EA005426B1 - Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному соединению и способы их применения - Google Patents

Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному соединению и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA005426B1
EA005426B1 EA199800669A EA199800669A EA005426B1 EA 005426 B1 EA005426 B1 EA 005426B1 EA 199800669 A EA199800669 A EA 199800669A EA 199800669 A EA199800669 A EA 199800669A EA 005426 B1 EA005426 B1 EA 005426B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
virus
vector
gene
viral
indicator gene
Prior art date
Application number
EA199800669A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199800669A1 (ru
Inventor
Дэниэл Дж. Кэпон
Кристос Джон Петропоулос
Original Assignee
Виролоджик, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Виролоджик, Инк. filed Critical Виролоджик, Инк.
Publication of EA199800669A1 publication Critical patent/EA199800669A1/ru
Publication of EA005426B1 publication Critical patent/EA005426B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающему (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы; (б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах; и (в) сравнение уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату. Настоящее изобретение также относится к способу определения устойчивости к противовирусному лекарственному препарату вируса, инфицирующего пациента. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу оценки биологической активности потенциального противовирусного соединения; векторам для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, содержащим фрагмент, полученный от пациента, и индикаторный ген; и упаковывающим

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к тестам на чувствительность и устойчивость к противовирусным препаратам, используемым для установления эффективных схем применения лекарств при лечении вирусных инфекций. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым векторам, хозяйским клеткам и композициям для осуществления этих новых тестов на чувствительность и устойчивость к противовирусным препаратам. Настоящее изобретение относится также к отбору кандидатов в лекарственные средства по их способности ингибировать отобранные вирусные последовательности и/или вирусные белки. В частности, настоящее изобретение относится к использованию техники рекомбинантной ДНК для получения первого конструкта резистентного тест-вектора, включающего сегмент, производимый пациентом, и индикаторный ген, с последующим введением резистентного тест-вектора в хозяйскую клетку и определением экспрессии или ингибирования продукта индикаторного гена в хозяйской клеткемишени в присутствии противовирусного лекарственного средства. Настоящее изобретение относится также к средствам и способам идентификации противовирусных лекарственных препаратов, которые обладают разными моделями (схемами) резистентности при сравнении с существующими противовирусными лекарственными препаратами. Настоящее изобретение относится также к способам и композициям для идентификации и оценки биологической эффективности потенциальных терапевтических соединений. Более точно, настоящее изобретение относится к тестам на лекарственную чувствительность и резистентность, пригодными для создания оптимального терапевтического режима для лечения разнообразных вирусных болезней, в том числе, например, Ηΐν/ΑΙΌδ и гепатитов.
Уровень техники Вирусная устойчивость к лекарственному препарату
Использование противовирусных соединений для химиотерапии и химиопрофилактики вирусных болезней представляет собой относительно новое направление в области инфекционных болезней, особенно в сравнении с более чем 50-летним опытом в области антибактериальных антибиотиков. История создания противовирусных соединений не была простой потому, что вирусы преподносят множество специфических проблем. Вирусы должны реплицироваться внутриклеточно и часто используют ферменты клетки хозяина, макромолекулы и органеллы для синтеза вирусных частиц. По этой причине безопасные и эффективные противовирусные соединения должны обладать способностью различать с высокой степенью эффективности клеточную и вирус-специфическую функции. Кроме того, вследствие природы вирусной репликации, оценка ίη νίίτο чувствительности вирусных изолятов к противовирусным соединениям должна осуществляться в комплексной культуральной системе, состоящей из живых клеток (например, тканевая культура). Результаты таких аналитических систем широко варьируют в соответствии с используемым типом клеток тканевой культуры и условиями анализа. Несмотря на эти сложности, для терапии ΑΙΌ3 одобрено девять лекарственных препаратов, пять ингибиторов обратной транскриптазы ΑΖΤ, бб1, ббС, б4Т, 3ТС, один ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, невирапин и три протеазных ингибитора, саквинавир, ритонавир и индиновир и недавно созданные несколько дополнительных кандидатов в противовирусные лекарственные препараты, такие как нелфинавир, делавиридин, νΧ-478 и 1592.
Резистентный вирусный препарат представляет собой практическую задачу, связанную с высокой скоростью вирусной репликации и частотой мутирования. Лекарственная устойчивость мутантов была впервые установлена для поксвирусов в отношении тиосемикарбазона (Арр1еуагб и XV ау (1966) Βτίΐ. 1. Εχρίΐ. Ра11ю1. 47, 144-51), для полиовируса в отношении гуанидина (Ме1шск с соавт. (1961) ЗДепсе 134, 557), для вируса гриппа А в отношении амантадина (ОхГогб с соавт. (1970) №1иге 226, 82-83; Сосйтап с соавт. (1965) Αηη. ΝΥ Асаб. Зс1. 130, 423-429) и для вируса простого герпеса в отношении йоддезоксиуридина (4а\\'е1х с соавт. (1970) Αηη. ΝΥ Αсаб. Зск 173, 282-291). По имеющимся данным, было идентифицировано приблизительно 75 мутаций лекарственной устойчивости Ηΐν (Ме11от8 с соавт. (1995) Ιηΐηΐ. Αηΐίνίηΐ Νε^8, приложение и Соибга, Ι.Η. с соавт. (1996) 1. νίτο1. 70, 8270-8276).
Небольшие и продуктивные геномы вирусов наиболее важных вирусных патогенов человека подверглись интенсивному молекулярно-генетическому изучению структуры и циклов репликации. В результате, более точно были охарактеризованы участки и механизмы активности и резистентности к противовирусным лекарственным препаратам, чем для каких-либо других классов лекарственных препаратов (Нюктав (1994) Тгенбх М1сгоЬю1. 2, 401-407). Вероятность того, что будут возникать мутанты с устойчивостью, является функцией, как минимум, четырех факторов 1) частоты мутирования вируса; 2) присущей мишенному участку вируса мутабельности в отношении специфического противовирусного действия; 3) селективности пресса противовирусных препаратов и 4) величины и скорости вирусной репликации. Что касается первого фактора, для одноцепочечной РНК вирусов, у которых утрачен механизм проверочного считывания геномной репликации, частоты мутирования составляют приблизительно 3х10-5 на пару оснований на цикл репликации (Но11эп6 с соавт. (1992) Сигг. Торкб МюгоЬю1. Iттиηο1. 176, 1-20; Машку с соавт. (1995) 1. νπΌ1. 69, 5087-94; Сойт (1995) Заеше 267, 483-489). Так, отдельный геном из 10 тысяч пар нуклеотидов, аналогичный тому, который присущ вирусу иммунодефицита человека (ΗΙν), предположительно содержит в среднем одну мутацию на каждые три потомка вирусного генома. Что касается второго фактора, присущая вирусному мишенному сайту мутабельность, в ответ на
-1005426 действие специфического противовирусного агента, может существенно влиять на вероятность появления устойчивых мутантов. Например, зидовудин (ΑΖΤ) более легко селектирует мутации обратной транскриптазы Ηΐν ίη νίίτο и ίη νίνο, чем это делает другой апробированный тимидиновый аналог 64Τ (ставудин).
Одно из вероятных неизбежных следствий действия противовирусного лекарственного препарата заключается в том, что он оказывает достаточно избирательное давление на вирусную репликацию, чтобы отобрать мутанты, резистентные к лекарственному препарату (Негтапп с соавт. (1977) Αηη. ΝΥ Асаб. 8С1. 284, 632-7). Что касается третьего фактора, с увеличением выдерживания с лекарственным препаратом, селективное давление на популяцию реплицирующегося вируса возрастает, способствуя более быстрому появлению мутантов, резистентных к лекарственному препарату. Например, наивысшие дозы ΑΖΤ содействуют отбору вируса, резистентного к лекарственному препарату, быстрее, чем наинизшие (Ктсйтап с соавт. (1990) 1. ΑΐΌ8. 3, 743-6). Это селективное давление, оказываемое на устойчивые мутанты, повышает вероятность возникновения таких мутантов, при условии, что поддерживаются существенные уровни вирусной репликации.
Что касается четвертого фактора, то величина и скорость репликации в вирусной популяции вносит основной вклад в вероятность возникновения устойчивых мутантов. Многие вирусные инфекции характеризуются высокими уровнями вирусной репликации при высоких скоростях вирусной сменяемости. Это особенно справедливо при хроническом Ηΐν-инфицировании, а также инфицировании вирусами гепатита В и С. Вероятность возникновения ΑΖΤ-резистентности повышена у Ηΐν-инфицированных пациентов со снижением количества СЭ4-лимфоцитов. что связано с возрастанием уровней Ηΐνрепликации (там же).
Наивысшие уровни вируса повышают вероятность предсуществующих мутантов. Было показано, что возникновение резистентной популяции происходит из-за выживаемости и селективного размножения уже существующей субпопуляции, которая произвольно появляется в отсутствие селективного давления. Все вирусы обладают базовой скоростью мутирования. По расчетам, в течение Ηΐν-инфекции ежедневно появляется приблизительно 1010 новых вирионов (Но с соавт. (1995) №ш.1ге 373, 123-126), мутационная скорость от 10-4 до 10-5 на нуклеотид гарантирует предсуществование почти любой мутации в любой временной точке течения Ηΐν-инфекции. Доказательством является накопление устойчивых к лекарственному препарату мутантов, которое практически осуществляется в субпопуляциях Ηΐνинфицированных индивидуумов (№уега с соавт. (1994) ΑΐΌ8 Век. Ηιιιη ВеИоуйикек 10, 1479-88; №цега с соавт. (1995) 1. νίτοί. 69, 23-31). Хорошо документировано также предсуществование устойчивых к лекарственному препарату мутантов пикорнавируса при скорости приблизительно 10-5 (Α1ιιη;·ι6 с соавт. (1987) Αηΐίνίπιί Век. 8, 27-39).
Вирус иммунодефицита, человека (Н1У)
Синдром приобретенного иммунодефицита (ΑΐΌ8) является смертельным заболеванием для человека и, в большинстве своем, считается одним из наиболее серьезных заболеваний, когда-либо поражавшего человечество. В мировом масштабе количество людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (Ηΐν), и случаев ΑΐΌ8 неуклонно повышается и попытки обуздать ход этого процесса (пандемии), по некоторым предположениям, имеют ограниченную эффективность. В настоящее время различают два типа Ηΐν: Ηΐν-1 и Ηΐν-2. На декабрь 1994 г. Всемирная Организация Здоровья сообщала о 1025073 случаях ΑΐΌ8. Они составляют лишь часть от общего числа случаев, и ВОЗ считает, что на конец 1994 г., принимая во внимание сообщения о не диагностированных, не сообщенных и задержанных данных, и на основании установленного количества Ηΐν-инфекций, во всем мире, в совокупности, было более 4,5 миллионов случаев ΑΐΌ8 (Мейепк ΑΐΌ8 9 (8ирр1. Α), 8259-8272). С тех пор как Ηΐν начал свое распространение в Северной Америке, Европе и Африке, за исключением Сахары, установлено, что инфицированными являются более чем 19,5 миллионов мужчин, женщин и детей (там же). Одной из отличительных особенностей пандемии ΑΐΌ8 явилось его глобальное распространение в последние 20 лет почти в 190 странах, сообщивших на сегодняшний день о случаях ΑΐΌ8. Прогноз, осуществляемый ВОЗ, о распространении Ηΐν-инфекций во всем мире, колеблется. Предполагаемая совокупная численность случаев ΑΐΌ8 среди взрослых к 2000 г. составит почти 10 миллионов. В 2000 г. общая численность смертей, связанных с Ηΐν, среди взрослых возрастет по прогнозу до более чем 8 миллионов от нынешнего общего количества около 3 миллионов. Ηΐν-1 и Ηΐν-2 представляют собой оболочечные ретровирусы с диплоидным геномом, обладающим двумя идентичными молекулами РНК. Молекулярная организация Ηΐν-1 представляет собой (5') υΐ-Β-^-^-ροί-οην-υΐ-Β-^ (3'), как показано на фиг. 1а. Последовательности И3, В и и5 образуют длинные концевые повторы (ΕΤΒ), которые представляют собой регуляторные элементы, которые промотируют экспрессию вирусных генов и, отчасти, соседние клеточные гены инфицированных хозяев. Внутренние области вирусной РНК кодируют структурные белки: дад (коровые белки р55, р17, р24 и р7) ро1 (протеаза р10, обратные транскриптазы р66 и р51 и интегразу р32) и ονη (оболочечные гликопротеины др120 и др41). Сад кодирует полипротеиновый предшественник, который расщепляется вирусной протеазой на три или четыре структурных белка; ро1 кодирует обратную транскриптазу (ΒΤ) и вирусные протеазу и интегразу; οπν кодирует трансмембранный и наружный гликопротеин вируса. Гены дад и ро1 экспрессируются в виде геномной РНК, а ген οπν экспрессируется в
-2005426 виде сплайсированной субгеномной РНК. В дополнение к еиу-гену имеются другие Ηΐν-гены, продуцируемые сплайсированными субгеномными РНК, которые способствуют репликации и биологической активности данного вируса. Эти гены включают: 1аС который кодирует белок, который активирует экспрессию вируса и некоторые клеточные гены; теу, который кодирует белок, который промотирует экспрессию несплайсированных или одиночно-сплайсированных мРНК; пеГ, который кодирует, миристилированный белок, который при некоторых условиях модулирует образование вируса; νίί, который кодирует белок, который влияет на способность вирусных частиц инфицировать клетки-мишени, но не оказывает влияния на вирусную экспрессию или на передачу вируса при межклеточном контакте; νρτ, который кодирует вирион-ассоциированный белок; и νρυ, который кодирует белок, который участвует в стимуляции внеклеточного высвобождения вирусных частиц.
Нет лучшей иллюстрации проблемы вирусной резистентности к лекарственному средству, чем заболевание ΑΙΌ8. Лекарственная устойчивость Ηΐν-изолятов была установлена для ингибиторов нуклеозидной и не-нуклеозидной обратной транскриптазы и для протеазных ингибиторов. Возникновение Ηΐνизолятов, резистентных к ΑΖΤ, не удивительно, поскольку ΑΖΤ и другие ингибиторы обратной транскриптазы лишь снижают вирусную репликацию примерно на 90%. Высокие скорости вирусной репликации в присутствии селективного давления лекарственного лечения создают идеальные условия для возникновения мутантов, резистентных к лекарственному препарату. На последних стадиях инфекции пациенты, которые обнаруживают самые высокие уровни вирусной репликации, создают резистентный вирус при лечении ΑΖΤ более быстро, чем пациенты на ранних стадиях инфекции (Ктсйшап с соавт. (1990) 1. ΑΙΩ8 3, 743-6). В первоначальном описании возникновения резистентности к ΑΖΤ обнаружили прогрессивное и постадийное снижение в лекарственной чувствительности (Ьатбег с соавт. (1989) 8с1епсе 243, 1731-1734). Это объясняли распознаванием множественных мутаций по гену обратной транскриптазы, что содействовало снижению чувствительности (Ьатбег с соавт. (1989) 8с1епсе 246, 1155-1158). Эти мутации осуществляли аддитивный или даже синергический вклад в фенотип сниженной чувствительности (Ке11ат. с соавт. (1992) Ргос. №11. Αсаб. 8ск 89, 1934-1938). Кумулятивное приобретение таких мутаций приводило к прогрессивному снижению в чувствительности. Подобные эффекты наблюдали с ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы ЩипЬетд с соавт. (1991) 1. νίτοί. 65, 4887-4892; 8агбаппа с соавт. (1992) 1. Βίο1. Сйет. 267, 17526-17530). Изучение протеазных ингибиторов обнаруживает, что селекция штаммов Ηΐν со сниженной чувствительностью к лекарственному препарату происходит в пределах недель (Но с соавт. (1994) 1. νίτοί. 68, 2016-2020; Кар1ап с соавт. (1994) Ргос. ΝαΗ. Αсаб. 8с1. 91, 5597-5601). Хотя в недавних исследованиях показали, что протеазные ингибиторы являются более сильными, нежели ингибиторы обратной транскриптазы, все же резистентность развивалась. (Сопбга с соавт., 1б. апб Верой 3гб СопГегепсе оп Ке1го\згикек апб Орройишкбс 1пГес1юпк, Магсй 1996). Субтерапевтические уровни лекарственного препарата, обусловленные снижением дозы, лекарственными взаимодействиями, малабсорбцией или снижением биологической доступности, связанной с другими факторами, или добровольно взятыми перерывами приема лекарства, все это дает возможность повысить вирусную репликацию и увеличить возможность для мутирования и резистентности (там же).
Селективное давление лекарственного лечения приводит к увеличению предсуществующих мутантов. С продлением вирусной репликации, в отсутствие полностью супрессированной противовирусной лекарственной активности, кумулятивное приобретение множественных мутаций может происходить в течение длительного времени, как было описано для ΑΖΤ и протеазных ингибиторов ΗΙν. В действительности наблюдали, что вирусные мутанты множественно резистенты к разным лекарственным средствам (Ьатбет с соавт. (1989) 8аепсе 243, 1731-1734; Ьатбет с соавт. (1989) 8с1епсе 246, 1155-1158; Сопбга с соавт. (1995) №Шге 374, 569-71). При неизбежном появлении резистентности для многих вирусных инфекциях, как, например, для ΗΙν, необходимо создавать способы для оптимизации лечения, преодолевая резистентность вирусных популяций. Выяснение вклада лекарственной устойчивости в лекарственную недостаточность является трудной проблемой, потому что пациенты, у которых, по всей вероятности, развилась лекарственная устойчивость, вероятнее всего обладают другими примешивающимися факторами, которые будут предрасполагать их к неблагоприятному прогнозу (Вюйтап (1994) ΑΙΌ8 Век Нит Рекгоуйикек 10, 901-905). Кроме того, пациенты содержат в себе смесь вирусов с разной чувствительностью.
Гепатит В (ИВУ)
ΗΒν представляет собой возбудитель острого и хронического гепатита, который поражает около 200 миллионов больных во всем мире. Ζ^^ηι-ηπι Α.Ι Транс. В. 8ос. Тгор. Меб. Нуд1епе (1982) 76, 711718. ΗΒν-инфекция, приобретенная во взрослой жизни, часто является клинически неочевидной, и наиболее остро инфицированные взрослые люди полностью оправляются от болезни и очищаются от вируса. Однако изредка острое заболевание печени может быть настолько серьезным, что больной погибает от скоротечного гепатита. Небольшая часть, возможно от 5 до 10% остро инфицированных взрослых, становятся постоянно инфицированными этим вирусом и заболевают болезнью печени различной тяжести. Однако новорожденные, получившие ΗΒν-инфекцию по наследству, редко остаются чистыми, и свыше 90% таких детей становятся хронически инфицированными. Из-за того что ΗΒν обычно передается от матери новорожденному младенцу, в густо населенных областях Африки и Азии несколько сотен
-3005426 миллионов людей этого мира из числа живущих постоянно инфицированы НВУ и в разной степени страдают хроническим заболеванием печени, которое в значительной мере увеличивает их риск заболеть циррозом и гепатоцеллюлярной карциномой (НСС). Действительно, риск заболеть НСС возрастает 100кратно у пациентов с хроническим гепатитом, а продолжительность жизни у мужчин с риском НСС, инфицированных при рождении, составляет 40%. Веак1у В.Р. с соавт. Ьапсе! (1981) 2, 1129-1133. В соответствии с этим большая часть популяции мира страдает и умирает от последующих осложнений НВУинфекции. Создания лекарственных препаратов анти-НВУ ждали долго, но оно было затруднено узким кругом хозяев НВУ: НВУ реплицируется, в основном, в печени человека и шимпанзе и не реплицируется в печени экспериментальных животных или в культуре клеток. Тю11ащ, Р. с соавт. Иа1иге (Ьоибои) (1985) 317, 489-495.
Вирус гепатита В является ДНК вирусом с компактной геномной структурой; несмотря на свой малый размер, кольцевая, 3200 пар оснований, ДНК НВУ кодирует четыре совокупности вирусных продуктов и представляет собой комплекс со структурой множественной частицы. НВУ осуществляет свою геномную экономию, опираясь на эффективную стратегию кодирования белков четырех перекрывающихся генов: 8, С, Р и X. НВУ является одним из представителей семейства животных вирусов, гепаднавирусов и классифицируется как гепаднавирус, тип 1. Подобные вирусы инфицируют некоторые виды североамериканских лесных сурков, норовых и древесных белок и пекинских уток. Все гепаднавирусы, в том числе НВУ, совмещают нижеследующие характеристики: 1) существует три различимые морфологические формы, 2) все представители обладают белками, которые функционально и структурно эквивалентны по оболочечным и нуклеокапсидным антигенам НВУ, 3) они реплицируются в границах печени, но могут также существовать во внепеченочных участках, 4) они содержат эндогенную ДНК-полимеразу с РНК- и ДНК-зависимыми ДНК-полимеразными активностями, 5) их геномы представляют собой частично двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК, 6) они ассоциированы с острым и хроническим гепатитами и гепато-целлюлярной карциномой и 7) репликация их генома осуществляется через РНКинтермедиат, который обратно транскрибируем в ДНК с использованием эндогенной РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности вируса способом, аналогичным тому, который наблюдается у ретровирусов. В ядрах инфицированных печеночных клеток частично двухцепочечная ДНК преобразуется в ковалентно замкнутую кольцевую двухцепочечную ДНК (сскДНК) с помощью ДНК-зависимой ДНКполимеразы. Транскрипция вирусной ДНК осуществляется с помощью РНК-полимеразы хозяина и приводит к возникновению нескольких РНК-транскриптов, которые отличаются по своим сайтам инициации, однако, все терминированы обычным сигналом полиаденилирования. Самые длинные из этих ДНК действуют в качестве прегеномных у вируса, а также информационных для некоторых вирусных белков. Вирусные белки, транслируемые из прегеномных РНК, и белки и РНК прегенома упакованы в вирионы и выделены из гепатоцитов. Хотя культивирование НВУ ίη νίΐτο затруднено, некоторые клетки были успешно трансфицированы ДНК НВУ, приводя к образованию ίη νίΐτο частиц НВУ.
Существуют три формы частиц НВУ: неинфекционные 22 нм частицы, которые появляются либо в виде сферических или длинных филаментозных форм, и 42 нм двухоболочечных сферических частиц, которые представляют интактный инфекционный вирион гепатита В. Оболочечный белок, НВ5Ад, является продуктом гена 8 из НВУ и обнаруживается на внешней поверхности вириона и в мельчайших сферических и трубчатых структурах. Расположенная выше гена 8 открытая рамка считывания, представлена открытыми рамками считывания пре-8-гена, пре-81 и пре-82, которые кодируют продукты пре-8-гена, в том числе рецепторы на поверхности НВУ для полимеризованного человеческого сывороточного альбумина и сайты присоединения для гепатоцитных рецепторов. Интактный 42 нм вирион можно разрушить с помощью мягких детергентов и выделить 27 нм нуклеокапсидную коровую частицу. Эта сердцевина состоит из двух нуклеокапсидных белков, кодируемых С-геном. С-ген обладает двумя кодонами инициации, определяющие кор, и прекоровой областью. Основной антиген, экспрессируемый на поверхности нуклеокапсидной сердцевины, кодируется данной сердцевинной областью и в качестве антигена (НВсАд) относится к кору гепатита В. Антиген е гепатита В (НВеАд) получен из того же гена С, благодаря инициации АТС на прекоре.
В нуклеокапсидной сердцевине упакована также ДНК-полимераза, которая управляет репликацией и репарирует ДНК НВУ. Эта ДНК-полимераза кодируется Р-геном, третьим и самым большим из генов НВУ. Данный фермент обладает и ДНК-зависимой ДНК-полимеразной и РНК-зависимой обратнотранскриптазной активностями и необходим также для эффективного капсидирования прегеномной РНК. Четвертый ген, X, кодирует небольшой, не ассоциированный с макрочастицей белок, который показал способность трансактивировать транскрипцию и вирусных и клеточных генов.
Хотя репликация НВУ довольно хорошо понята, ранние стадии НВУ-инфекции определены недостаточно. Клеточные рецепторы или сайты присоединения на вирионах не могут быть изучены без анализов соответствующих тканевых культур. В попытке постановки этой проблемы были созданы некоторые клеточные линии, человеческие гепатобластомные клетки Ний (НВ 611) (Иеба, К. с соавт. Упо1оду (1989) 169, 213-216) и клетки НерС2 (Са11е, Р.В. и Тйебшапп, Ь. Аг/пепп-Еогкй Эгид Век. (1990) 40, 1380-1382) для оценки лекарственного препарата анти-НВУ.
-4005426
Недавно обратили внимание на молекулярные варианты НВУ. Изменчивость происходит по всему геному НВУ, и клинические изоляты НВУ, которые не экспрессируют вирусные белки, приписывали мутации индивидуального или даже множественного гена. Например, были описаны варианты, у которых отсутствуют нуклеокапсидные белки, оболочечные белки или и те, и другие. Внимание привлекли два мутанта. Первый из них обнаруживается у некоторых пациентов с тяжелой хронической НВУинфекцией. Обнаружено, что эти пациенты инфицированы НВУ-мутантом, который содержит изменение в прекоровой области, придающее данному вирусу неспособность кодировать НВеАд. Мутация, наиболее обычно встречаемая у таких пациентов, представляет собой одиночную замену основания, от С до А, которая происходит во втором предпоследнем кодоне пре-С-гена в нуклеотиде 1896. Эта замена приводит к замещению триптофанового кодона ТТС на стоп-кодон (ТАС), который предотвращает трансляцию НВеАд. Пациенты с такими прекоровыми мутантами, которые неспособны выделять НВеАд, склонны к тяжелому заболеванию печени, которое быстро прогрессирует до цирроза и которые сразу не отвечают на противовирусную терапию.
Вторая категория НВУ-мутантов состоит из просачивающихся мутантов, у которых одиночная аминокислотная замена, глицина на аргинин, происходит в позиции 145 иммунодоминантной детерминанты, обычной для всех субтипов НВ 5Ад. Это изменение в НВ 5Ад имеет результатом крайне важное конформационное изменение, которое приводит к утрате обезвреживающей активности антитела антиНВ5.
Доступные в настоящее время анализы вирусной резистентности
Под определением чувствительности вируса к лекарственному препарату, как правило, подразумевают концентрацию противовирусного агента, при которой ингибируется заданная доля вирусной репликации (например, 1С5о для противовирусного агента является концентрацией, при которой ингибируется 50% вирусной репликации). Поэтому снижение чувствительности вируса к лекарственному препарату является критерием, по которому противовирусный препарат селектирует мутантный вирус, который резистентен к этому противовирусному лекарственному препарату. Резистентность вируса к лекарственному препарату определяют, как правило, по снижению чувствительности вируса к лекарственному препарату у данного пациента в течение длительного времени, в клиническом смысле, вирусная лекарственная устойчивость, показанная с помощью противовирусного лекарственного препарата, является менее эффективной или клинически не эффективной для пациента.
В настоящее время средства, доступные исследователю и клиницисту, чтобы анализировать противовирусную лекарственную чувствительность и устойчивость, не адекватны. Классический тест для определения устойчивости и чувствительности Н1У к противовирусному агенту является сложным, трудоемким, дорогостоящим и опасным в том отношении, что он требует культивирования патогенного вируса из каждого и каждому пациенту (Вагге-8шои581 с соавт. (1983) 8с1епсе 220, 868-871; Ρορονίο с соавт. (1984) 8с1епсе 224, 497-500). В данной методике, моноядерные клетки периферической крови (РМВС) вначале культивируют для установления вирусного штамма известной множественности заражения (шо1), и тем самым получают вирусный штамм, используемый для заражения мишенной индикаторной клеточной линии. Происходящую вспышку вирусной репликации затем обычно измеряли в присутствии и в отсутствие противовирусного агента путем определения продукции вирусных антигенов в клеточной культуре. Такие тесты можно надежно осуществлять только руками квалифицированных исследователей, и проводить осуществление в течение двух-трех месяцев по цене тысячи долларов на пациента по каждому тестируемому агенту. К тому же, поскольку вирусные штаммы с достаточным шо1 не могут быть установлены по РМВС некоторых Н1У-пациентов, классический тест на Н1У-резистентность невозможно осуществить у всех Н1У-инфицированных индивидуумов. Намного существенней в ходе получения вирусного штамма при прохождении культивирования вируса могут меняться собственные характеристики вирусов и поэтому могут затмевать истинную природу вируса пациента. Поэтому применение классического теста ограничено сбором информации об отклонениях в клинических опытах и не может быть пригодным для предполагаемого анализа, который можно было бы использовать для проведения индивидуальной противовирусной терапии данному пациенту. Несмотря на эти ограничения, классический тест обладает двумя важными качествами: он является специфичным для оцениваемого агента и он предоставляет информацию о фенотипе вируса, принадлежащего пациенту, т.е. о концентрации лекарственного препарата, которая ингибирует 50% вирусной репликации (1С50).
Предпринимались многочисленные попытки усовершенствовать классический тест, но у каждой из них имелись серьезные изъяны. Первый тип этих испытаний можно описать как неспецифический в том плане, что они не определяют характеристик всех вирусов, принадлежащих пациенту, а создают независимую систему измерений течения инфекции. Среди этих испытаний имеются такие, которые определяют численность СИ4+-Т-клеток у пациента, критерий развития Н1У-заболевания (Соебег! с соавт. (1987) 1АМА 257, 331-334), такие, которые определяют уровни вирусного антигена (например, антиген кора р24 (А11аш с соавт. (1987) N. Епд1. 1. Меб. 317, 1114-1121)), и такие, которые определяют уровни вирусных РНК и ДНК (напр., количественная полимеразная цепная реакция и анализ разветвленной ДНК (Р1а1ак с соавт. (1993) 8аепсе 259, 1749-1754; Иебеа (1993) Сйп. Сйет. 39, 725-726)). Исходный недостаток таких неспецифических тестов заключается в том, что они не предоставляют какой-либо информации о рези
-5005426 стентности вируса к лекарственному препарату рег ке, а выводят эту информацию из течения болезни данного пациента. Кроме того, многие факторы, иные, чем резистентность вируса к лекарственному препарату, могут влиять на уровень рассматриваемого параметра. Иными словами, во время течения болезни численность СО4+-Т-клеток, уровни антигена р24 и уровни РНК вируса Ηΐν могут варьировать по другим причинам, чем лекарственная устойчивость.
Другая модификация классического теста амплифицирует вирусный ген, который является мишенью данного противовирусного агента. В данном тесте вирусный ген от пациента амплифицировали, а затем рекомбинировали в биологически активный провирусный клон Ηΐν. Этот провирусный клон трансфицировали в клетки человека для получения вирусного штамма с известной шо1, который впоследствии может использоваться для заражения мишенной индикаторной клеточной линии. В способе классического теста, затем определяют продуцирование вирусных антигенов в присутствии или в отсутствие противовирусного агента. В одном из таких анализов, описанном Ке11ат и Ьагбег (1994) ЛпШшсгоЫа1 Лдеп1к апб СЬето. 38, 23-30, осуществляли РСК.-амплификацию кодирующих обратную транскриптазу последовательностей пациента, которые затем интродуцировали в провирусный ДНК-клон путем гомологичной рекомбинации для воссоздания полного вирусного генома, включающего ген обратной транскриптазы, который был делетирован. Получающийся рекомбинантный вирус, произведенный из таких клонов, культивировали затем в линиях Т-клеток, а лекарственную чувствительность тестировали в анализе восстановления бляшки Не1а СЭ4'. Однако этот класс теста все еще требует культивирования вируса, чтобы определить лекарственную устойчивость, и является, таким образом, трудным, длительным и дорогостоящим и нуждается в лабораторном исследователе для ухода за опасными вирусными культурами. К тому же, из-за сопутствующей изменчивости самого вируса в течение процесса культивирования получаемые результаты могут оказаться соответственно неточными.
Второй класс попыток тестирования создает специфическую информацию по генотипу Ηΐνпациента с конечной целью скоррелировать эту генотипическую информацию с фенотипом вирусов, резистентных к лекарственному препарату. Действительно, было показано, что специфические аминокислотные замены в вирусных генах, таких как гены обратной транскриптазы и протеазы, корреспондируют со специфическими уровнями вирусной резистентности к ингибиторам, соответственно, обратной транскриптазы и протеазы (Ьагбег с соавт. (1994) 1. Сеп. νίτο1. 75, 951-957). Главный недостаток, связанный с таким анализом, заключается в том, что он непрямой и может запутать вторичными мутациями, которые, как было показано, обогащают или скрывают эффекты первичной мутации. Он осложняет взаимодействие всех аминокислотных остатков в рамках данного вирусного полипептида, который строго определяет активность генных продуктов в присутствии или в отсутствие ингибитора. Поэтому понадобилась бы обширная база данных и идеальные пропорции, чтобы интерпретировать статус лекарственной устойчивости или чувствительности данного генотипа, данного числа потенциальных аминокислотных замен в геноме Ηΐν.
Третий класс теста, недавно созданный анализ, основанный на бактериях, делает возможным использование молекулярно клонированного вирусного гена (в частности, гена обратной транскриптазы), который инсерцировали в бактериальный вектор экспрессии. При трансформации специальных штаммов Е. со11, которые являются дефицитными по бактериальной ДНК-полимеразе I, клонированный ген обратной транскриптазы может деблокировать рост бактерий в селективных ростовых условиях. В создаваемой Е. со11, зависимой от обратной транскриптазы для своего роста, можно выяснить эффекты некоторых ингибиторов обратной транскриптазы на активность вирусного гена (РСТ заявка № \¥О 95/22622).
Однако главный недостаток этого подхода заключается в том, что ингибитор может быть перемещен через клеточную мембрану и метаболизирован данной бактерией иначе, чем в человеческой клетке, и в итоге в бактерии концентрация истинного метаболического ингибитора обратной транскриптазы может сильно отличаться от таковой в инфицированной человеческой клетке-мишени, или истинный ингибитор может полностью отсутствовать. Действительно, известно, что метаболизм нуклеозидов заметно отличается между человеческими и бактериальными клетками. Другой существенный недостаток этого подхода состоит в том, что данный анализ измеряет активности ДНК-зависимой ДНК-полимеразы обратной транскриптазы, но не РНК-зависимой ДНК-полимеразы, перенос нити или РНК-Н-активности обратной транскриптазы. Поэтому противовирусное соединение, которое действует по крайней мере на часть этих других активностей, не будет проявлять в данном анализе полной ингибиторной активностью. Еще одна трудность, связанная с этим подходом, заключается в том, что он представляет собой тест, основанный на культивировании; поэтому если ингибитор (например, аналог нуклеозида) также блокирует бактериальный рост по причинам иным, чем его действие на обратную транскриптазу, он не может быть адекватно оттестирован в этой системе.
Вирусные векторы
Вирусные векторы и, в частности, ретровирусные векторы, использовали для модификации животных клеток по причине высокой эффективности, с которой ретровирусные векторы заражают клеткимишени и интегрируются в геном клетки-мишени. Вследствие их способности инсерцироваться в геном клеток млекопитающих значительное внимание обращено на ретровирусные векторы для использования в генной терапии. Детали ретровирусных векторов и их применение можно найти в патентах и патент
-6005426 ных публикациях, в том числе европейская патентная заявка ЕРА 0178220, патент США 4405712, РСТ заявка АО 92/07943, патент США 4980289, патент США 5439809 и РСТ заявка АО 89/11539. Указания на эти патенты и публикации включены здесь путем ссылки.
Одним из следствий технологий получения указанного ретровирусного вектора было создание упаковывающих клеточных линий. Главная проблема, связанная с использованием ретровирусов, заключается в возможности вспышки репликации компетентного ретровируса. Поэтому существует необходимость получения хелперных векторов, которые не могли бы процессироваться в вирионах. В итоге были созданы упаковывающие неполные векторы и упаковывающие клеточные линии. Детали недостаточно упаковывающих векторов и упаковывающих клеточных линий можно найти в патентах и патентных публикациях, в том числе патенте США 5124263, европейской патентной заявке пуб. № 0386882, РСТ заявке № АО 91/19798, РСТ заявке № АО 88/08454, РСТ заявке № АО 93/03143, патенте США 4650764, патенте США 4861719 и патенте США 5278056, раскрытие которых включено здесь путем ссылки.
Цель настоящего изобретения состоит в разработке теста на лекарственную чувствительность и устойчивость способного показать, действительно ли вирусная популяция пациента резистентна к данному вышеуказанному лекарственному средству. Следующая цель настоящего изобретения заключается в разработке теста, который поможет терапевту заменить один или несколько лекарственных препаратов в терапевтическом режиме пациента, который приобрел резистентность к данному лекарственному препарату или лекарственным препаратам после предварительного курса лечения. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в создании теста, который поможет отобрать эффективный режим лекарственного препарата для лечения вирусных инфекций. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в создании безопасного, стандартизованного, приемлемого, быстрого, точного, и воспроизводимого анализа лекарственной чувствительности и резистентности для клинического и исследовательского применения. Следующая цель настоящего изобретения заключается в создании теста и методов оценки биологической эффективности, кандидатов на лекарственные соединения, которые действуют на специфические вирусные гены и/или вирусные белки, в частности те, которые относятся к вирусной лекарственной устойчивости и перекрестной резистентности. Цель настоящего изобретения заключается также в создании средств и композиций оценки вирусной лекарственной устойчивости и чувствительности. Это и другие цели настоящего изобретения станут очевидными из полного настоящего описания.
Сущность изобретения
Первым аспектом настоящего изобретения является способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах и (в) сравнение уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату.
В конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как описано выше, но в отсутствие противовирусного препарата. В другом конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии индикаторного гена представляет собой уровень экспрессии, который определяют, как описано выше, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного соединения.
Вторым аспектом изобретения является вектор для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, используемый для осуществления способа, представляющего первый аспект изобретения. Указанный вектор содержит фрагмент вируса и индикаторный ген, и не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса.
Вектор для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий фрагмент(ы) вируса, полученный(е) от пациента (например, Ηΐν, НВУ и т.п.), и индикаторный ген, может дополнительно включать один или несколько участков ДНК, полученных не от пациента. В одном из воплощений настоящего изобретения вектор для определения чувствительности конструируют из геномного вирусного вектора, который может включать делецию по одному или нескольким генам. Например, для случая ВИЧ, ген еиу делетирован в векторе, который в противном случае сохраняет экспрессию мРНК и характеристики процессинга полного вируса. Альтернативно, вектор конструируют из субгеномного вирусного вектора, который может включать всего один или несколько вирусных генов, которые обычно являются мишенью противовирусного лекарственного средства. Например, для случая с ΗΒν один или несколько генов ΗΒν, кодирующих определенные структурные и ферментатив
-7005426 ные функции, необходимые для репликации ДНК НВУ и образования вирусных частиц (т.е. гены С, 8 и X), могут быть делетированы в векторе, который в противном случае сохраняет экспрессию мРНК и характеристики процессинга полного вируса. Кроме того, вектор включает либо природный энхансер/промотор из конкретного вируса, либо чужеродный энхансер/промотор для экспрессии геновмишеней противовирусных препаратов.
Экспрессия индикаторного гена в составе вектора для определения чувствительности вируса в клетке-мишени зависит в конечном итоге от функционирования последовательностей фрагмента, полученного от пациента. Индикаторный ген может быть функциональным или нефункциональным. В случае нефункционального индикаторного гена индикаторный ген недостаточно экспрессируется в клеткехозяине, трансфицированной вектором, до тех пор, пока он не превратится в функциональный индикаторный ген в результате действия одного или нескольких продуктов фрагмента, полученного от пациента. В одном из воплощений настоящего изобретения индикаторный ген является нефункциональным за счет использования пермутированного промотора, т. е. промотора, который, хотя и находится в той же транскрипционной ориентации, что и индикаторный ген, но следует за ним вместо того, чтобы предшествовать кодирующей последовательности индикаторного гена. Кроме того, ориентация нефункционального индикаторного гена противоположна той, которую имеют вирусные промоторы или ЬТК.. Поэтому кодирующая последовательность такого нефункционального индикаторного гена не транскрибируется ни под пермутированным промотором, ни под вирусными промоторами. В случае ВИЧ индикаторный ген претерпевает перестановку в результате обратной транскрипции, так что пермутированный промотор теперь предшествует последовательности индикаторного гена, который, в результате, может функционально экспрессироваться. В случае НВУ, индикаторный ген претерпевает перестановку в результате циркуляризации генома в ходе репликации НВУ. Во втором воплощении настоящего изобретения индикаторный ген приводится в нефункциональное состояние за счет использования пермутированной кодирующей области, т.е. кодирующей области индикаторного гена, в которой 5'-часть данной кодирующей области следует за, а не предшествует 3'-части данной кодирующей области. В такой конфигурации не экспрессируется никакой мРНК, которая приводила бы к появлению функционального продукта индикаторного гена. В случае ВИЧ индикаторный ген претерпевает перестройку в результате обратной транскрипции, так что 5'-кодирующая область индикаторного гена теперь предшествует 3'-кодирующей области, и, в результате, индикаторный ген может быть функционально экспрессирован. В случае НВУ индикаторный ген претерпевает перестройку в результате циркуляризации генома в ходе репликации НВУ. В третьем воплощении настоящего изобретения индикаторный ген делают нефункциональным путем использования инвертированного интрона, т. е. интрон инсертируют в кодирующую последовательность индикаторного гена в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации данного индикаторного гена. Кроме того, индикаторный ген сам по себе содержит функциональный промотор с полной транскрипционной единицей, ориентированный противоположно вирусным промоторам. Таким образом, нефункциональный индикаторный ген находится в неверной ориентации, чтобы транскрибироваться под вирусными ЬТК в случае ВИЧ или энхансером-промотором НВУ, и он не может функционально транскрибироваться под своим собственным промотором, поскольку инвертированный интрон не может быть должным образом вырезан при сплайсинге. Однако в случае ретровирусов и гепаднавирусов, особенно ВИЧ и НВУ, транскрипция под вирусными промоторами приводит к образованию мРНК, в которой при сплайсинге может происходить удаление инвертированного интрона. У ретровирусов в результате обратной транскрипции образующегося прошедшего сплайсинг транскрипта и интеграции получающегося провируса в хромосому клетки-хозяина индикаторный ген может функционально транскрибироваться под своим собственным промотором. У НВУ в результате обратной транскрипции образующегося прошедшего сплайсинг транскрипта и циркуляризации геномной ДНК в клетке-хозяине индикаторный ген может функционально транскрибироваться под своим собственным промотором.
Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающие нефункциональный индикаторный ген, могут использоваться для проведения тестов на лекарственную чувствительность в анализах, как основанных на (вирусных) частицах, так и не основанных на частицах. Анализ, основанный на частицах, базируется на вирусных частицах вектора для определения чувствительности, которые являются дефектными по репликации, будучи полученными с помощью клеток-хозяев для вектора для определения чувствительности. Транс-действующие факторы, необходимые для формирования вирусных частиц вектора для определения чувствительности, обеспечиваются упаковывающими экспрессионными векторами, которыми трансфицируют упаковывающие клеткихозяева. Напротив, тест на чувствительность, основанный не на частицах, осуществляют путем трансфекции одних-единственных клеток-хозяев вектором для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату в отсутствие упаковывающих экспрессионных векторов.
В случае функционального индикаторного гена функциональный индикаторный ген эффективно экспрессируется в первых клетках-хозяевах, трансфицированных вектором для определения чувствительности (обозначаемых здесь как клетки-хозяева вектора для определения чувствительности). Таким образом, функция индикаторного гена в клетке-хозяине вектора для определения чувствительности не зависит от фрагмента, полученного от пациента. Однако способность индикаторного гена к экспрессии
-8005426 во второй клетке-хозяине (обозначаемой здесь как клетка-хозяин-мишень) зависит от образования функциональных вирусных частиц вектора для определения чувствительности в клетке-хозяине вектора. Таким образом, активность индикаторного гена в клетках-хозяевах-мишенях зависит от активности фрагментов, полученных от пациента.
Третьим аспектом изобретения является упаковывающая клетка-хозяин, содержащая вектор для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, представляющий второй аспект изобретения, и служащая для упаковки ДНК вектора с образованием вирусных частиц вектора для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату.
Четвертым, особым аспектом настоящего изобретения является способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и нефункциональный индикаторный ген, причем экспрессия указанного нефункционального индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах и (в) сравнение уровня экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату.
В конкретном воплощении способа, представляющего четвертый аспект изобретения, контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как описано выше, но в отсутствие противовирусного препарата. В другом конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии индикаторного гена представляет собой стандартный уровень экспрессии, который определяют, как описано выше, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного соединения.
Конкретным воплощением способов определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, представляющих первый и четвертый аспекты настоящего изобретения, является определение чувствительности вируса иммунодефицита человека к лекарственному препарату против ВИЧ. Другим конкретным воплощением указанных способов является определение чувствительности вируса гепатита Б человека к лекарственному препарату против ИВУ.
Пятым аспектом изобретения является способ определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) определение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату способом, представляющим первый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента; и (б) сравнение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, определенной на стадии (а), со стандартной кривой чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, причем уменьшение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату относительно указанной стандартной кривой свидетельствует о том, что указанный вирус устойчив к указанному противовирусному лекарственному препарату, и величина указанного уменьшения чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату показывает, в какой степени указанный вирус устойчив к противовирусному лекарственному препарату.
Шестым аспектом изобретения является способ определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) определение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату способом, представляющим четвертый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента; и (б) сравнение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, определенной на стадии (а), со стандартной кривой чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, причем уменьшение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату относительно указанной стандартной кривой свидетельствует о том, что указанный вирус устойчив к указанному противовирусному лекарственному препарату, и величина указанного уменьшения чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату показывает, в какой степени указанный вирус устойчив к противовирусному лекарственному препарату.
-9005426
Конкретным воплощением способов определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, представляющих пятый и шестой аспекты настоящего изобретения, является определение устойчивости вируса иммунодефицита человека в пациенте к лекарственному препарату против ВИЧ. Другим конкретным воплощением указанных способов является определение устойчивости вируса гепатита Б человека к лекарственному препарату против НВУ.
Седьмым аспектом изобретения является способ определения прогрессирования или развития устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в первый момент времени способом, представляющим первый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента;
(б) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному препарату во второй, более поздний момент времени способом, представляющим первый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента в этот более поздний момент времени;
(в) сравнение эффективности противовирусного лекарственного препарата, оцененной на стадиях (а) и (б), причем уменьшение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в более поздний момент времени по сравнению с более ранним свидетельствует о развитии или прогрессировании устойчивости вируса, инфицирующего указанного пациента, к противовирусному лекарственному препарату.
Восьмым аспектом изобретения является способ определения прогрессирования или развития устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в первый момент времени способом, представляющим четвертый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента;
(б) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному препарату во второй, более поздний момент времени способом, представляющим четвертый аспект изобретения, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента в этот более поздний момент времени;
(в) сравнение эффективности противовирусного лекарственного препарата, оцененной на стадиях (а) и (б), причем уменьшение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в более поздний момент времени по сравнению с более ранним свидетельствует о развитии или прогрессировании устойчивости вируса, инфицирующего указанного пациента, к противовирусному лекарственному препарату.
Девятым аспектом данного изобретения является способ определения биологической эффективности потенциального противовирусного соединения, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного потенциального противовирусного соединения, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, включающий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах и (в) сравнение указанного уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии (б) , с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (в), и уровнем экспрессии, измеренным на стадии (б), коррелирует с эффективностью указанного потенциального противовирусного соединения, определяя тем самым эффективность потенциального противовирусного соединения.
В конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как описано выше, но в отсутствие потенциального противовирусного соединения. В другом конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии индикаторного гена представляет собой стандартный уровень экспрессии, который определяют, как описано выше, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного соединения.
Десятым аспектом настоящего изобретения является способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикатор, причем экспрессия указанного индикатора зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного индикатора в указанных клетках-хозяевах и (в) сравнение уровня экспрессии указанного индикатора, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикатора, причем разница между указанным уровнем экспрессии ин-10005426 дикатора, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату.
В конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии указанного индикатора определяют, как описано выше, но в отсутствие противовирусного препарата.
Согласно десятому аспекту изобретения индикатор может быть представлен как ДНК-структурой, так и РНК-структурой.
Конкретными воплощениями способа определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату согласно аспекту 10 предусмотрено определение чувствительности вируса иммунодефицита человека к препарату против ВИЧ и вируса гепатита Б человека к препарату против НВУ, соответственно.
Наконец, последним одиннадцатым аспектом изобретения является способ определения биологической эффективности потенциального противовирусного соединения, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного потенциального противовирусного соединения, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикатор, причем экспрессия указанного индикатора зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
(б) измерение уровня экспрессии указанного индикатора в указанных клетках-хозяевах и (в) сравнение указанного уровня экспрессии указанного индикатора, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикатора, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикатора, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с эффективностью указанного потенциального противовирусного соединения, определяя тем самым эффективность потенциального противовирусного соединения.
В конкретном воплощении контрольный уровень экспрессии указанного индикатора определяют, как описано выше, но в отсутствие противовирусного соединению.
Согласно одиннадцатому аспекту изобретения индикатор может быть представлен как ДНКструктурой, так и РНК-структурой.
В конкретных воплощениях изобретение направлено на обеспечение способов анализа лекарственной чувствительности/устойчивости ВИЧ к противовирусным препаратам. Указаны конкретные векторы для определения чувствительности настоящего изобретения для использования в тесте на лекарственную чувствительность/устойчивость ВИЧ к противовирусному препарату, а также клетки-хозяева вектора для определения чувствительности.
Следующее воплощение настоящего изобретения направлено на способы анализа лекарственной чувствительности/устойчивости НВУ к противовирусным препаратам. Аналогично, для случая НВУ указаны конкретные векторы для определения чувствительности настоящего изобретения для использования в тесте на лекарственную чувствительность/устойчивость НВУ к противовирусному препарату (также упоминаемые в данном описании как системы векторов для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату), а также клетки-хозяева вектора для определения чувствительности.
Способы анализа настоящего изобретения помогают терапевту оценить, действительно ли вирусный ген, кодирующий вирусный белок или функциональную вирусную последовательность, и который может быть мишенью противовирусного агента, мутирует, делая лекарственный препарат менее эффективным. В частности, новые способы анализа настоящего изобретения позволяют определить, действительно ли вирус становится резистентным к конкретному противовирусному лекарственному препарату. К тому же, настоящее изобретение помогает терапевту оценить лекарственную чувствительность и устойчивость в комбинированной терапии. Кроме того, способы анализа настоящего изобретения помогают внести отдельные изменения в предполагаемый терапевтический режим путем тестирования конкретного лекарственного препарата (или лекарственных препаратов) или сочетания лекарственных препаратов и определить, действительно ли эти лекарственные препараты, в отдельности или в сочетании, подавляют один или несколько вирусных генов и/или вирусных белков.
Настоящее изобретение обеспечивает существенные преимущества в сравнении с ныне доступными способами анализа благодаря созданию более безопасного, более приемлемого, более воспроизводимого, более быстрого и более эффективного способа анализа лекарственной чувствительности и устойчивости вируса для проверки терапевтической эффективности конкретного противовирусного лекарственного(ых) препарата(ов) или сочетаний лекарственных препаратов, помогающего терапевту в оптимизации лечения. Способы анализа настоящего изобретения обладают существенным преимуществом, давая возможность оценить устойчивость и чувствительность вируса на всех стадиях создания лекарственного препарата 1) в ходе предварительной клинической оценки потенциальных противовирусных соединений;
2) в ходе клинической оценки новых лекарственных препаратов; 3) в ходе лечения пациента, получая возможность создать терапевтический режим для преодоления проблемы лекарственной устойчивости; и
-11005426
4) как часть эпидемиологического обследования при оценке распространенности лекарственной устойчивости вирусов в ходе использования утвержденных и экспериментальных лекарственных препаратов.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1.
A. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК Н1У-1. В каждой из трех открытых рамок считывания находятся вирусные белки, кодируемые генами дад, ροϊ, νίί, νρτ, 1а1. τον, νρυ, еиу и пеГ. РНК транскрибируется с вирусной ДНК и процессируется вирусными и клеточными ферментами, приводя к появлению и геномной вирусной РНК и мРНК. Показаны элементы вирусного длинного концевого повтора (ьтк) - из, к и и5.
B. Обобщенное диаграммное изображение вирусного геномного вектора Ηΐν, который содержит следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область из Ηΐν-ЬТВ, 2) область К Ηΐν-ЬТВ, 3) область И5 Ηΐν-ЬТК, 4) кодирующие области генов Ηΐν дад-ροϊ, νίί, ντρ, 1а1. геу, ури, делетированного епу, и пеГ, и
5) 3' Ηΐν-ЬТК
C. Обобщенное диаграммное изображение вирусного геномного вектора Ηΐν, который содержит следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) энхансер-промотор ΐΕ ΟΜν, 2) область К Ηΐν-ЕТК, 3) область И5 Ηΐν-ЕТК, 4) кодирующие области генов Ηΐν дад-ροϊ, νίί, ντρ, 1а1, гем νρυ, делетированного οιιν, и пеГ, и 5) 3' Ηΐν-ЬТВ.
Ό. Обобщенное диаграммное изображение вирусного субгеномного вектора Ηΐν, который содержит следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область И3 Ηΐν-ЬТВ, 2) область К Ηΐν-ЬТВ, 3) область И5 Ηΐν-ЕТК, 4) кодирующие области гена дад-ροϊ Ηΐν, и 5) 3' Ηΐν-ЕТК.
Е. Обобщенное диаграммное изображение вирусного субгеномного вектора Ηΐν, который содержит следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) энхансер-промотор ΐΕ ΟΜν, 2) область К Ηΐν-ЬТВ, 3) область И5 Ηΐν-ЕТК, 4) кодирующие области гена дад-ροϊ Ηΐν, и 5) 3' Ηΐν-ЕТК.
Фиг. 2.
A. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК Ηΐν-1.
B. Диаграммное изображение резистентного тест-вектора, включающего нефункциональный индикаторный ген, включающий пермутированный промотор, обладающего следующими элементами в направлении 5' к 3': 1) область И3 Ηΐν-ЕТК (ρΕΟ-ϊυοΡΡ-Ηδ и ρΕΟ-ϊυοΡΡ-ΡΒ) или энхансер-промотор ΐΕ ΟΜν (ρΟΟ-ϊιιοΡΡ-Ηδ и ρΟΟ-ϊυοΡΡ-ΡΒ), 2) область К Ηΐν-ЬТК, 3) область И5 Ηΐν-ЬТВ содержащую инсерцированный промотор РНК-полимеразы фага Т7 (указанный здесь в качестве промотора Т7) с направлением транскрипции, противоположной направлению ЬТК, 4) кодирующие области генов дад-ροϊ, νίί, νρτ, 1а1, гем νρυ делегированного еп\г и пеГ, 5) сегмент(ы), получаемые от пациента, инсерцированные в сайты акцепторной последовательности пациента, 6) кассету индикаторного гена, инсерцированную в делегированный ген еп\г, и 7) 3' Ηΐν-ЕТК.
C. Диаграммное изображение, показывающее преобразование не функционального индикаторного гена (пермутированный промотор) в резистентном тест-векторе, описанном в 2(А), в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы. Преобразование в функциональный индикаторный ген происходит из-за репозиции промотора Т7 относительно кодирующей области индикаторного гена.
Фиг. 3.
A. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК Ηΐν-1.
B. Диаграммное изображение упаковывающего экспрессионного вектора ρ^ТΒ-ΗIV3', который представляет гены νίί, νρτ, 1а1, гем νρυ и пеГ, каждый из которых экспрессируется в виде сплайсируемой субгеномной мРНК, транскрибируемой из области И3 Ηΐν ЬТК.
C. Диаграммное изображение упаковывающего экспрессионного вектора ρΟΜν-Ηΐν3', который представляет гены νίί, νρτ, 1а1, гем νρυ и пеГ, каждый из которых экспрессируется в виде сплайсируемой субгеномной мРНК, транскрибируемой из энхансер-промотора ΐΕ ΟΜν.
Ό. Диаграммное изображение упаковывающего экспрессионного вектора ρV^-еην4070Α [ρΟΧΑ8(4070Α его)], который представляет продукт амфотропного гена ΜΕν еп\г, с помощью транскрипции из энхансер-промотора ΟΜν ΐΕ.
Фиг. 4.
A. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК Ηΐν-1.
B. Обобщенное диаграммное изображение резистентных тест-векторов, включающих нефункциональный индикаторный ген, включающий пермутированную кодирующую область, содержащую следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область И3 Ηΐν-ЕТК (ρΕΟ-ϊυοΡΟ-Ηδ и ρΕΟ-ϊυοΡΟ-ΡΒ) или первый энхансер-промотор (ρΟΟ-ϊυοΡΟ-Ηδ и ρΟΟ-ϊυοΡΟ-ΡΒ), 2) область К и И5 Ηΐν-ЕТК, 3) гены кодирующих областей Ηΐν дад-ροϊ, νίί, νρτ, 1а1, гем νρυ, делегируемый еп\\ и пеГ, 4) сегмент(ы), получаемый(е) от пациента, инсерцированный в сайты акцепторной последовательности пациента, 5) кассету первого индикаторного гена, содержащую 5'-кодирующую область гена люциферазы, инсерцированную в делегируемый ген еп\; 6) кассету второго индикаторного гена, содержащую 3'-кодирующую область гена люциферазы, инсерцированную в делегируемую 3'-область И3 Ηΐν-ЕТК, и 7) 3'-область К и И5 Ηΐν-ЬТК.
-12005426
С. Диаграммное изображение, показывающее преобразование не функционального индикаторного гена (пермутируемая кодирующая область) в резистентном тест-векторе, описанного в 4(А), в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы. После обратной транскрипции и переноса цепи, 3'-кодирующую область люциферазы копировали из 3'-ЬТВ в 5'-ЬТВ, давая возможность транскрипционной мРНК, которая может быть сплайсирована, образовать функциональную кодирующую область люциферазы.
Фиг. 5.
A. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК Н1У-1.
B. Обобщенное диаграммное изображение резистентных тест-векторов, включающих нефункциональный индикаторный ген, включающий инвертированный интрон, содержащих следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область ИЗ Н1У-ЬТВ (рЬ6-1ис11-Н8 и рЬ6-1ис11-РВ) или первый энхансерпромотор (рС6-1ис11-Н8 и рС6-1ис11-РВ), 2) области В и И5 Н1У-ЬТВ, 3) гены кодирующих областей Н1У дад-ро1, νίί, ург, 1а1. теу, ури, делегируемый еиу и пе£, 4) сегмент(ы), получаемый(е) от пациента, инсерцированные в сайт акцепторные последовательности пациента, 5) кассету индикаторного гена, инсерцированную в делегируемый ген епу, и 5) 3' Н1У-ЬТВ.
C. Диаграммное изображение, показывающее преобразование не функционального индикаторного гена (инвертированный интрон) в резистентный тест-вектор, описываемый в 5(А), в функциональный идикаторный ген с помощью обратной транскриптазы. Общее направление транскрипции кассеты индикаторного гена противоположно направлению первого энхансер-промотора СМУ и вирусных ЬТВ, а направление искусственного интрона остается тем же, что и у последних элементов.
Транскрипция индикаторного гена под вторым энхансер-промотором СМУ не приводит к образованию функциональных транскриптов, так как инвертированный интрон не может быть сплайсирован в этом направлении. Транскрипция индикаторного гена под вирусным 5'-ЬТВ или первым энхансерпромотором ΙΕ СМУ, тем не менее, приводит к удалению инвертированного интрона путем сплайсинга РНК, хотя индикаторный ген, еще не экспрессируется функционально, поскольку результирующий транскрипт обладает антисмысловой ориентацией. После обратной транскрипции этого транскрипта и интеграции полученной провирусной ДНК, индикаторный ген может быть функционально транскрибирован под вторым энхансер-промотором СМУ, поскольку инвертированный интрон был удален заранее.
Фиг. 6.
A. Диаграммное изображение структуры геномной ДНК Н1У-1 показано выше (А) и (В).
B. Обобщенное диаграммное изображение резистентных тест-векторов, включающих функциональный индикаторный ген, обладающий следующими элементами в направлении 5' к 3': 1) область И3 Н1У-ШВ (рЬ6-1ис-Н8-1 и рЬ6-1ис-РВ-1) или первый энхансер-промотор ΙΕ СМУ (рС6-1ис-Н8-1 и рСС1ис-РВ-1), 2) области В и И5 Н1У-ЬТВ, 3) кодирующую область генов Н1У дад-ро1, у1Г_ ург, 1а1, геу, ури, делегируемого епу, и пе£, 4) кассету функционального индикаторного гена, инсерцированную в делегируемый ген епу, с направлением транскрипции, противоположной вирусным ЬТВ и 5) 3' Н1У-ЬТВ.
C. Обобщенное диаграммное изображение резистентных тест-векторов, включающих кассету функционального индикаторного гена (рЬ6-1ис-Н8-2, рЬ6-1ис-РВ-2, рС6-1ис-Н8-2 и рС6-1ис-РВ-2), в которых направление транскрипции кассеты индикаторного гена является тем же, что и у вирусных ЬТВ.
Фиг. 7.
A. Демонстрация лекарственной чувствительности с использованием резистентных тест-векторов, рСС-СХСЫ (Е-1исР) 2-АА и рС6-СХАТ(Е-1исР)2-АА. Данные представлены в виде активности гена люциферазы в хозяйских клетках-мишенях в виде Относительных Световых Единиц (ВЕИ) в отсутствие А2Т или в присутствии 5 мМ А2Т.
B. Лекарственная чувствительность и тест на резистентность, осуществляемый с помощью резистентного тест-вектора, рС6-СХСХ(Е-1исР)2-АА, содержащего преобработанные А2Т и постобработанные А2Т тест-сегменты, произведенные пациентом. Резистентные тест-векторы, получали из вирусного вектора геномного индикаторного гена, рС6-СХСХ(Г-1исР)2-АА. Данные представлены в виде процентного ингибирования активности гена люциферазы в хозяйских клетках-мишенях у§. концентрации А2Т (1о§10). рС6-СХСХ(Г-1исР)2-АА представляет собой кривую в виде зачерненных квадратов. рС6-СХСХ(Е-1исР)2-АА, содержащий сегменты, произведенные пациентом, перед обработкой А2Т представляет собой кривую в виде зачерненных кружков, а после обработки А2Т - в виде зачерненных треугольников.
C. Лекарственная чувствительность и тест на резистентность, осуществляемый с помощью резистентного тест-вектора, рС6-СХСХ(Е-1исР)2-АА, содержащий сегмент обратной транскриптазы, полученный из биологически активного провирусного гена, рХЪ4-3. Данные представлены в виде процентного ингибирования активности гена люциферазы в хозяйских клетках-мишенях у§. концентрации невирапина (1од10) и представляют собой кривую в виде зачерненных квадратов.
Ό. Лекарственная чувствительность и тест на резистентность, осуществляемый с помощью резистентного тест-вектора, рС6-СХСХ(Е-1исР)2-АА, содержащего протеазный сегмент, полученный из биологически активного провирусного клона, рХЪ4-3. Данные представлены в виде процентного ингибиро
-13005426 вания активности гена люциферазы в хозяйских клетках-мишенях νδ. концентрации индинавира (1о§ю) и представляют собой кривую в виде зачерненных квадратов.
Фиг. 8.
A. Диаграммное изображение структуры прегеномной РНК НВУ. Прегеномная РНК показана в виде жирной линии. Последовательности прямого повтора показаны в виде замкнутых треугольников. Показаны позиции капсидированной сигнальной последовательности ((). Гены С, Р, 8 и Х показаны в виде незакрашенных прямоугольников. Указаны концевой белок (ТК), спейсер, ДНК-полимераза/обратная транскриптаза (ро1/КТ), и области Н РНК гена Р. Сайты С, Р, 8 и Х инициации трансляции отмечены заштрихованными треугольниками.
B. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, ρΟ6-ΗΒν(ΝΓ-Ι6)ΙΙ-(Ρ8Α8-), компонента резистентной тест-векторной системы, включающего кассету индикаторного гена и инвертированный интрон, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3':
1) область энхансер-промотора ΙΕ СМУ, 2) 5'-область генома НВУ и ΌΚ1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ΟΚΓ элиминирован), 3) кассету не функционального индикаторного гена, в котором индикаторный ген ΟΚΓ содержит инвертированный интрон, 4) область генома НВУ, содержащая ΌΚ2, ΌΚ1*, 3'ε и З'-область сигнала полиаденилирования (рА) НВУ.
C. Диаграммное изображение ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК), образованной из субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, рС8-НВУ(Г-Ю)11(Р8А8-), содержащей кассету индикаторного гена, собранную в результате репликации НВУ-вируса.
Ό. Диаграммное изображение, как один из примеров, упаковывающего вектора, рРК-СРХ, компонента резистентной тест-векторной системы, включающего сегмент, произведенный пациентом, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕ СМУ, 2) область генома НВУ, простирающуюся от С-кодона инициации трансляции ΟΚΓ до 3'-РА-сигнала, и включающую гены С, Р, 8 и X. Ген С упаковывающего вектора, рРК-СРХ, модифицировали так, чтобы он не содержал последовательности пре-С ΟΚΓ и не экспрессировал 8-белки (как показано в Х на сайтах инициации трансляции).
Е. Диаграммное изображение дополнительного упаковывающего вектора, рРК-8, создающего белки
8-гена, который котрансфицировали с тест-векторной системой на резистентность, включающего индикаторный ген вирусного вектора, рС8-НВУ(№'-Ю)П-(Р8А8-), и упаковывающую плазмиду, рРК-СРХ.
Γ. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, рС8-НВУ(№-Ю)П-(Р8А8+), включающего не функциональный индикаторный ген с инвертированным интроном, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕ СМУ, 2) 5'-область генома НВУ и ΌΚ1 и 5 (кодом инициации трансляции пре-С ΟΚΓ элиминирован), 3) кассету индикаторного гена (содержащую инвертированный интрон) в пределах области НВУ-генома, которая содержит сегмент гена Р, производимого пациентом, 4) область НВУ-генома, содержащая ΌΚ2, ΌΚ1*, 3'ε, и область РАсигнала НВУ.
6. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК), образованной из резистентного тест-вектора, рС8-НВУ(Г-Ю)П-(Р8А8+), содержащего кассету функционального индикаторного гена и сегмент, производимого пациентом гена Р, собранного в результате вирусной репликации НВУ.
Н. Диаграммное изображение упаковывающего вектора, рРК-С8Х, представляющего белки гена С, 8 и X, который котрансфицировали с резистентным тест-вектором, рС8-НВУ(№-Ю)П-(Р8А8+).
Фиг. 9.
A. Диаграммное изображение структуры прегеномной РНК НВУ.
B. Диаграммное изображение индикаторного гена вирусного вектора НВУ, содержащего кассету не функционального индикаторного гена. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация прямого праймера (Р£) и обратного праймера (Рг), связывающего сайты, не определяет функциональную единицу амплификации в линеаризованной форме вектора, который используется для трансфекции упаковывающих хозяйских клеток. Обратный праймер Рг, связывающий сайты, создавали для перекрытия соединения последовательности, которое образовано при сплайсинге прегеномной РНК.
C. Диаграммное изображение гс-ДНК-формы индикаторного гена вирусного вектора, описанного в 10В. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация Р£ и Рг праймеров, связывающих сайты, определяет функциональную единицу амплификации для плюс-цепи ДНК-компонента гс-ДНК-формы, а плюс- и минус-цепочечные ДНК компоненты - из сскДНК-формы вектора, который получали путем репликации ДНК НВУ, находящейся внутри вирусных частиц, получаемых в упаковывающих хозяйских клетках. Данный Рг-связывающий сайт собирали путем сплайсинга прегеномной РНК.
Ό. Диаграммное изображение индикаторного гена вирусного НВУ-вектора, содержащего кассету нефункционального индикаторного гена. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация Р£ и Рг праймеров, связывающих сайты оп
-14005426 ределяет функциональную единицу амплификации в линеаризованной форме вектора, который используется для трансфекции упаковывающих хозяйских клеток, но Р£ связывающий сайт не примыкает к связывающему сайту экзонуклеазной детекционной пробы (зонд) в несплайсируемой линеаризованной форме вектора. Данное выстраивание Р£, Рг и зонда, связывающих сайты, не представляет эффективную экзонуклеазную детекционную единицу.
Е. Диаграммное изображение гс-ДНК, образующей индикаторный ген вирусного вектора, описанного на фиг. 9Ό. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНКмишени. Локализация и ориентация Р£ и Рг праймера, связывающих сайты, определяет функциональную единицу амплификации в гс-ДНК и сскДНК формах вектора, который получали путем репликации ДНК НВУ в упаковывающих хозяйских клетках. Локализация Р£ связывающего сайта прямо примыкает к связывающему сайту экзонуклеазной детекционной пробы (зонд) в гс-ДНК и сскДНК формах вектора. Данное выстраивание РЕ, РК. и пробы, связывающих сайты, представляет эффективную экзонуклеазную детекционную единицу.
Е. Диаграммное изображение НВУ-индикаторного гена вирусного вектора. Показан праймер, связывающий сайты для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация прямого праймера (Р£) и обратного праймера (Рг), связывающих сайты, не определяет функциональную единицу амплификации в линеаризованной форме вектора, который используется для трансфекции упаковывающих хозяйских клеток.
С. Диаграммное изображение гс-ДНК-формы индикаторного гена вирусного вектора, описанного в 10Е. Показан праймер, связывающий сайт для амплификации последовательности ДНК-мишени. Локализация и ориентация Р£ и Рг, связывающих сайты, определяет функциональную единицу амплификации в плюс-цепи ДНК-компонента гс-ДНК-формы и в плюс- и минус-цепи ДНК-компонентов сскДНК-формы вектора, который получали путем репликации ДНК НВУ внутри вирусных частиц, получаемых в упаковывающих хозяйских клетках.
Фиг. 10.
A. Диаграммное изображение структуры прегеномной ДНК НВУ.
B. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, рС8-НВУ(№'-Ю)РР-(Р8А8-), компонента резистентной тест-векторной системы, включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, содержащего следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕ СМУ, 2) 5'-область генома НВУ и ΌΚ1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован), 3) кассету нефункционального индикаторного гена, собранную так, чтобы промоторная область находилась 3', то есть ниже индикаторного гена ОКЕ, 4) 3'область генома НВУ, содержащую ΌΚ2, ΌΚ1*, 3'ε, и 3'-область сигнала рА НВУ (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован). Упаковывающий вектор, рРК-СРХ, компонент резистентной тест-векторной системы, включающий сегмент гена Р, производимого пациентом, показан на фиг. 8Ό, а 8-упаковывающий вектор, рРК-8, показан на фиг. 8Е.
C. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК), образованной из субгеномного индикаторного гена рС8-НВУ (Е-1С)РР(Р8А8-), содержащей кассету функционального индикаторного гена, собранную в результате вирусной репликации НВУ.
Ό. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, рС8-НВУ (ΝΡ-Ю) РР (Р8А8+), включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕ СМУ, 2) 5'-область НВУ генома ΌΚ1 и 5'-копия (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован), 3) энхансерпромоторную область (пермутированный промотор), 4) ген Р, содержащий сегмент, производимый пациентом, 5) ОКЕ индикаторного гена, 6) участок внутреннего входа рибосом (1КЕ8), 7) 3'-область генома НВУ, содержащую ИК2, ИК1*, 3'ε, и 3'-область сигнала рА НВУ (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован). Упаковывающий вектор, рРК-С8Х, предоставляющий гены С, 8 и X, котрансфицировали с резистентным тест-вектором, рС8-НВУ(№-Ю)РР(Р8А8+) и показали на фиг. 8Н.
Е. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК) формы из резистентного тест-вектора, рС8-НВУ(Е-1С)РР(Р8А8+), содержащей кассету функционального индикаторного гена и сегмент гена Р, получаемого от пациента, собранную в результате вирусной репликации НВУ.
Фиг. 11.
A. Диаграммное изображение структуры прегеномной РНК НВУ.
B. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, рС8-НВУ(№-Ю)РРТ18-(Р8А8-), компонента резистентной тест-векторной системы, включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором и сайт инициации трансляции, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕ-СМУ, 2) 5'область НВУ генома, включающую ИК1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован),
3) индикаторный ген ОКЕ, не имеющий сайта инициации трансляции, 4) область энхансер-промотора (пермутированный промотор), 5) 3'-область НВУ-генома, содержащей ИК2, кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ, ИК1*, 3'ε, и 3'-область сигнала рА НВУ. Упаковывающий вектор, рРК-СРХ, компонент
-15005426 резистентной тест-векторной системы, включающий сегмент, производимый пациентом, показан на фиг. 8Ό, а 8-упаковывающий вектору рРК-8у показан на фиг. 8Е.
С. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой (сскДНК), ДНК-формы субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, ρΟ8-ΗΒν(Ε-Ι6)ΡΡΤΙ§(Ρ§Α§-), содержащей функциональную кассету индикаторного гена, собранную в результате вирусной репликации ΗΒν.
Ό. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, ρΟ8-ΗΒν(ΝΡ-Ι6) ΡΡΤΙ8(Ρ8Α8+), включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕ СМС, 2) 5'область ΗΒν генома, включающую ΌΡ1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован), 3) индикаторный ген ОКЕ, не имеющий сайта инициации трансляции, 4) ген Р, содержащий сегмент, производимый пациентом, 5) область энхансер-промотора (пермутированный промотор), 6) 3'-область ΗΒν-генома, содержащую ΌΡ2, кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ, ΌΚ1*, 3'ε, и 3'-область сигнала рА ΗΒν. Упаковывающий вектор, ρΡΚ-СЗХ, создающий гены С, 8 и X, котрансфицировали с резистентным тест-вектором, ρС8-ΗΒV(NЕ-Ю)ΡΡΤI8(Ρ8Α8+), и показали на фиг. 8Н.
Е. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой (сскДНК), ДНК-формы из резистентного тест-вектора, ρС8-ΗΒV(Е-Ю)ΡΡΤI8(Ρ8Α8+), содержащей кассету функционального индикаторного гена и сегмент гена Р, производимого пациентом, собранной в результате вирусной репликации ΗΒν.
Фиг. 12.
A. Диаграммное изображение структуры прегеномной РНК структуры ΗΒν.
B. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, ρС8-ΗΒV(NЕ-Ю)ΡСК-(Ρ8Α8-), компонента резистентной тест-векторной системы, включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированной кодирующей областью, содержащей следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕ-СМУ, 2) 5'-область ΗΒν генома, включающую ΌΚ1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован), 3) кассету нефункционального индикаторного гена, собранную так, чтобы промоторная область и 5'-часть кодирующей области располагались 3', т.е. ниже остальной 3'-части кодирующей области, 4) 3'-область ΗΒν-генома, содержащую ΌΚ2, ΌΚ1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА ΗΒν (кодон инициации трансляции элиминирован). Упаковывающий вектор, рРК-СРХ, компонент резистентной тест-векторной системы, включающий сегмент, производимый пациентом, показан на фиг. 8Ό, а 8-упаковывающий вектор, ρΡΚ-8, показан на фиг. 8Е.
C. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК) формы из субгеномного индикаторного гена вирусного вектора ρС8-ΗΒV(Е-Ю)ΡСК(Ρ8Α8-), содержащая кассету функционального индикаторного гена, собранную в результате вирусной репликации ΗΒν.
Ό. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, ρС8-ΗΒV(NЕ-Ю) ΡΟΚ(Ρ8Α8+), включающего нефункциональный индикаторный ген с пермутированной кодирующей областью, содержащую следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕСМУ, 2) 5'-область ΗΒν генома, включающую ΌΚ1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован), 3) 3'-часть ОКЕ индикаторного гена, начинающегося со сплайсированной акцепторной последовательности в обратной ориентации, 4) ген Р, содержащий сегмент, производимый пациентом, 5) область энхансер-промотора, 6) 5'-часть ОКЕ индикаторного гена, заканчивающегося в сплайсированной донорной последовательности в обратной ориентации, 7) 3'-область ΗΒν-генома, содержащую ОК2, ОК1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА ΗΒν (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован). Упаковывающий вектор, ρΡΚ-Ο8Χ, предоставляющий гены С, 8 и X, котрансфицировали с резистентным тествектором, ρС8-ΗΒV(NЕ-Ю)ΡΡΤI8(Ρ8Α8+), и показали на фиг. 8Н.
Е. Диаграммное изображение ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (сскДНК), образованной из резистентного тест-вектора, ρС8-ΗΒV(Е-Ю)ΡСК(Ρ8Α8+), содержащей кассету функционального индикаторного гена и сегмент гена Р, производимого пациентом, собранной в результате вирусной репликации ΗΒν.
Фиг. 13.
A. Диаграммное изображение структуры прегеномной ΡΗΚ-ΗΒν.
B. Обобщенное диаграммное изображение субгеномного индикаторного гена вирусного векторного компонента, ρС8-ΗΒV(Е-Ю)(Ρ8Α8-), включающего кассету индикаторного гена, содержащую следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора ΙΕ-СМУ, 2) 5'-область ΗΒν генома, включающую ΌΒ1 и 5' (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован), 3) кассету функционального индикаторного гена, 4) 3'-область ΗΒν-генома, содержащую ΌΡ2, ОК1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА ΗΒν (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован). Упаковывающий вектор, рРКСРХ, компонент резистентной тест-векторной системы, включающий сегмент гена Р, производимый пациентом, показан на фиг. 8Ό, а 8-упаковывающий вектор, ρΡΚ-8, показан на фиг. 8Е.
-16005426
С. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой (сскДНК), ДНК-формы из субгеномного индикаторного гена вирусного вектора, рС8-НВУ(Е-Ю)(Р8Л8-), содержащей функциональный индикаторный ген.
Ό. Обобщенное диаграммное изображение резистентного тест-вектора, рС8-НВУ(Е-Ю)(Р8Л8+), включающего функциональный индикаторный ген, содержащий следующие элементы в направлении 5' к 3': 1) область энхансер-промотора 1Е-СМУ, 2) 5'-область НВУ генома, включающую ΌΚ1 и 5' кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован, 3) кассету функционального индикаторного гена, 4) ген Р, содержащий сегмент, производимый пациентом, 5) 3'-область НВУ-генома, содержащую ΌΚ2, ΌΚ1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА НВУ (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован). Упаковывающий вектор, рРК-С8Х, создающий гены С, 8 и X, котрансфицировали с резистентным тест-вектором, рС8НВУ(Е-Ю)(Р8Л8+), и показали на фиг. 8Н.
Е. Диаграммное изображение ковалентно-замкнутой кольцевой (сскДНК), ДНК-формы из резистентного тест-вектора, рС8-НВУ(Е-Ю)(Р8Л8+), содержащую функциональный индикаторный ген.
Подробное описание изобретения
С целью лучшего понимания настоящего изобретения, ниже приводится его описание.
Настоящее изобретение относится к новому анализу чувствительности и резистентности к лекарственному препарату, включающему следующие стадии: (а) введение резистентного тест-вектора, включающего сегмент, производимый пациентом, и индикаторного гена в хозяйскую клетку; (Ь) культивирование хозяйской клетки со стадии (а); (с) измерение экспрессии индикаторного гена в хозяйской клеткемишени; (б) сравнение экспрессии индикаторного гена со стадии (с) с экспрессией индикаторного гена, измеряемого, когда стадии (а)-(с) осуществляют в отсутствие противовирусного лекарственного препарата, и в присутствии тестируемой концентрации представлена на стадиях (а)-(с); на стадиях (Ь)-(с) или на стадии (с).
В одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ определения чувствительности к противовирусному лекарственному препарату, включающий: (а) введение резистентного тест-вектора, включающего сегмент, производимый пациентом, и индикаторного гена в хозяйскую клетку; (Ь) культивирование хозяйской клетки со стадии (а); (с) измерение индикатора в клетке-мишени, причем указанный индикатор представляет собой ДНК- или РНК-структуру; и (б) сравнение измерения индикатора со стадии (с) с измерением индикатора на стадиях (а)-(с), осуществляемых в отсутствие противовирусного лекарственного препарата и в присутствии тестируемой концентрации противовирусного лекарственного препарата на стадиях (а)-(с); на стадиях (Ь)-(с) или на стадии (с).
Настоящее изобретение относится также к способу определения у пациента противовирусной лекарственной устойчивости, включающий: (а) построение стандартной кривой лекарственной чувствительности к противовирусному лекарственному препарату; (Ь) определение у пациента противовирусной лекарственной чувствительности с использованием любого теста на чувствительность, описанного выше; и (с) сравнение противовирусной лекарственной чувствительности со стадии (Ь) со стандартной кривой, определенной на стадии (а), причем уменьшение противовирусной чувствительности свидетельствует о выработке у пациента противовирусной лекарственной устойчивости.
Настоящее изобретение относится также к способу определения устойчивости пациента к противовирусному лекарственному средству, включающему: (а) определение чувствительности пациента к противовирусному лекарственному средству в первый раз в соответствии с любым из вышеупомянутых способов, причем сегмент, производимый пациентом, получают от пациента приблизительно в вышеуказанное время; (Ь) определение устойчивости того же пациента к противовирусному лекарственному средству в более позднее время и (с) сравнение противовирусной лекарственной чувствительности, определяемой на стадии (а) и (Ь), причем уменьшение противовирусной лекарственной чувствительности в более позднее время, сравненное с первым разом, свидетельствует о выработке или развитии у пациента противовирусной лекарственной резистентности.
Исследование по настоящему изобретению можно использовать для любого вирусного заболевания, где затрагиваются и чувствительность, и резистентность к противовирусному лекарственному средству, в том числе, например, Н1У, вирус простого герпеса, цитомегаловирус, вирус ветряной оспы, другие человеческие вирусы герпеса (Н1У), вирус гриппа А, респираторно-синцитиальный вирус, вирусы гепатита А, В и С, риновирус и человеческий вирус папилломы. Эти вышеупомянутые представляют некоторые вирусы, для которых в настоящее время имеется химиотерапия, и представляют собой вирусные семейства ретровирусов, вирусов герпеса, ортомиксовируса, пневмовирусов и гепаднавирусов. Анализ по настоящему изобретению будет использоваться и для других вирусных инфекций, возникающих при инфекциях, связанных с вирусами в рамках этих семейств, а также вирусных инфекций, возникающих от вирусов других вирусных семейств. Кроме того, тесты на лекарственную чувствительность и резистентность, исследованные в настоящем изобретении, полезны для скринирования соединений для лечения вирусных заболеваний, которые в настоящее время не доступны для лечения.
Структура, жизненный цикл и генетические элементы вирусов, которые можно было бы протестировать на лекарственную чувствительность и резистентность в настоящем изобретении, известны рядовым специалистам в данной области. Для практики настоящего изобретения полезно, например, знать
-17005426 жизненный цикл ретровируса, а также вирусные гены, необходимые для избавления от ретровируса и инфицированности. Клетки, зараженные ретровирусом, сбрасывают оболочку с вируссодержащего диплоидного РНК-генома. Этот вирус, известный как оболочечный гликопротеин, который служит, чтобы детерминировать диапазон инфекционности хозяина, присоединяется к клеточному рецептору на плазматической мембране клетки для инфицирования. После связывания с рецептором, вирус интернализуется и раздетым проникает в цитоплазму хозяйской клетки. На своем пути к ядру или в ядро, молекулы обратной транскриптазы, присущие кору, стремятся синтезировать двухцепочечную ДНК провируса, синтез которой праймирован путем связывания молекулы 1РНК с геномной вирусной РНК. Двухцепоченая провирусная ДНК последовательно интегрируется в геном хозяйской клетки, где она служит в качестве матрицы транскрипции и для мРНК, кодирующих вирусные белки, и для РНК генома вириона, которая упаковывается в вирусные частицы кора. На своем пути из инфицированной клетки коровые частицы двигаются через цитоплазму, присоединяются к внутренней плазматической мембране вновь инфицируемой клетки, а почка, создающаяся на их путях из мембраны, содержит оболочечный гликопротеин, генный продукт, кодируемый вирусом. Этот цикл заражения - обратная транскрипция, транскрипция, трансляция, сборка вириона и баддинг повторяются много раз, чтобы расширить заражение.
Вирусная РНК и как результат провирусная ДНК кодирует несколько цис-действующих элементов, которые жизненно важны для успешного завершения жизненного цикла вируса. РНК вириона переносит вирусный промотор на свой З'-конец. Репликационный пилотаж помещает вирусный промотор на 5'конец провирусного генома, поскольку геном обратно транскрибируем. Только 3'-5'-ретровирусный ЬТК располагает вирусный упаковывающий сайт. Ретровирусный жизненный цикл требует присутствия вирусно кодируемых трансактивирующих факторов. Вирусная РНК-зависимая ДНК-полимераза (ро1) обратная транскриптаза также содержится в вирусном коре и является жизненно важной для вирусного жизненного цикла, в котором она ответственна за преобразование геномной РНК в интеграционную промежуточную провирусную ДНК. Вирусный оболочечный гликопротеин, епу, необходим для присоединения вируса к неинфицированной клетке и для расселения вируса. Существуют также транскрипционные транс-активирующие факторы, так называемые трансактиваторы, которые могут служить для модуляции уровня транскрипции интегрированного родительского провируса. Обычно вирусы, компетентные по репликации (бездефектные), являются автономными в том, что они кодируют все эти трансдействующие факторы. Их дефектный двойник не автономен.
В случае ДНК-вируса, такого как гепаднавирус, знание жизненного цикла и вирусных генов, требуемых для заражения, является полезным для практики настоящего изобретения. Процесс проникновения ΗΒν не был достаточно охарактеризован. Репликация ΗΒν использует промежуточную РНКматрицу. В зараженной клетке первая стадия в репликации представляет собой преобразование ассиметричной раскрученной кольцевой ДНК (гс-ΌΝΆ) в ковалентно-замкнутую кольцевую ДНК (сскДНК). Этот процесс, который происходит в ядре инфицированных клеток печени, влечет за собой завершение синтеза положительно-цепочечной ДНК и лигирование концов ДНК. На второй стадии сскДНК транскрибируется с помощью хозяйской РНК-полимеразы с образованием 3,5 т.п.н. РНК-матрицы (прегеном). Этот прегеном комплексуется с белком в вирусный кор. Третья стадия синтеза включает синтез негативно-смысловой цепи ДНК путем репликации прегеномной РНК с использованием кодируемого вирусом белка Р обратной транскриптазы. Белок Р выступает также в качестве минус-цепи ДНК-праймера. Наконец, синтез позитивно-смысловой цепи ДНК происходит путем репликации первой цепи ДНК с использованием ДНК-полимеразной активности белка Р и олигомера вирусной РНК в качестве праймера. Прегеном также транскрибирует мРНК по главным структурным коровым белкам.
Нижеследующая схема последовательностей операций иллюстрирует различные векторы и хозяйские клетки, которые могут использоваться в настоящем изобретении. Включение всех операций не предполагалось.
-18005426
Векторы
Кассета индикаторного + Вирусный вектор
Гена (функциональный/не- (геномный или субгеномный)
Функциональный индикаторный Ген)
Индикаторный Ген Вирусного Вектора (функциональный/нефункциональный индикаторный ген + Акцепторные сайты последовательности пациента
V + Сегменты, производимые пациентом
Резистентный тест-вектор (сегменты, производимые пациентом + индикаторный ген)
Хозяйские клетки
Упаковывающая хозяйская клетка - трансфицируемая упаковывающими экспрессионными векторами
Резистентный тест-вектор хозяйской клетки - упаковывающая хозяйская клетка, трансфицируемая резистентным тест-вектором
Хозяйская клетка-мишень - хозяйская клетка для заражения резистентным тест-вектором вирусной частицы, полученной с помощью резистентного тест-вектора хозяйской клетки.
Резистентный тест-вектор
Резистентный тест-вектор подразумевает несколько векторов, которые, взятые вместе, содержат ДНК или РНК, включающую сегмент, производимый пациентом, и индикаторный ген. В том случае если резистентный тест-вектор включает более чем один вектор, сегмент, производимый пациентом, может содержать в одном векторе и индикаторный ген в отличающемся векторе. Такой резистентный тествектор, включающий более чем один вектор, рассматривается здесь для ясности в качестве резистентной тест-векторной системы, но все же подразумевает резистентный тест-вектор. ДНК или РНК резистентный тест-вектор может, следовательно, содержатся в одной или нескольких молекулах ДНК или РНК. В первом варианте осуществления настоящего изобретения резистентный тест-вектор делали путем инсерции сегмента, производимого пациентом, в индикаторный ген вирусного вектора. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения резистентный тест-вектор делали путем инсерции сегмента, производимого пациентом, в упаковывающий вектор, тогда как индикаторный ген содержался во втором векторе, например, индикаторный ген вирусного вектора. Используемое здесь понятие сегмент, производимый пациентом, относится к одному или нескольким вирусным сегментам, получаемым непосредственно от пациента с использованием различных способов, например молекулярным клонированием или полимеразной цепной реакцией (РСК), амплифицирующей сегменты, производимые пациентом с использованием вирусной ДНК или комплементарной ДНК (кДНК), получаемой из вирусной РНК, присутствующей в клетках (например, моноядерные клетки периферической крови, РМВС), в сыворотке или в других жидкостях организма инфицированных пациентов. Когда вирусный сегмент получен непосредственно от пациента, его получали без проведения вируса через культуру или же его культивировали с последующим минимальным количеством пассажей, чтобы существенно исключить отбор мутаций в культуре. Термин вирусный сегмент относится к любой функциональной вирусной последовательности или вирусному гену, кодирующему генный продукт (например, белок), который является мишенью противовирусного лекарственного препарата. Термин функциональная вирусная последовательность, как он здесь используется, относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) с функциональной активностью, такой как энхансеры, промоторы, сайты полиаденилирования, сайты действия транс-действующих факторов, таких как 1аг и ККЕ, к упаковывающим последовательностям, интегрирующим последовательностям, или последовательностям сплайсинга. Если лекарственный препарат предназначен для мишени более чем одной функциональной вирусной последовательности или вирусного генного продукта, тогда сегменты, производимые пациентом, корреспондирующие с каждым указанным вирусным геном, будут инсерцированы в резистентный тест-вектор. В случае комбинированной терапии, где установлено, что два или несколько противовирусов мишенируют две отличающиеся функциональные вирусные последовательности или вирусные генные продукты, сегменты, производимые пациентом, корреспондирующие с каждой функциональной вирусной последовательностью или
-19005426 вирусным генным продуктом, будут инсерцированы в резистентный тест-вектор. Сегменты, производимые пациентом, инсерцированы в уникальные сайты рестрикции или специфические местоположения, называемые акцепторными сайтами последовательности пациента, в вирусном векторе, с индикаторным геном, или, например, упаковывающем векторе, зависящем от конкретной используемой конструкции, описанной здесь.
Используемое здесь понятие сегмент, производимый пациентом, охватывает сегменты, полученные от человека и различных видов животных. Такие виды включают, но не ограничиваются, шимпанзе, лошадями, крупным рогатым скотом, кошками и собаками.
Сегменты, производимые человеком, могут также включаться в резистентные тест-векторы с использованием любой из нескольких альтернативных методик клонирования. Например, клонирование путем интродукции сайтов рестрикции класса II и в плазмидный остов и в сегменты, производимые человеком, или с помощью клонирования урацил-ДНК-гликозилазного праймера (ссылки).
Сегмент, производимый пациентом, может быть получен любым способом молекулярного клонирования или генной амплификации, или их модификациями, путем интродуцирования акцепторных сайтов последовательности пациента, как описано ниже, на концы сегмента, производимого пациентом, интродуцируемого в резистентный тест-вектор. Например, в способе амплификации, таком как РСК, сайты рестрикции, корреспондирующие акцепторным сайтам в последовательности пациента, могут быть вставлены в концы праймеров, используемых в реакции РСК. Аналогично, в способе молекулярного клонирования, таком как кДНК-клонирование, указанные сайты рестрикции могут быть вставлены в концы праймеров, используемых для синтеза первой или второй цепи кДНК, или в способе, таком как восстановление ДНК с помощью праймера, в любой из двух, клонированной или неклонированной ДНК, указанные сайты рестрикции могут быть вставлены в праймеры, используемые для реакции репарации. Акцепторные сайты последовательности пациента и праймеры конструировали для улучшения представительства сегментов, производимых пациентом. Наборы резистентных тест-векторов, обладающие сконструированными акцепторными сайтами последовательности пациента, создают представительные сегменты, производимые пациентом, которые должны быть недостаточно представлены только в одном резистентном тест-векторе.
Резистентные тест-векторы получали путем модификации индикаторного гена вирусного вектора (описываемого ниже) путем интродуцирования акцепторных сайтов последовательности пациента, амплификации или клонирования сегментов, производимых пациентом, и инсерцирования амплифицированных или клонированных последовательностей точно в вирусные векторы, с индикаторным геном, по акцепторным сайтам последовательности пациента. Резистентные тест-векторы конструировали из индикаторного гена вирусных векторов, которые, в свою очередь, произведены из геномных вирусных векторов или субгеномных вирусных векторов и кассеты индикаторного гена, каждый из которых описывается ниже. Затем резистентные тест-векторы интродуцировали в хозяйскую клетку. Альтернативно, резистентный тест-вектор (определяемый также как резистентная тест-векторноя система) получали путем введения акцепторных сайтов последовательности пациента в упаковывающий вектор, амплификации или клонирования сегментов, производимых пациентом, и инсерцирования амплифицированных или клонированных последовательностей точно в упаковывающий вектор по акцепторным сайтам последовательности пациента и котрансфицирования этого упаковывающего вектора с индикаторным геном вирусного вектора.
В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, резистентный тествектор может быть интродуцирован в упаковывающие хозяйские клетки вместе с упаковывающими экспрессионными векторами, как описывается ниже, с получением резистентных тест-векторных вирусных частиц, которые используются в тестах на лекарственную устойчивость и чувствительность, рассматриваемые здесь в качестве теста, основанного на частице. В альтернативном предпочтительном варианте, резистентный тест-вектор может быть интродуцирован в хозяйскую клетку в отсутствие упаковывающего экспрессионного вектора для осуществления теста на лекарственную устойчивость и - чувствительность, который рассматривается здесь в качестве теста не основанного на частице. Используемый здесь упаковывающий экспрессионный вектор создает факторы, такие как упаковывающие белки (например, структурные белки, такие как полипептиды кора и оболочки), трансдействующие факторы, или гены, необходимые для дефектно-реплицируемого ретровируса или гепаднавируса. В такой ситуации компетентный по репликации вирусный геном ослаблен таким образом, что не может самореплицироваться. Это означает, что хотя упаковывающий вектор может давать трансдействующие или недостающие гены, необходимые для спасения дефектного вирусного генома, присутсвующего в клетке, содержащей ослабленный геном, этот ослабленный геном не может спасти самого себя.
Индикатор или индикаторный ген
Индикатор или индикаторный ген относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, ДНК или РНК структура которого либо прямо, либо посредством реагирования приводит к возникновению измеряемого или заметного внешнего проявления, например, цвета или света, измеряемого длиной волны, или в случае ДНК или РНК, используемых в качестве индикаторного изменения или образования специфической ДНК или РНК структуры. Предпочтительные примеры индикаторного гена предоставля-20005426 ет ген 1;·κΖ Е. со11, который кодирует бета-галактозидазу, ген 1ис, который кодирует любую форму люциферазы, например, Рко!ошк ругаШ (жук-светляк) или Веш11а геПТогтк (морская фиалка), ген рйоА Е. со11, который кодирует щелочную фосфатазу, белок, флуоресцирующий зеленым, и бактериальный ген САТ, который кодирует хлорамфениколацетилтрансферазу. Дополнительными предпочтительными примерами индикаторного гена являются секретируемые белки или белки клеточной оболочки, которые легко измерить в анализе, таком как радиоиммунологическом анализе (В1А), или флуоресцентноактивируемом клеточном анализе (ЕАС8), в том числе, например, ростовые факторы, цитокины и поверхностные антигены клетки (например, гормон роста, соответственно 11-2 или СЭ4). Понятие индикаторный - ген включает также селекционный ген, рассматриваемый также как селективный маркер. Примерами подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих являются дигидрофолатредуктаза (ЭНЕВ), тимидинкиназа, гигромицин, неомицин, зеоцин или др! Е. со11. Что касается вышеупомянутых примеров индикаторных генов, данный индикаторный ген и сегмент, производимый пациентом, представляют собой обособленные элементы системы, т.е. разные и самостоятельные гены. В некоторых случаях сегмент, производимый пациентом, может также использоваться в качестве индикаторного гена. В одном таком варианте осуществления настоящего изобретения, в котором сегмент, производимый пациентом, корреспондирует с более чем одним вирусным геном, который представляет собой мишень противовируса одного из указанных вирусных генов, может также служить в качестве индикаторного гена. Например, вирусный протеазный ген может выступать в качестве индикаторного гена, благодаря своей способности расщеплять хромогенный субстрат или своей способности активировать неактивный зимоген (профермент), который в свою очередь расщепляет хромогенный субстрат, приводя к возникновению в каждом случае цветной реакции. Во всех вышеприведенных примерах индикаторных генов, индикаторный ген может быть либо функциональным, либо нефункциональным, но в каждом случае экспрессия индикаторного гена в клетке-мишени строго зависит от действия сегмента, производимого пациентом.
Функциональный индикаторный ген
Что касается функционального индикаторного гена, индикаторный ген может быть экспрессирован в упаковывающей хозяйской клетке/резистентном тест-векторе хозяйской клетки, указанной ниже, независимо от сегмента, производимого пациентом, однако, функциональный ген мог бы не экспрессироваться в хозяйской клетке-мишени, указанной ниже, без производства функциональных резистентных тест-векторных частиц и их эффективного заражения хозяйской клетки-мишени. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, функциональный индикаторный ген, кассету индикаторного гена, включающую контрольные элементы и ген, кодирующий индикаторный белок, инсерцировали в индикаторный ген вирусного вектора с одной и той же или противоположной транскрипционной ориентацией, в качестве своего или чужого энхансер/промотора вирусного вектора. В отдельном примере, для случая Н1У или НВУ, размещали индикаторный ген и его промотор (энхансер/промотор 1Е СМУ) в одной и той же или противоположной транскрипционной ориентации, соответственно, в виде ШУ-ЬТВ или НВУ-энхансер-промотора, или энхансер-промотора 1Е СМУ, ассоциируемых с вирусным вектором.
Нефункциональный индикаторный ген
Альтернативным индикаторным геном может быть нефункциональный в том смысле, что данный индикаторный ген не эффективно экспрессируется в упаковывающей хозяйской клетке, трансфицированной резистентным тест-вектором, который затем считают резистентным тест-вектором хозяйской клетки, до его преобразования в функциональный индикаторный ген, вследствие действия одного или нескольких продуктов сегмента, производимого пациентом. Индикаторному гену придают нефункциональность путем генетического воздействия, в соответствии с настоящим изобретением.
1. Пермутированный промотор.
В одном из вариантов настоящего изобретения индикаторный ген делали нефункциональным, вследствие определенной локализации промотора, при которой, хотя данный промотор и находится в той же транскрипционной ориентации, что и индикаторный ген, он следует за, а не предшествует данному индикаторному гену, кодирующему последовательность. Этот поставленный не на место промотор рассматривается в качестве пермутированного промотора. Кроме того, к данному пермутированному промотору нефункциональный индикаторный ген ориентируют противоположно ориентации к своему или чужому промотор/энхансеру вирусного вектора. Поэтому кодирующая последовательность нефункционального индикаторного гена не может транскрибироваться ни под пермутированным промотором, ни под вирусными промоторами. Нефункциональному индикаторному гену и его пермутированному промотору сообщают функциональность действием одного или нескольких вирусных белков. В примере нефункционального индикаторного гена с пермутированным промотором для случая Н1У помещали промотор РНК-полимеразы фага Т7 (именуемый здесь как Т7-промотор), промотор в 5'-ЬТВ, в той же ориентации, что и индикаторный ген. Данный индикаторный ген не может транскрибироваться под Т7промотором, поскольку кассета индикаторного гена расположена ниже Т7-промотора. Нефункциональный индикаторный ген в резистентном тест-векторе преобразовывали в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы при заражении клеток-мишеней, приводящему к репозиционированию Т7-промотора, путем репликации 5'-ЬТВ в 3'-ЬТВ, относительно генной кодирующей области.
-21005426
После интеграции репарированного индикаторного гена в хромосому клетки-мишени с помощью ΗΙνинтегразы, ядерная РНК-полимераза Т7, экспрессируемая клеткой-мишенью, транскрибирует данный индикаторный ген. В одним из примеров нефункционального индикаторного гена с пермутированным промотором для случая с ΗΒν энхансер-промоторную область помещали ниже или в 3' данного индикаторного гена, и там, и там, обладающую одной и той же ориентацией. Индикаторный ген не может транскрибироваться под этим энхансер-промотором, поскольку кассета индикаторного гена расположена выше. Нефункциональный ген в резистентном тест-векторе преобразовывали в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскрипции и образования кольцевой молекулы из ΗΒνиндикаторного гена вирусного вектора путем перестановки энхансер-промотора выше относительно кодирующей области индикаторного гена.
Перкутированный промотор может быть любым эукариотическим или прокариотическим промотором, который может транскрибироваться в данной клетке-мишени. Предпочтительно, чтобы данный промотор был небольшим по размеру, чтобы иметь возможность инсерцироваться в вирусный геном без нарушения вирусной репликации. Более предпочтительно использовать промотор, небольшой по размеру и способный к транскрипции с помощью единственной субъединицы РНК-полимеразы, интродуцируемой в хозяйскую клетку-мишень, такой как промотор бактериофага. Примеры таких бактериофаговых промоторов и соответствующих им РНК-полимераз включают промоторы фагов Т7, Т3 и Зр6. Ядерная локализующая последовательность (ΝΕ-З) может быть присоединена к РНК-полимеразе для локализации экспрессии РНК-полимеразы в ядре, где они могут быть необходимы для транскрибирования репарируемого индикаторного гена. Такую ΝΕ-З можно получить из белка, перемещаемого в белок, такого как Тантиген ЗV40. При использовании фаговой РНК-полимеразы, участок внутреннего входа рибосом (1НЕЗ), такой как 5'-нетранслируемая область (ИТК) ЕМС-вируса, можно добавить впереди индикаторного гена, для трансляции транскриптов, которые вообще не копированы. Для случая ΗΙν пермутированный промотор сам по себе может быть интродуцирован в любое положение в пределах 5'-ЬТЕ, который копировали с 3'-ЬТЕ во время обратной транскрипции, при условии, что ЬТН-функция не нарушается предпочтительно в пределах И5 и Н-частей данного ЬТК и более предпочтительно вне функционально важных и высоко консервативных областей И5 и Н. В случае ΗΒν пермутированный промотор можно поместить в любое положение, которое не нарушает цис-действующие элементы, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν. Блокирующие последовательности, добавляемые на концы резистентного тест-вектора, должны иметь не подходящую экспрессию нефункционального индикаторного гена, обусловленную артефактами трансфекции (сцепление ДНК). В Ηΐν-примере, приведенный выше пермутированный промотор Т7, так блокирующий последовательность, может состоять из Т7транскрипционного терминатора, расположенного для блочного прочтения линейно записанной информации о транскрипции, происходящей из-за сцепления ДНК, но не транскрипции, происходящей из-за перестановки пермутированного Т7-промотора из 5'-ЬТЕ в 3'-ЬТВ во время обратной транскрипции.
2. Пермутированная кодирующая область.
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения, индикаторному гену придавали нефункциональность, обусловленную близким местонахождением 5'- и 3'-кодирующими областями индикаторного гена, в котором 3'-кодирующая область предшествует, а не следует за 5'-кодирующей областью. Эту неправильно расположенную кодирующую область рассматривают в качестве пермутированной кодирующей области. Ориентация не функционального индикаторного гена может быть той же или противоположной ориентации своего или чужого промотор/энхансера вирусного вектора, поскольку мРНК, кодирующая функциональный индикаторный ген, получена, как оказалось, для любой ориентации. Нефункциональному индикаторному гену и его пермутированной кодирующей области сообщали функциональность с помощью действия одного или нескольких продуктов сегмента, производимого пациентом. Во втором примере нефункционального индикаторного гена с пермутированной кодирующей областью для случая Ηΐν, 5'-кодирующую область индикаторного гена помещали с ассоциированным промотором в 3'-ЬТВ ОЗ-области, а 3'-кодирующую область индикаторного гена - в верхний участок Ηΐν-генома, с кодирующей областью каждой, обладающей той же транскрипционной ориентацией, что и вирусные ЬТК. В обоих примерах 5'- и 3'-кодирующие области могут также обладать ассоциированным донорными и акцепторными последовательностями сплайсинга, которые могут быть гетерологичными или синтетическими сигналами сплайсинга. Данный индикаторный ген не может быть функционально транскрибирован под ассоциированным промотором или под вирусными промоторами, так как пермутированная кодирующая область предотвращает образование функционально сплайсируемых транскриптов. Нефункциональный индикаторный ген в резистентном тест-векторе преобразовывали в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы при заражении клеток-мишеней, что происходило из-за перестановки 5'- и 3'-кодирующих областей индикаторного гена относительно друг друга, путем репликации 3'-ЬТЕ в 5'-ЬТВ. После транскрипции с помощью промотора, ассоциированного с 5'-кодирующей областью, РНК-сплайсинг может соединить 5'- и 3'-кодирующие области с образованием продукта функционального индикаторного гена. В одном из примеров нефункциональный индикаторный ген с пермутированной кодирующей областью в случае ΗΒν 3'-кодирующую область индикаторного гена, помещали выше 5' энхансер-промотора и 5'-кодирующей области индикаторного гена, вме
-22005426 сте или по отдельности. Направление транскрипции 5'- и 3'-кодирующих областей индикаторного гена идентично относительно друг друга и является тем же, что и у индикаторного гена вирусного вектора. Поскольку, однако, 5'- и 3'-кодирующие области индикаторного гена пермутированы в резистентном тест-векторе (т.е. 5'-кодирующая область находится ниже 3'-кодирующей области), мРНК, которая может быть сплайсирована с образованием кодирующей области функционального индикаторного гена, не транскрибируется. После обратной транскрипции и образования кольцевой молекулы индикаторного гена вирусного вектора, 3'-кодирующая область индикаторного гена располагается ниже 3'- и 5'кодирующих областей к энхансер-промотору, что позволяет осуществляться транскрипции мРНК, которая может сплайсироваться с образованием кодирующей области функционального индикаторного гена.
3. Инвертированный интрон.
В третьем варианте осуществления настоящего изобретения индикаторному гену придавали функциональность, благодаря использованию инвертированного интрона, например, интрон инсерцировали в кодирующую последовательность индикаторного гена с направлением транскрипции, противоположным направлению транскрипции индикаторного гена. Общее направление транскрипции кассеты индикаторного гена, включая свой собственный, присоединямый промотор, является противоположным направлению транскрипции вирусных контрольных элементов, тогда как ориентация искусственного интрона та же, что и у вирусных контрольных элементов. Транскрипция индикаторного гена под своим собственным присоединенным промотором не приводит к образованию функциональных транскриптов, поскольку инвертированный интрон не может быть быть сплайсирован в этой ориентации. Транскрипция индикаторного гена под вирусными контрольными элементами приводит, однако, к удалению инвертированного интрона, благодаря РНК-сплайсингу, хотя индикаторный ген все еще функционально не экспрессирован, поскольку итоговый транскрипт обладает антисмысловой ориентацией. После обратной транскрипции этого транскрипта и интеграции полученной ретровирусной ДНК или образования кольцевой молекулы ДНК гепаднавируса индикаторный ген можно функционально транскрибировать с использованием своего собственного присоединенного промотора, поскольку ранее был удален инвертированный интрон. В данном случае индикаторный ген сам может содержать свой собственный функциональный промотор с полной единицей транскрипции, противоположно ориентированной к вирусным контрольным элементам. Поэтому нефункциональный индикаторный ген находится в неверной ориентации, чтобы быть транскрибированным под вирусными контрольными элементами, и он не может быть функционально транскрибирован под своим собственным промотором, поскольку инвертированный интрон не может быть надлежащим образом вырезан путем сплайсирования. Однако, что касается ретровируса и, особенно, Ηΐν и гепаднавируса, и, особенно, ΗΒν, транскрипция под вирусными промоторами (ΈΤΗ Ηΐν или энхансер-промотор ΗΒν) приводит к удалению инвертированного интрона путем сплайсинга. Вследствие обратной транскрипции результирующего сплайсируемого транскрипта и интеграции результирующего провируса в хромосому хозяйской клетки или образования кольцевой молекулы ΗΒνвектора, теперь индикаторный ген может транскрибироваться под своим собственным промотором. Инвертированный интрон, состоящий из донорного и акцепторного сайта сплайсинга для удаления интрона, локализуются предпочтительно в кодирующей области индикаторного гена, чтобы нарушить трансляцию индикаторного гена. Донорный и акцепторный сплайсинг может представлять собой любой сплайсинг донора и акцептора. Предпочтительным донор-рецепторным сплайсингом является донорный сплайсинг ΐΕ СМV и акцепторный сплайсинг второго экзона человеческого гена альфа-глобулина (интрон А).
Индикаторный ген вирусного вектора. Конструирование
Используемый здесь индикаторный ген вирусного вектора относится к вектору(ам), включающему индикаторный ген и его контрольные элементы и один или несколько вирусных генов. Индикаторный ген вирусного вектора собирали из кассеты индикаторного гена и указанного выше вирусного вектора. Индикаторный ген вирусного вектора может дополнительно включать энхансер, сигналы сплайсирования, последовательности полиаденилирования, терминаторы транскрипции или другие регуляторные последовательности. Сверх того, индикаторный ген вирусного вектора может быть функциональным или нефункциональным. Оказалось, что вирусные сегменты, которые являются мишенью противовирусного лекарственного препарата, не включены в индикаторный ген вирусного вектора, потому что они созданы во втором векторе. Кассета индикаторного гена включает индикаторный ген и контрольные элементы. Вирусный вектор относится к вектору, включающему некоторые или все следующие: вирусные гены, кодирующие генный продукт, контрольные последовательности, вирусные упаковывающие последовательности, и, что касается ретровируса, интегрирующие последовательности. Вирусный вектор может дополнительно включать один или несколько вирусных сегментов, из которых один или несколько могут быть мишенью противовирусного лекарственного препарата. Два примера вирусного вектора, который содержит вирусные гены, относятся к рассматриваемому здесь геномному вирусному вектору и субгеномному вирусному вектору. Геномный вирусный вектор представляет собой вектор, который может включать делецию одного или нескольких вирусных генов для придания вирусной репликации некомпетентности, но который иным образом предохраняет экспрессию мРНК и характеристики процессирования полного вируса. В первом варианте осуществления настоящего изобретения Ηΐν-теста на лекар
-23005426 ственную чувствительность и устойчивость геномный вирусный вектор включает гены дад-ро1, νίί, ург, 1а1. геу, ури и пеГ (некоторые, большинство или все епу могут быть делегированы). Субгеномный вирусный вектор относится к вектору, включающему кодирующую область одного или нескольких вирусных генов, которые могут кодировать белки, которые представляют собой мишень(и) противовирусного лекарственного препарата. Что касается Ηΐν, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является субгеномный вирусный вектор, включающий ген дад-ро1 Ηΐν. Что касается ΗΒν, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является субгеномный вирусный вектор, включающий ген Р ΗΒν. Что касается Ηΐν, двумя примерами провирусных клонов, используемых для конструкции вирусного вектора, являются НХВ2 (Р1ксЬег с соавт., (1986) МНиге, 320, 367-371) и ΝΕ4-3, (ЛбасЫ с соавт., (1986) ί. У1го1., 59, 284-291). Что касается ΗΒν, охарактеризовано большое количество полных геномных последовательностей, которые могли бы использоваться для конструирования вирусных векторов ΗΒν: СепБапк №к. М54923, М38636, 102203 и Х59795. Вирусные кодирующие гены могут находиться под контролем своего энхансер/промотора или чужого вирусного или клеточного энхансер/промотора. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения для Ηΐν-теста на лекарственную чувствительность и устойчивость заключается в размещении геномных и субгеномных вирусных кодирующих областей под контролем своего энхансер/промотора из И3-области Ηΐν-ЬТК или быстродействующего раннего (ΐΕ) энхансер/промотора. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения для ΗΒν-теста на чувствительность и устойчивость заключается в размещении геномных и субгеномных вирусных кодирующих областей под контролем быстродействующего раннего (ΐΕ) энхансер/промотора СМν. Что касается индикаторного гена вирусного вектора, который содержит один или несколько вирусных генов, которые являются мишенями или кодируют белки, которые являются мишенями противовирусного лекарственного препарата(ов), кроме того, указанный вектор содержит сайты акцепторной последовательности пациента. Сегменты, производимые пациентом, инсерцировали в акцепторный сайт последовательности пациента в вирусный вектор, с индикаторным геном, который затем рассматривали в качестве резистентного тест-вектора, как описано выше. Акцепторные сайты последовательности пациента представляют собой сайты в векторе для инсерции сегментов, производимых пациентом, и указанные сайты могут быть 1) уникальными свитами рестрикции, интродуцируемыми путем свит-направленного мутагенеза в вектор; 2) естественно встречаемыми в векторе уникальными сайтами рестрикции; или 3) отобранными сайтами, в которые можно инсерцировать сегмент, производимый пациентом, с использованием альтернативных методов клонирования (например, ЬЭСклонирование). В одном из примеров осуществления настоящего изобретения акцепторный сайт последовательности пациента интродуцировали в индикаторный ген вирусного вектора. Акцепторные сайты последовательности пациента предпочтительно локализовали в пределах или вблизи кодирующей области вирусного белка, который представляет собой мишень противовирусного лекарственного препарата. Вирусные последовательности, используемые для интродукции акцепторных сайтов последовательности пациента, предпочтительно выбранные так, чтобы не изменять или изменять незначительно, переводили в аминокислотную кодирующую последовательность, обнаруживаемую в той же позиции. Предпочтительно акцепторные сайты последовательности пациента локализовали в пределах относительно консервативной области вирусного генома, чтобы облегчить интродукцию сегментов, производимых пациентом. Альтернативно, акцепторные сайты последовательности пациента локализовали между функционально важными генами или регуляторными последовательностями. Акцепторные сайты, производимые пациентом, могут быть локализованы в вирусном геноме или вблизи областей вирусного генома, которые являются относительно консервативными, чтобы позволить праймировать праймеру, используемому для введения корреспондирующего сайта рестрикции в сегмент, производимый пациентом. В дальнейшем, для улучшения представительства сегментов, производимых пациентом, такие праймеры можно создавать в качестве вырожденных пулов для обеспечения гетерогенности вирусной последовательности или можно вставить остатки, такие как дезоксиинозин (ΐ), который обладает способностью к множественному спариванию. Наборы резистентных тест-векторов, обладающих акцепторными свитами последовательности пациента, которые определяют одни и те же или перекрывающиеся сайт-рестрикционные интервалы, могут использоваться вместе в тестах на лекарственную чувствительность или устойчивость для создания репрезентативных сегментов, производимых пациентом, которые содержат внутренние сайты рестрикции, идентичные данному акцепторному сайту последовательности пациента, и поэтому недостаточно представлены в любом единственном резистентном тест-векторе.
Хозяйские клетки
Резистентный тест-вектор интродуцировали в хозяйскую клетку. Подходящими хозяйскими клетками являются клетки млекопитающих. Предпочтительные хозяйские клетки получали из человеческих тканей и клеток, которые, в принципе, являются мишенями вирусной инфекции. Что касается Ηΐν, они включают человеческие клетки, такие как человеческие Т-клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангерганса, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и другие клетки. Что касается ΗΒν, подходящие хозяйские клетки включают клеточные линии гепатомы ЩерС2, Η нН 7), первичные человеческие гепатоциты, клетки млекопитающих, которые могут быть заражены псевдотипированным ΗΒν, и другие клетки. Хозяйские клетки, производимые человеком, гарантируют,
-24005426 что противовирусный лекарственный препарат будет входить в клетку эффективно и будет преобразовываться с помощью ферментативного аппарата клетки в метаболически важную форму противовирусного ингибитора. Хозяйские клетки рассматриваются здесь в качестве упаковывающих хозяйских клеток, хозяйских клеток с резистентным тест-вектором. Упаковывающие хозяйские клетки относятся к хозяйским клеткам, которые создают трансдействующие факторы и вирусные упаковывающие белки, необходимые для репликации используемых здесь дефектных вирусных векторов, таких как резистентные тест-векторы, для получения резистентных тест-векторных вирусных частиц. Упаковывающие белки могут быть созданы с помощью экспрессии вирусных генов, содержащихся в самом резистентном тествекторе, в упаковывающем экспрессионном векторе(ах) или их обоих. Упаковывающие хозяйские клетки представляют собой хозяйскую клетку, которую трансфицировали одним или несколькими упаковывающими экспрессионными векторами, или которую трансфицировали резистентным тест-вектором, которая затем рассматривается здесь в качестве хозяйской клетки с резистентным тест-вектором или иногда рассматривается в качестве упаковывающей хозяйской клетки/хозяйской клетки с резистентным тест-вектором. Предпочтительные хозяйские клетки для использования в качестве упаковывающих хозяйских клеток для Ηΐν включают 293-эмбриональные почечные клетки человека (293, Сгайат, Р.Ь. с соавт., 1. Сеп νΐΐΌ1. 36: 59, 1977), ВО8С23 (Реаг с соавт., Ргос. Αсаб. 8ск 90, 8392, 1993), клеточные линии 1ка54 и 1ка201 (Ηе^ηζе1 с соавт., 1. νπΌ1. 62, 3738, 1988), №ρΟ2 ΗΒν (Са11е и 6^1111131111 Ь. Αγζ^μ.-Εογ^^ Огцд Век. (1990) 40, 1380-1382). (Ηι.ι1ι, Иеба, К с соавт., Уйо1оду (1989) 169, 213-216). Хозяйские клетки-мишени относятся к клетке, инфицированной тест-векторными вирусными частицами, продуцируемыми хозяйской клеткой с резистентным тест-вектором, в которой имеют место экспрессия или ингибирование индикаторного гена. Предпочтительные хозяйские клетки для использования в качестве хозяйских клеток-мишеней включают человеческие Т-клеточные лейкозные клеточные линии, в том числе .Пика! (АТСС ΤΙΒ-152), Η9 (АТСС НТВ-176), СЕМ (АТСС ССЬ-119), ΗυΤ78 (АТСС Т1В-161) и их производные.
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость настоящего изобретения могут быть осуществлены в одной или нескольких хозяйских клетках. Вирусную лекарственную чувствительность определяли как концентрацию противовирусного агента, при которой ингибируется данный процент экспрессии индикаторного гена (например, Ιί.'50 для противовирусного агента представляет собой концентрацию, при которой ингибируется 50% экспрессии индикаторного гена). Стандартную кривую лекарственной чувствительности данного противовирусного лекарственного препарата можно построить для вирусного сегмента, который представляет собой либо стандартный лабораторный вирусный сегмент, либо сегмент от пациента, не подвергавшийся лекарственному воздействию (т.е. пациент, который не получал противовирусного лекарственного препарата) с использованием способа настоящего изобретения. Соответственно вирусная лекарственная устойчивость ослабляется до вирусной лекарственной чувствительности для данного пациента либо при сравнении лекарственной чувствительности с таким данным стандартом, либо при осуществлении последовательного измерения у одного и того же пациента много раз, которая определяется путем увеличиваемого ингибирования экспрессии индикаторного гена (т.е. ослабления экспрессии индикаторного гена).
Для первого типа теста на лекарственную чувствительность и устойчивость, вирусные частицы с резистентным тест-вектором получали с помощью первой хозяйской клетки (хозяйская клетка с тествектором), которую получали с помощью трансфицирующей упаковывающей хозяйской клетки с резистентным тест-вектором и упаковывающим экспрессионным вектором(ами). Вирусные частицы с резистентным тест-вектором использовали затем для заражения второй хозяйской клетки (хозяйская клеткамишень), в которой измеряли экспрессию индикаторного гена. Такие две клеточные системы, включающие упаковывающую хозяйскую клетку, которую трансфицировали резистентным тест-вектором, которую впоследствии рассматривали в качестве хозяйской клетки с резистентным тест-вектором, и клеткумишень использовали в отношении любого индикаторного гена, функционального или нефункционального. Функциональные индикаторные гены эффективно экспрессируются при трансфекции упаковывающей хозяйской клетки и нуждаются в инфицировании хозяйской клетки-мишени супернатантном хозяйской клетки с резистентным тест-вектором для осуществления теста настоящего изобретения.
Нефункциональные индикаторные гены с пермутированным промотором, пермутированной кодирующей областью или инвертированным интроном не экспрессируются эффективно при трансфекции, упаковывающей хозяйской клетки, и поэтому заражение хозяйской клетки-мишени можно достигнуть либо путем сокультивирования с хозяйской клеткой с резистентным тест-вектором и хозяйской клеткоймишенью, либо путем заражения хозяйской клетки-мишени с использованием супернатанта хозяйской клетки с резистентным тест-вектором. Для второго типа теста на лекарственную чувствительность и устойчивость единственная хозяйская клетка (хозяйская клетка с резистентным тест-вектором) также служила в качестве хозяйской клетки-мишени. Упаковывающие хозяйские клетки трансфицировали и получали вирусные частицы с резистентным тест-вектором, а некоторые упаковывающие клетки также становились мишенью для заражения с помощью резистентных тест-векторных частиц. Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость, использующие единственный тип хозяйской клетки, возмож
-25005426 ны с вирусными резистентными тест-векторами, включающими нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, пермутированной кодирующей областью или инвертированным интроном. Такие индикаторные гены эффективно не экспрессируют при трансфекции первой клетки, но эффективно экспрессируют только при заражении второй клетки и поэтому дают благоприятную возможность для измерения эффекта оцениваемого противовирусного агента.
Что касается теста на лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием резистентного тест-вектора, включающего функциональный индикаторный ген, то ни процесс сокультивирования, ни тест на устойчивость и чувствительность, использующий единственный тип клетки, не может применяться для заражения клеток-мишеней. Резистентный тест-вектор, включающий функциональный индикаторный ген, нуждается в двухклеточной системе с использованием отфильтрованных супернатантов из хозяйских клеток с резистентным тест-вектором для заражения хозяйской клетки-мишени.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения, что касается Н1У, тесты на резистентность, основанные на частице, осуществляли с резистентными тест-векторами, полученными из геномных вирусных векторов, т.е. рЬ6-1исРР-Н8, рС6-1исРР-У8, рЬ6-1исРР-РВ, рСС-1исРР-РВ, рЬ6-1исРС-Н8, рСС-1исРС-Н8, рЬС-1исРС-РВ, рС6-1исРС-РВ, рЬ6-1исП-Н8, рС6-1исП-Н8, рЬ6-1исП-РВ, рС6-1исП-РВ и рСС-СХСМ(Р-1исР)2-ЛЛ, которые контрансфицировали упаковывающим экспрессионным вектором рУЪ-еиу4070Л (рассматриваемого также в качестве рСХА8-4070Леиу). Альтернативно, тест на резистентность, основанный на частице, может быть осуществлен с резистентными тест-векторами, полученными из субгеномных вирусных векторов, т.е. рЬ8-1исРР-Н8, рС8-1исРР-Н8, рЬ8-1исРР-РВ, рС8-1ис-РРРВ, рЬ8-1исРС-Н8, рС8-1исРС-Н8, рЬ8-1исРС-РВ, рС8-1ис-РС-РВ, рЬ8-1исП-Н8, рС8-1исП-Н8, рЬ8-1ис11РВ и рС8-1ис-П-РВ), которые котрансфицировали упаковывающим экспрессионным вектором рУЪеиу4070А и либо рЬТК-Н1У3', либо рСМУ-Н1У3'. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, что касается Н1У, тест на резистентность, основанный не на частице, осуществляли с использованием каждого из вышеописанных резистентных тест-векторов путем трансфекции селектируемых хозяйских клеток в отсутствие упаковывающих экпрессионных векторов.
Что касается теста на чувствительность и устойчивость, основанного на частице вирусные частицы с резистентным тест-вектором получали с помощью первой хозяйской клетки (хозяйская клетка с резистентным тест-вектором), которую получали путем трансфицирования упаковывающей хозяйской клеткой с тест вектором на резистентность и упаковывающим экспрессионным вектором(ами). Вирусные частицы с резистентным тест-вектором использовали затем для заражения второй хозяйской клетки (хозяйская клетка-мишень), в которой измеряли экспрессию индикаторного гена. Для второго типа теста на чувствительность и устойчивость, основанного на частице, и единственный тип хозяйской клетки (хозяйская клетка с резистентным тест-вектором) служил обоим целям: трансфицировали некоторые упаковывающие хозяйские клетки в данной культуре и получали вирусные частицы с резистентным тествектором, а некоторые хозяйские клетки в одной и той же культуре являются мишенью заражения с помощью частиц с резистентным тест-вектором, полученных таким образом. Тесты на резистентность, использующие единственный тип хозяйской клетки, возможны с резистентными тест-векторами, включающими нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, с такими индикаторными генами, эффективно экспрессируемыми при инфекции пермиссивной хозяйской клетки, они эффективно не экспрессируют при трансфекции одного и того же типа хозяйской клетки и поэтому создают благоприятную возможность для измерения оценки эффекта противовирусного агента. По аналогичным причинам тесты на устойчивость, использующие два типа клеток, могут быть осуществлены путем сокультивирования двух типов клеток в качестве альтернативы заражения второго типа клетки вирусными частицами, получаемыми из супернатантов первого типа клеток.
Что касается теста на чувствительность и устойчивость, не основанного на частице, тесты на устойчивость осуществляли путем трансфекции единственной хозяйской клетки с резистентным тествектором в отсутствие упаковывающих экспрессионных векторов. Тесты на устойчивость, не основанные на частице, осуществляли с использованием резистентных тест-векторов, включающих нефункциональные индикаторные гены с любыми пермутированными промоторами, пермутированными кодирующими областями или инвертированными интронами. Эти тесты на устойчивость, не основанные на частице, осуществляли путем трансфекции единственной хозяйской клетки с каждым резистентным тествектором в отсутствие упаковывающих экспрессионных векторов. Хотя нефункциональные индикаторные гены, содержащиеся в этих резистентных тест-векторах, эффективно не экспрессируются при трансфекции хозяйских клеток, отмечается детектируемая экспрессия индикаторного гена, происходящая от обратной транскрипции, не основанной на вирусной частице. Обратная транскрипция и перенос цепи заканчиваются преобразованием пермутированного, нефункционального индикаторного гена в не перкутированный функциональный индикаторный ген. Поскольку обратная транскрипция полностью зависит от экспрессии гена ро1, содержащегося в каждом резистентном тест-векторе, противовирусные агенты можно тестировать на их способность ингибировать продукты гена ро1, кодируемые в сегментах, производимых пациентом, содержащихся в резистентных тест-векторах. Что касается Н1У, обратная транскрипция и перенос цепи заканчивается преобразованием нефункционального индикаторного гена в функциональный индикаторный ген. Поскольку обратная транскрипция полностью зависит от экспрес
-26005426 сии сегмента, производимого пациентом, содержащегося в каждом резистентном тест-векторе, противовирусные агенты можно тестировать по их способности ингибировать продукты данного гена, кодируемого в сегментах, производимых пациентом, содержащихся в резистентных тест-векторах.
Упаковывающие хозяйские клетки трансфицировали резистентным тест-вектором и соответствующим упаковывающим экспрессионным вектором(ами), чтобы получить хозяйские клетки с резистентным тест-вектором. Индивидуальные противовирусные агенты, в том числе ингибиторы обратной транскриптазы ΛΖΤ. бб1, ббС, б4Т и 3ТС и протеазные ингибиторы саквинавир, ритонавир и индинавир, а также их сочетания, добавляли в индивидуальные чашки с упаковывающими хозяйскими клетками во время их трансфекции в ряду соответствующих концентраций. Через 24-48 ч после трансфекции, хозяйские клетки-мишени инфицировали путем сокультивирования с хозяйскими клетками с резистентным тествектором или с вирусными частицами с резистентным тест-вектором, полученными из отфильтрованных супернатантов хозяйских клеток с резистентным тест-вектором. Каждый противовирусный агент или их сочетание добавляли к хозяйским клеткам-мишеням перед или во время заражения до получения одной и той же конечной концентрации данного агента или агентов, наличествующих в течение трансфекции.
Определение экспрессии или ингибирования индикаторного гена в хозяйских клетках-мишенях, инфицированных сокультивированием или фильтрованными вирусными супернатантами, осуществляли путем анализа экспрессии индикаторного гена, например, в отношении индикаторного гена, который представляет собой ген 1ис жука-светляка, путем измерения активности люциферазы. Снижение активности люциферазы наблюдали для хозяйских клеток-мишеней, инфицированных данным препаратом вирусных частиц с резистентным тест-вектором в присутствии данного противовирусного агента или агентов, по сравнению с контролем, выполняемом в отсутствие противовирусного агента, в основном связанного с 1од-концентрацией противовирусного агента в виде сигмоидальной кривой. Эту кривую ингибирования использовали для вычисления истинной ингибирующей концентрации (1С) этого агента или сочетание агентов, действующих на продукт вируса-мишени, кодируют в сегментах, производимых пациентом, присутствующих в резистентном тест-векторе.
Что касается теста на чувствительность и устойчивость для одной клетки, то хозяйские клетки трансфицировали резистентным тест-вектором и соответствующим упаковывающим экспрессионным вектором(ами), чтобы получить хозяйские клетки с резистентным тест-вектором. Индивидуальные противовирусные агенты или их сочетания вносили в чашки с трансфицируемыми клетками во время их трансфекции, в ряду соответствующих концентраций. Через 24-72 ч после трансфекции клетки собирали и анализировали на активность люциферазы жука-светляка. Поскольку трансфицированные клетки в культуре эффективно не экспрессируют индикаторный ген, трансфицированные клетки в культуре, как и суперинфицированные клетки в культуре, могут служить в качестве хозяйских клеток-мишеней для экспрессии индикаторного гена. Снижение люциферазной активности, наблюдаемое для клеток, трансфицированных в присутствии данного противовирусного агента или агентов, в сравнении с контролем, выполняемом в отсутствие противовирусного агента(ов), в основном относится к 1од-концентрации противовирусного агента в виде сигмоидальной кривой. Эту кривую ингибирования использовали для вычисления истинной ингибирующей концентрации (1С) агента, или сочетания агентов, для продукта вирусамишени, кодируемого в сегментах, производимых пациентом, присутствующих в резистентном тествекторе.
Кандидаты в противовирусные лекарственные препараты/лекарственные препараты
Противовирусные лекарственные препараты, которые вносили в тест-систему, добавляли в определенные моменты в зависимости от мишени для противовирусного препарата. Например, в отношении Н1У-протеазных ингибиторов, включающих саквинавир, ритонавир, индинавир и нелфинавир, их добавляли в индивидуальные чашки с упаковывающими хозяйскими клетками во время их трансфекции резистентным тест-вектором. Н1У-протеазные ингибиторы добавляли также к хозяйским клеткам-мишеням во время инфицирования для получения той же конечной концентрации, что и при добавлении в течение трансфекции. Н1У-ингибиторы обратной транскриптазы, включающие ΛΖΤ, бб1, ббС, б4Т, 3ТС и неварипин, вносили в индивидуальные планшеты с хозяйскими клетками-мишенями во время инфицирования с помощью вирусных частиц с резистентным тест-вектором в испытуемой концентрации. Альтернативно, противовирусные лекарственные препараты могут присутствовать на протяжении анализа. Испытуемую концентрацию выбирали из ряда концентраций, которые обычно находятся между около 0,1 нМ и около 100 М и более точно для каждого из следующих лекарственных препаратов: ΛΖΤ от около 1 нМ до около 5 М; бб1 от около 1 нМ до около 25 М; 3ТС от около 1 нМ до около 50 М; б4Т от около 1 нМ до около 25 М и неварипина от около 1 нМ до около 100 М.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение тестировали в опыте настоящего изобретения на лекарственную чувствительность и устойчивость. Противовирусное соединение-кандидат добавляли к тест-системе в соответствующей концентрации в определенные моменты в зависимости от белка-мишени противовирусного кандидата. Альтернативно, можно протестировать более чем одно противовирусное соединение-кандидат или можно протестировать противовирусное соединение-кандидат в сочетании с утвержденным противовирусным лекарственным препаратом, таким как АΖΤ, бб1, ббС, б4Т, 3ТС, саквинавир или соединение, которое подвергали клиническим испытанием, та
-27005426 кое как ритонавир или индиновир. Эффективность противовирусного кандидата оценивали путем измерения экспрессии или ингибирования индикаторного гена. В другом аспекте этого варианта осуществления настоящего изобретения тест на лекарственную чувствительность и устойчивость можно использовать для скринирования вирусных мутантов. После идентификации устойчивых мутантов к любому известному противовирусу или кандидату в противовирусы, устойчивые мутанты выделяли и анализировали их ДНК. Можно собрать, таким образом, библиотеку устойчивых мутантов, облегчающую скринирование кандидатов в противовирусы, поодиночке или в сочетании. Рядовому специалисту в данной области это поможет идентифицировать эффективные противовирусы и создать эффективные терапевтические режимы.
Общие материалы и методы
Большинство методик, используемых для конструирования векторов и трансфектных, и зараженных клеток, широко практикуются в данной области, и большинство практиков хорошо знакомы со стандартными материальными средствами, которые описывают специальные условия и методики. Однако для удобства нижеследующие параграфы могут служить в качестве ориентира.
Плазмиды и векторы обозначили с помощью строчной буквы р с последующими буквами и/или числами. Исходные плазмиды представляют собой здесь любые коммерчески доступные, доступные всем без ограничений или могут быть сконструированы из доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. Кроме того, плазмиды, эквивалентные описанным, известны в данной области и знакомы рядовым младшим специалистам.
Для конструкции векторов настоящего изобретения использовали методики стандартного лигирования и рестрикции, хорошо известные в данной области (см. Аи5иЬе1 с соавт., (1987) Сиггеп! РгоЮсой ίη Мо1еси1аг Вю1оду, \Убеу - ЮТегааепсе ог ΜαηίαΙίδ с соавт., (1992) в Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаШгу, Ν.Υ.). Выделяемые плазмиды, последовательности ДНК или синтезированные олигонуклеотиды очищали, метили и классифицировали в желаемой форме. Последовательности из всех ДНК-конструктов, включающих синтетическую ДНК, подтверждали анализом секвенирования ДНК (8апдег с соавт., (1977) Ргос. №И. Асаб. 8ск 74, 5463-5467).
Гидролитическое расщепление ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК ферментом рестрикции, который действует только на некоторые последовательности, сайты рестрикции в ДНК. Различные ферменты рестрикции, используемые здесь, коммерчески доступны, и условия их реакции, кофакторы и другие требования известны рядовым младшим специалистам. Для аналитических целей, обычно, использовали 1 г плазмиды или ДНК-фрагмента с около 2 единицами фермента в около 20 л буферного раствора. Альтернативно, использовали избыток рестрикционного фермента, чтобы гарантировать полное гидролитическое расщепление ДНК-субстрата. Подходящее для обработки время инкубации составляет от около 1 до 2 ч при около 37°С, хотя допустимы вариации. После каждой инкубации белок удаляли путем экстракции смесью фенол/хлороформ, и возможной последующей эфирной экстракцией, а полученную нуклеиновую кислоту извлекали из водных фракций путем осаждения этанолом. При необходимости разделение по размеру расщепленных фрагментов можно осуществлять электрофорезом в полиакриламидном геле или агарозном геле с использованием стандартных методик. Общее описание разделения по размеру находится в МеШобк о£ Епхуто1оду 65:499-560 (1980).
Рестрикционно расщепленные фрагменты могут быть затуплены по концам путем обработки большим фрагментом ДНК-полимеразы Ι (Клёнов) Е.Сой в присутствии четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (б№ТР) в периоды инкубации от около 15 до 25 мин при 20°С в 50 мМ Трис (рН 7,6) 50 мМ №С1, 6 мМ МдС12, 6 мМ ЭТТ и 5-10 мМ бЭТР. Фрагмент Кленова достраивает 5'-липкие концы, но уничтожает выступающие 3'-одиночные цепи, даже в присутствии четырех бNТΡ. При желании можно осуществить селективную репарацию путем снабжения лишь одного из б№ТР или с выбранными бNТΡ в ограниченных рамках, диктуемых природой липких концов. После обработки фрагментом Кленова, полученную смесь экстрагировали смесью фенол/хлороформ и осаждали этанолом. В соответствующих условиях обрабатывали нуклеазой 81 или Ва1-31, подвергая гидролизу любую одноцепочечную часть.
Лигирования осуществляли в объемах 15-50 л при следующих стандартных условиях и температурах: 20 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 10 мМ МдС12, 10 мМ ЭТТ, 33 мг/мл В8А, 10 мМ-50 мМ №1С1 и либо 40 мМ АТР, 0,01-0,02 (\Уе155) единиц ДНК-лигазы Т4 при 0°С (для лигирования липкого конца), либо 1 мМ АТР, 0,3-0,6 (\Уе155) единиц ДНК-лигазы Т4 при 14°С (для лигирования тупого конца). Межмолекулярные лигирования липкого конца обычно осуществляют при концентрациях 33-100 г/мл общей ДНК (5-100 мМ общая конечная концентрация). Межмолекулярные лигирования тупого конца (обычно использующие 10-30-кратный молярный избыток линкеров) осуществляют при 1 мМ общей конечной концентрации.
Временная экспрессия относится к неамплифицируемой экспрессии в пределах от одного дня до двух недель трансфекции. Оптимальное время для временной экспрессии отдельного требуемого гетерологичного белка может варьировать в зависимости от нескольких факторов, включающих, например, любые трансдействующие факторы, которые можно использовать, трансляционные контрольные механизмы и хозяйскую клетку. Временная экспрессия случается, когда отдельная плазмида, которая осуществляла трансфекционные функции, т. е. транскрибируется и транслируется. В течение этого времени
-28005426 плазмидная ДНК, которая проникла в клетку, перемещается в ядро. Данная ДНК, находящаяся в неинтегрированном состоянии, свободна в рамках данного ядра. Транскрипция данной плазмиды, поглощенной данной клеткой, происходит в течение этого периода. После трансфекции плазмидная ДНК может становится деградированной или разбавленной вследствие клеточного деления. В клеточном хроматине происходит и случайная интеграция.
Обычно, векторы, содержащие промоторы и контрольные последовательности, которые получены от видов совместимых с хозяйской клеткой, использовали в отдельной хозяйской клетке. Промоторы, подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, иллюстративно включают беталактамазную и лактозную промоторные системы, промоторную систему щелочной фосфатазы, триптофана (1гр) и гибридные промоторы, такой как 1ас-промотор. Однако подходят и другие функциональные бактериальные промоторы. Кроме прокариот, могут использоваться микробы-эукариоты, такие как дрожжевые культуры. 8асс11аготусез ссгсуыас или обычные хлебопекарные дрожжи представляют собой наиболее обычный эукариотический микроорганизм, хотя всегда доступен и ряд других штаммов. Промоторы, контролирующие транскрипцию из векторов в хозяйских клетках млекопитающих, могут быть получены из разных источников, например из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, обезьяний вирус 40 (8У40), аденовирус, вирус гепатита В и предпочтительно цитомегаловирус, или из гетерологичных промоторов млекопитающих, например Ь-актинового промотора. Удобны ранний и поздний промоторы вируса 8У40, получаемые в виде 8У40-рестрикционного фрагмента, который также содержит вирусный 8У40-ориджин репликации. Предранний промотор цитомегаловируса человека удобно получать в виде Е-рестрикционного фрагмента НтбШ. Разумеется, промоторы хозяйской клетки или близких видов также используются здесь.
Используемые здесь векторы могут содержать селективный ген, именуемый также селективный маркер. Селективный ген кодирует белок, необходимый для выживаемости или роста хозяйской клетки, трансформируемой вектором.
Примеры подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих включают ген дигидрофолатредуктазы, ген орнитиндекарбоксилазы, множественный ген лекарственной устойчивости (тбг), ген аденозиндезаминазы и ген глутаминсинтазы. Когда такие селективные маркеры успешно переносят в хозяйскую клетку млекопитающего, трансформируемая хозяйская клетка млекопитающего может выживать при помещении под селективный пресс. Существуют две широко используемые отличающиеся категории селективных режимов. Первая категория основывается на метаболизме клетки и использует мутантную клеточную линию, которая утратила способность к росту независимо от дополнительной среды. Вторая категория отнесена к доминантной селекции, которая относится к схеме селекции, используемой для любого типа клетки и не требует применения мутантной клеточной линии. В этих схемах обычно используется лекарственное средство для задержки роста хозяйской клетки. Те клетки, которые обладают новым геном, будут экспрессировать белок, сообщающий лекарственную устойчивость, и будут выживать при селекции. Примерами такой доминантной селекции является использование лекарственного препарата неомицина (8ои1йегп апб Вегд (1982) 1. Уо1ес. Арр! Сепе!. 1, 327), микофеноловой кислоты (МиШдап апб Вегд (1980) 8с1епсе 209, 1422), или гигромицина (8идбеп с соавт., (1985) Мо1. Се11. В1о1. 5, 410-413). В трех примерах, приведенных выше, используют бактериальные гены под эукариотическим контролем для сообщения устойчивости, присущей, соответственно, лекарственному средству неомицину (С418 или гентицин), хдр! (микофеноловая кислота) или гигромицину.
Трансфекция означает введение ДНК в хозяйскую клетку таким образом, чтобы данная ДНК экспрессировалась независимо от того, экспрессируется ли она функционально или иначе; данная ДНК может также реплицироваться либо в качестве внехромосомного элемента, либо путем хромосомного слияния. Если не оговорено особо, метод, используемый здесь для трансформации хозяйской клетки, представляет собой кальций-фосфатный метод Сгайат и уап бег ЕЬ (1973) У1го1оду 52, 456-457. Альтернативными методами трансфекции являются электропорация, ΌΕΑΕ-декстрановый метод, липофекция и биологическая бомбардировка (КпеДег (1990) Сепе ТгапзГег апб Ехргеззюп: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 81оскЮп Ргезз).
Хозяйские клетки могут быть трансфицированы экспрессионными векторами настоящего изобретения и культивированы в традиционной питательной среде, модифицированной, чтобы подходила для индуцирующихся промоторов, селектирующихся трансформантов или амплифицирующихся генов. Хозяйские клетки культивировали в Е12:ЭМЕМ (С1Ьсо) 50:50 с добавлением глутамина и без антибиотиков. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное, представляют собой условия, ранее использовавшиеся для хозяйской клетки, селектируемой по экспрессии, и являются очевидными для рядовых младших специалистов.
Нижеследующие примеры лишь иллюстрируют лучший ныне известный способ для применения на практике настоящего изобретения, и не должны создавать ограничение настоящему изобретению. Все литературные ссылки точно включены путем ссылки.
-29005426
Пример 1. Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость ΗΙν с использованием резистентных тест-векторов, включающих сегмент(ы), производимый пациентом, и нефункциональный индикаторный ген А с А-пермутированным промотором.
Индикаторный ген вирусного вектора. Конструирование.
Вирусные векторы с индикаторным геном, содержащие нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, создавали с использованием геномного и субгеномного вирусных векторов ΗΙν, включающих вирусные гены, которые представляют собой мишень(и) для противовирусных лекарственных препаратов. Вирусные векторы с индикаторным геном ρΕΟ-ΙιιοΡΡ и ρΟΌ-ΙιιοΡΡ основываются на геномных вирусных векторах ρΕ6 и ΡΟΌ; каждый несет делению в гене епу ΗΙν. Резистентные тест-векторы получали из геномного индикаторного гена вирусных векторов, ρΕΟ-ΙιιοΡΡ и ρί'ΌΙιιοΡΡ, содержащие акцепторный сайт последовательности пациента для инсерции сегмента, производимого пациентом, и использовали во взаимодействии с упаковывающим экспрессионным вектором, кодирующим продукт гена епу амфотропного ΜΕν 4070Α. Вирусные векторы, с индикаторным геном, ρΕ8ΙιιοΡΡ и ρС8-1исΡΡ основаны на субгеномных векторах ρΕ8 и ρС8; каждый кодирует только ген дад-ροΐ ΗΙν. Резистентные тест-векторы получали из субгеномного индикаторного гена вирусных векторов, ρΕίΈ-ΙιιοΡΡ и ρС8-1исΡΡ, содержащих акцепторный сайт последовательности для инсерции сегмента, производимого пациентом, и использовали во взаимодействии с первым упаковывающим экспрессионным вектором, кодирующим гены νίί, νρΓ, 1аЕ гее, νρυ, пеГ, и вторым упаковывающим вектором, кодирующим продукт гена епу амфотропного ΜΕν 4070Α.
Вирусные векторы ΗΙν - геномный и субгеномный.
Вирусные векторы ΗΙν конструировали с использованием последовательностей из биологически активного провирусного клона НХВ2 (Е18Йег с соавт. (1986) №11иге 320, 367-371). Сконструировали два типа вирусного вектора: геномные вирусные векторы с делениями по единственному гену, такому как епу, но который иначе предохраняет экспрессию мРНК и характеристики процессирования полного вируса, и субгеномные вирусные векторы, которые могут включать один или несколько генов, которые представляют собой типичные специфические мишени, тестирующиеся на чувствительность и устойчивость, такой как дад-ροΐ, или которые могут утрачивать вирусные гены в совокупности. Оба типа векторов обладают уникальным сайтом рестрикции в рамках вирусного генома для инсерции кассеты индикаторного гена, а также акцепторными сайтами последовательности пациента, т.е. дополнительными уникальными сайтами рестрикции вблизи или в противовирусном мишенном гене (например, ро1), чтобы дать возможность инсерцировать последовательности, производимые пациентом. Кроме того, оба типа вектора конструировали, чтобы вставить любой свой энхансер-промотор из И3-области ΗΙν-ЕТК или чужой энхансер-промотор из предранней (ΙΕ) области СМУ. Для конструирования плазмидных ДНК использовали стандартные методы (ЛизиМ с соавт. (1987) Сиггеп! ΡΐΌΐοοοΡ ш Мо1еси1аг Βίο1ο§\·, А11еуИ'ИегЮепсе). Последовательности всех ДНК-конструктов, включающих синтетическую ДНК, подтверждали анализом секвенирования ДНК (8апдег с соавт. (1977) Ρεοα №И, Αсаά, 8с1. 74, 5463-5467).
Последовательности ΗΙν получали из плазмиды ρΒ8-ΗΙν +аде с соавт. (1990) 1. ΥιγοΙ. 64, 52705276), которая содержит провирусную ДНК-последовательность НХВ2 в рестрикционном фрагменте ΗρаI-XЬаI, инсерцированном в полилинкер ρΒΙιπ-^πρΙ К8(+) плазмидного клонирующего вектора (8!га!адепе, 8ап ^^едο, СΑ). Поскольку этот провирусный клон содержит ^охарактеризованную, фланкирующую человеческую ДНК из сайта провирусной интеграции, использовали две стадии сайтнаправленного мутагенеза для удаления таких последовательностей с использованием плазмиды ρΒ8ΗΙν в качестве матрицы. На первой стадии человеческие последовательности, примыкающие к 5'-ЬТК, удаляли с использованием олигонуклеотида 1, который содержит нижеследующие последовательности в направлении 5' к 3': 1) последовательность, комплементарную первым 18 нуклеотидам интегрированного провируса, в левой И3-области, 2) 6-нуклеотидный 8таI-сайт, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную области в ρΒΙ^^ηρΐ К8(+) сразу за полилинкером и промотором фага Т3. На второй стадии человеческие последовательности, примыкающие к 5'-ЬТК, удаляли с использованием олигонуклеотида 2, который содержит следующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную области в ρΒΙ^^ήρΐ К8(+) сразу за ΡνΗΙ-сайтом, в гене Ьас2, 2) шестинуклеотидный ХЬаЕсайт, и 3) последовательность, комплементарную последним 18 нуклеотидам интегрированного провируса, в правой И5-области. Результирующую плазмиду назвали ρΒ8-ΗΧΒ2.
Геномный и субгеномный вирусные векторы, использующие И3-область ΗΙν-ЬТК в качестве энхансер-промотора для экспрессии противовирусных мишенных генов (фиг. 1), каждый, получали из плазмиды ρΒ8-ΗΧΒ2 с помощью единственной стадии сайт-направленного мутагенеза. Геномный вирусный вектор ρΕ6, который делегировали по гену его; готовили с использованием олигонуклеотида 3, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 7626-7463 НХВ2 в гене οπν (все координаты для НХВ2 приведены по ссылке Се^аик, инвентарный номер К03455), 2) 8-нуклеотидный ΝοΐΙ-сайт, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 6384-6401 НХВ2 в гене епу Субгеномный вирусный вектор ρΕ8, который делегировали по генам еп\г, 1аЕ гем, νίί, νρΓ и νρυ, готовили с использованием олигонуклеотида 4, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную по
-30005426 следовательность, комплементарную позициям 7626-7643 НХВ2 в гене епу, 2) 8-нуклеотидный ΝοΐΙ-сайт, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 5109-5126 НХВ2 в гене ν1Γ.
Геномный и субгеномный вирусные векторы, которые используют область ΙΕ СМУ, в качестве энхансер-промотора для экспрессии противовирусных мишенных генов, получали из плазмид рБС и рЬ8 и назвали, соответственно, рСС и рС8 (фиг. 1). Геномный вирусный вектор рСС готовили в две стадии. На первой стадии промежуточную плазмиду готовили из двух ДНК-фрагментов: 1) 11,2 т.п.н. векторный фрагмент готовили из гидролитически расщепленной 8та1 плазмиды рБС и обработки вектора щелочной фосфатазой, и 2) 0,9 т.п.н. ДНК-фрагмент, содержащий энхансер-промотор ΙΕ СМУ, изготавливали путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-1 (описанной ниже) с помощью 8та1. Плазмиды, содержащие ΙΕ-область СМУ в одной и той же транскрипционной ориентации, в качестве вирусных БТК идентифицировали путем рестрикционного картирования. На второй стадии плазмиду рСС готовили из этой промежуточной плазмиды с помощью сайт-направленного мутагенеза, чтобы присоединить энхансер-промотор ΙΕ СМУ к К-области 5'-БТК в позиции, позволяющей произойти инициации транскрипции в начале К-области, с использованием олигонуклеотида 5, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 455-472 НХВ2 в начале К-области, и 2) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям от -18 до -1 в энхансер-промоторе ΙΕ СМУ (координаты приведены по ВохйаП с соавт. (1985) Се11 41, 521-530). Субгеномный вирусный вектор рС8 получали из плазмиды рСС и готовили из двух ДНК-фрагментов: 1) 9,1 т.п.н. векторную ДНК готовили путем гидролитического расщепления плазмиды рЬ8 с помощью 8та! и ί,ΊαΙ. и 2) 1.3 т.п.н. фрагмент ДНК готовили путем гидролитического расщепления плазмиды рСС с помощью 8таХ и С1аГ
Геномный индикаторный ген вирусного вектора - пермутированный промотор.
Вирусные векторы с индикаторным геном рЬС-1исРР и рСС-1исРР и резистентные тест-векторы, полученные из них, содержат нижеследующие элементы в направлении 5' к 3' (фиг. 2В): 1) И3-область ШУ-БТК (рЬС-1исРР) или энхансер-промотор ΙΕ СМУ (рСС-1исРР), 2) К-область ШУ-БТК, 3) И5область ШУ-БТК, содержащую инсерцированный Т7-промотор с направлением транскрипции, противоположным направлению транскрипции для ЬТК, 4) кодирующие области ШУ-генов дад-ро1, νίΓ, ург, 1аБ геу, ури, делегированного епу и пеГ, 5) кассету индикаторного гена, инсерцированную в делегируемый ген епу, и 6) 3'-БТК ШУ. Одну и ту же кассету индикаторного гена инсерцировали в рЬС-1исРР и рСС1исРР и содержащие нижеследующие элементы: 1) область 5'-ИТК ЕМС, которая дает разрешение на внутренний вход рибосом, 2) полную кодирующую область гена люциферазы (1ис), и 3) Т7-терминатор транскрипции. Индикаторный ген обладает направлением транскрипции, противоположным направлению транскрипции ШУ-БТК или энхансера-промотора ΙΕ СМУ, и, по этой причине не может функционально транскрибироваться под этими элементами. Индикаторный ген также не может транскрибироваться под Т7-промотором, поскольку кассета индикаторного гена расположена выше Т7-промотора. После обратной транскрипции и переноса цепи, Т7-промотор реплицировали из 5'-БТК, разрешая функциональную транскрипцию индикаторного гена из вновь созданного Т7-промотора с помощью РНКполимеразы Т7 (фиг. 2С).
Плазмиду р1исРР, которая содержит кассету индикаторного гена, готовили в три стадии. На первой стадии плазмиду рУБ-ЕМС/Т7, которая содержит кассету, фланкируемую уникальными сайтами ΝοΐΙ, включающую элемент 5'-ИТК ЕМС и Т7-терминатор транскрипции, готовили из двух ДНК-фрагментов:
1) 3,0 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ (описанной ниже) с помощью ΝοΐΙ, и обработки вектора щелочной фосфатазой, и 2) 0,8 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего 5'-ИТК ЕМС и Т7-терминатор, приготовленный с помощью РСК с использованием плазмиды рТМ1 (Мокк с соавт. (1990) №11иге 348, 91-92), в качестве матрицы, и олигонуклеотидов 6 и 7, в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью ΝοΐΙ. Олигонуклеотиды 6 и 7, каждый, включает сайт рестрикции ΝοΐΙ. На второй стадии плазмиду рУБ-1ис, которая содержит кодирующую область гена люциферазы жука-светляка, инсерцируемую в экспрессионный вектор рУБ-1 (описанный ниже) млекопитающего, готовили из двух ДНК-фрагментов: 4,1 т.п.н. вектора ДНК, приготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-1 с помощью ΝιυΙ и Вд1П, и 2) 0,7 т.п. н. ДНК-фрагмента, содержащего полную кодирующую область люциферазы, приготовленную путем РСК с использованием плазмиды рСЕМ-1ис (Рготеда, Маά^8οη. \νΙ), в качестве матрицы, и олигонуклеотидов 8 и 9, в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью ΝιυΙ и Вд1П. Олигонуклеотиды 8 и 9 включают сайты рестрикции, соответственно, ΝιυΙ и ΝοοΙ, и Вд1П и ΧΙιοΙ. На третьей стадии плазмиду р1исРР, которая содержит кодирующую область гена люциферазы, инсерцируемого между элементом 5' -ИТК ЕМС и Т7-терминатором транскрипции, готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 3,8 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-ЕМС/17 с помощью ΝΜ и 8аП, и 2) 1,7 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего полную кодирующую область люциферазы, приготовленную путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-1ис с помощью ΝΜ и ХМ.
Плазмиду рБС-1исРР готовили в две стадии. На первой стадии плазмиду рБС-Т7 готовили путем инсерцирования промотора фага Т7, расположенного выше И8-области ШУ-БТК, в плазмиду рБС путем
-31005426 сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотида 10, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 552-569 НХВ2 в И5-области, 2) 20-нуклеотидную последовательность, комплементарную Т7-промотору, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 534-551 НХВ2 И5-области. На второй стадии плазмиду ρί-Ο-ϊποΡΡ готовили из двух ДНК-фрагментов: 1) 11,2 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды ])ЬС-Т7 с помощью Νοΐΐ и обработки результирующего вектора щелочной фосфатазой, и 2) 2,5 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего кассету индикаторного гена люциферазы, приготовленную путем гидролитического расщепления плазмиды ρϊυοΡΡ с помощью Νοΐΐ. Клоны, корреспондирующие с ρΕΟ-ϊυοΡΡ, которые содержат кассету индикаторного гена, инсерцируемую в вирусный вектор в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации вирусных ЬТК, идентифицировали путем рестрикционного картирования.
Плазмиду ρί,Ό-ϊιιοΡΡ готовили в две стадии. На первой стадии плазмиду ])СС-Т7 готовили путем инсерцирования промотора фага Т7 в расположенную выше И5-область Ηΐν-ЬТК в плазмиде ])СС путем сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотида 10. На второй стадии плазмиду ρί,ΌϊιιοΡΡ готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 11,7 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды ])СС-Т7 с помощью Νοΐΐ и обработки полученного вектора щелочной фосфатазой, и 2) 2,5 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего кассету индикаторного гена люциферазы, приготовленную путем гидролитического расщепления плазмиды ρϊιιοΡΡ с помощью Νοΐΐ. Клоны, корреспондирующие с ρΟΌ-ΚιοΡΡ, которые содержат кассету индикаторного гена, инсерцируемую в вирусный вектор в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации энхансер-промотора ΐΕ СΜV и вирусных ЬТК, идентифицировали путем рестрикционного картирования.
Субгеномный индикаторный ген вирусного вектора - пермутированный промотор.
Вирусные векторы с индикаторным геном ρΕδ-ϊυοΡΡ и рСδ-ϊυсΡΡ и резистентные тест-векторы, получаемые из них, содержат нижеследующие элементы в направлении 5' к 3' (фиг. 2В): 1) И3-область ΗΐνЬТК (ρΕδ-ϊυοΡΡ) или энхансер-промотор ΐΕ СΜV (ρСδ-ϊυсΡΡ), 2) К-область Ηΐν-ЬТК, 3) И5-область Ηΐν-ЬТК, содержащую инсерцируемый Т7-промотор с транскрипционной ориентацией, противоположной ориентации ЬТК§, 4) кодирующую область гена дад-ροϊ Ηΐν, 5) кассету индикаторного гена, 6) элемент ККЬ из гена етг Ηΐν, содержащий вирусную упаковывающую последовательность, и 7) 3'-ЬТК Ηΐν. Кассета индикаторного гена ρΕδ-ϊυοΡΡ и ρСδ-ϊυсΡΡ является той же, что и в ρΕΟ-ϊυοΡΡ и ρС6ϊι,ιοΡΡ. Как и для поздних векторов, индикаторные гены ρΕδ-ϊυοΡΡ и ρСδ-ϊυсΡΡ не могут функционально транскрибироваться при обратной транскрипции и переносить цепь в результате репликации Т7промотора с 5'-ЬТК на 3'-ЬТК (фиг. 2С). Плазмиду ρΕδ-ϊυοΡΡ готовили в две стадии. На первой стадии плазмиду которая содержит промотор Т7, инсерцируемый в расположенную выше И5-область
Ηΐν-ЬТК, готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 9,1 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды ρΕδ с помощью δтаI и СЫ, и 2) 0,8 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего Ηΐν-ЬТК с К5-областью, содержащей инсерцируемый Т7-промотор, приготовленный путем гидролитического расщепления плазмиды ])ЬС-Т7 с помощью δтаΐ и СЫ. На второй стадии плазмиду ρΕδϊι,ιοΡΡ готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 9,9 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды ])ЕБ-Т7 с помощью Νοΐΐ и обработки полученного вектора щелочной фосфатазой, и 2) 2,5 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего кассету индикаторного гена люциферазы, приготовленную путем гидролитического расщепления плазмиды ρϊυοΡΡ с помощью Νοΐΐ. Клоны, корреспондирующие с ρΕδ-ϊυοΡΡ, которая содержит кассету индикаторного гена, инсерцируемую в вирусной вектор в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации вирусных ЬТК, идентифицировали путем рестрикционного картирования.
Плазмиду ρСδ-ϊυсΡΡ готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 11,6 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды ρΕδ-ϊυοΡΡ с помощью δтаI и СЫ, и 2) 1,3 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего ΐΕ-промотор СΜV, слитого с К5-областью с помощью инсерцируемого Т7-промотора, приготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды [)6:0^7 с помощью δтаI и СШ.
Резистентные тест-векторы. - Конструирование.
Резистентные тест-векторы готовили путем 1) модификации вирусных векторов с индикаторным геном ρΡβ-ϊιιοΡΡ, ρί,Ό-ϊιιοΡΡ, ρΕδ-ϊυοΡΡ и ρСδ-ϊυсΡΡ путем интродуцирования уникальных сайтов рестрикции, именуемых акцепторными сайтами, производимыми пациентом, в или рядом с геном рок 2) амплификацией сегментов, производимых пациентом, корреспондирующих с Ηΐν-протеазой и обратно транскриптазными кодирующими областями путем Ρί,'Ρ с использованием комплементарной ДНК (кДНК), приготовленной из вирусной РНК или ДНК, присутствующей в сыворотке или клетках, инфицированных пациентов, и 3) инсерцирования амплифицируемых последовательностей точно в вирусные векторы с индикаторным геном по акцепторным сайтам последовательности пациента (фиг. 2В). Два набора акцепторных сайтов последовательности пациента интродуцировали путем сайт-направленного мутагенеза в каждый из четырех вирусных векторов, с индикаторным геном. Первый набор акцепторных сайтов последовательности пациента состоит из сайта Нраΐ и сайта δа1ΐ, которые определяют промежуток, включающий кодирующую область полной протеазы и наибольшую кодирующую область обратной
-32005426 транскриптазы, возникающий в плазмидах рЬС-1исРР-Н8, рСС-1исРР-Н8 и р18-1исРР-Н8, рС8-1исРР-Н8. Второй набор акцепторных сайтов последовательности пациента состоит из сайта РуиГ и сайта ВатН1, которые определяют тот же промежуток, возникающий в плазмидах, соответственно, рЬС-1исРР-РВ, рСС-1исРР-РВ, рЬ8-1исРР-РВ и рС8-1исРР-РВ. Имеющие общее происхождение пары резистентных тествекторов, которые определяют один и тот же интервал рестрикции (например, полученные из рЬС-1исРРН8 и рЬС-1исРР-РВ), использовали вместе в некоторых тестах на устойчивость для улучшения представительства сегментов, производимых пациентом, которые содержат внутренние сайты рестрикции, идентичные данным акцепторным сайтам последовательности пациента и поэтому будут недостаточно представлены в любом отдельном резистентном тест-векторе.
Плазмиду рЬС-1исРР-Н8 готовили путем трех последовательных стадий сайт-направленного мутагенеза с использованием плазмиды рЬС-1исРР в качестве матрицы. Первые две стадии предназначены для интродуцирования двух новых сайтов рестрикции, один из которых (Нра1) относится к уникальному, и один из них (8а1Г) уже присутствует единожды в каждом вирусном векторе с индикаторным геном. Третья стадия предназначается для делегирования предсуществующего в каждом векторе сайта 8а1Г для создания интродуцируемого уникального сайта 8а1Г. На стадии 1 сайт Нра1 интродуцировали непосредственно выше зрелой кодирующей области НГУ-протеазы в позиции 2243 с использованием олигонуклеотида 11, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную позициям 2249-2266 НХВ2, 2) шестинуклеотидный сайт Нрак который оставляет последовательность дад-белка в этой позиции неизменяемой и интродуцирует консервативную аминокислотную замену (Р1е на Уа1) в предшественник ро1-последовательности, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 2225-2242 НХВ2. На стадии 2 сайт 8а1Г интродуцировали в карбоксиконцевую кодирующую область обратной транскриптазы НГУ в позиции 4190 с использованием олигонкулеотида 12, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 4196-4213 НХВ2, 2) шестинуклеотидный сайт 8а1Г, который оставляет последовательность белка обратной транскриптазы в этой позиции неизменяемой, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 4172-4189 НХВ2. На стадии 3 предсуществующей в ург-кодирующей области сайт 8а1Г в позиции 5785 НХВ2 делегируем с использованием олигонуклеотида 13, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 5791-5808 НХВ2, 2) 6нуклеотидную последовательность ССССЛС, которая удаляет сайт 8а1Г, но оставляет в этой позиции неизменяемой последовательность ург-белка, 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 5767-5784 НХВ2.
Плазмиды рСС-1ис-Н8, рЬ8-1исРР-Н8 и рС8-1исРР-Н8 получали из рЬС-1исРР-Н8 следующим образом. Плазмиду рСС-1ис-Н8 готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 12,9 т.п.н. векторную ДНК готовили путем гидролитического расщепления плазмиды рЬС-1исРР-Н8 с помощью 8таГ и С1аГ, 2) 1,3 т.п.н. фрагмент ДНК готовили путем гидролитического расщепления плазмиды рСС-1исРР с помощью 8таГ и С1аГ. Плазмиду рЬ8-1исРР-Н8 готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 11,1 т.п.н. векторную ДНК готовили путем гидролитического расщепления плазмиды рЬС-1исРР-Н8 с помощью ИйеГ и Х1юк и 2) 1,3 т.п.н. фрагмент ДНК готовили путем гидролитического расщепления плазмиды рЬ8-1исРР с помощью ИйеГ и Х1юГ Плазмиду рС8-1исРР-Н8 готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 11,6 т.п.н. векторную ДНК готовили путем гидролитического расщепления плазмиды рЬ8-1исРР-Н8 с помощью 8таГ и С1аГ, и 2) 1,3 т.п.н. фрагмент ДНК готовили путем гидролитического расщепления плазмиды рС8-1исРР с помощью 8таГ и С1аГ.
Плазмиду рЬС-1исРР-РВ готовили в четырех последовательных стадиях сайт-направленного мутагенеза с использованием плазмиды рЬС-1исРР в качестве матрицы. Первые две стадии осуществляли с целью интродуцирования двух новых сайтов рестрикции (РуиГ и ВатНГ), каждый из которых уже присутствует единожды в каждом вирусном векторе, с индикаторным геном. Третью и четвертую стадии осуществляли с целью делегирования предсуществующих в каждом векторе сайтов РуиГ и ВатНГ, чтобы создать вновь интродуцируемые уникальные сайты. На стадии 1, сайт РуиГ, интродуцировали непосредственно выше от зрелой кодирующей области НГУ-протеазы в позиции 2221 с использованием олигонуклеотида 14, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 2227-2244 НХВ2, 2) 6-нуклеотидный сайт РуиГ, который оставляет в этой позиции дад- и ро1-предшественники белковых последовательностей неизменяемыми, 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 2203-2220 НХВ2. На стадии 2 ВатНГ-сайт интродуцировали в карбоксиконцевую кодирующую область обратной транскриптазы НГУ в позиции 4212 с использованием олигонуклеотида 15, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 4218-4235 НХВ2, 2) 6-нуклеотидный сайт ВатНГ, который оставляет в этой позиции последовательность белка обратная транскриптаза неизменяемой, 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 4194-4211 НХВ2. На стадии 3 предсуществующий в Ь-лактамазной кодирующей области сайт РуиГ в позиции 2413 (ссылки на координаты от СеиВапк, инвентарный номер Х52331), делегировали с использованием олигонуклеотида 16, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1)
-33005426
18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 2395-2412 из В1ие8спр1 К8 (+), 2)
6-нуклеотидную последовательность СААТСС, которая удаляет сайт Руи1, но оставляет неизменяемой в этой позиции Ь-лактамазную белковую последовательность, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 2419-2436 из В1ие5спр1 КЗ (+). На стадии 4 предсуществующий в кодирующей области геу Ηΐν сайт ВатН1 в позиции 8474 из НХВ2, делегировали с использованием олигонуклеотида 17, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 8480-8497 НХВ2, 2) 6-нуклеотидную последовательность ССАТТС, которая удаляет сайт ВатН1, но оставляет в этой позиции последовательность белка геу Ηΐν неизменяемой, и 3) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 84568473 НХВ2.
Плазмиды рСС-1исРР-РВ, рЬ8-1исРР-РВ и рС8-1исРР-РВ получали из рЬС-1исРР-РВ следующим образом. Плазмиду рСС-1исРР-РВ готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 12,9 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды рЬС-1исРР-РВ с помощью 8та1 и С1а1, и 2)
1,3 т.п.н. фрагмента ДНК, приготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рЬ8-1исРР с помощью 8та1 и С1а1. Плазмиду рЬ8-1исРР-РВ готовили из трех фрагментов ДНК: 1) 11,1 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды рЬС-1исРР-РВ с помощью Ыбе1 и Х1ю1. и 2) 0,5 т.п.н. фрагмента ДНК, приготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рЬ8-1исРР с помощью Ыбе1 и Ηίηάΐΐΐ и 3) 0,8 т.п.н. фрагмента ДНК, приготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рЬС-1исРР-РВ с помощью Ηίηάΐΐΐ и Х1юЕ
Плазмиду рС8-1исРР-РВ готовили из двух фрагментов ДНК: 1) 11,6 т.п.н. векторной ДНК, приготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды рЬ8-1исРР-РВ с помощью 8та! и С1а!, и 2)
1,3 т.п.н. фрагмента ДНК, приготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рС8-1исРР с помощью 8таI и С1аР
Сегмент(ы), производимый пациентом, корреспондирующий с Ηΐν-протеазой и кодирующими областями обратной транскриптазы, амплифицировали методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ЯТ-РСЯ), с использованием вирусной РНК, выделенной из сыворотки Ηΐνинфицированных пациентов. Как описано, использовали два протокола ЯТ-РСЯ. В первом методе (Р1а1ак с соавт. (1993) 8с1епсе 259, 1749-1754), соответственно, для приготовления кДНК и для РСЯ-реакции использовали разные ферменты, обратную транскриптазу вируса лейкоза мышей Молони (ВРЬ, ВеИеьба, ΜΌ) и Тас.| ДНК-полимеразу (Воске Мо1еси1аг П1адпо8Йс8, Оп1агю, Сапаба). Во втором методе (Ми1бег с соавт. (1994) 1. Сйп. М1сгоЫо1. 32, 292-300), для осуществления и кДНК-синтеза и для РСЯреакции, использовали единственный фермент, ДНК-полимеразу ТНегтих 1йегторЫ1и8 (Т(П). Для амплификации сегментов, производимых пациентом, которые могут быть точно инсерцированы в вирусные векторы с индикаторным геном, содержащий акцепторные сайты пациента ^аРБаП и РуЩ/ВатШ, использовали две пары праймеров, содержащих, соответственно, олигонуклеотиды 18 и 19 и олигонуклеотиды 20 и 21.
Первый набор из четырех резистентных тест-векторов, включающий первую праймерную пару, сконструировали из нижеследующих двух ДНК-препаратов: 1) векторную ДНК готовили из плазмиды р^С-1ис-В8. рСС-ШсРР^З, рЕЗ-тсРР^З или рСЗ-ШсРР^З, гидролитически расщепленных с помощью Ира! и 8аП, и 2) 2,0 т.п.н. амплифицированный ДНК-продукт готовили в ЯТ-РСЯ с использованием вирусной РНК, выделенной из сыворотки Ηΐν-инфицированного индивидуума в качестве матрицы, и олигонуклеотидов 18 и 19 в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью Η^ι! и 8а1Р Второй набор из четырех резистентных тест-векторов, включающий вторую праймерную пару, сконструировали из нижеследующих двух ДНК-препаратов: 1) векторную ДНК готовили из плазмиды рЬС-1исРР-РВ, рСС-1исРР-РВ, рЬ8-1исРР-РВ или рС8-1исРР-РВ, гидролитически расщепляемой с помощью Руи1 и ВатШ, и 2) 2,0 т.п.н. амплифицированный ДНК-продукт готовили в ЯТ-РСЯ с использованием вирусной РНК, выделенной из сыворотки Ηΐν-инфицированного индивидуума в качестве матрицы, и олигонуклеотидов 18 и 19 в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью Руи1 и ВатШ. Олигонуклеотиды 18, 19, 20 и 21 включают, соответственно, сайты рестрикции ВраЕ 8аИ, Руи1 и ВатШ. Для гарантии того, что плазмидная ДНК, корреспондирующая с каждым из восьми полученных резистентных тест-векторов, включает репрезентативную выборку вирусных квази-видов Ηΐν, присутствующих в сыворотке данного пациента, для приготовления плазмидной ДНК использовали, как минимум, сто независимых трансформантов Е. сой, полученных для конструирования данного резистентного тест-вектора.
Чтобы улучшить репрезентативность сегментов, производимых пациентом, третий и четвертый наборы резистентных тест-векторов готовили с использованием частично вырожденных РСЯ-праймерных пулов, именуемых олигонуклеотидом 22, 23, 24 и 25, которые основываются на последовательностях олигонуклеотидов, соответственно, 18, 19, 20 и 21. Каждый праймерный пул синтезировали способом, который вставляет более чем одно нуклеотидное основание (С, А, Т или С) в каждую из 18 нуклеотидных позиций, локализованных на 3'-конце родительского праймера, который проявляет последовательные вариации у пациентов, в разных изолятах, каталогизированных в базе данных Ηΐνпоследовательности в Ьо§ А1ато§ (Муега с соавт. (1993) Витай Яе1гоу|ги5е5 апб АШ8 1993, Ьо§ А1ато§
-34005426 №1Нопа1 ЬаЬотаГоту, Ьо8 Л1ато5, ХМ). Третий набор из четырех резистентных тест-векторов конструировали с использованием векторов, приготовляемых из плазмиды рЬ6-1исРР-Н8, рС6-1исРР-Н8, рЬ8-1исРРН8 или рС8-1исРР-Н8, с амплифицируемыми последовательностями пациента, приготовленными с олигонуклеотидами 22 и 23; четвертый набор из четырех резистентных тест-векторов конструировали с использованием векторов, приготовленных из плазмиды рЬ6-1исРР-РВ, рСС-1исРР-РВ, рЬ8-1исРР-РВ или рС8-1исРР-РВ с амплифицируемыми последовательностями пациента, приготовленными с олигонуклеотидами 24 и 25. Олигонуклеотиды 22, 23, 24 и 25 включают, соответственно, Нра1, 8аИ, Руи1 и ВатН1 сайты рестрикции.
Хозяйские клетки - получение
Упаковывающие хозяйские клетки и хозяйские клетки с резистентным тест-вектором.
Резистентные тест-векторы использовали для получения хозяйских клеток с резистентным тествектором из упаковывающих хозяйских клеток, экспрессирующих вирусные упаковывающие белки. Упаковывающие белки могут быть созданы путем экспрессии вирусных генов, содержащихся в своем резистентном тест-векторе, в упаковывающем экспрессионном векторе(ах) или в обоих. Для получения упаковывающих белков может использоваться любая временная или стабильная трансфекция упаковывающей хозяйской клетки. Упаковывающий экспрессионный вектор, кодирующий амфотропный МЬУ епу-генный продукт, дает возможность продуцировать в резистентном тест-векторе хозяйской клетки резистентный тест-вектор вирусных частиц, который может эффективно заражать человеческие клеткимишени. Резистентные тест-векторы, производимые из плазмид рЬ6-1исРР-Н8, рЬ6-1исРР-РВ, рСС1исРР-Н8 и рСС-1исРР-РВ, кодируют все Н1У-гены за исключением епу, используются для получения резистентного тест-вектора хозяйских клеток. Упаковывающий экспрессионный вектор рУЬ-епу4070А, который кодирует амфотропный генный продукт епу МЬУ 4070А, использовали с предшествующими резистентными тест-векторами, основанными на геноме, чтобы дать возможность производить резистентный тест-вектор хозяйской клетки из резистентного тест-вектора вирусных частиц. Резистентные тест-векторы, производимые из плазмид рЬ8-1исРР-Н8, рЬ8-1исРР-РВ, рС8-1исРР-Н8 и рС8-1исРР-РВ, кодируют только продукты гена дад-ро1 Н1У и используются для изготовления резистентного тествектора хозяйских клеток. рУЬ-епу4070А, который создает епу, и, любой упаковывающий вектор рЬТВН1У3' или рСМУ-Н1У3', каждый из которых создает Н1У-гены уг£, ург, 1а1, геу, ури и пе£ использовали с предшествующими, основанными на субгеноме резистентными тест-векторами, чтобы облегчить образование в резистентном тест-векторе хозяйских клеток резистентного тест-вектора вирусных частиц.
Плазмиды рЬТВ-Н1У3' и рСМУ-Н1У3', каждая, произведены путем удаления наибольшей кодирующей области дад-ро1 из геномных вирусных векторов, соответственно, рЬС и рСС. Плазмиду рЬТВН1У3' получали путем сайт-направленного мутагенеза с использованием плазмиды рЬС в качестве матрицы с олигонуклеотидом 26, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 4712-4729 из НХВ2 в гене ро1, и 2) 18-нуклеотидную последовательность, комплементарную с позициями 925-942 из НХВ2 в гене дад. Плазмиду рСМУ-Н1У3' (фиг. 3С) изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) 6,8 т.п.н. векторного фрагмента, изготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рЬТВ-Н1У3' с помощью 8та1 и С1а1, и 2) 1,3 т.п.н. фрагмента ДНК, изготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рСС с помощью 8та1 и С1а1.
Плазмиду рУЬ-епу4070А (фиг. 3Ό) конструировали из двух фрагментов ДНК: 1) 4,3 т.п.н. векторного фрагмента, изготовленного путем гидролитического расщепления экспрессионного вектора млекопитающего рУЬ-2 с помощью №и1 и Вд1Ш, и 2) 2,0 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего полную кодирующую область генного продукта епу МЙУ4070А (нуклеотиды 37-2001, координаты даны по СепВапк, инвентарный номер М33469, Ой с соавт. (1990) 1. Уио1. 64, 755-766), изготовленного путем РСВ с использованием плазмиды рСВ1Ратдад-2 (Эапоз апб МиШдап (1988) Ргос. №111. Асаб. 8ск 85, 6460) в качестве матрицы с олигонуклеотидами 27 и 28 в качестве праймеров с последующим гидролитическим расщеплением с помощью №и1 и Вд1П. Олигонуклеотид 27 включает уникальный сайт №и1 с последующей консенсусной последовательностью для инициации трансляции у млекопитающих (например, Кохак (1991) 1. У1го1. Сйет. 266, 19867-19870), а олигонуклеотид 28 включает уникальный сайт ВдШ.
Экспрессионный вектор рУЙ-2 млекопитающего содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': промотор/энхансер ΙΕ СМУ, донор сплайсинга первого экзона ΙΕ СМУ, человеческий 1 глобиновый акцептор сплайсинга второго экзона, клонирующий сайт полилинкера, сайт полиаденилирования из гена Т-антигена 8У40 и 8У-ориджин репликации. Плазмиду рУЪ-2 конструировали в четыре стадии следующим образом. На первой стадии изготавливали плазмиду рУЪ путем замещения полилинкерного сайта клонирования и промоторов фага Т7 и Т3 плазмиды рВйюхспр! II К8 (+) на полилинкерный сайт клонирования, содержащий рестрикционные сайты ВззНП, Хо11, 8та1, НшбШ, 8рй1, 8та1, ΕсоВI, ΝιυΙ, Ара1, ВдШ, ΝΙκΙ, №Й, Хйо1 и ВззНП. рУЬ конструировали из двух фрагментов ДНК: 1) 3,0 т.п.н. векторного фрагмента, изготовленного путем разрезания плазмиды рВйюхспр! ΙΙ К8 (+) с помощью ВззНд, и обработки полученного вектора щелочной фосфатазой, и 2) фрагмента ДНК, изготовленного путем отжига перекрывающихся олигонуклеотидов 29 и 30, удлиняющегося с помощью ДНКполимеразы Клёнова и гидролитического расщепления с помощью В88НП. Плазмиды, содержащие сайты
-35005426
НшбШ и ХМ, размещенные в 5' к 3' относительно плазмидной карты В1иекспр1 II К3 (+) (инвентарный номер в СепЬапк Х52327), идентифицировали путем картирования в рестрикционном анализе. На второй стадии промежуточную плазмиду изготавливали из плазмиды рУЪ путем вставки энхансер-промотора 1Е СМУ и донора сплайсинга первого экзона, и человеческого 1 глобинового акцепторного сплайсинга второго экзона. Эту промежуточную плазмиду изготавливали из трех фрагментов ДНК: 1) 3,0 т.п.н. фрагмента ДНК, изготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рУЪ с помощью НшбШ и ЕсоВ1, 2) 0,9 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего энхансер-промотор 1Е СМУ и донор сплайсинга первого экзона (нуклеотиды от -674 до -19, координаты приведены по Воккаг! с соавт. (1985) Се11 41, 521-530), изготовленного путем РСВ с использованием плазмиды рСМ5027, содержащей т-фрагмент Рк!1 из НСМУ-штамма АЭ169 (Воккаг! с соавт., там же) в качестве матрицы с олигонуклеотидами 31 и 32 в качестве матрицы, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью НшбШ и 8рЫ, и 3) 0,1 т.п. н. фрагмента ДНК, содержащего человеческий 1 глобиновый акцептор сплайсинга второго экзона (нуклеотиды 6808-6916, координаты путем ссылки на СепЬапк, инвентарный номер 100153), изготовленный путем РСВ с использованием плазмиды рр8УаНР (Тге1ктап с соавт. (1983) Ргос. Ν;Κ1. Асаб. 8ск 80, 7428-7432) в качестве матрицы с олигонуклеотидами 33 и 34 с последующим гидролитическим расщеплением с помощью 8рЫ и ЕсоШ. Олигонуклеотиды 31, 32, 33 и 34 включают сайты рестрикции НшбШ, 8рЫ и ЕсоВ1 на своих соответствующих концах. На третьей стадии готовили плазмиду рУЪ-1 путем вставки сайта полиаденилирования Т-антигена 8У40 в эту промежуточную плазмиду. Плазмиду рУЪ-1 изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) 4,0 т.п.н. векторного фрагмента, изготовленного путем разрезания промежуточной плазмиды с помощью ВдШ и ΝΜ, и 2) 0,2 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего сайт полиаденилирования Т-антигена 8У40 (нуклеотиды 2770-2533 8У40, координаты приведены путем ссылки на Веабу с соавт (1987) 8с1епсе 200, 494-502), изготовленного путем РСВ с использованием плазмиды р8У2 (8оШ11егп апб Вегд (1982) I. Мо1. Арр1. Сеп. 1, 327-341) в качестве матрицы с олигонуклеотидами 35 и 36 в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью ВдШ и Ν1κ1. Олигонуклеотиды 35 и 36 включают уникальные сайты рестрикции ВдШ и ΝΜ по своим соответствующим концам. На четвертой стадии изготавливали плазмиду рУЪ-2 путем вставки 8У40-ориджина репликации в плазмиду рУЪ-1. Плазмиду рУЪ-2 изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) 4,2 т.п.н. векторного фрагмента, изготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рУЪ-1 с помощью ΝΊιοΙ и Х1о1, и 2) 0,2 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего 8У40-ориджин репликации (нуклеотиды 5725-5578 8У40, там же), изготовленного путем РСВ с использованием плазмиды р8У2 в качестве матрицы и олигонуклеотидов 37 и 38 в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью Ν1κΙ и 8а11. Олигонуклеотиды 37 и 38 включают уникальные сайты рестрикции ΝΜ и 8а11 по своим соответствующим концам.
Хозяйские клетки-мишени.
Хозяйские клетки-мишени, используемые для тестов на устойчивость, осуществляли с резистентными тест-векторами, производимыми из плазмид рЪС-1исРР-Н8, рЪС-1исРР-РВ, рСС-1исРР-Н8, рСС1исРР-РВ, рЪ8-1исРР-Н8, рЪ8-1исРР-РВ, рС8-1исРР-Н8 или рС8-1исРР-РВ, полученными из клеточной линии 293 человеческой эмбриональной почки и лейкозной Т-клеточной линии 1игка! (Американская Коллекция Типовых Культур, ВоскуШе, МО). Каждая клеточная линия представляет собой стабильно трансфицированную экспрессионным вектором, кодирующим вариантную РНК-полимеразу фага Т7. Этот вариант содержит ядерный локализующий сигнал Т-антигена 8У40 (ΝΕ8), слитый в рамке с Νконцевой РНК-полимеразой Т7, позволяющей ему перемещаться и функционировать в клеточном ядре (ШеЬег с соавт.(1989) Ыискк Ас1бк Век. 17, 8485-8493). Нефункциональный индикаторный ген в резистентном тест-векторе преобразуется в функциональный индикаторный ген с помощью обратной транскриптазы при инфицировании клеток-мишеней, получаемых от переставленного Т7-промотора относительно генной кодирующей области. После интеграции восстановленного индикаторного гена в хромосому клетки-мишени с помощью интегразы, ядерная РНК-полимераза Т7, экспрессируемая клеткоймишенью, способна функционально транскрибировать данный индикаторный ген.
Плазмида рУЪ-Т7ВКАР-НЪ8 используется для прямой экспрессии варианта РНК-полимеразы Т7, присоединенной к ΝΕ8, в человеческих и других клетках и клеточных линиях млекопитающих. рУЪТ7ВЫАР-НЪ8 изготавливали из трех фрагментов ДНК: 1) 4,3 т.п.н. векторного фрагмента путем гидролитического расщепления плазмиды рУЪ-2 с помощью ЕсоВ1 и ВдШ, 2) 2,6 т.п.н. фрагмента ДНК, кодирующей аминокислотные остатки 34-883 РНК-полимеразы Т7 (нуклеотиды 267-2817, координаты по СепЬапк, инвентарный номер М38308, Сгаскет апб Р1е1пет (1984) Вюогд. КЫт. 10, 824-843), изготовленного путем РСВ с использованием плазмиды рТ7-С1 (Эепд с соавт. (1994) Сепе 143, 245-249) в качестве матрицы с олигонуклеотидами 39 и 40 в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью №и1 и ВдШ, и 3) синтетического фрагмента ДНК, кодирующего первые три аминокислоты Т-антигена 8У40 с последующими аминокислотами 118-133 из большого Т-антигена 8У40, содержащего ΝΗ8 (ЫеЬег с соавт., там же), изготовленного путем отжига перекрывающихся олигонуклеотидов 41 и 42, удлиненного с помощью ДНК-полимеразы Клёнова и гидролитически расщепленного с помощью ЕсоВ1 и ΝπιΙ. Олигонуклеотиды 39, 40, 41, 42 включают сайты рестрикции, соответственно, ΝιυΙ, ВдШ, ЕсοВI и №ик Плазмида рУЪ-Ыео используется для создания стабильных трансфектантов из
-36005426 человеческих и других клеток и клеточных линий млекопитающих путем котрансфекции. ρΥΒΝοο управляет экспрессией неомицинфосфотрансферазы и придает устойчивость к антибиотику С418. Плазмиду ρνΒΝοο изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) 4,3 т.п.н. векторного фрагмента, изготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рУЪ-2 с помощью Ε^Κ! и ВдШ, и 2) 0,8 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего полную кодирующую область №ο (нуклеотиды 1551-2345 последовательности транспозона Тп5, координаты приведены по СеоЬаок, инвентарный номер υ00004, Веск с соавт. (1982) Сепе 19, 327-336), изготовленного путем РСВ с использованием плазмиды ρ8Υ2ποο (8οι.ι11ΐ0Γη апб Вегд (1982) I. Μοί. Αρρί. Сео. 1, 327-341) в качестве матрицы с олигонуклеотидами 43 и 44 в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью Ε^Βΐ и ВдШ. Олигонуклеотид 43 включает уникальный ΕοοΒΙ-οβητ с последующей консенсусной последовательностью млекопитающих инициации трансляции, а олигонуклеотид 44 включает уникальный ВдШ-сайт.
ΡΥΕ-Τ7ΚΝΑΡ интродуцировали путем стабильной трансфекции в клетки методом кальцийфосфатной копреципитации (^1д1ег с соавт. (1979) Се11 16, 777) и в клетки Лика! электропорацией (Шшд с соавт. (1991) Се11 64, 891-901). Клетки 293 поддерживались в ΌΜΕΜ-среде (ЖС Вюкаепсек) с добавлением глюкозы, 1 г/л, 10% донорской сыворотки теленка (Иккие Си1!иге Вюкдхек). Клетки Лика! поддерживали в среде ΗΡΜΐ 1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы (ΐτνίη 8сепНПс), глутамина, пенициллина и стрептомицина. Трансфекционная смесь для клеток 293 и 1шка1-клеток, каждая, содержит смесь из 10 микрограмм ρΥΕ-Τ7ΒΝΑΡ и селективного маркера ρΥΕ-Νοο в соотношении по массе от 10:1 до 20:1. Через 24-48 ч после трансфекции, клеткам меняли среду на такую же, содержащую антибиотик С418 (С1ВСО, Сгапб Ыаиб, Ν.Υ.). Независимые 293-клеточные клоны, устойчивые к С418 отбирали прямо из селекционных чашек через две недели и увеличивали в объеме для анализа. Независимые .ТшкаЕклеточные клоны, устойчивые к С418, получали путем лимитирующего разведения через две-три недели лекарственной селекции и увеличивали в объеме для анализа.
293- и 1шка1-клеточные клоны, устойчивые к С418, скринировали по уровню экспрессии РНКполимеразы Т7 путем определения уровня стационарной мРНК, специфичной к РНК-полимеразе Т7, синтезируемой клетками, с использованием метода Нозерн-блот-гибридизации (Α^υΜ с соавт. (1987) Сиггеп! Ργοϊο^Ε ίη Μο1οαι13Γ Вшкду. ^ПеуЧШегкшепсе). Клеточные клоны 293 и 1игка1, экспрессирующие оптимальные уровни РНК-полимеразы Т7 и затем идентифицируемые путем определения их способности поддерживать транскрипцию, специфичную для РНК-полимеразы Т7, для временных трансфекций с плазмидой ρΕΜΕΈικόβΑη (Эепд с соавт. (1991) Сепе 109, 193-201), в которой транскрипция люциферазного гена управляется под Т7-промотором. 293 и 1игка!-клоны, поддерживающие наивысшие уровни экспрессии люциферазного гена отбирали для дальнейшего использования; они приводятся, соответственно, в виде 293/Τ7ΒNΑΡ-N^8-клеток и ^шкаι/Τ7ΒNΑΡ-N^8-клеток.
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на устойчивость осуществляли с тест-векторами на устойчивость, основанных на вирусных векторах, с индикаторным геном, ρΕ6-1υοΡΡ-Η8, ρ^С-1исΡΡ-ΡΒ, ρΕΌ-1ικΡΡ-Η8, ρСС-1исΡΡ-ΡΒ, ρΕ81ι.κΡΡ-Η8, ρ^8-1исΡΡ-ΡΒ, ρС8-1исΡΡ-Η8 или ρС8-1исΡΡ-ΡΒ, использующих любые два типа хозяйской клетки или один тип хозяйской клетки. В тесте на устойчивость первого типа, тест-вектор вирусных частиц на устойчивость получали с помощью первой хозяйской клетки (резистентный тест-вектор хозяйской клетки), которую получали путем трансфицирования упаковывающей хозяйской клетки с резистентным тест-вектором и упаковывающим экспрессионным вектором(ами). Резистентный тест-вектор вирусных частиц использовали затем для заражения второй хозяйской клетки (хозяйская клеткамишень), в которой измеряли экспрессию индикаторного гена. В тесте на устойчивость второго типа, единственный тип хозяйской клетки служит обоим целям: несколько упаковывающих хозяйских клеток в данной культуре трансфицировали и получали резистентный тест-вектор вирусных частиц, а несколько хозяйских клеток в той же самой культуре являются мишенью инфицирования частицами с резистентным тест-вектором, полученных таким образом. Тесты на устойчивость, использующие единственный тип хозяйской клетки, возможно, осуществляются с резистентными тест-векторами, включающими не функциональный индикаторный ген с пермутированным промотором: когда такие индикаторные гены эффективно экспрессируются при заражении пермиссивной хозяйской клетки, они не экспрессируются эффективно при трансфекции того же типа хозяйской клетки и поэтому создают благоприятную возможность для измерения эффекта оцениваемого противовирусного агента. По аналогичным причинам тесты на устойчивость, использующие два типа клеток, осуществляют сокультивированием двух типов клеток в качестве альтернативы инфицирования клетки второго типа вирусными частицами, получаемыми из супернатантов клетки первого типа.
Тест на чувствительность и устойчивость - две клетки.
Резистентный тест-вектор хозяйской клетки получали путем контрансфекции резистентного тествектора и подходящего упаковывающего вектора(ов) с использованием либо 293-клеточной линии 1ка54или !ка201-клеточных линий (Ηοίπζο1 с соавт. (1988) ί. νίτο1. 62, 3738), либо ВО8С 23-клеточной линии (Геаг с соавт. (1993) Ргос. №И. Αсаб. 8с1. 90, 8392) в качестве упаковывающих хозяйских клеток. Резистентные тест-векторы, сконструированные путем инсерцирования сегмента, производимого пациентом, в ρΕ^1ι.κΡΡ-Η8, ρ^-1^ΡΡ-Η8, ρ^С-1исΡΡ-ΡΒ и ρСС-1исΡΡ-РВ, котрансфицировали упаковывающим
-37005426 экспрессионным вектором ρV^-еην4070Α, а резистентные тест-векторы, полученные путем инсерцирования сегментов, производимых пациентом, в рЕЗЧисРР-ИЗ, рЬЗ-1исРР-РБ и ρСЗ-1исРР-РΒ, котрансфицировали упаковывающими экспрессионными векторами ρV^-еην4070Α и либо рЬ 1^-4^3( либо ρСМV-ΗIV3'. Клетки ^и^каΐ/Τ7ΚNΑР-N^З использовали в качестве хозяйских клеток-мишеней.
Упаковывающие хозяйские клетки выращивали в ЭМЕМ-среде, 1 г/л глюкозы, 10% донорской сыворотки теленка и пассировали при разведении 1:10 каждые три дня. Перед трансфекцией клетки помещали на 48 ч в чашки при 1х106 клеток на 10 см чашку. Клетки трансфицировали методом кальцийфосфатной копреципитации с использованием от 5 до 10 мг каждого резистентного тест-вектора и подходящего упаковывающего вектора(ов) для получения резистентного тест-вектора хозяйских клеток. Индивидуальные противовирусные агенты, в том числе ингибиторы обратной транскриптазы ΑΖΈ бб1, ббС б4Т и 3ТС, и протеазные ингибиторы саквинавир, ритонавир и индинавир, а также их сочетания вносили в отдельные чашки с трансфицируемыми клетками во время их трансфекции в ряду соответствующих концентраций. Через 24-48 ч после трансфекции мишенные хозяйские клетки инфицировали путем сокультивирования резистентным тест-вектором хозяйских клеток или вирусными частицами, получаемыми из отфильтрованных супернатантов тест-векторных хозяйских клеток. Каждый противовирусный агент или его сочетания добавляли к хозяйской клетке-мишени во время ее инфицирования для достижения одной и той же конечной концентрации данного агента, или агентов, присутствующих в течение трансфекции.
Для инфицирования путем сокультивирования, среду удаляли из 10 см чашки с резистентными тест-векторными хозяйскими клетками, приготовленными путем предыдущей 24-48 ч трансфекции, и 0,5-1,0 х 106 ^шкаί/Τ7ΚNΑР-N^З мишенных клеток вносили в чашку в 1игка1-клеточную среду, содержащую противовирусный агент в соответствующей концентрации. Клетки-мишени сокультивировали с резистентными тест-векторными хозяйскими клетками в течение 24 ч, затем удаляли и вносили свежеприготовленные резистентные тест-векторные хозяйские клетки для второго сокультивирования в Л1гка1клеточной среде, содержащей противовирусный агент(ы) в соответствующей концентрации. 24 ч спустя хозяйские клетки-мишени отбирали после второго сокультивирования, собранные путем центрифугирования, промывали три раза ледяным фосфатно-солевым буферным раствором (РΒЗ), и проверяли на люциферазную активность. Для инфицирования отфильтрованными супернатантами, среду удаляли из 10 см чашки с резистентными тест-векторными хозяйскими клетками, приготовленными путем предыдущей 24-48-часовой трансфекции. Удаленную среду фильтровали через через 0,45 мм фильтр во время сбора, замораживали при -70°С, и оттаивали перед трансдукцией. Клетки ^шкаΐ/Τ7ΚNΑР-N^З (0,5-1,0 х 106) вносили в 5 мл равной смеси из 1шка1-клеточной среды и отфильтрованного супернатанта, соединяли с 8 мг/мл полибрена (З1дта, З1. Ьошк, М1) и с соответствующей концентрацией противовирусного агента(ов). Спустя 24-48 ч после инфицирования, собирали хозяйские клетки-мишени центрифугированием, промывали три раза ледяным фосфатно-солевым раствором и проверяли экспрессию индикаторного гена. Хозяйские клетки-мишени инфицировали путем сокультивирования или отфильтрованными вирусными супернатантами и проверяли, как описано, на люциферазную активность (Αι.ΐ5ΐ.^1 с соавт. (1987) СштеШ РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Б^оду, V^1еу-Iηΐе^8с^еηсе). Снижение люциферазной активности наблюдали для хозяйских клеток-мишеней, инфицированных данным препаратом резистентных тест-векторных вирусных частиц в присутствии данного противовирусного агента или агентов, в сравнении с контролем, осуществляемом в отсутствие противовирусного агента, в основном связанного с 1од-концентрацией противовирусного агента в виде сигмоидальной кривой. Эту кривую ингибирования использовали для вычисления очевидной ингибиторной концентрации (1С) этого агента или сочетания агентов, вирусного мишенного продукта, кодируемого с помощью сегментов, производимых пациентом, присутствующих в резистентном тест-векторе.
Тестирование чувствительности и устойчивости - одна клетка.
Резистентный тест-вектор хозяйских клеток получали путем котрансфекции резистентного тествектора и подходящего упаковывающего вектора(ов) с использованием либо клеток 293/Τ7Κ.NΑР-N^З. либо клеток ^шкаί/Τ7ΚNΑР-N^З в качестве упаковывающих хозяйских клеток. Резистентные тествекторы конструировали путем вставки сегментов, производимых пациентом, в ρ^С-1исРР-ΗЗ, рССЫсРР-ИЗ, ркС-1исРР-РБ и ρСС-1исРР-РΒ, котрансфицируемых упаковывающим экспрессионным вектором ρV^-еην4070Α, а резистентные тест-векторы, получаемые путем вставки сегментов, производимых пациентом, в рЕЗЧисРР-ИЗ, рСЗ-1исРР-ИЗ, рЬЗ-1исРР-РБ и ρСЗ-1исРР-РΒ, котрансфицировали упаковывающими экспрессионными векторами ρV^-еην4070Α и, либо )9^^-4^3/ либо ρСМV-ΗIV3'.
Клетки трансфицировали с использованием 5-10 мг каждого резистентного тест-вектора и подходящим упаковывающим экспрессионным вектором(ами) для получения резистентного тест-вектора хозяйских клеток. Клетки 293/Τ7ΚNΑР-N^З трансфицировали методом кальций-фосфатной копреципитации, а клетки ^шкаί/Τ7ΚNΑР-N^З трансфицировали электропорацией. Индивидуальные противовирусные агенты или их сочетания вносили в отдельные чашки с трансфицируемыми клетками на время их трансфекции в ряду подходящих концентраций. Через 24-72 ч после трансфекции клетки собирали центрифугированием, промывали три раза ледяным фосфатно-солевым раствором и проверяли, как описано,
-38005426 на активность люциферазы жука-светляка. Поскольку трансфицируемые в культуре клетки эффективно не экспрессируют индикаторный ген, трансфицированные в этой культуре клетки, также как и суперинфицированные клетки в культуре, могут служить в качестве хозяйских клеток-мишеней для экспрессии индикаторного гена. Снижение люциферазной активности, наблюдаемое для клеток, трансфицируемых в присутствии данного противовирусного агента, или агентов, в сравнении с контролем, осуществляемом в отсутствие противовирусного агента(ов), обычно связывали с 1од-концентрацией противовирусного агента в виде сигмоидальной кривой. Эту кривую ингибирования использовали для вычисления истинной ингибирующей концентрации (1С) этого агента, или сочетания агентов, для вирусного продуктамишени, кодируемого сегментами, производимыми пациентом, присутствующими в резистентном тествекторе.
Пример 2. Тесты на Ηΐν-чувствительность и устойчивость к лекарственному препарату с использованием резистентных тест-векторов, включающих сегменты, производимые пациентом, и нефункциональный индикаторный ген А с перкутированной кодирующей областью А.
Индикаторный ген вирусного вектора - конструирование
Геномные вирусные векторы с индикаторным геном, с акцепторными свитами последовательности пациента рЬСЧисРС-Ж, р^С-1исРС-РΒ, рССЧисРС-Щ и рСС-1исРС-РΒ и резистентные тест-векторы, производимые из них, каждый, содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3' (фиг. 4В): 1) И3-область Ηΐν-ЬТК (рЬСЧисРС-Ж и рЬС-1исРС-РБ) или первый энхансер-промотор ΐΕ СМV (рСС1исРС-№ и рСС-1исРС-РΒ), 2) К- и И5-области Ηΐν-ЬТК, 3) кодирующие области Ηΐν-генов дад-ро1, νίί, ург, 1а1, геу, ури, делегированного епу и пеГ, 4) первую кассету индикаторного гена, содержащую 5'кодирующую область люциферазного гена, инсерцированного в делетированный ген епу, 5) вторую кассету индикаторного гена, содержащую 3'-кодирующую область люциферазного гена, инсерцированного в делегированную И-область 3'-ЬТК Ηΐν, и 6) К- и И5-область 3'-ЬТК Ηΐν. рЬСЧисРС-Ж и рСС-1исРСΗ8, содержат уникальные акцепторные сайты, Ηраΐ и 8аИ последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам 2243 и 4190 из НХВ2; рЬС-кюРС-РЕ и рСС-1исРС-РΒ содержат уникальные акцепторные сайты Руи1 и ΒатΗΐ последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам 2221 и 4212 из НХВ2 (подробно см. пример 1). Первая кассета индикаторного гена содержит: 1) второй энхансерпромотор СМУ, 2) 5'-кодирующую область люциферазного гена (аминокислоты 1-446), и 3) донор сплайсинга ΐΕ СМУ. Кассета второго индикаторного гена содержит: 1) 3'-кодирующую область люциферазного гена (аминокислоты 447-550), и 3) сайт полиаденилирования 8У40. Транскрипционная ориентация 5' - и 3'-кодирующих областей идентична друг другу и противоположна транскрипционной ориентации первого энхансер-промотора СМУ и вирусных ЬТК. Однако поскольку люциферазные 5'- и 3'кодирующие области пермутированы в резистентных тест-векторах (т.е. 5'-кодирующая область находится ниже 3'-кодирующей области), мРНК не транскрибируется, которая может быть сплайсирована с образованием функциональной люциферазной кодирующей области. После обратной транскрипции и переноса цепи люциферазную 3'-кодирующиую область копировали из 3'-ЬТК в 5'ЬТК, позволяя транскрибироваться мРНК, которая может быть сплайсирована с образованием функциональной люциферазной кодирующей области (фиг. 4С). Субгеномные вирусные векторы с индикаторным геном у с акцепторными сайтами последовательности пациента рЬЗЧисРС-Ж, р^8-1исРС-РΒ, рСЗЧисРС-Ж и рС81исРС-РΒ и резистентные тест-векторы, произведенные из них, каждый, содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3' (фиг. 4В): 1) И3-область Ηΐν-ЬТК (^-8-11.^0^8 и рЬ8-1исРС-РБ) или первый энхансер-промотор ΐΕ СМУ (р^8-1исРС-Η8 и рС8-1исРС-РΒ), 2) К- и И5-области Ηΐν-ЬТК, 3) кодирующие области Ηΐν-гена дад-ро1, 4) кассету первого индикаторного гена, содержащую 5'-кодирующую область люциферазного гена, 5) ΚΚΕ-элемент из Ηΐν-гена епу, содержащий вирусную упаковывающую последовательность, 6) кассету второго индикаторного гена, содержащую 3'-кодирующую область люциферазного гена, вставленную в делегируемую И3-область 3'ЬТК Ηΐν, и 7) К- и И5-область 3'-ЬТК Ηΐν. Р^8-1исРС-Η8 и рС8-1исРС-Η8 содержат уникальные акцепторные сайты Ηраΐ и 8аЛ последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам 2243 и 4190 из НХВ2; рСБ-кюРС-РЕ и рС8-1исРС-РΒ содержат уникальные акцепторные сайты Руи1 и ΒатΗΐ последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам 2221 и 4212 из НХВ2. Первая кассета индикаторного гена содержит: 1) второй энхансерпромотор СМУ, 2) 5'-кодирующую область люциферазного гена (аминокислоты 1-446) и 3) донор сплайсинга ΐΕ СМУ. Кассета второго индикаторного гена содержит: 1) акцептор сплайсинга второго экзона (-глобинового гена, 2) 3'-кодирующая область люциферазного гена (аминокислоты 447-550) и 3) сайт полиаденилирования 8У40. Поскольку люциферазные 5'- и 3'-кодирующие области пермутированы в резистентных тест-векторах, обратная транскрипция и перенос цепи может происходить с образованием непермутированных 5'- и 3'-кодирующих областей, позволяя транскрибироваться мРНК, которая может быть сплайсирована с образованием люциферазной кодирующей области (фиг. 4С).
Плазмиду рУЬ-1ис5', которая содержит кассету первого индикаторного гена, изготавливали в три стадии. В первых двух стадиях искусственный интрон, содержащийся в рУЬ-1, состоящий из донора сплайсинга ΐΕ СМУ и акцептора сплайсинга - глобинового гена, подвергали сайт-направленному мутагенезу для создания сайтов рестрикции, которые при гидролитическом расщеплении дают фрагмент ДНК, чьи 5'- и 3'-концы точно корреспондируют с началом и концом искусственного интрона. На стадии один
-39005426 сайт-направленный мутагенез осуществляли с помощью рУЪ-1 с использованием олигонуклеотида 45, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность, которая предшествует донору сплайсинга 1Е СМУ, 2) ТАС-тринуклеотидную последовательность, корреспондирующую с первой половиной 8паВ1-сайта рестрикции, и 3) 18-нуклеотидную последовательность в начале искусственного интрона. Поскольку последовательность первых трех нуклеотидов интрона представляет собой СТА, результирующая плазмида рУЬ-8паВ1 содержит 8паВ1-сайт рестрикции, который при гидролитическом расщеплении высвобождает 5'-последовательность из данного интрона в виде тупого конца ДНК. На стадии два, сайт-направленный мутагенез осуществляли с помощью рУЬ-8паВ1 с использованием олигонуклеотида 46, который содержит нижеследующие последовательности (5' к 3'): 1) 18-нуклеотидную последовательность в конце искусственного интрона, 2) СТСтринуклеотидную последовательность, корреспондирующую со второй половиной ΡνπΙΙ-сайта рестрикции, и 3) 18-нуклеотидную последовательность после акцептора сплайсинга - глобина. Поскольку последовательность последних трех нуклеотидов данного интрона представляет собой САС, результирующая плазмида рУЪ-8паВ1/Руц11 содержит РуцП-сайт рестрикции, который при гидролитическом расщеплении высвобождает 3'-последовательность из данного интрона в виде тупого конца ДНК. На третьей стадии плазмиду рУБ-1ис5' изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) 5,3 т.п.н. векторной ДНК, изготавливаемой путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-1ис с помощью ЕсоК1 и ΝΜ, и обработки полученного вектора ДНК-полимеразой Клёнова и щелочной фосфатазой, и 2) 0,1 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего донор сплайсинга ΙΕ СМУ, изготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-8паВ1^и11 с помощью 8паВ1 и 8та1. Клоны, корреспондирующие с рУЪ-1ис5', которые содержат донор сплайсинга ΙΕ СМУ, инсерцируемые в правильной ориентации в люциферазную кодирующую область, идентифицировали путем рестрикционного картирования.
Плазмиду рУБ-1ис3', которая содержит кассету второго индикаторного гена, изготавливали в три стадии. На первой стадии плазмиду рВ8-ЬТК, в которой субклонировали 3'-ЬТК из рВ8-НХВ2, изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) 3,0 т.п.н. векторной ДНК, изготавливаемой путем гидролитического расщепления рВ1и5спр1 II К8 (+) с помощью ХМ и ХЬа1, и 2) 0,8 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего 3'ЬТК, изготовленного путем гидролитического расщепления рВ8-НХВ2 с помощью XйοI и ХЬак На стадии два плазмиду рВ8-ЬТК-1ис3', которая содержит 3'-кодирующую область люциферазы с последующим сайтом полиаденилирования 8У40, инсерцируемого в делегируемый 3-ЬТК, изготавливали из двух фрагментов: 1) 3,5 т.п.н. векторной ДНК, изготовленной путем гидролитического расщепления рВ8-ЬТК с помощью ЕсоКУ, обработки результирующего вектора щелочной фосфатазой, и 2) 0,5 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего 3'-люциферазную кодирующую область и ро1уА-сайт 8У40, изготовленный путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-1ис с помощью ЕсоКУ и ΝΜ, с последующей обработкой результирующего фрагмента ДНК-полимеразой Клёнова. Клоны, обладающие 3'-люциферазной кодирующей областью, инсерцируемой в правильной ориентации (т.е. противоположной направлению транскрипции в 3'-ЬТК), идентифицировали с помощью рестрикционного картирования. На стадии три плазмиду рУБ-1ис3', изготавливали из двух фрагментов: 1) 4,0 т.п.н. векторной ДНК, изготовленной путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-ЬТК-1ис3', с помощью ЕсоКУ, с последующей обработкой результирующего вектора щелочной фофатазой, и 2) 0,1 т.п.н фрагмента ДНК, содержащего акцепторный сплайсинг второго экзона глобинового гена, инсерцируемый в правильной ориентации в люциферазную кодирующую область, идентифицировали с помощью рестриктазного картирования.
Плазмиды рЬС-1исРС-Н8, рЬС-1исРС-РВ, рЬ8-1исРС-Н8 и рЬ8-1исРС-РВ изготавливали с помощью той же трехстадийной методики. На стадии один плазмиды рЬС-1исПР-Н8, рЬС-1исПР-РВ, рЬ8-1исПР-Н8 и рЬ8-1исПР-РВ изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) векторной ДНК, изготовленной путем гидролитического расщепления плазмид рЬС-1исРР-Н8, рЬС-1исРР-РВ, рЬ8-1исРР-Н8, рЬ8-1исРР-РВ, соответственно с помощью 8таI и СШ, и 2) 0,8 т.п.н. фрагмента ДНК, изготовленного путем гидролитического расщепления плазмиды рЬС с помощью 8таI и С1а! На стадии два плазмиды рЬ8-1ис5'-РВ, рЬС1ис5'-Н8, рЬ8-1ис5'-РВ изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) векторную ДНК изготавливали путем гидролитического расщепления плазмид, соответственно рЬС-1исПР-Н8, рЬС-1исПР-РВ, рЬ8-1исПР-Н8 и рЬ8-1исПР-РВ, и обработки результирующих векторов щелочной фосфатазой, и 2) 2,5 т.п.н. фрагмент ДНК, содержащий кассету первого индикаторного гена, изготовленную путем гидролитического расщепления рУБ-1ис5' с помощью №П. Клоны, которые содержали кассету первого индикаторного гена, инсерцируемую в вирусный вектор в транскрипционной ориентации, противоположной транскрипционной ориентации вирусных ЬТК, идентифицировали путем рестрикционного картирования. На стадии три плазмиды рЬС-1исРС-Н8, рЬС-1исРС-РВ и рЬ8-1исРС-РВ изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) векторной ДНК, изготовленной путем гидролитического расщепления плазмид, соответственно рЬС-1ис5'Н8, рЬС-1ис5'-РВ, рЬ8-1ис5'-Н8 и рЬ8-1ис5'-РВ, с помощью ХМ и ХМ, и 2) 1,1 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего кассету второго индикаторного гена, изготовленную путем гидролитического расщепления плазмиды рУБ-1ис3' с помощью ХМ и ХЬа!
Плазмиды рСС-1исРС-Н8, рСС-1исРС-РВ, рС8-1исРС-Н8 и рС8-1исРС-РВ, каждую, изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) векторной ДНК, изготовленной путем гидролитического расщепления любой плазмиды, соответственно рЬС-1исРС-Н8, рЬС-1исРС-РВ, рЬ8-1исРС-Н8 и рЬ8-1исРС-РВ, с помощью
-40005426
8ιη;·ιΙ и С1аГ и 2) 1,3 фрагмента ДНК, изготовленного путем гидролитического расщепления рСС с помощью 8та! и С1аГ
Резистентный тест-вектор - конструирование
Резистентные тест-векторы, содержащие нефункциональный индикаторный ген с пермутированной кодирующей областью, конструировали с использованием ΗΙν-геномных и субгеномных вирусных векторов, включающих противовирусные гены-мишени, описанные в примере 1.
Резистентные тест-векторы изготавливали из плазмид рГС-1исРС68, р^С-1исРС-РΒ, рС6-1ис-Η8, ρС6-1исРС-РΒ, ρ^8-1исРС-Η8, ρ^8-1исРС-РΒ, ρС8-1исРС-Η8 и ρС8-1исРС-РΒ (фиг. 4Β) с помощью методики, описанной в примере 1. Резистентные тест-векторы конструировали с помощью векторов, изготовленных из плазмид р^С-1исРС-Η8, рСС-ШсРС-Ж, ρ^8-1исРС-Η8 или ρС8-1исРС-Η8 с использованием амплифицируемых последовательностей пациента, изготовленных с олигонуклеотидами 18 и 19 и с олигонуклеотидами 22 и 23. Резистентные тест-векторы конструировали с помощью векторов, изготовленных из плазмид р^С-1исРС-РΒ, ρС6-1исРС-РΒ, ρ^8-1исРС-РΒ или ρС8-1исРС-РΒ с использованием амплифицируемых последовательностей пациента, изготовленных с помощью олигонуклеотидов 20 и 21 и с олигонуклеотидами 24 и 25.
Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на устойчивость осуществляли с помощью методик, описанных в примере 1, следующим образом. Резистентные тест-векторы, изготовленные из плазмид рЬбЛисРС-Щ, ρ^С-1исРС-РΒ. рСС-1исРСΗ8 и рСС-1исРС-РΒ, утратившие функциональный ΗΙν-ген еп\г, использовали во взаимодействии с упаковывающим экспрессионным вектором рУЬ-епу4070Л. Резистентные тест-векторы изготавливали из плазмид рГ8-1исРС68, рЬ8-1исРС-РВ, ρС8-1исРС-Η8 и ρС8-1исРС-РΒ, кодирующих только продукты ΗΙν-гена дад-ро1, и используемые совместно с рУЬ-е 113407(^, и упаковывающими экспрессионными векторами, либо ]36ΤΡ6Ιν3', либо рСМУ-ШУ3'. В резистентных тест-векторах, осуществляемых с использованием двух типов хозяйских клеток, 293-клеточной линией, 1ка54-клеточной линией, 1ка201клеточной линией или 23-клеточной линией Β08Ο используемых в качестве упаковывающих хозяйских клеток, применяли не модифицированные 1игка1-клетки в качестве клеток-мишеней. Поскольку нефункциональные индикаторные гены с пермутируемой кодирующей областью, содержащиеся в этих резистентных тест-векторах, эффективно не экспрессируются при трансфекции упаковывающих хозяйских клеток, инфицирование хозяйских клеток-мишеней осуществляли либо путем сокультивирования с упаковывающими хозяйскими клетками, либо путем использования вируса из супернатанта упаковывающей хозяйской клетки. По аналогичным причинам тесты на устойчивость, осуществляемые с этими резистентными тест-векторами, могут использовать единственный тип хозяйской клетки. Тесты на устойчивость с использованием единственного типа хозяйской клетки осуществляли с использованием либо 293-, 1ка54-, 1ка201-, Β08С 23, либо 1игка1-клеток.
Пример 3. Тест на ШУ-лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием резистентных тест-векторов, включающих сегмент(ы), производимый пациентом, и нефункциональный индикаторный ген А с инвертированным нитроном.
Резистентные тест-векторы, содержащие нефункциональный индикаторный ген с инвертированным интроном, создавали с использованием ΗΙν-геномных и субгеномных вирусных векторов, включающих противовирусные гены-мишени, описанные в примере 1.
Вирусные векторы с индикаторным геном - инвертированный интрон
Геномные вирусные векторы с индикаторным геном, с акцепторными сайтами последовательности пациента рЬСЧисП-Ж, р^С-1исII-РΒ, рССЧисП-Ж и рС6-1исII-РΒ и резистентные тест-векторы, получаемые из них, каждый, содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': 1) и3-область ΗΙνШ (рЬбЧисП-Ж и р^С-1исII-РΒ) или первый энхансер-промотор ΙΕ СМУ (рССЧисП-Ж и рС6-1исПРΒ), 2) В- и и5-области ШУ-ШВ, 3) кодирующие области ΗΙν-генов дад-ро1, νίί, зрг, 1аГ гез, зри, делегируемого епз и пеГ, 4) кассету индикаторного гена, инсерцируемую в делегируемый ген οιιν, и 5) 3'-ПВ ΗΙν. рЬбЧисП-Ж и рССЧисП-Ж содержат уникальные Η]3;·1Ι- и 8аП-акцепторные сайты последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам 2243 и 4190 из НХВ2; р^С-1исII-РΒ и рС6-1исII-РΒ содержат уникальные акцепторные сайты ΓνιιΙ и ΒатΗI последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам 2221 и 4212 из НХВ2 (см. подробности примера 1). Кассета индикаторного гена содержит
1) второй энхансер-промотор СМУ, 2) кодирующую область люциферазного гена, разорванного инвертированным искусственным интроном, и 3) последовательностью полиаденилирования 8ν40. Общая транскрипционная ориентация кассеты индикаторного гена противоположна транскрипционной ориентации первого энхансер-промотора СМУ и вирусных ГИВ, а ориентация искусственного интрона та же, что и у последних элементов. Транскрипция индикаторного гена под вторым энхансер-промотором СМУ не приводит к получению функциональных транскриптов, поскольку инвертированный интрон не может быть сплайсирован в данной ориентации. Транскрипция индикаторного гена под 5'-вирусным ИВ или первым энхансер-промотором ΙΕ СМУ приводит, однако, к удалению инвертированного интрона путем РНК-сплайсинга, хотя индикаторный ген, еще функционально не экспрессируемый в виде результирующего транскрипта, обладает антисмысловой ориентацией. После обратной транскрипции этого транскрипта и интеграции полученной провирусной ДНК, индикаторный ген может быть функционально
-41005426 транскрибируем под вторым энхансер-промотором СМУ в виде инвертированного интрона, который прежде удалялся (фиг. 5 С).
Субгеномные вирусные векторы с индикаторным геном, с акцепторными свитами последовательности пациента рЬ8-1исГГ-Н8, рЬ8-1исГГ-РВ, рС8-1ис11-Н8 и рС8-1ис11-РВ и резистентные тест-векторы, получаемые из них, каждый, содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': 1) ИЗ-область НГУ-ЬТК (рЬ8-1исГГ-Н8 и рЬ8-1исП-РВ) или первый энхансер-промотор 1Е СМУ (рС8-1ис11-Н8 и рС81ис11-РВ), 2) К-и И5-области НГУ-ЬТК, 3) кодирующую область НГУ-гена дад-ро1, 4) кассету индикаторного гена, 5) ККЕ-элемент НГУ-гена епу, содержащий вирусную упаковывающую последовательность, и 6) 3'-ЬТК НГУ. рЬ8-1исГГ-Н8 и рС8-1исГГ-Н8 содержат уникальные акцепторные сайты НраГ и 8а1Г последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам 2243 и 4190 из НХВ2; рЬ8-1исП-РВ и рС81исГГ-РВ содержат уникальные акцепторные сайты РуцГ и ВатНГ последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам НХВ2 2221 и 4212. Данная кассета индикаторного гена содержит 1) второй энхансер-промотор СМУ, 2) кодирующую область люциферазного гена, разорванную инвертированным искусственным интроном, и 3) последовательностью полиаденилирования 8У40. Как и в случае для рЬС1исГГ и рСС-1исГГ геномных вирусных векторов, индикаторные гены из рЬ8-1исГГ и рС8-1исГГ не могут функционально транскрибироваться уже после того, как удалили инвертированный интрон и происходит обратная транскрипция и провирусная интеграция (фиг. 5С).
Плазмиду рУЪ-1исГГ, которая содержит кассету индикаторного гена, в которую в люциферазную кодирующую область инсерцирован искусственный интрон из рУЬ-8паВГ/РуиГГ в инвертированной ориентации, изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) 5,8 т.п.н. векторного фрагмента, изготовленного путем гидролитического расщепления рУЪ-1ис с помощью ЕсоКГ и обработки результирующего вектора щелочной фосфатазой, и 2) 0,2 т.п.н. фрагмента ДНК, точно корреспондирующего с искусственной интронной последовательностью, изготовленный путем гидролитического расщепления рУЪ-8паВГ/РуиГГ с помощью 8паГ и РуиГГ. Клоны, корреспондирующие с рУЪ-1исГГ, которые содержат искусственный интрон, вставленный в люциферазную кодирующую область в инвертированной ориентации, идентифицировали с помощью рестрикционного картирования. Плазмиды рЬС-1исГГ-Н8, рЬС-1исП-РВ, рЬ8-1исГГ-Н8 и рЬ81исГГ-РВ изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) векторной ДНК, изготовленной путем гидролитического расщепления плазмид, соответственно рЬС-1исПР-Н8, рЬС-1исПР-РВ, рЬ8-1исПР-Н8 и рЬ8-1исОРРВ, и обработки результирующих векторов щелочной фосфатазой, и 2) 3.2 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего кассету люциферазного индикаторного гена, изготовленную путем гидролитического расщепления рУЪ-1исГГ с помощью ΝοΐΤ Клоны, которые содержат корректную р1исГГ-кассету индикаторного гена, инсерцируемые в вирусный вектор в транскрипционной ориентации, противоположной транскрипционной ориентации вирусных ЬТК, идентифицировали с помощью рестрикционного картирования и использовали для изготовления резистентных тест-векторов.
Плазмиды рСС-1исГГ-Н8, рСС-1исГГ-РВ, рС8-1исГГ-Н8 и рС8-1исГГ-РВ, каждую, изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) векторной ДНК, изготовленной путем гидролитического расщепления плазмид, соответственно рЬС-1исГГ-Н8, рЬС-1исГГ-РВ, рЬ8-1исГГ-Н8 и рЬ8-1исГГ-РВ, с помощью 8таГ и С1аГ, и
2) 1,3 т.п.н. фрагмента ДНК, изготовленного путем гидролитического расщепления рСС с помощью 8таГ и С1аГ.
Резистентный тест-вектор - конструирование
Резистентные тест-векторы изготавливали из плазмид рЬС-1исГГ-Н8, рЬС-1исГГ-РВ, рСС-1исГГ-Н8, рСС-1исГГ-РВ, рЬ8-1исГГ-Н8, рЬ8-1исГГ-РВ, рС8-1исГГ-Н8 и рС8-1исГГ-РВ (фиг. 5В), с помощью методики, описанной в примере 1. Резистентные тест-векторы конструировали с помощью векторов, изготовленных из плазмид рЬС-1исГГ-Н8, рСС-1исГГ-Н8, рЬ8-1исГГ-Н8 или рС8-1исГГ-Н8 с использованием амплифицированных последовательностей пациента, изготовленных с помощью олигонуклеотидов 18 и 19 и с помощью олигонуклеотидов 22 и 23. Резистентные тест-векторы, сконструированные с помощью векторов, изготовленных из плазмид рЬС-1исП-РВ, рСС-1исГГ-РВ, рЬ8-1исП-РВ или рС8-1исГГ-РВ с использованием амплифицированных последовательностей пациента, изготавливали с помощью олигонуклеотидов 20 и 21 и с помощью олигонуклеотидов 24 и 25.
Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость
Резистентные тест-векторы осуществляли с помощью методик, описанных в примере 1, следующим образом. Резистентные тест-векторы изготавливали из плазмид рЬС-1исГГ-Н8, рЬС-1исП-РВ, рСС-1исГГН8 и рСС-1исГГ-РВ, утративших функциональный НГУ-ген епу, и использовали во взаимодействии с упаковывающим экспрессионным вектором рУЪ-епу4070А. Резистентные тест-векторы изготавливали из плазмид рЬ8-1исГГ-Н8, рЬ8-1исП-РВ, рС8-1исГГ-Н8 и рС8-1исГГ-РВ, кодирующих только НГУ-ген дад-ро1, и использовали во взаимодействии с рУЪ-епу4070А и либо с упаковывающими экспрессионными векторами рЬТК-НГУ3', либо с рСМУ-НГУ3'. В тестах на устойчивость, осуществляемых с использованием двух типов хозяйских клеток, 293-клеточную линию, №154-клеточную линию, №1201-клеточной линию или 23-клеточную линию ВО8С использовали в качестве упаковывающих хозяйских клеток, а немодифицированные бигка!-клеток использовали в качестве клеток-мишеней. Поскольку нефункциональные индикаторные гены с инвертированными интронами, удерживаемые в этих резистентных тест-векторах, эффективно не экспрессируются при трансфекции упаковывающих хозяйских клеток, инфицирование хо
-42005426 зяйских клеток-мишеней осуществляется либо путем сокультивирования с упаковывающими хозяйскими клетками, либо путем использования вируса из супернатанта упаковывающей хозяйской клетки. По аналогичным причинам, тесты на устойчивость, осуществляемые с помощью этих резистентных тествекторов, могут использовать единственный тип хозяйской клетки. Тесты на устойчивость, использующие единственный тип хозяйской клетки, осуществляли с использованием либо 293-, 1за54-. 1за201, ВО8С 23-, либо 1игка1-клеток.
Пример 4. Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость, не основанный на частице, с использованием резистентных тест-векторов, включающих сегмент(ы), производимый пациентом, и нефункциональный индикаторный ген А.
Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на устойчивость, не основанные на частице, осуществляли с использованием резистентных тест-векторов, включающих нефункциональный индикаторный ген либо с пермутированными промоторами, пермутированными кодирующими областями, либо с инвертированными интронами, описанными в примерах 1, 2 и 3. Эти, основанные не на частице, тесты на устойчивость осуществляли путем трансфекции единственного типа хозяйской клетки с каждым резистентным тест-вектором в отсутствие упаковывающих экспрессионных векторов. Хотя нефункциональные индикаторные гены, удерживаемые в этих резистентных тест-векторах, эффективно не экспрессируется при трансфекции хозяйских клеток, существует детектируемая экспрессия индикаторного гена, происходящая из-за обратной транскрипции, не основанной на вирусной частице. Обратная транскрипция и перенос гена приводит к преобразованию пермутированного, нефункционального индикаторного гена в не пермутированный, функциональный индикаторный ген. Поскольку обратная транскрипция полностью зависит от экспрессии гена ро1, содержащемся в каждом резистентном тест-векторе, противовирусные агенты можно протестировать на их способность ингибировать продукты гена ро1, кодируемые в сегментах, производимых пациентом, удерживаемых в резистентных тест-векторах. Тесты на устойчивость, не основанные на частице, осуществляли с помощью общепринятых методик, описанных в примере 1, с нижеследующими модификациями: 1) резистентные тест-векторы трансфицировали в подходящие хозяйские клетки, 2) противовирусные агенты или их сочетания вносили в соответствующих концентрациях в индивидуальные культуры трансфицируемых хозяйских клеток сразу после трансфекции, 3) хозяйские клетки собирали через 24-72 ч после трансфекции и проверяли на люциферазную активность. Снижение люциферазной активности наблюдали в хозяйских клетках, трансфицированных данным резистентным тест-вектором в присутствии данного противовирусного агента или агентов, в сравнении с контролем, осуществляемом в отсутствие противовирусного агента(ов), применяемого для вычисления явного ингибирующего содержания (К1) этого агента или сочетания этих агентов, для продукта вирусного гена-мишени, кодируемого в сегментах, производимых пациентом, присутствующих в резистентном тест-векторе.
Резистентный тест-вектор - конструирование
Тесты на устойчивость, не основанные на частице, изготавливали с помощью резистентных тествекторов, включающих не функциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, а резистентные тест-векторы изготавливали, как описано в примере 1, с использованием плазмид рЬС-1исРРН8, рЬ6-1исРР-РВ, рСС-1исРР-Н8, рСС-1исРР-РВ, рЬ8-1исРР-Н8, рЬ8-1исРР-РВ, рС8-1исРР-Н8 или рС81ис11-РВ. Каждый резистентный тест-вектор трансфицировали в хозяйские клетки, экспрессирующие цитоплазматическую РНК-полимеразу Т7 (например, 293/Т7КЫАР-клетки или 1игка1/Т7КМАР-клетки). Такие хозяйские клетки получали путем стабильной трансфекции 293-клеток и 1игка1-клеток, описанной в примере 1, используя плазмиду рУБ-Т7КЫАР, которая управляет экспрессией цитоплазматической РНКполимеразы фага Т7 в клетках и клеточных линиях человека и других млекопитающих. рУБ-Т7КЫАР конструировали из нижеследующих двух фрагментов ДНК: 1) 4,3 т.п.н. векторного фрагмента, изготовленного путем гидролитического расщепления экспрессионного вектора рУЪ-2 млекопитающего с помощью ЕсоК1 и Вд11, и 2) 2,6 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего полную кодирующую область РНКполимеразы Т7 (нуклеотиды 166-2815, координаты даны по СепЬапк инвентарный номер М38208, Сгасйеу апб Р1е1пеу (1984) Вюогд. КЫт. 10, 824-843), изготовленную с помощью РСК с использованием плазмиды рТ7-С1 в качестве матрицы с олигонуклеотидами 47 и 40 в качестве праймеров, с последующим гидролитическим расщеплением с помощью ЕсоК1 и ВдШ. Олигонуклеотид 47 включает в себя уникальный ЕсоК1-сайт с последующей консенсусной последовательностью эукариотической инициации трансляции (например, Кохак (1991) 1. Вю1. Сйет. 266, 19867-19870), а олигонуклеотид 40 включает в себя уникальный ВдШ-сайт.
Тесты на устойчивость, не основанные на частице, осуществляли с помощью резистентных тествекторов, включающих не функциональный индикаторный ген с пермутированной кодирующей областью, а резистентные векторы изготавливали, как описано в примере 1, с использованием плазмид рБС1исРС-Н8, рЬ6-1исРС-РВ, рСС-1исРС-Н8, рСС-1исРР-РВ, рЬ8-1исРС-Н8, рЬ8-1исРС-РВ, рС8-1исРС-Н8, рС8-1исРС-РВ, рЬ6-1исП-Н8, рЬ6-1исП-РВ, рСС-1ис11-Н8, рСС-1ис11-РВ, рЬ8-1исП-Н8, рЬ8-1исП-РВ, рС81ис11-Н8 или рС8-1ис11-РВ. Каждый резистентный тест-вектор трансфицировали либо в 293-, 1за54-, 1за201-, ВО8С 23- или 1игка1-клетки.
-43005426
Пример 5. Тест на ШУ-лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием резистентных тест-векторов, включающих сегмент(ы), производимые пациентом, и функциональный индикаторный ген А.
Индикаторный ген вирусного вектора. - Функциональный индикаторный ген
Геномные вирусные векторы с индикаторным геном, с акцепторными свитами последовательности пациента, плазмидами рЬ6-1ис-Н8-1, рЬ6-1ис-Н8-2, рЬ6-1ис-РВ-1, рЬ6-1ис-РВ-2, рС6-1ис-Н8-1, рС6-1исН8-2, рСС-1ис-РВ-1 и рСС-1ис-РВ-2, резистентные тест-векторы, получаемые из них, каждый, содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3' (фиг. 6): 1) И3-область ШУ-БТИ (рЕ6-1ис-Н8-1, рЬ6-1исН8-2, рЕ6-1ис-РВ-1 и рЕ6-1ис-РВ-2) или первый энхансер-промотор ΙΕ СМУ (рС6-1ис-Н8-1, рС6-1исН8-2, рС6-1ис-РВ-1 и рС6-1ис-РВ-2), 2) Κ- и И5-области ШУ-БТИ, 3) кодирующие области ШУ-генов дад-ро1, νίί, ург, 1аЕ гет, νρи, делетируемого еп\г и пе£, 4) кассету индикаторного гена, инсерцируемую в делетируемый ген епт, и 5) 3ЕТЕ ШУ. рЬ6-1ис-Н8-1, рЬ6-1ис-Н8-2, рС6-1ис-Н8-1 и рС6-1ис-Н8-2 содержат уникальные акцепторные сайты ΗρаI и 8аП последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам НХВ2 2243 и 4190; рЕ6-1ис-РВ-2, рС6-1ис-РВ-1 и рС6-1ис-РВ-2 содержат уникальные акцепторные сайты РуШ и ВатН последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам НХВ2 2221 и 4212 (см. в подробностях пример 1). Кассеты индикаторного гена каждой плазмиды содержат 1) второй энхансер-промотор СМУ, 2) кодирующую область люциферазного гена и 3) последовательность полиаденилирования 8У40. Кассеты индикаторного гена рЬ6-1ис-Н8-1, рЬ6-1ис-РВ-1, рС6-1ис-Н8-1 и рСС-1ис-РВ-1 инсерцированы в вектор в транскрипционной ориентации, противоположной транскрипционной ориентации вирусных БТР или первого энхансер-промотора СМУ (фиг. 6В), а кассеты индикаторного гена рЬ6-1ис-Н8-2, рЕ6-1ис-РВ-2, рС6-1ис-Н8-2 и рС6-1ис-РВ-2 инсерцированы в вектор в той же ориентации (фиг. 6С).
Субгеномный вирусные векторы с индикаторным геном с акцепторными свитами последовательности пациента рЬ8-1ис-Н8-1, рЬ8-1ис-Н8-2, рЕ8-1ис-РВ-1, рЕ8-1ис-РВ-2, рС8-1ис-Н8-1, рС8-1ис-Н8-2, рС81ис-РВ-1 и рС8-1ис-РВ-2 и резистентные тест-векторы, производимые из них, каждый, содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3' (фиг. 6): 1) И3-область ШУ-БТИ (рЕ8-1ис-Н8-1, рЬ8-1ис-Н8-2, рЬ8-1ис-РВ-1 и рЬ8-1ис-РВ-2) или первый ΙΕ СМУ энхансер-промотор (рС8-1ис-Н8-1, рС8-1ис-Н8-2, рС81ис-РВ-1 и рС8-1ис-РВ-2), 2) Κ- и И5-области ШУ-Ш, 3) кодирующую область ШУ-гена дад-ро1, 4) кассету индикаторного гена, 5) ΚΚΕ-элемент ШУ-гена епт, содержащий вирусную упаковывающую последовательность, и 6) 3'-ΕΈΚ ШУ. рЕ8-1ис-Н8-1, рЬ8-1ис-Н8-2, рС8-1ис-Н8-1 и рС8-1ис-Н8-2 содержат уникальные акцепторные сайты ΗρаI и 8аП последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам НХВ2 2243 и 4190; рЕ8-1ис-РВ-1, рЕ8-1ис-РВ-2, рС8-1ис-РВ-1 и рС8-1ис-РВ-2 содержат уникальные акцепторные сайты РуШ и ВатШ последовательности пациента, соответственно, по нуклеотидам НХВ2 2221 и 4212. Кассеты индикаторного гена каждой плазмиды содержат 1) второй энхансер-промотор СМУ, 2)полную кодирующую область люциферазного гена и 3) последовательность полиаденилирования 8У40. Кассеты индикаторного гена рЬ8-1ис-Н8-1, рЬ8-1ис-РВ-1, рС8-1ис-Н8-1 и рС8-1ис-РВ-1, инсерцированы в вектор в транскрипционной ориентации, противоположной транскрипционной ориентации вирусных БТР или первого энхансер-промотора СМУ (фиг. 6В), а кассеты индикаторного гена рЬ8-1исН8-2, рЕ8-1ис-РВ-2, рС8-1ис-Н8-2 и рС8-1ис-РВ-2 инсерцированы в вектор в той же ориентации (фиг. 6С).
Плазмиды рЕ6-1ис-Н8-1 и рЕ6-1ис-Н8-2, рЕ6-1ис-РВ-1 и рЕ6-1ис-РВ-2, рС6-1ис-Н8-1 и рС6-1исН8-2, рС6-1ис-РВ-1 и рС6-1ис-РВ-2, рЬ8-1ис-Н8-1 и рЕ8-1ис-Н8-2, рЬ8-1ис-РВ-1 и рЕ8-1ис-РВ-2, рС8-1исН8-1 и рС8-1ис-Н8-2, рС8-1ис-РВ-1 и рС8-1ис-РВ-2, каждую, изготавливали из двух фрагментов ДНК: 1) векторной ДНК, изготовленной путем гидролитического расщепления либо рЬ6-1исП-Н8, рЬ6-1исП-РВ, рС6-1исП-Н8, рС6-1исП-РВ, рЕ8-1ис-Н8, рЬ8-1исП-РВ, рС8-1исП-Н8 и рС8-1исП-РВ соответственно с помощью №б и обработки результирующих векторов щелочной фосфатазой, и 2) 3,0 т.п.н. фрагмента ДНК, содержащего кассету люциферазного индикаторного гена, изготовленного путем гидролитического расщепления рУБ-1ис с помощью ΝθίΕ Клоны, содержащие кассету индикаторного гена, инсерцируемого в данный вирусный вектор в обоих транскрипционных ориентациях по отношению к вирусным БТЕ, идентифицировали с помощью рестрикционного картирования (например, рБС-1ис-Н8-1 и рБС-1ис-Н82).
Резистентный тест-вектор - конструирование
Резистентные тест-векторы, содержащие функциональный индикаторный ген, конструировали с использованием ШУ-геномных и субгеномных вирусных векторов, включающих противовирусные гены-мишени, описанные в примере 1. Резистентные тест-векторы изготавливали из вышеуказанных плазмид (фиг. 6) с помощью методики, описанной в примере 1. Резистентные тест-векторы конструировали с помощью векторов изготовленных из плазмид рЕ6-1ис-Н8-1, рЬ6-1ис-Н8-2, рС6-1ис-Н8-1, рС6-1ис-Н8-2, рЬ8-1ис-Н8-1, рЬ8-1ис-Н8-2, рС8-1ис-Н8-1 или рС8-1ис-Н8-1 с использованием амплифицируемых последовательностей пациента, с помощью олигонуклеотидов 18 и 19 и с помощью олигонуклеотидов 22 и 23. Резистентные тест-векторы изготавливали из плазмид рЕ8-1ис-РВ-1, рЕ6-1ис-РВ-2, рС6-1ис-РВ-1, рС61ис-РВ-2, рЕ8-1ис-РВ-1, рЕ8-1ис-РВ-2, рС8-1ис-РВ-1 или рС8-1ис-РВ-1 с использованием амплифицируе
-44005426 мых последовательностей пациента, изготовленных с помощью олигонуклеотидов 20 и 21 и с помощью олигонуклеотидов 24 и 25.
Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на резистентность осуществляли с помощью методик, описанных в примере 1, следующим образом. Резистентные тест-векторы, изготовленные из плазмид рЬС-1ис-Н8-1, рБС-1ис-Н8-2, рЬС-1исРВ-1, рЬС-1ис-РВ-2, рСС-1ис-Н8-1, рСС-1ис-Н8-2, рСС-1ис-РВ-1 и рСС-1ис-РВ-2, утратили функциональный ШУ-ген епу и используются во взаимодействии с упаковывающим экспрессионным вектором рУБепу4070А. Резистентные тест-векторы, изготовленные из плазмид рБ8-1ис-Н8-1, рБ8-1ис-Н8-2, рБ8-1исРВ-1, рБ8-1ис-РВ-2, рС8-1ис-Н8-1, рС8-1ис-Н8-2, рС8-1ис-РВ-1 и рС8-1ис-РВ-2, кодируют только продукты ШУ-гена дад-ю! и используются во взаимодействии с рУБ-епу4070А и с упаковывающими векторами либо с рБТК-Н1У3', либо с рСМУ-ШУ3'. Тесты на устойчивость осуществляли с двумя типами хозяйских клеток, используя 293-клеточную линию, ΐ8а54-клеточную линию, ΐ8а201-клеточную линию или 23клеточную линию ВО8С в качестве упаковывающих хозяйских клеток и используя немодифицированные ЛикаЕклетки в качестве клеток-мишеней. Инфицирование клеток-мишеней этих или других резистентных тест-векторов, содержащих функциональные индикаторные гены, осуществляли, используя методику для инфицирования резистентных тест-векторных вирусных частиц из отфильтрованных супернатантов, полученных из резистентных тест-векторных индикаторных хозяйских клеток, как описано в примере 1. По сравнению с резистентными тест-векторами, включающими нефункциональные вирусные векторы с индикаторным геном, с пермутированным промотором или инвертированным интроном, эти включающие функциональные индикаторные гены обычно способны экспрессировать свои индикаторные гены в трансфицированных упаковывающих хозяйских клетках. Ни методика сокультивирования, ни тест на устойчивость с использованием единственного клеточного типа не могут по этой причине легко адаптироваться к инфицированию клеток-мишеней с использованием резистентных тест-векторов с функциональными индикаторными генами, так как было бы трудно различать экспрессию индикаторного гена в инфицированных хозяйских клетках-мишенях и трансфицированных упаковывающих хозяйских клетках.
Все ссылки на публикации и патентные заявки в настоящем описании включены здесь путем ссылки на их полноту, как если бы каждая индивидуальная публикация или патентная заявка была указана специально или индивидуально для включения её путем ссылки.
Специалистам в данной области, к которой относится настоящее изобретение, очевидно, что представленное изобретение может быть вариантом осуществления настоящего изобретения в формах иных, чем в формах специфически раскрытых выше, например для осуществления лекарственной чувствительности и устойчивости тестируемых на других вирусах, не выходя за рамки существа настоящего изобретения и характеристик настоящего изобретения. Отдельные варианты осуществления настоящего изобретения, описанные выше, по этой причине рассматриваются в качестве иллюстративных и не ограничивающих. Объем настоящего изобретения сформулирован в прилагаемой формуле изобретения и не ограничен примерами, содержащимися в вышеприведенном описании.
Пример 6. Тест на ШУ-лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием резистентных тест-векторов, включающих сегмент(ы) и функциональный индикаторный ген А.
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на резистентность осуществляли с резистентными тест-векторами, основанными на вирусных векторах с индикаторным геном рСС-СХС^Б-1исР)2 и рСС-СХАТ(Е-1исР)2, которые оба сходны с рСС-1ис-2, описанном в примере 5, использующем два типа хозяйской клетки. Что касается рСССXСN(Е-1исР)2, индикаторный ген вирусного вектора модифицировали в том плане, что кассета индикаторного гена, утратившая интрон А (СМУ/а-глобиновый интрон, описанный выше), не содержит сигнала полиаденилирования и вышерасположенная 3' И5-последовательность не была включена в данную конструкцию. Вышерасположенную И5 заменили на рο1уА-сигнал 8У40 и области начала репликации. Индикаторный ген вирусного вектора рСС-СХАТ(Б-1исР)2 отличается от рСС-СXСN(Е-1исР)2 в том плане, что кассета индикаторного гена содержит искусственный интрон выше энхансер-промотора СМУ и области ТК-сигнала полиаденилирования. Резистентный тест-вектор вирусных частиц изготавливали с помощью первой хозяйской клетки (резистентный тест-вектор хозяйской клетки), который изготавливали путем трансфекции упаковывающей хозяйской клетки резистентным тест-вектором и упаковывающим экспрессионным вектором. Резистентный тест-вектор вирусных частиц использовали затем для заражения второй хозяйской клетки (хозяйская клетка-мишень), в которой измеряли экспрессию данного индикаторного гена.
Тесты на лекарственную чувствительность/устойчивость с ΛΖΈ
Конструировали резистентный тест-вектор рСС-1ис-2, содержащий кассету функционального люциферазного гена, и трансфицировали хозяйские клетки резистентной тест-векторной ДНК. Резистентные тест-векторы, содержащие тест-последовательности обратной транскриптазы, производимые пациентом, которые чувствительны или устойчивы к нуклеозидному ингибитору, АΖТ (81дта), обратной транскриптазы. Резистентный тест-вектор вирусных частиц, изготовленный путем трансфекции резистентной тест-векторной ДНК в хозяйские клетки, использовали для заражения хозяйских клеток
-45005426 мишеней, выращенных в отсутствие ΑΖΤ или в присутствии увеличивающихся концентраций данного лекарственного препарата (диапазон от приблизительно 0,0001 до 1000 мкМ). Количество люциферазной активности, продуцируемой в инфицированных хозяйских клетках-мишенях в присутствии лекарственного препарата, сравнивали с количеством люциферазы, продуцируемой в инфицированных хозяйских клетках-мишенях в отсутствие лекарственного препарата. Лекарственную устойчивость измеряли в виде количества лекарственного препарата, необходимого для ингибирования 50% люциферазной активности, детектируемой в отсутствие лекарственного препарата (ингибируюшая концентрация 50%, ГС50). Значения ГС50 определяли с помощью кривой отражающей процент ингибирования от 1од10-концентрации лекарственного препарата.
Хозяйские клетки (293) высевали в чашку Петри диаметром 10 см и трансфицировали несколькими днями спустя после помещения тест-векторной плазмидной ДНК и оболочечного экспрессионного вектора рСХА8(4070А-еиу). Трансфекции осуществляли с использованием кальций-фосфатной методики преципитации. Клеточную культуральную среду, содержащую ДНК-преципитат, заменяли на свежую среду от 1 до 24 ч после трансфекции. Клеточную культуральную среду, содержащую резистентные тествекторные вирусные частицы, собирали через один-четыре дня после трансфекции и пропускали через 0,45 мм фильтр для сохранения при -80°С. Уровни НГУ-капсидного белка (р24) в собранной клеточной культуральной среде определяли с помощью ЕГА-метода как описано у производителей (8ГАС; Егейепск, ΜΌ). За 6-8 ч до инфицирования клетки-мишени (293 и 293/Т) помещали в чашку с клеточной культуральной средой, не содержащей ΑΖΤ или содержащей последовательные двукратные разведения ΑΖΤ, начиная со 100 мкМ и заканчивая 0,0005 мкМ. Концентрации ΑΖΤ поддерживали в течение инфицирования. Хозяйские клетки-мишени инокулировали с 90 мкл трансфицируемого супернатанта резистентного тест-вектора хозяйской клетки. Контроль за инфицированиями осуществляли с использованием клеточной культуральной среды из контролей к трансфекциям (без ДНК) или из трансфекций, содержащих резистентную тест-векторную плазмидную ДНК без оболочечной экспрессионной плазмидной ДНК (рСXΑ§(4070Α-еην)). Через 1-24 ч после инокуляции в каждую ячейку вносили свежую среду. Через 1236 ч спустя эту среду полностью заменяли свежей средой. Через один-три или более дней после инфекции эту среду удаляли, в каждую ячейку вносили буфер для клеточного лизиса (Рготеда). Клеточные лизаты разбавляли в 100 раз буфером для лизиса и каждый разбавленный клеточный лизат проверяли на люциферазную активность (фиг. 7 А). Ингибирующий эффект ΑΖΤ определяли, используя нижеследующее уравнение:
% люциферазного ингибирования = 1 - (ΕΕυ1ιΚ|ΛΖ·|·| - КЬШис), где ΚΕυ1πηΑΖΤ] представляет собой относительную световую единицу люциферазной активности в инфицированных клетках в присутствии ΑΖΤ, а КЕЫис представляет собой относительную световую единицу люциферазной активности в инфицированных клетках в отсутствие ΑΖΤ. Значения ГС50 получали из сигмоидальных кривых, которые были образованы по данным кривой процентного ингибирования люциферазной активности уз. Ьод10-концентрации лекарственного препарата. Кривые ингибирования ΑΖΤ показаны на (фиг. 7В).
Тест на лекарственную чувствительность/устойчивость невирапина.
Резистентный тест-вектор, основанный на вирусном векторе, с индикаторным геном, рСС-СХСЫ(Е1исР)2, содержащий обратнотранскриптазную последовательность, производили из биологически активного провирусного клона, рИЕ4-3, который чувствителен к не нуклеозидному ингибитору обратной транскриптазы, невирапину (ВГ-КС-587, ВоеЬпидег Гид1еНе1т). Трансфекция хозяйских упаковывающих клеток и инфицирование хозяйских клеток-мишеней осуществляли, как описано выше для тестов на лекарственную чувствительность/устойчивость ΑΖΤ. Невирапиновую чувствительность/устойчивость оценивали, используя невирапиновые концентрации в диапазоне от 0,0001 до 100 мкМ. Кривую ингибирования невирапина определяли как описано выше для ΑΖΤ и показано на фиг. 7С.
Тесты на лекарственную чувствительность/устойчивость индинавира.
Резистентный тест-вектор, основанный на вирусном векторе с индикаторным геном рСС-СХСЫ(Е1исР)2 содержит протеазную последовательность, произведенную из биологически активного провирусного клона рЫЕ4-3, который чувствителен к протеазному ингибитору индинавиру (МК-639, Мегск). Трансфекцию хозяйских упаковывающих клеток и инфицирование хозяйских клеток-мишеней осуществляли, как описано для теста на лекарственную чувствительность/устойчивость ΑΖΤ, за тем исключением, что данный протеазный ингибитор индинавир присутствовал в культурах трансфицируемых упаковывающих хозяйских клеток, а также в культурах инфицируемых хозяйских клетках-мишенях, как описано выше. Чувствительность/устойчивость к индинавиру оценивали, используя концентрации индинавира в диапазоне от 1,5 пМ до 3 мкМ. Кривую ингибирования индинавира определяли, как описано выше для ΑΖΤ и показано на фиг. 7Ό.
Пример 7. Гепатит-тест на лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием тествекторов, включающих сегмент(ы), производимый пациентом, и нефункциональный индикаторный ген, содержащий инвертированный интрон.
-46005426
Индикаторный ген вирусного вектора - конструирование
Вирусные векторы с индикаторным геном, содержащие нефункциональный индикаторный ген с инвертированным интроном, конструировали с использованием субгеномных вирусных векторов ΗΒν, включающих вирусные гены, которые являются мишенью(ями) противовирусных лекарственных препаратов. Вирусные векторы ρСδ-ΗΒV(NΡ-Ю)ΐΐ(ΡδΑδ-) с индикаторным геном основаны на субгеномном вирусном векторе ρСδ-ΗΒV. Вирусный вектор с индикаторным геном содержит кассету нефункционального индикаторного гена, содержащую инвертированный интрон и все цис-действующие регуляторные элементы, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν, т.е. ОК1, 5'ε ОК2, ОК1*, 3'рА, но утратили генные последовательности ΗΒν (т.е. гены С, Р, δ, X), которые обеспечивают трансдействующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν и для образования вирусных частиц (фиг. 8В). Гены С, Р, δ и Х и акцепторные сайты последовательности пациента, содержатся в упаковывающем векторе рРК-СРХ (описываемые ниже, фиг. 8Ό) и рРК-3 (описываемый ниже, фиг. 8Е). В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор ρСδ-ΗΒV(NΡΐΟ)ΐΐ-(ΡδΑδ-) с индикаторным геном и упаковывающий вектор рРК-СРХ составляют резистентную тествекторную систему. Нефункциональный индикаторный ген вирусного вектора ρСδ-ΗΒV(NΡ-Ю)ΐΐ(ΡδΑδ-) содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': 1) энхансер-промоторную область ΐΕ СΜV, 2) 5'-область ΗΒν-генома ОК1 и 5'-копию капсидированной сигнальной области (ε) (кодон инциации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован), 3) кассету нефункционального индикаторного гена, в котором ОКЕ индикаторного гена содержит инвертированный интрон, 4) область ΗΒν-генома, содержащую ОК2, ОК1*, 3'ε и 3'-область сигнала полиаденилирования (рА) ΗΒν. Экспрессионная кассета нефункционального индикаторного гена включает некоторые или все нижеследующие элементы, выстроенные в направлении 5' к 3': (1) транскрипционную область энхансер-промотора, (2) интрон, (3) индикаторный ген, содержащий инвертированный интрон, (4) транскрипционные последовательности сигнала полиаденилирования (например, δν40), (тимидинкиназный ген Ηδν-1). Экспрессионная кассета индикаторного гена имеет направление транскрипции, противоположное направлению последовательности элементов ΗΒν (фиг. 8В). Однако интрон в ОКЕ индикаторного гена обладает той же транскрипционной ориентацией, что и последовательность элементов ΗΒν.
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения, вирусный вектор ρСδ-ΗΒV(NЕΐΟ)ΐΐ(ΡδΑδ+) с индикаторным геном содержит кассету нефункционального индикаторного гена, все цисдействующие регуляторные элементы которого необходимы для репликации ДНК ΗΒν, и некоторые или генные последовательности ΗΒν (т.е. гены С, Р, δ, X), которые обеспечивают транс-действующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν и образования вирусных частиц (фиг. 8Е). Резистентные тест-векторы, произведенные из вирусного вектора ρСδ-ΗΒV(NЕΐΟ)ΐΐ(ΡδΑδ+) с индикаторным геном, содержат акцепторные сайты последовательности пациента (ΡδΑδ) и используются во взаимодействии с упаковывающим вектором ρΡΚ-ί,’δΧ (фиг. 8Н). В этом варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор с индикаторным геном может также обеспечивать некоторые или все упаковывающие функции, такие как Р. Структурные и ферментативные операции, которые не обеспечиваются вирусным вектором с индикаторным геном, но которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν и образования вирусных частиц, создаются с использованием упаковывающего вектора(ов) ρΡΚ-ί,’δΧ (описываемый ниже, фиг. 8Н). В данном варианте осуществления вирусный вектор ρСδ-ΗΒV(NΡ-Ю)ΐΐ(ΡδΑδ+) с нефункциональным индикаторным геном содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': 1) ΐΕ-область энхансер-промотора СΜV, 2) 5'-область ΗΒν-генома и ОК1 и 5'ε (кодон инициации трансляции пре-С ОКЕ элиминирован), 3) кассету индикаторного гена, содержащую инвертированный интрон, расположенный в данной области Βν-генома, который может содержать некоторые или все гены С, Р, δ и X, а также Р-генный сегмент, производимый пациентом, 4) область ΗΒν генома, содержащую ОК2, ОК1*, 3'ε и 3Аобласть сигнала рА ΗΒν. В вирусном векторе ρСδ-ΗΒV (ΝΡ-Ю) ΐΐ-(ΡδΑδ+) с нефункциональным индикаторным геном экспрессируемая кассета индикаторного гена обладает транскрипционной ориентацией, противоположной транскрипционной ориентации последовательности элементов ΗΒν (фиг. 8Е). Однако интрон в ОКЕ данного индикаторного гена обладает той же транскрипционной ориентацией, что и данная последовательность элементов ΗΒν.
В трансфицируемых клетках указанные упаковывающие векторы (фиг. 8Ό, 8Е и 8Н) обеспечивают транс, структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν и образования вирусных частиц, но которые не создаются с помощью резистентного тест-вектора или вирусного вектора с индикаторным геном. В данном варианте осуществления настоящего изобретения, в котором вирусный вектор, такой как ρСδ-ΗΒV(NЕ-Ю)ΡΡ-(ΡδΑδ-) с индикаторным геном, котрансфицировали с упаковывающим вектором, таким как рРК-СРХ; сочетание этих векторов составляет систему резистентного тест-вектора, он представляет собой упаковывающий вектор, который содержит акцепторные сайты последовательности пациента для инсерцирования Р-генного сегмента, производимого пациентом (описан выше). Упаковывающий вектор рРК-СРХ содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': 1) ΐΕ-область энхансер-промотора СΜV, 2) область ΗΒν-генома, заполняющая от С-кодона инициации трансляции ОКЕ до 3'-сигнала рА и включающая гены С, Р, δ и X. С-ген упаковывающих векторов
-47005426 модифицировали так, чтобы он не содержал и/или не экспрессировал пре-С последовательности ОКЕ и не экспрессировал 3-белки (описываемые ниже).
В ΗΒν, РНК, которая кодирует С- и/или Р-белки, предпочтительно упакована в цис и, следовательно, могла бы препятствовать эффективной упаковке резистентного тест-вектора, содержащего нефункциональный индикаторный ген или векторную РНК вируса, с нефункциональным индикаторным геном, который не кодирует С- и Р-белки. Избрали две стадии для предотвращения капсидирования РНК, полученной из упаковывающих векторов и для улучшения капсидирующей эффективности резистентного тест-вектора или вирусной векторной ДНК с нефункциональным индикаторным геном. Во-первых, РНК, продуцируемая с помощью упаковывающих векторов, не содержит 5'-капсидирующую сигнальную область (ε) (фиг. 8Ό, 8Е и 8Н). Во-вторых, в случае, когда либо С-генную, и/либо Р-генную упаковывающие функции создавали с помощью резистентного тест-вектора или вирусного вектора с нефункциональным индикаторным геном, использовали упаковывающие векторы, такие как ρΡΚ-8 или ρΡΚ^8Κ, которые не экспрессируют С- и/или Р-генные продукты (фиг. 8Е и 8Н).
Резистентные тест-векторы - конструирование
Резистентные тест-векторы изготавливали путем 1) модификации вирусного вектора ρС8-ΗΒV(NЕΙ6)ΙΙ-(Ρ8Α8-) с индикаторным геном путем интродуцирования уникальных сайтов рестрикции, именуемых акцепторными сайтами последовательности пациента (Ρ8Α8) в Р-генной области, 2) амплификации сегментов, производимых пациентом, корреспондирующих с ΗΒν-мишенью лекарственного препарата, например обратной транскриптазой или ДНК-полимеразой, с помощью амплификации вирусной ДНК, присутствующей в сыворотке или клетках инфицированных пациентов, и 3) инсерцирования амплифицируемых последовательностей точно в вирусные векторы с индикаторным геном по акцепторным сайтам последовательности пациента (фиг. 8Е). Альтернативно, резистентные тест-векторные системы изготавливали путем 1) модификации упаковывающих векторов рРИ-СРХ путем итродуцирования акцепторных сайтов последовательности пациентов в Р-ген, 2) амплификации сегментов, производимых пациентом, корреспондирующих с ΗΒν-мишенью лекарственного препарата, например обратной транскриптазой или ДНК-полимеразой, с помощью амплификации с использованием вирусной ДНК, присутствующей в сыворотке или клетках инфицированных пациентов, и 3) инсерцирования амплифицируемых последовательностей точно в упаковывающие векторы по акцепторным сайтам пациента (фиг. 8Ό). В первом варианте осуществления настоящего изобретения 5'-Ρ8Α8 находится вблизи границы спейсера и КТдоментов Р-белка (выше, сразу за сайтом инициации трансляции 8-белка), а 3'-Ρ8Α8 находится вблизи Стерминального конца Н-домена РНК Р-белка. Инсерция сегмента Р-гена, производимого пациентом, в акцепторные сайты последовательности пациента приводит к образованию химерной Р-генной последовательности, в которой ТР и спейсерные домены кодируются с помощью векторной Р-генной последовательности, тогда как обратная транскриптаза/полимераза и РНК Н-доменов кодируются с помощью сегментов, производимых пациентом (фиг. 8Ό и 8Е).
В ΗΒν полная ОКЕ 3-гена перекрывает ОКЕ Р-гена, но экспрессируется с использованием отличающейся рамки считывания Ща88а1, Μ. апб 8сйа11ег, Η. (1993) Тгепбз ш МюгоЬюЦду 1, 221-228). Поэтому Р-генные последовательности ΗΒν (обратная транскриптаза и РНК Н-доментов), полученные от пациентов, также содержат корреспондирующие последовательности 8-гена пациента. Экспрессию 8генной области, производимой пациентом, от перекрывания ОКЕ 8-гена предотвращали путем элиминирования сайтов инициации трансляции трех ОКЕ 8-гена (рге-31, рге-32 и 8) и/или интродуцирования внутрирамочных кодонов терминации в векторы ρС8-ΗΒV(NЕ-Ю)II-(Ρ8Α8+) или рРΚ-СРΚ (фиг. 8Е и 8Ό). Обеспечивали экспрессию 8-гена в транс, используя отдельный упаковывающий вектор, который создает хорошо характеризуемые продукты 8-гена (фиг. 8Е и 8Н). Модификации, которые исключают экспрессию 8-гена, осуществляли без интродуцирующих изменений с перекрыванием аминокислотных последовательностей, которые кодируются с помощью терминального белка (ТР) или спейсерных доментов Р-гена.
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость осуществляли с резистентным тествектором, основанном на вирусных векторах с индикаторным геном ρС8-ΗΒV (№-ГК) ΙΙ-(Ρ8Α8+) или с резистентной тест-векторной системой, основанной на вирусном векторе с индикаторным геном ρС8ΗΒν (№-Ю) ΙΙ-(Ρ8Α8-) и упаковывающем векторе рРЕ-СРХ с использованием либо одного типа хозяйской клетки, либо двух типов хозяйской клетки. Котрансфекцию упаковывающих хозяйских клеток либо с резистентным тест-вектором, таким как ρС8-ΗΒV(NЕ-Ю)II-(Ρ8Α8+), и упаковывающим вектором ρΡΚС8Х, либо с вирусным вектором с индикаторным геном, таким как ρС8-ΗΒV(NЕ-Ю)II-(Ρ8Α8-), и упаковывающим векторсодержащем сегментом, производимом пациентом, таким как рРИ-СРХ (т.е. резистентная тест-векторная система), производят ΗΒν-вирусные частицы, содержащие капсидированную прегеномную РНК индикаторного гена, которые в результате сплайсинга инвертированного интрона, содержат функциональный индикаторный ген (фиг. 8В и 8С).
Воспроизведение трансфекций осуществляли в сериях культур упаковывающих клеток, поддерживаемых либо в отсутствие противовирусного лекарственного препарата, либо в увеличивающихся концентрациях противо-НВV-лекарственного препарата (например, ингибитора обратной транскриптазы
-48005426 или полимеразы Р-белка ΗΒν). После выдерживания упаковывающих хозяйских клеток в течение нескольких дней в присутствии или отсутствие противо-НВV-лекарственного препарата, уровень лекарственной чувствительности или устойчивости можно оценивать либо прямо в лизатах упаковывающих клеток, либо в выделенных ΗΒν-частицах, полученных путем сбора хозяйской упаковывающей клетки культуральной среды. Можно использовать альтернативные подходы для оценки лекарственной чувствительности и устойчивости в клеточных лизатах и выделенных ΗΒν-частицах.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения отнесенному к так называемому одноклеточному анализу, лекарственную чувствительность и устойчивость оценивали путем измерения экспрессии индикаторного гена, например люциферазной активности, в трансфицируемых хозяйских клетках в присутствии или отсутствие противовирусного лекарственного препарата. Снижение люциферазной активности наблюдали в клетках, трансфицируемых в присутствии данного противовирусного агента или сочетания агентов, в сравнении с контролем, осуществляемом в отсутствие противовирусного агента(ов), обычно связанного с 1од концентрации противовирусного агента в виде сигмоидальной кривой.
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения, отнесенному к так называемому двухклеточному анализу, лекарственную чувствительность и устойчивость оценивали путем измерения экспрессии индикаторного гена после инфицирования или трансфекции, соответственно ΗΒν-частицами или ДНК ΗΒν-частиц. ΗΒν-вирусные частицы получали из упаковывающих хозяйских клеток, используемых для заражения хозяйских клеток-мишеней, или ДНК из этих частиц, использованных для трансфекции хозяйских клеток-мишеней. Во время инфицирования или трансфицирования в клеточную культуру вносили соответствующую концентрацию противовирусного лекарственного препарата. Через несколько дней после инфицирования или трансфицирования хозяйские клетки-мишени лизировали и измеряли экспрессию индикаторного гена. Снижение экспрессии индикаторного гена наблюдали для клеток, трансфицированных или инфицированных в присутствии лекарственных препаратов, которые ингибируют репликацию ΗΒν, например, путем ингибирования активностей либо обратной транскриптазы (-цепь ДНК), либо ДНК-полимеразы (+цепь ДНК) Р-белка ΗΒν в сравнении с контролем, осуществляемом в отсутствие лекарственного препарата.
В третьем варианте осуществления настоящего изобретения, отнесенном к так называемому анализу структуры ДНК индикатора, лекарственную чувствительность или устойчивость оценивали путем измерения уровня репликации ДНК ΗΒν, который возникает в трансфицированных упаковывающих хозяйских клетках или в вирусных частицах, продуцируемых упаковывающими хозяйскими клетками. В трансфицируемых хозяйских клетках субгеномный ΗΒν-вирусный вектор транскрибируется и РНКтранскрипт упаковывается в виде прегеномной РНК. В течение вирусного созревания эта прегеномная РНК преобразовывается в раскрученную кольцевую форму геномной ДНК (гс-ДНК), состоящую из полной минус-цепи и частичной плюс-цепи ДНК-копии. В последующей стадии гс-ДНК преобразовывали в форму замкнутой ковалентно-непрерывной кольцевой ДНК (сскДНК). Для измерения репликации ДНК ΗΒν конструировали амплификационные праймеры для амплификации структуры ДНК ΗΒν, которая формировалась путем сплайсинга прегеномной РНК и преобразования этой сплайсированной РНК в формы гс-ДНК и сскДНК.
Образование корректной амплификационной структуры-мишени в ΗΒν-частицах нуждается в успешной полной репликации ДНК ΗΒν, приводящей к формированию гс-ДНК и сскДНК. Противовирусные лекарственные препараты, которые ингибируют репликацию ДНК ΗΒν (активности обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы), будут ограничивать формирование последовательности ДНКмишени, которая, в свою очередь, может быть измерена в виде снижения амплифицируемого ДНКпродукта с использованием ряда количественных амплификационных анализов. В одном из примеров (фиг. 10В), связывающий участок обратного праймера (Рг) разделяли на два компонента с помощью интронной последовательности, которую инсерцировали в ОВР в той же транскрипционной ориентации, что и ΗΒν-последовательности. Праймерсвязывающий участок прямого праймера (РГ) локализовали в области вирусного вектора, который фланкировали с помощью ΌΒ2- и ΌΒ1 ^последовательностей. В линеаризованном ΗΒν-векторе праймеры РГ и Рг управляют ДНК-синтезом в противоположных направлениях и ориентируют наружу относительно друг друга. В этом случае, Рг-праймер направляет ДНКсинтез вверх (к 5'-копии (ε)), а РГ-праймер направляет ДНК-синтез вниз (к 3'(ε)). Это выстраивание праймеров и матрицы не определяет функциональную амплификационную единицу в линеаризованном вирусном векторе с индикаторным геном. К тому же, Рг-связывающий участок не интактен в линеаризованном несплайсированном векторе и поэтому Рг не будет отжигать ДНК-мишень. Напротив, РГ- и Ргпраймеры, принимающие ориентацию внутрь по отношению друг к другу в раскрученной кольцевой форме ДНК ΗΒν, обнаружены в зрелых вирионах и, сплайсируя РНК-прегеном, собирают интактный Ргпраймерный связывающий участок. Оба праймера теперь направляют синтез ДНК в направлении к единственной копии ΌΒ1, плюс-цепи копии гс-ДНК и в сскДНК - либо в плюс-, либо в минус-цепи. Данное выстраивание праймеров и матрицы определяет функциональную амплификационную единицу (фиг. 10С).
-49005426
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения анализа ДНКпоследовательности индикатора (фиг. 9Ό) измеряли 5'-экзонуклеазную активность фермента амплификации (например, Тац-полимеразы), а не продукцию амплифицируемой ДНК (С. Не1б с соавт., 1996. Сепоте Векеагск 6:986-994). 5'-экзонуклеазную активность измеряли путем мониторинга нуклеолитического расщепления флуоресцентно меченной олигонуклеотидной пробы (зонда), которая способна связываться с областью амплифицируемой ДНК-матрицы, фланкированной с помощью РТ- и Рг-связывающих участков. Выполнение этого анализа зависит от непосредственной близости 3'-конца вышележащего праймера (РТ) к 5'-концу данной олигонуклеотидной пробы. Когда РТ-праймер удлинен, он вытесняет 5'конец данной олигонуклеотидной пробы так, чтобы 5'-экзонуклеазная активность полимеразы расщепляла данную олигонуклеотидную пробу. Цель интрона заключается в дистанцировании РТ-связывающего участка достаточно далеко от 5'-конца последовательности экзонуклеазной пробы для существенного удаления детектируемой экзонуклеазно расщепляемой олигонуклеотидной пробы в нейспласированной матрице-мишени. Удаление интрона посредством сплайсинга служит, чтобы позиционировать 3'-конец РТ-связывающего участка непосредственно выше пробы 5'-связывающего участка. Позднейшая перестройка облегчает детектирование экзонуклеазной активности амплифицируемой матрицы-мишени (фиг. 1Е).
Лекарственное скринирование
Лекарственное скринирование осуществляли с использованием вирусного вектора с индикаторным геном, содержащим кассету нефункционального индикаторного гена с инвертированным интроном и упаковывающим вектором(ами). В трансфицируемых упаковывающих хозяйских клетках, вирусный вектор с индикаторным геном продуцирует капсидированный компетентный (ε+) РНК-транскрипт, содержащий данный индикаторный ген. Упаковывающий вектор создает в транс, структурные и/или ферментативные вирусные функции, которые не создаются с помощью резистентного тест-вектора, но которые необходимы для репликации вирусной ДНК и формирования частицы. При котрансфекции упаковывающих хозяйских клеток, вирусный вектор с индикаторным геном и упаковывающие векторы дают начало НВУ-вирусным частицам, содержащим капсидированный вирусный вектор с индикаторным геном, прегеномной РНК, которая в результате сплайсинга инвертированного интрона, содержит функциональный индикаторный ген.
Лекарственное скринирование осуществляли следующим образом: вирусный вектор с индикаторным геном и упаковывающий ДНК-вектор использовали для трансфицирования упаковывающих хозяйских клеток. Воспроизведение трансфекций осуществляли в сериях культур упаковывающих хозяйских клеток, поддерживаемых либо в отсутствие, либо в присутствии потенциальных противовирусных лекарственных препаратов (например, кандидаты-ингибиторы обратной транскриптазы или полимеразы Рбелка НВУ). После выдерживания упаковывающих хозяйских клеток в течение нескольких дней в присутствии или в отсутствие кандидата в противовирусные лекарственные препараты, уровень ингибирования репликации ДНК оценивали либо прямо в упаковывающих клеточных лизатах, либо в изолированных НВУ-частицах, полученных путем сбора культуральной среды хозяйской упаковывающей клетки. Детекция либо ДНК, либо активности индикаторного гена методами, описанными выше, может быть использована для оценки потенциальных кандидатов в противирусный лекарственный препарат.
Пример 8. Гепатит-тест на чувствительность и устойчивость к лекарственному препарату с использованием резистентных тест-вектора(ов), включающих сегмент(ы), производимый пациентом, и нефункциональный индикаторный ген А, содержащий пермутированный промотор А.
Вирусных вектор с индикаторным геном - конструирование
Вирусные векторы с индикаторным геном, содержащие нефункциональный ген с пермутированным промотором, конструировали с использованием субгеномного вирусного вектора НВУ, включающего вирусные векторы, которые являются мишенью(ями) противовирусных лекарственных препаратов. Вирусные векторы с индикаторным геном рС8-НВУ(ЫЕ-Ю) РР-(Р8А8-) основаны на субгеномном вирусном векторе рС8-НВУ. Вирусный вектор рС8-НВУ(NΡ-IС)РР-(Р8А8-) с индикаторным геном содержит кассету нефункционального индикаторного гена с пермутированным промотором и все цисдействующие регуляторные элементы, которые необходимы для репликации ДНК НВУ (т.е. ОВ1, 5'ε ОВ2, ОВ1*, 3'рА), но утратили НВУ-генные последовательности (т.е. гены С, Р, 8, X), которые обеспечивают транс-действующую структурную и ферментативную функции, которые необходимы для репликации ДНК НВУ и формирования вирусной частицы (фиг. 10В). Гены С, Р и Х и акцепторные сайты последовательности пациента содержатся в упаковывающем векторе рРК-СРХ (описан в примере 1, см. фиг. 8Ό). 8-ген содержится в упаковывающем векторе рРК-5 (описан в примере 7, см. фиг. 8Е). В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор рС8-НВУ(NЕ-IС)РР-(Р8А8-) с индикаторным геном и упаковывающий вектор рРК-СРХ определяют резистентную тест-векторную систему. Вирусный вектор рС8-НВУ(NЕ-IС)РР-(Р8А8-) с нефункциональным индикаторным геном содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': (1) ГЕ-область энхансер-промотора СМУ, (2) 5'-область НВУ-генома и ОВ1 и 5'ε (кодон инициации трансляции рге-С ОВЕ элиминирован), (3) кассету нефункционального индикаторного гена, собранную так, чтобы позиционировать 3' область промотора, т.е. ни
-50005426 же ОВР данного индикаторного гена, (4) 3'-область ΗВV-генома, содержащую ЭЯ2, ЭЯ1*, 3'ε и 3'область сигнала рА ΗВV (кодон инициации трансляции рге-С ОЯР элиминирован). Кассета нефункционального индикаторного гена включает некоторые или все нижеследующие элементы, выстроенные в направлении 5' к 3': (1) участок внутреннего входа рибосом (ГЯЕ8), (2) индикаторный ген, который может содержать инвертированный интрон, и (3) транскрипционную последовательность сигнала полиаденилирования (например, тимидинкиназный ген Η8ν-1, 8ν40), (4) область энхансер-промотора. В рамках вирусного вектора с нефункциональным индикаторным геном экспрессионная кассета индикаторного гена обладает транскрипционной ориентацией либо противоположной, либо той же что и Η8νпоследовательные элементы. В случаях, где ОЯР индикаторного гена содержит интрон, этот интрон обладает той же транскрипционной ориентацией, что и ΗВV-последовательные элементы.
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор с индикаторным геном содержит кассету не функционального индикаторного гена, содержащую область пермутированного промотора, все цис-действующие регуляторные элементы которого необходимы для репликации ДНК ΗВV, и некоторые или все генные последовательности ΗВV (т.е. гены С, Р, 8, X), которые обеспечивают транс-действующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК ΗВV и формирования вирусной частицы, рС8-ΗВV(NР-IС)РР-(Ρ8А8+) (фиг. 10Ό). Резистентные тест-векторы, произведенные из вирусного вектора рС8-ΗВV(NР-IС) РР-(Р8А8+) с индикаторным геном, содержат акцепторные сайты последовательности пациента и используются во взаимодействии с упаковывающим вектором рРК-С8К (фиг. 8Н). В данном варианте осуществления вирусного вектора с индикаторным геном можно также создать некоторые или все функции упаковки. К тому же, в данном варианте осуществления настоящего изобретения структурные и ферментативные активности, которые не обеспечены вирусным вектором с индикаторным геном, но, которые необходимы для репликации ДНК ΗВV и формирования вирусной частицы, создавали с использованием дополнительных упаковывающих векторов. В данном варианте осуществления настоящего изобретения этот вирусный вектор рС8ΗВV(NР-IС)РР-(Ρ8А8+) с нефункциональным индикаторным геном содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': (1) ΐΕ-область энхансер-промотора СΜV, (2) 5'-область ΗВV-генома и ЭЯ1 и 5'ε (кодон инициации трансляции рге-С ОЯР элиминирован), (3)область энхансер-промотора (пермутированный промотор), (4) Р-ген, содержащий сегмент, производимый пациентом, (5) ОЯР данного индикаторного гена, (6) участок внутреннего входа рибосом (ГЯЕ8) и (7) 3'-область ΗВV-генома, содержащую ЭЯ2, ЭЯ 1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА Ηβν (кодон инициации трансляции рге-С ОЯР элиминирован). В рамках вирусного вектора с нефункциональным индикаторным геном экспрессионная кассета индикаторного гена обладает транскрипционной ориентацией либо в прямом, либо в обратном направлении по отношению к ΗВV-последовательным элементам. В случаях, где индикаторный ген содержит инвертированный интрон, этот интрон обладает той же транскрипционной ориентацией, что и ΗВVпоследовательные элементы.
Резистентный тест-вектор - конструирование
Резистентные тест-векторы, содержащие не функциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, конструировали с использованием ΗВV-субгеномного вирусного вектора, включающего противовирусные гены-мишени, как описано в примере 8. Вирусный вектор с индикаторным геном или упаковывающий вектор модифицировали, чтобы включить акцепторные сайты последовательности пациента (Р8А8) для инсерции Р-гена, содержащего сегменты, производимые пациентом (ΡΌ8) (описан в примере 7, см. фиг. 8Ό и 8Е). Экспрессию 8-гена, производимого пациентом, исключали, как описано в примере 7 (см. фиг. 8Ό). Одинаковую экспрессию 8-гена обеспечивали в транс, используя отдельный упаковывающий вектор, который создает хорошо характеризуемые продукты 8-гена (фиг. 8Е).
Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость осуществляли с резистентным тествектором, основанном на вирусных векторах рС8-ΗВV(NΕ-IС)ΡΡ-(Ρ8А8+) с индикаторным геном или с вирусным вектором рС8-ΗВV(NΕ-IС)ΡΡ-(Ρ8А8-) с индикаторным геном и упаковывающим вектором рРК-СРХ, используя либо один тип хозяйской клетки, либо два типа хозяйской клетки. При котрансфекции упаковывающих хозяйских клеток либо с резистентным тест-вектором и упаковывающим тествектором, либо с вирусным вектором с индикаторным геном и упаковывающими векторами (т.е. резистентной тест-векторной системой), продуцировали ΗВV-вирусные частицы, содержащие капсидированный индикаторный ген прегеномной РНК, содержащий нефункциональный индикаторный ген. В трансфицируемых хозяйских клетках нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором преобразовывали в функциональный индикаторный ген в течение процесса репликации ДНК Ηβν (фиг. 10В и 10С).
Тесты на чувствительность и устойчивость осуществляли, как описано в примере 7 (выше). Устойчивость или чувствительность действия обратной транскриптазы и/или ДНК-полимеразы к различным противовирусным лекарственным препаратам можно измерить путем измерения уровней экспрессии индикаторного гена в трансфицированных или инфицированных хозяйских клетках. Альтернативно, устойчивость или чувствительность может быть измерена путем количественного анализа итоговой репли
-51005426 кации ДНК НВУ, которая имеет место. Последнюю можно осуществить с использованием количественных испытаний амплификации ДНК. В одном из примеров этого вида анализа (фиг. 9Р и 9С) праймерсвязывающий участок обратного праймера (Рг) локализовали в области ниже от 5'ε. Праймерсвязывающий участок прямого праймера (РГ) локализовали в области, фланкируемой с помощью последовательностей ΩΡ2 и ОВ1*. В линеаризованном НВУ-векторе РГ- и Рг-праймеры управляют синтезом ДНК в противоположных направлениях. В этом случае Рг-праймер направляет синтез в верхнем направлении в отношении 5'ε, а РГ-праймер направляет синтез ДНК в нижнем направлении в отношении 3'ε. Эта праймерная компоновка не определяет функциональную амплификационную единицу в линеаризованной копии вирусного вектора, которая используется для трансфекции. Напротив, РГ- и Рг-праймеры допускают ориентирование в отношении друг к другу для гс-ДНК-формы, которая обнаружена в зрелых вирионах. Оба праймера не управляют синтезом ДНК в отношении единственной копии ОВ1 в плюсцепи копии гс-ДНК. Данное выстраивание праймеров и матрицы определяет функциональную амплификационную единицу.
Лекарственное скринирование
Лекарственное скринирование с использованием вирусного вектора с индикаторным геном, который содержит нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, осуществляли, как описано в примере 7 выше.
Пример 9. Тест на гепатит-лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием тествекторов, включающих сегменты, производимые пациентом, и нефункциональный индикаторный ген А, содержащий пермутированный промотор А и сайты инициации трансляции.
Вирусный вектор с индикаторным геном
Вирусные векторы с индикаторным геном, содержащие нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором и свитами инициации трансляции рС8-НВУ(NР-Ю)РРТI8 конструировали с использованием НВУ-субгеномного вирусного вектора, включающего вирусные гены, которые представляют собой мишень(и) противовирусных лекарственных препаратов. Вирусные векторы рС8НВУ(NР-Ю)РРТI8(Р8А8-) с индикаторным геном основаны на субгеномном вирусном векторе рС8НВУ. Вирусные векторы с индикаторным геном, содержащие кассету нефункционального индикаторного гена с пермутированным промотором и областями инициации трансляции, и все цис-действующие регуляторные элементы, которые необходимы для репликации ДНК НВУ (т.е. ОВ1, 5'ε, ОВ2, ОВ1*, 3'рА), но утратившие генные последовательности НВУ (т.е. гены С, Р, 8, Х), которые обеспечивают транс-действующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК НВУ образования вирусной частицы (фиг. 11В). Гены С, Р и Х и акцепторные сайты последовательности пациента содержатся в упаковывающем векторе рРК-СРХ (пример 7, фиг. 8Ό). 8-ген содержится в упаковывающем векторе рРК-8 (пример 7, фиг. 8Е). В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор рС8-НВУ(NР-Ю)РРТI8(Р8А8-) с индикаторным геном и упаковывающий вектор рРК-СРХ определяют резистентную тест-векторную систему. Вирусный вектор рС8НВУ(NР-Ю)РРТI8(Р8А8-) с не функциональным индикаторным геном содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': (1) ΙΕ-область энхансер-промотора СМУ, (2) 5'-область НВУ-генома, включающего ОВ1 и 5'ε (кодон инициации трансляции пре-С ОВР элиминирован), (3) ОКТ индикаторного гена, утративший сайт инициации трансляции, (4) область энхансер-промотора (пермутированный промотор), (5) 3'-область НВУ-генома, содержащая ОВ2, функциональный кодон инициации трансляции ргеС ОВР, ОВ1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА НВУ. Кассета нефункционального индикаторного гена включает некоторые или все нижеследующие элементы, выстроенные в направлении 5' к 3': (1) ОВР индикаторного гена, который не содержится внутри сайта инициации трансляции, (2) транскрипционная последовательность сигнала полиаденилирования (например, Н8У-1 тимидинкиназный ген, 8У40), (3) область энхансер-промотора. В рамках вирусного вектора рС8-НВУ(NР-Ю)РРТI8(Р8А8-) с индикаторным геном, экспрессионная кассета индикаторного гена транскрипционно ориентирована так же, что и НВУпоследовательные элементы. В случае, где ОВР индикаторного гена содержит интрон, этот интрон обладает транскрипционной ориентацией той же, что и НВУ-последовательные элементы. Во втором варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор с нефункциональным индикаторным геном содержит кассету нефункционального индикаторного гена, содержащую пермутированный промотор и области инициации трансляции, все цис-действующие регуляторные элементы, которые необходимы для репликации ДНК НВУ, и некоторые или все НВУ-генные последовательности (т.е. гены С, Р, 8 и Х), которые обеспечивают транс-действующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК НВУ и образования вирусной частицы рС8-НВУ(NР-Ю)РРТI8(Р8А8+) (фиг. 11Ό). Структурные и ферментативные активности, которые не создаются с помощью вирусного вектора с индикаторным геном, но которые необходимы для репликации ДНК НВУ и образования вирусной частицы, создавали с использованием дополнительных упаковывающих векторов рРК-С8Х (описаны в примере 7, см. фиг. 8Е). С, 8 и Х содержатся в упаковывающем векторе рРК-С8Х (описан в примере 7, см. фиг. 8Н). В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор рС8-НВУ(№Ю)РРТI8(Р8А8+) с нефункциональным индикаторным геном содержит нижеследующие элементы в на-52005426 правлении 5 к 3' (фиг. 11Ό): (1) ΐΕ-область энхансер-промотора СМУ, (2) 5'-область ΗΒν-генома, включающего ΌΚ1 и 5'ε (кодон инициации трансляции рге-С ОКЕ исключен), (3) ОКЕ индикаторного гена, утратившего сайт инициации трансляции, (4) Р-ген, содержащий сегмент, производимый пациентом, (5) область энхансер-промотора (пермутированный промотор), (6) 3'-область ΗΒν-генома, содержащий ОК2, кодон инициации трансляции рге-С ОКЕ, ОК1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА ΗΒν. В вирусном векторе с нефункциональным индикаторном геном экспрессионная кассета индикаторного гена обладает транскрипционной ориентацией той же, что и ΗΒν-последовательные элементы. В случаях, где данный индикаторный ген содержит инвертированный интрон, этот интрон обладает транскрипционной ориентацией той же, что и ΗΒν-последовательные элементы.
Резистентные тест-векторы - конструирование
Резистентные тест-векторы, содержащие нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором, конструировали с использованием ΗΒν-субгеномного вирусного вектора, включающего противовирусные гены-мишени, как описано в примере 7. Вирусный вектор с индикаторным геном и упаковывающий вектор модифицировали, чтобы включить акцепторные сайты последовательности пациента (Р8А8) для инсерции Р-гена, содержащего сегменты, производимые пациентом (РЭ8) (описаны в примере 1, см. фиг. 8Ό и 8Е). Экспрессию производимого пациентом 8-гена исключали, как описано в примере 7 (см. фиг. 8Ό). Одинаковую экспрессию 8-гена обеспечивали в транс, используя отдельный упаковывающий вектор, который создает хорошо характеризуемые продукты 8-гена (фиг. 8Е).
Тест на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость осуществляли с помощью методик, описанных в примере 7 и 8. Нефункциональный индикаторный ген преобразовывали в функциональный индикаторный ген в течение ΗΒν-репликации (фиг. 11В и 11С).
Лекарственное скринирование
Лекарственное скринирование с использованием вирусного вектора с индикаторным геном, который содержит нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором и области инициации трансляции, осуществляли практически так же, как описано в примере 7 и 8 (выше).
Пример 10. Тест на гепатит-лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием тест-векторов, включающих сегменты, производимые пациентом, и нефункциональный индикаторный ген, с пермутированными кодирующими областями.
Вирусный вектор с индикаторным геном
Вирусные векторы с индикаторным геном, содержащие нефункциональный индикаторный ген с пермутированными кодирующими областями, конструировали с использованием ΗΒν-субгеномных вирусных векторов, включающих вирусные гены, которые являются мишенью(ями) противовирусных лекарственных препаратов. Вирусные векторы рС8-ΗΒV(NЕ-ΐС)РСК(Р8А8-) с индикаторным геном основаны на субгеномном вирусном векторе рС.'8-ΗΒν. Вирусный вектор с индикаторным геном содержит кассету нефункционального индикаторного гена с пермутированной кодирующей областью и все цисдействующие регуляторные элементы, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν (т.е. ОК1, 5'ε, ОК2, ЭК 1*, 3' рА), но утратили ΗΒν-генные последовательности (т.е. гены С, Р, 8, X), которые создают трансдействующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν и образования вирусной частицы (фиг. 12 В). Гены С, Р и Х и акцепторные сайты последовательности пациента содержатся в упаковывающем векторе рРК-СРХ и 8-ген создавали с помощью упаковывающего вектора рРК-8, (описан в примере 7, см. фиг. 8Ό и 8Е). В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор рС8-ΗΒV(NЕ-ΐС)РСК(Р8А8-) с индикаторным геном и упаковывающий вектор рРК-СРХ определяют резистентную тест-векторную систему. Вирусный вектор рС8ΗΒν(ΝΕ-№) РСК (Р8А8-) с нефункциональным индикаторным геном содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': (1) ΐΕ-область энхансер-промотора СМУ, (2) 5'-область ΗΒν-генома, включающий ЭК1 и 5'ε (кодон инициации трансляции рге-С ОКЕ элиминирован), (3) кассету нефункционального индикаторного гена, собранную так, чтобы данная промоторная область и 5'-часть данной кодирующей области позиционировались 3', т.е. ниже от остальной 3'-части данной кодирующей области, (4) 3'область ΗΒν-генома, содержащая ОК2, ОК1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА ΗΒν (кодон инициации трансляции рге-С ОКЕ элиминирован). Кассета нефункционального индикаторного гена включает некоторые или все нижеследующие элементы, выстроенные в направлении 5' к 3': (1) 3'-область интрона, заканчивающаяся в акцепторной последовательности сплайсинга, (2) 3'-области индикаторной (репортерной) ОКЕ или ОКЕ селективного маркера, (3) транскрипционную последовательность сигнала полиаденилирования (например, Η8ν-1 тимидинкиназный ген, 8У40), (4) энхансер-промоторную область, (5) 5'область ОКЕ индикаторного гена, (6) 5'-область интрона, начинающегося в последовательности донорного сплайсинга. В вирусном векторе нефункционального индикаторного гена, экспрессионная кассета индикаторного гена обладает транскрипционной ориентацией либо в той же, либо в противоположной транскрипционной ориентации ΗΒν-последовательных элементов. В случаях, где ОКЕ индикаторного гена содержит интрон, этот интрон ориентирован в том же направлении по отношению к ΗΒνпоследовательным элементам.
-53005426
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор с индикаторным геном содержит кассету нефункционального индикаторного гена, содержащую пермутированную кодирующую область, все цис-действующие регуляторные элементы, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒV, и некоторые или все генные последовательности ΗΒV (т.е. гены С, Р, 8, X), которые обеспечивают транс-действующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК №ν и формирования вирусной частицы ρС8-ΗΒV(NЕ-ΐС)ΡСΒ(Ρ8Α8+) (фиг. 12Ό). Резистентные тест-векторы, произведенные из вирусного вектора ρС8-ΗΒV(NЕ-ΐС)ΡСΒ(Ρ8Α8+) с индикаторным геном, содержащие акцепторные сайты последовательности пациента (Ρ8Α8) использовали во взаимодействии с упаковывающим вектором ρΡΚ-ί'8Ι< (описан в примере 7, см. фиг. 8Н). В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор с индикаторным геном может также обеспечивать некоторые или все упаковывающие функции. В данном варианте осуществления настоящего изобретения структурная и ферментативная активности, которые не создаются с помощью вирусного вектора с индикаторным геном, но, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒV и формирования вирусной частицы, создавали с использованием дополнительных упаковывающих векторов. В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектору с нефункциональным индикаторным геном, содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': (1) ΐΕ-областъ энхансера-промотора СΜV, (2) область ΗΒV-генома ниже сразу от кодона инициации трансляции ρΓθ-С ОВЕ и ΌΒ1 и 5'ε, (3) кассету индикаторного гена, содержащую область ΗΒV-генома, которая может содержать несколько или все гены С, Р, 8 и X, (4) область ΗΒV-генома, содержащая ΌΚ2, ΌΚ1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА №ν (кодон инициации ρΐΌ-С ОВЕ элиминирован). В вирусном векторе ρС8-ΗΒV(NЕ-ΐС)ΡСΒ (Ρ8Α8+) с индикаторным геном экспрессия кассеты индикаторного гена обладает транскрипционной ориентацией либо той же, либо противоположной ΗΒV-последовательным элементам. В случаях, где индикаторный ген содержит инвертированный интрон, этот интрон ориентирован в том же направлении во отношению ΗΒV-последовательных элементов.
Резистентные тест-векторы - конструирование
Резистентные тест-векторы, содержащие нефункциональный индикаторный ген с пермутированной кодированной областью, конструировали с использованием ΗΒV-субгеномного вирусного вектора, включающего противовирусные гены-мишени, как описано в примере 7. Вирусный вектор с индикаторным геном или упаковывающий вектор модифицировали, чтобы включить акцепторные сайты последовательности пациента (Ρ8Α8) для инсерции Р-гена, содержащего сегменты, производимые пациентом (ΡΌ8) (описан в примере 7, см. фиг. 8Ό и 8Е). Экспрессию производимого пациентом 8-гена исключали, как описано в примере 7 (см. фиг. 8Ό). Одинаковую экспрессию 8-гена обеспечивали в транс, используя отдельный упаковывающий вектор, который создает хорошо характеризуемые продукты 8-гена (фиг. 8Е).
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость осуществляли с помощью методик, описанных в примерах 7 и 8. Нефункциональный индикаторный ген преобразовывали в функциональный индикаторный ген в течение ΗΒV-репликации (фиг. 12В и 12С).
Лекарственное скринирование
Лекарственное скринирование с использованием вирусного вектора с индикаторным геном, который содержит нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором и областями инициации трансляции, осуществляли, по существу, как описано в примерах 7 и 8 (выше).
Пример 11. Тест на гепатит-лекарственную чувствительность и устойчивость с использованием тест-вектора, включающего сегмент(ы), производимые пациентом, и функциональный индикаторный ген А.
Вирусный вектор с индикаторным геном - конструирование
Вирусные векторы с индикаторным геном, содержащие индикаторный ген, конструировали с использованием ΗΒV-субгеномных векторов, включающих вирусные гены, которые являются мишенью(ями) противовирусных лекарственных препаратов. Вирусные векторы ρС8-ΗΒV(Е-ΐС)(Ρ8Α8-) с индикаторным геном основаны на субгеномном вирусном векторе ρС8-ΗΒV. Вирусный вектор ρС8ΗΒV(Е-ΐС)(Ρ8Α8-) с индикаторным геном содержит кассету функционального индикаторного гена и все цис-действующие регуляторные элементы, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒV (т.е. ОВ1, 5'ε, ОВ2, ОВ1*, 3' рА), но утратили ΗΒV-генные последовательности (т.е. гены С, Р, 8, X), которые создают транс-действующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒV и формирования вирусной частицы (фиг. 14В). Гены С, Р и Х и акцепторные сайты последовательности пациента содержатся в упаковывающем векторе рРК-СРХ, а 8-ген содержится в упаковывающем векторе ρΡΚ-8 (описан ниже, см. фиг. 8Ό и 8Е). В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор ρС8-ΗΒV(Е-ΐС)(Ρ8Α8-) с индикаторным геном и упаковывающий вектор рРК-СРХ определяют резистентную тест-векторную систему. Вирусный вектор ρС8-(Е-ΐС)(Ρ8Α8-) с функциональным индикаторным геном содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': (1) ΐΕобласть энхансер-промотора СΜV, (2) 5'-область ΗΒV-генома, включающий ΌΒ1 и 5'ε (кодон инициации
-54005426 трансляции рге-С ОВР элиминирован), (3) кассету функционального индикаторного гена, (4) 3'-область ΗΒν-генома, содержащая ЭВ2, ЭВ1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА ΗΒν (кодон инициации трансляции рге-С ОВР элиминирован). Кассета функционального индикаторного гена включает некоторые или все нижеследующие элементы, выстроенные в направлении 5' к 3': (1) транскрипционную область энхансерпромотора, (2) интрон, (3) ОВР индикаторного гена или ОВР селективного маркерного гена, (4) транскрипционную последовательность сигнала полиаденилирования (например, 8У40) или однонаправленный (Η8ν-1 тимидинкиназный ген). Экспрессионная кассета индикаторного гена обладает транскрипционной ориентацией той же или противоположной с ΗΒν-последовательными элементами.
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор с индикаторным геном содержит кассету с функциональным индикаторным геном, все цис-действующие регуляторные элементы, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν и некоторые или все генные последовательности ΗΒν (т.е. гены С, Р, 8, X), которые обеспечивают транс-действующие структурные и ферментативные функции, которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν и формирования вирусной частицы рС8-ΗΒV(NР-Ю)РСΒ(Р8Α8+) (фиг. 13Ό). Резистентные тест-векторы, произведенные из вирусного вектора рС8-ΗΒV(Р-Ю)(Р8Α8+) с индикаторным геном содержат акцепторные сайты последовательности пациента ^8Α8) и использовались во взаимодействии с упаковывающим вектором рРК-С8К. В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор с индикаторным геном может также обеспечивать некоторые или все упаковывающие функции. Структурные и ферментативные активности, которые не создаются с помощью вирусного вектора с индикаторным геном, но которые необходимы для репликации ДНК ΗΒν и формирования вирусной частицы создавали с использованием дополнительных упаковывающих векторов рРК-С8Х (описан в примере 7, см. фиг. 8Н). В данном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный вектор с функциональным индикаторным геном содержит нижеследующие элементы в направлении 5' к 3': (1) ΙΕ-область энхансера-промотора СМУ, (2) область ΗΒνгенома ниже сразу от кодона инициации трансляции рге-С ОВР и ЭВ1 и 5'ε, (3) кассету функционального индикаторного гена в области ΗΒν-генома, которая содержит несколько или все гены С, Р, 8 и X, (4) область ΗΒν-генома, содержащая ЭВ2, ЭВ1*, 3'ε и 3'-область сигнала рА ΗΒν. В вирусном векторе с индикаторным геном экспрессия кассеты индикаторного гена обладает транскрипционной ориентацией либо противоположной, либо той же, что и ΗΒν-последовательные элементы.
Резистентные тест-векторы - конструирование
Резистентные тест-векторы, содержащие нефункциональный индикаторный ген с пермутированным промотором конструировали с использованием ΗΒν-субгеномного вирусного вектора, включающего противовирусные гены-мишени, как описано в примере 7. Вирусный вектор с индикаторным геном или упаковывающий вектор модифицировали, чтобы включить акцепторные сайты последовательности пациента ^8Α8) для инсерции Р-гена, содержащего сегменты, производимые пациентом (РЭ8) (описан в примере 7, см. фиг. 8Ό и 8Р). Экспрессию производимого пациентом 8-гена исключали, как описано в примере 7 (см. фиг. 8Ό). Одинаковую экспрессию 8-гена обеспечивали в транс, используя отдельный упаковывающий вектор, который создает хорошо характеризуемые продукты 8-гена (фиг. 8Е).
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость
Тесты на лекарственную чувствительность и устойчивость осуществляли с использованием резистентного тест-вектора, основанного на вирусном векторе рС8-ΗΒV(Р-Ю)(Р8Α8+) с функциональным индикаторным геном или с резистентной тест-векторной системой, основанной на вирусном векторе рС8-ΗΒV (Р-Ю)(Р8Α8-) с индикаторным геном, и с упаковывающим вектором(ами). В трансфицируемых упаковывающих хозяйских клетках вирусный вектор с индикаторным геном продуцирует капсидированный элемент (ε) РНК-транскрипта, содержащий кассету функционального индикаторного гена. Упаковывающий вектор(ы) обеспечивает в транс структурные и/или ферментативные функции, которые не создаются с помощью вирусного вектора с функциональным индикаторным геном, но которые необходимы для репликации ДНК и формирования частицы. При котрансфекции упаковывающих хозяйских клеток вирусный вектор с индикаторным геном и упаковывающими векторами способен формировать ΗΒν-частицы, содержащие капсидированный вирусный вектор с индикаторным геном, прегеномной РНК, содержащей кассету функционального индикаторного гена. В данном примере вирусный вектор с индикаторным геном содержит кассету функционального индикаторного гена и поэтому может производить активность индикаторного гена в трансфицируемых клетках в отсутствие репликации ДНК ΗΒν (фиг. 13). Что касается функционального индикаторного гена, ингибирование репликации ДНК ΗΒν с помощью лекарственных препаратов может быть оценено после сбора вирусных частиц, полученных в упаковывающей хозяйской клетке, и использованием частиц (или частицы ДНК) для заражения (или трансфекции) хозяйской клетки-мишени. Альтернативно, репликация может быть измерена прямо в вирусных частицах, выделенных из упаковывающих хозяйских клеток путем использования ДНК в качестве индикатора. Лекарственный препарат, который ингибирует репликацию ДНК ΗΒν, будет снижать формирование вирусных частиц, содержащих зрелую гс-ДНК-форму вирусного вектора с индикаторным геном. Следовательно, функциональный индикаторный ген не будет эффективно перемещаться к хозяйской клетке-мишени в течение инфицирования/трансфицирования и количество вирусного вектора
-55005426 с индикаторным геном, ссксДНК и активность индикаторного гена в этих клетках будет снижена. Детекцию экспрессии индикаторного гена в хозяйских клетках-мишенях в двухклеточном анализе осуществляли, как описано в примере 7. Детекцию гс-ДНК в вирусных частицах осуществляли с использованием ДНК в качестве индикатора, как описано в примере 8 и иллюстрировано на фиг. 9Р и 9С.
Лекарственное скринирование
Лекарственное скринирование с использованием вирусного вектора с индикаторным геном, с пермутированным промотором и областями инициации трансляции, осуществляли, по существу, как описано в примерах 7 и 8 (выше).
Олигонуклеотиды
1) 5' -АаТСААТТАаСССТТССАССССССТССАССТТССССТААТСА-3' (42-тег) (ЗЕО ГО N0:1)
2) 5 ' - СТОТТОООААОбОСОАТСТСТАОАТОСТАСЗАОАТТТТССАСА- 3 ' (42-тег) (ЗЕО 10 N0:2)
3) 5 · -СТССТССТССААСТСТСАССааСССССТТТАССАТСТОАТОСАС-3' (44-тег) (ЗЕО ГО N0:3)
4) 5' -СТССТССТССААСТСТСАСССССССССАТАТССТСТТТТАСТАА-3' (44-тег) (ЗЕО ГО N0:4)
5) 5' -аСТСТААССАСАСАаАСССССТТСАСТАААССАССТ-3' (Зб-тег) (ЗЕО Ю N0:5)
6) 5'-ОААТТСОСОСССССААТТСССССССТСТСССТ-3' (32-тег)(ЗЕО ГО N0:6)
7) 5' -СТТААССССССССССАТАТАСТТССТССТТТС-3' (32-тег)(ЗЕО Ю N0:7)
8) 5'-СААТТСТССССАССАТСЗААСАССССАААААС-3' (32-тег) (ЗЕО ГО N0:8) '
9) 5'-СТТААСАОАТСТСТСОАСТТАСААТТТООАСТТТСС-3' (Зб-тег) (ЗЕО ГО N0:9)
10) 5 · -АСАССОССАСАСАСТАСТТААТАС6АСТСАСТАТАООО
ТОААОСАСТСААОССААО-3'(5б-тег) (ЗЕО ГО N0:10)
11) 5'-ААОАОТОАССТОАОООААОТТААСООАТАСАОТТССТТОТСТ-3' (42-тег) (ЗЕО ГО N0:11)
12) 5'-ТССАОСАСТСАСТААТТТСТСОАСТТСТТСАТТТССТССААТ- 3' (42-тег) (ЗЕО ГО N0:12)
13) 5' -ТААСОССТАТТСТОСТАТОСССАСАСССААТТСТОААААТОО- 3 ' (42-тег) (ЗЕО 10 N0:13)
14) 5 * -ААООАТАСАОТТССТТОТСОАТСООСТССТОСТТСТОАОСОО-3' (42-тег) (ЗЕО 10 N0:14)
15) 5' - СТАААААТАСТАСТТТССООАТСССАаСАСТСЗАСТААТТТАТ - 3 ' (42-тег) (ЗЕО Ю N0:15)
16) 5'-ТТАОСТССТТСССТССТССААТСаТТСТСАОААСТААОТТСО-3' (42-тег) (ЗЕО И N0:16)
17) 5'-СТСССАОАТААОТОССААООАТТССТТСАСТААТССААТОСА-3'
-56005426 (42-тег) (ЗЕО. Ю N0:17)
18) 5' -СААТТССТТААСТТСССТСАСАТСАСТСТТТСС-3' (33-тег) (ЗЕО 10 N0:18)
19) 5' -СТТААСаТССАСТТ0ТТСАТТТССТССААТ-3' (30-тег) (ЗЕО 10 N0:19)
20) 5 ' - СААТТСССАТССАСААССААСТСТАТССТТТААСТТССС ТСАСАТСАСТСТТТОО-З' (55-тег) (ЗЕО И N0:20)
21) 5 ’ - СТТААСССАТСССАССАСТСАСТААТТТАТСТАСТТСТТС АТТТССТССААТ-3' (52-тег) (ЗЕО И N0:21)
22) 5' -СААТТССТТААСТТСССТСА1С/А) АТС (А/С) СТСТТТСС-З ' (33-тег ροοί) (ЗЕО И N0:22)
23) 5' -СТТААССТССАСТТ (С/Т) (Т/С)ТСАТТТССТСС(А/Т)АТ-3' (30-тег ροοί) (ЗЕО ΙΏ N0:23)
24) 5' - СААТТСССАТССАСААССААСТСТАТССТТТААСТТССС
ТСА(С/А)АТС(А/С)СТСТТТСС-3 ' (55-тег ροοί) (ЗЕО Ιϋ N0:24)
5) 5' - СТТААСССАТСССАССАСТСАСТААТТТАТСТАСТТ (С/Т) (Т/С) ТСАТТТССТСС (А/Т) АТ-3' (52-тег ροοί) (ЗЕО И N0:25)
26) 5 ' - АТСТСТТАССТСТССТАТСТААСАССССАССАТТАА- 3 ' (36-тег) (ЗЕО Ю N0:26)
27) 5' - СААТТСТССССАССАССАТССССССТТСААСССТС - 3 ' (35-тег) (ЗЕО Ιϋ N0:27)
28) 5 ' -СТТААСАСАТСТТСАТСССТССТАСТСТАТ-3' (30-тег) (ЗЕО Ю N0:28)
29) 5'-СААТТСССССССААССССССССААССССССААААССТТ ААССАТССААССССССААСААТТСААТССССААА- 3' (72-тег) (ЗЕО 10 N0:29)
30) 5 ' - СТТААСССаСССТТСТССАСТТССССССССТТССТАССТТ '
А<ЗАТСТТТССССССТТТСССаАТТСААТТСТТ-3' (72-тег) (ЗЕО 10 N0:30)
31) 5'-СААТТСААССТТССССАТТССАТАССТТСТ-З' (30-тег) (ЗЕО 10 N0:31)
32) 5 '-СТТААСССАТССАТААСААСССАА-3 ' (24-тег) (ЗЕО 10 N0:32)
33) 5'-СААТТСССАТССТССССТССТСССАССССС-3’ (30-тег) (ЗЕО Ю N0: 33)
34) 5 ' - СТТААССААТТСТССТССССССАСААССАС - 3 ' (30-тег) (ЗЕО Ю N0:34)
35) 5'-СААТТСАСАТСТСССАТАССАСАТТТСТАС-3' (30-тег) (ЗЕО 1Ώ N0:35)
6) 5' - СТТААСССТАССТССАСАСАТСАТААСАТА- 3 ' (30-тег) (ЗЕО Ю N0:36)
37) 5 ' - СААТТСССТАССАТССССССССТААСТССС- 3 ' (30-тег) (ЗЕО 10 N0:37)
38) 5 ' -СТТААССТССАСССААААСССТАССССТСС- 3 ' (30-тег) (ЗЕО Ιϋ N0:38)
9) 5 ' - СААТТСТССССААСАСТТСССССТ - 3 ' (24-тег) (ЗЕО И N0:39)
40) 5' -СТТААСАСАТСТТТАССССААССССААСТС- 3 ' (30-тег) (ЗЕО Ю N0:40)
41) 5 ' - СТТААССААТТСТТССАААААаСТТТССААСАТССАТА ААСТТТТТАСАААСТССАСТАССАСТСС-3' (66-тег) (ЗЕО И N0:41)
42) 5' -СААТТСТССССАТСТАСАСаТТСТАССТТТСТСТТСТТ ТТТТССАССАСТССТАСТССАСТТТ-З' (63-тег.) (ЗЕО Ιϋ N0:42)
43) 5' -СТТААССААТТСССАССАТСАТТСААСААСАТССА- 5' (35-тег) (ЗЕО Ю N0:43)
44) 5'-СААТТСАСАТСТТСАСААСААСТССТСААС-3' (30-тег) (ЗЕО 10 N0:44)
45) 5 ' - СССССТСССААСАСТСАСТАССТААСТАСССССТАТАСА- 3 ' (39-тег) (ЗЕО И N0:45)
46) 5 ' - СТСТССТТСТССССССАССТССАСААТТСААТССССААА- 3 ' (39-тег) (ЗЕО Ю N0:46)
47) 5' -СТТААССААТТСССАССАТСААСАССАТТААСАТС- 5' (35-тег) (ЗЕО 10 N0:47)
-57005426
Список последовательностей (1) ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ:
(ί) ЗАЯВИТЕЛИ: Сароп, ϋβηίβΐ и СЬгхзСоз Д. РеСгорои1из (ϋ) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Композиции и способы определения проти вовирусной лекарственной чувствительности и устойчивости (ίϋ) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 47 (ίν) АДРЕС ДЛЯ СООБЩЕНИЙ;
(А) АДРЕСАТ: Соорег & ОипЬат ЬЬР
(В) УЛИЦА: 1185 Ανβηυβ о£ ЬНе Атегхсаз
(С) ГОРОД: Нью-Йорк
О) ШТАТ: Нью-Йорк
(Е) СТРАНА : Соединенные Штаты
(Г) ΖΙΡ: 10036
(V) ФОРМА КОМПЬЮТЕРНОГО ПРОЧТЕНИЯ:
(A) ТИП НОСИТЕЛЯ ДАННЫХ: мягкий диск (B) КОМПЬЮТЕР: совместимый с персональными компьютерами фирмы ΙΒΜ (С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РЗ-ООЗ/М5-ООЗ (0) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: РаСепЫп Ее1еазе #1.0, Уегзьоп #1.30 (νί) ПОСЛЕДНИЕ СВЕДЕНИЯ О ПОДАННОЙ ЗАЯВКЕ:
(A) НОМЕР ЗАЯВКИ:
(B) ДАТА ПОДАЧИ:
(C) КЛАССИФИКАЦИЯ:
(νίίί) СВЕДЕНИЯ О ПАТЕНТНОМ ПОВЕРЕННОМ:
.. (А) ИМЯ: ИЬПе, СГоЪп Р.
(B) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: 28,678 (C) НОМЕР РЕГИСТРАЦИИ/РЕЕСТРА: 50130-А-
РСТ/ДРИ/АКС (ίχ) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННЫЕ СВЕДЕНИЯ:
(A) ТЕЛЕФОН: 212-278-0400 ’ (B) ТЕЛЕФАКС: 212-391-0526 - (2) СВЕДЕНИЯ О ПОС ИД Μ» 1:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
Ю) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕ<2 Ю N0:1
АСТСААТТАС СССТТССАСС ССООТСОАСС ТТСОСОТААТ СА (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:2:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:2:
СТОТТССОАА ОСОСОАТСТС ТАОАТССТАО АСАТТТТССА СА (2) СВЕДЕНИЯ О2 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю ыбТЗ:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 44 пары оснований - (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:3:
СТССТССТСС ААОТСТСАОС ОСССОССТТТ АССАТСТОАТ ОСАС (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЙ~5ЕО Ю N0:4:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований · (B) ВИД: нуклеиновая кислота , (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ; линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:4:
СТССТССТСС ААСТСТОАОС ОССССССАТА ТОСТОТТТТА СТАЛ _____ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:5:
-58005426 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 36 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Э) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χϊ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:5:
(ЗОТСТААССА ОАОАОАСССС СТТСАСТААА СОАССТ (Σ) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5Е<2 Ю N0:6:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 32 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χι) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:6:
СААТТССССС ССССААТТСС СССССТСТСС СТ ______32 _____ _ _ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО 10 N0:7:
(Ϊ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 32 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (Х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:7
СТТААСССВС ССССОАТАТА сттсстсстт тс (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:8:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 32 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК [геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:8:
СЗААТТСТССС ОАССАТСОАА САССССАААА АС 32 (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:9’:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 36 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:9:
СТТААСАОАТ СТСТССАСТТ АСААТТТОСА СТТТСС _---- --(2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:10:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 56 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная .
(ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:10:
АСАСОООСАС АСАСТАСТТА АТАССАСТСА СТАТАССОТС ААССАСТСАА
СССАА<3 56 __ _______ ______ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:11:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:11:
ААСАСТСАСС ТСАОССААСТ ТААСС5САТАС АСТТССТТСТ СТ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:12:
-59005426 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕ<2 Ю N0:12:
ТССАССАСТС АСТААТТТСТ ССАСТТСТТС АТТТССТССА АТ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 3ΕθΪΟ N0:13:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Εζ} 10 N0:13:
ТААССССТАТ ТСТССТАТСС ССАСАСССАА ТТСТСААААТ СС ____ 42 ____ __ __ ___ _ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5Е0 Ю N0:14:
(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 Ю N0:14:
ААООАТАСАС ТТССТТСТСС АТССССТССТ ССТТСТОАОО ОС _ ___ 42 ___..
(2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 3Εζ} Ю N0:15:
(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 Ю N0:15
СТАААААТАС ТАСТТТСССС АТСССАССАС ТСАСТААТТТ АТ ________42 __ __ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ<2 Ю N0:16:
(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:16:
ТТАССТССТТ СССТССТССА АТССТТСТСА СААСТААСТТ СС _________42_______ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:17: ' (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 42 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Ω) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ΐΐ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 Ю N0:17:
СТСССАСАТА АСТСССААСС ДТТССТТСАС ТААТССААТС СА _______ 42________ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ(2 Ю N0:18:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 33 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная · (ΐΐ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ΙΌ N0:18:
СААТТССТТА АСТТСССТСА САТСАСТСТТ ТОО _____ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕ<2 Ю N0:19:
-60005426 (1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:19:
СТТААССТСС АСТТСТТСАТ ТТССТССААТ ______ _____ ____ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:20:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 55 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (ΧΪ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:21:
ОААТТССОАТ ССАСААСОАА СТОТАТССТТ ТААСТТСССТ САСАТСАСТС ТТТСС (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:24:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 52 пара оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:21:
СТТААССОАТ СССАССАСТО АСТААТТТАТ СТАСТТСТТС АТТТССТССА АТ .
(2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО 10 N0:22:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 33 парз оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная .
(ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:22:
ОААТТСОТТА АСТТСССТСА НАТСМСТСТТ ТОО ____—. 13-----------{2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:23:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:23:
(ЗТТААСаТСС АСТТКУТСАТ ТТССТССНАТ (гТсВЕДЕНИЯ^О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5Е0 ϊϋ N0:24:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 55 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная - (Б) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:24:
СААТТСССАТ ССАСААССАА СТОТАТССТТ ТААСТТСССТ САЯАТСМСТС ТТТСС (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО 10 N0:25:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 52 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная ’ (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:25:
СТТААСССАТ СССАОСАСТО АСТААТТТАТ СТАСТТКУТС АТТТССТССИ АТ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:26:
-61005426 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 36 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:26:
АТСТСТТАСС ТСТССТАТСТ ААСАООССАС ОАТТАА (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬН0СТЙ~5Ё0 Ю N0:27:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 35 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:27:
ОААТТСТСОС САССАССАТО ОССССТТСАА СОСТС __ .__________35 ___________
СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:28:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:28:
ОТТААСАСАТ СТТСАТОССТ СОТАСТСТАТ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:29:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 72 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Э) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (Χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:29:
СААТТССССС ССААОСОССС ССААССССОС ААААССТТАА ССАТССААСС ССЗСОААСААТ 60
ТСААТСОССА АА (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ΙΒ N0:30:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 72 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ιϋ N0:30:
(ЗТТААСССОС ССТТСТСОАО ТТССОЗСССС ТТССТАССТТ АСАТСТТТОО ССССТТТССС 60
САТТОААТТС ТТ _____ 72_________ ___ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ιϋ·Ν0:31:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:31:
СААТТСААСС ТТССССАТТС САТАССТТСТ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:32:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 24 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:32:
-62005426
СТТААСССАТ ССАТААОААС ССАА (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:33:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная .
(И) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (Х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕ<2 Ю N0:33
СААТТСОСАТ ОСТССССТСС ТССОАСССОО ______ 30____________________ ____
СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:34:
(ί) ХАРАКТЕ РИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) '
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:34:
СТТААСОААТ ТСТССТССОО ССАСААССАС (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО 10 N0:35:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) <Х±> ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕ<2 Ю N0:35
СААТТСАОАТ СТОССАТАСС АСАТТТОТАО (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:36:
(1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота
СААТТСТССС СААСАОТТСС СССТ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЁО Ю N0:40:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (хх) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е<2 10 N0:40:
СТТААСАОАТ СТТТАСОСОА АСССОААСТС (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:4ΪΊ (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: бб пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0> ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (хх) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:41:
СТТААССААТ ТСТТССАААА АССТТТССАА САТССАТААА СТТТТТАОАА
АСТССАСТАС 60
САСТСС (2)‘СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ΕθΐΟ ΝΟΪ 4 2_: ’ (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 63 лары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная {0) ТОПОЛОГИЯ: линейная ; (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (XX) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Е0 Ю N0:42:
СААТТСТССС САТСТАСАСС ТТСТАССТТТ СТСТТСТТТТ ТТССАССАСТ ССТАСТССАС ТТТ 63
-63005426 (С) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (Э) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (κι) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:36:
ОТТААСОСТА ССТССАОАСА ТОАТААСАТА (2) СВЕДЕНИЯ ^^ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:37:
(Ϊ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(А) ДЛИНА: 30 пар оснований . (В) ВИД: нуклеиновая кислота (С) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:37
ОААТТСОСТА ОСАТСССССС ССТААСТССО __ __ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:38:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная {ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:38:
ОТТААСОТСО АСОСААААОС СТАСОССТСС '
(2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:39:
(Ϊ) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 24 пары оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО 10 N0:39:
(2)’ СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО 10 N0:43:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 35 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:43:
ОТТААССААТ ТСССАССАТС АТТСААСААС АТОСА (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:44:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:44:
СААТТСАСАТ СТТСАСААСА АСТССТСААС (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:45: ίί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 39 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ю N0:45:.
СССССТСССА АСАСТСАСТА ССТААСТАСС СССТАТАСА (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО Ю N0:46:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 39 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная
-64005426 (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χΐ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5Εζ} Ю N0:46:
стстасттст ссссссасст ссаоааттса атсссоааа
39___________ (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5Е0 Ю N0:47:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 35 пар оснований (B) ВИД: нуклеиновая кислота (C) СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная (С) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) ВИД МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: £Εβ Ю N0:47:
(ЗТТААСОААТ ТСССАССАТО ААСАСОАТТА АСАТС

Claims (113)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
    (б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах; и (в) сравнение уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату.
  2. 2. Способ по п.1, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как раскрыто в п.1, но в отсутствие противовирусного препарата.
  3. 3. Способ по п.1, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена является уровнем экспрессии, который определяют, как раскрыто в п.1, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного препарата.
  4. 4. Способ по п.1, в котором указанный вектор содержит ДНК геномного вирусного вектора.
  5. 5. Способ по п.1, в котором указанный вектор содержит ДНК субгеномного вирусного вектора.
  6. 6. Способ по п.1, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ретровируса.
  7. 7. Способ по п.6, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ВИЧ.
  8. 8. Способ по п.7, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую νί£, ург, 1а1, гет, три или пе£, или их комбинацию.
  9. 9. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента.
  10. 10. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса содержит функциональную вирусную последовательность.
  11. 11. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса кодирует белок, являющийся мишенью указанного противовирусного лекарственного препарата.
  12. 12. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса кодирует два белка, являющихся мишенями указанного противовирусного лекарственного препарата.
  13. 13. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса содержит ретровирусный ген.
  14. 14. Способ по п.13, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген ВИЧ.
  15. 15. Способ по п.14, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген дад-ро1 ВИЧ.
  16. 16. Способ по п.1, в котором указанный индикаторный ген представляет собой функциональный индикаторный ген, а способ дополнительно включает стадию инфицирования указанных клеток-хозяев вирусными частицами вектора, полученными из отфильтрованных супернатантов культуры упаковывающих клеток-хозяев данного вектора, причем указанную стадию инфицирования проводят до стадии а).
  17. 17. Способ по п.1, в котором указанный индикаторный ген представляет собой нефункциональный индикаторный ген.
  18. 18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию инфицирования указанных клеток-хозяев вирусными частицами вектора, полученными из отфильтрованных супернатантов культуры упаковывающих клеток-хозяев данного вектора, причем указанную стадию инфицирования проводят до стадии а).
  19. 19. Способ по п.17, в котором указанную стадию инфицирования осуществляют путем совместного культивирования указанных клеток-хозяев с упаковывающими клетками-хозяевами вектора.
    -65005426
  20. 20. Способ по п.1, в котором указанный индикаторный ген представляет собой ген люциферазы.
  21. 21. Способ по п.1, в котором указанный индикаторный ген представляет собой ген 1;·κΖ Е. со11.
  22. 22. Способ по п.18, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки человека.
  23. 23. Способ по п.18, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки почки эмбриона человека.
  24. 24. Способ по п.18, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки 293.
  25. 25. Способ по п.1, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой Т-клетки человека.
  26. 26. Способ по п.25, в котором указанные клетки-хозяева принадлежат линии Т-клеточного лейкоза человека.
  27. 27. Способ по п.26, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки Л1гка1.
  28. 28. Способ по п.26, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки Н9.
  29. 29. Способ по п.26, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки СЕМ.
  30. 30. Вектор для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, содержащий фрагмент вируса и индикаторный ген, и не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, используемый для осуществления способа по п.1.
  31. 31. Вектор по п.30, в котором указанный фрагмент вируса содержит два гена.
  32. 32. Вектор по п.30, в котором указанный фрагмент вируса содержит ретровирусный ген.
  33. 33. Вектор по п.32, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген ВИЧ.
  34. 34. Вектор по п.31, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген дад-ро1 ВИЧ.
  35. 35. Вектор по п.30, в котором указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента.
  36. 36. Вектор по п.30, в котором указанный индикаторный ген представляет собой функциональный индикаторный ген.
  37. 37. Вектор по п.30, в котором указанный индикаторный ген представляет собой нефункциональный индикаторный ген.
  38. 38. Вектор по п.30, в котором указанный индикаторный ген представляет собой ген люциферазы.
  39. 39. Упаковывающая клетка-хозяин, содержащая вектор по п.30.
  40. 40. Упаковывающая клетка-хозяин по п.39, представляющая собой клетку млекопитающего.
  41. 41. Упаковывающая клетка-хозяин по п.40, представляющая собой клетку человека.
  42. 42. Упаковывающая клетка-хозяин по п.41, представляющая собой клетку почки эмбриона человека.
  43. 43. Упаковывающая клетка-хозяин по п.42, представляющая собой клетку 293.
  44. 44. Упаковывающая клетка-хозяин по п.41, принадлежащая линии клеток гепатомы человека.
  45. 45. Упаковывающая клетка-хозяин по п.44, представляющая собой клетку ЩрС2.
  46. 46. Упаковывающая клетка-хозяин по п.44, представляющая собой клетку Ηιι1ι7.
  47. 47. Способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и нефункциональный индикаторный ген, причем экспрессия указанного нефункционального индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
    (б) измерение уровня экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах; и (в) сравнение уровня экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного нефункционального индикаторного гена, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному препарату.
  48. 48. Способ по п.47, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как раскрыто в п.47, но в отсутствие указанного противовирусного препарата.
  49. 49. Способ по п.47, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена представляет собой стандартный уровень экспрессии, который определяют, как раскрыто в п.47, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного препарата.
  50. 50. Способ по п.47, в котором указанный вектор содержит ДНК геномного вирусного вектора.
  51. 51. Способ по п.47, в котором указанный вектор содержит ДНК субгеномного вирусного вектора.
  52. 52. Способ по п.47, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ретровируса.
    -66005426
  53. 53. Способ по п.52, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ВИЧ.
  54. 54. Способ по п.53, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую угГ, ург, 1а1, геу, ури или пеГ, или их комбинацию.
  55. 55. Способ по п.47, в котором указанный фрагмент вируса кодирует один белок.
  56. 56. Способ по п.47, в котором указанный фрагмент вируса кодирует два белка.
  57. 57. Способ по п.47, в котором указанный фрагмент вируса содержит ретровирусный ген.
  58. 58. Способ по п.57, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген ВИЧ.
  59. 59. Способ по п.58, в котором указанный фрагмент вируса содержит ген дад-ро1 ВИЧ.
  60. 60. Способ по п.47, в котором указанный фрагмент вируса представляет собой фрагмент, полученный от пациента.
  61. 61. Способ по п.47, в котором указанный индикаторный ген представляет собой ген люциферазы.
  62. 62. Способ по п.47, в котором указанный нефункциональный индикаторный ген содержит пермутированный промотор.
  63. 63. Способ по п.47, в котором указанный нефункциональный индикаторный ген содержит пермутированную кодирующую область.
  64. 64. Способ по п.47, в котором указанный нефункциональный индикаторный ген содержит инвертированный интрон.
  65. 65. Способ по п.47, в котором указанная клетка-хозяин представляет собой клетку человека.
  66. 66. Способ по п.65, в котором указанная клетка-хозяин представляет собой Т-клетку человека.
  67. 67. Способ по п.47, дополнительно включающий стадию инфицирования указанных клеток-хозяев вирусными частицами вектора, полученными из отфильтрованных супернатантов культуры упаковывающих клеток-хозяев данного вектора, причем указанную стадию проводят до стадии а).
  68. 68. Способ по п.67, в котором указанную стадию инфицирования осуществляют путем совместного культивирования указанных клеток-хозяев с упаковывающими клетками-хозяевами вектора.
  69. 69. Способ по п.67, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки человека.
  70. 70. Способ по п.67, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки почки эмбриона человека.
  71. 71. Способ по п.70, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки 293.
  72. 72. Способ по п.67, в котором упаковывающие клетки-хозяева принадлежат линии клеток гепатомы человека.
  73. 73. Способ по п.72, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки ШрС2.
  74. 74. Способ по п.72, в котором упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки Ηι.ι1ι7.
  75. 75. Способ по п.67, в котором клетки-хозяева и упаковывающие клетки-хозяева представляют собой клетки одного и того же типа.
  76. 76. Способ определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) определение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату способом по п.1, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента; и (б) сравнение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, определенной на стадии (а), со стандартной кривой чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, причем уменьшение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату относительно указанной стандартной кривой свидетельствует о том, что указанный вирус устойчив к указанному противовирусному лекарственному препарату, и величина указанного уменьшения чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату показывает, в какой степени указанный вирус устойчив к противовирусному лекарственному препарату.
  77. 77. Способ определения устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) определение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату способом по п.47, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента; и (б) сравнение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, определенной на стадии (а), со стандартной кривой чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату, причем уменьшение чувствительности указанного вируса к указанному противовирусному лекарственному препарату относительно указанной стандартной кривой свидетельствует о том, что указанный вирус устойчив к указанному противовирусному лекарственному препарату, и величина указанного уменьшения чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату показывает, в какой степени указанный вирус устойчив к противовирусному лекарственному препарату.
  78. 78. Способ определения прогрессирования или развития устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий
    -67005426 (а) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в первый момент времени способом по п.1, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента;
    (б) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному препарату во второй, более поздний момент времени способом по п.1, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента в этот более поздний момент времени;
    (в) сравнение эффективности противовирусного лекарственного препарата, оцененной на стадиях (а) и (б), причем уменьшение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в более поздний момент времени по сравнению с более ранним свидетельствует о развитии или прогрессировании устойчивости вируса, инфицирующего указанного пациента, к противовирусному лекарственному препарату.
  79. 79. Способ определения прогрессирования или развития устойчивости вируса, инфицирующего пациента, к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в первый момент времени способом по п.47, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента;
    (б) определение чувствительности указанного вируса к противовирусному препарату во второй, более поздний момент времени способом по п.47, причем указанный фрагмент вируса является фрагментом, полученным от пациента в этот более поздний момент времени;
    (в) сравнение эффективности противовирусного лекарственного препарата, оцененной на стадиях (а) и (б), причем уменьшение чувствительности указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату в более поздний момент времени по сравнению с более ранним свидетельствует о развитии или прогрессировании устойчивости вируса, инфицирующего указанного пациента, к противовирусному лекарственному препарату.
  80. 80. Способ по п.1, в котором указанный вектор содержит ДНК гепаднавируса.
  81. 81. Способ по п.80, в котором указанный вектор содержит ДНК НВУ.
  82. 82. Способ по п.81, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую белки С, Р или Х, или их комбинацию.
  83. 83. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент вируса включает ген НВУ.
  84. 84. Способ по п.83, в котором указанный фрагмент вируса включает ген Р НВУ.
  85. 85. Способ по п.83, в котором указанный фрагмент вируса включает ген ВТ НВУ.
  86. 86. Способ по п.83, в котором указанный фрагмент вируса включает ген ДНК-полимеразы НВУ.
  87. 87. Вектор по п.30, в котором указанный фрагмент вируса включает ген гепаднавируса.
  88. 88. Вектор по п.87, в котором указанный фрагмент вируса включает ген НВУ.
  89. 89. Вектор по п.88, в котором указанный фрагмент вируса включает ген Р НВУ.
  90. 90. Вектор по п.88, в котором указанный фрагмент вируса включает ген ДНК-полимеразы НВУ или ген ВТ НВУ.
  91. 91. Способ определения биологической эффективности потенциального противовирусного соединения, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного потенциального противовирусного соединения, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, включающий фрагмент вируса и индикаторный ген, причем экспрессия указанного индикаторного гена зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
    (б) измерение уровня экспрессии указанного индикаторного гена в указанных клетках-хозяевах; и (в) сравнение указанного уровня экспрессии указанного индикаторного гена, измеренного на стадии (б) , с контрольным уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикаторного гена, измеренным на стадии (в), и уровнем экспрессии, измеренным на стадии (б), коррелирует с эффективностью указанного потенциального противовирусного соединения, определяя тем самьм эффективность потенциального противовирусного соединения.
  92. 92. Способ по п.91, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена определяют, как раскрыто в п.91, но в отсутствие указанного противовирусного соединения.
  93. 93. Способ по п.91, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикаторного гена представляет собой стандартный уровень экспрессии, который определяют, как раскрыто в п.91, при использовании вектора, содержащего фрагмент стандартного лабораторного вируса, в отсутствие противовирусного соединения.
  94. 94. Способ по п.91, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ретровируса.
  95. 95. Способ по п.94, в котором указанный вектор содержит ДНК, происходящую из ВИЧ.
  96. 96. Способ по п.91, в котором указанный вектор для определения резистентности содержит ДНК гепаднавируса.
  97. 97. Способ по п.91, в котором указанный вектор содержит ДНК НВУ.
  98. 98. Способ по п.95, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую дад-ро1 ВИЧ.
    -68005426
  99. 99. Способ по п.97, в котором указанный вектор содержит ДНК, кодирующую белок Р ΗΒV.
  100. 100. Способ по п.91, в котором указанный фрагмент вируса кодирует один белок.
  101. 101. Способ по п.91, в котором указанный фрагмент вируса кодирует два белка.
  102. 102. Способ по п.91, в котором указанный фрагмент вируса включает ретровирусный ген.
  103. 103. Способ по п.102, в котором указанный фрагмент вируса включает ген ВИЧ.
  104. 104. Способ по п.91, в котором указанный фрагмент вируса включает ген гепаднавируса.
  105. 105. Способ по п.104, в котором указанный фрагмент вируса включает ген ΗΒV.
  106. 106. Способ определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному препарату, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного противовирусного препарата, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикатор, причем экспрессия указанного индикатора зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
    (б) измерение уровня экспрессии указанного индикатора в указанных клетках-хозяевах; и (в) сравнение уровня экспрессии указанного индикатора, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикатора, причем разница между указанным уровнем экспрессии индикатора, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с чувствительностью указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату, определяя тем самым чувствительность указанного вируса к противовирусному лекарственному препарату.
  107. 107. Способ по п.106, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикатора определяют, как раскрыто в п.106, но в отсутствие противовирусного препарата.
  108. 108. Способ по п.106, в котором указанный индикатор включает ДНК-структуру.
  109. 109. Способ по п.106, в котором указанный индикатор включает РНК-структуру.
  110. 110. Способ определения биологической эффективности потенциального противовирусного соединения, включающий (а) культивирование клеток-хозяев в присутствии указанного потенциального противовирусного соединения, причем указанные клетки-хозяева содержат вектор для определения указанной чувствительности, содержащий фрагмент вируса и индикатор, причем экспрессия указанного индикатора зависит от активности гена, кодируемого указанным фрагментом вируса, и указанный вектор содержит не все вирусные гены, необходимые для образования инфекционной вирусной частицы;
    (б) измерение уровня экспрессии указанного индикатора в указанных клетках-хозяевах; и (в) сравнение указанного уровня экспрессии указанного индикатора, измеренного на стадии (б), с контрольным уровнем экспрессии указанного индикатора, причем разница между уровнем экспрессии указанного индикатора, измеренным на стадии (б), и указанным контрольным уровнем экспрессии коррелирует с эффективностью указанного потенциального противовирусного соединения, определяя тем самым эффективность потенциального противовирусного соединения.
  111. 111. Способ по п.110, в котором контрольный уровень экспрессии указанного индикатора определяют, как раскрыто в п.110, но в отсутствие указанного противовирусного соединения.
  112. 112. Способ по п.110, в котором указанный индикатор включает ДНК-структуру.
  113. 113. Способ по п.110, в котором указанный индикатор включает РНК-структуру.
    1 Ί νί( Е_] ίαί пе? I о__ ро1 И 1ррц ΐ иίί ΐ из к из ург теъ епу из пи5
EA199800669A 1996-01-29 1997-01-29 Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному соединению и способы их применения EA005426B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US59300996A 1996-01-29 1996-01-29
PCT/US1997/001609 WO1997027319A1 (en) 1996-01-29 1997-01-29 Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199800669A1 EA199800669A1 (ru) 1999-02-25
EA005426B1 true EA005426B1 (ru) 2005-02-24

Family

ID=24372979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199800669A EA005426B1 (ru) 1996-01-29 1997-01-29 Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному соединению и способы их применения

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP0852626B1 (ru)
JP (1) JP4183749B2 (ru)
KR (1) KR100537153B1 (ru)
CN (1) CN1263867C (ru)
AP (1) AP9801360A0 (ru)
AT (1) ATE447621T1 (ru)
AU (1) AU732255B2 (ru)
CA (1) CA2216126C (ru)
DE (2) DE69739645D1 (ru)
EA (1) EA005426B1 (ru)
ES (1) ES2175355T3 (ru)
HU (1) HUP9900388A3 (ru)
IL (1) IL125464A (ru)
NO (1) NO983421L (ru)
NZ (1) NZ331376A (ru)
PL (1) PL328068A1 (ru)
RO (1) RO118887B1 (ru)
WO (1) WO1997027319A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2646472C1 (ru) * 2016-10-07 2018-03-05 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ оценки эффективности терапии инфекции вызванной вирусом герпеса человека 6 типа у детей

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE218541T1 (de) 1992-08-25 2002-06-15 Searle & Co Hydroxyethylaminosulfonamide verwendbar als inhibitoren retroviraler proteasen
DE69712731T2 (de) 1996-01-26 2003-02-06 Virco Nv Verfahren zur überwachung der chemotherapie von hiv-positiven patienten basierend auf der phenotypischen medikamentempfindlichkeit vom hiv stamm des patienten
US6242187B1 (en) 1996-01-29 2001-06-05 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
EP1012334A4 (en) * 1997-07-30 2004-12-29 Virologic Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETERMINING SENSITIVITY AND RESISTANCE TO ANTIVIRAL DRUGS, AND SCREENING FOR ANTIVIRAL DRUGS
WO1999051776A1 (en) * 1998-04-07 1999-10-14 Southern Research Institute High-throughput method for screening for antiviral activity
CA2329140A1 (en) * 1998-05-26 1999-12-02 Virologic, Inc. Means and methods for monitoring non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor antiretroviral therapy
US7037644B1 (en) 1998-05-26 2006-05-02 Virologic, Inc. Means and methods for monitoring non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor antiretroviral therapy and guiding therapeutic decisions in the treatment of HIV/AIDS
US20030148307A1 (en) 1998-06-19 2003-08-07 Department Of Health & Human Services, C/O Centers Of Disease Control And Prevention Method and kit for detecting resistance to antiviral drugs
US6787126B1 (en) 1998-06-19 2004-09-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method and kit for detecting resistance to antiviral drugs
ES2237923T3 (es) * 1998-06-19 2005-08-01 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Metodo para detectar resistencia a los medicamentos antivirales.
BR9912209A (pt) * 1998-06-24 2002-11-05 Virologic Inc Recursos e métodos para monitoração de terapia anti-retroviral inibidora de transcriptase reversa de nucleosìdeo e guia de decisões terapêuticas no tratamento de hiv/aids
EP1185712B8 (en) 1999-05-28 2005-10-19 Virco Bvba New mutational profiles in hiv-1 reverse transcriptase correlated with phenotypic drug resistance
EP1326640A4 (en) * 2000-09-15 2004-12-15 Virologic Inc NON-NUCLEOSIDIC REVERSE-TRANSCRIPTASE INHIBITOR AS ANTIRETROVIRAL THERAPY
RU2318213C2 (ru) 2000-10-20 2008-02-27 Вирко Бвба Новые мутационные профили обратной транскриптазы вич-1, коррелирующие с фенотипической резистентностью к лекарственным средствам
EP1340075B1 (en) * 2000-10-20 2009-01-28 Virco Bvba Establishment of biological cut-off values for predicting resistance to therapy
US7247439B1 (en) 2001-06-04 2007-07-24 Monogram Biosciences, Inc. Method of evaluating a patient antibody response to envelope proteins of a virus
US7097970B2 (en) 2001-06-04 2006-08-29 Monogram Biosciences, Inc. Methods of evaluating viral entry inhibitors using patient derived envelope protein constructs
US7320878B2 (en) 2001-11-08 2008-01-22 Tibotec Pharmaceuticals, Ltd. Protease assay for therapeutic drug monitoring
EP1522039B1 (en) 2002-07-01 2008-06-04 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. New mutational profiles in hiv-1 reverse transcriptase correlated with phenotypic drug resistance
EP1520247B1 (en) 2002-07-01 2009-05-27 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Mutational profiles in hiv-1 protease correlated with phenotypic drug resistance
US8603736B2 (en) 2004-06-07 2013-12-10 Monogram Biosciences, Inc. Compositions and methods for determining resistance to inhibitors of virus entry using recombinant virus assays
US8178291B2 (en) 2005-02-18 2012-05-15 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining hypersusceptibility of HIV-1 to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
CA2601922C (en) 2005-02-18 2020-11-24 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining anti-hiv drug susceptibility and replication capacity of hiv
EP2458018A3 (en) 2005-05-27 2012-07-25 Monogram BioSciences, Inc. Methods and compositions for determining resistance of HIV-1 to protease inhibitors
US8071284B2 (en) 2005-06-06 2011-12-06 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for determining altered susceptibility of HIV-1 to anti-HIV drugs
US9506121B2 (en) 2005-06-06 2016-11-29 Monogram Biosciences, Inc. Methods for determining resistance or susceptibility to HIV entry inhibitors
US8114585B2 (en) 2006-06-13 2012-02-14 Monogram Biosciences, Inc. Method for determining human immunodeficiency virus (HIV) coreceptor utilization by examining gp41 molecular determinants
ES2639568T3 (es) * 2007-01-23 2017-10-27 Janssen Pharmaceutica Nv Método para diseñar un régimen farmacológico para pacientes infectados con el VIH
US9581595B2 (en) 2007-02-26 2017-02-28 Laboratory Corporation Of America Holdings Compositions and methods for determining whether a subject would benefit from co-receptor inhibitor therapy
JPWO2018030534A1 (ja) * 2016-08-10 2019-06-13 国立研究開発法人理化学研究所 Ｂ型肝炎治療用組成物、及びｂ型肝炎ウイルスの複製活性の評価方法
WO2018126042A1 (en) * 2016-12-29 2018-07-05 Virongy L.L.C. Retro- and lenti-hbv hybrid vectors and constructs
CN109722465B (zh) * 2019-01-07 2022-02-01 福建省疾病预防控制中心(福建省健康教育促进中心、福建省卫生检验检测中心) 一种hiv耐药检测载体和构建方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0291893A1 (en) * 1987-05-19 1988-11-23 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Stable human cell lines expressing an indicator gene product under virus-specific genetic controls
EP0361749B1 (en) * 1988-09-27 1995-02-08 Dana Farber Cancer Institute A vector comprising a replication competent HIV-I provirus and a heterologous gene
HU209835B (en) * 1988-12-07 1994-11-28 Univ Osaka Res Found Method for producing of retrovirus protease, reverse transcriptase and integrase
ES2110411T3 (es) * 1989-08-25 1998-02-16 Chiron Corp Metodos para cultivar el virus de la hepatitis c (hcv) en lineas celulares de linfocitos b o t.
GB8923123D0 (en) * 1989-10-13 1989-11-29 Connaught Lab A vaccine for human immunodeficiency virus
FR2700169B1 (fr) * 1993-01-04 1995-03-24 Transgene Sa Nouveaux variants trans-dominants TAT du virus de l'immunodéficience humaine.
US5645982A (en) * 1993-08-19 1997-07-08 Systemix, Inc. Method for screening potential therapeutically effective antiviral agents
AU1923795A (en) * 1994-02-18 1995-09-04 University Of Washington Methods and compositions for screening for anti-aids drugs
US5733543A (en) * 1994-04-29 1998-03-31 Nabel; Gary J. Introduction of HIV-protective genes into cells by particle-mediated gene transfer
JP4303315B2 (ja) * 1994-05-09 2009-07-29 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド 非交差性レトロウイルスベクター
US5837464A (en) * 1996-01-29 1998-11-17 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
EP1012334A4 (en) * 1997-07-30 2004-12-29 Virologic Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETERMINING SENSITIVITY AND RESISTANCE TO ANTIVIRAL DRUGS, AND SCREENING FOR ANTIVIRAL DRUGS

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KELLAM P. et al. Recombinant Virus Assay: a Rapid, Phenotypic Assay for Assessment of Drug Susceptibility of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. January 1994, Vol. 38, pages 23-30 *
SALTARELLI M.J. et al. The CAEV tat Gene Trans-activates the Viral LTR and Is Necessary for Efficient Viral Replication. Virology. 1993, Vol. 197, pages 35-44, see entire document *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2646472C1 (ru) * 2016-10-07 2018-03-05 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ оценки эффективности терапии инфекции вызванной вирусом герпеса человека 6 типа у детей

Also Published As

Publication number Publication date
WO1997027319A1 (en) 1997-07-31
EP1170380B1 (en) 2009-11-04
JP4183749B2 (ja) 2008-11-19
IL125464A (en) 2007-12-03
EP0852626A4 (en) 1999-08-25
EP0852626A1 (en) 1998-07-15
DE69711584T2 (de) 2002-11-07
KR19990082129A (ko) 1999-11-15
NZ331376A (en) 2000-03-27
CA2216126A1 (en) 1997-07-31
AU732255B2 (en) 2001-04-12
DE69739645D1 (de) 2009-12-17
RO118887B1 (ro) 2003-12-30
HUP9900388A3 (en) 2005-03-29
EA199800669A1 (ru) 1999-02-25
NO983421L (no) 1998-09-25
EP1170380A3 (en) 2003-05-02
ES2175355T3 (es) 2002-11-16
CA2216126C (en) 2009-03-31
ATE447621T1 (de) 2009-11-15
JP2000503849A (ja) 2000-04-04
PL328068A1 (en) 1999-01-04
EP0852626B1 (en) 2002-04-03
HUP9900388A2 (hu) 1999-05-28
IL125464A0 (en) 1999-03-12
EP1170380A2 (en) 2002-01-09
CN1263867C (zh) 2006-07-12
KR100537153B1 (ko) 2006-12-15
CN1213407A (zh) 1999-04-07
AP9801360A0 (en) 1998-12-31
DE69711584D1 (de) 2002-05-08
AU1952897A (en) 1997-08-20
NO983421D0 (no) 1998-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA005426B1 (ru) Векторы для определения чувствительности вируса к противовирусному лекарственному соединению и способы их применения
US5837464A (en) Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
US6942969B2 (en) Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
Doedens et al. Inhibition of cellular protein secretion by poliovirus proteins 2B and 3A.
US6630343B1 (en) Hepatitis C virus culture system
Tang et al. Human immunodeficiency virus type 1 N-terminal capsid mutants that exhibit aberrant core morphology and are blocked in initiation of reverse transcription in infected cells
Ni et al. Generation and characterization of a stable cell line persistently replicating and secreting the human hepatitis delta virus
Karamichali et al. HCV defective genomes promote persistent infection by modulating the viral life cycle
Geng et al. The putative protein 6 of the severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus: expression and functional characterization
Hickman et al. Influenza A virus negative strand RNA is translated for CD8+ T cell immunosurveillance
CN102199613A (zh) 感染性丙型肝炎病毒高生产hcv突变体及其应用
Hernandez et al. A single deletion in the membrane-proximal region of the Sindbis virus glycoprotein E2 endodomain blocks virus assembly
Primadharsini et al. Development of recombinant infectious hepatitis E virus harboring the nanoKAZ gene and its application in drug screening
CN113817753A (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
JP2001512036A (ja) 抗ウイルス薬剤感受性および耐性を測定するための組成物および方法、並びに抗ウイルス薬剤をスクリーニングするための組成物および方法
US20020034732A1 (en) Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
van Buuren et al. Transmission genetics of drug-resistant hepatitis C virus
Martin et al. Mutants of Rous sarcoma virus with extensive deletions of the viral genome
Jung et al. Influence of Zika virus 3′-end sequence and nonstructural protein evolution on the viral replication competence and virulence
CN109913424B (zh) 一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系、应用及构建方法
KR100471946B1 (ko) Ｃ형 간염바이러스(ｈｃｖ)의 리플리콘, 이를 포함하는세포주, 및 상기 세포주를 이용한 ｈｃｖ 탐지방법
WO2022150293A1 (en) Coronavirus replicon delivery particles and methods of use thereof
AU776535B2 (en) Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
US20100215696A1 (en) Efficiently replicable heptitis c virus mutant, a heptitis c virus mutant comprising reporter gene, a method of preparing of hcv vaccine using the same and a method of screening anti hcv composition using the same
JP3831035B2 (ja) Ｃ型肝炎ウイルス感受性組換え肝細胞及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU