ES2229219T3 - Lineas celulares humanas inmortalizadas que contienen genes del citocromo p450 exogenos. - Google Patents

Lineas celulares humanas inmortalizadas que contienen genes del citocromo p450 exogenos.

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ES2229219T3 ES94917408T ES94917408T ES2229219T3 ES 2229219 T3 ES2229219 T3 ES 2229219T3 ES 94917408 T ES94917408 T ES 94917408T ES 94917408 T ES94917408 T ES 94917408T ES 2229219 T3 ES2229219 T3 ES 2229219T3
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Frank J. Gonzalez
Katharine C. Mace
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Abstract

SE PRESENTAN LINEAS CELULARES EPITELIALES DE LOS BRONQUIOS Y DEL HIGADO, NO TUMOROGENICAS, EN DONDE LAS LINEAS CELULARES PUEDEN EXPRESAR LOS GENES DE CITOCROMO P450 HUMANOS QUE SE HAN INSERTADO EN LAS LINEAS CELULARES. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS Y KITS PARA LA IDENTIFICACION DE MUTAGENES POTENCIALES, CITOTOXINAS, AGENTES CARCINOGENOS, AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS Y QUIMIOPREVENTIVOS MEDIANTE LA UTILIZACION DE ESTAS LINEAS CELULARES.

Description

Líneas celulares humanas inmortalizadas que contienen genes del citocromo P450 exógenos.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere a células epiteliales bronquiales humanas y a células epiteliales hepáticas humanas inmortalizadas que contienen varios genes del citocromo P450, y de los usos de estas células. La invención también se refiere a la construcción y aplicación de vectores recombinantes que contienen secuencias de ADN para codificar, y para expresar de manera eficiente, citocromos P450 enzimáticamente activos en células de mamíferos.
Los citocromos P450 son una gran familia de enzimas hemoproteicos capaces de metabolizar xenobióticos como fármacos, carcinógenos y contaminantes ambientales, así como endobióticos como corticoides, ácidos grasos y prostaglandinas. Algunos miembros de la familia del citocromo P450 son inducibles tanto en animales como en células cultivadas, mientras que otras formas constitutivas no son inducibles. Este grupo de enzimas tiene actividades tanto nocivas como beneficiosas. La actividad nociva es la conversión metabólica de los xenobióticos en tóxicos, mutágenos y carcinógenos.
Los estudios toxicológicos de fármacos, posibles carcinógenos, productos alimentarios, aditivos alimentarios y contaminantes alimentarios se han realizado en animales y más recientemente en sistemas in vitro, como bacterias (prueba de Ames) y modelos de cultivo de células animales. Estos sistemas no son adecuados porque no tienen un metabolismo específico humano. Por lo tanto, es difícil y potencialmente inexacta la extrapolación para determinar el riesgo en seres humanos. Los sistemas de estudio en bacterias y algunos de los modelos de cultivo en células animales carecen de actividad metabólica completa y podrían no detectar algunos componentes nocivos que dependen de la activación por las rutas metabólicas, por ejemplo, por los enzimas del citocromo P450. En el pasado se superó esta situación añadiendo el enzima metabolizador aislado del hígado de ratas a las células animales cultivadas. Este enfoque plantea dos problemas significativos. Primero, el metabolismo resultante no es necesariamente el mismo que en el ser humano. En segundo lugar, los metabolitos altamente reactivos podrían no alcanzar su molécula diana y, por lo tanto, podrían no ser detectados.
Aunque se han introducido enzimas metabolizadores humanos en una línea celular humana, este sistema tiene graves deficiencias. (Crespi, Progress in Clinical and Biological Research, Vol. 340B. Mendelsohn and Albertini [eds.]
Wiley-Liss, Nueva York 97-106, 1990). Las células humanas son linfoblastos que no constituyen un tejido diana importante de citotoxinas, mutágenos o carcinógenos, y no tienen actividad citocromo P450 natural en ausencia de inductores. Además, estas células carecen de otros enzimas que participan en el proceso de activación, por ejemplo, epóxido hidrolasa, que se deben introducir mediante metodología de transferencia génica. Por lo tanto, este sistema comprende un modelo artificial con una correlación cuestionable con la situación in vivo.
Se conoce un análisis breve y generalizado de un procedimiento para transformar células hepáticas a partir del documento PNAS 34/0,1993, pág. 174. No se comprende bien qué factores dan lugar a una divergencia de las propiedades funcionales entre diferentes líneas celulares transformadas o cómo controlarlas. Probablemente, un factor importante responsable de esa divergencia es la naturaleza del donante (por ejemplo, edad, sexo, peso) a partir del cual se obtienen las células hepáticas; sin embargo, los posibles donantes son escasos y el experimentador tiene únicamente una selección limitada.
Resumen de la invención
Por lo tanto, es deseable tener un sistema de líneas celulares humanas in vitro que sea igual a la situación humana in vivo. La presente invención proporciona líneas celulares humanas no tumorígenas aisladas cuyo origen son células epiteliales bronquiales y hepáticas con un potencial proliferativo ilimitado, que da lugar a inmortalización.
En una forma de realización de esta invención se proporciona una línea celular epitelial bronquial humana estable y no tumorígena en la que la línea celular es capaz de crecer sin senescencia cuando se la cultiva in vitro en un medio de cultivo, y que contiene un gen exógeno del citocromo P450 que es capaz de expresarse en la línea celular. El gen se puede insertar mediante transfección o infección. Los genes P450 que se expresan en estas líneas celulares incluyen 1A1, 1A2, 2A6, 3A3, 3A4, 2B6, 2B7, 2C9, 2D6 y/o 2E1. Las líneas celulares preferidas incluyen una cualquiera de las líneas celulares BEAS-2B-1A1, HEAS-2B-1A2, BEAS-2B-2A6, BEAS-2B-3A3, BEAS-2B-3A4, BEAS-2B-2B6, BEAS-2B-2B7, BEAS-2B-2C9, BEAS-2B-2D6, BEAS-2B-2E1 o un homólogo o un derivado de estas líneas celulares. La línea celular BEAS-2B-1A1 es una línea celular BEAS-2B que contiene el gen 1A1 del citocromo P450, la línea celular BEAS-2B-1A2 es una línea celular BEAS-2B que contiene el gen 1A2 del citocromo P450, y así sucesivamente. Los genes P450 preferentemente están unidos operativamente a un promotor del citomegalovirus para obtener una expresión eficiente. Una línea celular particularmente preferida es BEAS-2B-1A2 o un homólogo o un derivado de la misma.
En una segunda forma de realización de esta invención se proporciona una línea celular epitelial hepática humana estable y no tumorígena en la que la línea celular es capaz de crecer sin senescencia cuando se la cultiva in vitro en un medio de cultivo, y que contiene un gen exógeno del citocromo P450 que es capaz de expresarse en la línea celular. El gen se puede insertar mediante transfección o infección. Los genes P450 que se expresan en estas líneas celulares incluyen 1A1, 1A2, 2A6, 3A3, 3A4, 2B6, 2B7, 2C9, 2D6 y/o 2E1, Las líneas celulares preferidas incluyen una cualquiera de las líneas celulares THLE-5B-1A1, THLE-5B-1A2, THLE-5B-2A6, THLE-5B-3A3, THLE-5B-3A4, THLE-5B-2B6, THLE-5B-2B7, THLE-5B-2C9, THLE-5B-2D6 y THLE-5B-2E1 o un homólogo o un derivado de estas líneas celulares. La línea celular THLE-5B-1A1 es una línea celular THLE-5B que contiene el gen 1A1 del citocromo P450, la línea celular THLE-5B-1A2 es una línea celular THLE-5B que contiene el gen 1A2 del citocromo P450, y así sucesivamente. Los genes P450 preferentemente están unidos operativamente a un promotor de citomegalovirus para obtener una expresión eficiente. Una línea celular particularmente preferida es THLE-5B-1A2 o un homólogo o un derivado de la misma.
En otra forma de realización de esta invención se describen varios procedimientos para utilizar las líneas celulares. Por ejemplo, se describe un procedimiento para identificar o estudiar la mutagenia, citotoxicidad o carcinogenia de un agente que comprende las etapas de: a) hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto la línea celular con un agente sospechoso de ser un mutágeno, una citotoxina o un carcinógeno, y b) determinar o monitorizar esos efectos o cualquier cambio en la línea celular que sean indicativos de mutagenia, citotoxicidad o carcinogenia.
Esta invención también describe un procedimiento para identificar o estudiar la actividad quimioterápica o quimiopreventiva de un agente que comprende las etapas de a) hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto la línea celular con un agente sospechoso de ser un quimioterápico o un quimiopreventivo en presencia de un carcinógeno, y b) determinar o monitorizar esos efectos o cualquier cambio en la línea celular que sean indicativos de actividad quimioterápica. El agente se puede añadir antes que el carcinógeno para medir los efectos preventivos del agente.
En otro aspecto de esta invención se proporciona un procedimiento para determinar los metabolitos activados de un carcinógeno o xenobiótico que comprende las etapas de a) hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto la línea celular con el posible carcinógeno o xenobiótico, y b) identificar los metabolitos y/o sus efectos.
También se proporcionan kits diagnósticos que comprenden las líneas celulares, los medios y los reactivos para su uso en uno de los procedimientos.
Otros diversos objetos y ventajas de la presente invención serán evidentes en la Descripción detallada de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Estos y otros objetos, características y muchas de las ventajas añadidas de la invención se comprenden mejor después de leer la siguiente descripción detallada cuando se considera junto a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra la construcción esquemática de los vectores recombinantes para expresar los genes del citocromo P450 y la transfección de los vectores en las células BEAS-2B.
La Figura 2 muestra un mapa de los fragmentos pCMV y P450 para su inserción en este vector.
La Figura 3 muestra una inmunotransferencia de células BEAS-2B-CMV-1A2 que confirma la expresión de CYP1A2 en estas células. Abreviaturas: B=BEAS-2B; cl=clon; m=microsómico.
La Figura 4 muestra una inmunotransferencia de células BEAS-2B-CMV-2A6 que confirma la expresión de CYP2A6 en estas células.
La Figura 5 muestra una inmunotransferencia de células BEAS-2B-CMV-3A4 que confirma la expresión de CYP3A4 en estas células.
La Figura 6 muestra una inmunotransferencia de células BEAS-2B-CMV-2E1 que confirma la expresión de CYP2E1 en estas células.
La Figura 7 muestra una inmunotransferencia de células BEAS-2B-CMV-2D6 que confirma la expresión de CYP2D6 en estas células.
La Figura 8 muestra una inmunotransferencia de células THLE-5B-CMV-1A2 que confirma la expresión de CYP1A2 en estas células. Abreviaturas: T=THLE-5B.
La Figura 9 muestra la evolución temporal de la actividad etoxicumarina O-desetilasa en células THLE-5B-CMV-1A2.
La Figura 10 muestra la citotoxicidad de Aflatoxin B_{1} sobre las líneas THLE-5B-CMV-1A2 Y THLE-5B-CMV-neo.
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La Figura 11 muestra la citotoxicidad de la aflatoxina B_{1} sobre las líneas BEAS-2B-CMV-3A4, BEAS-2B-CMV-2A6, BEAS-2B-CMV-1A2 y BEAS-2B-CMV-neo.
La Figura 12 muestra la citotoxicidad de la aflatoxina B_{1} o de la aflatoxina G_{1} sobre las líneas BEAS-2B-pXT1 y BEAS-2B- 1A2.
La Figura 13 muestra la citotoxicidad de PhIP sobre las líneas THLE-5B- CMV-1A2 Y THLE-5B-CMV-1A2.
La Figura 14 muestra la citotoxicidad de dietilnitrosamina sobre las líneas celulares BEAS-2B-CMV-2E1 y BEAS-2B-CMV-neo.
La Figura 15 muestra la citotoxicidad de dimetilnitrosamina sobre las líneas celulares BEAS-2B-CMV-2E1 y BEAS-2B-CMV-neo.
Descripción de la invención
Los objetos y ventajas de la presente invención que se han señalado más arriba y otros más se consiguen (a) construyendo vectores recombinantes que contienen secuencias de ADNc que codifican proteínas del citocromo P450 de modo que las células de mamíferos, especialmente humanas, cuando son infectadas o transfectadas con dichos vectores recombinantes expresan de manera eficiente las proteínas P450; y (b) proporcionando líneas celulares funcionalmente intactas que contienen las proteínas del citocromo sin la necesidad de la adición externa de NADPH citocromo P450 reductasa para que tengan actividad enzimática.
Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en esta solicitud tienen el mismo significado que comprende habitualmente una persona con conocimientos normales de la materia a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen se puede usar en la práctica o en los estudios de la presente invención, a continuación se describen los procedimientos y materiales preferidos. Todas las publicaciones y documentos de patentes a los que se hace referencia en esta solicitud se incorporan a la misma como referencia.
I. Líneas celulares inmortalizadas
Las líneas celulares inmortalizadas estables y no tumorígenas que expresan el citocromo P450 de la invención proceden de células inmortalizadas de pulmón y de hígado. Se prefieren las células inmortalizadas sobre las células primarias para su uso como sistema de estudio debido a la mayor reproducibilidad de los resultados y a la preparación menos costosa para su uso (una vez que se ha establecido una línea celular inmortalizada). Las líneas celulares inmortalizadas derivadas de los tejidos pulmonar y hepático sirven como sistemas modelo de toxicidad de los tejidos respectivos de los que derivan. Las células inmortalizadas no tumorígenas son particularmente útiles debido a su mayor similitud con las células tisulares normales, y porque se pueden usar para determinar el potencial carcinógeno de sustancias en estudio. Se usa el término no tumorígenas para describir células que no forman tumores cuando se inyectan por vía subcutánea a un animal de prueba, como un ratón. Las líneas celulares inmortalizadas que expresan P450 de la presente invención son estables en el sentido de que no se produce ninguna reducción detectable de la expresión de P450 después de la introducción de un gen de P450 exógeno durante al menos 50 pases de las células.
Una línea celular inmortalizada se prepara a partir de células obtenidas a partir de un tejido específico de un solo donante humano. Un homólogo de esa línea celular es una segunda línea celular preparada mediante el mismo procedimiento a partir del mismo tejido, pero de un donante diferente. Por ejemplo, las líneas celulares THLE-2, THLE-3 y THLE-5 son homólogas (véase el Ejemplo 1). Diferentes aislados clonales de una línea celular se denominan líneas celulares derivadas. Por ejemplo, las líneas celulares THLE-5B-cl5.3 y THLE-5B-cl5.4 son derivados de la línea celular THLE-5B.
Las células inmortalizadas preferentemente conservan la expresión de enzimas de fase II, como epóxido hidrolasa, catalasa, glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa y glutatión S-transferasa. Estos enzimas participan en la destoxificación de xenobióticos, y su presencia aumenta la autenticidad del sistema de estudio de la toxicidad celular como modelo de los tejidos humanos.
Aunque se prefieren las líneas celulares inmortalizadas sobre las células primarias para su uso como sistemas de estudio de toxicidad por los las razones que se han analizado más arriba, se ha observado que las líneas celulares inmortalizadas existentes no expresan, o expresan a concentraciones muy bajas, uno o más citocromos P450. Los enzimas P450 son necesarios para el procesado metabólico de ciertos xenobióticos a formas tóxicas, mutágenas o carcinógenas. Así, las células inmortalizadas de la presente invención son transfectadas con uno o más genes del citocromo P450 exógenos para complementar los productos de expresión de los genes endógenos. Los genes P450 exógenos se unen operativamente a vectores de expresión, de modo que los genes se pueden expresar para producir enzimas P450 funcionales. Los enzimas P450 funcionales pueden metabolizar uno o más de los sustratos de la
Tabla 1.
II. Genes del citocromo P450 y vectores
Se pueden aislar clones genómicos o clones de ADNc que codifican genes del citocromo P450 usando sondas de hibridación diseñadas de acuerdo con las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos del gen deseado. Se pueden construir las sondas mediante síntesis química o mediante reacciones en cadena de la polimerasa usando cebadores que se basan en datos de la secuencia para amplificar fragmentos de ADN de mezclas o de bibliotecas (Patentes de los EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202). También se pueden incorporar sustituciones, deleciones y adiciones y similares de nucleótidos al fragmento de ADN del citocromo P450 que se va clonar, siempre que no se altere sustancialmente la función biológica del producto de expresión (Maniatis y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2A ed., 1989, y Berger y Kimmel, Methods in Enzimology, volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987)). Los clones se pueden expresar o se puede eliminar o sintetizar el gen P450 de interés para su uso en otros sistemas. Se han descrito las secuencias de varios aislados de ADNc para el citocromo P4502C9 (Umbenhauer y cols., Biochem, 26:1094-1099, 1987, y Kimura y col., Nucl. Acids Res., 15:10.053-10.054, 1987); P4502E1 (Song y cols., J. Biol. Chem., 261: 16.689-16.697, 1986, y Umeno y col., Biochem, 27:9006-9013, 1988); y P4503A4 (Beaune y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8064-8068, 1986, y González y col., DNA, 7:79-86, 1988). El citocromo P4501A2 está descrito en Jaiswal y col., Nucl. Acids Res., 14:6773-6774, 1986; 2A3 en Yamano y col., Biochem., 29:1322-1329, 1990; y 2D6 en González y col., Genomics, 2:174-179, 1988.
Los miembros de la familia del citocromo P450 difieren entre sí en la especificidad de sustrato y en los tipos tisulares en los que se expresan característicamente. La Tabla 1 muestra los tejidos en los que se expresan característicamente los distintos citocromos P450 y también enumera sustratos carcinógenos adecuados para estudiar la expresión de un citocromo P450 particular en una línea celular. Los diversos miembros de la familia del citocromo P450 a veces se denominan por sus abreviaturas. Por ejemplo, CYP1A1 se refiere al citocromo P450 1A1, CYP1A2 se refiere al citocromo P450 1A2, y así sucesivamente. El término "gen P450" incluye genes que se hibridan con genes P450 conocidos en condiciones estrictas, o genes cuyos productos de expresión se unen específicamente a anticuerpos frente a enzimas P450 conocidos.
TABLA 1
1 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}{148mm} B(a)P,
benzo(a)pireno; AAF, acetilaminofluorano; AF,
aminofluoreno; IQ,
2-amino-3-metilimidazo(4,5-f)quinolina;
MeIQ,
2-amino-3,4-dimetil-imidazo(4,5)quinolina
DEN, N-nitrosodietilamina; DMN,
N-nitrosodimetilamina; AFB _{1} , aflatoxina
B _{1} ; AFG _{1} , aflatoxina G _{1} ;
B(a)P7,8-diol; NNK,
4-(metilnitrosamino-1-3-piridil)-1-butanona.\end{minipage} \cr
 H, hígado; Pu, pulmón; In, intestino; Pla, placenta; EN, epitelio
nasal\cr  * Carcinógenos seleccionados para la evaluación de las
líneas celulares
establecidas.\cr}
III. Sistemas de expresión
Los genes del citocromo P450 se pueden transferir a las líneas celulares mediante transfección de ADN plasmídico o mediante infección por retrovirus. El vector vírico es preferentemente incapaz de replicarse, de modo que se obtienen líneas celulares que expresan los genes P450. La transfección de las células se puede producir mediante los métodos que se usan habitualmente, como tratamiento con fosfato de calcio o de estroncio, microinyección, electroporación o lipofección. Por ejemplo, se pueden infectar las células con un promotor dirigido por molony-LTR o un virus vacunal, o se pueden lipofectar con un constructo de un promotor de adenovirus, un promotor de VIH o un promotor de CMV. El plásmido de ADN transfectado puede contener un gen marcador seleccionable o puede estar cotransfectado con un plásmido que contiene un marcador seleccionable, y en algunos casos el vector vírico contiene un gen marcador seleccionable. Cuando se transfiere uno o más marcadores seleccionables a las células junto con el gen P450, se pueden identificar las poblaciones celulares que contienen el gen P450 y se pueden enriquecer seleccionándolas según el marcador o marcadores. Los marcadores típicamente son resistentes a antibióticos tales como tetraciclina, higromicina, neomicina y similares.
IV. Utilidad de las líneas celulares
Las líneas celulares estables no tumorígenas e inmortalizadas que expresan P450 de la presente invención son útiles en los siguientes aspectos.
(1) Identificación de posibles fármacos quimiopreventivos. Estas células son útiles para cribar productos químicos adecuados para el tratamiento del cáncer y de enfermedades relacionadas, cultivándolas in vitro en un medio que contiene el producto químico que se va a estudiar y posteriormente, después de un periodo adecuado de exposición, determinando si se ha producido, y en qué medida, genotoxicidad, formación de aductos de ADN, mutagenia, transformación celular y/o citotoxicidad después de la exposición a un carcinógeno, por ejemplo, mediante el ensayo de exclusión de azul tripán o ensayos relacionados (Peterson, Methods Enzymol., 58:141, 1979), o mediante ensayos de cultivo como la eficiencia de formación de colonias (MacDonald y cols., Exp. Cell Res., 50:417, 1968), todos los cuales son técnicas estándar bien conocidas en la materia. Una vez que se ha identificado un posible anticarcinógeno, se puede usar éste y las células en otros estudios, como diseño de fármacos.
(2) Estudios del control de la diferenciación epidermoide, e identificación de agentes químicos y biológicos que inducen la diferenciación epidermoide (sólo células bronquiales). Esto se consigue mediante ensayos descritos previamente para células epiteliales bronquiales humanas normales (Masui, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2438, 1986). Algunas células conservan la capacidad de sufrir diferenciación epidermoide en respuesta al suero. La inducción de diferenciación terminal puede ser una manera efectiva de controlar el crecimiento del cáncer. Se criban las sustancias químicas y biológicas para detectar su capacidad de inducir diferenciación añadiéndolas al medio de cultivo de estas células y posteriormente, después de un intervalo de tiempo adecuado, determinando si se ha producido un complejo de cambios que incluyen interrupción de la síntesis de ADN para estudiar los mecanismos biológicos de la diferenciación epidermoide, y la existencia de líneas celulares resistentes al suero y sensibles al suero permite la comparación y la identificación de los genes que participan en el proceso de diferenciación.
(3) Muerte celular programada. También se usan las líneas celulares para identificar agentes que inducen muerte celular programada o apoptosis, que puede tener un impacto importante en la prevención de la transformación maligna. La muerte celular programada se ensaya mediante fragmentación del ADN o análisis de los antígenos de la superficie celular.
(4) Uso de vectores recombinantes de expresión de ADN para producir proteínas de interés. Por ejemplo, se puede recombinar el gen que codifica una proteína de interés terapéutico con segmentos de ADN controladores (es decir, que contienen un promotor con o sin una secuencia potenciadora), se transfieren a la célula (por ejemplo, mediante transfección con fosfato de estroncio) y posteriormente se puede recuperar la proteína producida a partir del sobrenadante del medio de cultivo o de un extracto celular mediante procedimientos rutinarios que son bien conocidos en la materia.
(5) Estudios del metabolismo de carcinógenos y de otros xenobióticos. Se pueden añadir carcinógenos y otros xenobióticos al medio de cultivo de estas células y posteriormente se puede monitorizar la aparición de los productos del metabolismo de estos compuestos mediante técnicas como cromatografía en capa fina o cromatografía líquida de alto rendimiento y similares.
(6) Estudios de mutagenia de ADN. Se pueden añadir sustancias que se sabe o se sospecha que son mutágenos, o precursores de mutágenos, al medio de cultivo de las células y posteriormente se pueden estudiar las mutaciones, por ejemplo, mediante la detección de la aparición de colonias de células mutantes resistentes a fármacos (Thompson, Methods Enzymol., 58:308, 1977). De manera similar, se puede estudiar la mutagenia del ADN mediada por células cocultivando las células con tipos celulares que se sabe o se sospecha que son capaces de secretar compuestos mutágenos (Hsu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75:2003, 1978).
El enzima P450 también se puede asociar a un ensayo de detección de mutágenos como el sistema de Ames Salmonella/microsoma para la detección o el estudio de la frecuencia de mutagenia inducida por contaminantes ambientales, carcinógenos y similares (Ames y col., Mut. Res., 31:347, 1975). Por supuesto, también se pueden usar para estudiar la mutagenia otros procedimientos también conocidos en la materia como la aberración cromosómica y la inducción de intercambio de cromátides hermanas en células ováricas de hámster chino (Galloway y col., Environ. Mutag., 7:1, 1985) o ensayos de mutagenia de células de linfoma murino (Myhr y col., Prog. In Mut. Res., 5:555-568, 1985).
(7) Estudios de agentes que lesionan los cromosomas. Se pueden añadir al medio de cultivo de estas líneas celulares sustancias que se sabe o se sospecha que producen lesión cromosómica, y posteriormente se puede medir la magnitud de la lesión cromosómica mediante técnicas como la medición de la frecuencia de intercambio de cromátides hermanas (Latt y col., en: Tice, R.R y Hollaender, A., Sister Chromatic Exchanges, Nueva York, Plenum Press, pág. 11-ss, 1984).
(8) Estudios de transformación maligna. Se introducen en las células agentes químicos, físicos y víricos, y genes transferidos que incluyen oncogenes, genes supresores tumorales mutantes y ADN genómico de elevado peso molecular de tumores, y se determina la transformación usando ensayos estándar como el crecimiento independiente del anclado o la formación de tumores en ratones atímicos lampiños.
(9) Cribado de posibles agentes quimioterápicos. Se usan células alteradas mediante la transferencia de oncógenes o de carcinógenos químicos (como en el párrafo 7, más arriba) para cribar agentes quimioterápicos mediante pruebas que estudian la reversión del fenotipo transformador de células mediante reducción del crecimiento en agar 50bb o reducción de la formación de tumores en ratones.
(10) Estudios de bioquímica celular. Por ejemplo, los cambios del pH intracelular y de la concentración de calcio intercelular se correlacionan con el crecimiento celular y con la acción de agentes exógenos que incluyen, aunque no se limitan a ellos, los que se describen en los párrafos 1 a 9 más arriba. Para estudiar el pH y la concentración de calcio intercelular, se exponen las células que están contenidas en recipientes de cultivo adecuados a colorantes indicadores fluorescentes y posteriormente se detectan las emisiones de fluorescencia con un espectro fotómetro de fluorescencia (Grynkiewizc y col., J. Biol. Chem., 260: 3440-3450, 1985).
(11) Estudios de la respuesta celular a factores de crecimiento y de la producción de factores de crecimiento. Las células se pueden usar para identificar y purificar factores de crecimiento importantes para el crecimiento y diferenciación de células epiteliales bronquiales y hepáticas humanas. Las células de la presente invención son particularmente útiles para esa aplicación porque crecen en medios sin suero. Por lo tanto, se pueden estudiar las respuestas a factores de crecimiento en medios de cultivo definidos de manera precisa y se pueden identificar y purificar todos los factores que producen las células sin la complicación de la presencia de suero.
(12) Estudios de comunicación intercelular, por ejemplo mediante ensayos de carga con raspado con colorantes. Para determinar si las células que se cultivan in vitro tienen la capacidad de comunicarse mediante uniones en hendidura se puede raspar el cultivo, por ejemplo con un escalpelo, en presencia de un colorante fluorescente en el medio de cultivo. Las células del borde de la zona raspada están alteradas mecánicamente y, por lo tanto, captan el colorante; si se ha producido comunicación intercelular se puede evaluar determinando si las células que están a distancia de la herida también contienen colorante.
(13) Caracterización de los antígenos de superficie celular. Se incuban las células con un anticuerpo frente al antígeno de interés de la superficie celular, y posteriormente se las hace reaccionar con un segundo anticuerpo que está conjugado con un colorante fluorescente. Posteriormente se evalúan las células usando un clasificador celular activado por fluorescencia para determinar si son fluorescentes y, por lo tanto, si poseen el antígeno de superficie.
(14) Estudios con híbridos para la identificación de actividad supresora tumoral. Para determinar si estas líneas celulares contienen genes supresores tumorales, se las fusiona con células tumorales malignas. La presencia de genes supresores tumorales está indicada por la pérdida de malignidad, que se detecta por la pérdida de la capacidad de las células híbridas de formar tumores en ratones atímicos lampiños. Véase Stanbridge y col., Science, 215:252-259, 1982.
(15) Identificación de nuevos genes. Se pueden detectar nuevos genes, que incluyen los genes transformadores en cánceres que aparecen de manera natural como los que se describen en el párrafo 8 más arriba, genes de factores de crecimiento como los que se describen en el párrafo 11 más arriba y genes supresores tumorales como los que se describen en el párrafo 14 más arriba, usando técnicas biológicas moleculares estándar (Davis y col., Methods in Molecular Biology, Nueva York: Elsevier, 1986) y técnicas como clonación de sustracción de ADNc y similares. Estos genes o sus derivados se pueden usar en terapia génica.
Por supuesto, se ensamblan con facilidad kits para cribar agentes carcinógenos o antineoplásicos y para cualquier otro uso según se describe en esta solicitud, y comprenden recipientes que contienen las líneas celulares de la presente invención, medios para propagar las células y reactivos y/o aparatos para detectar respuestas morfológicas, fisiológicas y/o genéticas en las líneas celulares. También se pueden incluir otros componentes que se encuentran sistemáticamente en esos kits, junto con instrucciones para realizar la prueba.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de células inmortalizadas A. Células bronquiales
Las líneas celulares epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas que se usan para producir células transfectadas con el citocromo P450 de la presente invención están descritas en la Patente de EE.UU. Nº 4.885.238. Estas líneas celulares se preparan como se señala a continuación.
Se cultivaron células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) procedentes de explantes de piezas traqueobronquiales de necropsia de pacientes sin cáncer, como describieron Lechner y col., J. Tissue Culture Methods, 9:43-48, 1985. Las células NHBE se infectaron con un virus híbrido adenovirus 12-SV40. En todos los casos la duración de la vida de estos cultivos era mayor que la de las células NHBE; la mayor parte de los cultivos experimentó un periodo prolongado de senescencia denominado "crisis". Con el cultivo continuado en algunos casos aparecieron colonias de células que habían escapado a la senescencia; esas colonias supervivientes se pasaron posteriormente durante periodos prolongados de tiempo y mostraron un potencial de crecimiento ilimitado.
Al igual que las células NHBE, pero al contrario que las células del carcinoma bronquial, algunas de las líneas celulares así obtenidas mantenían la capacidad de experimentar diferenciación epidermoide en respuesta a la exposición al suero. La inyección de estas células en ratones atímicos lampiños no dio lugar a la formación de tumores después de periodos de hasta nueve meses. Además, se encontró que estas líneas celulares eran receptores adecuados para la transfección de genes adicionales y que eran útiles para estudiar el potencial citotóxico de agentes químicos y físicos, la capacidad de los agentes biológicos de inhibir o promover el crecimiento, y el potencial de los agentes químicos y biológicos de inducir diferenciación epidermoide.
Desarrollo de la línea celular BEAS-2B
Una línea celular preferida para su uso en esta invención es BEAS-2B, que se preparó como sigue. Las células NHBE se cultivaron a partir de explantes de piezas de autopsia de pacientes sin cáncer, como describieron Lechner y col., J. Tissue Culture Methods, 9:43-48, 1985. Las células se cultivaron en un medio sin suero, LHC-9, se recogieron mediante tripsinización y se sembraron en 10 ml de medio de cultivo en placas de cultivo de 100 mm (Lux, Miles Scientific, Naperville, IL), cuyas superficies de cultivo habían sido recubiertas con una solución de albúmina sérica bovina, fibronectina y colágeno (Lechner y col., supra).
El virus híbrido adenovirus 12-SV40 (Ad12SV40) (Schell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55:81-88, 1966) se cultivó en células Vero como describieron Rhim y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:313-317, 1981. Las células NHBE se expusieron al virus a 37ºC durante 4 horas a una multiplicidad de infección de aproximadamente 100. Cuando los cultivos se hicieron confluentes, se subcultivó cada placa en dos matraces de 75 cm^{3}. Una vez más se permitió que las células se hicieran confluentes y posteriormente se volvieron a nutrir dos veces a la semana hasta que aparecieron colonias transformadas y las células normales experimentaban senescencia. La senescencia de las células normales se aceleró exponiendo los cultivos a SFT al 1% en LHC-9 durante 28 días (Lechner y col., Differentiation, 25:229-237, 1984); todos los subcultivos posteriores de estas células se realizaron en medio LHC-9 sin suero. Se subcultivaron las colonias individuales 41 días después de la infección vírica y las cepas celulares así obtenidas con este experimento se denominaron BEAS-2B. La inmunotransferencia Northern de las células BEAS-2B ha mostrado que estas células expresan los enzimas de fase II epóxido-hidrolasa, catalasa, glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa y glutatión S-transferasa.
Cuando se las complementa con citocromo P450 exógeno, las células BEAS-B2 representan un auténtico sistema modelo para el análisis del tejido pulmonar normal in vivo. Las células BEAS-2B proceden de células epiteliales bronquiales humanas, que son las probables células progenitoras de todos los tipos de cáncer de pulmón. Además, excepto para los citocromos P450, que se expresan a concentraciones reducidas o que no se expresan, las células BEAS-2B expresan muchos enzimas que participan en el proceso de activación de los carcinógenos y mutágenos, como glutatión S-transferasa, epóxido hidrolasa Y NADPH citocromo P450 reductasa. Las células BEAS-2B se han depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection y se les ha asignado el número de acceso CRL9609.
B. Líneas de células hepáticas
La preparación y propiedades de las líneas celulares hepáticas inmortalizadas no tumorígenas (antes de la transfección con los genes P450 exógeno) se analiza con más detalle en la solicitud pendiente de tramitación USSN 07/844.873. Los detalles importantes de la preparación de las líneas celulares también se describen a continuación. Se resumen las propiedades de las líneas celulares.
(1) Preparación (a) Cultivo primario del tejido hepático adulto normal
El medio LCM (Lechner J.F., y col., Cancer Detect. Prev., 14:239 (1989)) está formado por medio PFMR-4(Biofluids, Rockville, MD) en el que la concentración de Ca^{2+} está reducida a 0,4 mM y la arginina está sustituida por ornitina 0,3 mM, complementado con insulina (1,45 \muM), transferrina (125 nM), toxina colérica (300 pM), factor de crecimiento epidérmico (825 pM), hidrocortisona (0,2 \muM), triyodotironina (10 nM), ácido retinoico (10 nM), fosfoetanolamina (0,5 \muM), ExCyte V (312 \muM), extracto de hipófisis bovina (7,5 \mug de proteína/ml) y suero desnaturalizado químicamente.
Para hacer células Hep-G2 condicionadas en medio LCM (HGLCM) se mantuvieron células Hep-G2 (American Type Cuylture Collection, Rockville, MD) en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%. Los cultivos casi confluentes de dichas células se lavaron dos veces con LCM y posteriormente se mantuvieron en LCM durante 72 horas. Se eliminó el medio del sobrenadante (HGLCM), se esterilizó mediante filtración a través de una membrana de 0,22 \mum y se almacenó en condiciones estériles.
Las células epiteliales hepáticas normales se obtuvieron mediante perfusión con colagenasa/dispasa del lóbulo hepático izquierdo de hígados de autopsias inmediatas de donantes adultos sin datos clínicos de cáncer (Hsu, I.C., y col., In Vitro Cell Develop. Biol., 21:154 (1985)). Los cultivos se inocularon en matraces que habían sido recubiertos previamente con colágeno I (Vitrogen^{TM}, Celtrix Laboratorios, Palo Alto, CA) y se incubaron durante una noche en medio de Waymouth que contenía suero bovino fetal al 10%. Al día siguiente se lavaron los cultivos con suero salino tamponado con fosfato (PDS) y el medio se cambió a HGLCM.
A los 2-4 días del aislamiento de las células normales, eran evidentes grupos de células en replicación espaciadas de manera aleatoria con morfología epitelial. Estos cultivos formaron una monocapa confluente después de 10-14 días de incubación. Estas células normales se podían subcultivar a una relación de separación de 1:4 usando la misma solución de colagenasa/dispasa que se usó para establecer el cultivo primario para eliminar las células de la superficie del recipiente de cultivo. La duración media de la vida de estos cultivos de células epiteliales hepáticas normales fue de 12 duplicaciones poblacionales.
(b) Producción del retrovirus que expresa marcadores de SV40
Se construyó un retrovirus recombinante que contenía el gran gen del antígeno T de SV40 mediante inserción del fragmento BgII-HpaI del ADN del virus SV40 (nucleótidos 5235-2666) en el punto BamHII del vector retrovírico pZipNeoSVX (Jat, P.S., y col., Mol. Cell. Biol., 6:1204 (1986)) usando conectores BamHII y técnicas de ADN recombinante estándar. El fragmento del genoma de SV40 que se empleó carecía del promotor temprano y del punto de poliadenilación.
Se hicieron partículas víricas recombinantes infecciosas infectando la línea celular empaquetadora anfotrópica PA317 con el virus recombinante ecotrópico que se establece transfectando el vector obtenido más arriba en la línea empaquetadora ecotropica Psi2. Las células transfectadas se aislaron mediante selección con neomicina y se aislaron 10 clones. Las células PA317 clonadas se propagaron en medio DMEM complementado con SBF al 10%. El medio se cambió a medio PC-1 sin suero (Ventrex Laboratorios, Pórtland, ME) y los virus recogidos se titularon infectando 8 x 10^{4} células NIH 3T3 en una placa de 60 mm con varias diluciones del medio del sobrenadante que contenía virus en presencia de polibreno 8 \mug/ml y contando las colonias después de 10 días de selección usando 750 \mug/ml de neomicina.
(c) Infección de las células de cultivos tisulares hepáticos primarios
Se usó una mezcla de virus de 7 de los 10 clones de las células PA317 transfectadas para infectar los cultivos tisulares hepáticos primarios. Se infectaron 8 x 10^{4} células de los cultivos primarios con el virus recombinante durante dos horas en presencia de polibreno 8 \mug/ml en medio PC-1. Después de la infección los cultivos se lavaron con suero salino tamponado con HEPES (HBS) y se incubaron en medio LCM. La infección con el virus recombinante hizo que prácticamente todas las células hepáticas del cultivo experimentaran una división rápida. De esta manera se han establecido varios cultivos. Todos ellos se han pasado como cultivos en masa. Inicialmente las células THLE experimentaron aproximadamente 25 duplicaciones poblacionales durante las primeras seis semanas después de la infección, y posteriormente disminuyó mucho el crecimiento. Las células se criopreservaron en cada pase durante este periodo de crecimiento temprano.
La línea celular THLE-2 se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD, el 16 de mayo de 1989, y se le asignó el número de acceso CRL10149. La línea celular THLE-3 se depositó bajo los términos y condiciones del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection el 14 de enero de 1993, y se le asignó el número de acceso CRL11233. La línea celular THLE-5 (a veces denominada también "THLE-5B") se depositó bajo los términos y condiciones del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection el 23 de abril de 1992, y se le asignó el número de acceso CRL11113.
La línea celular THLE-B5 se usó en muchos de los experimentos de los Ejemplos 2-5.
(2) Propiedades de las líneas celulares THLE
Transformación del ADN. Las células THLE contienen aproximadamente una copia del gen del antígeno T de SV40 según se determina mediante inmunotransferencia Southern.
Inmortalidad. El crecimiento disminuyó de manera marcada después de \approx25 DP durante las primeras seis semanas después de la infección. En este momento se usaron las células THLE criopreservadas durante el pase temprano para determinar las respuestas de crecimiento a los complementos con medio LCM. La tasa de crecimiento clonal se pudo optimizar omitiendo los complementos de lípidos (ExCyte V) y de toxina colérica, sustituyendo la ornitina por arginina y sustituyendo el medio condicionado con HepG2 por T2-CM. Con este medio de cultivo modificado (MLCM) las células THLE han experimentado > 130 DP sin datos de senescencia. Su máximo tiempo aparente de DP es de 24 horas, y su eficiencia de formación de colonias es \approx 15%.
Expresión de rasgos fenotípicos de hepatocitos
La citoqueratina 18, pero no la citoqueratina 19, se expresó uniformemente en las células THLE en el pase temprano, mientras que en el pase 10-12 todas las células también expresaban citoqueratina 19. No se detectó expresión de \alpha-fetoproteína ni de factor VIII en el pase temprano ni tardío, mientras que sí había \alpha_{1}-antitripsina y \alpha_{2}-macroglobulina. Se detectó fácilmente albúmina en el citoplasma de las células THLE en el pase temprano mediante inmunocitoquímica. Las islas de células positivas para albúmina estaban rodeadas por acúmulos de células que se tenían con menos intensidad, lo que indicaba clones o tipos celulares diferentes. El análisis de inmunotransferencia mostró que las células THLE de pase tardío pueden secretar albúmina. La secreción de albúmina por las células THLE estaba entre \approx 300 pg/ml y 14,5 ng/ml. Había una positividad débil a \gammaGT mediante citoquímica en algunas colonias de células THLE, así como en los cultivos primarios antes de la introducción del antígeno de SV40. En la misma prueba las células 3T6 eran negativas, mientras que las células HepG2 mostraron una elevada actividad enzimática.
Análisis de cariotipo y de oncogenia. El análisis de cariotipo mostró que las células THLE son hipodiploides, y la mayor parte de los cariotipos son casi diploides. También se detectaron los efectos típicos del antígeno T de SV40 en las células THLE en el pase 22, es decir, monosomía del cromosoma 13 y deleciones de los cromosomas 2 y 8. Cuando se estudió en las líneas celulares la formación de tumores por la inyección subcutánea de 10^{6} células por cada ratón atímico lampiño (20 animales) no se encontraron tumores después de 12 meses de observación.
Estudios metabólicos. Se investigó en células THLE el metabolismo, citotoxicidad y formación de productos de ADN de 3 clases químicas diferentes de carcinógenos. AFP_{1}, B[a]P y DMN producían una citotoxicidad dependiente de la dosis en las células THLE, lo que indica la activación metabólica de estos promutágenos a metabolitos genotóxicos. AFP_{1}, B[a]P y DMN formaron 3,5\pm0,9, 30,4\pm 3,9 y 1,5\pm0,1 fmol de aducto por cada \mug de ADN, respectivamente, en células HTLE cultivadas en recipientes cilíndricos. El principal aducto que se encontró en células tratadas con B[a]P marcado con ^{3}H era cromatográficamente indistinguible del principal producto que se formaba cuando se permitía que t-8-dihidroxi-c-9,10-epoxi-7,8,9,10-tetrahidrobenzo[a] pireno (BDPO) al (\pm)7% reaccionara con el ADN. El análisis después del marcado con ^{32}P reveló el aducto N^{1}-metildesoxiguanosina en las células THLE incubadas con DMN. El principal aducto de las células THLE expuestas a AFB_{1} era 8,9-dihidro-8-(2,6-diamino-4-oxo-3,4-dihidropirimid-5- il-formamido)-9-hidroxiaflatoxina B_{1} (AFB_{1}-FAPyr), mientras que AFB_{1}-diol y 8,9-dihidro-8(N^{1}-guanil)-9-hidroxiaflatoxina B1 fueron aductos menores. La preincubación de las células con Aroclor 1254, un inductor del CYP1A1/1A2, estimuló tres veces la formación de aductos relacionados con B[a]P hasta 4,9\pm2,7 fmol/\mug de ADN, disminuyó los aductos relacionados con DMN a 3,4\pm0,1 fmol/\mug de ADN, y no afectó a la formación de aductos de AFB_{1} (1,6\pm0,4 fmol/\mug de ADN). El pretratamiento con \beta-naftoflavona abolió la capacidad de las células THLE de activar al B[a]P. de manera similar, el tratamiento con etanol de las células THLE disminuyó la activación metabólica de DMN.
Expresión de enzimas de fase I y II. El análisis de ARN de la concentración en estado estable del ARNm de CYP1A1 fue compatible con los resultados de los análisis de los aductos de ADN. No se pudo detectar ARNm de CYP1A1 en células controles cultivadas como cultivos en recipientes cilíndricos. La exposición a Aroclor o a B[a]P incrementó la concentración en estado estable del ARNm de CYP1A1. Cuando se trató a las células con ambos agentes, los efectos inductores de CYP1A1 parecieron ser aditivos. Por el contrario, ni DMN ni AFB_{1} indujeron la expresión del ARNm de CYP1A1 en cultivos de células THLE en recipientes cilíndricos. No se pudieron detectar otros CYP (CYP1A2, CYP2A3, CYP2E1, CYP2D8 y CYP3A4) mediante análisis de transferencia de
ARN.
Las células THLE expresan la misma cantidad de ARNm de la epóxido hidrolasa, pero menos ARNm de la NADPH CYP reductasa. Los enzimas destoxificadores como superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa se expresan en células THLE a concentraciones de ARNm en estado estable similares a las cantidades que se encuentran en el tejido hepático humano. No se encontró ARNm de GST \pi en el tejido humano original (no se muestran los datos).
Conclusiones. Estos resultados indican que las líneas celulares THLE muestran muchas de las propiedades que se asocian al estado quiescente de los hepatocitos adultos normales, aparte de la expresión de una dotación completa de enzimas del citocromo P450. Aunque las células THLE son capaces de cierto grado de metabolismo de sustancias tóxicas, carcinógenos o mutágenos, esta capacidad es mucho menor que la de las células THLE transfectadas con P450 de la presente invención. Véase el Ejemplo 5.
Ejemplo 2 Introducción de los enzimas P450 en las células inmortalizadas A. Sistema de infección de retrovirus defectuosos pXT1
El ADNc de los enzimas del citocromo P450, 1A2, 2A3, 3D6, 2E1 y 3A4, se introdujo mediante retrovirus anfotrópicos recombinantes a títulos elevados en las células BEAS-2B. estos retrovirus se generaron clonando los correspondientes ADNc en un plásmido pXT1 (Boulter y col., Nucleic Acid Res., 15:7194, 1987) y transfectando los plásmidos recombinantes en líneas empaquetadoras cocultivadas con cubiertas anfotrópicas (PA317) y ecotrópicas (Psi2) usando precipitación con fosfato cálcico (Bestwick y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5404-5408, 1988) (véase la 
\hbox{Figura 1).}
Después de 10 días se recogieron los virus de cultivos confluentes de PA317/Psi2 en medio PC-1 sin suero (Ventrex Laboratories, Portland, OR). Se determinaron los títulos en células NIH3T3 y se expresaron como clones resistentes a neomicina/ml de sobrenadante. Las células BEAS-2B se infectaron durante dos horas con virus P450 o con el virus control, pXT1, en medio PC-1 complementado con polibreno 8 \mug/ml (Tabla 2).
TABLA 2
2
Se empleó un cociente igual de células a unidades formadoras de colonias. Cuarenta y ocho horas después de la infección se seleccionaron las células BEAS-2B según la resistencia a neomicina G418 con neomicina 125 \mug/ml durante ocho días. Posteriormente se seleccionaron las células según la presencia de los genes introducidos mediante análisis de inmunotransferencia. A modo de ejemplo, para las células BEAS-21A2, la población y 3 clones (clon 8 > clon 3 > clon 6) expresaban la proteína correspondiente al retrovirus P450 respectivo. Según esto, el clon 8 (cl8) mostró la mayor sensibilidad, y era hasta 150 veces más reactivo al efecto citotóxico y hasta 250 veces al efecto genotóxico de un compuesto modelo, AFB_{1}, que el control.
B. Sistema de lipofección CMV-plásmido
Se generaron constructos pCMV-citocromo P450 clonando ADNc de citocromo P450 humano en el extremo 3' del promotor de la región génica temprana inmediata del citomegalovirus (CMV). Véase la Figura 2. Los fragmentos de ADNc se insertaron en el punto BamHI (después de las modificaciones de los extremos adhesivos) del neoplásmido pCMV (amablemente proporcionado por Bert Vogelstein, Johns Hopkins University) para generar los constructos pCMV-citocromo P450. Baker y col., Science (1990), 249:912-915, han descrito la construcción del pCMV. pA es la secuencia de poliadenilación del gen de la \beta globina del conejo. Neo es el gen de la neomicina seleccionable que confiere resistencia a la selección G418. Amp^{R} es el gen de resistencia a ampicilina.
Los constructos pCMV-citocromo P450 (y el vector pCMV como control) se introdujeron en líneas celulares hepáticas y bronquiales mediante lipofección. Brevemente, se lipofectaron 1 x 10^{6} células con 10 \mug de ADN en 5 ml de medio Opti-Mem (GIBCO-BRL) que contenía 50 \mug de Lipofectin (GIBCO-BRL). Después de tres horas se lavaron las células y se añadió medio nuevo que contenía suero bovino fetal desnaturalizado químicamente al 10% (Upstate Biotechnology, Inc., Nueva York). Después de 48 horas las células THLE-5B o BEAS-B2 transfectadas se seleccionaron según su resistencia a G418 con G418 50 \mug/ml durante dos semanas.
Ejemplo 3 Análisis de inmunotransferencia de los genes P450 introducidos
Después de la introducción de los genes P450 mediante infección con retrovirus con replicación defectuosa o lipofección, como se ha descrito en el Ejemplo 2, se estudió en las líneas celulares la expresión de los genes P450 mediante inmunotransferencia. Se sometieron muestras del extracto proteico total (aproximadamente 2 x 10^{4} células) y fracciones microsómicas de citocromo P450 humano estándar (10 \mug) (Gentest Corp., Woburn, MA) (como controles positivos) a SDS-PAGE (genes de poliacrilamida al 15%) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando un dispositivo de electotransferencia (Ancos, Dinamarca). Los filtros se incubaron con anticuerpos policlonales frente al citocromo P450 en estudio (diluido al 1:50) y se revelaron usando un kit de tinción de IgG de conejo frente a fosfatasa alcalina ImmunoPure ABC (Pierce, Socochim SA, Suiza). Las Figuras 3-7 muestran la expresión de los citocromos P450 1A2, 2A6, 3A4, 2E1 Y 2D6 en las células BEAS-2B respectivas que han sido transfectadas con los genes respectivos unidos al vector pCMV. También se muestran fracciones microsómicas estándar (M) como controles positivos y células BEAS-2B transfectadas con p-CMV no modificado (B-CMV-neo) como controles negativos. Estos resultados indican que los genes del citocromo P450 exógeno transfectados se expresan en células BEAS-2B. Se obtuvieron resultados similares después de transfectar células THLE-5B. La Figura 8 muestra que la expresión del citocromo P450-1A2 se obtuvo en líneas celulares THLE-5B-CMV 1A2. No se observó expresión en las células THLE-5B-CMV controles (que carecen de un gen P450 exógeno).
Ejemplo 4 Metabolismo de los sustratos del citocromo P450 en células transfectadas con genes P450 exógenos
Se estudiaron células que contenían genes P450 exógenos para analizar su capacidad de metabolizar los sustratos de P450 y demostrar de esta manera la funcionalidad de los enzimas del citocromo P450, que se debía a la expresión de los genes exógenos. En un experimento se usó como sustrato etoxicumarina para determinar la funcionalidad del citocromo P450 1A2 en células BEAS-2B y THLE-5B. los cultivos se colocaron en placas de Petri a 0,25 a 0,5 x 10^{6} células/placa de Petri de 60 mm. Al día siguiente se sustituyó el medio por 2 ml de tampón de ensayo (sacarosa 0,2 M, Tris 0,05 M, pH 8,5, MgCl_{2} 0,01 M) que contenía como sustrato etoxicumarina 250 \muM. Después de la incubación a 37ºC durante el tiempo deseado, se acidificó 1,0 ml de sobrenadante mediante la adición de 100 \mul de TCA al 20%. Después de la centrifugación se mezcló el sobrenadante con 2,0 ml de tampón de glicina-NaOH 1,6 M, pH 10,3, y se leyó la fluorescencia con excitación a 390 nm y emisión a 440 nm. Se puede cuantificar comparando la fluorescencia de una cantidad conocida de umbeliferona. La Tabla 3 muestra la actividad de la ECD para las líneas celulares AHH-1A2/Hyg (línea celular linfoblástica que contiene CYP1A2, descrita por Crespi, supra), BEAS-2B-1A2 cl8 (línea celular BEAS-2B que contiene CYP1A2 unido al sistema de expresión pXT1), BEAS-2B-CMV-1A2 cl2 (línea celular BEAS-2B que contiene CYP1A2 unido al sistema de expresión pCMV) y THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 y THLE-5B-CMV-1A2 cl5.4 (diferentes clones de células THLE-5B que contienen citocromo CYP1A2 unido al vector pCMV). La Figura 4 muestra la evolución temporal de la actividad ECD del CYP1A2 para las líneas celulares THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 y THLE-5B-CMV-1A2 cl5.4.
TABLA 3
3
En un experimento similar también se mostró que las células THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 son capaces de metabolizar el sustrato etoxiresofurina aproximadamente 100 veces más rápidamente que las células controles THLE-5B-CMV-neo cl5.16. Véase la Tabla 4. Esto confirma que el enzima CYPA12 que se produce por la expresión del gen exógeno también es funcional para el metabolismo de etoxiresofurina.
TABLA 4
4
En otro experimento se mostró que las células BEAS-2B que contienen citocromo p450 2A6 exógeno son capaces de metabolizar cumarina a una tasa elevada en comparación con las células controles, lo que indica la funcionalidad del producto de la expresión de 2A6. Véase la Tabla 5.
TABLA 5
5
Ejemplo 5 Análisis de citotoxicidad y genotoxicidad de líneas celulares que expresan P450 A. Análisis de citotoxicidad de AFB_{1}
Se expusieron los cultivos a las concentraciones indicadas de aflatoxina B_{1} (AFB_{1}). Cada cultivo contenía aproximadamente 1 x 10^{5} células por cada placa de 60 mm. Después de 28 horas se lavaron las células y se añadió medio nuevo. Después de cinco días se determinó el número de células. La citotoxicidad se expresa como la tasa de supervivencia en relación con las células correspondientes no tratadas. Los valores se expresan como media\pmDT de dos experimentos independientes.
La Tabla 6 y la Figura 10 comparan la supervivencia relativa de diferentes tipos celulares después del tratamiento con varias dosis de AFB_{1}. AHH-1A2/Hyg es la línea celular linfoblástica que expresa P450 descrita por Crespi, supra, y AHH-1TK+/- es un control que carece de un gen de P450 exógeno; BEAS-2B-1A2 cl8 y BEAS-2B-CMV-1A2 cl2 son líneas celulares BEAS-2B que contienen un gen P5450 exógeno bajo el control respectivo de los sistemas de expresión pXT1 y pCMV; BEAS-2B-pXT1 cl4 y BEAS-2B-CMV-neo cl2 son líneas celulares BEAS-B2 controles que contienen vectores de expresión pXT1 no modificado y pCMV; THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 es una línea THLE-5B que contiene CYP1A2 en un vector pCMV, y THLE-5B-CMV-neo cl5.16 es una línea celular THLE-5B control que contiene un vector pCMV no modificado. También se determinó la supervivencia de las cepas THLE-5B mediante un ensayo de microtítulo de 96 pocillos. En este ensayo se trató a 1x 10^{4} células/pocillo con AFB_{1} durante 28 horas. Las células se tiñeron con violeta cristal cuatro o cinco días después. Después de la extracción del colorante se leyeron las placas a 630 nm.
6
7
La Tabla 6 muestra que todas las líneas celulares que contienen un gen P450 exógeno mostraban una menor supervivencia que los controles correspondientes. La Tabla también indica que las células BEAS-2B que expresan el P450 de pCMV son más sensibles que las células que expresan el P450 de pXT1, lo que indica que la unión operativa de un gen P450 al promotor del citomegalovirus en pCMV favorece una mayor expresión de P450. De las diversas líneas celulares que se han estudiado, las células THLE-5B que contienen P450 unido al sistema de expresión de pCMV mostraron la mayor sensibilidad a AFB_{1}.
TABLA 7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 7 muestra los valores de DC_{50} obtenidos a partir de los datos de la Tabla 6. La DC_{50} es la dosis de carcinógeno necesaria para obtener una supervivencia de 50%. A partir de esta Tabla se pueden extraer conclusiones similares a las que se han analizado más arriba para la Tabla 6.
También se ha estudiado la citotoxicidad de la aflatoxina B_{1} en cultivos de BEAS-2B que expresan otros genes exógenos del citocromo P450, junto con células controles adecuadas. La Figura 11 muestra que las células BEAS-2B-CMV-3A4 cl7 (células BEAS-2B que contienen un gen del citocromo P450 3A4 exógeno unido al vector pCMV) muestran una mayor citotoxicidad que las células BEAS-2B-CMV-neo cl2 (células BEAS-2B que contienen el vector pCMV pero qye carecen de un gen P450 exógeno).
B. Análisis de genotoxicidad de AFB_{1}
La Tabla 8 da la formación de aductos de ADN con AFB_{1} para la línea celular BEAS-2B-1A2 cl8 en comparación con un control BEAS-2B-pXT1 cl4. Éstas son las mismas líneas celulares que se describen en la Tabla 6. La formación estuvo elevada por un factor de 1000 en el clon 8.
TABLA 8
9
C. Análisis de la citotoxicidad de AFG_{1}
La Figura 12 muestra el análisis de la citotoxicidad para la aflatoxina G_{1} en comparación con la aflatoxina B_{1} en los clones BEAS-2B-pXT1 y BEAS-2B-1A2. Se expuso a las células a varias concentraciones de los mutágenos durante 28 horas. Cada cultivo contenía 250 células por cada placa de 60 mm. Después de 7-10 días se determinó la citotoxicidad midiendo el número de colonias de cada placa. El número de colonias de los cultivos tratados con mutágenos se dividió entre el número de colonias de los cultivos no tratados para obtener la supervivencia relativa. Cada punto temporal refleja al menos tres experimentos independientes. La Figura 12 muestra que las células BEAS-2B-1A2 son más sensibles tanto a aflatoxina B_{1} como a aflatoxina G_{1} que las células controles que carecían del gen del citocromo P450-1A2 exógeno.
D. Análisis de la citotoxicidad de PhIP
Se estudió la citotoxicidad de PhIP en células PHLE-5B que expresaban el citocromo CYP1A2 procedentes del vector pCMV usando el procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 5.A. Se expusieron cultivos de células a las concentraciones indicadas de PhIP. La Figura 13 muestra que la línea celular THLE-5B-CMV-1A2 cl5.3 es bastante más sensible a PhIP que la cepa control THLE-5B-CMV-neo cl5.18 (que contiene el vector pCMV no modificado).
E. Análisis de la citotoxicidad de dietilnitrosamina y dimetilnitrosamina
Se estudió la citotoxicidad de dietilnitrosamina y dimetilnitrosamina en células BEAS-B2 que expresaban el citocromo P450 2E1 procedente del pCMV. Las Figuras 14 y 15 muestran que estas células son más sensibles a dietilnitrosamina y dimetilnitrosamina que las líneas celulares controles que contienen el vector pCMV no modificado.

Claims (9)

1. Una línea celular epitelial de hígado adulto humano estable y no tumorígena que contiene un gen del citocromo P450 exógeno capaz de expresarse en dicha línea celular producida insertando dicho gen del citocromo P450 exógeno en una línea celular THLE-5B, depositada como ATCC CRL11113, o un aislado clonal de la misma.
2. La línea celular de la reivindicación 1, en la que el gen del citocromo P450 exógeno se selecciona del grupo formado por los citocromos P450 1A1, 1A2, 2A6, 3A3, 3A4, 2B6, 2B7, 2C9, 2D6 y 2E1.
3. La línea celular de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho gen del citocromo P450 exógeno está unido operativamente a un promotor del citomegalovirus.
4. La línea celular de una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el gen del citocromo P450 exógeno es 1A2.
5. Un procedimiento para identificar o estudiar la mutagenia, citotoxicidad o carcinogenia de un agente que comprende las etapas de:
a)
hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto la línea celular de una de las reivindicaciones 1 a 4 con un agente sospechoso de ser un mutágeno, una citotoxina o un carcinógeno, y
b)
determinar o monitorizar esos efectos en dicha línea celular que sean indicativos de mutagenia, citotoxicidad o carcinogenia.
6. El procedimiento para identificar o estudiar la actividad quimiopreventiva de un agente que comprende las etapas de:
a)
hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto la línea celular de una de las reivindicaciones 1 a 4 con un agente sospechoso de ser un quimiopreventivo en presencia de un carcinógeno, y
b)
determinar o monitorizar esos efectos en dicha línea celular que sean indicativos de actividad quimiopreventiva.
7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que se hace que dicho agente reaccione, se cultive o se ponga en contacto con dicha línea celular antes de la adición de dicho carcinógeno.
8. Un procedimiento para determinar los metabolitos activados por un carcinógeno o un xenobiótico, que comprende las etapas de:
a)
hacer reaccionar, cultivar o poner en contacto la línea celular de una de las reivindicaciones 1 a 4 con el posible carcinógeno o xenobiótico, e
b)
identificar los metabolitos y/o sus efectos.
9. Un kit que comprende la línea celular de una de las reivindicaciones 1 a 4, medios para propagar dicha línea celular, y reactivos para diagnosticar una respuesta de dicha línea celular a un agente carcinógeno, mutágeno o tóxico.
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