JP2003079270A - ミエリン発達障害モデル非ヒト動物 - Google Patents
ミエリン発達障害モデル非ヒト動物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 中枢神経系（ＣＮＳ）において、オリゴデン
ドログリア（乏突起膠細胞）におけるミエリン形成のプ
ロセスを解明し、その知見に基づいて、ミエリン発達障
害モデル非ヒト動物を作製し提供すること、及び該ミエ
リン発達障害モデル非ヒト動物を用いて、ミエリン発達
調節物質及び脱髄疾患の治療薬をスクリーニングする方
法を提供すること。 【解決手段】 本発明においては、免疫グロブリンＦｃ
受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）、Ｆｙｎチロキシ
ナーゼ（Ｆｙｎ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢ
Ｐ）が、ミエリン形成シグナル分子として働くことを見
い出し、この知見に基づいて、該シグナル分子を欠損し
たミエリン発達障害モデル非ヒト動物を作製し、更に該
ミエリン発達障害モデル非ヒト動物を用いて、ミエリン
発達調節物質及び脱髄疾患の治療薬をスクリーニングす
る方法を構築した。
ドログリア（乏突起膠細胞）におけるミエリン形成のプ
ロセスを解明し、その知見に基づいて、ミエリン発達障
害モデル非ヒト動物を作製し提供すること、及び該ミエ
リン発達障害モデル非ヒト動物を用いて、ミエリン発達
調節物質及び脱髄疾患の治療薬をスクリーニングする方
法を提供すること。 【解決手段】 本発明においては、免疫グロブリンＦｃ
受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）、Ｆｙｎチロキシ
ナーゼ（Ｆｙｎ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢ
Ｐ）が、ミエリン形成シグナル分子として働くことを見
い出し、この知見に基づいて、該シグナル分子を欠損し
たミエリン発達障害モデル非ヒト動物を作製し、更に該
ミエリン発達障害モデル非ヒト動物を用いて、ミエリン
発達調節物質及び脱髄疾患の治療薬をスクリーニングす
る方法を構築した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はミエリン発達障害モ
デル非ヒト動物、特に、オリゴデンドログリアにおける
ミエリン形成シグナル分子の欠損により、ミエリン形成
が阻害され、脱髄疾患を発症したミエリン発達障害モデ
ル非ヒト動物、及び該非ヒト動物を用いたミエリン発達
調節物質、脱髄疾患の治療薬のスクリーニングに関す
る。
デル非ヒト動物、特に、オリゴデンドログリアにおける
ミエリン形成シグナル分子の欠損により、ミエリン形成
が阻害され、脱髄疾患を発症したミエリン発達障害モデ
ル非ヒト動物、及び該非ヒト動物を用いたミエリン発達
調節物質、脱髄疾患の治療薬のスクリーニングに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】神経線維（nerve fiber）には、有髄線
維といわれ、神経細胞（ニューロン）の突起である軸索
（axon）が髄鞘によって包まれているものがある。この
髄鞘はミエリンと呼ばれる。個々の軸索を覆う多層膜性
鞘であるミエリンは、神経インパルスの高速伝導、並び
に軸索の機能及びその構造の構築（integrity）にとっ
て必要である（Science 280, 1610, 1998、J. Neurosc
i. 18, 1953, 1998）。ミエリンは中枢神経系（ＣＮ
Ｓ）においてオリゴデンドログリア（乏突起膠細胞）に
より合成され、そのプロセスは誕生直後から開始され
る。ミエリンが崩壊すると、中枢神経系におけるミエリ
ンが決定的に失われることを特徴とする重大な疾患をヒ
トに引き起こす。
維といわれ、神経細胞（ニューロン）の突起である軸索
（axon）が髄鞘によって包まれているものがある。この
髄鞘はミエリンと呼ばれる。個々の軸索を覆う多層膜性
鞘であるミエリンは、神経インパルスの高速伝導、並び
に軸索の機能及びその構造の構築（integrity）にとっ
て必要である（Science 280, 1610, 1998、J. Neurosc
i. 18, 1953, 1998）。ミエリンは中枢神経系（ＣＮ
Ｓ）においてオリゴデンドログリア（乏突起膠細胞）に
より合成され、そのプロセスは誕生直後から開始され
る。ミエリンが崩壊すると、中枢神経系におけるミエリ
ンが決定的に失われることを特徴とする重大な疾患をヒ
トに引き起こす。
【０００３】ミエリンは少数のミエリンタンパク質で構
成されている。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）
は、中枢神経系内における全ミエリンタンパク質の３０
〜４０％を構成している。ＭＢＰはミエリン形成に不可
欠であり、ミエリン鞘の緊密化（コンパクション）に重
要な役割を果たしている（J. Cell Biol. 95, 242, 198
2）。ＭＢＰはまた、ミエリン随伴性糖タンパク質（Ｍ
ＡＧ）等、他のミエリンタンパク質の発現も調節してお
り、ＭＢＰがミエリン形成に欠くことができない必須の
ものであることが示唆される（Neurosci. Lett. 298, 1
63, 2001）。
成されている。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）
は、中枢神経系内における全ミエリンタンパク質の３０
〜４０％を構成している。ＭＢＰはミエリン形成に不可
欠であり、ミエリン鞘の緊密化（コンパクション）に重
要な役割を果たしている（J. Cell Biol. 95, 242, 198
2）。ＭＢＰはまた、ミエリン随伴性糖タンパク質（Ｍ
ＡＧ）等、他のミエリンタンパク質の発現も調節してお
り、ＭＢＰがミエリン形成に欠くことができない必須の
ものであることが示唆される（Neurosci. Lett. 298, 1
63, 2001）。
【０００４】一方、脱髄疾患の一つである多発性硬化症
（ＭＳ）は、一世紀以上も前に報告されている疾患であ
るが、その病因及び治療法については未だに不明な点が
多く、研究も進んでいない（Nature 399, A40, 199
9）。近年になってオリゴデンドログリア前駆体細胞集
団が、初めてＭＳ病巣において見い出されたことが報告
されている（J. Neurosci. 18, 601, 1998）。失われた
ミエリンの再生に関与するこれら内因性前駆体細胞の分
化及び／又は増強を可能にする機構は、効果的な治療上
のターゲットと考えられる。そこでミエリン形成を含む
機構を解明する包括的な研究を行うことは、脱髄疾患の
治療に非常に有益である。
（ＭＳ）は、一世紀以上も前に報告されている疾患であ
るが、その病因及び治療法については未だに不明な点が
多く、研究も進んでいない（Nature 399, A40, 199
9）。近年になってオリゴデンドログリア前駆体細胞集
団が、初めてＭＳ病巣において見い出されたことが報告
されている（J. Neurosci. 18, 601, 1998）。失われた
ミエリンの再生に関与するこれら内因性前駆体細胞の分
化及び／又は増強を可能にする機構は、効果的な治療上
のターゲットと考えられる。そこでミエリン形成を含む
機構を解明する包括的な研究を行うことは、脱髄疾患の
治療に非常に有益である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、中枢
神経系（ＣＮＳ）において、オリゴデンドログリア（乏
突起膠細胞）におけるミエリン形成のプロセス、特に、
このミエリン形成のプロセスにおいてミエリン形成に関
与するシグナル分子とその関与の機構を解明し、その知
見に基づいて、ミエリン発達障害モデル非ヒト動物を作
製し提供すること、及び該ミエリン発達障害モデル非ヒ
ト動物を用いて、ミエリン発達調節物質及び脱髄疾患の
治療薬をスクリーニングする方法を提供することにあ
る。ここでミエリン発達調節物質とは、ミエリンの発達
を促進又は抑制する物質をいう。
神経系（ＣＮＳ）において、オリゴデンドログリア（乏
突起膠細胞）におけるミエリン形成のプロセス、特に、
このミエリン形成のプロセスにおいてミエリン形成に関
与するシグナル分子とその関与の機構を解明し、その知
見に基づいて、ミエリン発達障害モデル非ヒト動物を作
製し提供すること、及び該ミエリン発達障害モデル非ヒ
ト動物を用いて、ミエリン発達調節物質及び脱髄疾患の
治療薬をスクリーニングする方法を提供することにあ
る。ここでミエリン発達調節物質とは、ミエリンの発達
を促進又は抑制する物質をいう。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究の結果、免疫グロブリンＦｃ受容
体のγサブユニット（ＦｃＲγ）、Ｆｙｎチロキシナー
ゼ（Ｆｙｎ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）
が、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰからなるシグナルカスケ
ードとしてミエリン形成に関与していることを見い出し
た。本発明においては、この知見に基づいて、該シグナ
ル分子を欠損したミエリン発達障害モデル非ヒト動物を
作製し、更に該ミエリン発達障害モデル非ヒト動物を用
いて、ミエリン発達調節物質及び脱髄疾患の治療薬をス
クリーニングする方法を構築した。
を解決すべく鋭意研究の結果、免疫グロブリンＦｃ受容
体のγサブユニット（ＦｃＲγ）、Ｆｙｎチロキシナー
ゼ（Ｆｙｎ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）
が、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰからなるシグナルカスケ
ードとしてミエリン形成に関与していることを見い出し
た。本発明においては、この知見に基づいて、該シグナ
ル分子を欠損したミエリン発達障害モデル非ヒト動物を
作製し、更に該ミエリン発達障害モデル非ヒト動物を用
いて、ミエリン発達調節物質及び脱髄疾患の治療薬をス
クリーニングする方法を構築した。
【０００７】すなわち本発明は、オリゴデンドログリア
におけるミエリン形成シグナル分子の欠損により、ミエ
リン形成が阻害され、脱髄疾患を発症したことを特徴と
するミエリン発達障害モデル非ヒト動物（請求項１）
や、脱髄疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）であることを特
徴とする請求項１記載のミエリン発達障害モデル非ヒト
動物（請求項２）や、ミエリン形成シグナル分子の欠損
が、免疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット（Ｆｃ
Ｒγ）及び／又はＦｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）のシ
グナル分子の欠損であることを特徴とする請求項１又は
２記載のミエリン発達障害モデル非ヒト動物（請求項
３）や、ミエリン形成シグナル分子の欠損が、ミエリン
形成を調節するシグナルカスケードの阻害であることを
特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のミエリン発達
障害モデル非ヒト動物（請求項４）や、ミエリン形成を
調節するシグナルカスケードの阻害が、免疫グロブリン
Ｆｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）−Ｆｙｎチロ
キシナーゼ（Ｆｙｎ）−ミエリン塩基性タンパク質（Ｍ
ＢＰ）からなるシグナルカスケードの阻害であることを
特徴とする請求項４記載のミエリン発達障害モデル非ヒ
ト動物（請求項５）や、非ヒト動物がマウスであること
を特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のミエリン発
達障害モデル非ヒト動物（請求項６）からなる。
におけるミエリン形成シグナル分子の欠損により、ミエ
リン形成が阻害され、脱髄疾患を発症したことを特徴と
するミエリン発達障害モデル非ヒト動物（請求項１）
や、脱髄疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）であることを特
徴とする請求項１記載のミエリン発達障害モデル非ヒト
動物（請求項２）や、ミエリン形成シグナル分子の欠損
が、免疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット（Ｆｃ
Ｒγ）及び／又はＦｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）のシ
グナル分子の欠損であることを特徴とする請求項１又は
２記載のミエリン発達障害モデル非ヒト動物（請求項
３）や、ミエリン形成シグナル分子の欠損が、ミエリン
形成を調節するシグナルカスケードの阻害であることを
特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のミエリン発達
障害モデル非ヒト動物（請求項４）や、ミエリン形成を
調節するシグナルカスケードの阻害が、免疫グロブリン
Ｆｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）−Ｆｙｎチロ
キシナーゼ（Ｆｙｎ）−ミエリン塩基性タンパク質（Ｍ
ＢＰ）からなるシグナルカスケードの阻害であることを
特徴とする請求項４記載のミエリン発達障害モデル非ヒ
ト動物（請求項５）や、非ヒト動物がマウスであること
を特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のミエリン発
達障害モデル非ヒト動物（請求項６）からなる。
【０００８】また本発明は、請求項１〜６のいずれか記
載のミエリン発達障害モデル非ヒト動物に被検物質を投
与すること又は該動物由来の組織、器官若しくは細胞を
被検物質と接触させることを特徴とするミエリン発達調
節物質のスクリーニング方法（請求項７）や、請求項１
〜６のいずれか記載のミエリン発達障害モデル非ヒト動
物に被検物質を投与すること又は該動物由来の組織、器
官若しくは細胞を被検物質と接触させ、ミエリン塩基性
タンパク質（ＭＢＰ）の発現又はミエリンの形成を測定
又は評価することを特徴とする請求項７記載のミエリン
発達調節物質のスクリーニング方法（請求項８）や、ミ
エリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の発現又はミエリン
の形成の測定又は評価を、ミエリン発達障害モデル非ヒ
ト動物の場合と野生型非ヒト動物の場合を比較・評価す
ることにより行うことを特徴とする請求項８記載のミエ
リン発達調節物質のスクリーニング方法（請求項９）
や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項
７〜９のいずれか記載のミエリン発達調節物質のスクリ
ーニング方法（請求項１０）や、請求項７〜１０のいず
れか記載のミエリン発達調節物質のスクリーニング方法
により得られるミエリン発達調節物質（請求項１１）
や、請求項１〜６のいずれか記載のミエリン発達障害モ
デル非ヒト動物を、脱髄疾患の治療薬のスクリーニング
に使用することを特徴とする脱髄疾患治療薬のスクリー
ニング方法（請求項１２）や、脱髄疾患治療薬が、多発
性硬化症（ＭＳ）の治療薬であることを特徴とする請求
項１２記載の脱髄疾患治療薬のスクリーニング方法（請
求項１３）や、請求項１２又は１３記載の脱髄疾患治療
薬のスクリーニング方法により得られる脱髄疾患治療薬
（請求項１４）や、ミエリン形成シグナル分子を有効成
分とすることを特徴とする脱髄疾患治療薬（請求項１
５）や、ミエリン形成シグナル分子が、免疫グロブリン
Ｆｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）及び／又はＦ
ｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）のシグナル分子であるこ
とを特徴とする請求項１５記載の脱髄疾患治療薬（請求
項１６）や、免疫グロブリンＩｇＧからなる静脈内免疫
グロブリン療法用脱髄疾患治療薬（請求項１７）や、脱
髄疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）であることを特徴とす
る請求項１５〜１７のいずれか記載の脱髄疾患治療薬
（請求項１８）からなる。
載のミエリン発達障害モデル非ヒト動物に被検物質を投
与すること又は該動物由来の組織、器官若しくは細胞を
被検物質と接触させることを特徴とするミエリン発達調
節物質のスクリーニング方法（請求項７）や、請求項１
〜６のいずれか記載のミエリン発達障害モデル非ヒト動
物に被検物質を投与すること又は該動物由来の組織、器
官若しくは細胞を被検物質と接触させ、ミエリン塩基性
タンパク質（ＭＢＰ）の発現又はミエリンの形成を測定
又は評価することを特徴とする請求項７記載のミエリン
発達調節物質のスクリーニング方法（請求項８）や、ミ
エリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の発現又はミエリン
の形成の測定又は評価を、ミエリン発達障害モデル非ヒ
ト動物の場合と野生型非ヒト動物の場合を比較・評価す
ることにより行うことを特徴とする請求項８記載のミエ
リン発達調節物質のスクリーニング方法（請求項９）
や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項
７〜９のいずれか記載のミエリン発達調節物質のスクリ
ーニング方法（請求項１０）や、請求項７〜１０のいず
れか記載のミエリン発達調節物質のスクリーニング方法
により得られるミエリン発達調節物質（請求項１１）
や、請求項１〜６のいずれか記載のミエリン発達障害モ
デル非ヒト動物を、脱髄疾患の治療薬のスクリーニング
に使用することを特徴とする脱髄疾患治療薬のスクリー
ニング方法（請求項１２）や、脱髄疾患治療薬が、多発
性硬化症（ＭＳ）の治療薬であることを特徴とする請求
項１２記載の脱髄疾患治療薬のスクリーニング方法（請
求項１３）や、請求項１２又は１３記載の脱髄疾患治療
薬のスクリーニング方法により得られる脱髄疾患治療薬
（請求項１４）や、ミエリン形成シグナル分子を有効成
分とすることを特徴とする脱髄疾患治療薬（請求項１
５）や、ミエリン形成シグナル分子が、免疫グロブリン
Ｆｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）及び／又はＦ
ｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）のシグナル分子であるこ
とを特徴とする請求項１５記載の脱髄疾患治療薬（請求
項１６）や、免疫グロブリンＩｇＧからなる静脈内免疫
グロブリン療法用脱髄疾患治療薬（請求項１７）や、脱
髄疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）であることを特徴とす
る請求項１５〜１７のいずれか記載の脱髄疾患治療薬
（請求項１８）からなる。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）
において、オリゴデンドログリア（乏突起膠細胞）にお
けるミエリン形成のプロセス、特に、このミエリン形成
のプロセスにおいてミエリン形成に関与するシグナル分
子とその関与の機構を解明し、その知見に基づいて、ミ
エリン発達障害モデル非ヒト動物を作製することよりな
る。
において、オリゴデンドログリア（乏突起膠細胞）にお
けるミエリン形成のプロセス、特に、このミエリン形成
のプロセスにおいてミエリン形成に関与するシグナル分
子とその関与の機構を解明し、その知見に基づいて、ミ
エリン発達障害モデル非ヒト動物を作製することよりな
る。
【００１０】本発明においては、ミエリン形成に関与す
るシグナル分子として、免疫グロブリンＦｃ受容体のγ
サブユニット（ＦｃＲγ）、Ｆｙｎチロキシナーゼ（Ｆ
ｙｎ）及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）が免疫
グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）−
Ｆｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）−ミエリン塩基性タン
パク質（ＭＢＰ）からなるシグナルカスケードとして関
与することを見い出した。したがって、これらのシグナ
ル分子を欠損させて、ミエリン発達障害モデル非ヒト動
物を作製し、該非ヒト動物を用いてミエリン発達調節物
質のスクリーニングを行う。又、本発明においては、シ
グナル分子を欠損させたミエリン発達障害モデル非ヒト
動物が、多発性硬化症（ＭＳ）のような脱髄疾患を発症
することを見い出した。したがって、該ミエリン発達障
害モデル非ヒト動物を用いて、脱髄疾患の治療薬のスク
リーニングを行うことを可能とする。
るシグナル分子として、免疫グロブリンＦｃ受容体のγ
サブユニット（ＦｃＲγ）、Ｆｙｎチロキシナーゼ（Ｆ
ｙｎ）及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）が免疫
グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）−
Ｆｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）−ミエリン塩基性タン
パク質（ＭＢＰ）からなるシグナルカスケードとして関
与することを見い出した。したがって、これらのシグナ
ル分子を欠損させて、ミエリン発達障害モデル非ヒト動
物を作製し、該非ヒト動物を用いてミエリン発達調節物
質のスクリーニングを行う。又、本発明においては、シ
グナル分子を欠損させたミエリン発達障害モデル非ヒト
動物が、多発性硬化症（ＭＳ）のような脱髄疾患を発症
することを見い出した。したがって、該ミエリン発達障
害モデル非ヒト動物を用いて、脱髄疾患の治療薬のスク
リーニングを行うことを可能とする。
【００１１】ミエリン発達障害モデル非ヒト動物を作製
するためには、ミエリン形成に関与するシグナル分子の
遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちこれ
らのシグナル分子のノックアウトマウスを作製する。こ
れらのノックアウトマウスは、文献（Cell 76, 519-52
9, 1994）に記載する方法等によって作製することがで
きる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣ
Ｒ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、シグナ
ル分子の遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングさ
れた遺伝子を組換えＤＮＡ技術により、シグナル分子の
遺伝子の全部又は一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝
子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリ
アトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘ
ルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺
伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作
製し、この作製されたターゲティングベクターを線状化
し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によって
ＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組
換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮ
Ｃ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。
この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうか
をサザンブロット法等により確認することが好ましい。
するためには、ミエリン形成に関与するシグナル分子の
遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちこれ
らのシグナル分子のノックアウトマウスを作製する。こ
れらのノックアウトマウスは、文献（Cell 76, 519-52
9, 1994）に記載する方法等によって作製することがで
きる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣ
Ｒ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、シグナ
ル分子の遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングさ
れた遺伝子を組換えＤＮＡ技術により、シグナル分子の
遺伝子の全部又は一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝
子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリ
アトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘ
ルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺
伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作
製し、この作製されたターゲティングベクターを線状化
し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によって
ＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組
換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮ
Ｃ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。
この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうか
をサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００１２】上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中に
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウ
スを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを
交配させることによって、シグナル分子のノックアウト
マウスを得ることができる。そして、かかるシグナル分
子のノックアウトマウスにおけるシグナル分子の遺伝子
が染色体上で欠損していることを確認する方法として
は、例えば、上記の方法により得られたマウスの尾から
ＤＮＡを単離してサザンブロット法等により調べる方法
や、このマウスの骨髄マスト細胞等から抽出したタンパ
ク質をイムノブロット分析等により調べる方法等を挙げ
ることができる。
マイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマ
ウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウ
スを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウ
スを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを
交配させることによって、シグナル分子のノックアウト
マウスを得ることができる。そして、かかるシグナル分
子のノックアウトマウスにおけるシグナル分子の遺伝子
が染色体上で欠損していることを確認する方法として
は、例えば、上記の方法により得られたマウスの尾から
ＤＮＡを単離してサザンブロット法等により調べる方法
や、このマウスの骨髄マスト細胞等から抽出したタンパ
ク質をイムノブロット分析等により調べる方法等を挙げ
ることができる。
【００１３】本発明における、ミエリン発達調節物質及
び脱髄疾患の治療薬のスクリーニング方法としては、本
発明のミエリン発達障害モデル非ヒト動物に被検物質を
投与する方法や、ミエリン発達障害モデル非ヒト動物由
来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させる
方法を挙げることができる。ミエリン発達障害モデル非
ヒト動物由来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と
接触させる方法としては、ミエリン発達障害モデル非ヒ
ト動物、例えば、前記ミエリン形成に関与するシグナル
分子のノックアウトマウス由来の組織、器官、又は細胞
を被検物質と接触させ、該細胞におけるミエリン塩基性
タンパク質の発現を測定・評価する方法を具体的に例示
することができる。
び脱髄疾患の治療薬のスクリーニング方法としては、本
発明のミエリン発達障害モデル非ヒト動物に被検物質を
投与する方法や、ミエリン発達障害モデル非ヒト動物由
来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させる
方法を挙げることができる。ミエリン発達障害モデル非
ヒト動物由来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と
接触させる方法としては、ミエリン発達障害モデル非ヒ
ト動物、例えば、前記ミエリン形成に関与するシグナル
分子のノックアウトマウス由来の組織、器官、又は細胞
を被検物質と接触させ、該細胞におけるミエリン塩基性
タンパク質の発現を測定・評価する方法を具体的に例示
することができる。
【００１４】また、ミエリン発達障害モデル非ヒト動物
に被検物質を投与する方法としては、例えば、ミエリン
形成に関与するシグナル分子のノックアウトマウスに被
検物質を投与し、該マウス由来の組織、器官、又は細胞
におけるミエリン塩基性タンパク質の発現等、ミエリン
の発達を測定・評価する方法や、前記ミエリン形成に関
与するシグナル分子のノックアウトマウスに被検物質を
投与し、該非ヒト動物におけるミエリン形成の発達又は
脱髄の程度を測定・評価する方法や、前記ミエリン形成
に関与するシグナル分子のノックアウトマウスに被検物
質を投与し、該マウスの多発性硬化症等の病徴を測定・
評価する方法などを具体的に挙げることができる。例え
ば、多発性硬化症においては、中枢神経系の白質に大小
さまざまの脱髄巣が散在し、組織学的には髄鞘が破壊さ
れる。脱髄巣は早期には炎症性細胞浸潤があるが、慢性
期になるとグリア線維でおきかえられて硬くなる。な
お、上記スクリーニングに際しては、シグナル分子のノ
ックアウトマウスと同腹の野生型マウスと比較評価する
ことが好ましい。
に被検物質を投与する方法としては、例えば、ミエリン
形成に関与するシグナル分子のノックアウトマウスに被
検物質を投与し、該マウス由来の組織、器官、又は細胞
におけるミエリン塩基性タンパク質の発現等、ミエリン
の発達を測定・評価する方法や、前記ミエリン形成に関
与するシグナル分子のノックアウトマウスに被検物質を
投与し、該非ヒト動物におけるミエリン形成の発達又は
脱髄の程度を測定・評価する方法や、前記ミエリン形成
に関与するシグナル分子のノックアウトマウスに被検物
質を投与し、該マウスの多発性硬化症等の病徴を測定・
評価する方法などを具体的に挙げることができる。例え
ば、多発性硬化症においては、中枢神経系の白質に大小
さまざまの脱髄巣が散在し、組織学的には髄鞘が破壊さ
れる。脱髄巣は早期には炎症性細胞浸潤があるが、慢性
期になるとグリア線維でおきかえられて硬くなる。な
お、上記スクリーニングに際しては、シグナル分子のノ
ックアウトマウスと同腹の野生型マウスと比較評価する
ことが好ましい。
【００１５】
【実施例】以下に、本発明における、中枢神経系（ＣＮ
Ｓ）のオリゴデンドログリア（乏突起膠細胞）における
ミエリン形成のプロセス、特に、このミエリン形成のプ
ロセスにおいてミエリン形成に関与するシグナル分子と
その関与の機構の解明について、及び該知見に基づく、
ミエリン発達障害モデル非ヒト動物の調製、更には該ミ
エリン発達障害モデル非ヒト動物を用いて、ミエリン発
達調節物質及び脱髄疾患の治療薬をスクリーニングする
方法について、実施例を挙げて具体的に説明するが、こ
の発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではな
い。
Ｓ）のオリゴデンドログリア（乏突起膠細胞）における
ミエリン形成のプロセス、特に、このミエリン形成のプ
ロセスにおいてミエリン形成に関与するシグナル分子と
その関与の機構の解明について、及び該知見に基づく、
ミエリン発達障害モデル非ヒト動物の調製、更には該ミ
エリン発達障害モデル非ヒト動物を用いて、ミエリン発
達調節物質及び脱髄疾患の治療薬をスクリーニングする
方法について、実施例を挙げて具体的に説明するが、こ
の発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではな
い。
【００１６】［中枢神経系（ＣＮＳ）において、オリゴ
デンドログリア（乏突起膠細胞）におけるミエリン形成
のプロセスとそれに関与するシグナル分子、及びその機
構の解明］生来ＭＢＰ遺伝子を欠損し、無意識に震える
マウス（Cell 42, 149, 1985）は、中枢神経系軸策にお
いて低有髄化（hypomyelination）を示し、生後３ヶ月
以内に死亡する。ＭＢＰ遺伝子のエクソン２を有するＭ
ＢＰの特異的アイソフォーム（イソ型）は、ミエリン形
成に調節機能を示すことから（J. Cell Biol. 113,393,
1991）、ミエリン形成の予備的事象としてＭＢＰが必
須であることが示されている。ミエリン形成プロセスに
おいては、Ｆｙｎチロシンキナーゼ（Ｆｙｎ）が、オリ
ゴデンドログリアにおける最も重要なシグナル分子とし
て機能し（Nature 367, 572, 1994）、ＭＢＰの発現を
刺激する（J. Neurosci. 19, 1393, 1999）。Ｆｙｎ欠
損マウスでは、ＭＢＰ産生が著しく低下する（Nature 3
67, 572, 1994、J. Neurosci. 19, 1393, 1999、Neuros
ci. Res. 37, 21, 2000）。非受容体型チロシンキナー
ゼであるＦｙｎは、細胞外シグナルを仲介するためにア
ダプター分子と結合する必要がある。ミエリン随伴性糖
タンパク質（ＭＡＧ）は、有髄化においてＦｙｎシグナ
ルの初期誘発に関わる物質の候補と考えられてきたが
（Nature 367, 572, 1994、J. Neurosci. 19, 1393, 19
99、Neurosci. Res. 37, 21, 2000、J. Comp. Neurol.
284, 451, 1989、J. Neurosci. Res. 25, 1, 1990）、
ＭＡＧ欠損マウスで観察されたミエリンの異常は些細な
ものだった（Nature 2369, 747, 1994、Neuron 13, 22
9, 1994）。ＭＡＧ欠損マウスではＭＢＰ発現に有意の
差は認められず（Nature 2369, 747, 1994、Neuron 13,
229, 1994、J. Neurosci. Res. 62, 772, 2000）、細
胞外シグナルをＦｙｎに結合する上流シグナル分子とし
てのＭＡＧの有効性に疑問を投げかけている（Nature 3
67, 572, 1994、J. Neurosci. 19, 1393, 1999、Neuros
ci. Res. 37, 21, 2000）。ＭＡＧ以外の分子がＭＡＧ
欠損マウスにおいてその代わりに機能すると考える研究
者もいるが、まだ確認されていない（Glia 29, 154, 20
00、J. Neurosci. 20, 7430, 2000）。
デンドログリア（乏突起膠細胞）におけるミエリン形成
のプロセスとそれに関与するシグナル分子、及びその機
構の解明］生来ＭＢＰ遺伝子を欠損し、無意識に震える
マウス（Cell 42, 149, 1985）は、中枢神経系軸策にお
いて低有髄化（hypomyelination）を示し、生後３ヶ月
以内に死亡する。ＭＢＰ遺伝子のエクソン２を有するＭ
ＢＰの特異的アイソフォーム（イソ型）は、ミエリン形
成に調節機能を示すことから（J. Cell Biol. 113,393,
1991）、ミエリン形成の予備的事象としてＭＢＰが必
須であることが示されている。ミエリン形成プロセスに
おいては、Ｆｙｎチロシンキナーゼ（Ｆｙｎ）が、オリ
ゴデンドログリアにおける最も重要なシグナル分子とし
て機能し（Nature 367, 572, 1994）、ＭＢＰの発現を
刺激する（J. Neurosci. 19, 1393, 1999）。Ｆｙｎ欠
損マウスでは、ＭＢＰ産生が著しく低下する（Nature 3
67, 572, 1994、J. Neurosci. 19, 1393, 1999、Neuros
ci. Res. 37, 21, 2000）。非受容体型チロシンキナー
ゼであるＦｙｎは、細胞外シグナルを仲介するためにア
ダプター分子と結合する必要がある。ミエリン随伴性糖
タンパク質（ＭＡＧ）は、有髄化においてＦｙｎシグナ
ルの初期誘発に関わる物質の候補と考えられてきたが
（Nature 367, 572, 1994、J. Neurosci. 19, 1393, 19
99、Neurosci. Res. 37, 21, 2000、J. Comp. Neurol.
284, 451, 1989、J. Neurosci. Res. 25, 1, 1990）、
ＭＡＧ欠損マウスで観察されたミエリンの異常は些細な
ものだった（Nature 2369, 747, 1994、Neuron 13, 22
9, 1994）。ＭＡＧ欠損マウスではＭＢＰ発現に有意の
差は認められず（Nature 2369, 747, 1994、Neuron 13,
229, 1994、J. Neurosci. Res. 62, 772, 2000）、細
胞外シグナルをＦｙｎに結合する上流シグナル分子とし
てのＭＡＧの有効性に疑問を投げかけている（Nature 3
67, 572, 1994、J. Neurosci. 19, 1393, 1999、Neuros
ci. Res. 37, 21, 2000）。ＭＡＧ以外の分子がＭＡＧ
欠損マウスにおいてその代わりに機能すると考える研究
者もいるが、まだ確認されていない（Glia 29, 154, 20
00、J. Neurosci. 20, 7430, 2000）。
【００１７】しかしＭＡＧは、ミエリン形成を誘発する
ものではなく、かかる誘発に関与する未知の分子の存在
が考えられる（Neurosci. Lett. 298, 163, 2001）。ま
たインビトロでの実験により、オリゴデンドログリアが
形態分化するときのＦｙｎ活性が、ＭＡＧの初期発現に
先立って生じることが明らかになった（J. Cell Biol.
145, 1209, 1999）。つまりＭＢＰがインビボでのＭＡ
Ｇの発現を調節している（Neurosci. Lett. 298, 163,
2001）。本発明は、Ｆｙｎに機能的に結合し、ＭＢＰの
初期発現を惹起する誘発因子（trigger）を同定するこ
とを目的とする。ミエリン形成における真の誘発因子で
あるこの分子は、ＭＡＧの出現に先立って発現される
（例：生後２週目の始め。Neurosci. Lett. 298, 163,
2001、J. Neurosci. 19, 4948, 1999）。かかるカスケ
ードを解明すると、ミエリン形成に関わる機構をより深
く理解できるようになる。
ものではなく、かかる誘発に関与する未知の分子の存在
が考えられる（Neurosci. Lett. 298, 163, 2001）。ま
たインビトロでの実験により、オリゴデンドログリアが
形態分化するときのＦｙｎ活性が、ＭＡＧの初期発現に
先立って生じることが明らかになった（J. Cell Biol.
145, 1209, 1999）。つまりＭＢＰがインビボでのＭＡ
Ｇの発現を調節している（Neurosci. Lett. 298, 163,
2001）。本発明は、Ｆｙｎに機能的に結合し、ＭＢＰの
初期発現を惹起する誘発因子（trigger）を同定するこ
とを目的とする。ミエリン形成における真の誘発因子で
あるこの分子は、ＭＡＧの出現に先立って発現される
（例：生後２週目の始め。Neurosci. Lett. 298, 163,
2001、J. Neurosci. 19, 4948, 1999）。かかるカスケ
ードを解明すると、ミエリン形成に関わる機構をより深
く理解できるようになる。
【００１８】本発明者らは、免疫系の重要なシグナル分
子である免疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット
（ＦｃＲγ）（Immunol. Res. 22, 21, 2000）が、ミエ
リン形成に関与していることを明らかにした。Ｆｙｎに
結合するＦｃＲγ（Immunol. Res. 22, 21, 2000）は、
オリゴデンドログリアにおけるＭＢＰの初期発現を支配
している。本発明者らは、かかるＦｃＲγ−Ｆｙｎ−Ｍ
ＢＰカスケードがミエリン形成に重要であると考えた。
免疫グロブリンＧに特異的なＦｃ受容体をオリゴデンド
ログリアから検出したが、これにより抗体−Ｆｃ受容体
相互作用がミエリン形成を調節していることが示唆され
る。ＦｙｎのレギュレーターであるＣＤ４５（Mol. Cel
l. Biol. 13, 1651, 1993）は、ミエリン形成の過程で
オリゴデンドログリアにおいてＦｃＲγと共発現され
た。一部のＭＳ患者にＣＤ４５の変異が認められたこと
から、ミエリン形成過程における上記シグナル分子の関
与が確認できる（Nat. Genet. 26, 495, 2000）。本発
明は、脳と免疫系との関連性に関し、ミエリン形成機構
を解明するものである。かかる関係を解明することによ
り、ＭＳ等の脱髄疾患の新たな治療法の開発が可能とな
る。
子である免疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット
（ＦｃＲγ）（Immunol. Res. 22, 21, 2000）が、ミエ
リン形成に関与していることを明らかにした。Ｆｙｎに
結合するＦｃＲγ（Immunol. Res. 22, 21, 2000）は、
オリゴデンドログリアにおけるＭＢＰの初期発現を支配
している。本発明者らは、かかるＦｃＲγ−Ｆｙｎ−Ｍ
ＢＰカスケードがミエリン形成に重要であると考えた。
免疫グロブリンＧに特異的なＦｃ受容体をオリゴデンド
ログリアから検出したが、これにより抗体−Ｆｃ受容体
相互作用がミエリン形成を調節していることが示唆され
る。ＦｙｎのレギュレーターであるＣＤ４５（Mol. Cel
l. Biol. 13, 1651, 1993）は、ミエリン形成の過程で
オリゴデンドログリアにおいてＦｃＲγと共発現され
た。一部のＭＳ患者にＣＤ４５の変異が認められたこと
から、ミエリン形成過程における上記シグナル分子の関
与が確認できる（Nat. Genet. 26, 495, 2000）。本発
明は、脳と免疫系との関連性に関し、ミエリン形成機構
を解明するものである。かかる関係を解明することによ
り、ＭＳ等の脱髄疾患の新たな治療法の開発が可能とな
る。
【００１９】［インビトロでのオリゴデンドログリアに
おけるＦｃＲγの発現］免疫系において、Ｓｒｃファミ
リーのチロシンキナーゼシグナル活性の一部として、免
疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ：immunore
ceptor tyrosine-based activation motife）を含む
細胞質ドメインと分子との相互作用がある（Nature 33
8, 383, 1989、Cell 78, 553, 1994）。Ｓｒｃファミリ
ーのチロシンキナーゼはＩＴＡＭに存在するチロシン残
基をリン酸化し、細胞内シグナリングを誘発する（Scie
nce 263, 1136, 1994）。Ｓｒｃファミリーのメンバー
であるＦｙｎは、有髄化の初期現象において重要である
（Nature 367, 572, 1994）。このことから、有髄化の
初期現象においてオリゴデンドログリアで発現されるＩ
ＴＡＭを有する分子が、ミエリン形成に関与しているこ
とが考えられる。Ｆｙｎによってリン酸化されることが
わかっている上記細胞質ＩＴＡＭを含むＦｃＲγ（Bloo
d 15, 4246, 2000）を候補として調べたが、かかる免疫
分子がオリゴデンドログリア細胞内に存在するかどうか
については未だ解明されていない。
おけるＦｃＲγの発現］免疫系において、Ｓｒｃファミ
リーのチロシンキナーゼシグナル活性の一部として、免
疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ：immunore
ceptor tyrosine-based activation motife）を含む
細胞質ドメインと分子との相互作用がある（Nature 33
8, 383, 1989、Cell 78, 553, 1994）。Ｓｒｃファミリ
ーのチロシンキナーゼはＩＴＡＭに存在するチロシン残
基をリン酸化し、細胞内シグナリングを誘発する（Scie
nce 263, 1136, 1994）。Ｓｒｃファミリーのメンバー
であるＦｙｎは、有髄化の初期現象において重要である
（Nature 367, 572, 1994）。このことから、有髄化の
初期現象においてオリゴデンドログリアで発現されるＩ
ＴＡＭを有する分子が、ミエリン形成に関与しているこ
とが考えられる。Ｆｙｎによってリン酸化されることが
わかっている上記細胞質ＩＴＡＭを含むＦｃＲγ（Bloo
d 15, 4246, 2000）を候補として調べたが、かかる免疫
分子がオリゴデンドログリア細胞内に存在するかどうか
については未だ解明されていない。
【００２０】本発明は、オリゴデンドログリア系統にお
けるＦｃＲγの存在について初めて詳らかにするもので
ある。マウス中枢神経系から単離したオリゴデンドログ
リア前駆体細胞（ＯＰＣ；J. Neurosci. Res. 60, 579,
2000）を培養して抽出した全ＲＮＡを調べたところ、
この段階ではまだＭＡＧが発現されていないことがわか
った（Keio J. Med. 44, 47, 1995）。しかし、ＦｃＲ
γ ｍＲＮＡがマスト細胞の発現レベルと同等に有意に
発現されることが、ＲＴ−ＰＣＲの結果明らかになった
（図１Ａ−ａ）（ＲＴ−ＰＣＲの実験は、方法２参
照）。これ以外のＩＴＡＭ含有分子であるＣＤ３ζ（Im
munol. Res. 22, 21, 2000）は、神経細胞の発達及びそ
の可塑性に関与しているが（Science 290, 2155, 200
0）、ＲＴ−ＰＣＲによるＯＰＣでは検出されなかった
（図１Ａ−ｂ）。
けるＦｃＲγの存在について初めて詳らかにするもので
ある。マウス中枢神経系から単離したオリゴデンドログ
リア前駆体細胞（ＯＰＣ；J. Neurosci. Res. 60, 579,
2000）を培養して抽出した全ＲＮＡを調べたところ、
この段階ではまだＭＡＧが発現されていないことがわか
った（Keio J. Med. 44, 47, 1995）。しかし、ＦｃＲ
γ ｍＲＮＡがマスト細胞の発現レベルと同等に有意に
発現されることが、ＲＴ−ＰＣＲの結果明らかになった
（図１Ａ−ａ）（ＲＴ−ＰＣＲの実験は、方法２参
照）。これ以外のＩＴＡＭ含有分子であるＣＤ３ζ（Im
munol. Res. 22, 21, 2000）は、神経細胞の発達及びそ
の可塑性に関与しているが（Science 290, 2155, 200
0）、ＲＴ−ＰＣＲによるＯＰＣでは検出されなかった
（図１Ａ−ｂ）。
【００２１】本発明者らはまた、免疫細胞化学法によ
り、Ａ２Ｂ５陽性オリゴデンドログリア幹細胞（progen
itors）（Nature 303, 390, 1983；図１Ｂ−ｂ）、並び
にＯ４及びＯ１陽性幼若オリゴデンドログリア（Dev. B
iol. 83, 311, 1981；図１Ｂ−ｄ、ｆ）におけるＦｃＲ
γの発現を検出した（ＦｃＲγの発現の検出は、方法３
及び４参照）。その結果ＦｃＲγは、ＯＰＣにおけるｍ
ＲＮＡ及びタンパク質レベルの双方で発現された。培養
Ｏ４陽性幼若オリゴデンドログリアを、ウエスタンブロ
ット分析にかけたが（方法５参照）、ここでもＦｃＲγ
分子が検出された（図１Ｃ）。ＩＴＡＭを介したＦｃＲ
γのＦｙｎへの結合（Blood 15, 4246, 2000）に関連
し、ＯＰＣ及び幼若オリゴデンドログリアにおいてＦｃ
Ｒγが発現されることからは、ＦｃＲγがオリゴデンド
ログリアにおけるミエリン形成に関与していることが示
唆される。
り、Ａ２Ｂ５陽性オリゴデンドログリア幹細胞（progen
itors）（Nature 303, 390, 1983；図１Ｂ−ｂ）、並び
にＯ４及びＯ１陽性幼若オリゴデンドログリア（Dev. B
iol. 83, 311, 1981；図１Ｂ−ｄ、ｆ）におけるＦｃＲ
γの発現を検出した（ＦｃＲγの発現の検出は、方法３
及び４参照）。その結果ＦｃＲγは、ＯＰＣにおけるｍ
ＲＮＡ及びタンパク質レベルの双方で発現された。培養
Ｏ４陽性幼若オリゴデンドログリアを、ウエスタンブロ
ット分析にかけたが（方法５参照）、ここでもＦｃＲγ
分子が検出された（図１Ｃ）。ＩＴＡＭを介したＦｃＲ
γのＦｙｎへの結合（Blood 15, 4246, 2000）に関連
し、ＯＰＣ及び幼若オリゴデンドログリアにおいてＦｃ
Ｒγが発現されることからは、ＦｃＲγがオリゴデンド
ログリアにおけるミエリン形成に関与していることが示
唆される。
【００２２】［インビボでのオリゴデンドログリアにお
けるＦｃＲγの発現］中枢神経系におけるインビボでの
ＦｃＲγの発現を考察するために、種々の日齢での新生
児期マウスの脳に免疫組織化学法を実施した（方法４、
６及び７参照）。出生時（Ｐ０）には、脳室下帯内（脳
室に近接する生殖マトリックスエリア；ＳＶＺ）でＦｃ
Ｒγ陽性細胞が検出された（図２−ａ）。生後４日目
（Ｐ４）では、その発現は白質にまでおよび、脳梁にお
いても検出された（図２−ｂ）。免疫組織化学法によっ
てＭＢＰ及びＭＡＧが検出可能となるＰ７までには、Ｆ
ｃＲγの発現は主に白質に集中するようになる（図２−
ｃ）。染色して観察した分布の拡大状況は、ＳＶＺにお
ける生後のグリア形成パターンと著しく類似しているの
は興味深いことである（Neuron 10, 201, 1993）。
けるＦｃＲγの発現］中枢神経系におけるインビボでの
ＦｃＲγの発現を考察するために、種々の日齢での新生
児期マウスの脳に免疫組織化学法を実施した（方法４、
６及び７参照）。出生時（Ｐ０）には、脳室下帯内（脳
室に近接する生殖マトリックスエリア；ＳＶＺ）でＦｃ
Ｒγ陽性細胞が検出された（図２−ａ）。生後４日目
（Ｐ４）では、その発現は白質にまでおよび、脳梁にお
いても検出された（図２−ｂ）。免疫組織化学法によっ
てＭＢＰ及びＭＡＧが検出可能となるＰ７までには、Ｆ
ｃＲγの発現は主に白質に集中するようになる（図２−
ｃ）。染色して観察した分布の拡大状況は、ＳＶＺにお
ける生後のグリア形成パターンと著しく類似しているの
は興味深いことである（Neuron 10, 201, 1993）。
【００２３】Ｐ０で、側脳室のマウス−ムサシ−１（ｍ
−Ｍｓｉ−１）陽性神経幹細胞層近傍においてもＦｃＲ
γ陽性細胞が観察されたことから（J. Neurosci. 17, 8
300,1997、図２−ｄ，ｅ）、ＦｃＲγ陽性細胞が神経幹
細胞由来であることが示唆される。成熟中枢神経系にお
ける（ＦｃＲγの）分布はＰ７で観察されたものと類似
していた（図２−ｆ）。つまりＦｃＲγは、ＭＡＧの発
現（生後２週目の始め；Neurosci. Lett. 298, 163, 20
01、J. Neurosci. 19, 4948, 1999）に先だって中枢神
経系において発現され、またかかるＦｃＲγ陽性細胞集
団は成熟中枢神経系に留まる。成熟中枢神経系内におけ
るＦｃＲγ陽性細胞集団は、白質の脳室上部エリア及び
側脳室近傍の成熟ＳＶＺにその分布が局在する限定集団
であったのは驚くべきことである（図２−ｆ）。これら
の細胞の存在からは、ＦｃＲγ陽性細胞におけるグリア
形成が成熟期まで続き、一方、生後間もなく形成された
細胞は、この領域内で静止していることが想定される。
−Ｍｓｉ−１）陽性神経幹細胞層近傍においてもＦｃＲ
γ陽性細胞が観察されたことから（J. Neurosci. 17, 8
300,1997、図２−ｄ，ｅ）、ＦｃＲγ陽性細胞が神経幹
細胞由来であることが示唆される。成熟中枢神経系にお
ける（ＦｃＲγの）分布はＰ７で観察されたものと類似
していた（図２−ｆ）。つまりＦｃＲγは、ＭＡＧの発
現（生後２週目の始め；Neurosci. Lett. 298, 163, 20
01、J. Neurosci. 19, 4948, 1999）に先だって中枢神
経系において発現され、またかかるＦｃＲγ陽性細胞集
団は成熟中枢神経系に留まる。成熟中枢神経系内におけ
るＦｃＲγ陽性細胞集団は、白質の脳室上部エリア及び
側脳室近傍の成熟ＳＶＺにその分布が局在する限定集団
であったのは驚くべきことである（図２−ｆ）。これら
の細胞の存在からは、ＦｃＲγ陽性細胞におけるグリア
形成が成熟期まで続き、一方、生後間もなく形成された
細胞は、この領域内で静止していることが想定される。
【００２４】インビボで、上記ＦｃＲγ発現細胞がオリ
ゴデンドログリア系統由来であることを確認するため
に、数種の抗体でＦｃＲγ発現細胞を標識して該細胞を
同定した（方法８参照）。Ｐ０においてＦｃＲγ発現細
胞は、ＧＦＡＰ陽性細胞（アストログリア系統の細胞）
及びＯｘ−４２陽性細胞（Immunology 57, 239, 1986；
ミクログリア系統）のいずれからも区別された（図３
Ａ）。少数のＦｃＲγ発現細胞は、ＳＶＺ内においてＧ
ＦＡＰと若干共染色されたものの、大部分の細胞はＧＦ
ＡＰ陰性だった。ＦｃＲγ発現細胞は、Ｏｘ−４２とは
共標識化せず、Ｐ０におけるＦｃＲγ発現細胞の大部分
は、アストログリア又はミクログリア系統のいずれから
も生じないことが考えられる。これらの細胞はオリゴデ
ンドログリア系統由来であると推定される。Ｐ７におい
て、Ｆｙｎ（図３Ｂ−ａ）及びＭＡＧ（図３Ｂ−ｂ、方
法９参照）と共標識化するＦｃＲγ発現細胞を検出し
た。ＭＡＧは専らオリゴデンドログリアで発現されるこ
とから（J. Comp. Neurol. 284,451, 1989）、ＦｃＲγ
発現細胞はインビボでオリゴデンドログリア系統から発
達するといえる。
ゴデンドログリア系統由来であることを確認するため
に、数種の抗体でＦｃＲγ発現細胞を標識して該細胞を
同定した（方法８参照）。Ｐ０においてＦｃＲγ発現細
胞は、ＧＦＡＰ陽性細胞（アストログリア系統の細胞）
及びＯｘ−４２陽性細胞（Immunology 57, 239, 1986；
ミクログリア系統）のいずれからも区別された（図３
Ａ）。少数のＦｃＲγ発現細胞は、ＳＶＺ内においてＧ
ＦＡＰと若干共染色されたものの、大部分の細胞はＧＦ
ＡＰ陰性だった。ＦｃＲγ発現細胞は、Ｏｘ−４２とは
共標識化せず、Ｐ０におけるＦｃＲγ発現細胞の大部分
は、アストログリア又はミクログリア系統のいずれから
も生じないことが考えられる。これらの細胞はオリゴデ
ンドログリア系統由来であると推定される。Ｐ７におい
て、Ｆｙｎ（図３Ｂ−ａ）及びＭＡＧ（図３Ｂ−ｂ、方
法９参照）と共標識化するＦｃＲγ発現細胞を検出し
た。ＭＡＧは専らオリゴデンドログリアで発現されるこ
とから（J. Comp. Neurol. 284,451, 1989）、ＦｃＲγ
発現細胞はインビボでオリゴデンドログリア系統から発
達するといえる。
【００２５】成熟中枢神経系では、ＦｃＲγ陽性細胞は
白質の限られた部分で観察された（図２−ｆ）。本発明
者らは幼若オリゴデンドログリア形態を示す細胞を、Ｆ
ｃＲγ及びＭＢＰを調べるために染色して観察した結果
（図３Ｃ−ａ）、成熟中枢神経系におけるＦｃＲγ陽性
オリゴデンドログリア細胞の存在が考えられた。生後間
もない脳と比し、ＧＦＡＰ陽性細胞の小サブ集団は、Ｆ
ｃＲγにも陽性を示し、成熟ＳＶＺ内で優勢だった（図
３Ｃ−ｂ）。大部分のＧＦＡＰ陽性細胞は、ＦｃＲγに
対し陰性を示し、このようにＧＦＡＰ及びＦｃＲγのい
ずれにも陽性を示す限られた細胞集団は、成熟中枢神経
系固有のものである。これらの細胞が、神経幹細胞とし
て作用するＳＶＺアストロサイトである可能性について
は、これから考察する必要がある。
白質の限られた部分で観察された（図２−ｆ）。本発明
者らは幼若オリゴデンドログリア形態を示す細胞を、Ｆ
ｃＲγ及びＭＢＰを調べるために染色して観察した結果
（図３Ｃ−ａ）、成熟中枢神経系におけるＦｃＲγ陽性
オリゴデンドログリア細胞の存在が考えられた。生後間
もない脳と比し、ＧＦＡＰ陽性細胞の小サブ集団は、Ｆ
ｃＲγにも陽性を示し、成熟ＳＶＺ内で優勢だった（図
３Ｃ−ｂ）。大部分のＧＦＡＰ陽性細胞は、ＦｃＲγに
対し陰性を示し、このようにＧＦＡＰ及びＦｃＲγのい
ずれにも陽性を示す限られた細胞集団は、成熟中枢神経
系固有のものである。これらの細胞が、神経幹細胞とし
て作用するＳＶＺアストロサイトである可能性について
は、これから考察する必要がある。
【００２６】ＦｃＲγは、オリゴデンドログリア系統に
おいてＭＡＧ発現に先立ち、インビトロ及びインビボの
いずれにおいても発現される。しかし顕微鏡で観察した
ところ、インビボでの前有髄化段階におけるＭＡＧ及び
ＦｃＲγの発現は、オリゴデンドログリアにおいて完全
に共局在するものではなかった。ＭＡＧは細胞突起の端
部を強く染色し、ＦｃＲγは細胞表面を染色する（図３
Ｂ−ｂ）。Ｆｙｎは、主として細胞表面で検出される
が、これは共染色によって確かめたＦｃＲγの発現パタ
ーンに似ている（図３Ｂ−ａ）。前有髄化オリゴデンド
ログリアにおけるＦｙｎのインビボでの局在は、ＭＡＧ
のでなくＦｃＲγの局在と近似している。ＦｃＲγ陽性
細胞は、分析を行ったいずれの日齢においても、ＳＶＺ
及び脳室上部エリアを別として、灰白質又は白質のいず
れかで観察されることは稀だった（図２−ｆ）。観察さ
れた染色分布の拡張（図２−ａ，ｂ，ｃ）及びＳＶＺで
のグリア形成に関する従来の研究（Neuron 10, 201, 19
93）と関連させて上記の観察結果をみると、ＦｃＲγ
は、成熟有髄化細胞においてではなくＯＰＣ及び前有髄
化オリゴデンドログリアにおいて発現されることが考え
られる。
おいてＭＡＧ発現に先立ち、インビトロ及びインビボの
いずれにおいても発現される。しかし顕微鏡で観察した
ところ、インビボでの前有髄化段階におけるＭＡＧ及び
ＦｃＲγの発現は、オリゴデンドログリアにおいて完全
に共局在するものではなかった。ＭＡＧは細胞突起の端
部を強く染色し、ＦｃＲγは細胞表面を染色する（図３
Ｂ−ｂ）。Ｆｙｎは、主として細胞表面で検出される
が、これは共染色によって確かめたＦｃＲγの発現パタ
ーンに似ている（図３Ｂ−ａ）。前有髄化オリゴデンド
ログリアにおけるＦｙｎのインビボでの局在は、ＭＡＧ
のでなくＦｃＲγの局在と近似している。ＦｃＲγ陽性
細胞は、分析を行ったいずれの日齢においても、ＳＶＺ
及び脳室上部エリアを別として、灰白質又は白質のいず
れかで観察されることは稀だった（図２−ｆ）。観察さ
れた染色分布の拡張（図２−ａ，ｂ，ｃ）及びＳＶＺで
のグリア形成に関する従来の研究（Neuron 10, 201, 19
93）と関連させて上記の観察結果をみると、ＦｃＲγ
は、成熟有髄化細胞においてではなくＯＰＣ及び前有髄
化オリゴデンドログリアにおいて発現されることが考え
られる。
【００２７】ＦｃＲγがミエリン形成を最初に誘発する
という推論に基づき（例えばＦｙｎ−ＭＢＰカスケード
の誘発；Neurosci. Lett. 298, 163, 2001）、本発明者
らは、ＦｃＲγの発現が、Ｆｙｎ及びＭＢＰの発現に類
似していると考えた。連続した切片を調べ、Ｐ７の成長
しつつあるミエリン鞘に含まれるＦｃＲγ、Ｆｙｎ、及
びＭＢＰの染色パターンが互いに似ていることを観察し
た（図３Ｄ）。Ｆｙｎは、軸索においても発現された
（Nature 366, 742, 1994）。このように発現パターン
が類似しているとき、それらの分子間には何らかの関係
があると考えられる。この結果は、Ｆｙｎ−ＭＢＰカス
ケードの誘発因子としてのＦｃＲγの役割を明らかにす
るものである。
という推論に基づき（例えばＦｙｎ−ＭＢＰカスケード
の誘発；Neurosci. Lett. 298, 163, 2001）、本発明者
らは、ＦｃＲγの発現が、Ｆｙｎ及びＭＢＰの発現に類
似していると考えた。連続した切片を調べ、Ｐ７の成長
しつつあるミエリン鞘に含まれるＦｃＲγ、Ｆｙｎ、及
びＭＢＰの染色パターンが互いに似ていることを観察し
た（図３Ｄ）。Ｆｙｎは、軸索においても発現された
（Nature 366, 742, 1994）。このように発現パターン
が類似しているとき、それらの分子間には何らかの関係
があると考えられる。この結果は、Ｆｙｎ−ＭＢＰカス
ケードの誘発因子としてのＦｃＲγの役割を明らかにす
るものである。
【００２８】［交差結合ＦｃＲγのＭＢＰ発現の刺激］
抗ＦｃＲγラビットポリクローナル抗体（方法１０参
照）と交差結合させ、ＯＰＣ内にＦｃＲγシグナリング
を人工的に産生し（J. Neurosci. Res. 60, 579,2000、
方法１参照）、ＭＢＰ発現におけるＦｃＲγ刺激の効果
を調べた。２４時間交差結合させた結果、いくつかの突
起を有する培養ＯＰＣは、顕著な形態上の変化をみせ、
その突起はよく発達した（図４Ａ−ｂ）。抗体非存在下
では、このような発達はみられなかった（図４Ａ−
ａ）。ウエスタンブロット分析を行ったところ、対照と
比べＭＢＰ発現は、交差結合による刺激をより強く受け
ていた（図４Ｂ；方法１１参照）。Ｆｙｎに対して行っ
た類似の実験からも、交差結合させたオリゴデンドログ
リアで発現が増加することがわかった（図４Ｂ）。オリ
ゴデンドログリア分化の過程においてＦｙｎは、２倍か
ら３倍に上方調節されるので（J. Cell Biol. 145, 120
9, 1999）、Ｆｙｎ発現の増加及び劇的な形態上の変化
を明らかにした本発明の実験結果からＦｃＲγシグナル
がＯＰＣ分化を誘発することが示唆される。つまりＦｃ
Ｒγシグナルは、ミエリン形成に必要であり、ひいては
オリゴデンドログリアにおけるＭＢＰの発現を刺激し、
さらにＦｙｎ発現を増加させる。
抗ＦｃＲγラビットポリクローナル抗体（方法１０参
照）と交差結合させ、ＯＰＣ内にＦｃＲγシグナリング
を人工的に産生し（J. Neurosci. Res. 60, 579,2000、
方法１参照）、ＭＢＰ発現におけるＦｃＲγ刺激の効果
を調べた。２４時間交差結合させた結果、いくつかの突
起を有する培養ＯＰＣは、顕著な形態上の変化をみせ、
その突起はよく発達した（図４Ａ−ｂ）。抗体非存在下
では、このような発達はみられなかった（図４Ａ−
ａ）。ウエスタンブロット分析を行ったところ、対照と
比べＭＢＰ発現は、交差結合による刺激をより強く受け
ていた（図４Ｂ；方法１１参照）。Ｆｙｎに対して行っ
た類似の実験からも、交差結合させたオリゴデンドログ
リアで発現が増加することがわかった（図４Ｂ）。オリ
ゴデンドログリア分化の過程においてＦｙｎは、２倍か
ら３倍に上方調節されるので（J. Cell Biol. 145, 120
9, 1999）、Ｆｙｎ発現の増加及び劇的な形態上の変化
を明らかにした本発明の実験結果からＦｃＲγシグナル
がＯＰＣ分化を誘発することが示唆される。つまりＦｃ
Ｒγシグナルは、ミエリン形成に必要であり、ひいては
オリゴデンドログリアにおけるＭＢＰの発現を刺激し、
さらにＦｙｎ発現を増加させる。
【００２９】ＭＢＰ発現を刺激することにより、エクソ
ン２含有アイソフォームが著しく上方調節される（図４
Ｂ）。１４．０、１７．０、１８．５、及び２１．５ｋ
Ｄのタンパク質を産生するＭＢＰの主要な４アイソフォ
ームは、ＭＢＰ遺伝子内の７つのエクソンを代わりに用
いることにより作出し得る（Cell 43, 721, 1985）。各
アイソフォームの厳密な役割は、これから解明されなけ
ればならないが、これらのアイソフォームは、細胞内に
おける分布によって２グループに分類できる。１７．０
及び２１．５ｋＤのタンパク質であるエクソン２含有ア
イソフォームは、細胞質全体にわたって分散・分布して
おり、通常これらのアイソフォームは核に蓄積してい
る。他方、残りの１４．０及び１８．５ｋＤタンパク質
のアイソフォーム２種は、主に形質膜にみられ、ミエリ
ン緊密化に作用する（J. Cell Biol. 113, 393, 199
1）。エクソン２含有アイソフォームが核に活性的に輸
送されることからは、かかるアイソフォームが有髄化に
調節機能を示すことが示唆され（Neuron 18, 579, 199
7）、本発明の結果も、かかる可能性を裏付けるもので
ある。ＭＢＰにおけるエクソン２含有アイソフォームの
役割からも、ＦｃＲγがミエリン形成の誘発因子である
との本発明者らの推論が裏付けられる。
ン２含有アイソフォームが著しく上方調節される（図４
Ｂ）。１４．０、１７．０、１８．５、及び２１．５ｋ
Ｄのタンパク質を産生するＭＢＰの主要な４アイソフォ
ームは、ＭＢＰ遺伝子内の７つのエクソンを代わりに用
いることにより作出し得る（Cell 43, 721, 1985）。各
アイソフォームの厳密な役割は、これから解明されなけ
ればならないが、これらのアイソフォームは、細胞内に
おける分布によって２グループに分類できる。１７．０
及び２１．５ｋＤのタンパク質であるエクソン２含有ア
イソフォームは、細胞質全体にわたって分散・分布して
おり、通常これらのアイソフォームは核に蓄積してい
る。他方、残りの１４．０及び１８．５ｋＤタンパク質
のアイソフォーム２種は、主に形質膜にみられ、ミエリ
ン緊密化に作用する（J. Cell Biol. 113, 393, 199
1）。エクソン２含有アイソフォームが核に活性的に輸
送されることからは、かかるアイソフォームが有髄化に
調節機能を示すことが示唆され（Neuron 18, 579, 199
7）、本発明の結果も、かかる可能性を裏付けるもので
ある。ＭＢＰにおけるエクソン２含有アイソフォームの
役割からも、ＦｃＲγがミエリン形成の誘発因子である
との本発明者らの推論が裏付けられる。
【００３０】抗ＦｃＲγ抗体の代わりにマウス免疫グロ
ブリンＧの２ｂアイソフォーム（ＩｇＧ２ｂ）を投与し
ても、エクソン２含有ＭＢＰの発現は同様の増加を示す
ことを見い出した（図４Ｂ）。使用したＩｇＧ２ｂモノ
クローナル抗体は、マウスに元来備わっていないエピト
ープを有していた。フローサイトメトリーにかけたとこ
ろ、この抗体は、いずれのオリゴデンドログリアタンパ
ク質とも反応しなかった（フローサイトメトリーは、方
法１０参照）。従って、エクソン２含有ＭＢＰの発現を
刺激した結果からは、ＩｇＧ２ｂがＩｇＧのＦｃ受容体
（ＦｃγＲｓ；図７Ａ）と相互作用することが考えられ
る。ＩｇＧ２ｂの投与によってＦｙｎ発現が刺激される
かどうかについては観察できなかったが、これは恐らく
刺激プロセスでの抗ＦｃＲγ抗体と比較した場合、Ｉｇ
Ｇ２ｂが間接的投与だったためだと考えられる（図４
Ｂ）。更に本発明者らはＦｃＲγ欠損マウス（Cell 76,
519, 1994）から得られたＯＰＣを刺激した。ＩｇＧ２
ｂを用いて同じ操作をした場合、前記ＯＰＣと野生型Ｏ
ＰＣ間で観察された変化に差は認められなかった（図４
Ｃ）。ＦｃＲγがＯＰＣの差に本質的に関わるシグナル
分子であり、ＩｇＧ２ｂがＦｃγＲを介しＦｃＲγを活
発化の役割を明らかにするものである。
ブリンＧの２ｂアイソフォーム（ＩｇＧ２ｂ）を投与し
ても、エクソン２含有ＭＢＰの発現は同様の増加を示す
ことを見い出した（図４Ｂ）。使用したＩｇＧ２ｂモノ
クローナル抗体は、マウスに元来備わっていないエピト
ープを有していた。フローサイトメトリーにかけたとこ
ろ、この抗体は、いずれのオリゴデンドログリアタンパ
ク質とも反応しなかった（フローサイトメトリーは、方
法１０参照）。従って、エクソン２含有ＭＢＰの発現を
刺激した結果からは、ＩｇＧ２ｂがＩｇＧのＦｃ受容体
（ＦｃγＲｓ；図７Ａ）と相互作用することが考えられ
る。ＩｇＧ２ｂの投与によってＦｙｎ発現が刺激される
かどうかについては観察できなかったが、これは恐らく
刺激プロセスでの抗ＦｃＲγ抗体と比較した場合、Ｉｇ
Ｇ２ｂが間接的投与だったためだと考えられる（図４
Ｂ）。更に本発明者らはＦｃＲγ欠損マウス（Cell 76,
519, 1994）から得られたＯＰＣを刺激した。ＩｇＧ２
ｂを用いて同じ操作をした場合、前記ＯＰＣと野生型Ｏ
ＰＣ間で観察された変化に差は認められなかった（図４
Ｃ）。ＦｃＲγがＯＰＣの差に本質的に関わるシグナル
分子であり、ＩｇＧ２ｂがＦｃγＲを介しＦｃＲγを活
発化の役割を明らかにするものである。
【００３１】［ＦｃＲγ、Ｆｙｎ及びＭＢＰ欠損マウス
の作製］Ｆｙｎ欠損マウスは、文献（Nature 366, 742,
1994）記載の方法によりＦｙｎ遺伝子のエクソンをβ
ガラクトシダーゼ遺伝子に置換して作製した。また、Ｍ
ＢＰ欠損マウスは震顫を起すことで偶然に見つかった、
突然変異により欠損したマウスを用いた。なお、ＦｃＲ
γ欠損マウスは、本発明者らが以前報告した文献（Cel
l, 76, 519-529, 1994）に準じて作製した。具体的に
は、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ法により得ら
れた遺伝子断片を用いて、ＦｃＲγ鎖遺伝子をスクリー
ニングし、スクリーニングされたＦｃＲγ鎖遺伝子を組
換えＤＮＡ技術により、ＦｃＲγ鎖遺伝子をネオマイシ
ン耐性遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシ
ンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子を導入してターゲ
ティングベクターを作製し、この作製されたターゲティ
ングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電
気穿孔）法によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを
行った。その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８に抵抗
性を示すＥＳ細胞を選択し、マウスの胚盤胞中にマイク
ロインジェクションして、かかる胚盤胞を仮親のマウス
に戻し、キメラマウスを作製した。このキメラマウスを
野生型のマウスとインタークロスさせ、ヘテロ接合体マ
ウスを作製し、また、このヘテロ接合体マウスをインタ
ークロスさせてＦｃＲγ鎖ノックアウトマウスを作製し
た。
の作製］Ｆｙｎ欠損マウスは、文献（Nature 366, 742,
1994）記載の方法によりＦｙｎ遺伝子のエクソンをβ
ガラクトシダーゼ遺伝子に置換して作製した。また、Ｍ
ＢＰ欠損マウスは震顫を起すことで偶然に見つかった、
突然変異により欠損したマウスを用いた。なお、ＦｃＲ
γ欠損マウスは、本発明者らが以前報告した文献（Cel
l, 76, 519-529, 1994）に準じて作製した。具体的に
は、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ法により得ら
れた遺伝子断片を用いて、ＦｃＲγ鎖遺伝子をスクリー
ニングし、スクリーニングされたＦｃＲγ鎖遺伝子を組
換えＤＮＡ技術により、ＦｃＲγ鎖遺伝子をネオマイシ
ン耐性遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシ
ンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子を導入してターゲ
ティングベクターを作製し、この作製されたターゲティ
ングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電
気穿孔）法によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを
行った。その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８に抵抗
性を示すＥＳ細胞を選択し、マウスの胚盤胞中にマイク
ロインジェクションして、かかる胚盤胞を仮親のマウス
に戻し、キメラマウスを作製した。このキメラマウスを
野生型のマウスとインタークロスさせ、ヘテロ接合体マ
ウスを作製し、また、このヘテロ接合体マウスをインタ
ークロスさせてＦｃＲγ鎖ノックアウトマウスを作製し
た。
【００３２】［ＦｃＲγ、ＦｙｎとＭＢＰ欠損マウスと
の比較］ＦｃＲγ及びＦｙｎはオリゴデンドログリア内
において共働してＭＢＰの発現を刺激する。ＦｃＲγ
ＩＴＡＭのリン酸化には、Ｓｒｃファミリーチロシンキ
ナーゼ類との相互作用が必要である（Science 263, 113
6, 1994）。Ｓｒｃファミリーメンバーの中でも、中枢
神経系内で発現されるのは５種類だけである（Annu. Re
v. Cell. Dev. Biol. 13, 513, 1997）。その５種類の
中で、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、及びＬｙｎがオリゴデンドログ
リア内で発現される（J. Neurosci. 21, 2039, 200
1）。しかしＳｒｃファミリーの中でミエリン形成に必
要とされるのは、Ｆｙｎだけである（J. Neurosci. 21,
2039, 2001）。Ｆｙｎは、ＦｃＲγのＩＴＡＭリン酸
化に深く関与することがわかっている（Blood 15, 424
6, 2000）。よって、オリゴデンドログリアにおけるＦ
ｃＲγ活性によりＭＢＰ発現は増加するが（図４Ｂ）、
該活性がＩＴＡＭをリン酸化するに際してはＦｙｎ依存
的である（Blood 15, 4246, 2000）。点変異によりＦｙ
ｎチロシンキナーゼ活性を消失させると、Ｆｙｎ非存在
下におけるのと同様な深刻なミエリン欠損が生じ、Ｆｙ
ｎキナーゼ活性がミエリン形成に必須であることが示唆
される（J. Neurosci.21, 2039, 2001）。ＭＢＰ発現が
刺激されるか否かは、主にＦｙｎに依存し（J. Neurosc
i. 19, 1393, 1999）、これはインビトロでの本発明の
結果と合致する（図４Ｂ）。
の比較］ＦｃＲγ及びＦｙｎはオリゴデンドログリア内
において共働してＭＢＰの発現を刺激する。ＦｃＲγ
ＩＴＡＭのリン酸化には、Ｓｒｃファミリーチロシンキ
ナーゼ類との相互作用が必要である（Science 263, 113
6, 1994）。Ｓｒｃファミリーメンバーの中でも、中枢
神経系内で発現されるのは５種類だけである（Annu. Re
v. Cell. Dev. Biol. 13, 513, 1997）。その５種類の
中で、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、及びＬｙｎがオリゴデンドログ
リア内で発現される（J. Neurosci. 21, 2039, 200
1）。しかしＳｒｃファミリーの中でミエリン形成に必
要とされるのは、Ｆｙｎだけである（J. Neurosci. 21,
2039, 2001）。Ｆｙｎは、ＦｃＲγのＩＴＡＭリン酸
化に深く関与することがわかっている（Blood 15, 424
6, 2000）。よって、オリゴデンドログリアにおけるＦ
ｃＲγ活性によりＭＢＰ発現は増加するが（図４Ｂ）、
該活性がＩＴＡＭをリン酸化するに際してはＦｙｎ依存
的である（Blood 15, 4246, 2000）。点変異によりＦｙ
ｎチロシンキナーゼ活性を消失させると、Ｆｙｎ非存在
下におけるのと同様な深刻なミエリン欠損が生じ、Ｆｙ
ｎキナーゼ活性がミエリン形成に必須であることが示唆
される（J. Neurosci.21, 2039, 2001）。ＭＢＰ発現が
刺激されるか否かは、主にＦｙｎに依存し（J. Neurosc
i. 19, 1393, 1999）、これはインビトロでの本発明の
結果と合致する（図４Ｂ）。
【００３３】ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、又はＭＢＰのいずれか
を欠損する変異マウスを用いて、インビボでのＦｃＲγ
−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードをさらに調べた（方法７参
照）。オリゴデンドログリアの増殖が最も盛んになるの
は、生後９日までであり（J.Neurosci. 20, 7698, 200
0）、この時期にオリゴデンドログリアはエクソン２含
有ＭＢＰを顕著に発現させた（J. Cell Biol. 113, 39
3, 1991）。インビトロでの刺激実験から、上記の日齢
（生後９日目まで）における有髄化プログラムを分析す
ることにより、ミエリン形成における欠損を明らかにで
きると考えられた。そこで生後１０日のマウスの脳を分
析して、有髄化の初期段階を調べた。ＦｃＲγ、Ｆｙ
ｎ、及びＭＢＰを欠損するマウスの白質を免疫組織化学
法に従って分析することにより（方法４、６及び７参
照）、同日齢の野生型マウスとそれぞれ比較し、３種類
の変異マウスにおけるミエリン形成が同様に遅延するこ
とがわかった。３種類全ての変異マウスにおけるＭＢＰ
及び／又はＭＡＧの発現が制限されることから（図５
Ａ）、かかる３種の分子がミエリン形成に不可欠である
ことが示唆される。ＦｃＲγ及びＦｙｎ欠損マウスのウ
エスタンブロット分析結果からは、Ｐ１０の新生児期マ
ウス及び成熟マウスにおけるＭＢＰ発現が低下すること
が明らかになった（図５Ｂ；方法１１参照）。上記の観
察結果からＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードが、イ
ンビボでのミエリン形成の初期段階において中心的役割
を果たしていることが考えられる。
を欠損する変異マウスを用いて、インビボでのＦｃＲγ
−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードをさらに調べた（方法７参
照）。オリゴデンドログリアの増殖が最も盛んになるの
は、生後９日までであり（J.Neurosci. 20, 7698, 200
0）、この時期にオリゴデンドログリアはエクソン２含
有ＭＢＰを顕著に発現させた（J. Cell Biol. 113, 39
3, 1991）。インビトロでの刺激実験から、上記の日齢
（生後９日目まで）における有髄化プログラムを分析す
ることにより、ミエリン形成における欠損を明らかにで
きると考えられた。そこで生後１０日のマウスの脳を分
析して、有髄化の初期段階を調べた。ＦｃＲγ、Ｆｙ
ｎ、及びＭＢＰを欠損するマウスの白質を免疫組織化学
法に従って分析することにより（方法４、６及び７参
照）、同日齢の野生型マウスとそれぞれ比較し、３種類
の変異マウスにおけるミエリン形成が同様に遅延するこ
とがわかった。３種類全ての変異マウスにおけるＭＢＰ
及び／又はＭＡＧの発現が制限されることから（図５
Ａ）、かかる３種の分子がミエリン形成に不可欠である
ことが示唆される。ＦｃＲγ及びＦｙｎ欠損マウスのウ
エスタンブロット分析結果からは、Ｐ１０の新生児期マ
ウス及び成熟マウスにおけるＭＢＰ発現が低下すること
が明らかになった（図５Ｂ；方法１１参照）。上記の観
察結果からＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢＰカスケードが、イ
ンビボでのミエリン形成の初期段階において中心的役割
を果たしていることが考えられる。
【００３４】ウエスタンブロット法により得られた結果
をKodak 1D Image Analysis Software, EDAS290 (Ver.
3.5)（Kodak社製）を用いて定量したところ、成熟中枢
神経系中の総ＭＢＰ量が、野生型のＭＢＰ量を１００と
したとき、Ｆｙｎ欠損マウスでは４０．３％、またＦｃ
Ｒγ欠損マウスでは６０．８％までそれぞれ低下したこ
とがわかった。エクソン２含有ＭＢＰの発現量（正味量
２１．５ｋＤ及び１７．０ｋＤ）は残りのアイソフォー
ム２種（１４．０及び１８．５ｋＤ）よりさらに影響を
受け、野生型マウスの発現量との比較で、Ｆｙｎ欠損マ
ウスでは３１．９％、ＦｃＲγ欠損マウスでは４０．０
％にそれぞれ低下した。ＦｃＲγ及びＦｙｎ欠損マウス
で同様のパターンが観察されたことで、上記分子類がミ
エリン形成を調節するシグナルカスケードに関与してい
るという本発明者らの理論が裏付けられた。上記両欠損
マウスにみられるエクソン２含有ＭＢＰ量の顕著な低下
は、本発明者らのインビトロでの結果と同じであり、上
記プロセスにおける前述のアイソフォームの存在が示唆
される（図４）。
をKodak 1D Image Analysis Software, EDAS290 (Ver.
3.5)（Kodak社製）を用いて定量したところ、成熟中枢
神経系中の総ＭＢＰ量が、野生型のＭＢＰ量を１００と
したとき、Ｆｙｎ欠損マウスでは４０．３％、またＦｃ
Ｒγ欠損マウスでは６０．８％までそれぞれ低下したこ
とがわかった。エクソン２含有ＭＢＰの発現量（正味量
２１．５ｋＤ及び１７．０ｋＤ）は残りのアイソフォー
ム２種（１４．０及び１８．５ｋＤ）よりさらに影響を
受け、野生型マウスの発現量との比較で、Ｆｙｎ欠損マ
ウスでは３１．９％、ＦｃＲγ欠損マウスでは４０．０
％にそれぞれ低下した。ＦｃＲγ及びＦｙｎ欠損マウス
で同様のパターンが観察されたことで、上記分子類がミ
エリン形成を調節するシグナルカスケードに関与してい
るという本発明者らの理論が裏付けられた。上記両欠損
マウスにみられるエクソン２含有ＭＢＰ量の顕著な低下
は、本発明者らのインビトロでの結果と同じであり、上
記プロセスにおける前述のアイソフォームの存在が示唆
される（図４）。
【００３５】変異マウスを用いたＰ１０でのＭＡＧ発現
を組織学的に比較したところ、ＭＡＧ陽性幼若オリゴデ
ンドログリアの分布（Neurosci. Lett. 298, 163, 200
1）は、ＦｃＲγ欠損マウスよりＭＢＰ欠損マウスで、
より顕著に低下した（図５Ａ−ｅ，ｆ，ｇ）。Ｆｙｎ欠
損マウスはその中間的な表現型を示した。上記の各種欠
損マウスにおいて、Ｐ１０までに脳梁から大脳皮質に移
動したＭＡＧ陽性幼若オリゴデンドログリアは、野生型
のレベルを１００としたとき、ＦｃＲγ欠損マウスで４
４％、Ｆｙｎ欠損マウスで２５％、またＭＢＰ欠損マウ
スで１２％だった（図５Ｃ：ＭＡＧ陽性幼若オリゴデン
ドログリアの定量は、方法１２参照）。この結果はＭＢ
Ｐ量に正比例しており、ＭＢＰ、特にエクソン２含有ア
イソフォームがミエリン形成に重要であることを示唆し
ている。
を組織学的に比較したところ、ＭＡＧ陽性幼若オリゴデ
ンドログリアの分布（Neurosci. Lett. 298, 163, 200
1）は、ＦｃＲγ欠損マウスよりＭＢＰ欠損マウスで、
より顕著に低下した（図５Ａ−ｅ，ｆ，ｇ）。Ｆｙｎ欠
損マウスはその中間的な表現型を示した。上記の各種欠
損マウスにおいて、Ｐ１０までに脳梁から大脳皮質に移
動したＭＡＧ陽性幼若オリゴデンドログリアは、野生型
のレベルを１００としたとき、ＦｃＲγ欠損マウスで４
４％、Ｆｙｎ欠損マウスで２５％、またＭＢＰ欠損マウ
スで１２％だった（図５Ｃ：ＭＡＧ陽性幼若オリゴデン
ドログリアの定量は、方法１２参照）。この結果はＭＢ
Ｐ量に正比例しており、ＭＢＰ、特にエクソン２含有ア
イソフォームがミエリン形成に重要であることを示唆し
ている。
【００３６】［ＦｃＲγ非存在下での脱髄］種々の日齢
のＦｃＲγ欠損マウスを分析して、ＦｃＲγ非存在下で
の有髄化を調べた。Ｐ１０で観察された有髄化阻害現象
（図５）は、グリア形成がうまくいかなかったことに起
因すると考えられ、この可能性を探るためにオリゴデン
ドログリア系統の最も初期の幹細胞に対するマーカーで
あるＰＤＧＦαＲの発現を調べた（Development 115, 5
35, 1992）。Ｐ１０の白質におけるＦｃＲγと共に染色
したＰＤＧＦαＲ陽性細胞の存在は（図６Ａ−ａ）、Ｆ
ｃＲγがオリゴデンドログリア系統の細胞で発現される
ことを示すものである（図３）。しかし、ＰＤＧＦαＲ
陽性細胞の一画分だけが、ＦｃＲγと共染色していた
（図６Ａ−ａ）。ＦｃＲγ陽性細胞は、ＰＤＧＦαＲ陽
性でもあり（図６Ａ−ａ）、ＰＤＧＦαＲ陽性／ＦｃＲ
γ陰性細胞が中枢神経系に存在する静止グリア前駆体細
胞であるとも考えられる。ＰＤＧＦαＲはまた、本発明
の実験においてグリア形成の状態を調べる際に役立つマ
ーカーとなり得る。有髄化欠損が観察されたＰ１０で
（図５）、ＰＤＧＦαＲ陽性細胞の数又は分布の変化は
観察されなかった（図６Ａ−ｂ，ｃ）。従って、Ｐ１０
で観察された有髄化欠損は（図５）、グリア形成ではな
くミエリン形成が阻害されることに主に起因している。
のＦｃＲγ欠損マウスを分析して、ＦｃＲγ非存在下で
の有髄化を調べた。Ｐ１０で観察された有髄化阻害現象
（図５）は、グリア形成がうまくいかなかったことに起
因すると考えられ、この可能性を探るためにオリゴデン
ドログリア系統の最も初期の幹細胞に対するマーカーで
あるＰＤＧＦαＲの発現を調べた（Development 115, 5
35, 1992）。Ｐ１０の白質におけるＦｃＲγと共に染色
したＰＤＧＦαＲ陽性細胞の存在は（図６Ａ−ａ）、Ｆ
ｃＲγがオリゴデンドログリア系統の細胞で発現される
ことを示すものである（図３）。しかし、ＰＤＧＦαＲ
陽性細胞の一画分だけが、ＦｃＲγと共染色していた
（図６Ａ−ａ）。ＦｃＲγ陽性細胞は、ＰＤＧＦαＲ陽
性でもあり（図６Ａ−ａ）、ＰＤＧＦαＲ陽性／ＦｃＲ
γ陰性細胞が中枢神経系に存在する静止グリア前駆体細
胞であるとも考えられる。ＰＤＧＦαＲはまた、本発明
の実験においてグリア形成の状態を調べる際に役立つマ
ーカーとなり得る。有髄化欠損が観察されたＰ１０で
（図５）、ＰＤＧＦαＲ陽性細胞の数又は分布の変化は
観察されなかった（図６Ａ−ｂ，ｃ）。従って、Ｐ１０
で観察された有髄化欠損は（図５）、グリア形成ではな
くミエリン形成が阻害されることに主に起因している。
【００３７】Ｐ１０でみられた欠損（図５）をその後の
段階で補う系の能力を調べるため、その後の発達段階に
おけるＭＡＧ陽性幼若オリゴデンドログリアの数（Neur
osci. Lett. 298, 163, 2001）を数えたＭＡＧ陽性幼若
オリゴデンドログリアの定量は、方法１２記載の方法に
より行った。変異マウス及び野生型マウスにおけるＭＡ
Ｇ陽性幼若オリゴデンドログリアの数の相違は、その後
の発達段階では有意の差ではなくなった（図６Ｂ−
ａ）。しかしこの時点では、変異体における有髄化はま
だ欠損していた。Ｐ５０に免疫組織化学法で検出したと
ころ、後の発達段階においても一般的に有髄化が欠損す
ることを反映し、ＭＢＰに加え、ミエリンの主要タンパ
ク質成分であるプロテオリピッドタンパク質（ＰＬＰ）
の発現も野生型に比し変異マウスで大きく低下すること
がわかった（図６Ｂ−ｂ，ｃ）。Ｐ６７の脳梁を電子顕
微鏡（方法５７参照）で観察すると、甚だしく低有髄化
された軸策が後部領域でみられた（図６Ｃ−ａ，ｂ）。
かかる脳梁の前部領域においても軸策が著しく腫張して
いたことは驚くべきことである（図６Ｃ−ｃ，ｄ）。ミ
エリン欠損は、特にＰＬＰ減少時においては、軸策腫脹
を引き起こした（Science 280, 1610, 1998）。上記の
電子顕微鏡による観察結果からは、ＦｃＲγ非存在下で
ミエリン欠損が極めて一般的に認められることが示唆さ
れる。変異体マウスにおける有髄化でみられた欠損に
は、単に有髄化の遅延だけではなく、その後の発達段階
を通して低有髄化が一般化されることも含まれる。
段階で補う系の能力を調べるため、その後の発達段階に
おけるＭＡＧ陽性幼若オリゴデンドログリアの数（Neur
osci. Lett. 298, 163, 2001）を数えたＭＡＧ陽性幼若
オリゴデンドログリアの定量は、方法１２記載の方法に
より行った。変異マウス及び野生型マウスにおけるＭＡ
Ｇ陽性幼若オリゴデンドログリアの数の相違は、その後
の発達段階では有意の差ではなくなった（図６Ｂ−
ａ）。しかしこの時点では、変異体における有髄化はま
だ欠損していた。Ｐ５０に免疫組織化学法で検出したと
ころ、後の発達段階においても一般的に有髄化が欠損す
ることを反映し、ＭＢＰに加え、ミエリンの主要タンパ
ク質成分であるプロテオリピッドタンパク質（ＰＬＰ）
の発現も野生型に比し変異マウスで大きく低下すること
がわかった（図６Ｂ−ｂ，ｃ）。Ｐ６７の脳梁を電子顕
微鏡（方法５７参照）で観察すると、甚だしく低有髄化
された軸策が後部領域でみられた（図６Ｃ−ａ，ｂ）。
かかる脳梁の前部領域においても軸策が著しく腫張して
いたことは驚くべきことである（図６Ｃ−ｃ，ｄ）。ミ
エリン欠損は、特にＰＬＰ減少時においては、軸策腫脹
を引き起こした（Science 280, 1610, 1998）。上記の
電子顕微鏡による観察結果からは、ＦｃＲγ非存在下で
ミエリン欠損が極めて一般的に認められることが示唆さ
れる。変異体マウスにおける有髄化でみられた欠損に
は、単に有髄化の遅延だけではなく、その後の発達段階
を通して低有髄化が一般化されることも含まれる。
【００３８】上記の観察結果により、ＦｃＲγがグリア
形成にではなくミエリン形成に必要であることが考えら
れ、ＦｃＲγがインビトロ及びインビボいずれにおいて
もミエリン形成を誘発するという本発明の理論が支持さ
れる。
形成にではなくミエリン形成に必要であることが考えら
れ、ＦｃＲγがインビトロ及びインビボいずれにおいて
もミエリン形成を誘発するという本発明の理論が支持さ
れる。
【００３９】［ＦｃＲγと共発現されるＦｃγＲｓ］い
くつかの免疫受容体がＦｃＲγを共有しており（Immuno
l. Res. 22, 21, 2000）、ミエリン形成の分子機構を理
解する上で、オリゴデンドログリアにおいてＦｃＲγ活
性に関与している受容体を解明することが重要である。
ＦｃＲγ欠損マウスでは、細胞表面において、ＩｇＥ
Ｆｃ受容体（ＦｃεＲＩ）及びＩｇＧＦｃ受容体（Ｆｃ
γＲＩ／III）いずれのα鎖（例えばリガンド結合サブ
ユニット）も発現されない（Cell 76, 519, 1994）。変
異体においてミエリン形成が阻害される理由としては、
ＦｃＲγ及び上記α鎖の両方を欠失していることが考え
られる。野生型マウスの幼若オリゴデンドログリアをＲ
Ｔ−ＰＣＲにかけたところ（方法２参照）、ＦｃεＲＩ
のα鎖は検出されなかった。一方、ＦｃγＲＩ及びＦｃ
γＲIIIのα鎖は容易に検出された（図７Ａ）。フロー
サイトメトリーにより、これらの発現パターンを確認し
た。従って、ＩｇＧには特異的だがＩｇＥは認識しない
Ｆｃ受容体が、ミエリン形成に関与していることが考え
られる。
くつかの免疫受容体がＦｃＲγを共有しており（Immuno
l. Res. 22, 21, 2000）、ミエリン形成の分子機構を理
解する上で、オリゴデンドログリアにおいてＦｃＲγ活
性に関与している受容体を解明することが重要である。
ＦｃＲγ欠損マウスでは、細胞表面において、ＩｇＥ
Ｆｃ受容体（ＦｃεＲＩ）及びＩｇＧＦｃ受容体（Ｆｃ
γＲＩ／III）いずれのα鎖（例えばリガンド結合サブ
ユニット）も発現されない（Cell 76, 519, 1994）。変
異体においてミエリン形成が阻害される理由としては、
ＦｃＲγ及び上記α鎖の両方を欠失していることが考え
られる。野生型マウスの幼若オリゴデンドログリアをＲ
Ｔ−ＰＣＲにかけたところ（方法２参照）、ＦｃεＲＩ
のα鎖は検出されなかった。一方、ＦｃγＲＩ及びＦｃ
γＲIIIのα鎖は容易に検出された（図７Ａ）。フロー
サイトメトリーにより、これらの発現パターンを確認し
た。従って、ＩｇＧには特異的だがＩｇＥは認識しない
Ｆｃ受容体が、ミエリン形成に関与していることが考え
られる。
【００４０】しかし、ＦｃＲγを共有するこれ以外のオ
リゴデンドログリア特異的受容体（１又は２以上）が関
与している可能性も排除できない。受容体型に関わら
ず、ＦｃＲγの交差結合がＭＢＰ発現を刺激することが
インビトロでの実験で明らかになった（図４）。ミエリ
ン形成過程におけるＩｇＧとＦｃγＲＩ／IIIとの共発
現が、ＭＢＰ発現を刺激することを上記の事実は示唆し
ている。新生児ＦｃＲ（ＦｃＲｎ；N. E. Simister, in
Immunoglobulin Receptors and Their Physiological
and Pathological Roles in Immunity, J. G. J. van d
e Winkel, P. M.Hogarth, Eds. (Kluwer Academic Publ
ishers. Netherland. 1998), PP. 63-71.）を介して転
移する新生児期マウスの母系ＩｇＧが存在すること、ま
た免疫系においてＩｇＧ分泌細胞が早くもＰ７で存在す
る（Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 5185, 1992）ことか
ら上記の結論が支持される。ＩｇＧ２ｂを用いてインビ
トロでの刺激実験を行ったところ、ＭＢＰレベルが増加
したことも（図４）、本発明の仮説との一致を示してい
る。
リゴデンドログリア特異的受容体（１又は２以上）が関
与している可能性も排除できない。受容体型に関わら
ず、ＦｃＲγの交差結合がＭＢＰ発現を刺激することが
インビトロでの実験で明らかになった（図４）。ミエリ
ン形成過程におけるＩｇＧとＦｃγＲＩ／IIIとの共発
現が、ＭＢＰ発現を刺激することを上記の事実は示唆し
ている。新生児ＦｃＲ（ＦｃＲｎ；N. E. Simister, in
Immunoglobulin Receptors and Their Physiological
and Pathological Roles in Immunity, J. G. J. van d
e Winkel, P. M.Hogarth, Eds. (Kluwer Academic Publ
ishers. Netherland. 1998), PP. 63-71.）を介して転
移する新生児期マウスの母系ＩｇＧが存在すること、ま
た免疫系においてＩｇＧ分泌細胞が早くもＰ７で存在す
る（Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 5185, 1992）ことか
ら上記の結論が支持される。ＩｇＧ２ｂを用いてインビ
トロでの刺激実験を行ったところ、ＭＢＰレベルが増加
したことも（図４）、本発明の仮説との一致を示してい
る。
【００４１】［ミエリン形成機構］上記実験例から、本
発明者らが想定したミエリン形成機構を説明するモデル
を図８に示した。ＦｃＲγは、オリゴデンドログリア系
統の細胞内においてインビトロ及びインビボいずれにお
いても発現された（図１〜３）。そこで本発明者らは、
ＦｃＲγがＦｙｎと機能的に共働して（Blood 15, 424
6, 2000）、形態分化を誘導し、またＭＢＰ発現、特に
エクソン２含有アイソフォーム発現の増加を誘導するこ
とにより、ミエリン形成を誘発していると考えた（図
４）。オリゴデンドログリアにおけるグリア形成が有意
の変化を示さないのに、ＦｃＲγ欠損マウスがミエリン
形成において重大な欠損を示すことから、この推論はイ
ンビボで確認された。
発明者らが想定したミエリン形成機構を説明するモデル
を図８に示した。ＦｃＲγは、オリゴデンドログリア系
統の細胞内においてインビトロ及びインビボいずれにお
いても発現された（図１〜３）。そこで本発明者らは、
ＦｃＲγがＦｙｎと機能的に共働して（Blood 15, 424
6, 2000）、形態分化を誘導し、またＭＢＰ発現、特に
エクソン２含有アイソフォーム発現の増加を誘導するこ
とにより、ミエリン形成を誘発していると考えた（図
４）。オリゴデンドログリアにおけるグリア形成が有意
の変化を示さないのに、ＦｃＲγ欠損マウスがミエリン
形成において重大な欠損を示すことから、この推論はイ
ンビボで確認された。
【００４２】かかる変異マウスにおいてはまたＭＢＰ発
現も低下し、エクソン２含有アイソフォームの発現も著
しく損なわれた（図５）。ＩｇＧ特異的でＩｇＥ非特異
的なＦｃ受容体の発現（図７Ａ）からは、オリゴデンド
ログリア上でＦｃ受容体を活性化させる細胞外誘発分子
としてのＩｇＧの役割が示唆される。インビトロにおい
てＯＰＣをＩｇＧ２ｂで刺激すると、ＭＢＰ発現が増加
した（図４）。またミエリン形成の初期段階のオリゴデ
ンドログリアにおいてＣＤ４５が、Ｆｙｎ及びＦｃＲγ
と共発現されることから（図７Ｂ）、ミエリン形成に必
須のＦｙｎの活性をＣＤ４５が調節している可能性が考
えられる。ＣＤ４５における変化が、ＭＳ発症に関与し
ている事例が既に報告されている（Nat. Genet. 26, 49
5, 2000）。
現も低下し、エクソン２含有アイソフォームの発現も著
しく損なわれた（図５）。ＩｇＧ特異的でＩｇＥ非特異
的なＦｃ受容体の発現（図７Ａ）からは、オリゴデンド
ログリア上でＦｃ受容体を活性化させる細胞外誘発分子
としてのＩｇＧの役割が示唆される。インビトロにおい
てＯＰＣをＩｇＧ２ｂで刺激すると、ＭＢＰ発現が増加
した（図４）。またミエリン形成の初期段階のオリゴデ
ンドログリアにおいてＣＤ４５が、Ｆｙｎ及びＦｃＲγ
と共発現されることから（図７Ｂ）、ミエリン形成に必
須のＦｙｎの活性をＣＤ４５が調節している可能性が考
えられる。ＣＤ４５における変化が、ＭＳ発症に関与し
ている事例が既に報告されている（Nat. Genet. 26, 49
5, 2000）。
【００４３】ＩｇＧ２ｂは、インビトロでＭＢＰの発現
を刺激する（図４）。ミエリン形成を誘発するＩｇＧの
生理学的機能を補うため、ＩｇＧはミエリン形成に先立
って存在していることが期待される。新生時期マウスの
母系由来ＩｇＧ（N. E. Simister, in Immunoglobulin
Receptors and Their Physiological and Pathological
Roles in Immunity, J. G. J. van de Winkel, P. M.
Hogarth, Eds. (Kluwer Academic Publishers. Netherl
and. 1998), PP. 63-71.）の他に、ＩｇＧ分泌細胞が、
Ｐ７の胸腺及び脾臓から検出された。これらの分泌細胞
は、この時期急速に増殖する（Proc. Natl. Acad. Sci.
89, 5185, 1992）。オリゴデンドログリアにおけるＦ
ｃを介したＩｇＧシグナリングによりミエリン形成が開
始されることから、脱髄疾患に対する静脈内免疫グロブ
リン療法（ＩＶＩｇ）の有効性が考えられる。ＩＶＩｇ
の高量投与による治療は、脱髄疾患の患者に対する治療
法として非常に有効である（Arch. Neurol. 56, 661, 1
999）。ＩＶＩｇをＭＳに用いると再発率が減少する（L
ancet 349, 589, 1997）。しかしこの療法の機構は、未
だ解明されていない。
を刺激する（図４）。ミエリン形成を誘発するＩｇＧの
生理学的機能を補うため、ＩｇＧはミエリン形成に先立
って存在していることが期待される。新生時期マウスの
母系由来ＩｇＧ（N. E. Simister, in Immunoglobulin
Receptors and Their Physiological and Pathological
Roles in Immunity, J. G. J. van de Winkel, P. M.
Hogarth, Eds. (Kluwer Academic Publishers. Netherl
and. 1998), PP. 63-71.）の他に、ＩｇＧ分泌細胞が、
Ｐ７の胸腺及び脾臓から検出された。これらの分泌細胞
は、この時期急速に増殖する（Proc. Natl. Acad. Sci.
89, 5185, 1992）。オリゴデンドログリアにおけるＦ
ｃを介したＩｇＧシグナリングによりミエリン形成が開
始されることから、脱髄疾患に対する静脈内免疫グロブ
リン療法（ＩＶＩｇ）の有効性が考えられる。ＩＶＩｇ
の高量投与による治療は、脱髄疾患の患者に対する治療
法として非常に有効である（Arch. Neurol. 56, 661, 1
999）。ＩＶＩｇをＭＳに用いると再発率が減少する（L
ancet 349, 589, 1997）。しかしこの療法の機構は、未
だ解明されていない。
【００４４】動物モデルを使った実験では、Theilerウ
イルスに感染させて脱髄を惹起させた後、免疫グロブリ
ンが中枢神経系における再有髄化を促進した（Ann. Neu
rol.27, 12, 1990）。免疫グロブリンの再有髄化促進能
は、分子のＦｃ部位によって仲介されるが、Ｆ（ａ
ｂ’）2断片は、かかる効果を実験動物モデルで誘導し
得なかった（J. Neuroimmunol. 78, 127, 1997）。以上
の発見から、免疫グロブリンのＦｃ部位を介し、ＩＶＩ
ｇによる再有髄化が強化され、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢ
Ｐカスケードがオリゴデンドログリア内で活性化される
と考えられる。ＭＳにより生じる障害は、ＦｃγＲ類の
多型性に影響され、ＩｇＧに対し高度な親和性を示すＦ
ｃγＲｓを有するＭＳ患者に対する治療は、より良好な
結果を生み出す（Neurology 52, 1771, 1999）。
イルスに感染させて脱髄を惹起させた後、免疫グロブリ
ンが中枢神経系における再有髄化を促進した（Ann. Neu
rol.27, 12, 1990）。免疫グロブリンの再有髄化促進能
は、分子のＦｃ部位によって仲介されるが、Ｆ（ａ
ｂ’）2断片は、かかる効果を実験動物モデルで誘導し
得なかった（J. Neuroimmunol. 78, 127, 1997）。以上
の発見から、免疫グロブリンのＦｃ部位を介し、ＩＶＩ
ｇによる再有髄化が強化され、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ−ＭＢ
Ｐカスケードがオリゴデンドログリア内で活性化される
と考えられる。ＭＳにより生じる障害は、ＦｃγＲ類の
多型性に影響され、ＩｇＧに対し高度な親和性を示すＦ
ｃγＲｓを有するＭＳ患者に対する治療は、より良好な
結果を生み出す（Neurology 52, 1771, 1999）。
【００４５】ＩｇＧと相互作用する独特な阻害Ｆｃ受容
体であるIIＢ型ＦｃγＲ（ＦｃγＲIIＢ）（Annu. Rev.
Immunol. 15, 203-234, 1997）は、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ
−ＭＢＰカスケードをネガティブに調節し、ポリクロー
ナルＩＶＩｇがもつミエリン形成に対する刺激能を消失
させる。ＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーのいず
れからも培養オリゴデンドログリアからＦｃγＲIIＢが
検出された。しかしＦｃγＲｓの想定されるリガンドが
免疫グロブリンではない可能性は排除できない。一方、
ミエリン形成におけるＦｃＲγ自体の刺激機能は、抗体
交差結合により明らかになり（図４）、再有髄化を直接
強化する上記の機構が、今後実用に供される可能性を示
唆している。
体であるIIＢ型ＦｃγＲ（ＦｃγＲIIＢ）（Annu. Rev.
Immunol. 15, 203-234, 1997）は、ＦｃＲγ−Ｆｙｎ
−ＭＢＰカスケードをネガティブに調節し、ポリクロー
ナルＩＶＩｇがもつミエリン形成に対する刺激能を消失
させる。ＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーのいず
れからも培養オリゴデンドログリアからＦｃγＲIIＢが
検出された。しかしＦｃγＲｓの想定されるリガンドが
免疫グロブリンではない可能性は排除できない。一方、
ミエリン形成におけるＦｃＲγ自体の刺激機能は、抗体
交差結合により明らかになり（図４）、再有髄化を直接
強化する上記の機構が、今後実用に供される可能性を示
唆している。
【００４６】エクソン２含有ＭＢＰの発現が、再有髄化
がある程度進行したＭＳ病巣から検出された（Annu. Ne
urol. 41, 797, 1997）。ＦｃＲγの交差結合の結果、
エクソン２含有ＭＢＰ発現量が増加し、また劇的な多型
性分化が生じる（図４）。上述したように、慢性ＭＳ病
巣においてみられる豊富ではあるが静止状態にある幼若
オリゴデンドログリア集団に関連して（J. Neurosci. 1
8, 601, 1998）、ミエリン形成開始機構に関する研究を
本発明者らが大きく進展させたことにより、今後、ＭＳ
及び他の脱髄疾患の治療及び予防に関する治療上のスト
ラテジーが大いに進化することが期待される。
がある程度進行したＭＳ病巣から検出された（Annu. Ne
urol. 41, 797, 1997）。ＦｃＲγの交差結合の結果、
エクソン２含有ＭＢＰ発現量が増加し、また劇的な多型
性分化が生じる（図４）。上述したように、慢性ＭＳ病
巣においてみられる豊富ではあるが静止状態にある幼若
オリゴデンドログリア集団に関連して（J. Neurosci. 1
8, 601, 1998）、ミエリン形成開始機構に関する研究を
本発明者らが大きく進展させたことにより、今後、ＭＳ
及び他の脱髄疾患の治療及び予防に関する治療上のスト
ラテジーが大いに進化することが期待される。
【００４７】［本発明の実施例で用いた実験方法］
（方法１）１７日目の胚から誘導された、マウスオリゴ
デンドログリア前駆体細胞に対して、ラットオリゴデン
ドログリア前駆体細胞に対する培養条件を詳細にしたＩ
ｔｏｈの方法（J. Neurosci. Res. 60, 579, 2000）を
適用した。培養細胞の約９０％は、決まってＯＰＣ系統
特異的マーカー、Ａ２Ｂ５（J. Neurosci. Res. 62, 52
1, 2000）に対して陽性であった。 （方法２）培養したＯＰＣから、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（GI
BCO BRL）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、
２０μｌのＴＥに再懸濁した。各々の試料について、一
本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Boehringer Mannheim）を用
いて、１μｌのＲＮＡを逆転写し、最終容量２０μｌを
得た。標準化のために、平行して、マウスβ−アクチン
を増幅した。マウスＦｃＲγ、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩ
α、ＦｃγＲＩα及びβ−アクチンの増幅のためのアニ
ーリングは５２℃で行った。ＦｃγＲIIIα及びＦｃγ
ＲIIBの増幅のためにのアニーリングは５３℃で行っ
た。ｃＤＮＡ試料は、３５サイクル行って増幅した（９
４℃で３０秒間熱変性、３０秒間アニーリング、７２℃
で３０秒間伸長反応＝１サイクル）。なお、ＰＣＲの際
に用いたプライマーを以下に示す。ＦｃＲγのプライマ
ーとしては、センスプライマー5'-ctcaagatccaggtccga-
3'（配列番号１）とアンチセンスプライマー5'-ctactgg
ggtggtttttcat-3'（配列番号２）を、ＣＤ３ζのプライ
マーとしては、センスプライマー5'-aggcacagagctttggt
ct-3'（配列番号３）とアンチセンスプライマー5'-ctgg
taaaggccatcgtgc-3'（配列番号４）を、ＦｃεＲＩαの
プライマーとしては、センスプライマー5'-aaatgaactct
actactaaa-3'（配列番号５）とアンチセンスプライマー
5'-cttttactacagcaattctgaa-3'（配列番号６）を、Ｆｃ
γＲＩαのプライマーとしては、センスプライマー5'-g
aacagccgttcagatct-3'（配列番号７）とアンチセンスプ
ライマー5'-ttcgtctcacagttcagg-3'（配列番号８）を、
ＦｃγＲIIIαのプライマーとしては、センスプライマ
ー5'-ctaaggtgccatagctgcagg-3'（配列番号９）とアン
チセンスプライマー5'-ctgattgacagggacttcctc-3'（配
列番号１０）を、ＦｃγＲIIＢのプライマーとしては、
センスプライマー5'-gtgaggtatcatcactacagt-3'（配列
番号１１）とアンチセンスプライマー5'-ggttctggtaatc
atgctctg-3'（配列番号１２）を、β−アクチンのプラ
イマーとしては、センスプライマー5'-tggtcgtcgacaacg
gct-3'（配列番号１３）とアンチセンスプライマー5'-t
ttacggatgtcaacgtcac-3'（配列番号１４）を、それぞれ
用いた。ＰＣＲ生成物の適量を、アガロースゲル電気泳
動分析にかけ、β−アクチンバンドの強さにより標準化
した。 （方法３）培養したＯＰＣ及び幼若オリゴデンドログリ
アを、室温で１５分間、ＰＬＰで固定した後、第一の抗
体でインキュベーションした（４℃で一夜）。続いて第
二の抗体で染色した後（室温で、１．５時間）、細胞を
共染色に用いられる他のセットの抗体で染色し、同じプ
ロトコルを継続した。
デンドログリア前駆体細胞に対して、ラットオリゴデン
ドログリア前駆体細胞に対する培養条件を詳細にしたＩ
ｔｏｈの方法（J. Neurosci. Res. 60, 579, 2000）を
適用した。培養細胞の約９０％は、決まってＯＰＣ系統
特異的マーカー、Ａ２Ｂ５（J. Neurosci. Res. 62, 52
1, 2000）に対して陽性であった。 （方法２）培養したＯＰＣから、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（GI
BCO BRL）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、
２０μｌのＴＥに再懸濁した。各々の試料について、一
本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Boehringer Mannheim）を用
いて、１μｌのＲＮＡを逆転写し、最終容量２０μｌを
得た。標準化のために、平行して、マウスβ−アクチン
を増幅した。マウスＦｃＲγ、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩ
α、ＦｃγＲＩα及びβ−アクチンの増幅のためのアニ
ーリングは５２℃で行った。ＦｃγＲIIIα及びＦｃγ
ＲIIBの増幅のためにのアニーリングは５３℃で行っ
た。ｃＤＮＡ試料は、３５サイクル行って増幅した（９
４℃で３０秒間熱変性、３０秒間アニーリング、７２℃
で３０秒間伸長反応＝１サイクル）。なお、ＰＣＲの際
に用いたプライマーを以下に示す。ＦｃＲγのプライマ
ーとしては、センスプライマー5'-ctcaagatccaggtccga-
3'（配列番号１）とアンチセンスプライマー5'-ctactgg
ggtggtttttcat-3'（配列番号２）を、ＣＤ３ζのプライ
マーとしては、センスプライマー5'-aggcacagagctttggt
ct-3'（配列番号３）とアンチセンスプライマー5'-ctgg
taaaggccatcgtgc-3'（配列番号４）を、ＦｃεＲＩαの
プライマーとしては、センスプライマー5'-aaatgaactct
actactaaa-3'（配列番号５）とアンチセンスプライマー
5'-cttttactacagcaattctgaa-3'（配列番号６）を、Ｆｃ
γＲＩαのプライマーとしては、センスプライマー5'-g
aacagccgttcagatct-3'（配列番号７）とアンチセンスプ
ライマー5'-ttcgtctcacagttcagg-3'（配列番号８）を、
ＦｃγＲIIIαのプライマーとしては、センスプライマ
ー5'-ctaaggtgccatagctgcagg-3'（配列番号９）とアン
チセンスプライマー5'-ctgattgacagggacttcctc-3'（配
列番号１０）を、ＦｃγＲIIＢのプライマーとしては、
センスプライマー5'-gtgaggtatcatcactacagt-3'（配列
番号１１）とアンチセンスプライマー5'-ggttctggtaatc
atgctctg-3'（配列番号１２）を、β−アクチンのプラ
イマーとしては、センスプライマー5'-tggtcgtcgacaacg
gct-3'（配列番号１３）とアンチセンスプライマー5'-t
ttacggatgtcaacgtcac-3'（配列番号１４）を、それぞれ
用いた。ＰＣＲ生成物の適量を、アガロースゲル電気泳
動分析にかけ、β−アクチンバンドの強さにより標準化
した。 （方法３）培養したＯＰＣ及び幼若オリゴデンドログリ
アを、室温で１５分間、ＰＬＰで固定した後、第一の抗
体でインキュベーションした（４℃で一夜）。続いて第
二の抗体で染色した後（室温で、１．５時間）、細胞を
共染色に用いられる他のセットの抗体で染色し、同じプ
ロトコルを継続した。
【００４８】（方法４）この研究に次に記述する抗体を
用いた。マウスモノクロナール抗体Ｏ１及びＯ４（Dev.
Biol. 83, 311, 1981）、マウスモノクロナール抗体Ａ
２Ｂ５（Nature303, 390, 1983）、ウサギポリクロナー
ル抗体 抗−ＦｃＲγ（Cell 76, 519,1994）、ウサギ
ポリクロナール抗体 抗−ＭＢＰ（Nichirei）、ウサギ
ポリクロナール抗体 抗−ＭＡＧ（Ｄｒ．Ｙ．Matsud
a、（National Center for Neurology and Psychi
atry、Japan）の好意による）、ウサギポリクロナール
抗体 抗−ＧＦＡＰ（DAKO）、マウスモノクロナール抗
体 Ｏｘ−４２（Immunology 57, 239, 1986）、ウサギ
ポリクロナール抗体 ＰＬＰ（Sigma）、ウサギポリク
ロナール抗体 抗−ＰＤＧＦαＲ（ＵＢＩ）、ラットモ
ノクロナール抗体抗−ｍ−Ｍｓｉ−１（Prof.H.Okano、
（Dept.of Physiology、Keio UniversitySchool of Med
icine、Japan）の好意による）、及びラットモノクロナ
ール抗体抗−ＣＤ４５（クローン：３０−Ｆ１１）。免
疫組織化学に対して，ＨＲＰ−複合抗−ウサギ−ＩｇＧ
抗体（ＭＢＬ）、ＨＲＰ−複合抗−マウス−ＩｇＧ抗体
（ＭＢＬ）、及びビオチン−複合抗−ラット−ＩｇＧ抗
体（ＤＡＫＯ）を、第二の抗体ＨＲＰ−複合ストレプト
アビジン（streputoavidin）（Nichirei）と一緒に用い
た。免疫細胞化学に対して、ローダミン−複合抗−マウ
スＩｇＭ抗体（EY Labo.Inc.）、及びフルオレセイン
−複合抗―ウサギＩｇＧ抗体を用いた。 （方法５）Ｏ４−陽性幼若オリゴデンドログリアを培養
するために、新生マウスの脳を切開し、分離培地を準備
した（J. Cell Biol. 85, 890, 1980）。１０日間培養
した後、アストロサイト単層に付着したオリゴデンドロ
グリアを、軌道震盪により物理的に分離し、回収した。
回収した細胞の内、９５％以上がＯ４に対し陽性だっ
た。アストロサイトに富んだ残存細胞層を、トリプシン
／ＥＤＴＡを用い分離した。回収した細胞のイムノブロ
ット分析を行った。オリゴデンドログリアに富んだ画分
を、磁気ソーティング（Miltenyi社製）、及びＯ４抗体
によりさらに精製し、フローサイトメトリーにかけた。
用いた。マウスモノクロナール抗体Ｏ１及びＯ４（Dev.
Biol. 83, 311, 1981）、マウスモノクロナール抗体Ａ
２Ｂ５（Nature303, 390, 1983）、ウサギポリクロナー
ル抗体 抗−ＦｃＲγ（Cell 76, 519,1994）、ウサギ
ポリクロナール抗体 抗−ＭＢＰ（Nichirei）、ウサギ
ポリクロナール抗体 抗−ＭＡＧ（Ｄｒ．Ｙ．Matsud
a、（National Center for Neurology and Psychi
atry、Japan）の好意による）、ウサギポリクロナール
抗体 抗−ＧＦＡＰ（DAKO）、マウスモノクロナール抗
体 Ｏｘ−４２（Immunology 57, 239, 1986）、ウサギ
ポリクロナール抗体 ＰＬＰ（Sigma）、ウサギポリク
ロナール抗体 抗−ＰＤＧＦαＲ（ＵＢＩ）、ラットモ
ノクロナール抗体抗−ｍ−Ｍｓｉ−１（Prof.H.Okano、
（Dept.of Physiology、Keio UniversitySchool of Med
icine、Japan）の好意による）、及びラットモノクロナ
ール抗体抗−ＣＤ４５（クローン：３０−Ｆ１１）。免
疫組織化学に対して，ＨＲＰ−複合抗−ウサギ−ＩｇＧ
抗体（ＭＢＬ）、ＨＲＰ−複合抗−マウス−ＩｇＧ抗体
（ＭＢＬ）、及びビオチン−複合抗−ラット−ＩｇＧ抗
体（ＤＡＫＯ）を、第二の抗体ＨＲＰ−複合ストレプト
アビジン（streputoavidin）（Nichirei）と一緒に用い
た。免疫細胞化学に対して、ローダミン−複合抗−マウ
スＩｇＭ抗体（EY Labo.Inc.）、及びフルオレセイン
−複合抗―ウサギＩｇＧ抗体を用いた。 （方法５）Ｏ４−陽性幼若オリゴデンドログリアを培養
するために、新生マウスの脳を切開し、分離培地を準備
した（J. Cell Biol. 85, 890, 1980）。１０日間培養
した後、アストロサイト単層に付着したオリゴデンドロ
グリアを、軌道震盪により物理的に分離し、回収した。
回収した細胞の内、９５％以上がＯ４に対し陽性だっ
た。アストロサイトに富んだ残存細胞層を、トリプシン
／ＥＤＴＡを用い分離した。回収した細胞のイムノブロ
ット分析を行った。オリゴデンドログリアに富んだ画分
を、磁気ソーティング（Miltenyi社製）、及びＯ４抗体
によりさらに精製し、フローサイトメトリーにかけた。
【００４９】（方法６）酸−アルコール溶液（９５％エ
タノール、５％酢酸；vol％）中で、脳を一晩固定化し
た。標準的なプロトコール（１００％エタノール、メチ
ルベンゾアート、キシレン、キシレン−パラフィン、及
びパラフィン溶液にそれぞれ１〜２時間）に従い、固定
化した脳をパラフィン化（paraffination）した。次
に、この試料をパラフィンに包埋した。包埋した脳を、
ミクロトームで１０μｍ厚さの切片に切り分けた。標準
的なプロトコールに従い、これらの切片を脱パラフィン
化した（キシレン、１００％エタノール、９０％エタノ
ール、７０％エタノール、及びＰＢＳ）。細胞内におけ
るペルオキシダーゼ活性を、３％Ｈ2Ｏ2により室温で１
０分間消失（quenched）させた。ＰＢＳでもう一回洗浄
した後、上記切片を一次抗体共存下で、使用する抗体に
より４℃で一晩或いは３７℃で２時間インキュベートし
た。インキュベーション後、切片をＰＢＳで数回洗浄
し、適正な二次抗体共存下で３７℃で１時間インキュベ
ートした。ビオチン結合二次抗体を用いた試料について
は、その切片をＨＲＰ結合ストレプトアビジン共存下に
おいても３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ
で完全に洗浄した後、ＤＡＢ（Wako社製）を含む溶液で
試料を染色した。拮抗染色（counter−stain）としてMe
thylgreen（Wako社製）を用いた。
タノール、５％酢酸；vol％）中で、脳を一晩固定化し
た。標準的なプロトコール（１００％エタノール、メチ
ルベンゾアート、キシレン、キシレン−パラフィン、及
びパラフィン溶液にそれぞれ１〜２時間）に従い、固定
化した脳をパラフィン化（paraffination）した。次
に、この試料をパラフィンに包埋した。包埋した脳を、
ミクロトームで１０μｍ厚さの切片に切り分けた。標準
的なプロトコールに従い、これらの切片を脱パラフィン
化した（キシレン、１００％エタノール、９０％エタノ
ール、７０％エタノール、及びＰＢＳ）。細胞内におけ
るペルオキシダーゼ活性を、３％Ｈ2Ｏ2により室温で１
０分間消失（quenched）させた。ＰＢＳでもう一回洗浄
した後、上記切片を一次抗体共存下で、使用する抗体に
より４℃で一晩或いは３７℃で２時間インキュベートし
た。インキュベーション後、切片をＰＢＳで数回洗浄
し、適正な二次抗体共存下で３７℃で１時間インキュベ
ートした。ビオチン結合二次抗体を用いた試料について
は、その切片をＨＲＰ結合ストレプトアビジン共存下に
おいても３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ
で完全に洗浄した後、ＤＡＢ（Wako社製）を含む溶液で
試料を染色した。拮抗染色（counter−stain）としてMe
thylgreen（Wako社製）を用いた。
【００５０】（方法７）野生型（C57BL/6）、ＦｃＲγ
−欠損（Cell 76, 519, 1994）、Ｆｙｎ−欠損（Nature
366, 742, 1994）、及びＭＢＰ―欠損（震えるマウス
として知らている；Jackson Lab.）マウスを、適当な
麻酔の下，試験に供する全ての週齢のマウスに関して、
適当な麻酔の下、犠牲にした。変異体を含めて、全マウ
スの遺伝的背景は、Ｃ５７ＢＬ／６である。 （方法８）予備的な染色の後、切片をＰＢＳで数回洗浄
した。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌバッファー（pH2.2）
中において、室温で一時間培養して、第一の抗体を除去
した。これらの染色条件は、第二の抗体の染色にも都合
良く用いた。最終染色に続いて、４−クロロ−１−ナフ
トール（Wako）を含む溶液を、第二の抗体を発色させる
ために用いた。
−欠損（Cell 76, 519, 1994）、Ｆｙｎ−欠損（Nature
366, 742, 1994）、及びＭＢＰ―欠損（震えるマウス
として知らている；Jackson Lab.）マウスを、適当な
麻酔の下，試験に供する全ての週齢のマウスに関して、
適当な麻酔の下、犠牲にした。変異体を含めて、全マウ
スの遺伝的背景は、Ｃ５７ＢＬ／６である。 （方法８）予備的な染色の後、切片をＰＢＳで数回洗浄
した。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌバッファー（pH2.2）
中において、室温で一時間培養して、第一の抗体を除去
した。これらの染色条件は、第二の抗体の染色にも都合
良く用いた。最終染色に続いて、４−クロロ−１−ナフ
トール（Wako）を含む溶液を、第二の抗体を発色させる
ために用いた。
【００５１】（方法９）使用した抗ＭＡＧ血清の特異性
は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に罹患させた
脳の切片を染色して確かめ、抗体と中枢神経系内のＦｃ
Ｒγ陽性免疫細胞集団との交差反応性の可能性を排除し
た。この抗体は、ＥＡＥに罹患した脳における侵入性免
疫細胞とは反応せず（図１の補足）、免疫細胞と交差反
応しないことを明らかにした。 （方法１０）一皿あたり、１×１０6のオリゴデンドロ
グリア前駆体細胞を播種した３５ｍｍ皿を、（１００μ
ｇ／ｍｌ；Sigma社製）、抗ＦｃＲγウサギポリクロー
ナル抗体を含むポリ−Ｌ−リジン（７０μｇ／ｍｌ）単
独、又はポリ−Ｌ−リジンと抗ヒトＦｃεＲＩαマウス
モノクローナル抗体（クローンＣＲＡ−１、サブタイプ
ＩｇＧ２ｂ；２０μｇ／ｍｌ；Kyokuto社製）のいずれ
かで処理した。２４時間後に細胞を回収した（図５
Ａ）。溶解緩衝液（５０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、１％ＮＰ４０、０．２５％デオキシコレートナト
リウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ−２
Ｎａ、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭの
ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌ
のロイペプチン、及び１μｇ／ｍｌのペプスタチン）を
用いて細胞を溶解させた後、該細胞溶解物にＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ法を実施した。標準的プロトコールに従い、ゲル
をウエスタンブロッティング分析にかけた。フローサイ
トメトリーの結果、ＣＲＡ−１抗体によりオリゴデンド
ログリア表面上のタンパク質は検出されなかった。
は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に罹患させた
脳の切片を染色して確かめ、抗体と中枢神経系内のＦｃ
Ｒγ陽性免疫細胞集団との交差反応性の可能性を排除し
た。この抗体は、ＥＡＥに罹患した脳における侵入性免
疫細胞とは反応せず（図１の補足）、免疫細胞と交差反
応しないことを明らかにした。 （方法１０）一皿あたり、１×１０6のオリゴデンドロ
グリア前駆体細胞を播種した３５ｍｍ皿を、（１００μ
ｇ／ｍｌ；Sigma社製）、抗ＦｃＲγウサギポリクロー
ナル抗体を含むポリ−Ｌ−リジン（７０μｇ／ｍｌ）単
独、又はポリ−Ｌ−リジンと抗ヒトＦｃεＲＩαマウス
モノクローナル抗体（クローンＣＲＡ−１、サブタイプ
ＩｇＧ２ｂ；２０μｇ／ｍｌ；Kyokuto社製）のいずれ
かで処理した。２４時間後に細胞を回収した（図５
Ａ）。溶解緩衝液（５０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、１％ＮＰ４０、０．２５％デオキシコレートナト
リウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ−２
Ｎａ、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭの
ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌ
のロイペプチン、及び１μｇ／ｍｌのペプスタチン）を
用いて細胞を溶解させた後、該細胞溶解物にＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ法を実施した。標準的プロトコールに従い、ゲル
をウエスタンブロッティング分析にかけた。フローサイ
トメトリーの結果、ＣＲＡ−１抗体によりオリゴデンド
ログリア表面上のタンパク質は検出されなかった。
【００５２】（方法１１）ミエリンフラクションを調製
する厳密な方法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びブロテイング
法については、既に述べた（Neurosci. Res. 37, 21, 2
000）。図５Ｂにおいて、同量の試料を、野性型及び変
異動物からのミエリン含有脳フラクションから得、各々
のレーンにかけた。 （方法１２）抗ＭＡＧ抗体で染色した後、変異マウス及
び野生型マウス双方の脳からの切片を３枚ずつ用い、大
脳皮質内のＭＡＧ陽性幼若オリゴデンドログリア（Neur
osci. Lett. 298, 163, 2001）の数を定量した。脳の使
用した部位は、実験した全てのマウスで解剖学的に同一
であることを確認して用いた。平均値及び標準偏差を算
出して表にした。 （方法１３）電子顕微鏡分析のための固定は、文献（An
nu. Rev. Cell. Dev. Biol. 13, 513, 1997）記載の方
法によって実施した。２％酢酸ウラニル及び鉛溶液で染
色超薄切片（Ultra−thin−section）を、ＪＥＯＬ １
００Ｃ電子顕微鏡（Nippon Kohden）を８０ｋＶで操作
して、観察した。
する厳密な方法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びブロテイング
法については、既に述べた（Neurosci. Res. 37, 21, 2
000）。図５Ｂにおいて、同量の試料を、野性型及び変
異動物からのミエリン含有脳フラクションから得、各々
のレーンにかけた。 （方法１２）抗ＭＡＧ抗体で染色した後、変異マウス及
び野生型マウス双方の脳からの切片を３枚ずつ用い、大
脳皮質内のＭＡＧ陽性幼若オリゴデンドログリア（Neur
osci. Lett. 298, 163, 2001）の数を定量した。脳の使
用した部位は、実験した全てのマウスで解剖学的に同一
であることを確認して用いた。平均値及び標準偏差を算
出して表にした。 （方法１３）電子顕微鏡分析のための固定は、文献（An
nu. Rev. Cell. Dev. Biol. 13, 513, 1997）記載の方
法によって実施した。２％酢酸ウラニル及び鉛溶液で染
色超薄切片（Ultra−thin−section）を、ＪＥＯＬ １
００Ｃ電子顕微鏡（Nippon Kohden）を８０ｋＶで操作
して、観察した。
【００５３】［図面の説明］図１（参考写真１参照）．
インビトロでのＯＰＣ（オリゴデンドログリア前駆体細
胞）及び幼若オリゴデンドログリアにおけるＦｃＲγ発
現の様子を示す図である。 Ａ：ＦｃＲγ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により分析した。Ｏ
ＰＣは、ＦｃＲγを発現したが（ａ）、ＣＤ３ζの発現
は認められなかった（ｂ）。骨髄由来のマスト細胞をポ
ジティブコントロールとして用いた。半定量ＲＴ−ＰＣ
Ｒ分析の結果、幼若オリゴデンドログリアにおけるＦｃ
Ｒγ ｍＲＮＡの発現レベルは、マスト細胞とほぼ同程
度だった。 Ｂ：ＦｃＲγ発現を免疫細胞化学法により調べた結果を
示す図である。ＦｃＲγは、Ａ２Ｂ５陽性オリゴデンド
ログリア幹細胞（ａ、ｂ）、Ｏ４−（ｃ、ｄ）、及びＯ
１陽性幼若オリゴデンドログリア（ｅ、ｆ）で発現され
る。バー（図中に大きさの物さしとしてバーで示す）：
１５μｍ。 Ｃ：ＦｃＲγのウエスタンブロッティング分析を行った
ところ、野生型由来幼若オリゴデンドログリアではＦｃ
Ｒγ発現が認められたが（方法５参照）、ＦｃＲγ欠損
マウスでは発現されなかった（Cell 76, 519, 1994）こ
とがわかった。
インビトロでのＯＰＣ（オリゴデンドログリア前駆体細
胞）及び幼若オリゴデンドログリアにおけるＦｃＲγ発
現の様子を示す図である。 Ａ：ＦｃＲγ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により分析した。Ｏ
ＰＣは、ＦｃＲγを発現したが（ａ）、ＣＤ３ζの発現
は認められなかった（ｂ）。骨髄由来のマスト細胞をポ
ジティブコントロールとして用いた。半定量ＲＴ−ＰＣ
Ｒ分析の結果、幼若オリゴデンドログリアにおけるＦｃ
Ｒγ ｍＲＮＡの発現レベルは、マスト細胞とほぼ同程
度だった。 Ｂ：ＦｃＲγ発現を免疫細胞化学法により調べた結果を
示す図である。ＦｃＲγは、Ａ２Ｂ５陽性オリゴデンド
ログリア幹細胞（ａ、ｂ）、Ｏ４−（ｃ、ｄ）、及びＯ
１陽性幼若オリゴデンドログリア（ｅ、ｆ）で発現され
る。バー（図中に大きさの物さしとしてバーで示す）：
１５μｍ。 Ｃ：ＦｃＲγのウエスタンブロッティング分析を行った
ところ、野生型由来幼若オリゴデンドログリアではＦｃ
Ｒγ発現が認められたが（方法５参照）、ＦｃＲγ欠損
マウスでは発現されなかった（Cell 76, 519, 1994）こ
とがわかった。
【００５４】図２（参考写真２参照）．インビボでのＦ
ｃＲγ発現細胞の分布の様子を示す図である。脳の冠状
切片を示す。Ｐ０では、ＦｃＲγ発現細胞の分布は主に
ＳＶＺに集中しており（ａ）、Ｐ４でその分布は白質ま
でおよび（ｂ）、Ｐ７で主に白質に局在する（ｃ）。Ｆ
ｃＲγ陽性細胞は、脳室帯のマウス−ムサシ−１（ｍ−
Ｍｓｉ−１）陽性細胞層に直に隣接する脳室下帯内で観
察されたことから（J. Neurosci. 17, 8300, 1997）、
かかるＦｃＲγ陽性細胞は神経幹細胞由来であると考え
られる（ｄ、ｅ）。ＦｃＲγ陽性細胞は成熟中枢神経系
においても保持され、その分布はＰ７のときと類似して
いる（Ｐ７における分布：ＦｃＲγ陽性細胞集団は白質
の脳室上部エリアに集中しており灰白質では殆ど認めら
れない（ｆ））。ＬＶ：側脳室。ｃｃ：脳梁。ｖｚ：脳
室帯。ｓｖｚ：脳室下帯。ＣＴＸ：大脳皮質。ＣＧ：帯
状束（cingulum）。ＣＰｕ：尾状被殻。バー：５０μｍ
（ｃ）、２５μｍ（ｅ）、５０μｍ（ｆ）。
ｃＲγ発現細胞の分布の様子を示す図である。脳の冠状
切片を示す。Ｐ０では、ＦｃＲγ発現細胞の分布は主に
ＳＶＺに集中しており（ａ）、Ｐ４でその分布は白質ま
でおよび（ｂ）、Ｐ７で主に白質に局在する（ｃ）。Ｆ
ｃＲγ陽性細胞は、脳室帯のマウス−ムサシ−１（ｍ−
Ｍｓｉ−１）陽性細胞層に直に隣接する脳室下帯内で観
察されたことから（J. Neurosci. 17, 8300, 1997）、
かかるＦｃＲγ陽性細胞は神経幹細胞由来であると考え
られる（ｄ、ｅ）。ＦｃＲγ陽性細胞は成熟中枢神経系
においても保持され、その分布はＰ７のときと類似して
いる（Ｐ７における分布：ＦｃＲγ陽性細胞集団は白質
の脳室上部エリアに集中しており灰白質では殆ど認めら
れない（ｆ））。ＬＶ：側脳室。ｃｃ：脳梁。ｖｚ：脳
室帯。ｓｖｚ：脳室下帯。ＣＴＸ：大脳皮質。ＣＧ：帯
状束（cingulum）。ＣＰｕ：尾状被殻。バー：５０μｍ
（ｃ）、２５μｍ（ｅ）、５０μｍ（ｆ）。
【００５５】図３（参考写真３参照）．インビボでのオ
リゴデンドログリア系統におけるＦｃＲγ陽性細胞の検
出を示す図である。 Ａ：Ｐ０脳の冠状切片を二重標識化する様子を示す。Ｆ
ｃＲγ陽性細胞は主にＳＶＺに分布していた（ａ）。殆
どのＦｃＲγ陽性細胞は、アストログリア系統のＧＦＡ
Ｐ陽性細胞の分布と重複しないように分布していた
（ｂ）。ミクログリア系統のＯｘ−４２陽性細胞の分布
は、ＦｃＲγ陽性細胞の分布とは異なっていた（ｃ）。
このことから、かかる日齢（Ｐ０）のＦｃＲγ陽性細胞
は、オリゴデンドログリア系統由来のものが優勢である
ことがわかる。ｂ図は、ａ図（枠内）を拡大したもので
ある。ｏ：オリゴデンドログリア細胞。ａ：アストログ
リア細胞。ｍ：ミクログリア細胞。バー：５０μｍ
（ａ、ｃ）、２５μｍ（ｂ）。 Ｂ：Ｐ７脳の冠状切片の二重標識化を示す図である。写
真は前有髄化段階の脳梁を撮ったものである。ＦｃＲγ
及びＦｙｎは、細胞表面において共在していた（矢頭；
ａ）。ＭＡＧは、ＦｃＲγ陽性オリゴデンドログリアに
おいて共標識された（矢頭）が、その発現は端部突起に
強く現れる傾向がみられた（ｂ）。バー：２５μｍ。
リゴデンドログリア系統におけるＦｃＲγ陽性細胞の検
出を示す図である。 Ａ：Ｐ０脳の冠状切片を二重標識化する様子を示す。Ｆ
ｃＲγ陽性細胞は主にＳＶＺに分布していた（ａ）。殆
どのＦｃＲγ陽性細胞は、アストログリア系統のＧＦＡ
Ｐ陽性細胞の分布と重複しないように分布していた
（ｂ）。ミクログリア系統のＯｘ−４２陽性細胞の分布
は、ＦｃＲγ陽性細胞の分布とは異なっていた（ｃ）。
このことから、かかる日齢（Ｐ０）のＦｃＲγ陽性細胞
は、オリゴデンドログリア系統由来のものが優勢である
ことがわかる。ｂ図は、ａ図（枠内）を拡大したもので
ある。ｏ：オリゴデンドログリア細胞。ａ：アストログ
リア細胞。ｍ：ミクログリア細胞。バー：５０μｍ
（ａ、ｃ）、２５μｍ（ｂ）。 Ｂ：Ｐ７脳の冠状切片の二重標識化を示す図である。写
真は前有髄化段階の脳梁を撮ったものである。ＦｃＲγ
及びＦｙｎは、細胞表面において共在していた（矢頭；
ａ）。ＭＡＧは、ＦｃＲγ陽性オリゴデンドログリアに
おいて共標識された（矢頭）が、その発現は端部突起に
強く現れる傾向がみられた（ｂ）。バー：２５μｍ。
【００５６】Ｃ：成熟中枢神経系に存在するＦｃＲγ陽
性細胞を同定する様子を示した図である。ＦｃＲγ及び
ＭＢＰ双方に対し陽性なオリゴデンドログリア細胞が、
白質内にて観察されたが、これは新生期中枢神経系での
観察結果と一致している（ａ）。一方、成熟ＳＶＺ内に
て優勢なＧＦＡＰ陽性細胞の小サブ集団もまたＦｃＲγ
陽性を示した（ｂ）。バー：２５μｍ。 Ｄ：一続きの切片を用いて分析したところ、ＦｃＲγ
（ａ）、Ｆｙｎ（ｂ）、及びＭＢＰ（ｃ）のいずれとも
同様の発現パターンを示した（矢印及び矢頭）。Ｐ７の
脳梁、及び脳弓の一部の写真を示した。ＦｃＲγやＭＢ
Ｐは発現されなかったにも関わらず、Ｆｙｎは軸索でも
発現されたことは特筆に値する（Nature 366, 742, 199
4）。バー：５０μｍ。
性細胞を同定する様子を示した図である。ＦｃＲγ及び
ＭＢＰ双方に対し陽性なオリゴデンドログリア細胞が、
白質内にて観察されたが、これは新生期中枢神経系での
観察結果と一致している（ａ）。一方、成熟ＳＶＺ内に
て優勢なＧＦＡＰ陽性細胞の小サブ集団もまたＦｃＲγ
陽性を示した（ｂ）。バー：２５μｍ。 Ｄ：一続きの切片を用いて分析したところ、ＦｃＲγ
（ａ）、Ｆｙｎ（ｂ）、及びＭＢＰ（ｃ）のいずれとも
同様の発現パターンを示した（矢印及び矢頭）。Ｐ７の
脳梁、及び脳弓の一部の写真を示した。ＦｃＲγやＭＢ
Ｐは発現されなかったにも関わらず、Ｆｙｎは軸索でも
発現されたことは特筆に値する（Nature 366, 742, 199
4）。バー：５０μｍ。
【００５７】図４（参考写真４参照）．インビトロでの
ＦｃＲγシグナルの活性化の様子を示す図である。 Ａ：抗ＦｃＲγ抗体と２４時間交差結合させた結果、Ｏ
ＰＣには、よく発達した突起があらわれ、劇的な形態上
の変化をみせた（ｂ）が、ＦｃＲγシグナルの活性化な
しには、かかる変化は認められなかった（ａ）。バー：
３５μｍ。 Ｂ：ＭＢＰ及びＦｙｎの発現を調べるウエスタンブロッ
ティング分析の結果を示す図である。Ａ図に示した細胞
を溶解させて分析した。ＭＢＰ、中でも特にエクソン２
含有アイソフォーム（１７．０ｋＤ及び２１．５ｋＤ）
及びＦｙｎは、抗ＦｃＲγ抗体による活性化がない場合
（対照（ctrl）；１列目）に比し、かかる抗体により活
性化されたときにＯＰＣ内で増加した（ＦｃＲγ；２列
目）。ＩｇＧ Ｆｃ受容体を介したＩｇＧ２ｂ（ＩｇＧ
２ｂ；３列目）による刺激によってもＭＢＰ発現は増加
したが、間接的な刺激プロセスを反映してＦｙｎは刺激
を受けなかった。ＯＰＣ及び既分化オリゴデンドログリ
アの双方に対してのマーカーであるＣＮＰａｓｅを負荷
対照として用いた。 Ｃ：ＦｃＲγ欠損マウスから得られたＯＰＣは、ＩｇＧ
２ｂによる刺激を受けなかった（５８；ａ、ｂを比
較）。このことから刺激（Ａ）によりもたらされたＯＰ
Ｃにおける変化は、細胞内においてＦｃＲγの発現に依
存することを示唆する。バー：３５μｍ。
ＦｃＲγシグナルの活性化の様子を示す図である。 Ａ：抗ＦｃＲγ抗体と２４時間交差結合させた結果、Ｏ
ＰＣには、よく発達した突起があらわれ、劇的な形態上
の変化をみせた（ｂ）が、ＦｃＲγシグナルの活性化な
しには、かかる変化は認められなかった（ａ）。バー：
３５μｍ。 Ｂ：ＭＢＰ及びＦｙｎの発現を調べるウエスタンブロッ
ティング分析の結果を示す図である。Ａ図に示した細胞
を溶解させて分析した。ＭＢＰ、中でも特にエクソン２
含有アイソフォーム（１７．０ｋＤ及び２１．５ｋＤ）
及びＦｙｎは、抗ＦｃＲγ抗体による活性化がない場合
（対照（ctrl）；１列目）に比し、かかる抗体により活
性化されたときにＯＰＣ内で増加した（ＦｃＲγ；２列
目）。ＩｇＧ Ｆｃ受容体を介したＩｇＧ２ｂ（ＩｇＧ
２ｂ；３列目）による刺激によってもＭＢＰ発現は増加
したが、間接的な刺激プロセスを反映してＦｙｎは刺激
を受けなかった。ＯＰＣ及び既分化オリゴデンドログリ
アの双方に対してのマーカーであるＣＮＰａｓｅを負荷
対照として用いた。 Ｃ：ＦｃＲγ欠損マウスから得られたＯＰＣは、ＩｇＧ
２ｂによる刺激を受けなかった（５８；ａ、ｂを比
較）。このことから刺激（Ａ）によりもたらされたＯＰ
Ｃにおける変化は、細胞内においてＦｃＲγの発現に依
存することを示唆する。バー：３５μｍ。
【００５８】図５（参考写真５参照）．ＦｃＲγ欠損マ
ウス、Ｆｙｎ欠損マウス、及びＭＢＰ欠損マウスを比較
対照した結果を示す図である。 Ａ：Ｐ１０脳の冠状切片の様子を示す図である。ミエリ
ン形態及び有髄化オリゴデンドログリアが認識できる帯
状束の白質を示した。ａ−ｄ、ｂ−ｅ、及びｃ−ｆは、
互いに隣接する切片である。ＭＢＰ分布は、ＦｃＲγ欠
損マウス（ｂ）及びＦｙｎ欠損マウス（ｃ）において制
限され、ＦｃＲγ欠損マウス（ｂ）より、Ｆｙｎ欠損マ
ウス（ｃ）においてさらに厳しく制限されていた。ＭＡ
Ｇ陽性幼若オリゴデンドログリア（矢頭）は、三種類の
変異マウス全てにおいて制限され、中でもＭＢＰ欠損マ
ウスで最も強く制限され（ｇ）、またＦｃＲγ欠損マウ
ス（ｅ）よりＦｙｎ欠損マウス（ｆ）において、より強
く制限されていた。以上の観察結果を総合すると、有髄
化オリゴデンドログリア内におけるＦｃＲγ−Ｆｙｎ−
ＭＢＰカスケードの存在が考えられる。バー：１００μ
ｍ。
ウス、Ｆｙｎ欠損マウス、及びＭＢＰ欠損マウスを比較
対照した結果を示す図である。 Ａ：Ｐ１０脳の冠状切片の様子を示す図である。ミエリ
ン形態及び有髄化オリゴデンドログリアが認識できる帯
状束の白質を示した。ａ−ｄ、ｂ−ｅ、及びｃ−ｆは、
互いに隣接する切片である。ＭＢＰ分布は、ＦｃＲγ欠
損マウス（ｂ）及びＦｙｎ欠損マウス（ｃ）において制
限され、ＦｃＲγ欠損マウス（ｂ）より、Ｆｙｎ欠損マ
ウス（ｃ）においてさらに厳しく制限されていた。ＭＡ
Ｇ陽性幼若オリゴデンドログリア（矢頭）は、三種類の
変異マウス全てにおいて制限され、中でもＭＢＰ欠損マ
ウスで最も強く制限され（ｇ）、またＦｃＲγ欠損マウ
ス（ｅ）よりＦｙｎ欠損マウス（ｆ）において、より強
く制限されていた。以上の観察結果を総合すると、有髄
化オリゴデンドログリア内におけるＦｃＲγ−Ｆｙｎ−
ＭＢＰカスケードの存在が考えられる。バー：１００μ
ｍ。
【００５９】Ｂ：ミエリン画分のＭＢＰをウエスタンブ
ロッティング分析にかけた結果を示す図である。成熟マ
ウス（ｂ）と同様に、Ｐ１０（ａ）のＦｙｎ欠損マウス
及びＦｃＲγ欠損マウスでもＭＢＰ発現が減少してい
た。成熟中枢神経系では、Ｆｙｎ欠損マウス及びＦｃＲ
γ欠損マウスにおける全ＭＢＰ量がそれぞれ４０．３％
及び６０．８％まで減少していた。エクソン２含有ＭＢ
Ｐアイソフォーム（１７．０ｋＤ及び２１．５ｋＤ）
は、他のアイソフォーム類に比し、より一層減少してお
り、Ｆｙｎ欠損成熟マウスでは３１．９％、またＦｃＲ
γ欠損成熟マウスでは４０．０％まで減少していた。か
かる欠損状況は、インビトロでの結果と合致していた
（図４）。 Ｃ：Ｐ１０の変異マウス及び野生型マウスにおける幼若
オリゴデンドログリアの移動を統計的に分析した結果を
示す図である（方法１２参照）。各冠状切片において、
Ｐ１０までに脳梁から大脳皮質に移動したＭＡＧ陽性幼
若オリゴデンドログリアを計数し、統計分析を行った。
その数（各切片毎の細胞数）は、ＦｃＲγ欠損マウスで
は野生型の約４４％、Ｆｙｎ欠損マウスでは野生型の約
２５％、またＭＢＰ欠損マウスでは野生型の約１２％だ
った。この統計結果は、ＭＢＰ発現レベルと正比例して
おり、エクソン２含有ＭＢＰアイソフォームがミエリン
形成に重要であることを示唆している。
ロッティング分析にかけた結果を示す図である。成熟マ
ウス（ｂ）と同様に、Ｐ１０（ａ）のＦｙｎ欠損マウス
及びＦｃＲγ欠損マウスでもＭＢＰ発現が減少してい
た。成熟中枢神経系では、Ｆｙｎ欠損マウス及びＦｃＲ
γ欠損マウスにおける全ＭＢＰ量がそれぞれ４０．３％
及び６０．８％まで減少していた。エクソン２含有ＭＢ
Ｐアイソフォーム（１７．０ｋＤ及び２１．５ｋＤ）
は、他のアイソフォーム類に比し、より一層減少してお
り、Ｆｙｎ欠損成熟マウスでは３１．９％、またＦｃＲ
γ欠損成熟マウスでは４０．０％まで減少していた。か
かる欠損状況は、インビトロでの結果と合致していた
（図４）。 Ｃ：Ｐ１０の変異マウス及び野生型マウスにおける幼若
オリゴデンドログリアの移動を統計的に分析した結果を
示す図である（方法１２参照）。各冠状切片において、
Ｐ１０までに脳梁から大脳皮質に移動したＭＡＧ陽性幼
若オリゴデンドログリアを計数し、統計分析を行った。
その数（各切片毎の細胞数）は、ＦｃＲγ欠損マウスで
は野生型の約４４％、Ｆｙｎ欠損マウスでは野生型の約
２５％、またＭＢＰ欠損マウスでは野生型の約１２％だ
った。この統計結果は、ＭＢＰ発現レベルと正比例して
おり、エクソン２含有ＭＢＰアイソフォームがミエリン
形成に重要であることを示唆している。
【００６０】図６（参考写真６参照）．ＦｃＲγ非存在
下における脱髄の様子を示す図である。 Ａ：視神経においてＦｃＲγを、ＯＰＣのマーカーであ
るＰＤＧＦ−αＲと共染色した様子を示す（Developmen
t 115, 535, 1992）（矢頭；ａ）。Ｐ１０のＦｃＲγ欠
損マウス（ｃ、ＦｃＲγ―/―）と野生型マウス（ｂ、W
ild）の間に、ＰＤＧＦ−αＲ陽性細胞分布に関する有
意の差はみられなかった。ＳＶＺと白質の境界を示す。
かかる観察結果からＰ１０での初期ミエリン形成におけ
る欠損（図５）が、グリア細胞形成不全によるものでは
なく、主にミエリン形成不全によるものであることが考
えられる。バー：４０μｍ。 Ｂ：発達後期におけるＭＡＧ陽性幼若オリゴデンドログ
リアの統計分析（Neurosci. Lett. 298, 163, 2001、方
法１２参照）からは、Ｐ５０とＰ９０の細胞数に有意の
差は認められなかった（ａ）。しかしこの時点におい
て、ＭＢＰだけでなくミエリン異常が明白になっている
（図５）。Ｐ５０の脳梁におけるＰＬＰを免疫組織化学
法により検出したところ、野生型（ｂ）に比し、ＦｃＲ
γ欠損マウス（ｃ）で顕著に減少していた。バー：４０
μｍ。 Ｃ：Ｐ６７ＦｃＲγ欠損マウス（ｂ）の脳梁後部領域で
は、野生型（ａ）に比べ、低髄化が甚大に生じているこ
とが電子顕微鏡による観察で明らかになった。ＦｃＲγ
欠損マウスの脳梁前部領域では、野生型（ｃ）に比べ低
髄化軸策内で軸策が大幅に腫脹（アステリスク）してい
ることが認められた（ｄ）。バー：２μｍ（ｂ）。５０
０ｎｍ（ｄ）。
下における脱髄の様子を示す図である。 Ａ：視神経においてＦｃＲγを、ＯＰＣのマーカーであ
るＰＤＧＦ−αＲと共染色した様子を示す（Developmen
t 115, 535, 1992）（矢頭；ａ）。Ｐ１０のＦｃＲγ欠
損マウス（ｃ、ＦｃＲγ―/―）と野生型マウス（ｂ、W
ild）の間に、ＰＤＧＦ−αＲ陽性細胞分布に関する有
意の差はみられなかった。ＳＶＺと白質の境界を示す。
かかる観察結果からＰ１０での初期ミエリン形成におけ
る欠損（図５）が、グリア細胞形成不全によるものでは
なく、主にミエリン形成不全によるものであることが考
えられる。バー：４０μｍ。 Ｂ：発達後期におけるＭＡＧ陽性幼若オリゴデンドログ
リアの統計分析（Neurosci. Lett. 298, 163, 2001、方
法１２参照）からは、Ｐ５０とＰ９０の細胞数に有意の
差は認められなかった（ａ）。しかしこの時点におい
て、ＭＢＰだけでなくミエリン異常が明白になっている
（図５）。Ｐ５０の脳梁におけるＰＬＰを免疫組織化学
法により検出したところ、野生型（ｂ）に比し、ＦｃＲ
γ欠損マウス（ｃ）で顕著に減少していた。バー：４０
μｍ。 Ｃ：Ｐ６７ＦｃＲγ欠損マウス（ｂ）の脳梁後部領域で
は、野生型（ａ）に比べ、低髄化が甚大に生じているこ
とが電子顕微鏡による観察で明らかになった。ＦｃＲγ
欠損マウスの脳梁前部領域では、野生型（ｃ）に比べ低
髄化軸策内で軸策が大幅に腫脹（アステリスク）してい
ることが認められた（ｄ）。バー：２μｍ（ｂ）。５０
０ｎｍ（ｄ）。
【００６１】図７（参考写真７参照）．オリゴデンドロ
グリア内で、ＦｃＲγと、ＦｃγＲＩ／III及びＣＤ４
５との共発現の様子を示す図である。 Ａ：幼若オリゴデンドログリアのＲＴ−ＰＣＲ分析結果
を示す図である（方法５参照）。ＦｃεＲＩのα鎖は検
出されなかったが、ＦｃγＲＩ／IIIのα鎖は検出され
たことから、ＩｇＧ Ｆｃ受容体が、ＦｃＲγのパート
ナーの一つと考えられる。幼若オリゴデンドログリアに
おけるｍＲＮＡ発現量が、骨髄由来マスト細胞のおよそ
１．８倍（ＦｃγＲＩ）及び０．８倍（ＦｃγＲIII）
であることが、半定量ＲＴ−ＰＣＲの結果からわかっ
た。 Ｂ：オリゴデンドログリアにおけるＣＤ４５発現の様子
を示す図である。ＭＡＧ陽性細胞内におけるその発現で
示されるように、ＣＤ４５はオリゴデンドログリアにて
発現される（ｃ）（矢頭）。Ｐ１０のオリゴデンドログ
リアにおける有髄化の初期プロセスにおいてＣＤ４５
は、Ｆｙｎと共発現される（矢頭；ｂ）。またＣＤ４５
は、成長過程の髄鞘（矢頭；ｄ）及び成熟中枢神経系
（矢頭；ａ）においてもＦｃＲγと共発現される。写真
は全て中枢神経系の白質で撮ったものである（ａは白質
と成熟ＳＶＺの境界、ｂとｄは脳梁、ｃは前側横連神
経）。バー：２５μｍ。 Ｃ：ＣＤ４５は、培養幼若オリゴデンドログリアからも
検出されたが（方法５参照）、アストロサイトからは検
出されなかったことがフローサイトメトリーからわかっ
た。これらの結果は、前述のカスケードの調節にＣＤ４
５が関与していることを示唆している。
グリア内で、ＦｃＲγと、ＦｃγＲＩ／III及びＣＤ４
５との共発現の様子を示す図である。 Ａ：幼若オリゴデンドログリアのＲＴ−ＰＣＲ分析結果
を示す図である（方法５参照）。ＦｃεＲＩのα鎖は検
出されなかったが、ＦｃγＲＩ／IIIのα鎖は検出され
たことから、ＩｇＧ Ｆｃ受容体が、ＦｃＲγのパート
ナーの一つと考えられる。幼若オリゴデンドログリアに
おけるｍＲＮＡ発現量が、骨髄由来マスト細胞のおよそ
１．８倍（ＦｃγＲＩ）及び０．８倍（ＦｃγＲIII）
であることが、半定量ＲＴ−ＰＣＲの結果からわかっ
た。 Ｂ：オリゴデンドログリアにおけるＣＤ４５発現の様子
を示す図である。ＭＡＧ陽性細胞内におけるその発現で
示されるように、ＣＤ４５はオリゴデンドログリアにて
発現される（ｃ）（矢頭）。Ｐ１０のオリゴデンドログ
リアにおける有髄化の初期プロセスにおいてＣＤ４５
は、Ｆｙｎと共発現される（矢頭；ｂ）。またＣＤ４５
は、成長過程の髄鞘（矢頭；ｄ）及び成熟中枢神経系
（矢頭；ａ）においてもＦｃＲγと共発現される。写真
は全て中枢神経系の白質で撮ったものである（ａは白質
と成熟ＳＶＺの境界、ｂとｄは脳梁、ｃは前側横連神
経）。バー：２５μｍ。 Ｃ：ＣＤ４５は、培養幼若オリゴデンドログリアからも
検出されたが（方法５参照）、アストロサイトからは検
出されなかったことがフローサイトメトリーからわかっ
た。これらの結果は、前述のカスケードの調節にＣＤ４
５が関与していることを示唆している。
【００６２】図８．前述のミエリン形成機構を説明する
図である。ＩｇＧ等の細胞外シグナルが、ＩｇＧ Ｆｃ
受容体（ＦｃγＲＩ／ＲIII）との会合を介してＦｃＲ
γを誘発する。ＣＤ４５がＦｙｎを活性化し、次にＦｙ
ｎをチロシンキナーゼとして、ＦｃＲγのＩＴＡＭリン
酸化が進行し、その結果ＭＢＰ、特にエクソン２含有ア
イソフォームの発現が刺激される。本発明者らが報告
（Neurosci. Lett. 298, 163, 2001）しているように、
ＭＢＰは、ＭＡＧ発現の調節に関わっている。ＦｃγＲ
ｓの多型性（Neurology 52, 1771, 1999）及びＣＤ４５
の変異（Nat. Genet. 26, 495, 2000）が、ＭＳ患者の
一部に関係していることが報告されている。脱髄疾患に
対するＩＶＩｇ療法の有効性を、このモデルを用い説明
することができる（Arch. Neurol. 56, 661, 1999）。
ＦｃＲγを直接刺激（図４）した結果からは、再有髄化
を増強し得る可能性が考えられる。
図である。ＩｇＧ等の細胞外シグナルが、ＩｇＧ Ｆｃ
受容体（ＦｃγＲＩ／ＲIII）との会合を介してＦｃＲ
γを誘発する。ＣＤ４５がＦｙｎを活性化し、次にＦｙ
ｎをチロシンキナーゼとして、ＦｃＲγのＩＴＡＭリン
酸化が進行し、その結果ＭＢＰ、特にエクソン２含有ア
イソフォームの発現が刺激される。本発明者らが報告
（Neurosci. Lett. 298, 163, 2001）しているように、
ＭＢＰは、ＭＡＧ発現の調節に関わっている。ＦｃγＲ
ｓの多型性（Neurology 52, 1771, 1999）及びＣＤ４５
の変異（Nat. Genet. 26, 495, 2000）が、ＭＳ患者の
一部に関係していることが報告されている。脱髄疾患に
対するＩＶＩｇ療法の有効性を、このモデルを用い説明
することができる（Arch. Neurol. 56, 661, 1999）。
ＦｃＲγを直接刺激（図４）した結果からは、再有髄化
を増強し得る可能性が考えられる。
【００６３】
【発明の効果】本発明により、シグナル分子がミエリン
形成に関与する機構を解明することにより、すなわち、
免疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲ
γ）、Ｆｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）、ミエリン塩基
性タンパク質（ＭＢＰ）が、ミエリン形成シグナル分子
として働くこと、及びこれらのシグナル分子が、ＦｃＲ
γ−Ｆｙｎ−ＭＢＰからなるシグナルカスケードとして
ミエリン形成に関与していることを解明したことによっ
て、該シグナル分子を欠損させ、ミエリン発達障害を起
した非ヒト動物を作製することを可能とした。また、該
シグナル分子を欠失したミエリン発達障害モデル非ヒト
動物が、多発性硬化症（ＭＳ）等の脱髄疾患を発症する
ことから、このミエリン発達障害モデル非ヒト動物を用
いて、ミエリン発達調節物質及び脱髄疾患の治療薬をス
クリーニングすることを可能とする。
形成に関与する機構を解明することにより、すなわち、
免疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲ
γ）、Ｆｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）、ミエリン塩基
性タンパク質（ＭＢＰ）が、ミエリン形成シグナル分子
として働くこと、及びこれらのシグナル分子が、ＦｃＲ
γ−Ｆｙｎ−ＭＢＰからなるシグナルカスケードとして
ミエリン形成に関与していることを解明したことによっ
て、該シグナル分子を欠損させ、ミエリン発達障害を起
した非ヒト動物を作製することを可能とした。また、該
シグナル分子を欠失したミエリン発達障害モデル非ヒト
動物が、多発性硬化症（ＭＳ）等の脱髄疾患を発症する
ことから、このミエリン発達障害モデル非ヒト動物を用
いて、ミエリン発達調節物質及び脱髄疾患の治療薬をス
クリーニングすることを可能とする。
【００６４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION
<120> Model non-human animals with development disorder of
myelin
<130> A031P83
<140>
<141>
<160> 14
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Sense primer
<400> 1
ctcaagatcc aggtccga 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Antisense
primer
<400> 2
ctactggggt ggtttttcat 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Sense primer
<400> 3
aggcacagag ctttggtct 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Antisense
primer
<400> 4
ctggtaaagg ccatcgtgc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Sense primer
<400> 5
aaatgaactc tactactaaa 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Antisense
primer
<400> 6
cttttactac agcaattctg aa 22
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Sense primer
<400> 7
gaacagccgt tcagatct 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Antisense
primer
<400> 8
ttcgtctcac agttcagg 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Sense primer
<400> 9
ctaaggtgcc atagctgcag g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Antisense
primer
<400> 10
ctgattgaca gggacttcct c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Sense primer
<400> 11
gtgaggtatc atcactacag t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Antisense
primer
<400> 12
ggttctggta atcatgctct g 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Sense primer
<400> 13
tggtcgtcga caacggct 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Antisense
primer
<400> 14
tttacggatg tcaacgtcac 20
【図１】インビトロでのＯＰＣ（オリゴデンドログリア
前駆体細胞）及び幼若オリゴデンドログリアにおけるＦ
ｃＲγ発現の様子を示す図である。
前駆体細胞）及び幼若オリゴデンドログリアにおけるＦ
ｃＲγ発現の様子を示す図である。
【図２】インビボでのＦｃＲγ発現細胞の分布の様子を
示す図である。脳の冠状切片を示す。
示す図である。脳の冠状切片を示す。
【図３】インビボでのオリゴデンドログリア系統におけ
るＦｃＲγ陽性細胞の検出を示す図である。
るＦｃＲγ陽性細胞の検出を示す図である。
【図４】インビトロでのＦｃＲγシグナルの活性化の様
子を示す図である。
子を示す図である。
【図５】ＦｃＲγ欠損マウス、Ｆｙｎ欠損マウス、及び
ＭＢＰ欠損マウスを比較対照した結果を示す図である。
ＭＢＰ欠損マウスを比較対照した結果を示す図である。
【図６】ＦｃＲγ非存在下における脱髄の様子を示す図
である。
である。
【図７】オリゴデンドログリア内で、ＦｃＲγと、Ｆｃ
γＲＩ／III及びＣＤ４５との共発現の様子を示す図で
ある。
γＲＩ／III及びＣＤ４５との共発現の様子を示す図で
ある。
【図８】シグナル分子の関与とミエリン形成機構を説明
する図である。
する図である。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｑ 1/02 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
33/50 Ａ６１Ｋ 37/48
Claims (18)
- 【請求項１】 オリゴデンドログリアにおけるミエリン
形成シグナル分子の欠損により、ミエリン形成が阻害さ
れ、脱髄疾患を発症したことを特徴とするミエリン発達
障害モデル非ヒト動物。 - 【請求項２】 脱髄疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）であ
ることを特徴とする請求項１記載のミエリン発達障害モ
デル非ヒト動物。 - 【請求項３】 ミエリン形成シグナル分子の欠損が、免
疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）
及び／又はＦｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）のシグナル
分子の欠損であることを特徴とする請求項１又は２記載
のミエリン発達障害モデル非ヒト動物。 - 【請求項４】 ミエリン形成シグナル分子の欠損が、ミ
エリン形成を調節するシグナルカスケードの阻害である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のミエリ
ン発達障害モデル非ヒト動物。 - 【請求項５】 ミエリン形成を調節するシグナルカスケ
ードの阻害が、免疫グロブリンＦｃ受容体のγサブユニ
ット（ＦｃＲγ）−Ｆｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）−
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）からなるシグナル
カスケードの阻害であることを特徴とする請求項４記載
のミエリン発達障害モデル非ヒト動物。 - 【請求項６】 非ヒト動物がマウスであることを特徴と
する請求項１〜５のいずれか記載のミエリン発達障害モ
デル非ヒト動物。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか記載のミエリン
発達障害モデル非ヒト動物に被検物質を投与すること又
は該動物由来の組織、器官若しくは細胞を被検物質と接
触させることを特徴とするミエリン発達調節物質のスク
リーニング方法。 - 【請求項８】 請求項１〜６のいずれか記載のミエリン
発達障害モデル非ヒト動物に被検物質を投与すること又
は該動物由来の組織、器官若しくは細胞を被検物質と接
触させ、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の発現又
はミエリンの形成を測定又は評価することを特徴とする
請求項７記載のミエリン発達調節物質のスクリーニング
方法。 - 【請求項９】 ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の
発現又はミエリンの形成の測定又は評価を、ミエリン発
達障害モデル非ヒト動物の場合と野生型非ヒト動物の場
合を比較・評価することにより行うことを特徴とする請
求項８記載のミエリン発達調節物質のスクリーニング方
法。 - 【請求項１０】 非ヒト動物がマウスであることを特徴
とする請求項７〜９のいずれか記載のミエリン発達調節
物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１１】 請求項７〜１０のいずれか記載のミエ
リン発達調節物質のスクリーニング方法により得られる
ミエリン発達調節物質。 - 【請求項１２】 請求項１〜６のいずれか記載のミエリ
ン発達障害モデル非ヒト動物を、脱髄疾患の治療薬のス
クリーニングに使用することを特徴とする脱髄疾患治療
薬のスクリーニング方法。 - 【請求項１３】 脱髄疾患治療薬が、多発性硬化症（Ｍ
Ｓ）の治療薬であることを特徴とする請求項１２記載の
脱髄疾患治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項１４】 請求項１２又は１３記載の脱髄疾患治
療薬のスクリーニング方法により得られる脱髄疾患治療
薬。 - 【請求項１５】 ミエリン形成シグナル分子を有効成分
とすることを特徴とする脱髄疾患治療薬。 - 【請求項１６】 ミエリン形成シグナル分子が、免疫グ
ロブリンＦｃ受容体のγサブユニット（ＦｃＲγ）及び
／又はＦｙｎチロキシナーゼ（Ｆｙｎ）のシグナル分子
であることを特徴とする請求項１５記載の脱髄疾患治療
薬。 - 【請求項１７】 免疫グロブリンＩｇＧからなる静脈内
免疫グロブリン療法用脱髄疾患治療薬。 - 【請求項１８】 脱髄疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）で
あることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか記載
の脱髄疾患治療薬。
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|---|---|---|---|
| JP2001274232A JP2003079270A (ja) | 2001-09-10 | 2001-09-10 | ミエリン発達障害モデル非ヒト動物 |
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