは細胞の内容物のおよそ70％、又は>35モル濃度に相当するからである）、H2O由来の水素原子及び酸素原子は生合成経路に関与する多くの反応に化学量論的に寄与する：例えばR−CO−CH2−COOH＋NADPH＋H 2O→R−CH 2CH2COOH（脂肪酸合成）。
結果として、H又はO同位体標識水の形態で提供される同位体標識が合成経路の一部として生物学的分子に組み込まれる。水素の組込みは、分子の不安定な位置への組込み（すなわち、酵素触媒反応を必要としない迅速な交換）又は安定位置への組み込み（すなわち酵素触媒を必要とする迅速でない交換）という2つの様式で生じ得る。酸素の組込みは安定位置で生じる。
細胞水から生物学的分子中のC-H結合への水素組み込みステップの一部は、生合成反応系列の十分に定義された酵素触媒ステップ中でのみ生じ、成熟した最終産物分子に存在した時点で不安定（すなわち、組織中の溶媒水で交換可能）ではない。例えば、グルコースのC-H結合は溶液中で交換可能ではない。反対に、以下の各C-H位置は特定の酵素反応の逆反応中に体内水と交換される：クレブス回路及び乳酸/ピルビン酸反応におけるオキサロ酢酸/コハク酸配列中のC-1及びC-6；グルコース-6-リン酸/フルクトース-6-リン酸反応におけるC-2；グリセルアルデヒド-3-リン酸/ジヒドロキシアセトン-リン酸反応におけるC-3及びC-4；3-ホスホグリセリン酸/グリセルアルデヒド-3-リン酸及びグルコース-6-リン酸/フルクトース-6-リン酸反応におけるC-5。
それにより、分子の特定の不安定でない位置に共有結合で組み込まれた水由来の標識水素又は酸素原子は、分子の「生合成経緯」を表す（すなわち、標識の組込みは、分子が同位体標識水が細胞水に存在した期間の間に合成されたことを示す）。
逆に、これらの生物学的分子中の不安定な水素（非共有的に会合した水素又は交換可能な共有結合中に存在する水素）は分子の生合成経緯を表さない。不安定な水素原子は、非標識水（H2O）と共にインキュベーションすることによって（すなわち、2H又は3Hを最初の位置に組み込んだ非酵素的交換反応と逆の同一反応によって）容易に除去することができる。以下に反応を示す：
Figure 2007522437
結果として、生合成経緯を反映しないが、非合成交換反応を介して組み込まれる潜在的汚染水素標識は、天然の豊富なH2Oと共にインキュベーションすることによって実際に容易に除去することができる。
分析方法が標識した水素原子の生物学的分子への組込みを定量的に測定するために使用可能である（例えば、3Hの液体シンチレーションカウンティング；2H及び18Oの質量分析又はNMR分光法）。同位体標識水の組込みの理論に関する更なる議論については、例えば参照により本明細書に組み入れるJungas RL. Biochemistry. 1968 7:3708-17を参照されたい。
標識水は商業的に容易に入手し得る。例えば、2H2OはCambridge Isotope Labs (Andover, MA)から購入することができ、3H2Oは例えばNew England Nuclear, Incから購入することができる。概して、2H2Oは非放射性であるため、放射性3H2Oよりも低い毒性関連が存在する。2H2Oは、例えば体内の総水分の割合として（例えば消費される体内の総水分の1％（例えば1日毎に消費される3リットルの水について、30μlの2H2Oが消費される））投与し得る。3H2Oが利用される場合、当業者によって容易に測定される非毒性量が投与される。
比較的高い2H2Oの体内水富化（例えば体内の総水分の1〜10％が標識される）は、本発明の技術を用いて比較的安価で達成し得る。この水富化は比較的一定かつ安定であり、毒性のいかなる徴候もなく、ヒト及び実験動物中で数週間又は数ヶ月間維持される。非常に多くのヒト被験者（>100人）におけるこの知見は、高用量の2H2Oでの前庭毒性についての以前の関心に反する。本願出願人は、体内水富化の急速な変化が（例えば、少量の分割用量での初回投与によって）防止される限り、2H2Oの高い体内水富化を毒性なく維持できることを見出した。例えば低価格の市販の2H2Oは、比較的低費用で1〜5％範囲での長期にわたる富化の維持を可能にする（例えば、計算は、2H-ロイシンによる10％遊離ロイシン富化での12時間の標識化（したがって、ロイシン前駆体プールにおけるその期間での7〜8％富化）よりも、2％2H2O富化での2ヶ月間の標識化（すなわちアラニン前駆体プールにおける7〜8％富化）よりも低価格であることを明らかにする）。
18O同位体は毒性ではなく、その結果有意な健康リスクが存在しないため、H2 18Oの投与に関して、相対的に高くかつ相対的に一定の体内水富化を達成し得る。
同位体標識水は連続的な同位体標識水の投与、断続的な同位体標識水の投与を介して、又は同位体標識水の単回又は複数回投与後に投与し得る。連続的な同位体標識水の投与において、同位体標識水は、個体中で長い間比較的一定の水富化を維持するのに十分な期間で個体に投与される。連続的方法に関して、標識水は定常状態濃度を達成するために十分な期間（例えば、ヒトでは3〜8週間；齧歯動物では1〜2週間）の投与に最適化される。
断続的な同位体標識水の投与において、同位体標識水の量が測定され、その後1回以上投与され、その後同位体標識水への曝露が中断され、体内水プールから同位体標識水を流出させる。次いで継時的な脱標識化をモニターし得る。水が生物学的分子において検出可能なレベルを達成するのに十分な期間で最適に投与される。
同位体標識水は当該技術分野で周知の様々な手段で個体又は組織に投与し得る。例えば、同位体標識水は、経口的、非経口的、皮下、血管内（例えば静脈内、動脈内）又は腹腔内に投与し得る。Isotec, Inc.（Miamisburg OH及びCambridge Isotopes, Inc. (Andover, MA)）を含む、2H2O及びH2 18Oのいくつかの商業的供給源が利用可能である。投与される同位体標識水の同位体含量は約0.001％〜約20％の範囲であることができかつ生物学的分子の同位体含量を測定するのに使用される機器の分析感度に左右され得る。経口投与のために、飲料水中の4％ 2H2Oが投与される。ヒトへの投与については、50mLの2H2Oが投与される。
標識水が投与される個体は哺乳動物であり得る、1つの変形において、哺乳動物は齧歯動物（ラット若しくはマウス）、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌ又はブタであり得る。哺乳動物は野生型であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は操作された動物（これに限定されるものではないが、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物又は遺伝子ノックイン動物を含む）であり得る。一実施形態では、哺乳動物は健康であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は疾患又は病状を有し得る。疾患を有するもしくは病状を有する哺乳動物は先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状を有し得る。先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状のいずれかを有する哺乳動物の例は当業者に周知である。さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得る。
v．炭水化物の前駆体
炭水化物を含む組成物は、単糖、多糖、又は単糖若しくは多糖と会合した別の化合物を含み得る。
同位体標識は当該技術分野で公知の生化学経路によって炭水化物又は炭水化物誘導体に組み込まれ得る。これらには、単糖（非限定的にグルコース及びガラクトースを含む）、アミノ糖（N-アセチル-ガラクトサミン等）、多糖（グリコーゲン等）、糖タンパク質（シアル酸等）、糖脂質（ガラクトセレブロシド）、及びグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸）が含まれる。
2H標識した糖は単糖として又は単糖残基を含むポリマーとして個体に投与し得る。標識した単糖は商業的に容易に入手し得る（例えばCambridge Isotopes, Massachusetts）。
2H標識した糖を含む比較的少量の化合物が投与される必要がある。量はミリグラムの単位で101mg、102mg、103mg、104mg、105mg又は106mgであり得る。2H標識した糖の富化はヒト及び動物内で数週間から数ヶ月間、毒性のいかなる徴候もなく維持される。標識した市販の糖が低価格であること、及び少量が投与されるべきであることが、低費用での富化の維持を可能にする。
一実施形態では、標識した糖はグルコースである。グルコースは解糖及びクエン酸回路によって代謝される。解糖はグルコースのC-H結合から大部分のH原子を放出し、クエン酸回路を介した酸化は、全てのH原子がH2Oに放出されることを保証する。グルコースによる3H又は2H標識の減失は、解糖（グルコースに関する細胞内代謝経路である）を評価するために使用されてきた。一部の研究者は、解糖の測定として、静脈内投与された3H-グルコースから3H2Oへの3Hの放出を使用してきた。2H-グルコースの2H2Oへの放出は以前は表面的には記載されていなかった。というのも、これは体内水プールが標識したグルコースの2H投与に対して大き過ぎて測定可能な2H2Oレベルを達成できないということが予想されたためである。一方、本願出願人は2H-グルコースの2H2Oへの放出を測定することができることの立証を見出した（参照により本明細書に組み入れる米国特許出願第10/701,990号参照）。別の変形では、標識したグルコースは[6,6-2H2]グルコース、[1-2H1]グルコース及び[1,2,3,4,5,6-2H7]グルコースであり得る。
別の変形では、標識した糖はフルクトース又はガラクトースを含む。フルクトースはフルクトース1-リン酸経路を介して解糖に入り、副次的にヘキソキナーゼによるフルクトース6-リン酸へのリン酸化を介する。ガラクトースはガラクトースとグルコースの相互変換経路を介して解糖に入る。
他の任意の糖も本発明に想定される。意図する単糖には、これに限定されるものではないが、トリオース、ペントース、ヘキソース及びより上位の単糖が含まれる。単糖には、非限定的にアルドース及びケトースがさらに含まれる。
別の変形では、多糖を含む化合物が投与され得る。ポリマーは多糖を含み得る。例えば、標識したグリコーゲン（多糖である）はグルコース残基を含む。別の変形では、標識した多糖が導入され得る。更なる変形として、標識した糖モノマーがスクロース（グルコースα-(1,2)-フルクトース）、ラクトース(ガラクトースβ-(1,4)-グルコース)、マルトース(グルコースα-(1,4)-グルコース)、デンプン(グルコースポリマー)又は別のポリマーの成分として投与され得る。
別の変形では、標識した糖は、経口経路、強制飼養経路、腹膜内経路、血管内（例えば静脈内、動脈内）経路、皮下経路又は他の身体経路によって投与し得る。特に、糖は、随意的に食物又は飲料の一部として、経口的に個体に投与し得る。
炭水化物前駆体が投与される個体は哺乳動物であり得る。1つの変形では、哺乳動物は齧歯動物（ラット若しくはマウス）、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌ又はブタであり得る。哺乳動物は野生型であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は操作された動物（例えば、これに限定されるものではないが、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物、遺伝子ノックイン動物を含む）であり得る。一実施形態では、哺乳動物は健康であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は疾患又は病状を有し得る。疾患を有する又は病状を有する哺乳動物は、先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状を有し得る。先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状のいずれかを有する哺乳動物の例は当業者に周知である。
さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得る。
vi．脂質及び他の脂肪の前駆体
標識した脂質の前駆体は脂質生合成における任意の前駆体を含み得る。脂質の前駆体分子はCO2、NH3、グルコース、ラクテート、H2O、アセテート及び脂肪酸であり得る。この前駆体は、標識水（例えば2H2O）（これは脂肪酸、アシル-グリセロールのグリセロール部分、コレステロール及びその誘導体についての前駆体である）；13C又は2H標識した脂肪酸（これはトリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステル、コアミド及び他の脂質についての前駆体である）；13C又は2H-アセテート（これは脂肪酸及びコレステロールについての前駆体である）；18O2（例えばH2 18O由来）（これは脂肪酸、コレステロール、アシル-グリセリド、及び酵素触媒反応又は（例えば脂肪酸に対する）非酵素的な酸化的損傷によって酸化的に修飾された特定の脂肪酸（過酸化水素等）についての前駆体である）；13C又は2H-グリセロール（これはアシル-グリセリドの前駆体である）；13C又は2H標識したアセテート、エタノール、ケトン体又は脂肪酸（これらは内生的に合成される脂肪酸、コレステロール及びアシルグリセリドについての前駆体である）；並びに2H若しくは13C標識したコレステロール又はその誘導体（胆汁酸及びステロイドホルモンを含む）を含み得る。同位体標識した全ての前駆体は、例えばCambridge Isotope Labs (Andover, MA)から商業的に購入し得る。
糖脂質及びセレブロシド等の複合脂質はまた、セレブロシドの糖部分（これに限定されるものではないが、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミン硫酸、グルクロン酸及びグルクロン酸硫酸を含む）、セレブロシドの脂肪酸アシル部分及びセレブロシドのスフィンゴシン部分の前駆体である、2H2O；セレブロシド、糖脂質及び他の誘導体の脂肪酸アシル部分の前駆体である、2H又は13C標識した脂肪酸を含む前駆体から標識することもできる。
この前駆体分子は脂質成分であり得るし又はこれを含んでもよい。
一実施形態では、2H標識した脂肪酸は標識した脂肪酸を含む脂肪又は他の基質として個体に投与され得る。2H標識した脂肪酸は商業的に容易に入手し得る。比較的少量の標識した脂肪酸が投与に要する。量はミリグラムの単位で、101mg、102mg、103mg、104mg、105mg又は106mgであり得る。特に2Hによる、脂肪酸富化は、ヒト及び動物中で数週間から数ヶ月の間いかなる毒性もなく維持し得る。標識した市販の脂肪酸が低価格であること、及び投与に少量を要することが、低費用での富化の維持を可能にする。
標識した脂肪酸（特に2H脂肪酸）の標識水（特に2H2O）への放出は脂肪の酸化を正確に反映する。標識した適量の脂肪酸の投与は、標識した水素又は酸素の水への放出を測定するのに十分である。特に、適量の2H脂肪酸の投与は2Hの重水素化水への放出を測定するのに十分である。
別の変形では、標識した脂肪酸は、経口経路、強制飼養経路、腹膜内経路、血管内（例えば静脈内、動脈内）経路、皮下経路又は他の身体経路によって投与し得る。特に、標識した脂肪酸は、随意的に食物又は飲料の一部として、経口的に個体に投与し得る。
脂質前駆体が投与される個体は哺乳動物であり得る。1つの変形において、哺乳動物は齧歯動物（ラット若しくはマウス）、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌ又はブタであり得る。哺乳動物は野生型であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は操作された動物（これに限定されるものではないが、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物、又は遺伝子ノックイン動物）であり得る。一実施形態では、動物は健康であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は疾患又は病状を有し得る。疾患を有するか又は病状を有する哺乳動物は、先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状を有し得る。先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状のいずれかを有する哺乳動物の例は当業者に周知である。
さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得る。
vii．グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンの前駆体
グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンは、細胞外空間（例えば軟骨、細胞間質及び滑膜関節液）で重要な役割を果たす生体分子の複雑なクラスである。これらのクラス中の分子には、例えば、グリコサミノグリカンの二糖から構築される巨大ポリマー（ヒアルロナン等）（これは最大50000反復ユニットのヒアルロン酸（HA）二糖からなるポリマーである）、グルクロン酸に結合したN-アセチル-グルコサミンを含むダイマー；コンドロイチン硫酸（CS）二糖（グルクロン酸と結合したN-アセチル-グルコサミン硫酸を含むダイマーである）の反復ユニットから構築されるCSポリマー、ヘパラン硫酸（これはグルクロン酸と結合したN-アセチル（又はN-スルホ）-グルコサミド硫酸のダイマーである）の反復ユニットから構築されるヘパラン硫酸ポリマー；並びにケラタン硫酸二糖（これはガラクトースと結合したN-アセチルグルコサミン硫酸を含むダイマーである）の反復ユニットから構築されるケラタン硫酸ポリマーが含まれる。プロテオグリカンは、中心のヒアルロナンポリマー及び中心のヒアルロナン鎖から分岐する他のグリコサミノグリカン（CS等）と結合される追加のタンパク質を含む。
標識したグリコサミノグリカン及びプロテオグリカンの前駆体には、これに限定されるものではないが、2H2O（N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、グルクロン酸、N-アセチルグルコサミン及びN-アセチルガラクトサミンの様々なスルフェート、ガラクトース、イズロン酸等を含む、糖部分に組み込まれる）、13C又は2Hグルコース（前記糖部分に組み込まれる）、2H又は13Cフルクトース（前記糖部分に組み込まれる）、2H又は13Cガラクトース（前記糖部分に組み込まれる）、15N-グリシン、他の15N標識したアミノ酸、又は15N尿素（前記アミノ糖の窒素部分（N-アセチルグリコサミン、N-アセチル-ガラクトサミン等）に組み込まれる）；13C又は2H脂肪酸、13C又は2Hケトン体、13C-グルコース、13C-フルクトース、18O2（例えばH2 18Oとして投与される）、13C又は2Hアセテート（N-アセチル-糖のアセチル部分（N-アセチル-グルコサミン又はN-アセチル-ガラクトサミン等）に組み込まれる）、及び18O又は35S標識したスルフェート（コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸の硫酸部分及び他の硫酸部分に組み込まれる）が含まれる。同位体標識した全ての前駆体は、例えばCambridge Isotope Labs (Andover, MA)から商業的に購入し得る。
標識したグリコサミノグリカン又はプロテオグリカン前駆体は、経口経路、強制飼養経路、腹膜内経路、血管内（例えば静脈内、動脈内）経路、皮下経路又は他の身体経路によって投与し得る。特に、標識したグリコサミノグリカン又はプロテオグリカン前駆体は、随意的に食物又は飲料の一部として、経口的に個体に投与し得る。
グリコサミノグリカン又はプロテオグリカン前駆体が投与される個体は哺乳動物であり得る。1つの変形において、哺乳動物は齧歯動物（ラット若しくはマウス）、霊長類、ハムスター、モルモット、イヌ又はブタであり得る。哺乳動物は野生型であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は操作された動物（これに限定されるものではないが、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物、遺伝子ノックイン動物）であり得る。一実施形態では、哺乳動物は健康であり得る。別の実施形態では、哺乳動物は疾患又は病状を有し得る。疾患を有するか又は病状を有する哺乳動物は、先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状を有し得る。先天的な疾患若しくは病状又は後天的な疾患若しくは病状のいずれかを有する哺乳動物の例は当業者に周知である。
さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得る。
Ｂ．目的の1以上の標的分子を取得すること
本発明の方法を実施する際に、一態様において、目的の標的分子が当該技術分野で公知の方法に従って1以上の細胞、組織又は生物から取得される。この方法は特定の目的分子に特異的であり得る。目的の分子は1以上の生物学的サンプルから単離し得る。
目的とする複数の分子は1以上の細胞、組織又は生物から取得し得る。1以上の生物学的サンプルは、例えば採血、採尿、生検、又は当該技術分野で公知の他の方法によって取得し得る。1以上の生物学的サンプルは1以上の生体液であり得る。目的とする1以上の分子も特定の器官又は組織（筋肉、肝臓、副腎組織、前立腺組織、子宮内膜組織、血液、皮膚及び乳房組織等）から取得し得る。目的の分子は、特定の細胞群（腫瘍細胞又は繊維芽細胞）から取得し得る。目的の分子はまた、当該技術分野で標準的な生化学的方法を用いて、1以上の生物学的サンプルから取得することもでき、かつ場合により部分的に精製又は単離し得る。
生物学的サンプリングの回数は、異なる因子に応じて変化し得る。かかる因子には、これに限定されるものではないが、目的の分子の性質、サンプリングの簡便さと安全性、目的の分子の合成速度及び分解/除去速度、並びに投与される化合物の半減期が含まれる。
目的の分子は、当該技術分野で公知のあらゆる精製法（非限定的に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、中高圧液体クロマトグラフィー（FPLC）、化学抽出、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び/又は当業者に公知の他の分離法を含む）によって、部分的に精製してもよく、場合により単離してもよい。
別の実施形態では、目的の分子は加水分解されるか、又はその他、さらに小さな分子を形成させるために分解される。加水分解方法には、当該技術分野で公知の任意の方法（非限定的に、化学的加水分解（酸加水分解等）及び生化学的加水分解（ペプチダーゼ分解等）を含む）が含まれ得る。加水分解又は分解は、目的とする1以上の分子の精製及び/若しくは単離の前又は後のいずれかで実施し得る。目的とする1以上の分子も、精製方法（非限定的に、高速液体クロマトグラフィー（HPLP）、中高圧液体クロマトグラフィー（FPLC）、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、並びに/又は当業者に公知の化学的化合物及び/若しくは生化学的化合物を分離する他の任意の方法を含む）によって部分的に精製することもでき、又は場合により単離することもできる。
C．分析
化合物の生物学的作用を同定するために使用される従来技術（静的方法）は、細胞中の分子の組成、構造又は濃度のみを測定し、かつこれを一の時点で測定する。これに対し、本発明の方法は、以下に記載されるように、無傷の代謝経路中の目的とする1以上の分子の分子流速の測定を可能にする。
１．質量分析法
目的とする1以上の分子中の同位体富化は、質量分析法等の様々な方法（これに限定されるものではないが、ガスクロマトグラフィー-質量分析法（GC-MS）、同位体比質量分析法、GC同位体比-燃焼MS、GC同位体比-ガス化(pyrrolysis)MS、液体クロマトグラフィーMS、エレクトロスプレーイオン化MS、マトリクス支援レーザー脱離飛行時間型MS、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴MS、及びサイクロイドMSを含む）によって測定することができる。
質量分析計は分子を高速移動する気体イオンに変換し、これらをその質量対電荷比に基づいて分離する。したがって、イオンの同位体若しくはアイソトポログ又はイオンフラグメントの分布を複数の分子中の同位体富化を測定するために使用し得る。
一般的に、質量分析計には、イオン化手法及び質量分析器が含まれる。多くの異なるタイプの質量分析計が当該技術分野で公知である。これらには、非限定的に、磁場分析計、エレクトロスプレーイオン化、四重極、イオン・トラップ、飛行時間型質量分析計及びフーリエ変換分析計が含まれる。
質量分析計は、多くの異なるイオン化方法を含んでもよい。これらには、非限定的に、気相イオン源（電子衝撃、化学イオン化及び電界イオン化等）並びに脱離源（電界脱離、高速原子衝撃、マトリクス支援レーザー脱離/イオン化及び表面増強レーザー脱離/イオン化）が含まれる。
さらに、2以上の質量分析計を前駆体イオンを分離するために最初に結合し（MS/MS）、次いで気相フラグメントを分離しかつ測定し得る。これらの機器は、最初の一連の分子のイオンフラグメントを作製し、その後、最初のイオンの第2フラグメントを作製する。
異なるイオン化方法も当該技術分野で公知である。巨大な非揮発性高分子（タンパク質及びポリヌクレオチド等）のイオン化技術の開発が1つの鍵となる進展である。このタイプの技術にはエレクトロスプレーイオン化（ESI）及びマトリクス支援レーザー脱離(MALDI)が含まれてきた。これらは強力なサンプル分離導入技術（液体クロマトグラフィー及びキャピラリーゾーン電気泳動等）と組合せて適用されるべきMSを可能にしてきた。
さらに、質量分析計はガスクロマトグラフィー(GC)及び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の分離手法と結合し得る。ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC/MS）では、ガスクロマトグラフからのキャピラリーカラムは、場合によりジェット分離器を用いて、質量分析計と直接結合される。かかる応用において、ガスクロマトグラフィー(GC)カラムはサンプル成分をサンプルガス混合物から分離し、分離した成分は質量分析計中でイオン化され化学的に分析される。
GC/MS（又は小さな無機ガスというよりむしろ、分子のイオンを分析する他の質量分光様式）が分子の質量アイソトポマー存在量を測定するために使用される際には、同位体標識水由来の水素標識した同位体の組み込みが、in vivoでの同位体標識水から該分子へ組み込まれた水素原子数に応じて、3〜7倍に増幅される。
一般的に、目的の分子の基本となる質量アイソトポマー度数分布を決定するために、上記サンプルは同位体標識した前駆体の注入前に取得される。上記測定は、細胞、組織又は生物で、目的の分子の質量アイソトポマーの天然の度数を確立する一手段である。細胞、組織又は生物が類似する環境履歴を有する被験者の集団の一部である際には、集団アイソトポマー度数分布がそのようなバックグラウンドの測定に使用され得る。さらに、かかる基本となるアイソトポマー度数分布は、既知の平均の同位体の天然存在量を用いて評価し得る。例えば、事実上、13Ｃの天然存在量は有機性炭素中に1.11％存在する。そのようなアイソトポマー度数分布を測定する方法は下記に記載される。典型的には、目的の分子のサンプルは同位体標識した前駆体の被験者への投与前及び投与後に取得され、下記に記載されるようにアイソトポマー度数について分析される。
a．相対的及び絶対的質量アイソトポマー存在量の測定
測定した質量スペクトルのピーク高あるいはピーク下面積は、親（0質量同位体）アイソトポマーに対する比率として表してもよい。サンプル中のアイソトポマーの存在量に関する相対値及び絶対値を与える任意の算出法を、本発明の目的のために上記データを記載する際に使用し得ることが理解される。
2．標識化の算出：目的の分子の未標識の割合
次いで、目的の標識分子及び未標識分子の割合が算出される。実行者はまず分子の単離したアイソトポマー種に関する測定した過剰モル比を決定する。次いで、実行者は測定した過剰比の内部パターンを理論上のパターンと比較する。かかる理論上のパターンは、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第5,338,686号、5,910,403号及び6,010,846号に記載されるように、二項分布又は多項分布の関係を用いて算出することができる。この算出には質量アイソトポマー分布分析（MIDA）が含まれ得る。質量アイソトポマー分布分析（MIDA）組合せアルゴリズムの変形は当業者に公知の多くの異なる情報源で議論されている。この方法は、全て参照によりその全体を本明細書に組み入れるHellersteinとNeese (1999)、及びChinkesら(1996)、KelleherとMasterson(1992)並びに米国特許出願第10/279,399号でさらに議論されている。
上記引用文献に加えて、この方法を実行する算出ソフトウェアはMarc Hellerstein教授（University of California, Berkeley）から公然入手可能である。
過剰モル比の理論的パターンとの比較は、決定した関係を用いて、目的の分子について図式的の作成した表を用いて実施することができる。これらの比較から、前駆体サブユニットプール中のサブユニットの質量同位体富化の確率を記載する値（p値等）が決定される。次いで、この富化は、各質量アイソトポマーについて新たに合成された分子の富化を記載する値（Ax＊値）を決定するために用いられ、全てのアイソトポマーが新たに合成される場合、存在すると期待されるアイソトポマー過剰比を表す。
次いで、画分量が算出される。個別の同位体（元素について）又は質量アイソトポマー（分子について）の画分量は、その特定の同位体又は質量アイソトポマーによって表される全存在量の比率である。これは相対的な存在量と区別され、その際、最も豊富な種に100の値が与えられ、他の全ての種は100と相対的に規準化され、相対的存在量％として表現される。質量アイソトポマーMxに関して、
Figure 2007522437
 であり、その際、0〜nは存在量が生じる最小質量(M0)の質量アイソトポマーと相対的な見かけの質量の範囲である。
Figure 2007522437
 であり、その際、下付き文字eは富化した存在量を指し、bは基本の又は天然の存在量を指す。
前駆体投与の期間の間に実際に新たに合成されたポリマーの割合を決定するために、測定した過剰モル比（EMx）が算出した富化値Axと比較される（Axは各質量アイソトポマーに関する新規合成生体高分子の富化を記載し、全てのアイソトポマーが新たに合成された場合に存在することが期待されるアイソトポマーの過剰比を表す）。
3．分子流速の算出
合成速度を測定する方法は、分子前駆体プールに存在する質量同位体で標識したサブユニットの割合を算出すること、及び少なくとも1つの同位体標識したサブユニットを含む目的の分子の期待度数を算出するためにこの割合を用いることを含む。次いで、この期待度数は実際に実験的に測定した目的の分子の同位体度数と比較される。これらの値から、選択した組込み期間の間に、添加した同位体標識した前駆体から合成される目的の分子の割合を決定することができる。こうして、かかる期間の間の合成速度も測定される。
次いで、前駆体-生成物の関係も適用され得る。連続的な標識方法に関して、同位体富化が漸近的（すなわち最大可能性）富化と比較され、速度パラメーター（例えば合成速度）が前駆体-生成物式から算出される。分数合成速度（ks）は連続的に標識する前駆体-生成物式：
Ks=[-In(1-f)]/t、
を適用することによって計算し得る。ここで、f＝画分合成＝生成物富化/漸進的前駆体/富化であり、t＝調査される生物系で接触する標識投与の時間である。
断続的な標識方法に関して、同位体富化の低下速度が算出され、目的とする1以上の分子の速度パラメーターが指数関数的消失式から算出される。この方法を実行する際、生体高分子は質量アイソトポマー（好ましくは複数の質量同位体標識した前駆体を含む）中で富化される。目的の分子のより高質量のアイソトポマー（例えば、3又は4つの質量同位体標識した前駆体を含む分子）は、比較的少量の天然の質量同位体標識した前駆体に起因して、外因性前駆体の不在下でごく少量で生じるが、分子前駆体の組込みの期間の間にかなりの量で生じる。連続的な時点で1以上の細胞、組織又は生物から得た目的とする1以上の分子は、高質量のアイソトポマーの相対度数を測定するために質量分析法によって分析される。高質量のアイソトポマーは、ほぼ例外なく最初の時点前に合成されるので、2つの時点間の消失は目的の分子の消失速度の直接的な測度を提供する。
最初の時点は、質量同位体標識したサブユニットの割合が前駆体投与後の最高レベルから実質的に消失しているかを確認するために、投与の様式に応じて前駆体の投与の中断後2〜3時間であり得る。一実施形態では、その後の時点は典型的には最初の時点後1〜4時間であるが、この時期は生体高分子プールの置換速度に左右されよう。
目的の分子の消失速度は、目的とする3同位体分子に関する消失曲線から決定される。この場合は、消失曲線が幾つかの時点で定義される際に、消失動態はこの曲線を指数関数的消失曲線に適合させることによって、及びこれから消失定数を決定することによって決定することができる。
崩壊速度定数（Kd）は指数関数的又は他の動態消失曲線に基づいて算出し得る：
kd=[-In f]/t
記載されるように、この方法は質量同位体標識することができる2以上の同一のサブユニットから形成される実質的に全ての生体高分子に関する、サブニットプールの組成並びに合成及び消失速度を測定することに使用することができる。他の周知の算出技術及び実験的標識化又は脱標識化アプローチを、分子の流速及び目的の代謝経路を介した流速を算出するために使用することができる（例えば、Wolfe, R. R. Radioactive and Stable Isotope Tracers in Biomedicine: Principles and Practice of Kinetic Analysis. John Wiley & Sons; (March 1992)参照）。
4．液体シンチレーションカウンティング
放射性同位体は液体シンチレーションカウンターを用いて観察し得る。放射性同位体（3H等）は液体シンチレーション検出器によって検出される放射線を放出する。この検出器は放射線を増幅される電気信号に変換する。このように、生物学的分子中の放射性同位体の数が測定され得る。
一実施形態では、生物学的サンプル中の放射性同位体富化値が液体シンチレーションによって直接測定され得る。別の実施形態では、放射性同位体は3Hである。
別の実施形態では、生物学的分子又はその成分は部分的に精製され、又は場合により単離され、その後、液体シンチレーションカウンティングによって測定されうる。
D．本発明の使用
開示する発明は、薬剤の意外な、偶然の治療作用及び意外な薬剤毒性に関する、化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物の系統的なハイスループットスクリーニングを可能にする。図1は、治療及び薬剤毒性における偶然の又は予期せぬ事象の全範囲の真の重要性と対比した、対象とする作用に関する薬剤スクリーニング及び薬剤開発の現在の及び従来の方法を記載する。図2は、公知の薬剤によって誘起された新たな治療指標を検出するためのハイスループットスクリーニング法を図示する。
これらの新たな指標は以前は明確に確立されておらずかつ既存の情報からはっきりと予測可能ではないため、これらは定義により公知の薬剤承認用途の関連において偶然かつ予期されないものである。本発明は、疾患に関連する代謝経路を介した流速を測定するために、同位体動態技術を使用する方法を含む。本明細書に開示される発見ツールも、DDDAプロセス（前臨床試験からヒト試験を経る）を通した垂直統合を可能にし、これは当該技術分野で記載される現行の方法とは異なる。試験される化合物（又は試験される化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）は既にFDA承認された薬剤であり得、それにより承認薬剤に関する新規治療指標及び新規クレームの発見を可能にするか（図2及び表4参照）、又は試験される化合物（又は試験される化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）はFDA承認を欠く任意の化学物質又は生物学的因子であり得る。
薬剤調査及び医薬開発における現在の最新技術（すなわち、標的の確認と結合させた合理的薬剤設計）は、1930年代から1970年代に使用された初期のアプローチ（疾患の不十分な(crude)生理学的モデルに対する天然又は合成化学物質のランダムスクリーニング）よりもより系統的な薬剤発見のアプローチを可能にする。しかし、表1で見ることができるように、標的の確認と結合させた合理的薬剤設計は、初期のアプローチが有する重大な欠点（特に化合物の第2の治療指標及び/又は毒作用等の偶然の又は予期せぬ事象を検出し損なう）を共有する。これは現在のDDDAアプローチが狭い標的基準（酵素標的のHTSアッセイ又は酵素活性部位のコンピューターモデリング）に集中していること、及び化合物（既に承認された薬剤又は新規化学物質若しくは生物学的因子等）が、目的とする狭い標的の範囲外の多くの他の生物学的に重要なプロセスに不可避的に意図的でなく又は予測不可能に作用するからである。化合物の活性（治療活性及び毒性作用）は、単に薬理学者及び医師がそのように望んだという理由によっては、現在のDDDA技術を用いてスクリーニングされかつ試験される目的の標的に制限されない。
Figure 2007522437
本発明の方法は、研究者が化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物から誘起された偶然の若しくは予期せぬ事象を合理的にスクリーニングすること、及びこれをハイスループット様式で行うことを可能にする。例えば、本明細書に開示する方法は、数週間又は数ヶ月にわたる、何百又は何千もの動物の、相対的な分子流速の研究を可能にする。安定同位体の供給源として標識水（例えば2H2O）を用いることによって、各動物（又はヒト対象）は標識水（2H2O等）を含む水を飲み、標識プロトコールに必要とされる限りこれが継続される。2以上の生物学的分子の分子流速は質量分析法によって決定される。この方法は完全に自動化し得る（自動抽出、コンピューターによるデータ分析及び流速の算出）。
本明細書に開示する方法は、当業者に目的とする様々な分子（生物系で見出される重要な代謝経路を含む）の分子流速を測定することを可能にする。多くの例において、代謝経路中の及び代謝経路を介した流速の変化は、特定の疾患と結びつけることができ、これらの経路を含む分子の流速を測定することは、化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物の第2の治療指標及び/又は偶然の毒作用を検出する際に有用な情報を提供するだろう。表2は生物系中の代謝経路を含む、目的とする多くの分子を列挙する：
Figure 2007522437
Figure 2007522437
本発明の方法は、生物系における作用、特に予期せぬ又は偶然の作用に関する、化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物のハイスループットスクリーニングを、疾患に関与すると考えられる代謝経路における分子流速を測定することによって可能にする。一実施形態では、目的とする1以上の代謝経路における測定中の分子流速は、1以上の疾患の根底にある分子病態又は原因に関連し得る。別の実施形態では、目的とする1以上の代謝経路における分子流速は、目的の疾患の開始、進行、重篤性、病状、侵攻性、段階、活性、障害、死亡率、罹患率、疾患の下位分類又は他の根底にある病原的若しくは病理学的特徴に寄与し得る。
さらに別の実施形態では、目的とする1以上の代謝経路における分子流速は、目的の疾患の予後、生存、罹患率、死亡率、段階、治療反応、症状、障害又は他の臨床学的因子に寄与し得る。代謝経路における2以上の分子流速は、独立に又は同時に測定し得る。
かかる代謝経路には、これに限定されるものではないが、肝細胞増殖及び破壊、尿細管細胞代謝回転、リンパ球代謝回転、精母細胞代謝回転、筋肉及び心臓でのタンパク質合成及び分解、肝臓コラーゲンの合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリン合成及び分解、乳房上皮細胞増殖、結腸上皮細胞増殖、前立腺上皮細胞増殖、卵巣上皮細胞増殖、子宮内膜細胞増殖、気管支上皮細胞増殖、膵臓上皮細胞増殖、膵臓β細胞再生、皮膚でのケラチン合成、ケラチノサイト増殖、炭水化物代謝（インスリン耐性によって影響される経路を含む）、コレステロールの代謝及びクリアランス（コレステロール逆輸送を含む）、免疫グロブリン合成、ミトコンドリアDNAの合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質の合成及び分解、ミトコンドリアタンパク質の合成及び分解、脂肪脂質の合成及び分解、並びに脂肪細胞の合成及び分解が含まれ得る。
疾患の既知の動物モデルは本発明の一部として使用し得る。そのような疾患の動物モデルには、これに限定されるものではないが、アルツハイマー病、心不全、腎疾患、糖尿病性ネフロパシー、骨粗しょう症、肝繊維症、肝硬変、肝細胞壊死、肺繊維症、強皮症、腎繊維症、多発性硬化症、動脈硬化症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、皮膚の紫外線による老化、皮疹、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌、後天性免疫不全症候群、免疫欠如、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、糖尿病、糖尿病性合併症、インスリン耐性、肥満症、リポジストロフィー、代謝症候群、筋肉疲労、フレイルティー（frailty）、体調不良、血管形成、高脂血症、不妊症、ウイルス又は細菌感染症、自己免疫疾患及び免疫発赤が含まれ得る。
表3は、代謝経路及びこれに関連する疾患状態の例を例示する。広範であるが、本発明の方法がその病因が1以上の代謝経路における1以上の改変された流速によって少なくとも部分的に定義される任意の疾患に有用であることを当業者が理解する限り、表3に含まれるリストは限定を意図するものではない。
Figure 2007522437
Figure 2007522437
本発明の方法はFDA（又は米国外のこれに相当する他の政府機関）承認薬に関する第2の指標の同定を可能にする。薬剤の第2の（偶然の）治療作用に関して、一旦薬剤がFDA(又は米国外のこれに相当する他の政府機関)によって承認されれば、FDA承認された（すなわち目的の及び厳格に試験された）指標以外の目的については医師によって処方され得る点に留意すべきである。実際に、「承認外」の使用は米国で書かれた処方箋の大部分（＞60％）を占める。かかる承認外の使用は、しばしば承認薬の最大の商業的及び医学的影響を占める（表2、上記）。かかる第2の（すなわち偶然の又は予期せぬ）治療作用を認識又は認知し損なうことにより、しばしば医薬会社は特許保護の満了前にその独占薬剤の完全な商業的優位性を獲得することを妨げられる。したがって、承認薬の新規用途は、米国で新規治療剤を開発するための最も魅力的かつ商業的に有利なアプローチの一つを表す。というのも承認薬は、潜在毒性に対して人間の最大の経験を有し、既に完全な安全性及び投薬試験を経ており、かつ医薬供給者になじみがあるからである。
既知の又は承認薬剤は、単一の又は複数の代謝経路への作用について独立又は同時にスクリーニングし得る。薬剤はランダムに選択してもよいし、又は薬剤は1以上の疾患の分子病態における仮定の役割に関する特定の生化学的理論又は仮定に基づいて選択してもよい。未承認薬（新規化学物質、未承認の生物学的因子、薬剤リード（生物学的リードを含む）等）等もランダムに選択してもよいし、又は1以上の疾患の分子病態における仮定の役割に関する特定の生化学的理論又は仮定に基づいて選択してもよい。
そのような既知の又は承認薬には、これに限定されるものではないが、スタチン、グリタゾン、COX-2阻害剤、NSAIDS、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、ACE阻害剤、抗生物質、抗ウイルス剤、脂質低下薬、抗高血圧症薬、抗炎症剤、抗鬱薬、抗不安薬、抗精神病薬、鎮静剤、鎮痛薬、抗ヒスタミン剤、経口血糖降下薬、抗痙攣薬、抗新生物薬、癌化学療法剤、性ステロイド、下垂体ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、食欲抑止剤、甲状腺ホルモン剤（thyromimetics）、抗発作剤、交感神経興奮剤、サルファ剤、ビグアニド及び他のクラスの薬剤が含まれ得る。実際に、現在の治療用品中の承認薬の第2クレーム又は未承認用途の非常に多くの例が存在する。
Figure 2007522437
併用療法は現在のDDDAシステムが完全に取り逃がす他の領域を表す。薬剤は疾患経路の別個の工程に作用することによって、疾患プロセスに相乗的に作用し得る（図2）。これらの相互作用は、一回に一つの標的酵素又は遺伝子を測定するスクリーニング手順を介して観察し得ないだろう。なぜなら、薬剤の併用はそれ自体特許性があり、製薬会社に更なる排他的期間を与えることができるため、効果的な予期せぬ薬剤の併用を同定し損ない、これは産業に対する甚大な商業的損失を表す。本発明の方法は併用療法をハイスループットスクリーニングアプローチによって系統的に同定することを可能にする（表５）。
Figure 2007522437
同一経路中で異なる作用部位を有する作用物質は、目的の経路を介した流速(例えばデノボDNA合成の流速；図3参照)にin vivoで補足的、相乗的又は拮抗的な効果を有し得る。
これらの作用物質間の相互作用は、疾患関連経路中の1つの分子標的及び工程を1回調査する現在の又は従来のアッセイの使用によって検出又は定量することはできない。かなり有用な薬剤併用療法の多くの例は、一般的には偶然の発見若しくは疾患を有するヒトにおける試行錯誤によって、又は理論的な生化学的相互作用に基づいて、内科治療（表5参照）において明らかにされてきた。経路を介した流れに対する効果について作用物質の組合せを系統的にスクリーニング及び評価する方法、特に既知の承認薬をスクリーニング及び評価する方法は予め利用可能ではなかった。本明細書に開示する方法は、効果的な療法の組合せを同定する、開発する及び承認する工程を促進するだろう。
別の実施形態では、本発明の方法は、化合物の毒作用を検出する際に有用である。化合物の予期せぬ毒性は、しばしばフェーズII〜IIIのFDA臨床試験において、又はさらに悪くは薬剤の承認後の臨床的使用中に明らかになる。かかる毒性はありふれており、製薬産業に対する莫大な金融赤字源を代表する。DDDAプロセスにおいて大部分の毒性を早期に同定するための又は臨床的徴候及び症状前にその発生をモニターするためのDDDAシステムの欠点は、製薬会社の商業的収益性のみならず公衆衛生にも悪影響を有する現在のDDDAプロセスの基本的な欠点を代表する。かかる毒作用（予期せぬ毒性）には末端器官の毒性を含み得る。末端器官の毒性には、これに限定されるものではないが、肝細胞増殖及び破壊、尿細管細胞代謝回転、リンパ球代謝回転、精母細胞代謝回転、筋肉及び心臓でのタンパク質合成及び分解、肝臓コラーゲンの合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリン合成及び分解、乳房上皮細胞増殖、結腸上皮細胞増殖、前立腺上皮細胞増殖、卵巣上皮細胞増殖、子宮内膜細胞増殖、気管支上皮細胞増殖、膵臓上皮細胞増殖、皮膚でのケラチン合成、ケラチノサイト増殖、免疫グロブリン合成、ミトコンドリアDNAの合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質の合成及び分解、ミトコンドリアタンパク質の合成及び分解、脂肪脂質の合成及び分解、並びに脂肪細胞の合成及び分解が含まれ得る。
E．同位体摂動型分子
別の変形において、この方法は単離した同位体摂動型分子（例えば標識した脂肪酸、脂質、炭水化物、タンパク質、核酸等）の製造を提供する。これらの単離した同位体摂動型分子には、目的の代謝経路内の分子の流れを測定する際に有用な情報が含まれる。生物の細胞及び/又は組織から一旦単離されれば、上記されるように、情報を抽出するために1以上の単離した同位体摂動型分子が分析される。
F．キット
本発明はまた、in vivoで分子流速を測定しかつ比較するためのキットを提供する。このキットは同位体標識した前駆体分子を含んでもよく、そして組織サンプルを取得するために必要なタンパク質及び/又は化学物質を分離する、精製する又は単離するための当該技術分野で知られる化学化合物、組合せ分析のための自動算出ソフトウェア、及び該キットを使用するための指示書をさらに含んでもよい。
水を投与するための道具（例えば計量カップ、針、注射器、ピペット、IVチューブ）等の他のキット構成品も、必要に応じてキット中に提供することができる。同様に、細胞、組織又は生物からサンプルを取得するための器具（例えば、試料カップ、針、注射器及び組織採取装置）も必要に応じて提供することができる。
G．情報記憶装置
本発明はまた、本発明の方法によって収集したデータを含む、紙レポート又はデータ記憶装置等の情報記憶装置を提供する。情報記憶装置には、これに限定されるものではないが、紙面若しくは同様の有形的表現媒体に書かれたレポート、プラスチック製の透明シート若しくはマイクロフィッシュに書かれたレポート、及び光学式媒体又は磁気媒体（例えば、コンパクトディスク、デジタルビデオディスク、磁気ディスク等）に記憶されたデータ、又は情報を一時的に又は永久的に記憶するコンピューターが含まれる。データはコンピューター内に少なくとも部分的に含まれてもよく、そして電子メールのメッセージの形態であってもよく、別個の電子ファイルとして電子メールのメッセージに添付されてもよい。情報記憶装置内のデータは「未加工」（すなわち分析されずに収集される）であっても、部分的に分析されても又は完全に分析されてもよい。データ分析はコンピューター又は他の幾つかの自動化装置を経由してもよいし又は手動で行ってもよい。情報記憶装置は、更なる分析若しくは表示又はその両者のために、別個のデータ記録システム（例えば、コンピューター、ハンドヘルド・コンピューター等）にデータをダウンロードするために使用され得る。あるいは、情報記憶装置内のデータは、更なる分析若しくは表示又はその両者のために、紙、プラスチック製の透明シート又は他の同様の有形的表現媒体に複製し得る。
H．実施例
以下の非限定的な実施例は本明細書に開示の発明をさらに説明する。当業者は実施例に記載される、上述される、及び本明細書の開示に照らして解釈される手順における変形が、クレームされる発明に完全に包含されることを理解するだろう。
実施例１：化合物への曝露後の、ラットにおけるトリグリセリド（TG）合成（脂肪生成）及び分解（脂肪分解）の測定
化合物が脂肪生成を阻害するか否か（及びその結果、肥満又は他の代謝性疾患を治療するための候補薬剤）を評価するために、Sprague-Dawleyラット（200〜300g Simonsen Labs, Gilroy, CA）を化合物に曝露するか又は曝露しないままにする（すなわち対照）。ラットには強制飼養を介して化合物又はビヒクルが投与される。1種又は数種の化合物を投与し得る。例えば、何千もの化合物を最初にスクリーニング、プール、再スクリーニング、サブプール等して1以上の活性化合物をスクリーニングし得る。99.8％ 2H2Oの初回プライミング用量を腹腔内注射を介して与え、約2.5%の体内水富化（体重の60％を水と仮定する）を達成し、その後、飲料水中4％の2H2Oを最大で12週間投与する。
脂肪組織サンプルを1mlメタノール：クロロホルム（2:1）を含む二重の組織ガラス研磨機（例えば、Kontes組織研磨機、Kimble Kontes, Vineland, NJ）に置き、その後タンパク質を除去するために均質に遠心分離されるまで研磨する。この溶液をそれぞれ2mlのクロロホルムと水で抽出する。水相を捨て、脂質画分を3N メタノールHCl（Sigma-Aldrich）と共に55℃で60分間インキュベートすることによってトランスエステル化する。脂肪酸メチルエステルを、5％ NaClというよりむしろ純水を水相に使用するよう改変したFolch技術によってグリセロールから分離する。次いで、グリセロールを含む水相を凍結乾燥し、グリセロールを他で記載されるように（参照により本明細書に組み入れるHellerstein, M. K., R. A. Neese及びJ. M. Schwarz. Am J Physiol 265: E814-20, 1993）無水酢酸：ピリジン（2:1）と共にインキュベートすることによってグリセロールトリアセテートに変換する。一部のサンプルを抽出し、次いで、他に記載されるように（参照により本明細書に組み入れるJung, H. R., S. M. Turner, R. A. Neese, S. G. Young及びM. K. Hellerstein. Biochem J 343 Pt 2:473-8, 1999）薄層クロマトグラフィー（TLC）によって他のアシルグリセリドからTGを分離し、その後、上述されるように分析する。
グリセロールトリアセテートは上述されるようにGC/MSによって同位体富化について分析される。
新たに合成されるTGの画分である(f)は上述されるように算出される。
2H2O標識化の間のTG-グリセロールにおける理論上の水平状態（plateau）値又は漸近値（A1 ∞）は2つの方法で、すなわち、グリセロールにおける組合せ標識パターンの質量アイソトポマー分布解析（MIDA）（A1 ∞ mida）によって、及び「完全に置換した」TG蓄積部に達した水平状態富化（A1 ∞水平状態）の測定によって決定する（以下参照）。次いで標準的な前駆体-生成物式：
f=1-e-ks＊t
ks=-In(1-f)/t
[式中、ksは画分置換又は合成速度定数を表し、tは標識化の時点である]
を適用する。
脂肪TGの絶対合成速度は、標識期間にわたって測定した画分合成（ks）をTGのプールサイズと掛け算することによって算出する。この算出のために、TG含量は肥満でない若齢の齧歯動物の体重の10％であると仮定される。脂肪組織TGの絶対合成速度は以下のように算出することができる：
絶対合成（mg/d）=ks(d-1)×TG含量（mg）
統計分析に関して、有意性の基準としてp＜0.05を有する群を比較するためにANOVAが使用される。標識組込みデータの曲線適合はデルタグラフを用いて行われる（Delta Point, Inc.）。
次いで、TG合成速度が、化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）が脂肪生成を阻害するか否かを判定するために、曝露された動物と曝露されない動物との間で比較される。
上述されるものと同一のプロトコールを用いて、化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）が脂肪分解を刺激するか否かも評価し得る。個々の脂肪蓄積部における純(net)脂肪分解（TG分解）速度は、TG合成の絶対速度とTG蓄積の純速度との間の差異から算出する（ここで、後者は脂肪体又は全身における長期間体重の変化から決定される）：
純脂肪分解（mg/d）＝絶対TG合成−純TG蓄積
＝([ks(d-1)×TG含量(mg)]−[(TG含量の変化)/時間(d)]
次いで、化合物に曝露された動物は、化合物（又は化合物の組み合わせ若しくは化合物の混合物）が脂肪分解活性を有するか否かを判定するために曝露されていない動物と比較される。
実施例2：化合物への曝露後の、ラットにおけるDNAの合成及び分解の測定
DNA合成は細胞増殖の生物指標である。一部の背景（setting）では、細胞増殖を刺激する（例えば創傷治癒を刺激する）ことが望まれてもよく、他の背景では、細胞増殖（例えば癌）を阻害することが望まれてもよい。
ラットに2H2Oを実施例1（前掲）で議論されるように投与する。
ラットに化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）又はビヒクル（対照）のいずれかを実施例1（前掲）で議論されるように投与する。
次いで、DNAを目的の組織又は細胞からQiagenキット（Qiagen, Valencia, CA）を製造者のプロトコールに従って用いて単離する。
次いで、同位体富化を分析し記載されるように（前掲）流速を算出する。次いで、DNA合成を上に（及び参照により組み入れる米国特許第5,910,403号に）記載されるように測定する。次いで、化合物に曝露された動物を、この化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）がDNA合成に対する効果を有するか否かを判定するために曝露されていない動物と比較する。
実施例3：化合物への曝露後の、ラットの海馬神経前駆体細胞における神経形成の測定
化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）は、1以上が神経形成に対する効果を有し得るか否かを判定するためにラットで試験する。神経形成の潜在性を有する化合物は、脊髄損傷、パーキンソン病、ハンチントン病及び他の神経変性障害を治療する際の使用を見出し得る。ラットを曝露群と対照群とに分割し、実施例1（前掲）のように標識水を投与する。強制飼養、鞘内投与又は頭蓋内投与（当該技術分野で周知であるように、投与経路は化合物、化合物の組合せ又は化合物の混合物の化学的性質に左右される）による化合物又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物(又は、対照ラットの場合、ビヒクル)への曝露後に、ラットをケタミン、キシラジン及びアセプロマジンによって深麻酔する。次いでラットの首を切断し、全脳を取り出す。
神経形成分析用の組織を単離するために、脳を縦に二等分し、海馬白板に沿う天然の分離線（separation line）を用いて各海馬葉をこれを覆う大脳白質から分離する。海馬ふさ及び海馬支脚の白質を取り出す。
組織を細かく刻み、HBSSに溶解したパパイン（2.5 U/ml；Worthington, Freehold, NJ）、DNアーゼ（250 U/ml, Worthington）及び中性プロテアーゼ（1 U/ml ディスパーゼ；Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）の溶液中、45分で消化する（あるいは、組織は0.1％パパインと0.01％DNアーゼの混合液を含むDMEM中、45分で消化することもできる）。
細胞及び組織断片を10％FBSを含むDMEM（Hyclone, Logan, UT）で3回洗浄する。
次いで、完全な消化組織をDMEM-10% FBS中で懸濁し、滅菌の107μMナイロンメッシュを介して濾過し、そして等量のPercoll溶液と十分に混合する。Percoll溶液はPercoll（9部）（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を10×PBS（１部）（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）と混合することによって作製される。
次いで、細胞懸濁液を遠心分離によって細分する（30分、18℃、20000×g）。細胞画分を回収し、DMEM-10% FBS中で3回以上、Percollのない状態で洗浄処理する。
DNA合成は実施例2（前掲）のように測定する。
次いで、この化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）が海馬神経前駆体細胞におけるDNA合成に対する効果を有するか否かを判定するために、化合物に曝露した動物を曝露していない動物と比較する。
実施例4：化合物への曝露後の、マウス由来のアルツハイマー病関連タンパク質の流速の測定
マウスをラットに関する実施例1（前掲）に記載の手順を用いて2H2Oで標識する。強制飼養、鞘内投与又は頭蓋内投与を介してマウスに化合物を与える。アミロイドベータ(Aβ)タンパク質を単離するために尿を集める。総尿タンパク質を濃縮し、免疫親和性精製に適切なバッファーに移す。免疫親和性精製後、Aβはサイズ排除及び/又は逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製することができる。精製したペプチドの同一性は、ELISA、ウエスタンブロット、及びLC-MS(ESI)によって確認される。
マウスを犠牲にし、脳組織を抽出し、そしてアミロイド前駆体タンパク質（APP）とAPPのC末端断片（CTF）を取得する。脳タンパク質は中性バッファー中で抽出し、不溶性物質を除き、そしてタンパク質を沈殿させる。生じた物質をイオン交換バッファーへ移し、イオン交換クロマトグラフィー及びその後、サイズ排除及び/又は逆相クロマトグラフィーによって精製する。精製したタンパク質の同一性はELISA及びウエスタンブロットによって確認する。
Aβ、APP及びCTFの富化は上述されるように行う。Aβ、APP及びCTFの分子流速は上述されるように算出する。次いで、化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）がAβ、APP及びCTF合成又は分解に対する効果を有するか否かを判定するために、化合物に曝露された動物を曝露されていない動物と比較する。
実施例5：化合物への曝露後の、正常ラットにおけるグルコースの解糖除去
解糖除去はインスリン耐性及び2型糖尿病の生物指標である（Reaven GM. Banting Lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes 37(12): 1595-607, 1988参照）。実施例1（前掲）のように、ラットは化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）に対するin vivoでの解糖除去を測定するために使用する。
2Hグルコース標識プロトコールは99.9％[6,6-2H2]グルコースの初回腹腔内(ip)注射からなる。ラットを標識するために、体重1g当たり2mgの標識グルコースを導入する。体内水は様々な時点で血清として回収する。化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）は強制飼養によって投与する。
解糖は、投与した[6,6-2H2]グルコースの、分子グルコース及び分子水中の異なるモル量の重水素を占めるように規準化された割合として、体内水中の重水素を測定することによって測定する。重水素化水は上述されるように測定される。任意の化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）が解糖に対する効果を有するか否かを判定するために、薬剤に曝露されたラットの解糖は曝露されていないラットの解糖と比較される。
実施例6：化合物への曝露後の、再ミエリン化の測度としての脳ガラクトセレブロシド代謝回転
ラットに実施例1（前掲）のように重水素化水を与える。ラットに、強制飼養、鞘内投与又は頭蓋内投与を介して化合物（すなわち、脱ミエリン化の阻害及び/又は再ミエリン化の刺激について承認されていない化合物）を投与する。脱ミエリン化は多発性硬化症(MS)の重要な生物指標である。脱ミエリン化はMSを治療するための潜在的な薬剤候補を示し得る。
一組の2ｍLの微小遠心チューブを計量する。脳をラットの死体から回収し、予め計量した微小遠心チューブに入れる。微小遠心チューブを再度計量する。純重量は脳の重量である。脳を氷冷したガラス平板上に置き、10個のBHTの結晶を添加する。脳を1分間細かく刻むために剃刀の刃を用いる。刻んだ脳を微小遠心チューブに戻すためにへらを用いる。脳はへらで十分に細かくする。80〜120mgの刻んだ脳を、組織がチューブの底面にあることを保証するPTFEネジ蓋付きの13×100mmガラスチューブへ入れる。残りの脳は微小遠心チューブ中、20℃で保存する。BHTを含む2mLのクロロホルム-メタノール2:1（v/v）をガラスチューブに添加し、チューブをボルテックス混合する（これは全ての組織が溶剤中に浸透することを保証する）。暗下、室温で3時間放置する。キャップをガラスチューブからはずす。チューブを室温で10分間、2000RCFで遠心する。上清（脂質抽出物）を2mLのネジ蓋の付いたバイアルに注ぎ、固形残存物を捨てる。
100mLの展開溶媒（クロロホルム-メタノール-水：69.15％：26.60％：4.26％）をTLC平板への添加の1時間前にTLC分離槽に添加する。A20 mLピペットは、Whatman LK6DFシリカゲル60TLC平板のレーン1、10、19に20mLの総セレブロシド標準をスポットするために使用する。各サンプルについて、20mLピペットは2つの隣接するレーンに100μLの脂質抽出物をスポットするために使用する（50mL/レーン）。TLC平板が視覚的に渇いて見えるまで待機する。TLC平板を展開槽で展開する。各槽は互いに向かい合った2つのプレートを保持する。通常、平板が完全に展開するのに40〜45分かかる。TLC平板の展開後、平板が乾燥するまで15分間待機する。20個のヨウ素結晶を特にヨード蒸気に使用される槽に入れる。この槽を80℃に設定したヒートブロックに置く。乾燥したTCL平板を二重結合を含む脂質のスポットを視覚化するためにヨード槽に入れる。総セレブロシド標準のスポットはサンプルのものと適合する。TCL平板の像はコンピューターで走査する。シリカゲルは計量ボックスで回収し、12×75mmの使い捨てガラスチューブに移す。1mLのクロロホルム-メタノール2:1をBHTと共に添加し、ボルテックス混合する。シリカが安定するまで放置する。溶剤を13×100mmのネジ蓋チューブに注ぐ。固形残存物を捨てる。1mLの3N メタノールHClをチューブに添加し、きつく蓋をする。チューブを80℃のヒートブロックに2時間置く。次いで、チューブをヒートブロックから取り、室温まで冷却する。1.5mL H2Oと3mL ヘキサンをチューブに添加し、チューブをボルテックス混合する。1.8〜2mLの底層（メチルグルコース及びメチルガラクトース）をGCバイアルに移す。GCバイアルをJouan 10.10スピードバックのはめ込み式回転体に入れ、回転体を安定させ、60℃に設定する。チューブが乾燥するまで真空処理する。100μLの無水酢酸-ピリジン2:1(v/v)をGCバイアルに添加し、このバイアルに蓋をして、室温で一時間放置する。次いで、バイアルが乾燥するまでN2を吹き付ける。100μLの酢酸エチルを添加し、バイアルをボルテックス混合する。混合液をGCインサートに移し、バイアルをクランパーでキャッピングす
る。サンプルにGC/MSを実行し、ガラクトセレブロシド富化を測定する。ガラクトセレブロシドの分子流速を、化合物（又は化合物の組合せ若しくは化合物の混合物）に暴露したラット及び曝露していない（ビヒクル対照）ラットから、上述されるように決定する。対照ラットのガラクトセレブロシド富化以上のガラクトセレブロシドの富化は、ガラクトセレブロシドの合成及び可能な再ミエリン化の増加を示す。対照未満の富化は脱ミエリン化を示す。
実施例7：リポ多糖（LPS）への曝露後の予期せぬ神経形成
マウス群（n=5/群）に2H2Oのボーラス（Spectra Isotopes, Columbia, MD）を体内水中5％ 2H2Oまで与え、飲料水として8％ 2H2Oを与えた。マウスを2H2Oで45日間維持し、その期間間、マウスは生理食塩水中のリポ多糖（LPS）（Sigma, St. Louis, MO）も一日おきに体重1kg当たり1若しくは4mgで注射されたか、又は注射されなかった。
マウスを二酸化炭素で安楽死させ、その脳を取り出した。海馬をばらばらにし、トリプシン処理し、ニューロンに特異的なマーカーである破傷風毒素（Ttx）で染色し、その後FITC標識した抗Ttx抗体（Roche, Basel Switzerland）で染色した。Ttx及びPI(DNA)陽性細胞を細胞分別機（Coulter EPICS Elite）で単離し、単離した細胞を市販のキット（DNeasy tissue kit, Qiagen, Valencia, CA）により、そのDNAを単離した。その後、DNAを加水分解し、誘導体化し、そして上述されるように分析した。
神経細胞は用量依存的様式でLPSに対してより早く代謝回転するように見えた（図4参照）。記載されるように与えたLPSは齧歯動物における脳内炎症反応（neuroinflammation）を誘導することが知られる。異なる、感受性を低下させる技術を用いた脳内炎症刺激による以前の研究は、脳内炎症反応と神経形成の抑制との間の潜在的な関連を示してきた。この点を考慮して、当該技術分野で周知であるように（例えばEkdahl C.Tら. Proc. Natl Acad. Sci. 2003 100(23):13632-13637（LPSへの恒常的曝露の存在下で神経形成が減少することが観察された）を参照）、LPSへの神経前駆体細胞の恒常的曝露が神経前駆体細胞の生存性に逆効果となり、その結果、神経形成を低下させることが予想されるため、本願出願人はよりゆっくりと代謝回転するニューロンを観察することを予想した。図5で理解できるように、全く逆のことが観察された。特に、算出した新規ニューロンの画分合成速度(f)は、fの低下が期待された結果であった際に、LPSへの曝露後にほぼ倍になった（約7％から約14％）（図4参照）。神経形成の増加は抗うつ剤（例えばフルオキセチン）と関連するため、これらの結果は、LPSがうつ状態を緩和（LPSの以前に知られていない指標である）し得ることを示唆する。
実施例8：レプチンへの曝露後の、ob/obマウスにおける脂肪細胞増殖の予期せぬ減少
4週齢のメスC57/bl6jマウス（Jackson Labs Bar Harbor, MT）を調査した：C57/bl6j+/?対照（con）、不断給餌C57/bl6jlep-/lep-(ob/ob)、レプチン処理したob/ob(ob-lep)及び食餌制限したob/ob(ob-r)。マウスをワイヤーで吊るした檻で個別に収容し、AIN 93精製飼料（Bio Serv, Frenchtown, NJ）を与えた。マウスに3日与えて環境に順応させ、その後マウスは正常に生育した。全ての処理及び調査は、2H2Oによる標識化の開始の5日前から開始した。
ob-r群の食物摂取量を制限し、自動化ペレット分配器（Coulbourn Instruments, Allentown PA）によって連続的な様式で与えた。
ob-lepマウスに、28日間、Aletミニ浸透圧ポンプ（Alza Corp. Palo Alto CA）を介して、1日当たり2μgの用量でマウスレプチン(Amgen, Thousand Oaks CA)を皮下に与えた。
マウスに2H2O（重水素化水）0.012ml/mgを注射した。次いで、通常の飲料水を4％2H2Oまで富化した水で置き換えた。2H2O処理は食物摂取量又は体重に影響を有しなかった。2H2O投与の開始後21日で、マウスを4時間絶食させ、イソフルランで麻酔し、心臓穿刺器具を介して放血させた。
脂肪組織の調製及び脂肪細胞の単離
脂肪体を単離し、鼠径及び後腹膜体（retroperitoneal pad）を切断し、右側と左側を分析のためにプールした。
切断の直後に、Rodbellの方法（Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis. J. Biol. Chem 239, 375-380 (1964)）に従って成熟脂肪細胞を単離するために、予め計量したチューブ中、カルシウムを含むHBSS中に脂肪体を入れた。細かく刻んだ組織を0.1％のII型コラゲナーゼ（Worthington）を含むHBSS中に入れた。組織を37℃で最大90分インキュベートした。サンプルを800rpmで10分間回転させた。脂肪細胞が富化した画分を中央の画分から慎重に取り出し、そして凍結した。
脂肪細胞からのDNAの単離と誘導体化
脂肪細胞の凍結スラリーを凍結乾燥し、サンプルの乾燥重量を測定し、その後サンプルを消化し、DNAを他に記載されるように（Neese, R.Aら. Advances in the Stable Isotope-Mass Spectrometric Measurement of DNA Synthesis and Cell Proliferation. Anal Biochem 298, 189-195. (2001)）Quiagen DNeasy tissue kitを用いて単離した。各サンプルからのDNAの収量をPharmacia Biotec Genequant II分光測光器で測定した。
10〜25μgのDNAを、他に詳細に記載されるように（Neese, R.Aら. Advances in the Stable Isotope-Mass Spectrometric Measurement of DNA Synthesis and Cell Proliferation. Anal Biochem 298, 189-195. (2001)）個別のリボ核酸に加水分解した。単離したデオキシアデノシンを既に記載されるように（Neese, R.Aら. Advances in the Stable Isotope-Mass Spectrometric Measurement of DNA Synthesis and Cell Proliferation. Anal Biochem 298, 189-195. (2001)）還元し、アセチル化した。生じた酢酸エチル中の五炭糖−テトラ酢酸（PTA）誘導体を、DNAのデオキシリボース部分の同位体富化を測定するために、GC/MSに注入した。
H 2 Oの誘導体化と分析
体内水中の2H2O富化は、他で詳細に記載されるように（Neese, R.Aら. Advances in the Stable Isotope-Mass Spectrometric Measurement of DNA Synthesis and Cell Proliferation. Anal Biochem 298, 189-195. (2001)）、血漿サンプルから誘導体化したテトラブロモエチレンで測定した。
GC/MS分析
モデル5970及び5971 GC/MS又は5973機器（Agilent, Palo Alto, CA）を、グリセロールトリアセテート脂肪酸メチルエステル及びテトラブロモエチレンの同位体富化を測定するために使用した。
テトラブロモアセチレンをDB-225溶融石英カラムを用いて分析し、m/z 265及び266をモニターした（親のM0及びM1質量）。既知の2H2O富化の標準曲線を各サンプル群の前後に実行し、同位体富化を算出した。
PTAサンプルを6890 GC及びオートサンプラーを備えたHPモデル5973 MS（Agilent, Palo Alto, CA）で、重水素の組み込みについて分析した。メタンCIをm/z 245〜256の選択イオンモニタリング下で（M0及びM1質量を表す）、30m DB-225カラムを用いて使用した。天然存在量の（非富化型）dAサンプルを同時に測定し、脂肪PTAサンプル中の過剰M1(EM1)存在量を差（サンプル中のM1存在量の、非富化型標準で測定したM1存在量からの減算）によって算出した。画分脂肪細胞置換を算出するために、既に記載されるように（Neese, R.A.ら. Advances in the Stable Isotope-Mass Spectrometric Measurement of DNA Synthesis and Cell Proliferation. Anal Biochem 298, 189-195. (2001)）骨髄DNAサンプルを同時に実行かつ使用して完全に又はほぼ完全に代謝回転した組織を表した。
計算
（図5参照）。
実施例9：低用量のグリセオフルビンへの曝露後の、マウスにおける肝細胞増殖の予期せぬ増加
マウスに2H2O（マウスを重水素化水で5日間（実験期間）維持したことを除いて、実施例7（前掲）に記載されるように）を与え、対照群（グリセオフルビンへの曝露なし）、低用量群（1％グリセオフルビン、観察可能な効果を有しないレベル及び血漿中で上昇レベルの肝臓酵素を誘導しない用量）、中位用量群（2％グリセオフルビン、血漿中で上昇レベルの肝臓酵素が検出され始める用量）、及び高用量群（5％グリセオフルビン、血漿中の上昇レベルの肝臓酵素によって測定される、肝臓に対する毒作用をはっきりと誘起する用量）に分けた。細胞増殖は上述されるように測定した。グリセオフルビンは、肝細胞増殖及びポルフィリン症を生じさせる肝臓毒素として認識されている。グリセオフルビンは固形飼料（1％w/w）で5日間マウスに投与した。処置の5日後に、曝露したマウスにおける細胞増殖は、観察可能な効果レベルのないもの（NOEL）として報告された用量（1％）での肝細胞増殖の増加を示した（図6参照）。1％用量は、上昇レベルの血漿肝臓酵素を誘導しなかった（これはNOELと一致する（データは示されない））。期待した結果がNOEL及び論文中の報告に基づく観察可能な毒性の欠如であったため、NOEL用量（すなわち低用量）での肝細胞増殖の増加はグリセオフルビンに対する予期せぬ毒性反応であった。
実施例10：低用量の選択的エストロゲン受容体モジュレーターへの曝露後の、正常なラット及び卵巣を切除したラットにおける乳房上皮細胞増殖の予期せぬ減少
ラットをカリフォルニア大学バークレー校の動物施設又はKineMed生態動物園で、温度と湿度を調節した環境（12時間明所/12時間暗所のサイクル）で維持した。動物の世話及び実験手順は、研究の場所に応じて、カリフォルニア大学（バークレー）のAnimal Care及びUse Committee又はKineMedのInternal Animal Care及びUse Committeeによって承認された。ラットを標準的な齧歯動物飼料及び無制限に与えた水で維持した。ラットを心臓穿刺による最後の出血前に、CO2窒息によって犠牲にするか又はイソフルランによって麻酔した。
安定同位体標識：
ラットを、0.9％NaClを含む滅菌の99.8％2H2Oのボーラス腹腔内注射を与えて、すばやくラットを所望の体内水富化まで到達させ、その後直ちに、飲料水を2H2Oで研究に応じて4又は8％まで富化したもので置き換えることによって、重水素化水（重水、2H2O）で標識した。8％を使用した場合、注射は1/2注射量で二回行うことによって、一度に大量に注射することを回避した。各研究に使用した2H2O％は研究設計を記載する際に示されよう（下記）。
選択的エストロゲン受容体モジュレーター（SERM）研究：
2つの異なるSERMの抗増殖効果を、無傷のメスSprague-Dawleyラット及び17β-エストラジオール置換と共に又は伴わずに卵巣切除されているSprague-Dawleyラットで試験した。徐放性ペレットをInnovative Researchから購入した。選択した薬剤のレベルは、乳腺の生物学及び発癌性を引き起こすことが以前に報告された非常に低級のものであった（5mg、(Weckbecker G, Tolcsvai L, Stolz B, Pollak M,及びBruns C. Somatostatin analogue octreotide enhances the antineoplastic effects of tamoxifen and ovariectomy on 7,12-dimethylbenz(alpha)anthracene-induced rat mammary carcinomas. Cancer Res 54: 6334-6337, 1994)）。最初に、2.5、5及び10mgのタモキシフェンペレット（21日にわたって持続的に放出する薬剤として設計された）を、用量反応曲線を作成する目的で選択した。次いで、非常に低用量のタモキシフェン（0.1、0.5及び1.0mg）を調査した。タモキシフェン研究の結果に基づき、ラロキシフェンを論文で報告される（約5.9mgの21日ペレットと同量の皮下注射用量）（Kubatka P, Bojkova B, Kalicka K, Chamilova M, Adamekova E, Ahlers I, Ahlersova E及びCermakova M. Preventive effects of raloxifene and melatonin in N-methyl-N-nitrosourea-induced mammary carcinogenesis in female rats. Neoplasma 48: 313-319, 2001）よりも低用量で（0.1〜2.5mgの21日ペレット）試験した。
ラットをイソフルランで麻酔した。薬剤のペレット、エストラジオール及び/又はプラセボペレットを、小切開（＜1/2 cm）を介して肩より上に無菌的に（aspetically）に皮下挿入した。創傷クリップを用いて切開を閉じた。
骨髄の単離：
大腿部の骨髄をMedium 199で一掃し、収集した。細胞を100×gで遠心分離してペレットを収集した。
乳腺の酵素的細胞解離：
MECを既に記載されるように（Yang J, Guzman R, Richards J, Jentoft V, DeVault MR, Wellings SR及びNandi S. Primary culture of human mammary epithelial cells embedded in collagen gels. Journal of the National Cancer Institute 65: 337-343, 1980）酵素的細胞解離によってラット組織から単離した。簡潔に言うと、乳房組織を、0.5％IV型コラゲナーゼ（Worthington Biochemical, Lakewood, NJ）及び1:100希釈の抗生物質/抗真菌カクテル（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含むMedium 199(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で37℃で一晩消化することによって、単一の細胞懸濁液まで酵素的に解離させた。1個体の動物由来の乳腺を、総量約50mlで消化する前にきれいに切断した。次いで、消化物（digestate）を300×gで10分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを2.5mlの（37℃まで暖めた）Medium 199中で再懸濁した。細胞外DNAを除去しかつ細胞凝集を低減するために、100μl/mlのDNアーゼI（2000 Kunitzユニット/ml）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を暖めた培地中の細胞へ添加した。細胞を最も高い設定で1分より長くボルテックス混合し、細胞懸濁液をMEC単離前に40ミクロンのナイロンメッシュを介して濾過した。この工程により細胞外DNAを除去し、その結果、その後のPercoll勾配分離又は免疫磁性ビーズ単離の間の細胞の汚染及び凝集を防いだ。
Percoll勾配遠心分離による単離：
細胞を2.5mlのMedium 199中で再懸濁し、予め調製したPercoll勾配（16 mlのMedium 199＋1.2 mlの10X Hanks Balanced Salt Solution (GibcoBRL, Grand Island, NY)＋20000×gで1時間遠心分離した10.8 mlのPercoll）の最高位に層化した。細胞分離を達成するために800×gで15分間遠心分離した。中間層（単離したMEC）を取り出し、Medium 199で1回洗浄した。
免疫磁性ビーズ法によるMEC単離：
細胞を免疫磁性ビーズ法（MACSTM）を用いて製造業者の推奨（Miltenyi Biotech Inc., Auburn, CA）によって単離した。簡潔に言うと、細胞をペレット化し、1mlの標識バッファー（0.5％ウシ血清アルブミン及び2mM EDTA）で2回洗浄した。細胞を標識バッファー中4℃で30分間、100μlの1:50希釈のマウス抗ラット上皮膜抗原（EMA）の一次抗体（University of Iowa, Developmental Studies Hybridoma Bank, clone Ha4C19, custom biotinylated by Vector Labs, Burlingame, CA）中でインキュベートした。細胞を1mlの標識バッファーを添加し、300×gでペレット化することによって洗浄した。ストレプトアビジン又は抗ビオチン磁性ビーズ（Miltenyi Biotech Inc., Auburn, CA、80μlの標識バッファー中、107個の細胞当たり20μlのビーズ）による二次標識化のために、細胞を標識バッファー中4℃で30分間、推奨される濃度の免疫磁性試薬中でインキュベートした。細胞を、磁性カラム（Miltenyi Biotech Inc., Auburn, CA）に充填するために、1mlの標識バッファーを用いて洗浄し、300×gでペレット化し、500μlの標識バッファー中で再懸濁した。カラムを磁性保持器に設置し、標識バッファーで前調整し、サンプルをロードし、標識バッファーで3回洗浄して非標識細胞を溶出した。次いで、カラムを磁石から取り出し、陽性細胞画分を1mlの標識バッファーを含むカラムに沈めて、収集した。細胞を1 X PBS中で洗浄し、過剰なEDTA（EDTAはDNA加水分解酵素を妨害できる）を除去した。
GC/MS分析のための、DNA単離、ヌクレオシドへの加水分解、及び誘導体化：
DNAの沈殿及びヌクレオシドへの加水分解手順は既に詳細に記載されている（McCune JM, Hanley MB, Cesar D, Halvorsen R, Hoh R, Schmidt D, Wieder E, Deeks S, Siler S, Neese R及びHellerstein M. Factors influencing T-cell turnover in HIV-1-seropositive patients [コメント参照]. Journal of Clinical Investigation 105: R1-8, 2000）。簡潔に言うと、細胞（MEC及び骨髄細胞）を溶解し、DNAをQiagen QiAmpカラムを用いて単離した。DNAを塩基性条件下で、ヌクレアーゼP1（Roche, Indianapolis, IN）、ヘビ毒ホスホジエステラーゼI（Sigma, St Louis, MO）、DNアーゼ（Sigma, St. Louis）及びアルカリホスファターゼ（Sigma, St Louis, MO）を用いて酵素加水分解に供した。近年、費用をかなり低減しかつスループットを増加させる2つの酵素法が開発されている。この方法は、いずれも様々な供給源から商業的に購入可能な酸性ホスファターゼ及びヌクレアーゼS1による酸加水分解を含む。
誘導体化方法：
マウス及びホルモン処置したラットにおける最初の研究では、dAを既に記載されるようにアルドニトリルエトリアセテート(aldonitriletriacetate)（dRATA）誘導体に変換した。この誘導体化方法は既に記載されている（Neese RA, Misell LM, Turner S, Chu A, Kim J, Cesar D, Hoh R, Antelo F, Strawford A, McCune JM, Christiansen M及びHellerstein MK. Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15345-15350, 2002.）。さらに、より感度の高い最新のDNA誘導体化方法を、後のSERM薬剤処理（ラロキシフェン及びタモキシフェン）の研究のために開発し、使用した。このペンタフルオロベンジル誘導体（PFBHA）を、酸性条件下での過剰なペンタフルオロベンジルヒドロキシアミンによる酵素的DNA消化反応、これに続く無水酢酸によるアセチル化によって調製した。
GC/MS分析：
5890 GC及びオートサンプラーを備えたHPモデル5971又は5973MS（Hewlett-Packard, Palo Alto, CA）を用いた。誘導体化デオキシリボースのために選択したイオン記録様式下で、質量対電荷比（m/z）198、199でのイオンの存在量をdRATA誘導体について定量し、(m/z)245、246をPTA誘導体について定量し、そして(m/z)435、436をPFBHA誘導体について定量した（Neese RA, Siler SQ, Cesar D, Antelo F, Lee D, Misell L, Patel K, Tehrani S, Shah P及びHellerstein MK. Advances in the stable isotope-mass spectrophotometric measurement of DNA synthesis and cell proliferation. Analytical Biochemistry 298: 189, 2001）。DNA標準のバックグラウンド同位体富化をサンプルと同時に実行し、サンプル富化から差し引いた。MECのEM＋1（バックグラウンド富化を超える過剰なM＋1）(m/z 199、246又は436)富化を同一の動物由来の骨髄（完全に代謝回転した組織）EM＋1富化で割算して、MECの画分代謝回転を決定した（Neese RA, Siler SQ, Cesar D, Antelo F, Lee D, Misell L, Patel K, Tehrani S, Shah P及びHellerstein MK. Advances in the stable isotope-mass spectrophotometric measurement of DNA synthesis and cell proliferation. Analytical Biochemistry 298: 189, 2001）。
体内 2 H 2 O富化の測定：
体内水富化は既に記載されるようにGC/MSによって測定した（Neese RA, Siler SQ, Cesar D, Antelo F, Lee D, Misell L, Patel K, Tehrani S, Shah P及びHellerstein MK. Advances in the stable isotope-mass spectrophotometric measurement of DNA synthesis and cell proliferation. Analytical Biochemistry 298: 189, 2001）。
計算：
骨髄の富化は、既に発明者の研究室で齧歯動物において標識化の7〜10日以内に漸近値に達することが示されており（Neese RA, Misell LM, Turner S, Chu A, Kim J, Cesar D, Hoh R, Antelo F, Strawford A, McCune JM, Christiansen M及びHellerstein MK. Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15345-15350, 2002）、これは、ラット及びマウスMECの置換％を決定するために、ラットにおける本質的に完全な代謝回転比較組織として使用することができる（Neese RA, Siler SQ, Cesar D, Antelo F, Lee D, Misell L, Patel K, Tehrani S, Shah P及びHellerstein MK. Advances in the stable isotope-mass spectrophotometric measurement of DNA synthesis and cell proliferation. Analytical Biochemistry 298: 189, 2001）。
2H2O標識化後のMECの増殖及び置換速度は、上に記載されるように前駆体-生成物の関係に基づいて算出される：
Figure 2007522437
 [式中、EM1=過剰な存在量]
誘導体化したdRのM＋1質量アイソトポマーにおいて、BMは骨髄細胞を表す。
Figure 2007522437
卵巣を切除したラット及び無傷のラットのSERM処置：
MEC増殖速度に対するSERMの効果のGC/MS分析についての結果は、タモキシフェンとラロキシフェンの両者がたとえ最低用量でも有効な抗増殖剤であることを示唆し、これはSERMがこのような低用量で活性であろうことを示唆する何らかのデータを欠いていたことを考えると、完全に予期できなかった発見である。実際に、論文は非常に高用量のSERMがMEC増殖の低減への効果を認めるために必要であることを教示するが、本発明者らのデータは、反対に、かなり低い用量であっても強力な効果を有することを示す（図7参照）。MEC増殖の有意な低減は、エストロゲンの存在下であろうと不在下であろうと、ラットを薬剤処理しかつ7日間で標識した際に、タモキシフェン及びラロキシフェンの全ての用量で観察された（図7参照）。
実施例11：ロシグリタゾンへの曝露後の、脂肪TG合成におけるグリセロール新生(glyceroneogenesis)の予期せぬ重大な寄与
ロシグリタゾンは脂肪細胞におけるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）の発現及び活性を増加することが報告されており（Glorian, M., Duplus, E., Beale, E. G., Scott, D. K., Granner, D. K.及びForest, C. (2001) Biochimie 83, 933-943; Duplus, E., Benelli, C., Reis, A. F., Fouque, F., Velho, G.及びForest, C. (2003) Biochimie 85, 1257-1264; Tordjman, J., Khazen, W., Antoine, B., Chauvet, G., Quette, J., Fouque, F., Beale, E. G., Benelli, C.及びForest, C. (2003) Biochimie 85, 1213-1218）、脂肪組織で見られる低レベルのグリセロールキナーゼ活性を増加することも示されている（Guan, H.P., Li, Y., Jensen, M. V., Newgard, C. B., Steppan, C. M.及びLazar, M. A. (2002) Nat Med 8, 1122-1128）（これはチアゾリジンジオンへの曝露後の脂肪TG合成の主要な機構であると考えられた）。反対に、公開されたin vitroデータに基づき、グリセロール新生はこのプロセスにおいて非常に重要でない役割を果たすと考えられた。しかし、本願出願人はチアゾリジンジオンロジグリタゾンに曝露された齧歯動物が実際にグリセロール新生の増加を記録したこと、及びグリセロール新生におけるこの増加が脂肪トリグリセリド合成における主要な寄与因子であることを見出しており、これはグリセロールキナーゼ活性が脂肪TG合成の根底にある支配的な機構であることを示すin vitroデータの重要な主部に基づく当該技術分野における共通の知識に反する。
動物研究：
マウス．4週齢のオスC57Bl/6Jマウス（16〜18g：Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）を用いた。マウスに適宜、高炭水化物、低脂肪（HC、70％炭水化物、10％脂肪）食餌若しくは低炭水化物、高脂肪食餌（LC、35％炭水化物、45％脂肪）（Research Diets Inc., New Brunswick, NJ）を与えた。追加群のマウスにロジグリタゾンを含むHC食餌を与えた（6.34mg/kcalの食餌）（これはマウスの体重1kg当たり約3mg/日の用量をもたらした）（Research Diets Inc., New Brunswick, NJ）。食餌の11日後、全ての動物に99.8％の2H2O生理食塩水のプライミング用量を腹腔内注射を介して与え、体内水中約4.8％の2H2O富化を達成し（30μl/gマウス）、その後、飲料水中8％2H2Oの投与を与えた。マウス（1群につきn=6）を重水処理の15日又は64日後に犠牲にした。腸間膜、精巣上体、後腹膜及び鼠径部の脂肪組織貯留物を取り出し、血液及び尿サンプルを得た。
ラット．Sprague-Dawleyラット（400〜500g、Charles River Laboratories, Wilmington, MA）を適切な留置頚動脈カーテルと共に購入した。ラットに適宜ピュリナ食餌を与えた。一晩の断食後、動物をイソフルランで麻酔し、99.8％ 2H2O-生理食塩水のプライミング用量を上記のように腹腔内注射を介して与えた。体内水との2H2Oの平衡化を可能にするために、少なくとも60分後、2つの基線血液サンプルを収集した（時間−30及び−15分）。時間0でフルクトースを静脈内に注入した（4時間の間、1分当たり16〜19mg/kg）。血液サンプルをフルクトース投与の3及び4時間後に得た。動物(n=4)を4時間の採血後に犠牲にし、最終血液サンプルを心穿刺を介して収集した。
脂肪組織からのアシルグリセリド-グリセロールの単離：
脂肪由来の脂質を改良したFolch抽出（Folch, J., Lees, M.及びSloane Stanley, G. H. (1957) J Biol Chem 226, 497-509）によって抽出した。脂質画分を3NメタノールHCl（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と共に60分間55℃でインキュベートすることによってトランスエステル化した。脂肪酸メチルエステルをFolch技術によってグリセロールから分離させた。グリセロールを含む水相を凍結乾燥し、グリセロールを他に記載されるように（Siler, S. Q., Neese, R. A., Parks, E. J.及びHellerstein, M. K. (1998) J Lipid Res 39, 2319-2328）無水酢酸-ピリジン(2:1)と共にインキュベートすることによってグリセロールトリアセテートに変換した。
血漿からのTG-グリセロールの単離：
新鮮な全血から得られる血漿をFolch技術によって抽出した。TGを既に記載されるように（Jung, H. R., Turner, S. M., Neese, R. A., Young, S. G.及びHellerstein, M. K. (1999) Biochem J 343 Pt 2, 473-478）TLCによって単離した。次いで、グリセロールの単離及び誘導体化を上述されるように実施した。
体内水中の 2 H 2 O富化の測定：
体内水（血漿又は尿由来）中の2H2O富化を2つの方法の内の1つによって測定した。簡潔に言うと、15〜20μLの血漿又は尿を炭化カルシウムを含む真空GCバイアル中で反応させてアセチレンを生じさせた。次いで、アセチレンガスを注射器で除去し、四塩化炭素中に10％臭素を含むGCバイアル中に注入し、室温で2時間インキュベートしてテトラブロモエタンを生じさせた。過剰な臭素を25μLの10％シクロヘキサンで中和し、サンプルを酢酸エチル中で懸濁した（Collins, M. L., Eng, S., Hoh, R.及びHellerstein, M. K. (2003) J Appl Physiol 94, 2203-2211）。あるいは、アセチレンガスを新規質量分析法（Previs, S. F., Hazey, J. W., Diraison, F., Beylot, M., David, F.及びBrunengraber, H. (1996) J Mass Spectrom 31, 639-642）によって直接測定した。簡潔に言うと、25μlのサンプルを乾燥したヘリウム環境中に炭化カルシウムを含む密閉したExitainerバイアル中に注入した。この反応から生じた少量（0.5ml）のアセチレンガスを取り除き、直接的な分析のためにヘリウム環境である別の密閉バイアルに注入した。標準曲線に使用されるこの2つの方法は同一の結果を生じる。しかし、直接アセチレン法はより時間を浪費しないものであり、したがってこの研究を進行する間に好適な方法となった。
GC-MS分析：
グリセロールトリアセテートを既に記載されるように（Siler, S. Q., Neese, R. A., Parks, E. J.及びHellerstein, M. K. (1998) J Lipid Res 39, 2319-2328）GC-MSによって同位体富化について分析した。質量アイソトポマー存在量を質量対電荷率(m/z)（159〜161(M0〜M2)）の選択イオンをモニタリングすることによって分析した。テトラブロモエタンを既に記載されるように（Neese, R. A., Siler, S. Q., Cesar, D., Antelo, F., Lee, D., Misell, L., Patel, K., Tehrani, S., Shah, P.及びHellerstein, M. K. (2001) Anal Biochem 298, 189-195）GC-MS法によって同位体富化について分析した。DB-225溶融石英カラム（J&W, Folsom, CA）と適合する5973質量分析計（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）を備えたモデル6890 GCを化学的イオン化様式で用いた。アセチレンの同位体富化（m/z 26及び27）をサイクロイド質量分析計（Monitor Instruments, Pittsburgh, PA）によって測定し、体内水富化の割合を水及び2H2Oから重量測定法で作成した標準曲線との比較によって算出した。
計算
体内 2 H 2 O富化：
体内2H2Oの同位体富化を、未標識水と既知の割合で混合した2H2Oを用いた標準曲線との比較及びテトラブロモエタン、又はより最近ではアセチレンへの変換によって測定した。質量分光分析は既に記載されていた（Neese, R. A., Siler, S. Q., Cesar, D., Antelo, F., Lee, D., Misell, L., Patel, K., Tehrani, S., Shah, P.及びHellerstein, M. K. (2001) Anal Biochem 298, 189-195）。
[ 2 H]グリセロール富化：
アシルグリセリドから誘導された[2H]グリセロールの同位体富化を、非標識のグリセロール標準中の質量アイソトポマーの存在量の減算によって算出した（Hellerstein, M. K.及びNeese, R. A. (1999) Am J Physiol 276, E1146-1170）。EM1及びEM2をMIDA計算について既に記載されるように（Turner, S. M., Murphy, E. J., Neese, R. A., Antelo, F., Thomas, T., Agarwal, A., Go, C.及びHellerstein, M. K. (2003) Am J Physiol Endocrinol Metab 285, E790-803）、質量アイソトポマーM0〜M2の和の画分として算出した。
n及びA ∞ 1のMIDAの算出：
MIDAは、上記及び米国特許第5,338,686号に記載されるように、ポリマー中に存在する標識パターンの組合せ分析に基づく技術である。簡潔に言うと、EM2-EM1比（R）はこの標識パターンの一実施形態である。Rは2つの因子に依存する：組織水中に存在する標識水素原子の割合（p）（すなわち組織水中の2H2O富化）及びこの組織水に由来するグリセロール中のC-H結合の可能な数(n)。α-GPのそれぞれ活発に組み込まれたC-H中の水素の2H同位体富化(p)が体内水中の2H富化と等しく、かつ2H2O富化が標識期間中に一定であると仮定する場合、nは測定した体内水中のp及び測定したRから算出することができる。
既に記載される（Turner, S. M., Murphy, E. J., Neese, R. A., Antelo, F., Thomas, T., Agarwal, A., Go, C.及びHellerstein, M. K. (2003) Am J Physiol Endocrinol Metab 285, E790-803; Hellerstein, M. K., and Neese, R. A. (1999) Am J Physiol 276, E1146-1170）組合せ確率に基づく算出アルゴリズムを用いて、「自動照合」表を作成することができ、これはnの離散値（n=3、n=4、n=5）に関する、pの所与の値の範囲を超えるRを記載する。測定した体内水富化からのp値を用いることによって、各対応のnで予測したRが測定したR値と比較される（自動照合表に基づく、例えばp＝4.00％は、n=3でR=.121、n=4でR=.143、n=5でR=.166を生じる）。生理学的サンプルはglyc3.5及びglyc5の混合物を含むため（下記参照）、本発明者らはこのモデリングのためにnを非整数値として扱う。次いで、線形回帰方程式を作成する。これは実験的に測定したpにおけるRとnとの間の関係を反映し（後者は測定した2H2O富化に基づく）、nに関する値は測定したRから算出される（例えば、p=4.00%である場合、nに関する式はn=43.86R-2.29であり、そしてR=0.152でn=4.38である）。
一旦nが確立されれば、その後、完全に標識されたTGグリセロールに関するA∞1又は理論上の漸近値を算出することができる。この漸近値又は水平状態（plateau）値の正確な測定が、前駆体-生成物又は上昇対水平状態（raise to plateau）アプローチを用いた画分合成の測定に要求される：
f=EM1/A∞ 1
[式中、EM1はグリセロールの質量＋1-標識種の同位体富化（すなわち、過剰の天然存在量における測定した存在量）を表し、A∞ 1は、p及びnの非整数値から算出される、グリセロールの質量＋1種の同位体富化を可能にする漸近値又は水平状態値を表す]
統計分析
計画したペアワイズ比較を含む一元ANOVAを有意性の基準としてP<0.05を用いて使用した。有意性の基準としてP<0.05を用いた独立の群のt検定及びノンパラメトリックなMannWhitney検定をフルクトースの導入比較に使用した。
結果：
この実験はPPAR-γアゴニスト処理後の、脂肪TG合成におけるグリセロール新生の役割を調査した。PPAR-γアゴニスト（ロシグリタゾン等）は多くの作用（脂肪生成及び脂肪蓄積の増加の刺激を含む）を誘導するインスリン感作物質である。PPAR-γは脂肪細胞におけるPEPCK遺伝子の転写に必要であり、ロシグリタゾンは脂肪組織におけるPEPCKの発現を誘導することが示されてきた（Duplus, E., Benelli, C., Reis, A. F., Fouque, F., Velho, G.及びForest, C. (2003) Biochimie 85, 1257-1264）。PEPCKを介したオキサロ酢酸からホスホエノールピルビン酸への変換は、グリセロール新生における律速段階である。ロシグリタゾンは単離した脂肪細胞においてグリセロールキナーゼ活性をかなり増加することが示されてきた（Guan, H. P., Li, Y., Jensen, M. V., Newgard, C. B., Steppan, C. M.及びLazar, M. A. (2002) Nat Med 8, 1122-1128）。増加したグリセロールキナーゼ活性からの脂肪生成に対する生理学的に有意な寄与はnの減少をもたらすが、グリセロール新生からの寄与の増加はnを増加するべきである。後者がはっきりと観察された（図8）。ロシグリタゾン処理によって観察されたnの増加は、おそらくは増加したPEPCK発現を介した、グリセロールキナーゼのアップレギュレーションに対するグリセロール新生のアップレギュレーションの有意性のin vivoでの証拠を提供する。この知見は上述されるように予期されなかった。
図1は、創薬の現代モデル（目的の作用について試験する）対偶然の作用を試験するための戦略を図示する概略図を示す。 図2は、承認薬の新規指標についてスクリーニングする方法を図示する概略図を示す。 図3は、例示的な代謝経路（DNA合成、デノボ及びサルベージの両方）の概略図及び様々な構成要素を示す。安定同位体標識又は放射性同位体標識の位置が示される。G6P=グルコース-6-リン酸。R5P=リボース-5-リン酸。PRPP=5-ホスホリボシル-α-ピロホスフェート。NDP=ヌクレオチド二リン酸。dNTP=デオキシヌクレオチド三リン酸。RR=リボヌクレオチドレダクターゼ。dN=デオキシヌクレオチド。3H-dT=トリチウム化デオキシチミジン。BrdU=5-ブロモ-2-デオキシウリジン。GNG=糖新生。DNNS=デノボヌクレオチド合成。DNPS=デノボ前駆体合成。 図4は、マウスニューロンのin vivoでの画分置換（代謝回転）を表す。ニューロンは既知の神経炎症刺激であるリポ多糖（LPS）、及び重水素化水で腹腔内に45日間同時に処置されたマウスから単離した。ニューロンの画分置換は単離したニューロン由来のDNAのGC/MS分析によって決定した。いずれの用量のLPSもニューロン代謝回転において対照に対して統計的に有意な増加を生じ（P<0.05）、そして統計的に有意な用量の依存性も観察された（P<0.05）。 図5は、レプチンによる処理後の、ob/obマウスにおける脂肪細胞増殖の減少を示す。 図6は、グリセオフルビン投与中のマウス肝細胞増殖を示す（a=対照、b=0.1％用量、c=0.2％用量、及びd=0.5％用量-5日間の曝露）。 図7は、非常に低用量の選択的エストロゲン受容体モジュレーター（タモキシフェン及びラロキシフェン）による処理後の、無傷のメスラット及び卵巣切除型ラットの両者における乳房上皮細胞増殖の減少を表す。 図8Aは、高炭水化物（HC）食へのロシグリタゾンの添加が、食餌の26日及び2H2Oの15日後に、精巣上体及び鼠径脂肪蓄積部でnを有意に増加したことを示す。図8Bは、75日の食餌によって、nがロシグリタゾン群における全ての脂肪蓄積部で有意により高いことを示す。

Claims (61)

1以上の代謝経路における分子流速への作用に関して、1以上の化合物をハイスループットスクリーニング（HTS）する方法であって、該方法が
a) 前記1以上の化合物を生物系に曝露すること；
b) 同位体標識した基質が目的の代謝経路に入りかつ通過することによって前記生物系の前記1以上の代謝経路内の目的の標的分子に入りかつ標識するのに十分な期間で、該同位体標識した基質を該生物系に投与すること；
c) 生物系から1以上のサンプルを取得すること、その際、該1以上のサンプルは同位体標識した目的とする標的分子の1以上を含む；
d) 前記目的の標的分子の同位体標識の、含量、組込み速度及び/若しくはパターン、又は含量及び/若しくはパターンの変化の速度を測定すること；
e) 目的とする前記1以上の代謝経路における分子流速を算出すること；
f) 前記1以上の化合物が投与されていない生物系において、工程b)〜e)に従って目的とする前記1以上の代謝経路における分子流速を測定すること；並びに
g) 前記1以上の化合物が投与された前記生物系における目的とする前記1以上の代謝経路の前記分子流速を、該1以上の化合物が投与されていない該生物系における該1以上の代謝経路の分子流速と比較して、該分子流速への1以上の作用について該化合物をスクリーニングすることを含む、前記方法。
目的とする上記1以上の代謝経路における測定中の分子流速が、1以上の疾患の基礎を成す分子病態又は原因に関連する、請求項1に記載の方法。
目的とする上記1以上の代謝経路における分子流速が、目的の疾患の開始、進行、重篤度、病状、侵攻性、程度、活性、障害、死亡率、罹患率、疾患の下位分類、又は他の基礎を成す病原的若しくは病理学的特徴に寄与する、請求項2に記載の方法。
目的とする上記代謝経路における分子流速が、目的の疾患の予後、生存性、罹患率、死亡率、段階、治療反応、症候学、障害又は他の臨床学的因子に寄与する、請求項2に記載の方法。
2以上の疾患の上記1以上の代謝経路の分子流速を同時に測定する、請求項2に記載の方法。
目的とする上記代謝経路からの分子流速の同時測定を安定同位体標識技術によって行う、請求項5に記載の方法。
使用する同位体標識が安定非放射性同位体である、請求項6に記載の方法。
使用する安定同位体が安定同位体標識水である、請求項7に記載の方法。
安定同位体標識水が2H2Oである、請求項8に記載の方法。
目的とする上記代謝経路からの分子流速の同時測定を放射性同位体標識技術によって行う、請求項5に記載の方法。
1以上の化合物が1以上の公知の薬剤を含む、請求項1に記載の方法。
1以上の公知の薬剤が連邦食品・医薬品局に承認された薬剤である、請求項11に記載の方法。
上記1以上の薬剤をランダムに選択する、請求項11に記載の方法。
上記1以上の薬剤を、1以上の疾患の分子病態における仮定の役割に関する、特定の生化学的論拠又は仮定に基づいて選択する、請求項11に記載の方法。
上記1以上の化合物が1以上の新規化学物質を含む、請求項1に記載の方法。
上記1以上の化合物が1以上の生物学的因子を含む、請求項1に記載の方法。
目的とする1以上の代謝経路における分子流速への上記作用が、偶然の、意外な又は予期せぬ作用を含む、請求項1に記載の方法。
上記偶然の、意外な又は予期せぬ作用が、上記1以上の化合物に関する1以上の第2の治療指標を含む、請求項17に記載の方法。
疾患の1以上の動物モデルを、上記1以上の第2の治療指標を評価するために使用する、請求項18に記載の方法。
上記疾患の動物モデルを、アルツハイマー病、心不全、腎疾患、糖尿病性ネフロパシー、骨粗しょう症、肝繊維症、肝硬変、肝細胞壊死、肺繊維症、強皮症、腎繊維症、多発性硬化症、動脈硬化症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、皮膚の紫外線による老化、皮疹、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌、後天性免疫不全症候群、免疫欠如、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、糖尿病、糖尿病性合併症、インスリン耐性、肥満症、リポジストロフィー、代謝症候群、筋肉疲労、フレイルティー（frailty）、体調不良、血管形成、高脂質血症、不妊症、ウイルス又は細菌感染症、自己免疫疾患及び免疫発赤から選択する、請求項19に記載の方法。
上記1以上の第2の治療指標に関連する、目的の上記代謝経路の分子流速を、特定の用量の又は特定の用量範囲の上記1以上の化合物に応じて測定する、請求項18に記載の方法。
上記1以上の代謝経路を、肝細胞増殖及び破壊、尿細管細胞代謝回転、リンパ球代謝回転、精母細胞代謝回転、筋肉及び心臓でのタンパク質合成及び分解、肝臓コラーゲンの合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリン合成及び分解、乳房上皮細胞増殖、結腸上皮細胞増殖、前立腺上皮細胞増殖、卵巣上皮細胞増殖、子宮内膜細胞増殖、気管支上皮細胞増殖、膵臓上皮細胞増殖、皮膚でのケラチン合成、ケラチノサイト増殖、炭水化物代謝、免疫グロブリン合成、ミトコンドリアDNAの合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質の合成及び分解、ミトコンドリアタンパク質の合成及び分解、脂肪脂質の合成及び分解、並びに脂肪細胞の合成及び分解から選択する、請求項1に記載の方法。
上記承認薬剤を複数の生化学的プロセスへの作用について同時にスクリーニングする、請求項12に記載の方法。
上記承認薬剤を、スタチン(statins)、グリタゾン(glitazones)、COX-2阻害剤、NSAIDS、β-遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、ACE阻害剤、抗生物質、抗ウイルス薬、脂質低下薬、抗高血圧剤、抗炎症剤、抗鬱薬、抗不安薬、抗精神病薬、鎮静剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、経口血糖降下薬、抗痙攣薬、抗新生物薬、癌化学療法剤、性ステロイド、下垂体ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、食欲抑制剤、甲状腺ホルモン剤、抗発作薬、交感神経興奮剤、サルファ剤、ビグアニド及び他のクラスの薬剤から選択する、請求項23に記載の方法。
上記予期せぬ又は偶然の作用が上記1以上の化合物の少なくとも1つの毒作用を含む、請求項17に記載の方法。
上記毒作用が少なくとも1つの末端器官の毒性を含む、請求項25に記載の方法。
上記末端器官の毒性を、肝細胞増殖及び分解、尿細管細胞代謝回転、リンパ球代謝回転、精母細胞代謝回転、筋肉及び心臓でのタンパク質合成及び分解、肝臓コラーゲン合成及び分解、脳又は末梢神経でのミエリン合成及び分解、乳房上皮細胞増殖、結腸上皮細胞増殖、前立腺上皮細胞増殖、卵巣上皮細胞増殖、子宮内膜細胞増殖、気管支上皮細胞増殖、膵臓上皮細胞増殖、皮膚でのケラチン合成、ケラチノサイト増殖、免疫グロブリン合成、ミトコンドリアDNAの合成及び分解、ミトコンドリアリン脂質の合成及び分解、ミトコンドリアタンパク質の合成及び分解、脂肪脂質の合成及び分解、並びに脂肪細胞の合成及び分解から選択する、請求項26に記載の方法。
上記末端器官の毒性に関連する、目的とする上記代謝経路の分子流速を、特定の用量の又は特定の用量範囲の上記1以上の化合物に応じて測定する、請求項26に記載の方法。
上記生物系を、原核細胞、真核細胞、細胞系、細胞培養物、単離された組織調製物、ウサギ、イヌ、マウス、ラット、モルモット、ブタ、非ヒト霊長類及びヒトから選択する、請求項1に記載の方法。
上記生物系がヒトである、請求項1に記載の方法。
上記同位体標識した基質を、2H2O、H2 18O、2H-グルコース、2H標識したアミノ酸、2H標識した有機分子、13C標識した有機分子、13CO2、15N標識した有機分子、3H2O、3H標識したグルコース、3H標識したアミノ酸、3H標識した有機分子、14C標識した有機分子及び14CO2から選択する、請求項1に記載の方法。
上記同位体標識した基質が2H2Oである、請求項1に記載の方法。
上記1以上の化合物を、上記生物系において生物学的活性の潜在性を有する、確立された又は仮定の用量範囲に従って投与する、請求項1に記載の方法。
上記1以上のサンプルを、上記生物系への上記同位体標識した基質の投与又は接触後、かつ上記生物系の上記1以上の化合物への曝露後の、既知の時間又は間隔で収集する、請求項1に記載の方法。
2以上の化合物の組合せを上記生物系に曝露する、請求項1に記載の方法。
目的の代謝経路を通じた分子流速への、化合物の組合せの相乗的、相補的又は拮抗的作用を、化合物の組合せに曝露された上記生物系における分子流速を、単一の化合物のみに曝露されたか又は試験中の上記化合物のいずれとも曝露されていない上記生物系における分子流速と比較することによって測定する、請求項35に記載の方法。
化合物の上記組合せをランダムに選択する、請求項35に記載の方法。
化合物の上記組合せを、1以上の上記疾患の分子病態における1以上の上記化合物の仮定の役割に関する特定の生化学的論拠又は仮定に基づいて選択する、請求項35に記載の方法。
上記1以上の化合物について同定された予期せぬ又は偶然の作用を、該1以上の化合物に関する潜在的な新規医学的指標としての承認のために開拓する、請求項17に記載の方法。
請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法を用いて同定される化合物。
請求項1に記載の方法から取得されるデータを含む情報記憶装置。
上記装置が複製したレポートである、請求項41に記載の装置。
上記レポートを複製する媒体が紙、プラスチック及びマイクロフィッシュから選択される、請求項42に記載の複製したレポート。
上記装置がコンピューター・ディスクである、請求項41に記載の装置。
上記ディスクがコンパクト・ディスク、デジタルビデオ・ディスク及び磁気ディスクから選択される、請求項44に記載のディスク。
上記装置がコンピューターである、請求項41に記載の装置。
請求項1に記載の方法によって生じる、単離された同位体摂動型（isotopically-perturbed）分子。
上記分子が、タンパク質、脂質、核酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ポルフィリン及び炭水化物分子から選択される、請求項47に記載の単離された同位体摂動型分子。
上記分子がミエリンである、請求項47に記載の単離された同位体摂動型分子。
上記分子がアミロイド-βである、請求項47に記載の単離された同位体摂動型分子。
上記分子がデオキシリボ核酸である、請求項47に記載の単離された同位体摂動型分子。
上記分子がリボ核酸である、請求項47に記載の単離された同位体摂動型分子。
上記分子がコラーゲンである、請求項47に記載の単離された同位体摂動型分子。
上記分子がトリグリセリドである、請求項47に記載の単離された同位体摂動型分子。
被験者の疾患と潜在的に関連する1以上の代謝経路における分子流速への作用に関しての、1以上の化合物のハイスループットスクリーニング（HTS）測定キットであって、
a) 1以上の同位体標識した前駆体、及び
b) このキットを使用するための指示書、
を含む前記キット。
前駆体分子を投与するための手段をさらに含む、請求項55に記載のキット。
被験者からサンプルを収集するための器具をさらに含む、請求項55に記載のキット。
請求項1に記載の方法によって少なくとも部分的に同定した1以上の薬剤の製造をさらに含む、請求項1に記載の方法。
ある化合物が1以上の代謝経路の代謝流速を改変するか否かを判定する方法であって、
a) 生物系を化合物で処理すること；
b) 同位体標識した基質が目的の代謝経路に入りかつ通過することによって前記生物系の前記1以上の代謝経路内の目的の標的分子に入りかつ標識するのに十分な期間で、該同位体標識した基質を該生物系に投与すること；
c) 前記生物系から1以上のサンプルを取得すること、その際、該1以上のサンプルは同位体標識された目的とする標的分子の1以上を含む；
d) 前記目的の標的分子の同位体標識の、含量、組込み速度及び/若しくはパターン、又は含量及び/若しくはパターンの変化の速度を測定すること；
e) 目的とする前記1以上の代謝経路における分子流速を算出すること；
f) 前記化合物が投与されていない生物系において、工程b)〜e)に従って目的とする前記1以上の代謝経路における分子流速を測定すること；並びに
g) 前記化合物が投与された前記生物系における目的とする前記1以上の代謝経路の前記分子流速を、該化合物が投与されていない該生物系における該1以上の代謝経路の分子流速と比較して、該化合物が該代謝流速を改変するか否かを判定することを含む、前記方法。
同位体標識が安定非放射性同位体である、請求項59に記載の方法。
上記安定同位体が安定同位体標識水である、請求項60に記載の方法。
JP2006541461A 2003-11-25 2004-11-24 生物系における作用、特に予期せぬ治療効果又は毒作用、を発見及び定量するための、化合物及び化合物の組合せのハイスループットスクリーニング方法 Pending JP2007522437A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52526103P 2003-11-25 2003-11-25
PCT/US2004/039722 WO2005051434A1 (en) 2003-11-25 2004-11-24 Method for high-throughput screening of compounds and combinations of compounds for discovery and quantification of actions, particularly unanticipated therapeutic or toxic actions, in biological systems

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2007522437A true JP2007522437A (ja) 2007-08-09
JP2007522437A5 JP2007522437A5 (ja) 2008-01-17

Family

ID=34632972

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006541461A Pending JP2007522437A (ja) 2003-11-25 2004-11-24 生物系における作用、特に予期せぬ治療効果又は毒作用、を発見及び定量するための、化合物及び化合物の組合せのハイスループットスクリーニング方法

Country Status (8)

Country Link
US (3) US20050202406A1 (ja)
EP (1) EP1687035A4 (ja)
JP (1) JP2007522437A (ja)
AU (1) AU2004293106A1 (ja)
CA (1) CA2546868A1 (ja)
IL (1) IL175178A0 (ja)
TW (1) TW200530587A (ja)
WO (1) WO2005051434A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016522192A (ja) * 2013-05-08 2016-07-28 ジーアール インテレクチュアル リザーブ リミティド ライアビリティ カンパニー 特定の脱ミエリン化及びミエリン化不全系障害の処置、及び／又は、再ミエリン化の促進のための方法
WO2023084648A1 (ja) * 2021-11-10 2023-05-19 株式会社日立ハイテク 薬剤相互作用解析方法

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5910403A (en) * 1997-05-15 1999-06-08 The Regents Of University Of California Methods for measuring cellular proliferation and destruction rates in vitro and in vivo
AU2002365268B2 (en) * 2001-10-24 2008-02-28 The Regents Of The University Of California Measurement of protein synthesis rates in humans and experimental systems by use of isotopically labeled water
JP2005517904A (ja) * 2002-02-12 2005-06-16 ザ リージェント オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 標識取り込みにより生物学的分子の生合成の割合を測定する非侵襲性の方法
US20060094057A1 (en) 2002-07-30 2006-05-04 Maro K. Hellerstein Method for automated, large-scale measurement of the molecular flux rates of the proteome or the organeome using mass spectrometry
DE20211783U1 (de) * 2002-07-31 2002-11-07 Fa. Hermann Heye i.Ins., 31683 Obernkirchen Pressstempelmechanismus einer Glasformmaschine
AU2003268416A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-29 The Regents Of The University Of California Methods for measuring rates of replication and death of nfectious microbial agents in an infected host organism
WO2004025270A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 The Regents Of The University Of California Methods for measuring rates of reserve cholesterol transport in vivo, as an index of anti-atherogenesis
US20070248540A1 (en) * 2002-09-16 2007-10-25 The Regents Of The University Of California Biochemical methods for measuring metabolic fitness of tissues or whole organisms
WO2004042360A2 (en) 2002-11-04 2004-05-21 The Regents Of The Univeristy Of California Deuterated glucose or fat tolerance tests for high-throughput measurement of the metabolism of sugars or fatty acids in the body
US7262020B2 (en) * 2003-07-03 2007-08-28 The Regents Of The University Of California Methods for comparing relative flux rates of two or more biological molecules in vivo through a single protocol
US20050202406A1 (en) 2003-11-25 2005-09-15 The Regents Of The University Of California Method for high-throughput screening of compounds and combinations of compounds for discovery and quantification of actions, particularly unanticipated therapeutic or toxic actions, in biological systems
TW200538738A (en) * 2004-02-20 2005-12-01 Univ California Molecular flux rates through critical pathways measured by stable isotope labeling in vivo, as biomarkers of drug action and disease activity
EP1723252A4 (en) * 2004-03-11 2009-07-29 Univ California TIMELY AND SPATIAL CHARACTERIZATION OF BIOSYNTHETIC EVENTS IN LIVING ORGANISMS THROUGH ISOTOPEN FINGERPRINTING UNDER CONDITIONS OF IMPROPER ISOTOPE GRADIENTS
US20050238577A1 (en) * 2004-03-29 2005-10-27 The Regents Of The University Of California Isolation of epithelial cells or their biochemical contents from excreta after in vivo isotopic labeling
JP4118918B2 (ja) * 2005-02-28 2008-07-16 シャープ株式会社 信号品質評価装置、情報記録再生装置、信号品質評価方法、記録条件決定方法、信号品質評価プログラム、信号品質評価プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体
US20060251576A1 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 The Regents Of The University Of California Methods for measuring cholesterol metabolism and transport
TW200711660A (en) 2005-06-10 2007-04-01 Univ California Monitoring two dimensions of diabetes pathogenesis separately or concurrently (insulin sensitivity and beta-cell sufficiency): uses in diagnosis, prognosis, assessment of disease risk, and drug development
EP2196927A4 (en) * 2007-10-02 2014-08-06 Fujitsu Ltd ANALYSIS ASSISTANCE PROGRAM, ANALYSIS ASSISTANCE EQUIPMENT AND ANALYSIS ASSISTANCE PROCEDURE
US8574543B2 (en) 2007-12-14 2013-11-05 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Method of isotope labeling and determining protein synthesis, quantitation and protein expression
WO2011115993A2 (en) * 2010-03-15 2011-09-22 The Johns Hopkins University Method for determining substance non-toxicity
WO2013036885A1 (en) * 2011-09-08 2013-03-14 The Regents Of The University Of California Metabolic flux measurement, imaging and microscopy
ES2668678T3 (es) 2011-12-07 2018-05-21 Glaxosmithkline Llc Procedimiento de determinación de la masa muscular esquelética corporal total
US9134319B2 (en) 2013-03-15 2015-09-15 The Regents Of The University Of California Method for replacing biomarkers of protein kinetics from tissue samples by biomarkers of protein kinetics from body fluids after isotopic labeling in vivo
EP2944963B1 (en) * 2014-05-14 2019-02-27 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Berlin-Buch Short term isotope pulse labeling method for analysing metabolic products in biological samples
US20160363580A1 (en) * 2015-06-11 2016-12-15 The Texas A&M University System Methods of Metabolic Kinetic Phenotyping and Uses Thereof
US10839936B2 (en) 2015-11-02 2020-11-17 International Business Machines Corporation Evidence boosting in rational drug design and indication expansion by leveraging disease association
CN105758955A (zh) * 2016-02-26 2016-07-13 清华大学 一种测定水环境中抗生素的方法
WO2019051226A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Liposcience, Inc. METABOLIC VULNERABILITY INDEX ASSESSMENTS WITH MULTIPLE PARAMETERS
KR102108855B1 (ko) * 2017-10-30 2020-05-12 한국표준과학연구원 안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도
WO2020182652A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-17 Basf Se Metabolic analysis method

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003502016A (ja) * 1999-03-17 2003-01-21 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 胆汁排泄感受性の候補化合物のスクリーニング方法
JP2003079270A (ja) * 2001-09-10 2003-03-18 Japan Science & Technology Corp ミエリン発達障害モデル非ヒト動物
US20030180800A1 (en) * 2002-03-22 2003-09-25 Lee Wai-Nang Paul Stable isotope based dynamic metabolic profiling of living organisms for characterization of metabolic diseases, drug testing and drug development

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4065552A (en) * 1975-05-05 1977-12-27 Giovanni Giacomo Costa Method of detecting malignant neoplasms
US4332784A (en) 1979-02-06 1982-06-01 The Radiochemical Centre Limited Dual isotope assays
SU968036A1 (ru) 1980-03-10 1982-10-23 Научно-исследовательский институт медицинской радиологии АМН СССР Способ получени меченого белка
US5317098A (en) * 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
DE3667103D1 (en) * 1986-06-09 1989-12-28 Bruker Analytische Messtechnik Method for determining the turnover of organic material in living tissue and nmr spectrometer for performing this method
US4940658A (en) * 1986-11-20 1990-07-10 University Patents, Inc. Assay for sulfhydryl amino acids and methods for detecting and distinguishing cobalamin and folic acid deficency
WO1989001342A2 (en) * 1987-08-07 1989-02-23 Mallinckrodt, Inc. Diagnostic or radiotherapeutic composition comprising a hydrogen containing compound
US5042488A (en) * 1987-09-29 1991-08-27 The Washington University Methods employing deuterium for obtaining direct, observable deuterium magnetic resonance images in vivo and in situ
US6004781A (en) * 1988-01-22 1999-12-21 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding Ig-CD4 fusion proteins
JPH04504049A (ja) 1989-03-20 1992-07-23 アンティキャンサー　インコーポレイテッド インビトロにおける組織の生存能力及び増殖能力を測定する、自生状態法及びシステム
GB2229718B (en) * 1989-03-22 1993-01-06 Inst Molekularnoi Genetik Method for preparing hydrogen-isotape labelled biologically active organic compounds
US5217903A (en) * 1990-05-15 1993-06-08 Trustees Of Boston University Measuring connective tissue breakdown products in body fluids
US5209919A (en) * 1990-07-13 1993-05-11 Regents Of The University Of California Method of measurement in biological systems
CA2027714C (en) * 1990-07-13 2003-01-28 Kenneth W. Turtletaub Method of measurement in biological systems
US5597548A (en) * 1990-07-18 1997-01-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 13 C Isotopomer analyses in intact tissue using (13 C) homonuclear decoupling
HU208084B (en) * 1991-10-31 1993-08-30 Hyd Kutato Fejlesztoe Kft Process for producing compositions suitable for curing tumorous diseases
US5394236A (en) * 1992-02-03 1995-02-28 Rutgers, The State University Methods and apparatus for isotopic analysis
CA2117749A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Paavo Kai Johannes Kinnunen Composition for therapeutic or diagnostic use, process for its preparation and its use
US5338686A (en) * 1992-04-29 1994-08-16 Hellerstein Marc K Method for measuring in vivo synthesis of biopolymers
JP2960832B2 (ja) * 1992-05-08 1999-10-12 ペルマテック テクノロジー アクチェンゲゼルシャフト エストラジオールの投与システム
US5366885A (en) 1992-06-09 1994-11-22 Barranco Iii Sam C Method and kit for testing tumors for drug sensitivity
US5432058A (en) * 1992-09-30 1995-07-11 Lange, Iii; Louis G. Method for measuring human cholesterol absorption using metabolically stable isotopes
US5506147A (en) * 1993-04-15 1996-04-09 Kolhouse; J. Fred Non-invasive evaluation of maldigestion and malaborption
US5665562A (en) * 1993-05-17 1997-09-09 Amersham International Plc Devices and methods for the measurement of cellular biochemical processes
US5439803A (en) 1993-08-13 1995-08-08 The Regents Of The University Of Michigan Isotope and assay for glycolysis and the pentose phosphate pathway
CA2176005A1 (en) 1993-11-08 1995-05-18 Trevor G. Redgrave Labelled diagnostic compositions and methods of their use
ATE245035T1 (de) * 1995-08-08 2003-08-15 Otsuka Pharma Co Ltd Diagnostische zusammensetzungen und deren anwendung in der diagnose von zentralnervösen anomalien
US5922554A (en) * 1995-10-30 1999-07-13 The Regents Of The University Of California Inhibition of cellular uptake of cholesterol
EP0826377B1 (en) 1996-08-27 2002-11-06 Tokyo Gas Co., Ltd. Diagnostic agent for diabetes
US6101846A (en) * 1997-02-06 2000-08-15 Micron Technology, Inc. Differential pressure process for fabricating a flat-panel display face plate with integral spacer support structures
JP2002505737A (ja) * 1997-02-14 2002-02-19 ジョージワシントン大学 Ｄｎａ合成速度測定のための分析
CN1127118C (zh) * 1997-03-14 2003-11-05 乔治华盛顿大学 一种用氟基化学反应连续测定同位素比率的装置和方法
US5910403A (en) * 1997-05-15 1999-06-08 The Regents Of University Of California Methods for measuring cellular proliferation and destruction rates in vitro and in vivo
US5961470A (en) * 1997-07-09 1999-10-05 Wagner; David A. Breath test for assessing hepatic function
US6329208B1 (en) * 1997-07-16 2001-12-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for determining gluconeogenesis, anapleurosis and pyruvate recycling
CA2249173C (en) * 1997-10-06 2008-12-16 Tokyo Gas Co., Ltd. Diagnostic agent for liver function
US5924995A (en) * 1997-11-10 1999-07-20 Meretek Diagnostics Non-invasive method for the functional assessment of infants and children with an inherited metabolic disorder
DE1075286T1 (de) * 1998-05-06 2002-05-23 Isotechnika,Inc. 13C-Glukose-Atemtest zur Diagnose von Diabetes-Indikationen und Überwachung der glykämischen Kontrolle
US6461870B2 (en) * 1998-05-06 2002-10-08 Isotechnika Inc. 13C glucose breath test for the diagnosis of diabetic indications and monitoring glycemic control
US6284219B1 (en) * 1998-06-30 2001-09-04 Phenome Sciences Inc. In vivo determination of metabolic function for use in therapy management
US6625547B1 (en) * 1998-08-05 2003-09-23 Washington State University Research Foundation Relative rates of cytochrome p450 metabolism
ATE253126T1 (de) * 1998-08-25 2003-11-15 Univ Washington Schnelle quantitative analyse von proteinen oder proteinfunktionen in komplexen gemischen
DE19839491A1 (de) * 1998-08-29 2000-03-02 Hermann Heumann Verfahren zur Markierung von Biopolymeren mit Isotopen
US6653076B1 (en) * 1998-08-31 2003-11-25 The Regents Of The University Of Washington Stable isotope metabolic labeling for analysis of biopolymers
US6693186B2 (en) 1998-09-01 2004-02-17 Antex Biologics Inc Neisseria meningitidis polypeptide, nucleic acid sequence and uses thereof
US6887712B1 (en) * 1998-11-09 2005-05-03 Atherogenics, Inc. Methods and compositions to lower plasma cholesterol levels
US6764817B1 (en) * 1999-04-20 2004-07-20 Target Discovery, Inc. Methods for conducting metabolic analyses
US20030119069A1 (en) * 1999-04-20 2003-06-26 Target Discovery, Inc. Labeling of protein samples
JP4723725B2 (ja) 1999-04-20 2011-07-13 ターゲット ディスカバリー， インコーポレイテッド 代謝経路を分析するための方法
US6391649B1 (en) * 1999-05-04 2002-05-21 The Rockefeller University Method for the comparative quantitative analysis of proteins and other biological material by isotopic labeling and mass spectroscopy
US7057168B2 (en) * 1999-07-21 2006-06-06 Sionex Corporation Systems for differential ion mobility analysis
US6653090B1 (en) * 1999-11-05 2003-11-25 University Of Alberta Methods for measuring the metabolism of and screening for drugs in isolated hearts
JP2001211782A (ja) 2000-02-02 2001-08-07 Masa Yamamoto ｔｏｂ遺伝子欠損ノックアウト非ヒト哺乳動物
US20020068366A1 (en) 2000-04-13 2002-06-06 Ladine James R. Proteomic analysis by parallel mass spectrometry
AU2001253727A1 (en) 2000-04-21 2001-11-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for identifying compounds useful for preventing acute clinical vascular events in a subject
AU2001259470A1 (en) * 2000-05-05 2001-11-20 Purdue Research Foundation Affinity selected signature peptides for protein identification and quantification
AU2001261394A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-26 Metabolic Solutions, Inc. Reverse isotope dilution assay and lactose intolerance assay
US6680203B2 (en) * 2000-07-10 2004-01-20 Esperion Therapeutics, Inc. Fourier transform mass spectrometry of complex biological samples
US7048907B2 (en) * 2001-02-05 2006-05-23 Biophysics Assay Laboratory, Inc. Synthesis, compositions and methods for the measurement of the concentration of stable-isotope labeled compounds in life forms and life form excretory products
GB0106923D0 (en) 2001-03-20 2001-05-09 Univ Dundee Liver function test
US7256047B2 (en) * 2001-05-01 2007-08-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Measurement of gluconeogenesis and intermediary metabolism using stable isotopes
US20040253647A1 (en) * 2001-06-26 2004-12-16 Mathews Paul M. Cell-based high-throughput screening methods
US6835927B2 (en) * 2001-10-15 2004-12-28 Surromed, Inc. Mass spectrometric quantification of chemical mixture components
AU2002365268B2 (en) 2001-10-24 2008-02-28 The Regents Of The University Of California Measurement of protein synthesis rates in humans and experimental systems by use of isotopically labeled water
ATE327512T1 (de) * 2001-12-08 2006-06-15 Micromass Ltd Massenspektrometrie-verfahren
US7635841B2 (en) * 2001-12-12 2009-12-22 Micromass Uk Limited Method of mass spectrometry
JP2005517904A (ja) * 2002-02-12 2005-06-16 ザ リージェント オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 標識取り込みにより生物学的分子の生合成の割合を測定する非侵襲性の方法
US20030180710A1 (en) 2002-03-22 2003-09-25 Lee Wai-Nang Paul Method of enhancing the efficiency of a pharmaceutical business
US20060100903A1 (en) * 2002-03-22 2006-05-11 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Method of enhancing the efficiency of a pharmaceutical business
US20050281745A1 (en) * 2002-03-22 2005-12-22 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Stable isotope based dynamic metabolic profiling of living organisms for characterization of metabolic diseases, drug testing and drug development
CA2503681A1 (en) 2002-04-05 2003-10-23 Marc K. Hellerstein Method for isolating and measuring proliferation of long-term label retaining cells and stem cells
US20030211036A1 (en) * 2002-05-07 2003-11-13 Hadassa Degani Method and apparatus for monitoring and quantitatively evaluating tumor perfusion
US7510880B2 (en) * 2002-06-26 2009-03-31 Gross Richard W Multidimensional mass spectrometry of serum and cellular lipids directly from biologic extracts
AU2003253702A1 (en) 2002-06-26 2004-01-19 The Regents Of The University Of California Methods and kits for determining energy expenditure in living organisms by metabolic water production
US20060094057A1 (en) * 2002-07-30 2006-05-04 Maro K. Hellerstein Method for automated, large-scale measurement of the molecular flux rates of the proteome or the organeome using mass spectrometry
AU2003265448A1 (en) * 2002-08-16 2004-03-03 The Regents Of The University Of California Dynamic hepatic recycling glucose tolerance test
AU2003268416A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 The Regents Of The University Of California Methods for measuring rates of replication and death of nfectious microbial agents in an infected host organism
WO2004025270A2 (en) 2002-09-13 2004-03-25 The Regents Of The University Of California Methods for measuring rates of reserve cholesterol transport in vivo, as an index of anti-atherogenesis
US20070248540A1 (en) * 2002-09-16 2007-10-25 The Regents Of The University Of California Biochemical methods for measuring metabolic fitness of tissues or whole organisms
US20040081994A1 (en) * 2002-09-16 2004-04-29 Hellerstein Marc K. Biochemical methods for measuring metabolic fitness of tissues or whole organisms
GB0221920D0 (en) * 2002-09-20 2002-10-30 Ricardo Consulting Eng Emission reduction apparatus
AU2003304026B2 (en) * 2002-10-29 2010-03-25 Target Discovery, Inc. Method for increasing ionization efficiency in mass spectroscopy
WO2004042360A2 (en) 2002-11-04 2004-05-21 The Regents Of The Univeristy Of California Deuterated glucose or fat tolerance tests for high-throughput measurement of the metabolism of sugars or fatty acids in the body
US20040121305A1 (en) * 2002-12-18 2004-06-24 Wiegand Roger Charles Generation of efficacy, toxicity and disease signatures and methods of use thereof
JP2006522340A (ja) * 2003-04-02 2006-09-28 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 質量分析データの分析法
US20050014181A1 (en) * 2003-06-18 2005-01-20 Galis Zorina S. Methods and compositions for the assessment of polymer assembly
EP1644856A2 (en) * 2003-06-30 2006-04-12 Ajinomoto Co., Inc. Intracellular metabolic flux analysis method using substrate labeled with isotope
US7262020B2 (en) * 2003-07-03 2007-08-28 The Regents Of The University Of California Methods for comparing relative flux rates of two or more biological molecules in vivo through a single protocol
WO2005009597A2 (en) 2003-07-03 2005-02-03 The Regents Of The University Of California Methods for comparing relative flux rates of two or more biological molecules in vivo through a single protocol
US20050202406A1 (en) 2003-11-25 2005-09-15 The Regents Of The University Of California Method for high-throughput screening of compounds and combinations of compounds for discovery and quantification of actions, particularly unanticipated therapeutic or toxic actions, in biological systems
US8510054B2 (en) * 2004-02-05 2013-08-13 Ajinomoto Co., Inc. Intracellular metabolic flux analysis method using substrate labeled with isotope
WO2006028492A2 (en) * 2004-02-13 2006-03-16 Nuvelo, Inc. hC1Q/TNF7 AND USES THEREOF
TW200538738A (en) * 2004-02-20 2005-12-01 Univ California Molecular flux rates through critical pathways measured by stable isotope labeling in vivo, as biomarkers of drug action and disease activity
EP1723252A4 (en) * 2004-03-11 2009-07-29 Univ California TIMELY AND SPATIAL CHARACTERIZATION OF BIOSYNTHETIC EVENTS IN LIVING ORGANISMS THROUGH ISOTOPEN FINGERPRINTING UNDER CONDITIONS OF IMPROPER ISOTOPE GRADIENTS
US20050238577A1 (en) * 2004-03-29 2005-10-27 The Regents Of The University Of California Isolation of epithelial cells or their biochemical contents from excreta after in vivo isotopic labeling
WO2005098024A1 (en) * 2004-03-30 2005-10-20 Kinemed, Inc. In vivo measurement of the relative fluxes through ribonucleotide reductase vs. deoxyribonucleoside pathways using isotopes
JP4654592B2 (ja) * 2004-04-02 2011-03-23 味の素株式会社 代謝フラックスの決定方法
WO2006050130A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Target Discovery, Inc. Glycan analysis using deuterated glucose
WO2006081521A2 (en) 2005-01-26 2006-08-03 The Regents Of The University Of Colorado Methods for diagnosis and intervention of hepatic disorders
US7892845B2 (en) 2005-04-06 2011-02-22 Washington University In St. Louis Methods for measuring the metabolism of neurally dervied biomolecules in vivo
US20060251576A1 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 The Regents Of The University Of California Methods for measuring cholesterol metabolism and transport
TW200711660A (en) * 2005-06-10 2007-04-01 Univ California Monitoring two dimensions of diabetes pathogenesis separately or concurrently (insulin sensitivity and beta-cell sufficiency): uses in diagnosis, prognosis, assessment of disease risk, and drug development
US9134319B2 (en) * 2013-03-15 2015-09-15 The Regents Of The University Of California Method for replacing biomarkers of protein kinetics from tissue samples by biomarkers of protein kinetics from body fluids after isotopic labeling in vivo

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003502016A (ja) * 1999-03-17 2003-01-21 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 胆汁排泄感受性の候補化合物のスクリーニング方法
JP2003079270A (ja) * 2001-09-10 2003-03-18 Japan Science & Technology Corp ミエリン発達障害モデル非ヒト動物
US20030180800A1 (en) * 2002-03-22 2003-09-25 Lee Wai-Nang Paul Stable isotope based dynamic metabolic profiling of living organisms for characterization of metabolic diseases, drug testing and drug development

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACTA HISTOCHEM CYTOCHEM, vol. Vol.35, No.2, Page.123 S1-3, JPN6011026655, 2002, ISSN: 0001926555 *
BIOCHEM J, vol. Vol.225, No.1, Page.219-226, JPN6010058710, 1985, ISSN: 0001749212 *
J AGRIC FOOD CHEM, vol. 49, no. 9, JPN6010008744, 2001, pages 4359 - 4363, ISSN: 0001544062 *
J CHROMATOGR B, vol. Vol.757, No.2, Page.295-300, JPN6010058711, 2001, ISSN: 0001749213 *
J CLIN INVEST, vol. 100, no. 5, JPN6010008740, 1997, pages 1305 - 1319, ISSN: 0001544060 *
J PHARMACOL EXP THER, vol. Vol.257, No.1, Page.282-289, JPN6010058704, 1991, ISSN: 0001749209 *
J STEROID BIOCHEM, vol. Vol.１８，No.1, Page.1-6, JPN6010058706, 1983, ISSN: 0001749210 *
NEUROPHARMACOLOGY, vol. 29, no. 12, JPN6010008742, 1990, pages 1187 - 1190, ISSN: 0001544061 *
PHARMACOL BIOCHEM BEHAV, vol. Vol.8, No.6, Page.749-752, JPN6010058708, 1978, ISSN: 0001749211 *
PROC NATL ANAD SCI USA, vol. 95, no. 4, JPN6010008738, 1998, pages 1776 - 1781, ISSN: 0001544059 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016522192A (ja) * 2013-05-08 2016-07-28 ジーアール インテレクチュアル リザーブ リミティド ライアビリティ カンパニー 特定の脱ミエリン化及びミエリン化不全系障害の処置、及び／又は、再ミエリン化の促進のための方法
WO2023084648A1 (ja) * 2021-11-10 2023-05-19 株式会社日立ハイテク 薬剤相互作用解析方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005051434A1 (en) 2005-06-09
US20110195865A1 (en) 2011-08-11
EP1687035A1 (en) 2006-08-09
CA2546868A1 (en) 2005-06-09
IL175178A0 (en) 2006-09-05
US20140162900A1 (en) 2014-06-12
US8663602B2 (en) 2014-03-04
EP1687035A4 (en) 2010-11-03
AU2004293106A1 (en) 2005-06-09
US20050202406A1 (en) 2005-09-15
TW200530587A (en) 2005-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2007522437A (ja) 生物系における作用、特に予期せぬ治療効果又は毒作用、を発見及び定量するための、化合物及び化合物の組合せのハイスループットスクリーニング方法
US10466253B2 (en) Molecular flux rates through critical pathways measured by stable isotope labeling in vivo, as biomarkers of drug action and disease activity
CA2530789C (en) Methods for comparing relative flux rates of two or more biological molecules in vivo through a single protocol
US7449171B2 (en) Measurement of biosynthesis and breakdown rates of biological molecules that are inaccessible or not easily accessible to direct sampling, non-invasively, by label incorporation into metabolic derivatives and catabolic products
WO2005094327A2 (en) Isolation of epithelial cells or their biochemical contents from excreta after in vivo isotopic labeling
WO2005009597A2 (en) Methods for comparing relative flux rates of two or more biological molecules in vivo through a single protocol

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071121

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20071121

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100223

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100514

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100521

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100615

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100622

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100720

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100727

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100823

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101012

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110106

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110114

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110412

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20110531