FI120352B - Menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseksi, ihmisen koolonin epiteelisolujen viljelemiseen ja immortalisoimiseen sopiva seerumia sisältämätön viljelyalusta, ihmisen koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja, menetelmä suolikanavan.... - Google Patents

Menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseksi, ihmisen koolonin epiteelisolujen viljelemiseen ja immortalisoimiseen sopiva seerumia sisältämätön viljelyalusta, ihmisen koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja, menetelmä suolikanavan.... Download PDF

Info

Publication number
FI120352B
FI120352B FI971628A FI971628A FI120352B FI 120352 B FI120352 B FI 120352B FI 971628 A FI971628 A FI 971628A FI 971628 A FI971628 A FI 971628A FI 120352 B FI120352 B FI 120352B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cells
epithelial cells
cell line
human colon
colon epithelial
Prior art date
Application number
FI971628A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI971628A0 (fi
FI971628A (fi
Inventor
Stephanie Blum
Original Assignee
Nestle Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nestle Sa filed Critical Nestle Sa
Publication of FI971628A0 publication Critical patent/FI971628A0/fi
Publication of FI971628A publication Critical patent/FI971628A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120352B publication Critical patent/FI120352B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/395—Thyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseksi, ihmisen koolonin epiteelisolujen viljelemiseen ja immortalisoimiseen sopiva seerumia sisältämätön viljelyalusta, ihmisen koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja, menetelmä suolikana-van solujen metaboliaan mutageenisen, toksisen tai hyödyllisen vaikutuksen omaa-5 van aineen identifioimiseksi, edellä mainittujen immortalisoitujen epiteelisolujen käyttö sellaisen aineen identifioimiseksi in vitro, niiden käyttö valmistettaessa aktiivisia farmaseuttisia aineita, sekä diagnostinen kitti - Förfarande för immortalisering av humana kolonepitelceller, serumfritt odlingsmedium lämpligt för odling och immortalisering av humana kolonepitelceller, human kolons immortaliserad epitelcellinje, 10 förfarande för identifiering av ämne med mutagen, toxisk eller nyttig inverkan pä metabolin hos tarmkanalens celler, användning av ovan nämnda immortaliserade epitelceller för identifiering av sädant ämne in vitro, användning av dessa vid fram-ställning av aktiva farmaceutiska ämnen, och diagnostiskt kit 15 Esillä olevan keksinnön kohteena on seerumia sisältämätön viljelyalusta, joka sopii ihmisen koolonin epiteelisolujen viljelemiseen ja immortalisoimiseen ja joka sisältää epäorgaanisia suoloja, glukoosia, natriumpyruvaattia, aminohappoja, BSA:a, etano-liamiinia, fosforyylietanoliamiinia, vitamiineja ja hormoneja.
20 Esillä olevan keksinnön kohteena on myös menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseksi, ihmisen koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja sekä menetelmä aineen, jolla on mutageeninen, toksinen tai hyödyllinen vaikutus suolikanavan solujen metaboliaan, identifioimiseksi.
25 Esillä olevan keksinnön kohteena on lisäksi diagnostinen kitti.
Ihmisen tautien, kuten esimerkiksi infektioiden, tulehdusten tai syöpien tutkimukseen sopivia ihmissolulinjoja on yritetty kehittää monta vuotta. Niihin soluihin, jotka usein osallistuvat tautien käynnistymiseen, kuuluvat myös epiteelisolut, erityisesti 30 suolistokanavan epiteelisolut, jotka ovat herkkiä ihmiskehon ympäristölle, ja erityisesti sen ruokavalio.
Ihmissolun muista soluista epiteelisolut eroavat siinä suhteessa, että ne ekspressoi-vat pääasiallisesti epiteelisoluissa löydettäviä yhdisteitä tai rakenteita. Näitä ovat 2 esimerkiksi sytokeratiinit (Moll et ai., Cell, 31, 11-24, 1982), solujen väliset yhdysra-kenteet (Gumbiner et ai., Cell, 69, 385-387,1992), alkalinen fosfataasi, joka on spesifinen suolelle (Dudeja et ai., Gastroenterlogy, 105. 357-366, 1993), sytokromit P450 (Mercurio et ai., Biochem. Biophy. Research Communications, 210. No. 2, 5 350-355, 1995; McKinnon et ai., Gut, 36, 259-267,1995), entsyymit, jotka ottavat osaa solujen puolustautumiseen hapettumista vastaan (Cu/Zn-superoksididismu-taasi, glutationiperoksidaasi ja katalaasi; Albers et ai., Toxicology and Applied Pharmacology, 109. 507-513, 1991) ja/tai elektrofiilien detoksifiointiin (glutationi-S-transferaasi ja kinonireduktaasi; Chenevix- Trench et ai., Carcinogenesis, 16, No. 7, 10 1655-1657, 1995) ja vimentiini (Richard et ai., Arch. Dematol. Res., 282. 512-515, 1990).
Ihmisen suolistokanavan epiteelisolut kykenevät lisäksi kiinnittämään maitohappobakteereita in vitro (Bernet et ai., Gut. 35, 483-489, 1994; US 5,032,399).
15
Ihmisen koolonin epiteelisolut eroavat lopuksi muista ihmisen epiteelisoluista siinä suhteessa, että ne ekspressoivat yhdisteitä tai rakenteita, joita on löydettävissä pääasiallisesti ihmisen suolen epiteelisoluista. Näitä ovat esimerkiksi pinnan nukka-lisäkkeet (Friedrich et ai., Bioassays, 12, No. 9, 403-408, 1990), sakkaroosi-isomal-20 taasi (Gibson et ai., Gut, 35, 791-797, 1994; Paul et ai., Am. Pysiol. Soc., C266-C278, 1993), tietyt luokan II MHC-antigeenit (Mayer et ai., Gastroenterology, 100.
3-12,1991), ja dipeptidyylipeptidaasi IV (DPPIV; Hauri et ai., J. Cell. Biol., 101, 836-851, 1985).
25 Ihmisen koolonin epiteelisolulinja voidaan valmistaa selektoimalla ihmisen syöpäsoluja. Stauffer et ai. ovat siten kuvanneet kahden solulinjan, NCM356:n ja NCM425:n, selektoinnin, jossa tehdään p53-mutaatio ja jossa ekspressoidaan erityisesti tuumoriantigeeni CEA (The American journal of surgery, 169. 190-196, 1995). Nämä solut edustavat tuumorigeenistä transformaatiovaihetta ja ne ovat mielenkiin-30 toisia tutkimuksissa, joiden kohteena on epiteelisolujen tuumorigeenisen transformaation kehittäminen.
Myös muita ihmisen koolonin epiteelisolulinjoja, jotka on eristetty ihmisen koolonin adenoomasta, tunnetaan, kuten esimerkiksi solulinjat CaCO-2 (ATCC HTB37; Fogh 3 et ai., J. Natl. Cancer Inst., 58, 209-214, 1977) ja HT29 (ATCC HTB38; Fogh et ai., Human tumour Cells In Vitro, 145-159, 1975).
Lisäksi on mahdollista immortalisoida normaaleja soluja, so. antaa niille kyky lisään-5 tyä määräämättömän kauan. Normaalit solut eivät itse asiassa pysy hengissä kymmentä viljelykertaa kauempaa. Tähän tarkoitukseen käytetään yleensä tekniikoita, joissa solut transfektoidaan erityisesti muokattujen vektoreiden avulla, kuten SV40-vektorilla, joka sisältää suuren T-antigeenin sekvenssin (R.D. Berry et ai., Br. J. Cancer, 5Z, 287-289,1988), tai vektorilla, joka sisältää ihmisen papilloomaviruksen 10 DNA-sekvenssejä (US 5,376,542).
Sanderson et ai. ovat siten immortalisoineet sikiön ohutsuolen normaaleja soluja (Int. Arch. Allergy Immunol., 107. 396-397, 1995). Nämä solut ovat kuitenkin yhä fysiologisesti kaukana normaaleista aikuisista soluista.
15 Tähän mennessä ei ole raportoitu mitään aikuisen ihmisen koolonin normaalien epiteelisolujen immortalisointia. Vaikkakin immortalisointitekniikat tunnetaan, edelleen on yhä vaikea löytää ihmissolun immortalisointiin optimaaliset olosuhteet niin, että solu säilyttää alkuperäiset ominaisuutensa ilman merkkejä tuumorigeenisestä trans-20 formaatiosta.
Yksi immortalisoitujen solujen lisääntymisehdoista on niiden kasvu jossain tietynlaisessa viljelyäIustassa. Kirjallisuudessa kuvatut viljelyalustat ovat kukin spesifisiä jollekin solutyypille, eikä niitä voida helposti soveltaa muihin solutyyppeihin. Esimerk-25 kinä mainittakoon seerumia sisältämättömät alustat, joita ovat kuvanneet Gibson et ai. (Gut, 35, 791-797, 1991), Pfeifer et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 5123-5127, 1993) ja Kulkani et ai. (Carcinogenesis, 16, No. 10, 2515-2521, 1995).
Keksinnön tavoitteena on tuoda käyttöön uusia ihmisen koolonin epiteelisolulinjoja, 30 jotka ovat geneettisesti ja fysiologisesti niin lähellä ihmisen koolonin normaaleja epiteelisoluja, että näitä on vaikea erottaa. Tarkemmin sanoen nämä solulinjat eivät ekspressoi tuumori ma rkkereita. Nämä solulinjat ekspressoivat lisäksi lukuisia spesifisiä markkereita, joita on ihmisen koolonin normaaleissa epiteelisoluissa.
4 Tätä tavoitetta silmälläpitäen keksinnön mukaiselle seerumia sisältämättömälle alustalle on tunnusomaista se, että alusta sisältää hivenaineita, C-vitamiinista ja retino-iinihaposta muodostuvia vitamiineja ja trijodityroniinista, deksametasonista, hydrokortisonista, naudan aivolisäkeuutteesta, insuliinista, EGF:sta ja transferriinistä muo-5 dostuvia hormoneja.
Keksinnön mukaiselle uudelle menetelmälle ihmisen koolonin epiteelisolujen immor-talisoimiseksi on tunnusomaista se, että menetelmässä valmistetaan ihmisen koolo-nista saatujen, primääristen epiteelisolujen viljelmä, viljelmä infektoidaan rekombi-10 nanttiviruksella ja immortalisoituja soluja viljellään jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisessa seerumia sisältämättömässä viljelyalustassa.
Keksinnön mukaisen ihmisen koolonin immortalisoidun epiteelisolulinjan tunnuspiirteet on esitetty itsenäisessä patenttivaatimuksessa 11.
15
Keksinnön mukaiselle menetelmälle aineen, jolla on mutageeninen, toksinen tai hyödyllinen vaikutus suolikanavan solujen metaboliaan, identifioimiseksi, on tunnusomaista se, että menetelmässä in vitro (1) aine, jonka epäillään olevan mutageeninen, toksinen tai hyödyllinen suolikanavan solujen metabolialle, saatetaan reagoi-20 maan viljelmän, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksen 11-16 mukaista solulinjaa, kanssa, viljellään tämän viljelmän kanssa tai saatetaan kosketukseen tämän viljelmän kanssa, ja (2) määritetään tai mitataan mainitun aineen vaikutukset tähän so-lulinjaan.
25 Keksinnön mukaiselle diagnostiselle kitille on tunnusomaista se, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 11-16 mukaisia ihmisen koolonin immortalisoituja epiteelisoluja, jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaista viljelyalustaa, ja reagensseja, joilla määritetään näiden solujen metabolinen vaste aineille, jotka ovat mutageenisiä, toksisia tai hyödyllisiä suolikanavan solujen metabolialle.
30
Keksinnön kohteena on myös jonkin patenttivaatimuksen 11-16 mukaisten ihmisen koolonin immortalisoitujen epiteelisolujen käyttö menetelmissä, joilla identifioidaan in vitro aineet, jotka ovat mutageenisiä, toksisia tai hyödyllisiä suolikanavan solujen metabolialle.
5
Keksinnön kohteena on lopuksi jonkin patenttivaatimuksen 11-16 mukaisten ihmisen koolonin immortalisoitujen epiteelisolujen käyttö valmistettaessa aktiivisia farmaseuttisia aineita.
5 Piirustuksissa:
Kuvio 1: Ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseen käytetty vektori pl_XSHD+SV40+.
10 Kuvio 2: Eri solulinjojen, jotka on saatu ihmisen koolonin epiteelisoluista, eks- pressoima suolen alkalisen fosfataasin aktiivisuus.
Kuvio 3: Niiden keksinnön mukaisten immortalisoitujen epiteelisolujen prosen tuaalinen määrä, jotka ekspressoivat luokan II MHC (HLA)-antigeenejä 15 gamma-interferonin läsnä ollessa, ajan funktiona.
Esillä olevan keksinnön yhteydessä ilmaisut "normaalit solut", "primääriset solut" tai "immortalisoimattomat solut" tarkoittavat ihmisen koolonin epiteelisoluja, joita voidaan saada terveen aikuisen, jolla ei ole vammauttavia fysiologisia tai geneettisiä 20 sairauksia, koolonista ja joita voidaan viljellä rajoitettu aika ilman, että ne menettävät alkuperäiset erilaistumisominaisuutensa.
Ilmaisulla "immortalisoidut solut" tarkoitetaan taas soluja, jotka on muokattu geneettisesti DNA-konstruktion avulla, joka antaa niille kyvyn lisääntyä rajattomasti, 25 so. yli 60 viljelykertaa. Stauffer'in et ai. valitsemia syöpäsoluja tai solulinjoja CaCO-2 ja HT29 ei siten pidetä soluina, jotka on immortalisoitu esillä olevan keksinnön mukaisesti.
Sana "viljelykerta" tarkoittaa samoin tapahtumaa, jossa otetaan osa solulinjan kon-30 fluentista viljelmästä, siirrostetaan tuoreeseen alustaan ja viljellään solulinjaa, kunnes konfluenssi tai täysimääräisyys saavutetaan. Solulinjoja viljellään siten traditionaalisesti viljelemällä peräkkäisiä kertoja tuoreissa alustoissa. Huomattakoon, että solulinjat voivat menettää alkuperäiset erilaistumisominaisuutensa usean peräkkäisen viljelykerran jälkeen. Sen vuoksi on erittäin edullista kyetä käyttämään sellaista 6 solulinjaa, jonka ominaisuudet säilyvät myös lukuisten viljelykertojen, mieluummin vähintään 60 viljelykerran jälkeen.
Ilmaisulla "alkuperäiset erilaistumisominaisuudet" tarkoitetaan sekä erityisesti ihmi-5 sen epiteelisoluissa löydettäviä markkereita että erityisesti ihmisen koolonin epiteelisoluissa löydettäviä erilaistumismarkkereita.
Keksinnön mukaiset ihmisen koolonin immortalisoidut epiteelisolulinjat eivät eks-pressoi tuumorimarkkereita, so. niissä ei ole karsinogeenisia mutaatioita, eivätkä ne 10 ekspressoi lähetti-RNA-molekyylejä (mRNA) tai erilaistuneita solurakenteita ja/tai proteiineja, jotka ovat tunnusomaisia solujen muuntumiselle tuumorisoluiksi. Näiden markkereiden läsnäolo voidaan detektoida esimerkiksi hybridisaation tai mRNA:n RT-PCR:n avulla käyttämällä spesifisiä radioleimattuja koettimia. Markkerin läsnäolo solussa ei tarkoita sitä, että tämä solu kykenee antamaan muutaman kuukauden 15 kuluttua syövän hiirelle, jolla ei ole immunopuolustuskykyä, vaan pikemminkin se kuvaa solujen tuumorigeenistä muuntunutta tilaa verrattuna niihin alkuperäisiin soluihin, joista ne on saatu.
Suositeltavaa on, että esillä olevan keksinnön mukaisessa solulinjassa ei ole p53-20 mutaatiota (Lavigeur et ai., Mol. Cell. Biol., 9, 3982-3991, 1989; Donehower et ai., Nature, 356. 215-221, 1992), karsinoembryonaalista antigeeniä (CEA; Stauffer et ai.) ja/tai mutaatiota APC-geenissä (adenomatoosi polyposis coli; Hargestet ai.,
Gut, 3Z, 826-829, 1995).
25 Toisaalta keksinnön mukaiset epiteelisolulinjat ekspressoivat metaboliamarkkereita, jotka ovat spesifisiä ihmisen normaaleille epiteelisoluille. Tämä markkeri voi olla lä-hetti-RNA (mRNA), proteiini ja/tai erilaistunut solurakenne, joka yleensä on löydettävissä vain pääosassa ihmisen epiteelisoluja ja joka voidaan saada esimerkiksi ihosta, silmästä, suolikanavasta tai maksasta. Keksinnön mukaiset ihmisen epiteelisolut 30 voivat sen vuoksi ekspressoida vähintään kaksi markkeria, joita on löydettävissä erityyppisistä epiteelisoluista. Keksinnön mukaiset solut ekspressoivat mieluummin tällaiset markkerit valittuna joukosta, johon kuuluvat ainakin sytokeratiinit, solujen väliset yhdysrakenteet (joista käytetään myös nimitystä "tight junctions"-rakenteet), suolen alkalinen fosfataasi, sytokromit P450, glutationi-S-transferaasi (GST), kinoni- 7 reduktaasi (QR), Cu/Zn-superoksididismutaasi (SOD), glutationiperoksidaasi (GP) ja katalaasi (CA).
Keksinnön mukaiset solulinjat voivat sen vuoksi ekspressoida entsyymejä, jotka ot-5 tavat osaa solujen hapettumiseen (SOD, GP ja CA) ja/tai elektrofiilien etoksifiointiin (GST ja QR). Nämä solulinjat sopivat siten erityisesti ihmisen koolonin tulehdusilmi-öiden tai limakalvojen ärsyyntymisten tutkimiseen.
Keksinnön mukaiset solulinjat ekspressoivat myös metabolisia erilaistumis-markke-10 reita, jotka ovat spesifisiä ihmisen koolonin immortalisoimattomille epiteelisoluille. Tämä markkeri voi olla mRNA, proteiini tai erilaistunut solurakenne, joka on löydettävissä vain koolonin epiteelisoluista. Suositeltavaa on, että keksinnön mukaiset solulinjat ekspressoivat metabolisena erilaistumismarkkerina vähintään kahta markke-ria valittuna joukosta, johon kuuluvat pinnan nukkalisäkkeet, sakkaroosi-isomaltaasi, 15 luokan II MHC:t, jotka ovat spesifisiä koolonin epiteelisoluille, ja dipeptidyyIipepti-daasi IV.
Keksinnön mukaiset solulinjat ekspressoivat samoin mieluummin luokan II MHC:n (MHC2) HLA-DR-ja HLA-DP-antigeenejä eivätkä ekspressoi HLA-DQ-antigeeniä ih-20 misen gamma-interferonin läsnä ollessa (HI_A-DQ:n ekspressio on liitetty tuumori-geenisyyteen.
Keksinnön mukaisten solulinjojen tulisi kyetä kiinnittämään in vitro Lactobacillus johnsonii-kannan CNCM-1225. Tätä tarkoitusta varten maitohappobakteerin viljel-25 mä on vain levitettävä keksinnön mukaisen solulinjan konfluentin viljelmän päälle, konfluenttiviljelmä on pestävä ja sen jälkeen on mitattava solulinjojen nukkalisäkkei-siin kiinnittyneiden bakteereiden määrä. Suotavaa on, että keksinnön mukainen so-lulinja kykenee kiinnittämään in vitro maitohappobakteerin CNCM-1225-kantaa vähintään 80 bakteeria 100 keksinnön koolonisolua kohti, erityisesti 80-200.
30
Keksinnön yhteydessä esitettyjen solulinjojen tulisi myös kyetä kiinnittymään in vitro Clostridium difficile-bakteereihin ja/tai muihin kiinnittyviin maitohappobaktee-reihin, kuten bifidobakteereihin, erityisesti bifidobakteereihin, joita on kuvattu julkaisuissa Applied Env. Microb., 59, 4121-4128, 1993 ja EP577904 (Nestle) ja jotka on 8 tallennettu Pasteur Institut-kokoelmaan, Pariisi, Ranska, jossa ne saivat vastaavasti tallennusnumerot CNCM 1-1226, CNCM 1-1227 ja CNCM 1-1228.
Keksinnön yhteydessä esitettyjen solulinjojen tulisi myös kyetä ekspressoimaan mo-5 nia sytokiinejä, sen jälkeen kun ne ovat olleet kosketuksessa tulehdusagenssin kanssa, erityisesti esimerkiksi sytokiinit IL-Ιβ, IL-IRa, TNFa, IL-6 ja IL-8.
Keksinnön kohteena on myös erityisesti keksinnön mukainen immortalisoitu solulin-ja, joka on tallennettu 16.4.1996 DSM-kokoelmaan, (Deutsche Sammlung Von Mik-10 roorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Saksa), jossa sille annettiin tallennusnumero DSM ACC2258.
Keksinnön mukaiset ihmisen koolonin epiteelisolulinjat säilyttävät edullisesti alkuperäiset erilaistumisominaisuutensa myös lukuisten kasvatuskertojen jälkeen, erityises-15 ti vähintään 40-80 kerran jälkeen. 40. kerran jälkeen tai jopa aikaisemminkin voidaan kuitenkin solulinjojen karyotyypissä havaita muutos kromosomifragmenttien häviämisen jälkeen. Nämä solulinjat yleensä kuitenkin säilyttävät sellaisenaan jokaisen kromosomiparin ryhmän ehjänä, mikä sallii myös alkuperäisten erilaistumisomi-naisuuksiensa ekspression säilymisen.
20
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös seerumia sisältämätön viljelyalusta, jossa keksinnön mukaisia ihmisen koolonin epiteelisoluja voidaan viljellä ja immortalisoida. Tämä viljelyalusta sopii erityisesti keksinnön mukaisten solulinjojen alkuperäisten erilaistumisominaisuuksien säilyttämiseen rajattomasti peräkkäisten viljelykertojen 25 aikana. Jos käytetään muita viljelyalustoja, keksinnön mukaiset solulinjat saattavat menettää alkuperäiset erilaistumisominaisuutensa muutaman peräkkäisen viljelyker-ran, esimerkiksi 5-10 viljelykerran jälkeen. Tämä alusta on myös oleellinen solulinjojen keksinnön mukaisen immortalisoinnin onnistumiselle. Jonkin sen tunnusomaisen komponentin vähentäminen johtaa siten usein siihen, että koolonin epiteelisolujen 30 keksinnön mukainen immortalisointi epäonnistuu.
Tämä alusta voi sisältää kaikki komponentit, joita tavallisesti on eläinsolujen seerumia sisältämättömissä viljelyalustoissa, so. esimerkiksi epäorgaanisia suoloja, glukoosia, puskuria (HEPES, esimerkiksi: Biofluids), natriumpyruvaattia, aminohappoja, 9 BSA:a, fosforyylietanoliamiinia, etanoliamiinia, vitamiineja ja hormoneja. Tämän alustan valmistamisessa voidaan perustana siten käyttää kaupallisia viljelyalustoja, kuten DMEM-alustaa (Biofluids Inc., USA).
5 Keksinnön mukaisen alustan uutuus on eräiden sen komponenttien uudessa yhdistelmässä, kun taas muut tavallisesti tarvittavat yhdisteet voivat vaihdella alan ammattimiesten tietämissä rajoissa. Näitä oleellisia komponentteja ovat hivenaineet, C-vitamiinista ja retinoiinihaposta muodostuvat vitamiinit ja trijodityroniinista, deksa-metasonista, hydrokortisonista, naudan aivolisäkeuutteesta, insuliinista, EGF:sta ja 10 transferriinistä muodostuvat hormonit.
Tässä viljelyalustassa voi siten olla mukana seuraavat: 1-100 nM hivenaineet, 10-1000 nM retioniinihappo, 10-1000 nM trijodityroniini (T3), 0,1-50 nM deksameta-soni, 1-100 nM hydrokortisoni, 1-100 μς/ιηΙ vitamiini C, 1-100 μς/ηηΙ naudan aivo-15 lisäkeuute, 0,1-50 μς/ιηΙ insuliini, 0,1-50 ng/ml EGF ja 0,1-100 μς/ηηΙ transferriini.
Hivenaineista voidaan valita yhdisteet joukosta, johon kuuluvat esimerkiksi seleeni, mangaani, silikaatti, molybdeeni, vanadiini, nikkeli, tina ja näiden suolat.
20 Epäorgaanisista suoloista, joita tavallisesti alustassa on mukana, voidaan valita suolat joukosta, johon kuuluvat esimerkiksi natriumkloraatti, kaliumkloraatti, kaliumsul-faatti, kalsiumkloraatti, kaksiemäksinen natriumfosfaatti, natrium-bikarbonaatti, rau-ta(III)nitriitti, ammoniummetavanadaatti, ammoniummolybdaatti, kupari(II)sulfaatti, magnesiumkloraatti, mangaanikloraatti, nikkelisuIfaatti, natriumasetaatti, natriumpy-25 ruvaatti, natriumseleniitti, natriumsilikaatti, tinakloraatti ja sinkkisulfaatti.
Erityisesti tulisi pitää huolta siitä, että alusta sisältää kalsiumia alle 80 μηι epäorgaanisina suoloina, jotta estettäisiin kontaminoivien fibroplastien kehittyminen. Kalsiumin konsentraatio voidaan kuitenkin nostaa arvoon 1 mM, joka oli tarpeen eräis-30 sä kokeissa (polarisointi, tight junction-proteiinien ekspressio jne.). Muutamien vilje-lykertojen jälkeen fibroplastien lisääntymisvaaraa ei enää ole, koska fibroplastit saattavat olla primääristen solujen prosessoinnista johtuvia varhaisvaiheen konta-minantteja.
10
Muista vitamiineista, joita tavallisesti laitetaan mukaan alustaan, voidaan samoin valita muita vitamiineja valittuna joukosta, johon kuuluvat esimerkiksi kalsium D-pantotenaatti, koliinikloraatti, foolihappo, inositoli, nikotiiniamidi, pyridoksiini, ribo-flaviini, tiamiini, biotiini ja syanokobalamiini.
5
Viljelyalustalla, joka tekee mahdolliseksi saada menestyksellisesti keksinnön mukaisia solulinjoja, on mieluummin jäljempänä esitetyssä taulukossa 1 määritelty koostumus B50.
10 Keksinnön kohteena on myös menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortali-soimiseksi, jossa menetelmässä valmistetaan ihmisen koolonista saatujen primääristen epiteelisolujen viljelmä, viljelmä infektoidaan rekombinanttiviruksella ja immorta-lisoituja soluja viljellään edellä kuvatussa seerumia sisältämättömässä viljelyalustas-sa.
15 Tätä ennen on suositeltavaa käyttää seuraavia vaiheita: (1) otetaan näyte ihmisen koolonin epiteelikudoksesta; (2) tämä näyte preparoidaan sen in vitro-viljelyä varten; 20 (3) epiteelisolut siirrostetaan seerumia sisältämättömään viljelyalustaan ja viljely- maljoille, joissa on päällystyskerros, joka edistää solujen kiinnittymistä ja niiden kasvua; (4) alusta vaihdetaan niin monta kertaa kuin on tarpeen konfluenttikasvun optimoimiseksi; 25 (5) solut infektoidaan rekombinanttiviruksella; (6) immortalisoituja soluja viljellään edellä kuvatussa seerumia sisältämättömässä viljelyalustassa.
Vaiheessa 1) on kyse koolonisolujen näytteiden ottamisesta normaaleilta ihmisiltä 30 suolistokanavaan tehtyjen kirurgisten toimenpiteiden aikana. Vaiheessa 2) näyte voidaan pestä viljelyalustassa, leikata paloiksi ja epiteeliosa erottaa muista kudoksista fysikaalisin ja/tai kemiallisin keinoin. Kudospalat voidaan esimerkiksi laittaa liuokseen, joka sisältää noin 0,5 % trypsiiniä ja 0,1 % EDTA:a, niin kauan, että solut 11 eroavat, minkä jälkeen lisätään muutamaksi minuutiksi trypsiinin inhibiittoria ja lopuksi lisätään viljelyalustaa, mieluummin edellä kuvattua alustaa.
Vaiheessa 3) voidaan epiteelisolut siirrostaa maljoille seerumia sisältämättömään 5 alustaan, mieluummin edellä kuvattuun alustaan. Viljelymaljoissa on mieluummin päällystyskerros, joka muodostuu fibronektiinin, BSA:n ja tyypin 1 kollageenin liuoksesta (kts. Lechner et ai., J. Tissue Cult. Meth., 9, 43-48, 1985).
Vaiheessa 4) vaihdetaan epiteelisoluja sisältävä viljelyalusta niin monta kertaa kuin 10 on tarpeen konfluenttikasvun optimoimiseksi. Alusta korvataan mieluummin joka toinen päivä. Sen jälkeen kun on päästy noin 90 % konfluenssiin käytettävästä olevasta pinta-alasta, mihin yleensä kuluu 10 päivää siirrostamisen jälkeen, solut erotetaan käsittelemällä trypsiinin ja EDTA:n liuoksilla.
15 Erotetut solut siirretään vaiheessa 5) infektointialustaan, esimerkiksi edellä kuvattuun alustaan, viljelymaljoilla, joissa mieluummin on edellä kuvattu päällystyskerros. Sen jälkeen solut infektoidaan tavalliseen tapaan eri rekombinanttiviruksella. Alan ammattimiesten käytettävissä on lukuisia transfektointitekniikoita. Esimerkkeinä voidaan mainita tekniikat, joita ovat kuvanneet Claudia Chen et ai. patenttijulkaisus-20 sa W096/07750 (Mol. and Cell. Biol., 7, 2745-2752, 1987) tai Wilson et ai. (Analytical Biochemistry, 226. 212-220, 1995).
Mieluummin käytetään SV40-rekombinanttivirusta, joka sisältää T-antigeenin (T-Ag), inaktivoidun viruksen replikaation aloituskohdan (MuLV-retrovirus) ja selektoitavan 25 geenin. Esimerkiksi voidaan käyttää kuviossa 1 esitettyä konstruktiota, jonka sekvenssi on saatavissa GeneBank-tietokannasta (tallennusnumero M64753; Stockshla-eder et ai., Human Gen. Therapy, 2, 33-39, 1991). Alan ammattimiehet voivat helposti rakentaa myös muita sopivia vektoreita kaupallisesti saatavissa olevista vektoreista, jotka sisältävät esimerkiksi T-Ag:ta koodaavaan geenin, selektoitavan geenin 30 ja/tai ihmisen replikaation alkukohdan. Esimerkkinä voidaan mainita plasmidit ATCC37460 ja ATCC37640, jotka sisältävät T-Ag:ta koodaavan geenin.
Vaiheessa 6) siirretään epiteelisolut tuoreeseen kasvualustaan viljelymaljoille, jotka mieluummin sisältävät edellä kuvatun päällystyskerroksen.
12
Keksinnön mukaisten epiteelisolulinjojen uusien ja alkuperäisten ominaisuuksien tuntemisen perusteella niitä voidaan ajatella sovellettavan immunologisissa, farmakologisissa ja toksikologisissa tutkimuksissa.
5 Keksinnön mukaiset solulinjat ovat siten erityisen sopivia seulottaessa aineita, jotka ovat mutageenisia, toksisia tai hyödyllisiä suolistokanavan solujen metabolialle. Seulonta voi esimerkiksi olla tapahtumasarja, jossa (1) aine, jonka epäillään olevan mu-tageeninen, toksinen tai hyödyllinen suolikanavan solujen metabolialle, saatetaan reagoimaan keksinnön mukaista solulinjaa sisältävän viljelmän kanssa, viljellään 10 tämän viljelmän kanssa tai saatetaan kosketukseen tämän viljelmän kanssa, ja (2) määritetään tai mitataan tämän aineen vaikutukset tähän solulinjaan.
Sen vuoksi on myös nähtävissä, että voidaan valmistaa diagnostinen kitti, joka sisältää keksinnön mukaisia epiteelisoluja, keksinnön mukaista viljelyalustaa ja reagens-15 seja, joilla määritetään näiden solujen metabolinen vaste mutageenisille, toksisille tai hyödyllisille aineille.
Keksinnön mukaiset solulinjat sopivat myös rekombinanttiproteiinien ekspressointiin. Vieraan DNA:n transfektointimenetelmät ovat nykyään alan ammattimiesten hyvin 20 tuntemia (kts. esimerkiksi WO94/05472).
Keksinnön mukaiset solulinjat saattavat olla myös hyödyllisiä geeniterapiassa ex vivo. Nämä solulinjat saattavat itse asiassa muodostaa sopivan työkalun, jolla voidaan kehittää mielenkiinnon kohteena olevia geenejä ekspressoivia rekombinantti-25 soluja terapeuttiseen käyttöön. Eräs keksinnön mukaisten solulinjojen lisäetu on, että niitä ei saateta alttiiksi eläinseerumille, mikä pienentää huomattavasti viruksien tai muiden patogeenisten aineiden aiheuttamia mahdollisia kontaminaatiovaaroja.
Esillä olevaa keksintöä on jäljempänä kuvattu yksityiskohtaisemmin jäljempänä an-30 netun kuvauksen avulla, joka liittyy keksinnön mukaisten solulinjojen valmistusesi-merkkeihin. Näitä esimerkkejä edeltää kuvaus käytetyistä viljelyalustoista sekä ver-tailuesimerkki. Sanomatta on kuitenkin selvää, että näiden esimerkkien tarkoituksena on havainnollistaa keksintöä eivätkä ne millään tavoin rajoita sitä. Solulinjojen viljely, SV40-vektoreiden valmistaminen, transfektointi ja markkereiden ekspressoin- 13 nin analysointi tehdään Sambrook'in et ai., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989), kuvaamilla menetelmillä, ellei toisin ole mainittu. Prosenttiluvut on laskettu painosta, ellei toisin ole ilmoitettu.
5 Vilielvalustat: Taulukko 1
Komponentit Alusta A50 Alusta B50 Q^koaT Alusta A5° Alusta B5C EPÄORGAANISET Hiven-
SUQIAT . aineet — lOnM
NäCI 6(400 g/1 6/100 g/1
Kcl 0.400 g/1 0,400 g/1 HORMONIT
10 MgS04-7H20 0^200 g/1 0,200 g/1 Insuliini 0,005 g/1 0.005 g/1
CaCl2 0,200 g/1 0,200 g/1 EGF 1 ng/ml 1 ng/ml
NaH2P04-H20 0.13 g/1 0,13 g/1 Transferriini 0,005 g/1 0.005 g/1
NaHCOj 3.7 g/1 3,7 g/1 T3 — 100 nM
Fe(N0j)2-9H20 0.0001 g/1 0,0001 g/1 Deksametasoni — 1 nM
MUUT Hydrokortisoni 10 nM
YHDISTEET Naudan aivo-
Glukoosi 4.50 g/1 4,50 g/1 lisäkeuute — 0,038 g/1
Hepes 20 mM 20 mM
^ Fenolipuna 0,010 g/1 0,010 g/1 ANTIBAKTE-
Natriumpyruvaat ti 0,110 g/1 0*110 g/1 RIAALINEN 0,25 μg/n^l 0,25 μg/ml BSA. 0.3% 0,3% Fungitsoni 2,5 U/ml 2,5U/ml PE 0,5 μΜ 0,5 μΜ Penisilliini 5 pg/ml 5 μg/Inl j AMINOHAPOT Streptomysiini ^g/ml 10og/ml ι L-arginiini-HCl 0,0840 g/1 0.0840 g/1 Gentamysiini ! L-kystiini 0,0480 g/1 0,0480 g/1
L-glutamiini — 2mM
20 Glysiini 0,0300 g/1 0,0300 g/1 L-histidiini 0.0420 g/1 0,0420 g/1 HC1-H20 ! L-isoleusiini 0V1048 g/1 0,1048 g/1 1 L-leusiini 0.1048 g/1 0,1048 g/1 L-lysiini-HCl 0,1462 g/1 0,1462 g/1 L-metioniini 0,0300 g/1 0.0300 g/1 L-fenyylialanii niO.0660 g/1 0,0660 g/1 L-seriini 0,0420 g/1 0,0420 g/1 1 i 25 L-treoniini 0,0952 g/1 0,0952 g/1 j L-tryptofaani 0,0160 g/1 0.0160 g/1 j L-tyrosiini 0,0720 g/1 Q,0720 g/1 L-valiini 0.0936 g/1 Ό,0936 g/1 !
VITAMIINIT
D-Ca-pantote- 0,004 g/1 0,004 g/1
Koliinikloridi 0,004 g/1 0,004 g/1
Foolihappo 0,004 g/1 0,004 g/1 _______ 2q Inositoli 0,008 g/1 0,008 g/1
Nikotiiniamidi 0,004 g/1 0.004 g/1
Pyridoksiini-HC L 0,004 g/1 0,004 g/1
Ribof laviini 0,0004 g/1 0,0004 g/1 i
Tiamiini-HCl 0,004 g/1 0,004 g/1 !
Vitamiini C — 0,030 g/1
Retioniinihappo 10 nM 100 nM _ (PE: fosforyylietanoliamiinin ja etanoliamiinin seos; 1 14
VERTAILUESIMERKKI
Käytetty vektori on Stockshlaeder'in et ai. (GeneBank, tallennusnro M64753; Stockshlaeder et ai., Human Gen. Therapy, 2, 33-39) kuvaama pl_XSHD+SV40+, 5 joka on esitetty kuviossa 1 ja joka sisältää suurta T-antigeeniä koodaavan geenin, selektoitavan histidinolidehydrogenaasi (HSD)-markkerin ja LTR-promoottorin.
SV40-virukset valmistetaan Lynch'in ja Miller'in menetelmän (J. Virol., 65, 3887-3890, 1991) modifioidulla versiolla. Tätä tarkoitusta varten ekotrooppisia solulinjoja 10 Psi2 (Mann et ai., Cell, 33, 153-159, 1983) ja amfotrooppisia solulinjoja PA317 (ATCC CRL9078) viljellään DM EM-alustassa (Dulbecco, USA), joka sisältää 10 % vasikansikiöseerumia, 37 °C:ssa 5 % C02 sisältävän atmosfäärin alla. Nämä linjat transfektoidaan tavanomaisesti erikseen käyttämällä 250 mM CaCI2:a ja 10 μg vektoria pl_XSHD+SV40+. Tämän jälkeen käsitellään trypsiinillä 48 tuntia inkuboinnin 15 jälkeen, sekoitetaan yhtä suuren määrän kanssa ja koko seosta inkuboidaan 37 °C:ssa 5 % C02 sisältävän atmosfäärin alla. Sen jälkeen kun kasvun konfluenssi on 70 %, virukset kerätään seerumia sisältämättömään PC-l-alustaan (Ventrex, USA). Suodattamisen jälkeen (0,45 μίτι, Micropore) virusten määrä määritetään NIH 3T3-soluilla (ATCC CRL 1658).
20
Koolonin primääriset solut saatiin sen jälkeen, kun 69-vuotiaalle naiselle tehtiin biopsia sigmoid diverticulum'in ilmestymisen johdosta. Näyte pestään DMEM-vilje-lyalustassa, leikataan palasiksi, epiteeliosa erotetaan muista kudoksista ja maljoilla olevat epiteelisolut siirrostetaan DMEM-alustaan. ViljelyinäIjoja oli esi-inkuboitu 500 25 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 5 mg ihmisen fibronektiiniä (Sigma), 5 ml Vitrogen 100:a (Collagen Corp. Palo Alto, CA, USA), 50 ml 0,1 % BSA-liuosta (Biofuids) ja loput DMEM-alustaa. Epiteelisoluja sisältävä viljelyalusta vaihdetaan niin monta kertaa kuin on tarpeen konfluenttikasvun optimoimiseksi.
30 Sen jälkeen kun konfluenssissa oli päästy noin 90 %:iin 1 viikon viljelyn jälkeen, solut erotetaan tavanomaisella tavalla käsittelemällä trypsiinin EDTA:n liuoksissa. Erotetut solut siirretään viljelymaljoille, joissa on edellä kuvattu päällystyskerros, edellä kuvatussa A50-alustassa.
15 Tämän jälkeen viljelmät infektoidaan, kun mukana on 8 μς/ιτιΙ polybreeniä ja edellä kuvatulla tavalla valmistettua SV40-rekombinanttivirusta (tiitteri ΙΟ5—107 CFU), joka sisältää T-antigeenin (T-Ag). 2 tunnin inkuboinnin jälkeen viljelmät pestään PBS:ssa ja lisätään tuoretta A50-kasvualustaa.
5
Solujen kasvu on kuitenkin valitettavasti niin alhainen, että ei ole mahdollista valita kloonia, jonka kasvu olisi verrattavissa ihmisen koolonin epiteelisolujen kasvuun.
ESIMERKKI 1 10
Ihmisen koolonin epiteelisolut infektoidaan edellä vertailuesimerkissä kuvatulla tavalla. Ainoa ero on, että A50-alusta korvataan edellä taulukossa 1 kuvatulla B50-alustalla.
15 Sen jälkeen kun on inkuboitu 2 tuntia viruksen kanssa, viljelmät pestään PBS:ssa, lisätään tuoretta B50-kasvualustaa ja soluja viljellään peräkkäisillä viljelykerroilla tuoreessa B50-alustassa. Jokaisen viljelykerran yhteydessä on huolehdittava siitä, että solut erotetaan käsittelemällä liuoksella, joka sisältää 0,02 % trypsiiniä, 1 % polyvinyyli-pyrrolidiinia ja 0,02 % etyleeniglykolia HEPES-puskurissa (Biofluids).
20
Seuraamalla viljelymaljoilla kehittyvien solupesäkkeiden kokoa valitaan nopeasti kehittyvät pesäkkeet. Näin oli mahdollista valita kuusi ihmisen koolonin immor-talisoitua epiteelisolulinjaa, joista yksi tallennettiin 16.4.1996 tallennussnumerolla DSM ACC2258 DSM-kokoelmaan (Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und 25 Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Saksa.
1. DSM ACC2258-kannan karvotvvppianalvvsi
Valmistetaan (menetelmällä, joka on kuvattu käsikirjassa "Human cytogenetics, 30 toim.: Rooney DE, Czepulkowski BH, IRL Press, Oxford, 1986", mainittu tässä yhteydessä viitteenä) 4 karyotyyppiä DSM ACC2258-kannasta 40. viljelykerran kohdalla. Tulokset osoittavat, että 6 eri kromosomia menetettiin tai vaurioitui. Solulinja säilyttää siten ehjänä genomissaan kromosomin kustakin kromo-somiparista. Solu- 16 linjan sukupuoli on XO/XX. Huomattakoon, että yhden kromosomiryhmän menettäminen ei ole merkki tämän solulinjan tuumorigeenisestä muuntumisesta.
2. DSM ACC2258-kannan tuumoriqeenisvvs 5 107 DSM ACC2258-solulinjan solua, jotka otettiin 46. viljelykerran kohdalla, injisoi-daan Stauffer'in et ai. (edellä) kuvaamalla menetelmällä hiiriin, joilla ei ollut immu-nopuolustusjärjestelmää ("karvattomiin" hiiriin). Yli 8 kuukaudenkaan jälkeen ei ollut näkyvissä mitään tuumoreiden muodostumista. Solulinjojen tuumorigeenisyttömyys 10 ei ole merkki tämän solulinjan ei-tuumorigeenisestä muuntumisesta. Esimerkiksi Stauffer'in et ai. kuvaama NMC456-solulinja ei itse asiassa indusoi tuumoreita karvattomissa hiirissä, vaikkakin se ekspressoi tuumorimarkkereita, jotka ovat tunnusomaisia tuumorigeeniselle muuntumiselle.
15 3. Tuumorimarkkereiden ekspressio DSM ACC2258-soluliniassa
Stauffer'in et ai. kuvaamalla menetelmällä määritetään, ekspressoiko DSM ACC258-solulinja seuraavat tuumorimarkkerit: p53-mutaatio, karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) ja mutaatio adenoma coposis coli (APC) geenissä.
20
Tulokset ovat negatiivisia kaikkien näiden markkereiden tapauksessa, mikä on osoitus solulinjan ei-tuumorigeenisestä transformaatiotilasta.
4. DSM ACC2258-solulinian kontaminoituminen viruksilla 25 DSM ACC2258-solulinjasta määritetään, onko se hepatiitti C-viruksen (HCV), hepatiitti B-viruksen (HBV) ja aids-viruksen (HIV-1) kontaminoima.
HBV:n analyysiä varten DNA erotetaan noin 2xl06 solusta käsittelemällä fenoli- ja 30 kloroformiliuoksilla ja sen jälkeen saostamalla etanolilla. Tämän jälkeen DNA- näytteet PCR-monistetaan käyttämällä alukkeita, jotka ovat spesifisiä viruksen pre-core-alueelle (Lynch et ai., J. Virol., 65, 3887-890). Sen jälkeen monistustuotteet erotetaan agaroosigeelillä ja tehdään näkyviksi UV-valossa etidiumbromidin läsnä 17 ollessa. Vertailuna analysoidaan rinnalla samalla tavalla seerumilaimennus, joka sisältää 10—105 HBV-virusta (Anawa Biomedical Serbices 6 Product, USA).
HIV-l-viruksen analysointia varten PCR-monistetaan edellä kuvatut DNA-näytteet 5 käyttämällä alukkeita, jotka ovat spesifisiä viruksen GAG-alueelle. Tämän jälkeen monistustuotteet erotetaan agaroosigeelillä ja tehdään näkyviksi UV-valossa eti-diumbromidin läsnä ollessa. Vertailuna analysoidaan rinnalla samalla tavoin seerumilaimennus, joka sisältää 10-105 HIV-l-virusta (Anawa Biomedical Services 6 Product, USA).
10 HCV-viruksen analyysiä varten RNA erotetaan 2xl06 solusta Chomczynski'n et ai. menetelmällä (Anal. Biochem., 162.156-159,1987). Käänteistranskriptio tehdään tavalliseen tapaan ja saatu komplementaarinen DNA PCR-monistetaan käyttämällä alukkeita, jotka ovat spesifisiä viruksen ei-koodaavalle 5'-alueelle. Tämän jälkeen 15 monistustuotteet erotetaan agaroosigeelillä ja tehdään näkyviksi UV-valossa eti-diumbromidin läsnä ollessa. Vertailuna analysoidaan rinnalla samalla tavalla seerumilaimennus, joka sisältää 10—105 HCV-virusta (Anawa Biomedical Services 6 Product, USA).
20 Tuloksien perusteella näitä kolmea virusta ei ole mukana.
5. Ihmisen epiteelisoluille spesifisten markkereiden ekspressointi 5.a. Svtokeratiinit: DSM ACC2258-solulinjan viljelmän solut kiinnitetään lasimaljoille 25 100-prosenttisella kylmällä metanoliliuoksella ja sen jälkeen maljat pestään puskurissa, jonka koostumus on: 0,05M Tris pH 8,6, 1,8 % NaCI ja 0,2 % polyetyleenigly-koli 2000 (TNP-puskuri). Sen jälkeen soluja inkuboidaan 30 minuuttia hiiren vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä tietyille sytokeratiineille (anti-CH-peptidi 4, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 19, 20, Sigma, USA). Maljat pestään kolme kertaa 0,5 % BSA:a 30 sisältävällä TNP-puskurilla, minkä jälkeen niitä inkuboidaan 30 minuuttia vuohi anti-hiiri IgG-vasta-aineen kanssa, joka sisältää immunofluoresenssiyhdistettä (1:300, FITC vuohi anti-hiiri IgG; Biosys). Maljat pestään 3 kertaa edellä mainitussa puskurissa, minkä jälkeen ne kiinnitetään ja ne analysoidaan fluoresenssi-mikroskopian avulla. Kaikki solut ovat positiivisia sytokeratiinien 7, 8 ja 17 suhteen.
18 5.b. Vimentiini: Samalla tavoin kuin sytokeratiinien analyysin tapauksessa altistetaan edellä kuvatut geenitetyt solut hiiri anti-vimentiini vasta-aineelle (DAKO, USA) ja sen jälkeen edellä mainitulle vuohi anti-hiiri IgG-vasta-aineelle. Fluoresenssimikrosko-pian perusteella kaikki solut ovat positiivisia vimentiinin suhteen.
5 5.C. Solujen väliset vhdvsrakenteet ftiqht iunctions-rakenteetj: DSM ACC2258-solulinjan soluja viljellään lasimaljalla konfluenssiin asti, minkä jälkeen ne kiinnitetään käsittelemällä 1 tunti huoneen lämpötilassa 2,5 % glutaraldehydiliuoksella 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4. Solut pestään kaksi kertaa samassa puskurissa, minkä 10 jälkeen ne kiinnitetään uudelleen 2 % Os04-liuoksella samassa puskurissa. Tämän jälkeen solut dehydratoidaan peräkkäisillä 30, 50, 70, 90 ja 100 % etanoliliuoksilla (Polaron Equipment Ltd., Watford, UK) ja tämän jälkeen solut otetaan ohuella kulta-kerroksella (SEM-päällystysyksikkö E5100, Polaron). Sen jälkeen solut tutkitaan elektronimikroskopian avulla (Philips 505 SEM). Analyysin perusteella soluissa on 15 solujen keskeisiä yhdysrakenteita, jotka ovat tunnusomaisia epiteelisoluille.
5.d. Alkalinen fosfataasi: DSM ACC2258-solulinjan solujen alkalisen fosfataasin aktiivisuus määritetään kaupallisen Sigma-kitin avulla, joka käyttää Dahlquist'in et ai. kuvaamaa menetelmää (Analytical Biochemistry, 22, 99-107, 1968). Kuviossa 2 20 esitetyt tulokset osoittavat, että DSM ACC2258-solulinjan solut (Ocll, Ocl2, Ocl4) ekspressoivat fosfataasiaktiivisuuden, joka on verrattavissa ihmisen koolonin epitee-lisyöpäsolujen CaCO-2 aktiivisuuteen, mutta suurempi kuin ihmisen koolonin epitee-lisyöpäsoluilla HT-29. Tulokset C, Q, D, H, P viittaavat muihin esimerkissä 2 esitettyihin ihmisen koolonin epiteelisolulinjoihin.
25 5.e. Svtokromi P450: DSM ACC2258-solulinjan solujen sytokromien ekspressio analysoidaan tunnetulla RT-PCR-tekniikalla käyttämällä DNA-alukkeita, jotka ovat spesifisiä eri sytokromeille P450. Nämä alukkeet valmistettiin tapaan eri sytokromien DNA-sekvensseistä, jotka on saatavissa GeneBank-tietokannasta (CYP1A1: tallen-30 nusnro X02612; CYP2C: tallennusnro M61855 tai M61858 tai M61856 tai MM61854; CYP2D6: tallennusnro M33388; CYP2E1: tallennusnro J02843; CYP3A5: tallennusnro J04813; CYP1A2: tallennusnro Z00036; CYP2A6: tallennusnro M33318; CYP2B6: tallennusnro M29874).
19 Tätä tarkoitusta varten solut viljellään konfluenssiin asti 35 mm maljoilla (Costar), RNA erotetaan RNAeasy-kitin (Qiagen) avulla, tehdään käänteistranskriptio (1st Strad cDNA Synthesis Kit for RT-PCR, Boehringer Mannheim), saatu komplementää-rinen DNA PCR-monistetaan käyttämällä DNA-alukkeita, jotka ovat spesifisiä eri sy-5 tokromeille P450, minkä jälkeen monistustuotteet erotetaan agaroosigeelillä ja tehdään näkyviksi UV-valossa etidiumbromidin läsnä ollessa.
Tulokset osoittavat, että solut ekspressoivat sytokromit CYP1A1, CYP2C, CYP2D6, CYP2E1 ja CYP3A5. Solut ovat sen sijaan negatiivisia sytokromien CYP1A2, CYP2A6 10 ja CYP2B6 suhteen. Sytokromin CYP3A5-ekspressio vahvistetaan myös DSM
ACC2258-solujen proteiiniuutteen western-blot-analyysin avulla käyttämällä anti-CYP3A5-polyklonaalista vasta-ainetta (Oxygene, USA).
5. f. Solujen hapettamiseen ia elektrofiilien detoksifiointiin osallistuvat entsyymit: 15 DSM ACC2258-solulinjan soluja viljellään, RNA erotetaan Chomczynski'n et ai. menetelmällä (Anal. Biochem., 162.156-159, 1987), DNA-koettimet valmistetaan Cu/Zn-superoksidaasidismutaasin (SOD), glutationiperoksidaasin (GP), katalaasin (CA), glutationi-S-transferaasin (GST) ja kinonireduktaasin (QR) DNA-sekvensseistä, jotka on saatavissa GeneBank-tietokannasta (GST: tallennusnro X08058; GP: tallennusnro 20 M21304; CA: tallennusnro M81578; SOD: tallennusnro 729336; QR: tallennusnro M81596-600) ja sen jälkeen RNA:lle tehdään näillä koettimilla Northern-blot näiden entsyymien transkription varmistamiseksi.
Tulokset osoittavat, että kaikki solut ekspressoivat SOD-, GP-, CA-, GST- ja QR-25 aktiivisuutta koodaavien geenien transkription. DSM ACC2258-solulinja ekspressoi sen vuoksi solujen hapettumiseen ja elektrofiilien detoksifiointiin osallistuvia entsyymejä.
6. Ihmisen koolonin epiteelisoluille spesifisten markkereiden eksoressio 30 6.a. Pinnan nukkalisäkkeet: edellä kohdassa 5.c. kuvatulla tavalla tehty solujen elektronimikroskooppianalyysi osoittaa selvästi, että tukeen kiinnittyvän osan vastapäätä on lyhyitä nukkalisäkkeitä.
20 6.b. Sakkaroosi-isomaltaasi: sakkaroosi-isomaltaasi on spesifinen ihmisen koolonin epiteelisoluille. Sakkaroosi-isomaltaasin läsnäolo voidaan osoittaa lähetti-RNA:n tasolla kohdassa 5.e. kuvatulla RT-PCR-tekniikalla sen jälkeen, kun DSM ACC2258-solujen konfluentti viljelmä on ollut alttiina 48 tuntia 1 ng/ml ihmisen rekombinantti-5 TGF-p:lle (Becton Dickinson). DNA-alukkeet valmistetaan tavalliseen tapaan sakka-roosi-isomaltaasigeenin DNA-sekvenssissä, joka on saatavissa GeneBank-tieto-kannasta (tallennusnro X63597 S41833 S41836).
6. C. Dipeptidyylipeptidaasi IV: DPPIV on spesifinen ihmisen koolonin epiteelisoluille. 10 Sen läsnäolo voidaan osoittaa lähetti-RNA:n tasolla edellä kohdassa 5.e. kuvatulla RT-PCR-tekniikalla. DNA-alukkeet valmistetaan tavalliseen tapaan DPPIV-geenin DNA-sekvenssistä, joka on saatavissa GeneBank-tietokannasta (tallennusnro U13710-35).
15 6.d. Luokan II MHC: koolonin epiteelisolut ekspressoivat luokan II MHC:n (HLA- antigeenit) γ-interferonin (γ-IFN) läsnä ollessa. Tätä tarkoitusta varten DSM ACC2258-soluja viljellään B50-alustassa 12, 24, 36 ja 48 tuntia, kun mukana on 100 U/ml rekombinantti-Y-interferonia (Boehringer Mannheim). Solut erotetaan liuoksella, joka sisältää 0,025 % trypsiiniä ja EDTA:a (Gibco Life Technologie, USA). Soluja 20 inkuboidaan HLA-DR-, HLA-DP- ja HLA-DQ-antigeeneille spesifisten vasta-aineiden (Becton-Dickinson, USA) läsnä ollessa ja solut erotetaan käyttämällä virtaussytomet-ria (FACS can, Becton-Dickinson).
Kuvion 3 tulokset osoittavat HLA-DP-antigeenin ekspression 12 tunnin viljelmässä ja 25 vielä suuremmat konsentraatiot 24 ja 48 tunnin kohdalla. HLA-DR:n ekspressio voidaan nähdä 24 tunnin viljelyn jälkeen maksimikonsentraatioiden ollessa 36 ja 48 tunnin kohdalla. Toisaalta HLA-DQ-antigeeni ei indusoidu, mikä vahvistaa koolonin primäärisillä epiteelisoluilla tehdyt havainnot (Mayer et ai.).
7. Kiinnittyminen mikro-omanismeihin 30 7.a. Kiinnittyminen bakteerikantaan CNCM-1225: ihmisen suolta asuttavat lukuisat ei-patogeeniset bakteerit, näiden joukossa laktobasilli- ja bifido-bakteerit. Eräät näistä kykenevät kiinnittymään suolen limakalvon nukkalisäkkeisiin. Lactobacillus johnsonii-kantaa CNCM-1225, jonka tiedetään kiinnittyvän voimakkaasti suolikana- 21 van epiteelisoluihin (EP577904; Bernet et ai.), viljellään siten 12 tuntia ilman hapen läsnäoloa MRS-alustassa (Man, Rogosa ja Sharpe, Biokar), joka sisältää 100 3hadeniinia.
5 DSM ACC2258-soluja viljellään 2 viikkoa konfluenssiin asti ja sen jälkeen niitä inku-boidaan 1 tunti 37 °C:ssa edellä kuvatun 12-tuntisen MRS-alustan tai tuoreen MRS-alustan tai fosfaattipuskurin, pH 6,5, jossa on 4xl08 solua per ml edellä kuvatusta 12-h MRS-viljelmästä, kanssa. DSM ACC2258-solut pestään kolme kertaa PBS:lla, lyysataan IM NaOH-liuoksella ja sen jälkeen tuikelaskimen avulla mitataan solujen 10 vapauttaman radioaktiviisuuden intensiteetti.
Vertailuna viljellään CaCO-2-kantaa samalla, edellä kuvatulla tavalla, inkuboidaan CNCM I-1225-kannalla ja mitataan solujen vapauttaman radioaktiivisuuden voimakkuus.
15 Jäljemmän taulukon 2 tulokset osoittavat, että DSM ACC2258-solut kykenevät kiinnittymään CNCM I-1225-bakteereihin sekä CaCO-2-soluihin. Huomattakoon myös, että 12 tunnin LA-l-kannan viljelmä todistettavasti selvästi sisältää tekijöitä, jotka edistävät bakteereiden kiinnittymistä. Kiinnittyminen on itse asiassa pienempää tuo-20 reellä MRS-alustalla, johon bakteereita oli lisätty. Lisäksi voidaan havaita, että pH 6,5, joka on sama kuin suolikanavassa in vivo, myös edistää bakteereiden kiinnittymistä, kun vertailukohteena on kiinnittyminen, joka on saatu tuoreella MRS-alustalla, jonka pH on suuruusluokkaa 5.
25 Taulukko 2 I ; 7 -—-- j Solulima_ Inkubointiolosuhteet ^H-adeniini , % i.DSM ACC2258 12-h MRS 30,2 i Uusi MRS 11,8 j ' __Puskuri pH 6.5__13,03_ 30 :aCo-2 12-h MRS 34,8
Uusi MRS 6,1 __Puskuri pH 6.5_8,3_ 22
Bernet'in et al. (Gut, 35, 483-489, 1994) kuvaamalla menetelmällä mitataan myös DSM ACC2258-solulinjan kyky pidättää CNCM I-1225-bakteereita. Lyhyesti sanottuna menetelmässä mitataan silmämääräisesti 100 koolonisoluun kiinnittyneiden bak-teereiden määrä. Tähän tarkoitukseen käytetään 12 tunnin MRS-viljelyalustaa tai 5 tuoretta MRS-alustaa, joka sisältää ml:ssa 4xl08 tästä 12 tunnin MRS-viljelmästä saatua solua. Analyysissä käytetään lisäksi kolmea valmistetta ja 20 kustakin valmisteesta satunnaisesti valittua mikrograafia.
Vertailuna mitataan samalla tavoin CaCO-2-solulinjan kyky pidättää CNCM 1-1225-10 bakteereita.
Jäljempänä annetussa taulukossa esitetyt tulokset osoittavat, että solulinja kykenee pidättämään merkittävän määrän bakteereita. Lisäksi voidaan havaita, että 12 tunnin LA-l-kannan viljelmä selvästi sisältää tekijöitä, jotka edistävät bakteereiden kiin-15 nittymistä. Näin korkeaan kiinnittymiseen ei ole itse asiassa mahdollista päästä tuoreella MRS-alustalla, johon bakteereita oli lisätty.
Taulukko 3 2Q Solulinja Inkubointi- No./100 solua Standardi- __olosuhteet__poikkeama 0SM ACC2258 12-h MRS 118 7 __Uusi MRS__13__4_
OaCo-2 12-h MRS 124 13 _ Uusi MRS _9_ 4_ 25 7.b. Kiinnittyminen Clostridium difficile-bakteereihin ia/tai tarttuviin bifidobaktee-reihin:
Analysoinnin kohteena on myös ollut DSM ACC2258-solulinjan kyky pidättää Clost-30 ridium difficile-bakteereita ja tarttuvia bifidobakteereita, Applied Env. Microb., 59, 4121-4128, 1993 ja EP577904 (Nestle). Tulokset osoittavat, että solulinja kykenee myös pidättämään merkittävän määrän kumpiakin bakteereita.
23 8. Svtokiinien ekspressio: DSM ACC2258-solulinjan solujen sytokiinien ekspressio analysoidaan tulehdusaineen läsnä ollessa tai ilman tämän mukanaoloa tunnetulla RT-PCR-tekniikalla käyttämällä DNA-alukkeita, jotka ovat spesifisiä eri sytokiineille. Nämä alukkeet valmistetaan tavalliseen tapaan eri sytokiinien DNA-sekvensseistä, 5 jotka on saatavissa GeneBank-tietokannasta (tallennusnro: TNFa: X02910; IL-Ιβ: M15840; IL-6: M14584; IL-8: M28130; IL-ra: M97748). Tulehdus indusoitiin inku-boimalla solulinjan kanssa 24 tuntia 1 mM histamiinia tai 20 ng/ml TPA:a.
Vertailuna tehtiin samat analyysit normaalilla koolonin kudossolulinjalla ja tuumori-10 geenisillä solulinjoilla HT-29 ja CaCO-2. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 4.
Taulukko 4 15 TvRNA kooloni- DSM ACC2258 HT-29 CaCO-2 kudos ei- ei-in- indu- ei in- indu- ei in- in- _dusoitu dusoitu soitu dusoitu soitu dusoitu dusoitu XL—1 β__+__+__*- -v-__—__+ +_ — +
Xl rd__ _ + Ί- + -f- — 4- TNFoc__—__+__++__+__++__+_ + + 20 IL—6__+__+__++__+__++__+__+_+_ XL 8 +__+ +__+ ++ + + + ESIMERKKI 2 25 Esimerkissä 1 esitetyillä muilla ihmisen koolonin immortalisoiduilla epiteelisolulinjoilla on samankaltaiset ominaisuudet kuin mitä edellä on kuvattu DSM ACC2258-kannan yhteydessä. Kuviossa 2 on esimerkkinä annettu viiden muun solulinjan, C, Q, D, H, P, alkalisen fosfataasin aktiivisuus.

Claims (18)

  1. 24 Patenttivaati m u kset
  2. 1. Seerumia sisältämätön viljelyalusta, joka sopii ihmisen koolonin epiteelisolujen viljelemiseen ja immortalisoimiseen ja joka sisältää epäorgaanisia suoloja, glukoosia, 5 natriumpyruvaattia, aminohappoja, BSA:a, etanoliamiinia, fosforyylietanoliamiinia, vitamiineja ja hormoneja, tunnettu siitä, että alusta sisältää hivenaineita, C-vita-miinista ja retinoiinihaposta muodostuvia vitamiineja ja trijodityroniinista, deksame-tasonista, hydrokortisonista, naudan aivolisäkeuutteesta, insuliinista, EGF:sta ja transferriinistä muodostuvia hormoneja. 10
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelyalusta, tunnettu siitä, että alusta sisältää 1-100 nM hivenaineita, 10-1000 nM retinoiinihappoa, 10-1000 nM trijodityroniinia, 0,1-50 nM deksametasonia, 1-100 nM hydrokortisonia, 1-100 pg/ml C-vitamiinia, 1-100 pg/ml naudan aivolisäkeuutetta, 0,1-50 pg/ml insuliinia, 0,1-50 ng/ml EGF:a 15 ja 0,1-100 pg/ml transferriiniä.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelyalusta, tunnettu siitä, että epäorgaaniset suolat on valittu joukosta, johon kuuluvat natriumkloraatti, kaliumkloraatti, kalium-sulfaatti, kalsiumkloraatti, kaksiemäksinen natriumfosfaatti, natriumbikarbonaatti, 20 rauta(III)nitriitti, ammoniummetavanadaatti, ammoniummolybdaatti, kupari(II)-sulfaatti, magnesiumkloraatti, mangaanikloraatti, nikkelisulfaatti, natriumasetaatti, natriumpyruvaatti, natriumseleniitti, natriumsilikaatti, tinakloraatti ja sinkkisulfaatti.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelyalusta, tunnettu siitä, että vitamiinit on 25 valittu joukosta, johon kuuluvat kalsium D-pantotenaatti, koliinikloraatti, foolihappo, inositoli, nikotiiniamidi, pyridoksiini, riboflaviini, tiamiini, biotiini ja syanokobalamiini.
  6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelyalusta, tunnettu siitä, että alusta sisältää alle 80 pM kalsiumia. 30
  7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelyalusta, tunnettu siitä, että sillä on taulukossa 1 määritelty koostumus B50. 25
  8. 7. Menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisen koolonista saatujen primääristen epiteelisolujen viljelmä, viljelmä infektoidaan rekombinanttiviruksella ja immortalisoituja soluja viljellään jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisessa seerumia sisältämättömässä viljelyalustassa. 5
  9. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että primäärisiä epiteelisoluja viljellään jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisessa seerumia sisältämättömässä viljelyalustassa.
  10. 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelmä infek toidaan SV40 T-Ag-rekombinanttiviruksella, joka sisältää osan MuLV-retroviruksesta.
  11. 10. Menetelmä aineen, jolla on mutageeninen, toksinen tai hyödyllinen vaikutus suolikanavan solujen metaboliaan, identifioimiseksi, tunnettu siitä, että menetel- 15 mässä in vitro (1) aine, jonka epäillään olevan mutageeninen, toksinen tai hyödyllinen suolikanavan solujen metabolialle, saatetaan reagoimaan viljelmän, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksen 11-16 mukaista solulinjaa, kanssa, viljellään tämän viljelmän kanssa tai saatetaan kosketukseen tämän viljelmän kanssa, ja (2) määritetään tai mitataan mainitun aineen vaikutukset tähän solulinjaan. 20
  12. 11. Ihmisen koolonin epiteelisolulinja, joka on immortalisoitu käyttämällä rekombi-nanttivirusta, jolloin mainittu solulinja - kykenee lisääntymään vähintään 60 peräkkäistä viljelykertaa, 25. on vailla tuumorimarkkereita, - ekspressoi immortalisoimattomille ihmisen epiteelisoluille spesifisiä metabo-liamarkkereita ja ihmisen koolonin immortalisoimattomille epiteelisoluille spesifisiä metabolisia erilaistumismarkkereita - kykenee kiinnittymään, in vitro, maitohappobakteerikantaan CNCM 1-1225, 30 ja - on saatavissa jonkin patenttivaatimusten 7-10 mukaisella menetelmällä. 1 2 Patenttivaatimuksen 11 mukainen immortalisoitu solulinja, joka ekspressoi me- 2 tabolisina markkereina, jotka ovat spesifisiä immortalisoimattomille ihmisen epitee- 26 lisoluille, vähintään kaksi markkeria valittuna joukosta, johon kuuluvat vimentiini, sytokeratiinit, solujen väliset yhdysrakenteet, alkalinen fosfataasi, sytokromit P450, glutationi-S-transferaasi, kinonireduktaasi, Cu/Zn-superoksidaasidismutaasi, gluta-tioniperoksidaasi ja katalaasi. 5
  13. 13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen immortalisoitu solulinja, joka ekspressoi me-tabolisina erilaistumismarkkereina, vähintään kaksi markkeria valittuna joukosta, johon kuuluvat pinnan nukka lisäkkeet, sakkaroosi-isomaltaasi, luokan II MHC ja dipeptidyylipeptidaasi IV. 10
  14. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen immortalisoitu solulinja, joka ekspressoi ihmisen gamma-interferonin läsnä ollessa luokan II MHC:n HLA-DR-ja HLA-DP-anti-geenit, mutta ei mainitun kompleksin HLA-DQ-antigeeniä.
  15. 15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen immortalisoitu solulinja, joka kykenee kiinnit tymään in iz/fromaitohappobakteerikantaan CNCM 1-1225 vähintään 80 bakteerina 100 koolonin epiteelisolua kohti.
  16. 16. Patenttivaatimuksen 11 mukainen immortalisoitu solulinja, jonka tallennusnume-20 ro on DSM ACC2258.
  17. 17. Diagnostinen kitti, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 11-16 mukaisia ihmisen koolonin immortalisoituja epiteelisoluja, jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaista viljelyalustaa, ja reagensseja, joilla määritetään näiden solu- 25 jen metabolinen vaste aineille, jotka ovat mutageenisiä, toksisia tai hyödyllisiä suoli-kanavan solujen metabolialle.
  18. 18. Jonkin patenttivaatimuksen 11-16 mukaisten ihmisen koolonin immortalisoitujen epiteelisolujen käyttö menetelmissä, joilla identifioidaan in vitro aineet, jotka ovat 30 mutageenisiä, toksisia tai hyödyllisiä suolikanavan solujen metabolialle. 1 Jonkin patenttivaatimuksen 11-16 mukaisten ihmisen koolonin immortalisoitujen epiteelisolujen käyttö valmistettaessa aktiivisia farmaseuttisia aineita. 27
FI971628A 1996-04-19 1997-04-17 Menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseksi, ihmisen koolonin epiteelisolujen viljelemiseen ja immortalisoimiseen sopiva seerumia sisältämätön viljelyalusta, ihmisen koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja, menetelmä suolikanavan.... FI120352B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96201064A EP0802257B1 (fr) 1996-04-19 1996-04-19 Lignée immortalisée de cellules épithéliales du colon humain
EP96201064 1996-04-19

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI971628A0 FI971628A0 (fi) 1997-04-17
FI971628A FI971628A (fi) 1997-10-20
FI120352B true FI120352B (fi) 2009-09-30

Family

ID=8223895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI971628A FI120352B (fi) 1996-04-19 1997-04-17 Menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseksi, ihmisen koolonin epiteelisolujen viljelemiseen ja immortalisoimiseen sopiva seerumia sisältämätön viljelyalusta, ihmisen koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja, menetelmä suolikanavan....

Country Status (14)

Country Link
US (3) US6194203B1 (fi)
EP (1) EP0802257B1 (fi)
JP (1) JP3931212B2 (fi)
AT (1) ATE222598T1 (fi)
AU (1) AU733913B2 (fi)
CA (1) CA2202923C (fi)
DE (1) DE69623109T2 (fi)
DK (1) DK0802257T3 (fi)
ES (1) ES2180689T3 (fi)
FI (1) FI120352B (fi)
NO (1) NO319494B1 (fi)
NZ (1) NZ314614A (fi)
PT (1) PT802257E (fi)
RU (1) RU2220201C2 (fi)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2180689T3 (es) * 1996-04-19 2003-02-16 Nestle Sa Linea inmortalizada de celulas epiteliales del colon humano.
ATE347587T1 (de) 1996-12-24 2006-12-15 Nestle Sa Immortalisierte menschliche epithelzell-linie aus kornea
US5960073A (en) * 1997-04-03 1999-09-28 Genesys Telecommunications Laboratories , Inc. Method and apparatus for providing an interactive home agent with access to call center functionality and resources
DE19755023C2 (de) * 1997-12-11 2000-03-09 Celanese Chem Europe Gmbh Katalysator und Verfahren zur Herstellung von Vinylacetat
DK1048725T3 (da) * 1999-04-27 2005-08-22 Transgene Sa Fremgangsmåde til fremstilling af pattedyrcellelinjer
EP1048724A1 (en) * 1999-04-27 2000-11-02 Transgene S.A. Human myoblast cell lines and their uses
US6429013B1 (en) * 1999-08-19 2002-08-06 Artecel Science, Inc. Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair
US7078232B2 (en) * 1999-08-19 2006-07-18 Artecel, Inc. Adipose tissue-derived adult stem or stromal cells for the repair of articular cartilage fractures and uses thereof
US6416999B1 (en) 2000-04-07 2002-07-09 Raven Biotechnologies, Inc. Human Müllerian duct-derived epithelial cells and methods of isolation and uses thereof
US6900056B2 (en) * 2001-02-15 2005-05-31 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
US20030215941A1 (en) * 2002-03-12 2003-11-20 Stewart Campbell Assay device that analyzes the absorption, metabolism, permeability and/or toxicity of a candidate compound
GB0212405D0 (en) * 2002-05-29 2002-07-10 Insignion Holdings Ltd Composition and its therapeutic use
US7115563B2 (en) * 2002-05-29 2006-10-03 Insignion Holding Limited Composition and its therapeutic use
ATE447953T1 (de) * 2004-07-19 2009-11-15 Inst Rech Developpement Ird Pharmazeutische zusammensetzungen zur behandlung von leishmaniasis
US8273553B2 (en) * 2004-11-02 2012-09-25 Ares Trading S.A. Production of growth hormone in serum-free cell culture medium for mammalian cells
ZA200702434B (en) 2004-11-02 2008-08-27 Ares Trading Sa Serum-free cell culture medium for mammalian cells
EP2390263A1 (en) 2005-08-26 2011-11-30 Ares Trading S.A. Process for the preparation of glycosylated interferon beta
MY185872A (en) 2006-09-13 2021-06-14 Abbvie Inc Cell culture improvements
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
TW201028433A (en) 2008-10-20 2010-08-01 Abbott Lab Viral inactivation during purification of antibodies
WO2010141039A1 (en) 2008-10-20 2010-12-09 Abbott Laboratories Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
GB2497249B (en) * 2011-07-12 2016-12-28 Foodchek Systems Inc Culture medium,method for culturing salmonella and e.coli and method for detecting salmonella and e.coli
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US20130281355A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
US9249182B2 (en) 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9206390B2 (en) 2012-09-02 2015-12-08 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
EP2767273A1 (en) 2013-02-15 2014-08-20 Universitätsklinikum Erlangen Death-associated protein kinases, inhibitors and activators thereof for use in pharmaceutical compositions and in predictive medicine
WO2014143205A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US8921526B2 (en) 2013-03-14 2014-12-30 Abbvie, Inc. Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
EP3352586A4 (en) 2015-09-21 2019-05-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University NUTRITIONAL ANTICANCER TREATMENT
US11060061B2 (en) * 2017-08-09 2021-07-13 Mandom Corporation Immortalized sweat gland myoepithelial cell
EP3723772A4 (en) 2017-12-11 2021-09-08 Filtricine, Inc. COMPOSITIONS, METHODS, KITS AND SYSTEMS FOR THE TREATMENT OF CANCER AND METABOLIC INTERVENTION THERAPY
CN111172114B (zh) * 2019-12-10 2021-11-30 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用
CN114891722A (zh) * 2022-05-13 2022-08-12 广东省农业科学院动物卫生研究所 禽肠道上皮细胞及其制备方法和应用
CN116083342A (zh) * 2023-01-16 2023-05-09 细新(上海)医疗科技有限公司 一种原代上皮细胞的培养体系和应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4229531A (en) * 1978-12-29 1980-10-21 Monsanto Company Production of tumor angiogenesis factor by cell culture
DE3711699A1 (de) * 1987-04-07 1988-11-10 Fraunhofer Ges Forschung Medium zur kultivierung und proliferation von epithelialen zelltypen
US4885238A (en) * 1987-10-30 1989-12-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immortalized human bronchial epitherial mesothelial cell lines
WO1989005862A1 (en) * 1987-12-09 1989-06-29 Invitron Corporation Human cell life extension
US5093259A (en) * 1988-07-07 1992-03-03 Oak Ridge Associated Universities, Inc. Continuous cell-line tamarin adenocarcinoma of the colon
US5665589A (en) * 1988-12-14 1997-09-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Human liver epithelial cell lines
US5529920A (en) * 1988-12-14 1996-06-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Human liver epithelial cell line and culture media therefor
US5376542A (en) 1992-04-27 1994-12-27 Georgetown University Method for producing immortalized cell lines using human papilluma virus genes
ATE172245T1 (de) 1992-07-06 1998-10-15 Nestle Sa Milchbakterien
US5462870A (en) * 1993-04-23 1995-10-31 Wayne State University Human diploid salivary gland epithelial cell lines
US5672498A (en) * 1993-12-28 1997-09-30 The Gillete Company Human corneal epithelial cell lines with extended lifespan
US5610043A (en) * 1994-04-28 1997-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Human prostatic cell lines immortalized by adenovirus 12-simian virus 40 (AD12/SV40) hybrid virus
ES2180689T3 (es) * 1996-04-19 2003-02-16 Nestle Sa Linea inmortalizada de celulas epiteliales del colon humano.

Also Published As

Publication number Publication date
AU1893397A (en) 1997-10-23
NZ314614A (en) 1999-04-29
DK0802257T3 (da) 2002-10-28
CA2202923C (en) 2008-06-10
EP0802257B1 (fr) 2002-08-21
JPH1028580A (ja) 1998-02-03
CA2202923A1 (en) 1997-10-19
NO319494B1 (no) 2005-08-22
FI971628A0 (fi) 1997-04-17
FI971628A (fi) 1997-10-20
DE69623109D1 (de) 2002-09-26
NO971757D0 (no) 1997-04-17
RU2220201C2 (ru) 2003-12-27
ES2180689T3 (es) 2003-02-16
EP0802257A1 (fr) 1997-10-22
US6194203B1 (en) 2001-02-27
NO971757L (no) 1997-10-20
JP3931212B2 (ja) 2007-06-13
ATE222598T1 (de) 2002-09-15
US6395542B1 (en) 2002-05-28
PT802257E (pt) 2003-01-31
US6399381B1 (en) 2002-06-04
DE69623109T2 (de) 2002-12-12
AU733913B2 (en) 2001-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120352B (fi) Menetelmä ihmisen koolonin epiteelisolujen immortalisoimiseksi, ihmisen koolonin epiteelisolujen viljelemiseen ja immortalisoimiseen sopiva seerumia sisältämätön viljelyalusta, ihmisen koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja, menetelmä suolikanavan....
US11530385B2 (en) Hormone responsive tissue culture system and uses thereof
US20050260748A1 (en) Adult stem cells and uses thereof
US9951315B2 (en) Immortalization of epithelial cells and methods of use
US8715954B2 (en) Method of producing C3A serum-free clonal cell line
CN1439049A (zh) 衍生自多能干细胞的肝细胞谱系细胞
US7294509B2 (en) Pre-adipose cell lines
CN1205737A (zh) 改良无限增殖化人类皮肤细胞系和用于其生产的新型无血清培育基
ES2229219T3 (es) Lineas celulares humanas inmortalizadas que contienen genes del citocromo p450 exogenos.
US20060154235A1 (en) Human hepatocyte-like cells and uses thereof
EP1704227A1 (en) Immortalized hepatocytes
EP0851028B1 (fr) Lignée immortalisée de cellules épithéliales humaines de la cornée
EP0929661A1 (en) Novel method of culturing human epithelial cells for the identification of cancer therapeutics and diagnostics
Stacey et al. Immortalisation of primary cells
Yoshizato Growth potential of adult hepatocytes in mammals: Highly replicative small hepatocytes with liver progenitor‐like traits
Brash et al. Overview of human cells in genetic research: Altered phenotypes in human cells caused by transferred genes
US8133729B2 (en) Biomimetic urothelium
Grisham et al. Clonal analysis of neoplastic transformation in cultured diploid rat liver epithelial cells
WO2002064017A2 (en) Immortalized human prostatic cancer cell lines
WO2002064018A2 (en) Immortalized human familial prostatic cancer cell lines

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120352

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed