ES2222456T3 - Lineas celulares epiteliales de higado humano. - Google Patents

Abstract

LINEAS DE CELULAS INMORTALIZADAS DERIVADAS DE UN HIGADO HUMANO ADULTO NORMAL QUE MUESTRAN CARACTERISTICAS FENOTIPICAS DE CELULAS EPITELIALES DE HIGADO ADULTO NORMAL.

Description

Líneas celulares epiteliales de hígado humano.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención se refiere a líneas celulares continuas derivadas de tejido hepático de humano adulto sano. Estas líneas celulares presentan características morfológicas y de expresión genética que concuerdan con un origen de hepatocitos humanos sanos. Las líneas celulares se inmortalizan mediante expresión del antígeno T grande (TAg) del virus SV40, pero no son tumorígenas. Como tales, proporcionan una fuente reproducible de células para estudios de iniciación y progresión de la carcinogenia, especialmente carcinogenia química o vírica producida por el metabolismo hepático de compuestos precursores no tumorígenos para dar sustancias genotóxicas o por infección por virus oncogénicos de la hepatitis.

Descripción de la técnica relacionada

A lo largo de esta solicitud de patente se citan numerosos artículos de la bibliografía científica. Cada una de estas referencias se incorpora en su totalidad en el presente documento mediante tal cita.

Kaighn y Prince (1) describieron cultivos de células hepáticas de donantes humanos que eran fetos, lactantes y adultos, obtenidas por clonación, hace más de 20 años. Todos estos cultivos tenían una duración de vida limitada. Sus observaciones sugirieron la existencia de células epiteliales de hígado humano de adulto sano que, o bien están menos diferenciadas, o bien pueden experimentar diferenciación retrógrada en una forma que puede completar unas pocas duplicaciones de la población in vitro si se cultivan en condiciones adecuadas. Se han establecido los cultivos de células epiteliales de hígado de rata (2, 3), pero estos cultivos, al igual que los de Kaighn y Prince, tenían sólo duraciones de vida limitadas. Recientemente, se describió un medio de cultivo sin suero (LCM, descrito posteriormente) que aguanta la replicación prolongada de células epiteliales de hígado humano sano (4). Sin embargo, el potencial de crecimiento de las células hepáticas en este medio seguía siendo limitado, es decir, nunca se obtuvieron más de 12 series de divisiones celulares en ninguno de los cultivos. Todos estos cultivos no son adecuados para los estudios a largo plazo debido a su duración de vida limitada.

Se ha estudiado la activación metabólica de los carcinógenos medioambientales de diversas clases químicas en explantes o microsomas de tejido hepático humano y hepatocitos humanos aislados (5). Además, las diferencias específicas de la especie animal observadas en el metabolismo de la aflatoxina B_{1} (AFB_{1}) y el 2-acetilaminofluoreno indican la necesidad de estudiar el hígado o los hepatocitos humanos. Sin embargo, debido a que la disponibilidad del tejido es limitada, los individuos varían en su propensión por el metabolismo xenobiótico y las condiciones reproducibles in vitro son difíciles de establecer, no se ha establecido un sistema reproducible con células hepáticas humanas para estudios fármaco-toxicológicos.

Varios grupos de investigadores han informado de que la longevidad de cultivos de células epiteliales humanas puede aumentarse o en algunos casos hacerse indefinida (5, 6) mediante transformación con el gen del antígeno T grande (TAg) del virus SV40. Tales células transformadas pueden tener un cariotipo casi normal y algunos de los aislados mantienen muchas de las características de crecimiento y diferenciación de sus homólogos normales, incluyendo la no-tumorogenicidad. Además, Woodworth et al. y Ledley et al. (7-9) han informado de que los hepatocitos de ratas transformados con un gen del TAg de SV40 mantenían diversas características de los hepatocitos normales. Desgraciadamente, tales cultivos no son útiles para estudios de la carcinogenia humana y estudios de metabolismo de fármacos, ya que el metabolismo de compuestos xenobióticos puede ser muy diferente en humanos y en ratas.

Sumario de la invención

El hígado humano es uno de los pocos órganos de los adultos que puede regenerarse. Sin embargo, nunca se ha establecido ningún cultivo de replicación continua de hepatocitos humanos de adulto, no neoplásicos. En el presente documento, se describe el establecimiento de un cultivo continuo de células epiteliales de hígado humano sano (hepatocitos) mediante infección de cultivos replicativos de tales células con un vector retrovírico que contiene el gen de TAg de SV40. Estas líneas celulares (células THLE) superan las deficiencias de las líneas celulares previas con respecto a la limitación de la duración de vida o el origen no humano y de este modo proporcionan una fuente reproducible de células para estudios a largo plazo de carcinogenia y toxicología humanas. Las células parecen ser inmortales, es decir, tienen una duración de vida indefinida in vitro. Las células de las líneas descritas en el presente documento no son tumorígenas y por tanto, proporcionan una fuente para estudios de procesos por los que las células se hacen tumorígenas. Son particularmente valiosas en el estudio de la carcinogenia química, ya que en el metabolismo de compuestos precursores no carcinógenos mediante enzimas hepáticas para dar un compuesto genotóxico parece que hay un mecanismo principal de carcinogenia mediante productos químicos. Por tanto, las células proporcionan un medio de búsqueda de productos químicos por el potencial carcinógeno mediante exposición de las células al precursor carcinógeno sospechoso y de ensayar la conversión de las células en un fenotipo tumorígeno. La reproducibilidad de tal ensayo depende de si se tiene una línea celular reproducible para llevar a cabo las pruebas anteriores. Las líneas celulares THLE de la presente invención proporcionan tales líneas celulares reproducibles.

Además, podría demostrarse que las células THLE de la presente invención son útiles en la investigación del control de los procesos de diferenciación. Generalmente se piensa que la proliferación y diferenciación son procesos celulares opuestos (47, 48). Por tanto, las células THLE pueden utilizarse para identificar fármacos útiles en el tratamiento de los tumores hepáticos mediante investigación del efecto de tales fármacos sobre el fenotipo de las células de THLE. Los compuestos que inducen diferenciación terminal de las células THLE se considerarían como candidatos prometedores.

La introducción de oncogenes además del gen de TAg de SV40 también puede realizarse en las células THLE de manera que se investigue el efecto de la expresión de tales oncogenes adicionales sobre la tumorogenicidad u otro aspecto fenotípico de las células THLE. De nuevo, las líneas celulares así obtenidas pueden utilizarse como diana en los ensayos de búsqueda de compuestos que son eficaces para parar la proliferación de células que expresan estos oncogenes adicionales.

Finalmente, los hepatocitos son el tipo celular infectado por los virus de la hepatitis (Hep A, Hep B, Hep C y hepatitis no A no B) y también el tipo celular infectado por muchos parásitos humanos. Por tanto, las células THLE proporcionan un huésped in vitro para el crecimiento de estos organismos y por consiguiente un sistema in vitro para el estudio de la biología celular de tales infecciones y la búsqueda de compuestos con eficacia para bloquear o curar tales infecciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la morfología y la expresión de marcadores celulares en las células THLE-2; micrografía de contraste de fases que muestra el aspecto epitelial de las células THLE-2 (A), tinción con inmunofluorescencia indirecta para el antígeno T de SV40 (B) y la citoqueratina 18 (C) que demuestra la presencia de ambas proteínas en aproximadamente el 100% de células de paso 5, tinción con inmunoperoxidasa que muestra la expresión clonal de la albúmina en las células THLE-2 de paso 5 (D). Para los análisis de inmunofluorescencia, la unión inespecífica se bloqueó con el suero de bloqueo apropiado (dilución 1:100, 20 min.). Posteriormente, se incubaron a temperatura ambiente (desde 30 min. hasta 1 h) anticuerpos (IgG) específicos de albúmina (1:20; American Qualox, La Mirada, CA), citoqueratinas generales (1:15; ICN, Costa Mesa, CA), citoqueratina 18 y citoqueratina 19 (1:20 cada una; ICN, Costa Mesa, CA), \alpha-fetoproteína (1:50; Zymed, San Francisco, CA), \alpha_{1}-antitripsina, \alpha_{2}-macroglobulina (1:50; Chemicon, Inc., Temecula, CA) y antígeno T de SV40 (1:5; Oncogene Science, Manhasset, NY) y se revelaron con anticuerpos secundarios fluorescentes diluidos 1:32 a temperatura ambiente (1 h). La tinción inmunocitoquímica para la albúmina se realizó mediante incubación con un anticuerpo de conejo anti-ratón secundario (DakoCorp, Santa Bárbara, CA) y terciario (anticuerpo de cerdo anti-conejo; DakoCorp, Santa Bárbara, CA) y revelado con peroxidasa de rábano picante ("horse radish") a temperatura ambiente (30 min. cada incubación).

La figura 2 muestra la secreción de albúmina de THLE-2 (A) y THLE-3 (B). Cuando se normalizaron con densitometría para el patrón de albúmina simultáneamente inmunoprecipitada de 3 ng en A y 2 \mug en B, THLE-2 (Rb), THLE-3 (FL) y THLE-3 (FL) secretaron aproximadamente 300 pg/ml, 70 pg/ml y 14,5 ng/ml de albúmina, respectivamente.

La figura 3 muestra los cariotipos de THLE-2 y THLE-3. La monosomía de los cromosomas 2 y 10, una ruptura en el cromosoma 1 (flecha) y una translocación 22q+ que conduce al cromosoma marcador M_{1A} caracterizan la metafase casi diploide de THLE-2 en el paso 18(A). También se detectaron los efectos habituales del antígeno T de SV40 en THLE-3 en el paso 22(B), ilustrados por la monosomía de los cromosomas 13 y 22 y las deleciones en los cromosomas 2 y 8. También se observa un cromosoma marcador (M) no identificado.

La figura 4 muestra los resultados de un experimento que ensayaba la activación metabólica de carcinógenos. Se incubaron (24 h) células THLE-2 con 1,5 \muM de ^{3}H-B[a]p, 32 \muM de ^{3}H-AFB_{1} o 50 \muM de DMN (dimetilnitrosamina), respectivamente. Veinticuatro horas antes del tratamiento con el carcinógeno se realizó un tratamiento previo con Arochlor 1254. Después, las células se recogieron con tripsina, se suspendieron en tampón de lisis (5-10 ml), (Applied Biosystems, Foster City, CA) y se trataron con ribonucleasa y proteinasa K (2 h cada una). El ADN modificado con carcinógeno se aisló de las células mediante extracción con cloroformo / fenol (39), se hidrolizó y se cromatografió. Los aductos de BPDE (benzopireno diol epóxido)-ADN se identificaron mediante mezclado de las bases del ADN hidrolizado con cantidades absorbente de UV de patrones de BPDE-ADN conocidos y se fraccionaron en columnas de Sephadex LH20 y además se caracterizaron mediante HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución) (A; \sqbullet, inducido por Arochlor; O, sin inducir) (24). Los análisis de Northern blot (B) de ARNm poli A^{+} seleccionado mostraron una inducción de CYP1A1 normalizado para GAPDH en el que Arochlor < B[a]P < Arochlor + B[a]P. Las razones relativas CYP1A1 / GAPDH son 0,73, 10,0 y 13,1, respectivamente. El análisis del aducto de alquilo-ADN se realizó mediante HPLC y se detectó mediante marcado posterior con ^{32}P. Los autorradiogramas de la separación por TLC (cromatografía en capa fina) bidimensional del ensayo del nucleótido marcado posteriormente con ^{32}P del ADN de células no tratadas (C) no mostraron aductos de N7-metil desoxiguanosina detectables, pero las células expuestas a DMN (D) tenían niveles detectables tal como se demuestra en este caso con 28 fmol por \mug de ADN. Los aductos co-eluyeron con marcadores UV del producto de marcado posteriormente para confirmar la identidad del aducto. El nivel de aducto se determinó mediante el uso de curvas de recuento en centelleo y de calibración para razones molares de aductos con respecto a dGp sin modificar conocidas frente a detectadas. El ADN purificado procedente de las células tratadas con AFB_{1} se ensayó mediante HPLC de alta resolución para la purificación y detección del aducto (23). Los perfiles de HPLC de los aductos AFB_{1}-ADN a las 24 h identificaron AFB_{1}-fAPyr como el producto principal (E). Las identificaciones se basan en co-elución con patrones auténticos.

La figura 5 muestra el análisis de Northern blot de las enzimas de fase II. El ARN total se aisló a partir de células THLE, tejido hepático humano sano, caso 88-5, lo que conllevó al establecimiento de THLE-2, la línea celular del hepatoblastoma, HepG2 y células epiteliales bronquiales humanas sanas (NHBE). Basándose en la tinción con bromuro de etidio (GADPH subestimaba la cantidad de ARN cargado a partir del hígado), se encontraron expresiones similares de epóxido hidrolasa (A), GPX (glutatión peroxidasa), SOD (superóxido dismutasa) (B) en las células THLE e hígado humano, mientras que la expresión de CAT (catalasa) (A) y de la reductasa del citocromo P450 (B, NADPH-red) estaba reducida.

Descripción detallada de la invención

Las líneas celulares de la presente invención proporcionan materiales biológicos reproducibles para las investigaciones en carcinogenia y toxicología. Las células pueden utilizarse para las investigaciones de activación metabólica de compuestos para dar citocinas o carcinógenos. Las células pueden utilizarse en su estado actual, o alternativamente, pueden introducirse genes exógenos además del antígeno T de SV40 en las células. De forma similar, las líneas celulares de la presente invención pueden infectarse con varios virus de interés en enfermedades humanas, tales como la hepatitis.

Los genes de interés en estudios de carcinogenia y toxicología, por ejemplo, podrían ser oncogenes per se, genes oncosupresores naturales o mutados o genes que codifican para enzimas para el metabolismo de compuestos xenobióticos. Una familia de genes particularmente interesante son los mutantes del gen oncosupresor p53, que se han implicado en la progresión de una variedad de tipos tumorales.

Las líneas celulares de la presente invención, bien tal como se describen en el presente documento o bien las que contienen genes exógenos adicionales, son útiles en la búsqueda y el estudio del modo de acción de los compuestos terapéuticos que alteran la expresión de los genes en las células o que alteran los efectos toxicológicos de alguna sustancia secundaria.

Las realizaciones preferidas de la invención se describen mediante los ejemplos posteriores. Estos ejemplos pretenden expresamente ilustrar, más que limitar, el alcance de la invención.

La proliferación celular se mide en varios experimentos descritos posteriormente. Por tanto, los métodos utilizados para tal medición se exponen como métodos generales. La síntesis de ADN se mide en células inoculadas con densidad clonal (100 células/cm^{2}). El medio se cambia por medio fresco al día siguiente y después de dos días adicionales de incubación se añade [^{3}H]-timidina (New England Nuclear) a los cultivos celulares a 0,5 \muCi/ml. Veinticuatro horas más tarde, la fracción ácida que puede precipitar se recoge sobre filtros de fibra de vidrio y la cantidad de [^{3}H] incorporado se cuantifica mediante recuento en centelleo. Alternativamente, la proliferación se mide contando el número de células en cada colonia. El medio se cambia por el medio en el que la proliferación debe ensayarse un día después de la inoculación con densidad clonal y los platos se incuban durante 7 días adicionales. Después, las células se fijan en formalina y se tiñen con cristal violeta. Se determina el número de células por colonia y se calculan las duplicaciones de población por día, tal como se ha descrito previamente (13).

Para muchos de los experimentos descritos, por ejemplo análisis de Southern y Northern blot y experimentos metabólicos, los cultivos se hacen crecer hasta densidades elevadas. Tales cultivos se incuban en matraces de cultivo de tejidos T175 o en frascos rotativos de 800 ml y se hacen crecer hasta una densidad de 3,7 x 10^{4} células/cm^{2}.

Ejemplo 1 Establecimiento de cultivos continuos de células epiteliales de hígado humano de adulto sano (células THLE) i) Cultivo primario de tejido de hígado de adulto sano

El medio LCM (4) consiste en un medio PFMR-4 (Biofluids, Rockville, MD) en el que la concentración de Ca^{2+} se reduce hasta 0,4 mM y la arginina se sustituye por ornitina 0,3 mM, enriquecida con insulina (1,45 \muM), transferrina (125 nM), toxina colérica (300 pM), factor de crecimiento epidérmico (825 pM), hidrocortisona (0,2 \muM), triyodotironina (10 nM), ácido retinoico (10 nM), fosfoetanolamina (0,5 \muM), Ex-Cyte V (312 \muM), extracto de hipófisis bovina (ref. 10, 7,5 \mug de proteína/ml) y suero desnaturalizado químicamente (10).

Para hacer el medio LCM acondicionado mediante células Hep-G2 (HGLCM), las células Hep-G2 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se mantienen en medio DMEM enriquecido con el 10% de suero bovino fetal. Los cultivos de tales células que casi confluyen se lavan dos veces con LCM y después se mantienen en LCM durante 72 horas. El medio sobrenadante (HGLCM) se elimina, se esteriliza mediante filtración a través de una membrana de 0,22 \mum y se almacena en condiciones estériles.

Las células epiteliales hepáticas normales se obtienen mediante perfusión con colagenasa / dispasa del lóbulo inferior izquierdo de hígados de donantes adultos mediante autopsia inmediata sin evidencia clínica de cáncer (11). Los cultivos se inoculan en matraces que se han recubierto previamente con colágeno I (Vitrogen^{MR}, Celtrix Laboratories, Palo Alto, CA) y se incuban durante la noche en medio de Waymouth que contiene el 10% de suero bovino fetal. Al día siguiente, los cultivos se aclaran con suero salino tamponado con fosfato (PBS) y el medio se cambia por HGLCM.

Al cabo de 2 a 4 días de aislamiento de las células normales, son evidentes grupos de células en replicación espaciadas de forma aleatoria con una morfología de tipo epitelial. Estos cultivos forman una monocapa confluente después de 10-14 días de incubación. Estas células normales pueden subcultivarse con una razón de fraccionamiento de 1:4 utilizando la misma disolución de colagenasa / dispasa tal como se utiliza para el establecimiento del cultivo primario para eliminar las células de la superficie del recipiente de cultivo. La duración media de vida de estos cultivos de células epiteliales hepáticas normales es de 12 duplicaciones de población.

ii) Producción del retrovirus que expresa TAg de SV40

Se construye un retrovirus recombinante que lleva el gen del antígeno T grande del virus SV40 mediante inserción de fragmento BglI-HpaI del ADN vírico de SV40 (nucleótidos 5235-2666) dentro del sitio BamHI del vector retrovírico pZipNeoSVX (12), utilizando secuencias de unión de BamHI y técnicas de ADN recombinante habituales. El fragmento del genoma de SV40 utilizado carece tanto del promotor temprano como del sitio de la poliadenilación.

Las partículas de virus recombinante infecciosas se obtienen mediante transfección de la línea celular de empaquetamiento anfotrópico PA317 con el vector recombinante ecotrópico obtenido anteriormente. Las células transfectadas se aíslan mediante selección con neomicina y se aíslan 10 clones. Las células PA317 clonadas se propagan en el medio DMEM enriquecido con el 10% de FBS. El medio se cambia por medio PC-1 sin suero (Ventrex Laboratories, Portland, ME) y el virus se titula mediante infección de 8 x 10^{4} células NIH 3T3 en un plato de 60 mm con varias diluciones del medio sobrenadante que contiene virus en presencia de 8 \mug/ml de polibreno y mediante recuento de las colonias después de 10 días de selección utilizando 750 g/ml de neomicina.

iii) Infección de células de cultivos primarios de tejido hepático

Se utiliza una mezcla de virus procedente de 7 de los 10 clones de las células PA317 transfectadas para infectar los cultivos primarios de tejido hepático. Se infectaron 8 x 10^{4} células de los cultivos primarios con 0,1 ufp del virus recombinante durante 2 horas en presencia de 8 \mug/ml de polibreno en medio PC-1. Después de la infección, los cultivos se lavan con suero salino tamponado con HEPES (HBS) y se incuban en medio LCM. La infección con el virus recombinante hace que prácticamente todas las células hepáticas en el cultivo experimenten una división rápida. Varios cultivos se han establecido así. De éstos, THLE-2 y THLE-3 se pasan como cultivos en masa. Inicialmente, las células THLE-2 y THLE-3 experimentan aproximadamente 25 duplicaciones de población durante las primeras seis semanas tras la infección, después el crecimiento disminuye notablemente. Las células se crioconservan en cada paso durante este periodo temprano de crecimiento.

La línea celular THLE-2 se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD, el 16 de mayo de 1989 y se le asignó el número de entrada CRL 10149. La línea celular THLE-3 se depositó bajo los términos y condiciones del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection el 14 de enero de 1993 y se le asignó el número de entrada CRL 11233.

Las células THLE-2 de tales reservas crioconservadas del paso temprano se utilizan para determinar las respuestas de crecimiento de las células a los diversos complementos del medio LCM. Los experimentos de eliminación única muestran que la tasa de crecimiento clonal de las células THLE-2 del paso temprano aumentaba si se suprimía el Ex-Cyte V y la toxina colérica de LCM y también si se sustituía la ornitina por arginina. El uso del medio acondicionado mediante células THLE-2 más que mediante células HepG2 mejora además el crecimiento de las células THLE-2. Por tanto, el medio LCM modificado (MLCM) es LCM reformulado con la supresión de Ex-Cyte V y toxina colérica y utilizando arginina más que ornitina (a 0,3 mM) y añadiendo hasta el 30% del medio, en volumen, acondicionado mediante células THLE-2 más que mediante células HepG2.

Mediante la utilización de MLCM para mantener el cultivo, se han cultivado las células THLE-2 durante más de 130 duplicaciones de población sin evidencia de senectud. El tiempo de generación de crecimiento clónico máximo aparente es de 24 horas y su eficacia de formación de colonias es del 15% de promedio. Las células THLE-3 se cambiaron a MLCM en el paso temprano y por consiguiente, esta línea celular nunca entró en un estado quiescente. Las células THLE-3 se han hecho crecer durante más de 100 duplicaciones de población. Su tasa de crecimiento es de 0,7 PDL (duplicaciones de población)/día y su eficacia de formación de colonias es del 15%.

Ejemplo 2 Análisis de la expresión de genes específica del hígado en las células THLE

Se evaluó la expresión de varios genes específicos del hígado tanto en la etapa de la transcripción como de la traducción en las células THLE.

El análisis del cariotipo se realiza utilizando técnicas habituales de la técnica.

Para el análisis de Southern blot, el ADN celular se extrae mediante métodos habituales de la técnica y se digiere con enzima de restricción ClaI. El ADN se somete a electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% y se transfiere a Gene Screen Plus^{MR} (DuPont, Wilmington, DE). El ADN genómico se analiza para detectar la presencia de ADN del antígeno T del SV40 mediante utilización de sondas con el fragmento HindIII de 1,17 kilopares de bases (kpb) del gen del antígeno T grande marcado con ^{32}P usando un kit de translación por cortes ("nick translation") según el método descrito por el fabricante (DuPont).

La expresión de ARNm se valora mediante análisis Northern blot y mediante hibridación in situ. Para el Northern blotting, el ARN se aísla tal como se ha descrito anteriormente (15) mediante hibridación para dar oligo-dT biotinilados, seguido de captura del ARN hibridado con perlas paramagnéticas de estreptavidina (Promega, Madison, WI). El protocolo de hibridación también se ha descrito anteriormente (15).

Para la hibridación in situ, las células se incuban durante 10 días en portaobjetos con cámaras para cultivos, después se lavan dos veces con PBS (pH 7,4) y se fijan durante 3 minutos en PBS que contiene el 4% de paraformaldehído, el 2% de sacarosa, 5 mM de MgCl_{2} y el 0,02% de pirocarbonato dietílico. Los portaobjetos se lavan entonces con dos cambios de PBS que contienen MgCl_{2} 5mM y después se incuban durante 10 minutos en glicina 0,1 M / Tris 0,2 M y posteriormente se acetilan mediante 10 minutos de incubación en anhídrido acético al 5% / trietanolamina 0,1 M, pH 8,0. Después, se lavan los portaobjetos en PBS y se prehibridan en formamida al 50%, 2x SSC (disolución de citrato sódico y cloruro sódico), ditiotreitol (DTT) 10 mM a 52ºC durante 10 minutos. La hibridación se realiza a 50ºC utilizando sondas de ARNc o a 42ºC utilizando sondas de ADNc en formamida al 50%, 2x SSC, DTT 0,1 mM, 1 mg/ml de ARNt, 10 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado, 2 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) y 6 x 10^{4} cpm/\mul de sonda. Tras la hibridación, los portaobjetos sondados con ARNc se aclaran en formamida al 50%, 5x SSC, a 50ºC durante una hora, después se digiere con ARNasa tal como lo describen Maier et al. (16). Los portaobjetos se lavan después a 45ºC en formamida al 50%, 2x SSC durante 30 minutos y finalmente en 2x SSC durante 30 minutos a 45ºC. Los portaobjetos sondados con sondas de ADNc se aclaran en formamida al 50%, 2x SSC a 37ºC durante 30 minutos, después en formamida al 50%, 1x SSC a temperatura ambiente y finalmente en 1x SSC a temperatura ambiente. Los portaobjetos hibridados se autorradiografían entonces utilizando emulsión NBT2 (Eastman Kodak), se exponen a 4ºC durante desde 7 hasta 10 días y se revelan con revelador D19 de Kodak, después se contratiñen con hematoxilina y eosina, se deshidratan y se montan con Permount.

Las sondas de ADNc están marcadas mediante translación por cortes utilizando dCTP-^{35}S como sustrato. La longitud media de tales sondas es de 0,2 kpb. Las ribosondas (ARNc) se preparan mediante el protocolo de transcripción de Melton et al. (17) utilizando UTP-^{35}S como el nucleótido marcado. Los transcritos se hidrolizan entonces parcialmente con álcali de manera que la mayor parte del marcado está en fragmentos de 100-200 nucleótidos de longitud.

La presencia de epóxido hidrolasa se determina en las líneas celulares mediante hibridación con una sonda génica humana; bien el fragmento SmaI-XhoI (0,4 kpb) o bien el NcoI-NspI (0,9 kpb) del plásmido R60 (Oxford Biochemicals, Oxford, MI 48051). La sonda de NADPH citocromo p450 reductasa deriva del plásmido hp450 (F. Gonzales, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD) mediante digestión con EcoRI y aislamiento del fragmento de 2,4 kpb. La expresión de la superóxido dismutasa (SOD) se determina mediante hibridación hasta un fragmento de EcoRI-HindIII de 0,45 kpb del ADNc obtenido a partir del plásmido sp65/SOD (18). La glutatión peroxidasa se analiza usando un fragmento de EcoRI de 0,8 kpb del ADNc humano obtenido a partir del plásmido pSPT19/GPX (19). Las expresiones de la glutatión-S-transferasa \pii, \alpha y \mu se valoran mediante hibridación con el fragmento de 0,73 kpb del plásmido pGEM4/GST\pii (J.A. Moxow, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD), el fragmento EcoRI de 0,7 kpb del plásmido pGST2-PvuII (20) y el fragmento PstI-EcoRI de 0,67 kpb del plásmido pGST-T-Nco (regalo de P.G. Board, Universidad Nacional de Australia), respectivamente. La sonda para el ARNm de la albúmina se aísla a partir del plásmido B44 (21). El ADNc inserto de 0,73 kpb de B44 se subclona en pGEM4 (Promega, Madison, WI) entre los sitios PstI y HindIII. Para detectar el ARNm de catalasa, se prepara una sonda de traslación por cortes a partir del fragmento EcoRI-HindIII de 1,25 kpb de un plásmido que contiene el fragmento HindIII-PvuII del ADNc de la catalasa humana (22). Las sondas para las isoenzimas del citocromo P450 corresponden al fragmento de ADNc de 3' EcoRI 1A2 de 1,0 kpb, 3' EcoRI 1A1 de 1,0 kpb, 3' BamHI-EcoRI IIA3 de 1,3 kpb, 3' BamHI-EcoRI IIE1 de 1,6 kpb, 3' EcoRI IIIA4 de 1,1 kpb, 5' EcoRI IIB1 de 0,8 kpb o al ADNc entero de IID6 de 1,6 kpb aislado mediante digestión por EcoRI de plásmidos suministrados por F. Gonzales (National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Para la inmunocitoquímica, se hacen crecer las células hasta casi la confluencia en portaobjetos de vidrio con cámaras (Lab-Tek) y se aclaran con suero salino tamponado con fosfato (PBS). Las células se fijan mediante inmersión de los portaobjetos en tampón fosfato que contiene paraformaldehído (para la tinción de la albúmina) o el 100% de metanol a 4ºC (para la tinción de la citoqueratina y TAg). Después, los portaobjetos se aclaran en PBS y se coloca el suero de bloqueo adecuado (dilución 1:100) en cada portaobjeto durante 20 minutos. Los anticuerpos primarios (IgG) contra albúmina (dilución 1:20, ICN, Costa Mesa, CA), citoqueratinas generales (dilución 1:15, ICN), citoqueratina 18 y citoqueratina 19 (cada una con dilución 1:20, ICN) y antígeno T de SV40 (dilución 1:5, Oncogene Science, Manhasset, NY) se aplican a los portaobjetos y se incuban durante 30 minutos hasta 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se aclaran en PBS para retirar el anticuerpo que no se ha unido. Para los estudios de inmunofluorescencia, se colocan isotiocianato de fluoresceína o isotiocianato de rodamina de tetrametilo marcados con anticuerpos secundarios sobre los portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la tinción con peroxidasa de rábano picante (HRP), los portaobjetos se incuban con anticuerpo secundario de cerdo anti-ratón durante 30 minutos a temperatura ambiente, se aclaran en PBS y después, se incuban con anticuerpo terciario de conejo anti-cerdo unido a HRP, en las mismas condiciones. El HRP se detecta mediante recambio de un sustrato de bencidina.

Para experimentos de control negativo, se utilizaron células fibroblásticas de ratón 3T6. Las células HepG2 se utilizaron como una línea celular de control positivo.

La secreción de albúmina a partir de las células THLE se ensayó mediante análisis Western blot de albúmina inmunoprecipitada. Se ajustaron los sobrenadantes celulares (10 ml a partir de cultivos de 72 horas de aproximadamente 0,6 x 10^{6} células/ml en matraces o 1,2 x 10^{6} células/ml en frascos rotativos, las células se cambiaron a LCM sin medio acondicionado 24 horas antes del ensayo) a la concentración de sal y detergente de RIPA (1x) (40), la albúmina inmunoprecipitó (4ºC: 1 h) con albúmina de cabra anti-humano (Dako, Santa Bárbara, CA) y se sometió a análisis de Western blot y densitometría cuantitativa (figura 2). La albúmina se aisló a partir de células que habían crecido en medio sin suero durante 24 horas en frascos rotativos (Rb) o matraces (Fl) (0,6 x 10^{6}/ml respectivamente; 72 h) con 10 \mul de albúmina de cabra anti-humana seguido de extracción (1 h) con proteína A sefarosa (Zymed, South San Francisco, CA). Los inmunocomplejos se lavaron dos veces con tampón de RIPA, una vez en una mezcla de volúmenes iguales de RIPA y TNE (NaCl 0,15 M; Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5; EDTA 1 mM) y una vez en TNE. La proteína de albúmina se eluyó en un tampón de muestra 200 \mul, Tris-HCl 0,06 M, pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glicerol, 5% de \beta-mercaptoetanol, 0,002% de azul de bromofenol), se sometió a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 7,5% con SDS y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó a las uniones inespecíficas a temperatura ambiente (1 h) con leche desnatada (5%) diluida en TBST (Tris 10 nM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20) antes de la hibridación con un anticuerpo anti-albúmina humana de conejo (Dako, Santa Bárbara, CA) diluido a 1:800 en TBST que incluye el 5% de leche desnatada. Posteriormente, la membrana se lavó tres veces en TBST (10 min.) se incubó a temperatura ambiente con un anticuerpo biotinilado de cerdo anti-conejo diluido a 1:2000 en TBST (30 min.), se lavó de nuevo como anteriormente y se incubó a temperatura ambiente en fosfatasa alcalina con estreptavidina en TBST (30 min.), lo que produjo una reacción de color en presencia del cromógeno (ABComplex, Dako, Santa Bárbara, CA).

El análisis del cariotipo de las células THLE-2 y THLE-3 muestra que ambas líneas son hipodiploides (aneuploides) aproximándose la mayor parte de los cariotipos a la diploidía. El cariotipo de cada línea celular es distinto; ninguno es completamente normal. Ambos presentan alteraciones estructurales tales como rupturas de cromátidas, deleciones y fragmentos acéntricos. Tanto THLE-2 como THLE-3 se han probado para la formación de tumores mediante inyección subcutánea en ratones desnudos atímicos; después de 12 meses tras la inyección de las células no apareció ningún tumor.

El análisis Southern blot del ADN de las células THLE-2 muestra que estas células contienen una copia única del gen del antígeno T de SV40 por cada genoma haploide. Los cultivos de células inmortalizadas con TAg de SV40 se pasan como cultivos en masa. El análisis inmunocitoquímico tanto de las células THLE-2 como de THLE-3 entre el 3º y 5º paso muestra que todas las células de ambas líneas expresan TAg en sus núcleos.

En el paso temprano (paso 3), las células tanto THLE-2 como THLE-3 demuestran evidencia inmunocitoquímica de expresión de citoqueratina 18, pero no de citoqueratina 19. Las células del paso temprano también se tiñen de manera positiva para la albúmina. La \alpha-fetoproteína no puede detectarse mediante inmunotinción. La hibridación in situ para ARNm confirma la expresión positiva de albúmina y la ausencia de expresión de \alpha-fetoproteína. La hibridación in situ también detecta ARNm que codifica para transferrina, \alpha2-macroglobulina y \alpha-1-antitripsina.

El examen de nuevo de la expresión de citoqueratina mediante inmunotinción en el paso 10 muestra que tanto la citoqueratina 18 como la citoqueratina 19 se expresan en el último paso en ambas líneas celulares. La expresión de albúmina en las células del último paso (paso 12) depende de las condiciones de cultivo. El crecimiento en condiciones que favorecen la proliferación rápida da como resultado una menor expresión de albúmina. El crecimiento en condiciones que ralentizan la proliferación, tales como cultivo en frascos rotativos o en placas sobre colágeno o en superficies MATRIGEL^{MR} da como resultado una expresión de albúmina aumentada. La secreción de albúmina por las células THLE-2 en cultivo rotativo fue de aproximadamente 300 pg/ml de medio de cultivo. En el cultivo en matraces, las células THLE-2 y THLE-3 produjeron 70 pg/ml y 14,5 ng/ml de albúmina, respectivamente. El análisis inmunocitoquímico de la expresión de albúmina muestra que la albúmina se detecta fácilmente en las células THLE-2 y THLE-3 de paso temprano. Los islotes de células que se teñían para la albúmina estaban rodeados por agrupaciones de células que se teñían de una manera menos intensa, lo que indicaba la presencia de diferentes tipos clonales en el cultivo con bajo PDL.

Las células THLE-2 se han evaluado para la expresión de varios marcadores específicos de hepatocitos. Las células THLE-2 expresan citoqueratina 18 y no citoqueratina 19 en el paso temprano, mientras que en el último paso, se observa la expresión de ambas citoqueratinas. Como la citoqueratina 19 no se expresa normalmente in vivo en los hepatocitos, pero se expresa en las células del conducto biliar, esto es una indicación de que las líneas celulares THLE, o bien desdiferencian con respecto a un tipo celular más primitivo, menos comprometido durante el paso, o bien de que un tipo de célula madre adquiere una ventaja selectiva en el cultivo. Recientemente, otros (44) han mostrado la evidencia que las células del conducto biliar y los hepatocitos surgen a partir de una célula madre común.

Las células para la tinción de \gamma-GT se cultivaron sobre portaobjetos de vidrio con cámaras recubiertos, se lavaron en PBS, se fijaron en acetona helada (2 min.) y se almacenaron a -20º hasta que se usaron. La reacción histoquímica enzimática para \gamma-GT se realizó tal como se describe (41). La línea celular HepG2 se utilizó como un control positivo y la línea celular embrionaria de hámster 3T6 como un control negativo. Se detectó semanalmente \gamma-GT mediante inmunocitoquímica en algunas colonias de THLE-2 y THLE-3, así como en cultivos primarios antes de la transformación vírica. Las células 3T6 fueron negativas, mientras que las células HepG2 presentaron uniformemente altos niveles de la enzima.

Para el análisis de factor VIII, las células se fijaron en acetona helada (2 min.) y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón para el factor VIII humano (45 min.; Zymed) a temperatura ambiente. Los cultivos primarios de células endoteliales de cordón umbilical humano se utilizaron como un control positivo. La expresión del factor VIII no se detectó en el paso temprano o último en las células THLE.

La expresión de la catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa se evalúa en las células THLE-2 mediante análisis Northern blot. Se demuestra que las células expresan ARNm para cada una de estas proteínas.

Cuando se evalúa la expresión de ARNm, se encuentra que las células THLE-2 de paso temprano expresan mensajes para la albúmina, transferrina, \alpha-1- antitripsina, \alpha2-macroglobulina, catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa. La expresión de \alpha-fetoproteína no puede detectarse ni a nivel de ARNm ni al de las proteínas. La \alpha-fetoproteína no se expresa normalmente en los hepatocitos maduros, pero es secretada por el hígado en regeneración y a menudo por el carcinoma hepatocelular. Por tanto, las células THLE-2 demuestran un patrón de expresión génica similar al de los hepatocitos normales in vivo. Este patrón de expresión génica indica que los cultivos de células THLE-2 (y probablemente células THLE-3, aunque no están tan bien caracterizadas) son en su mayoría una población en división de células hepáticas que mantienen al menos un fenotipo parcialmente diferenciado.

Las células THLE-2 y THLE-3 de paso temprano formaron colonias con la capacidad mixta de secretar albúmina. Se establece la hipótesis de que estas células constituyen hepatocitos desdiferenciados que tienen una capacidad variable para expresar albúmina o se originan a partir de células madre hepáticas diferenciadas a células con características de hepatocito. En ratas tratadas con carcinógenos hepáticos o compuestos tóxicos, se observan (42-45) células ovales que son mucho más pequeñas que los hepatocitos parenquimatosos o células nodulares. Las células ovales pueden diferenciarse a células del parénquima hepático en condiciones particulares in vivo (43, 45, 46), lo que sugiere que estas células pueden ser células madre con el potencial de transformarse neoplásicamente a carcinoma colangiocelular, así como hepatocelular (44). Las células ovales de la rata se caracterizan por la expresión de marcadores fenotípicos tales como albúmina, citoqueratina 18 y 19, \gamma-GT, \alpha-fetoproteína y glutatión-S-transferasa pi, mientras que la actividad glucosa 6 fosfatasa es sólo positiva débilmente (43, 45). Las células THLE tienen una morfología epitelial; las células del paso temprano secretaron albúmina, expresaron citoqueratina 18, transferrina, \alpha_{1}-antitripsina, \alpha-macroglobulina, GST (figuras 1 y 2), y niveles muy bajos de \gamma-GT. Fueron uniformemente negativas para \alpha-fetoproteína y factor VIII. Por tanto, las células THLE representan una población con un grado de diferenciación entre células ovales y hepatocitos. La posibilidad de que las células THLE deriven de precursores de hepatocitos tales como células ovales no puede descartarse. Sin embargo, el hecho de que la citoqueratina 18 se exprese y que la \alpha-fetoproteína esté ausente en un estadio muy temprano de su establecimiento indica una derivación a partir de hepatocitos diferenciados, más que de células ovales. La aparición de citoqueratina 19 y la disminución en la secreción de albúmina en los pasos finales sugiere que las células desdiferencian en cultivo, un proceso observado frecuentemente como una consecuencia de la transformación (47). En el modelo in vitro de células epiteliales hepáticas normales descrito en el presente documento, la desdiferenciación es reversible porque la expresión de albúmina puede inducirse en frascos rotativos y haciendo crecer células en matrices extracelulares o en agregados tridimensionales.

Una segunda consecuencia de la desdiferenciación de los hepatocitos es la pérdida de enzimas de metabolización de fármacos, incluyendo el citocromo P-450 y las oxidasas de función mixta asociadas (48). Se ha informado de que las condiciones de cultivo tales como matrices extracelulares (49-51), sistemas de co-cultivo (43, 52) y enriquecimiento con hormonas (7, 53, 54) influyen positivamente sobre las funciones diferenciadas incluyendo las actividades de enzimas de fase I y fase II de hepatocitos primarios (50, 55). Aunque las líneas celulares de hígado de rata inmortalizadas con SV40 no se han caracterizado extensamente por su potencial metabólico, se ha informado del mantenimiento y/o la capacidad de inducción de CYP2B y CYPIA, NADPH citocromo P450 reductasa, glutatión-S-transferasa y UDP-glucuroniltransferasa con niveles superiores que en líneas celulares de hepatoma humano o de rata (48). Las células THLE expresaron ARNm de enzimas de fase II tales como epóxido hidrolasa, CAT, GDP, SOD y GST a niveles comparables con el hígado humano. GST pi y \alpha-ARNm son las formas dominantes observadas tanto en las células THLE como en el hígado humano, respectivamente. La NADPH citocromo P450 reductasa se mantuvo pero a un nivel de ARNm de estado estacionario inferior que en el hígado humano.

Ejemplo 3 Metabolismo carcinógeno en las líneas celulares THLE, formación de aductos de ADN

Se evaluó el metabolismo de tres compuestos precursores carcinógenos para formar aductos de ADN en las líneas celulares THLE. Se utilizó benzo-[a]-pireno como un compuesto prototipo de la clase de los hidrocarburos aromáticos policíclicos de precursores carcinógenos. De manera similar, la dimetilnitrosamina sirvió como el prototipo para la clase de N-nitrosaminas de precursores carcinógenos y la aflatoxina B_{1} sirve de prototipo par las microtoxinas, que son compuestos producidos por microorganismo que se ha demostrado que se metabolizan por el hígado de los mamíferos en compuestos carcinógenos.

Para algunos experimentos, la mitad de los cultivos se mantienen en MLCM. El resto de los cultivos se tratan con 10 \mug/ml de Arochlor 1254 (NCI Chemical Repository, Kansas City, MO) veinticuatro horas antes de la incubación bien con benzo-a-pireno tritiado (B[a]P) o bien con aflatoxina B_{1} tritiada (AFB_{1}). En otros experimentos, los cultivos experimentales se tratan con [^{3}H]-B[a]P, [^{3}H]- AFB_{1} o [^{3}H]-dimetilnitrosamina (DMN) durante 24 horas sin tratamiento previo con Arochlor. Las células se aislaron mediante tripsinación y sedimentaron mediante centrifugación a 200 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se descarta y el sedimento celular se resuspende en 5-10 ml de tampón de lisis (Applied Biosystems, Foster City, CA). La solución de lisis se incuba en ARNasa durante 2 horas, seguido de un tratamiento durante 2 horas con proteinasa K. El ADN se purifica a partir de la mezcla de lisis mediante precipitación con etanol de la disolución acuosa tras la extracción con cloroformo / fenol.

El aducto ADN-AFB_{1} purificado, disuelto nuevamente en agua, se ajusta con HCl 0,15 N y se incuba durante 15 minutos a 90-95ºC, tal como se describió anteriormente (Groopman et al. (23)). Este procedimiento libera más del 95,5% de las aflatoxinas enlazadas covalentemente a partir del ADN modificado. Los hidrolizados se enfrían rápidamente sobre hielo y se ajustan hasta un pH de 5,3 con formato de amonio. Se añade metanol de calidad para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) hasta una concentración final del 5% y las muestras se colocan sobre una columna Sep-Pak C-18 (Waters Assoc., Milford, MA), se lavan con metanol al 5% en agua para eliminar el ADN no hidrolizado y después se eluyen con metanol al 80% en agua. Posteriormente, el disolvente se elimina del eluido mediante evaporación con rotación bajo presión reducida hasta un tamaño de muestra de 200-300 \mul para un análisis habitual con HPLC (23).

El análisis del aducto DMN-ADN se realiza con un ensayo combinado de HPLC y marcado posterior con ^{32}P tal como se ha informado anteriormente (24). En resumen, 100 \mug de ADN se digieren enzimáticamente para dar nucleótidos 3' monofosfato y después se purifican con HPLC en fase inversa con par iónico. Las fracciones que contienen N7-metildesoxiguanosina (N7medGp) se mezclan con desoxiguanosina (dGp) como un patrón interno en presencia de polinucleótido quinasa y gamma-ATP con ^{32}P. De este modo, los ortofosfatos radiactivos se transfieren a nucleótidos no modificados y que se convierten en aductos. Éstos se resuelven y se cuantifican utilizando cromatografía de capa fina bidimensional, autorradiografía y recuento en centelleo.

El análisis de los aductos B[a]P-ADN (BPDE-ADN) se realiza tal como se ha descrito anteriormente. En resumen, el ADN se hidroliza con ADNasa I, fosfatasa alcalina y fosfodiesterasa y después, se mezcla con cantidades absorbentes de UV de aductos auténticos de BPDE-ADN. Las mezclas se aplican a columnas Sephadex LH20 (90 cm x 5 cm, Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) y eluyen con gradientes de agua-metanol (30-100% sobre 1 litro). Las fracciones (5 ml) se analizan para la emisión de fluorescencia (excitación con 340 nm, emisión a 400 nm) y se someten partes (1 ml) de cada una a recuento en centelleo líquido. Las fracciones que contienen materiales radiactivos y fluorescentes se caracterizan adicionalmente mediante HPLC para confirmar la identidad del aducto.

Las células THLE-2 expuestas a dimetilnitrosamina, aflatoxina B_{1} y benzo-[a]-pireno muestran un citotoxicidad dependiente de la dosis, lo que sugiere que estas células pueden metabolizar estos compuestos a metabolitos genotóxicos. Por tanto, la formación de aductos de ADN por estos metabolitos se investiga utilizando células THLE-2 y THLE-3 cultivadas en matraces o en frascos rotativos. Los resultados de tales estudios se resumen en la tabla 2 y en la figura 5. Los cultivos en frascos rotativos tanto de células THLE-2 como THLE-3 demuestran niveles superiores de formación de aductos que el nivel observado en las células que crecen en matraces. No puede detectarse metabolismo de AFB_{1} o B[a]P en las células THLE-2 cuando los cultivos se mantienen en matraces. Sin embargo, ambos carcinógenos se metabolizan fácilmente en células incubadas en cultivos en frascos rotativos. El metabolismo de AFB_{1} en células THLE-3 es similar al observado en las células THLE-2. Sin embargo, el metabolismo de B[a]P en electrófilos que se unen a ADN en THLE-3 no depende del recipiente en el que se mantiene el cultivo.

El agente inductor de p450 Arochlor aumenta de manera significativa la tasa de formación de aductos por B[a]P, pero no tiene efecto sobre la formación de aductos de AFB_{1}. El aumento en la formación de aductos de ADN por el tratamiento con Arochlor es análogo al producido mediante inducción de ARNm de citocromo p450 1A1 (figura 5). En células no tratadas con Arochlor, el citocromo p450 1A1 y otras enzimas p450 no pueden detectarse en las condiciones de cultivo descritas. El metabolismo del compuesto original de B[a]P en electrófilo reactivo implica la acción de cualquiera de las dos enzimas citocromo p450 (P4501A1 y P450IIIA4) así como de la enzima de biotransformación de fase II epóxido hidrolasa (14). La cantidad de aducto de epóxido de dihidrodiol B[a]P que se encuentra tras la exposición de las células THLE-2 a B[a]P indica que al menos una de las enzimas P450, así como la epóxido hidrolasa son activas y están reguladas por Arochlor 1254. Puesto que se ha demostrado que Arochlor 1254 induce la actividad enzimática de diversas formas de P450 in vivo (25), ambas líneas celulares THLE-2 y THLE-3 responden a dicho tratamiento de una manera importante desde el punto de vista fisiológico.

Los resultados de los estudios del metabolismo carcinógeno se muestran en la tabla I.

TABLA I Aductos carcinógeno-ADN formados en células THLE-2

Compuesto	No inducido	Inducido con Arochlor
B[a]P	1,5 \pm 0,1b	4,9 \pm 2,1
AFB_{1}	2,5 \pm 0,9	1,6 \pm 0,4
DMN	30,4 \pm 3,9	3,4 \pm 0,1
^{a}ADN aislado a partir de células tratadas con el vehículo sólo fueron negativas para los aductos de los carcinógenos
examinados.
^{b} media \pm desviación estándar; fmol por \mug de ADN; cada valor dado se calcula a partir de dos experimentos sepa-
rados, teniendo cada uno una observación.

Bibliografía

Las siguientes referencias se citan anteriormente. Cada una se incorpora en el presente documento en su totalidad mediante tal cita.

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Claims (10)

1. Células que comprenden una línea celular derivada de tejido de hígado humano de adulto sano que tienen las características siguientes:

1) se inmortalizan mediante transformación con virus SV40;

2) cuando se ponen en contacto con un compuesto, pueden metabolizar el compuesto en un producto que forma un aducto con ADN; y

3) demuestran un patrón de expresión genética similar al de los hepatocitos humanos de adulto sano, incluyendo la expresión de citoqueratina 18 y albúmina.

2. Células según la reivindicación 1, en las que dicho compuesto es benzo-[a]-pireno.

3. Células según la reivindicación 1, que también expresan ARNm que codifica para al menos una de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en transferrina, \alpha-1-antitripsina, \alpha-2-macroglobulina, catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa.

4. Células según la reivindicación 1, que también expresan al menos un citocromo P450 de una manera inducible.

5. Células según la reivindicación 1, que son las células THLE-2 (ATCC CRL 10149).

6. Células según la reivindicación 1, que son las células THLE-3 (ATCC CRL 11233).

7. Método para evaluar la genotoxicidad de un compuesto que comprende:

1) cultivar las células según la reivindicación 1 en un medio que contiene dicho compuesto que va a ser evaluado;

2) cultivar las células según la reivindicación 1 en un medio que carece de dicho compuesto que va a ser evaluado;

3) medir la supervivencia de las células en la etapa (1);

4) medir la supervivencia de las células en la etapa (2); y

5) comparar los resultados de las etapas (3) y (4).

8. Método para evaluar la genotoxicidad de un compuesto, que comprende:

1) incubar las células según la reivindicación 1 en un medio que carece de dicho compuesto;

2) incubar las células según la reivindicación 1 en un medio que contiene dicho compuesto;

3) aislar el ADN de las células de la etapa (1);

4) medir la formación de aductos en el ADN aislado en la etapa (3);

5) aislar el ADN de las células de la etapa (2);

6) medir la formación de aductos en el ADN aislado en la etapa (5); y

7) comparar la cantidad de formación de aductos medida en la etapa (4) con la medida en la etapa (6).

9. Método para detectar la carcinogenia potencial de un compuesto, que comprende:

1) incubar las células según la reivindicación 1 en un medio que carece de dicho compuesto;

2) incubar las células según la reivindicación 1 en un medio que contiene dicho compuesto;

3) medir la expresión de al menos una enzima citocromo P450 en las células de la etapa (1);

4) medir la expresión de al menos una enzima citocromo P450 en las células de la etapa (2); y

5) comparar la cantidad de expresión de citocromo P450 medida en la etapa (3) con la cantidad medida en la etapa (4).

10. Método según la reivindicación 8, que comprende además las etapas de:

a) medir también la expresión de epóxido hidrolasa en las células en la etapa (1); y

b) medir también la expresión de epóxido hidrolasa en las células en la etapa (2); y

c) comparar también la expresión de epóxido hidrolasa medida en la etapa (a) con la cantidad medida en la etapa (b).