DE69433822T2 - Humane epithelzellinien der leber - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf kontinuierliche Zellinien, abgeleitet von normalem adultem humanem Lebergewebe. Diese Zellinien zeigen morphologische Eigenschaften und Genexpressionseigenschaften, die mit der Herkunft normaler humaner Leberepithelzellen übereinstimmen. Die Zellinien werden durch die Expression des großen T-Antigens (TAg) des SV40-Virus immortalisiert, sind aber nicht tumorbildend. Als solche stellen sie eine reproduzierbare Quelle von Zellen für Studien der Initiierung und Progression von Karzinogenese, besonders von chemischer und viraler Karzinogenese, verursacht durch den Lebermetabolismus von nicht tumorbildenden Vorläuferverbindungen zu genotoxischen Substanzen oder durch Infektion mit onkogenen Hepatitisviren, bereit.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • In dieser Patentanmeldung werden durchweg zahlreiche Artikel der wissenschaftlichen Literatur zitiert. Jede dieser Referenzen wird hiermit in ihrer Vollständigkeit durch ein solches Zitat berücksichtigt.
  • Kaighn und Prince (1) beschrieben vor mehr als 20 Jahren klonabgeleitete Kulturen von fötalen, infantilen und adulten humanen Donoren. Diese Kulturen hatten alle begrenzte Lebenserwartungen. Ihre Beobachtungen wiesen auf die Existenz von normalen adulten humanen Leberepithelzellen hin, die entweder weniger differenziert werden oder in der Lage sind, sich einer retrograden Differenzierung in eine Form zu unterziehen, die in der Lage ist, einige Populationsverdopplungen in vitro zu vervollständigen, wenn unter entsprechenden Bedingungen kultiviert. Kulturen von Ratten-Leberepithelzellen sind etabliert worden (2, 3), aber diese Kulturen, wie diese von Kaighn und Prince, haben nur eine begrenzte Lebenserwartung. Kürzlich beschrieben wir ein serumfreies Kulturmedium (LCM, unten beschrieben), das die ausgedehnte Replikation normaler humaner Leberepithelzellen unterstützt (4). Das Wachstumspotential der Leberzellen auf diesem Medium war jedoch immer noch begrenzt, d. h., es wurden nie mehr als 12 Zyklen von Zellteilungen in jeder unserer Kulturen erhalten. Alle diese Kulturen sind für langfristige Studien aufgrund ihrer begrenzten Lebenserwartung nicht geeignet.
  • Die metabolische Aktivierung von Umweltkarzinogenen aus verschiedenen chemischen Klassen ist in humanen Lebergewebeexplantaten oder Mikrosomen und in isolierten humanen Leberepithelzellen studiert worden (5). Außerdem zeigen die beobachteten Tierarten spezifischen Unterschiede im Metabolismus von Aflaxtoxin B1 (AFB1) und 2-Ace-tylaminofluoren die Notwendigkeit an, die humane Leber oder die Leberepithelzellen zu studieren. Weil jedoch die Gewebeverfügbarkeit begrenzt ist, unterscheiden sich die Individuen in ihrer Neigung zu einem xenobiotischen Metabolismus, und reproduzierbare in vitro Bedingungen sind schwierig zu etablieren, ein reproduzierbares System mit humanen Leberzellen für pharmako-toxikologische Studien ist nicht etabliert worden.
  • Mehrere Forschergruppen haben berichtet, daß die Langlebigkeit von Kulturen humaner Epithelzellen durch Transformation mit dem SV40-Virus großes T-Antigen (TAg)-Gen erhöht werden kann oder in einigen Fällen unbegrenzt gemacht werden kann (5, 6). Derartig transformierte Zellen können einen beinahe normalen Karyotyp haben, und einige von den isolierten behalten viele von den Wachstums- und Differenzierungseigenschaften ihrer normalen Gegenstücke, einschließlich der Nicht-Karzinogenität. Außerdem haben Woodworth et al. und Ledley et al. (7–9) berichtet, daß Ratten-Leberepithelzellen, die mit einem SV40-TAg-Gen transformiert wurden, mehrere normale Leberepithelzelleneigenschaften behielten. Leider sind solche Kulturen für Studien von humaner Karzinogenese und Arzneimittelmetabolismus nicht nützlich, da der Metabolismus xenobiotischer Verbindungen in Menschen und in Ratten sehr unterschiedlich sein kann.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die menschliche Leber ist eines der wenigen Organe in Erwachsenen, das zur Regeneration fähig ist. Jedoch ist noch nie eine kontinuierlich replizierende Kultur von nicht neoplastischen adulten humanen Leberepithelzellen etabliert worden. Wir offenbaren hierin die Etablierung einer kontinuierlichen Kultur normaler humaner Leberepithelzellen (Hepatozyten) durch Infektion replikativer Kulturen von solchen Zellen mit einem retroviralen Vektor, der das SV40 TAg-Gen enthält. Diese Zellinien (THLE-Zellen) überwinden die Mängel von vorhergehenden Zellinien bezüglich der Begrenzung der Lebenserwartung oder des nicht humanen Ursprungs und liefern damit eine reproduzierbare Quelle von Zellen für langfristige Studien der humanen Karzinogenese und Toxikologie.
  • Die Zellen scheinen immortal zu sein, d. h. sie haben eine unbegrenzte Lebenserwartung in vitro. Die Zellen von hierin beschriebenen Linien sind nicht tumorbildend und liefern so eine Quelle für Studien von Prozessen, bei denen Zellen tumorbildend gemacht werden. Sie sind besonders wertvoll im Studium chemischer Karzinogenese, da angenommen wird, daß der Metabolismus nicht karzinogener Vorläuferverbindungen durch Leberenzyme zu einer genotoxischen Verbindung ein Hauptmechanismus der Karzinogenese durch Chemikalien ist. Daher liefern die Zellen ein Mittel zum Screenen von Chemikalien auf karzinogenes Potential durch Exposition der Zellen mit dem angenommenen karzinogenen Vorläufer und einen Assay zur Umwandlung der Zellen zu einem tumorbildenden Phänotyp. Die Reproduzierbarkeit eines solchen Assays hängt davon ab, ob man eine reproduzierbare Zellinie hat, um die obigen Tests auszuführen. Die THLE-Zellinien der gegenwärtigen Erfindung liefern solche reproduzierbaren Zellinien.
  • Außerdem könnten sich die THLE-Zellen der vorliegenden Erfindung in der Untersuchung der Kontrolle von Differenzierungsprozessen als nützlich erweisen. Es wird allgemein angenommen, daß Proliferation und Differenzierung entgegenwirkende zelluläre Prozesse sind (47, 48). Daher können die THLE-Zellen benutzt werden, um Arzneistoffe zu identifizieren, die bei der Behandlung von Lebertumoren nützlich sind, indem die Wirkung solcher Arzneistoffe auf den Phänotyp der THLE-Zellen untersucht wird. Verbindungen, die die terminale Differenzierung der THLE-Zellen induzieren, würden als vielsprechende Kandidaten betrachtet werden.
  • Die Einführung von Onkogenen zusätzlich zu dem SV40 TAg-Gen kann auch in den THLE-Zellen durchgeführt werden, um die Wirkung der Expression von solchen zusätzlichen Onkogenen auf die tumorbildenden Eigenschaften oder anderen phänotypischen Aspekten der THLE-Zellen zu untersuchen. Die so abgeleiteten Zellinien können wiederum als Tar get in Screeningassays für Verbindungen benutzt werden, die wirkungsvoll sind, die Proliferation von Zellen, die diese zusätzlichen Onkogene exprimieren, zu stoppen.
  • Schließlich sind Leberepithelzellen der Zelltyp, der durch Hepatitisviren (HepA, HepB, HepC und nicht-A-nicht-B-Hepatitis) infiziert wird und auch der Zelltyp, der durch viele humane Parasiten infiziert wird. Daher liefern die THLE-Zellen einen in vitro-Wirt für das Wachstum dieser Organismen und folglich ein in vitro-System zum Studium der Zellbiologie solcher Infektionen und zum Screenen von Verbindungen auf Wirksamkeit bei der Hemmung oder Heilung solcher Infektionen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Morphologie und Expression zellulärer Marker in THLE-2-Zellen; Phasenkontrastaufnahme, die das epitheliale Auftreten von THLE-2-Zellen (A) zeigt, indirekte Immunfluoreszenzanfärbung für SV40-T-Antigen (B) und Cytokeratin 18 (C), die die Anwesenheit beider Proteine in nahezu 100% der Passage-5-Zellen demonstriert, Immunperoxidaseanfärbung, die die klonale Expression von Albumin in THLE-2-Zellen der Passage 5 (D) zeigt. Für die Immunfluoreszenz-Analysen wurde nicht spezifische Bindung mit dem entsprechenden Blockserum (1 : 100 Verdünnung, 20 min.) blockiert. Anschließend wurden Antikörper (IgG), spezifisch für Albumin (1 : 20; American Qualox, La Mirada, CA) allgemeine Cytokeratine (1 : 15; ICN, Costa Mesa, CA), Cytokeratin 18 Cytokeratin 19 (1 : 20 jedes; ICN, Costa Mesa, CA), α-Fetoprotein (1 : 50; Zymed, San Francisco, CA), α1-Antitrypsin, α2-Makroglobulin (1 : 50; Chemicon, Inc., Temecula, CA) und SV40 T-Anigen (1 : 5; Oncogene Science, Manhasset, NY) bei Raumtemperatur (30 min. bis 1 h) inkubiert und mit fluoreszenten sekundären Antikörpern, verdünnt 1 : 32 bei Raumtemperatur (1 h) entwickelt. Immuncytochemisches Anfärben für Albumin wurde durch Inkubation mit sekundären (Kaninchen anti-Maus; Da koCorp, Santa Barbara, CA) und tertiären (Schwein anti-Kaninchen; DakoCorp, Santa Barbara, CA) Antikörpern und durch Entwicklung mit Meerrettich-Peroxidase bei Raumtemperatur (30 min. jede Inkubation) durchgeführt.
  • 2 zeigt die Albuminsekretion von THLE-2 (A) und THLE-3 (B). Nach Normierung auf den gleichzeitig immunpräzipitierten Albuminstandard von 3 ng in A und 2 μg in B annähernd 300 pg/ml, 70 pg/ml und 14.5 ng/ml durch Densitometrie wurde Albumin in 24 Stunden von THLE-2 (Rb), THLE-2 (FL) bzw. von THLE-3 (FL) sekretiert.
  • 3 zeigt die Karyotypen von THLE-2 und THLE-3. Die Monosomie der Chromosomen 2 und 10, ein Bruch des Chromosoms 1 (Pfeil) und eine 22q+-Translokation, die zu dem Markeρchromosom M1A führt, charakterisieren die nahe-diploide Metaphase von THLE-2 an der Passage 18 (A). Typische SV40 T-Antigenwirkungen wurden auch in THLE-3 bei der Passage 22 (B) detektiert, veranschaulicht durch die Monosomie der Chromosomen 13 und 22 und die Deletionen in den Chromosomen 2 und 8. Ein nicht identifiziertes Markeρchromosom (M) wird auch gesehen.
  • 4 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, das die metabolische Aktivierung von Karzinogenen untersucht. Die THLE-2-Zellen werden mit 1.5 μM 3H-B[a]p, 32 μM 3H-AFB1 oder entsprechend mit 50 μM DMN inkubiert (24 h). Die Vorbehandlung mit Arochlor 1254 wurde 24 Stunden vor der karzinogenen Behandlung durchgeführt. Die Zellen wurden dann mit Trypsin, suspendiert in einem Lysepuffer (5–10 ml), (Applied Biosystems, Foster City, CA), geerntet und mit Ribonuklease und Proteinase K (2 h jede) behandelt. Karzinogenmodifizierte DNA wurde aus Zellen durch eine Chloroform-/Phenol-Extraktion isoliert (39), hydrolysiert und chromatographiert. Die BPDE-DNA-Addukte wurden durch Mischen der hydrolysierten DNA-Basen mit UV absorbierenden Mengen von bekannten BPDE-DNA-Standards identifiziert und auf Sephadex LH20-Säulen fraktioniert und weiter durch HPLC charakterisiert (A; Arochlor induziert; O, nicht induziert) (24). Die Northern Blot Analyse (B) von polyA+-selektierter mRNA zeigte eine Induktion von CYP1A1, normiert auf GAPDH, wo Arochlor < B[a]P < Arochlor + B[a]P. Die relativen CYP1A1/GAPDH-Verhältnisse sind 0,73, 10,0 bzw. 13,1. Die Alkyl-DNA-Addukt-Analyse wurde durch HPLC durchgeführt und durch 32P-Postmarkierung detektiert. Autoradiogramme der zweidimensionalen TLC-Trennung eines Nukleotid-32P-Postmarkierung-Assays von DNA aus unbehandelten Zellen (C) zeigten keine detektierbaren N7-Methyl- Deoxyguanosinaddukte, aber Zellen, die DMN ausgesetzt wurden (D), hatten detektierbare Werte, wie in diesem Fall gezeigt, bei 28 fmol pro μg DNA. Die Addukte koeluierten mit UV-Markern des postmarkierten Produkts, um die Adduktidentität zu bestätigen. Der Wert des Addukts wurde durch den Gebrauch von Szintillationszählung und Kalibrierkurven für bekannte versus detektierte molare Verhältnisse von Addukt zu unmodifiziertem dGp bestimmt. Die gereinigte DNA aus AFB1-behandelten Zellen wurde durch eine Hochleistungs-HPLC-Adduktreinigung und Detektion untersucht (23). Die HPLC-Profile der AFB1-DNA-Addukte identifizierten nach 24 Stunden AFB1-fAPyr als das Hauptprodukt (E). Identifikationen beruhen auf einer Koelution mit authentischen Standards.
  • 5 zeigt die Northern Blot Analyse von Phase-ΙΙ-Enzymen. Die gesamte RNA wurde isoliert aus THLE-Zellen, normalem adultem Lebergewebe, Fall 88-5, was zu der Etablierung von THLE-2, der hepatoblastomischen Zellinie, HepG2, und zu den normalen humanen bronchialen Epithelzellen (NHBE) führte. Beruhend auf der Ethidium Bromid-Anfärbung (GAPDH unterschätzte die Menge an RNA, die aus der Leber zugeführt wurde) wurde eine ähnliche Expression der Epoxid-Hydrolase (A), GPX, SOD (B) in den THLE-Zellen und der menschlichen Leber gefunden, wohingegen die Expression von CAT (A) und Cytochrom P450 Reduktase (B, NADPH-red.) reduziert wurde.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Zellinien der gegenwärtigen Erfindung liefern reproduzierbare biologische Materialien für Untersuchungen zur Karzinogenese und Toxikologie. Die Zellen können für Untersuchungen der metabolischen Aktivierung von Verbindungen zu Cytotoxinen oder Karzinogenen benutzt werden. Die Zellen können in ihrem gegenwärtigen Zustand benutzt werden, oder es können alternativ exogene Gene zusätzlich zu dem SV40 T-Antigen in die Zellen eingeführt werden. Ähnlich können die Zellinien der gegenwärtigen Erfindung mit verschiedenen Viren infiziert werden, die bei humaner Krankheit, wie beispielsweise Hepatitis, von Interesse sind.
  • Gene von Interesse in den Studien der Karzinogenese und Toxikologie könnten beispielsweise Onkogene per se, Wild-Typ-Gene oder mutierte Tumorsuppressorgene oder Gene sein, die Enzyme für den Metabolismus xenobiotischer Verbindungen kodieren. Eine Familie besonders interessanter Gene sind die Mutanten des Tumorsuppressorgens p53, die in Zusammenhang mit der Progression einer Vielzahl von Tumortypen gebracht worden sind.
  • Die Zellinien der gegenwärtigen Erfindung, entweder wie hierin beschrieben oder zusätzliche exogene Gene enthaltend, sind beim Screenen und Studium der Wirkungsweise therapeutischer Verbindungen, die die Genexpression in den Zellen verändern oder die die toxikologischen Wirkungen einiger Sekundärsubstanzen verändern, nützlich.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden mit Hilfe der Beispiele unten beschrieben. Diese Beispiele sind ausdrücklich dazu bestimmt, den Umfang der Erfindung eher zu veranschaulichen als zu begrenzen.
  • Die Zellproliferation wird in einer Vielzahl von Experimenten, unten beschrieben, gemessen. Daher werden die Methoden, die für solche Messungen benutzt werden, als allgemeine Methoden dargelegt. Die DNA-Synthese wird in Zellen, geimpft bei einer klonalen Dichte (100 Zellen/cm2) gemessen. Das Medium wird am nächsten Tag gegen ein frisches Medium ausgetauscht, und nach zwei zusätzlichen Tagen der Inkubation wird [3H]-Thymidin (New England Nuclear) zu den Zellkulturen bei 0,5 μCi/ml hinzugefügt. 24 Stunden später wird die sauer fällbare Fraktion auf Glasfaserfiltern gesammelt, und die eingebaute Menge an [3Η] wird durch Szintillationszählung quantifiziert. Alternativ wird die Proliferation durch Zählen der Anzahl der Zellen in jeder Kolonie gemessen. Das Medium wird gegen ein Medium ausgetauscht, in welchem die Proliferation einen Tag lang untersucht werden soll, folgend der Impfung bei der klonalen Dichte, und die Schalen werden für weitere 7 Tage inkubiert. Die Zellen werden dann formalinfixiert und mit Kristallviolett angefärbt. Die Zahl der Zellen pro Kolonie wird bestimmt, und die Populationsverdopplungen pro Tag werden, wie vorher beschrieben, berechnet (13).
  • Für viele der beschriebenen Experimente, beispielsweise die Southern und Nothern Blot Analysen und metabolischen Experimente, werden die Kulturen zu einer hohen Dichte gezüchtet. Solche Kulturen werden in T175-Gewebekulturkolben oder in 800 ml Rollflaschen inkubiert und zu einer Dichte von 3.7 × 104 Zellen/cm2 gezüchtet.
  • Beispiel 1: Etablierung von kontinuierlichen Kulturen von normalen adulten humanen Leberepithelzellen (THLE-Zellen)
  • i) Primäre Kultur von normalem adultem Lebergewebe
  • LCM-Medium (4) besteht aus PFMR-4 Medium (Biofluids, Rockville, MD), worin die Ca2+-Konzentration auf 0,4 mM reduziert wird und Arginin durch 0,3 mM Ornithin ersetzt wird, ergänzt mit Insulin (1,45 μM), Transferrin (125 nM), Choleratoxin (300 pM), epidermalem Wachstumsfaktor (825 pM), Hydrokortison (0,2 μM), Triiodothyronin (10 nM), retinoide Säure (10 nM), Phosphoethanolamin (0,5 μM), Ex-Cyte V (312 μM), Rinderhypophysenextrakt (ref. 10, 7,5 μg Protein/ml) und chemisch denaturiertem Serum (10).
  • Um ein LCM-Medium, konditioniert durch Hep-G2-Zellen (HGLCM), zu machen, werden Hep-G2-Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) in einem DMEM-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, gehalten. Nahkonfluente Kulturen solcher Zellen werden zwei mal mit LCM gewaschen und dann in LCM für 72 Stunden gehalten. Das überstehende Medium (HGLCM) wird entfernt, durch Filtration über eine 0,22 μm Membran sterilisiert und unter sterilen Bedingungen gelagert.
  • Normale Leberepithelzellen werden durch Collagenase/Dispase-Perfusion des linken unteren Flügels der Leber aus einer unmittelbaren Autopsie adulteρ Donoren mit keiner klinischen Evidenz auf Krebs erhalten (11). Die Kulturen werden in Kolben geimpft, die mit Collagen I vorbeschichtet worden sind (VitrogenTM, Celtrix Laboratories, Palo Alto, CA) und über Nacht in Waymouth's Medium, 10% fötales Rinderserum enthaltend, inkubiert worden sind. Am folgenden Tag werden die Kulturen mit Phosphat-gepuffertem Salin (PBS) gewaschen und das Medium gegen HGLCM ausgetauscht.
  • Innerhalb von 2 bis 4 Tagen der Isolation der normalen Zellen werden Gruppen von zufällig platzierten replizierenden Zellen mit einer epithelartigen Morphologie evident. Diese Kulturen bilden nach 10 bis 14 Tagen der Inkubation eine konfluente Monoschicht. Diese normalen Zellen können bei einem Aufteilungsverhältnis von 1 : 4 subkultiviert werden, indem die gleiche Collagenase-/Dispaselösung benutzt wird, wie sie beim Etablieren der primären Kultur, um die Zellen von der Oberfläche des Kulturgefäßes zu entfernen, benutzt wird. Die durchschnittliche Lebenserwartung dieser normalen Leberepithelzellkulturen ist 12 Populationsverdopplungen.
  • ii) Produktion des SV40 TAg-exprimierenden Retrovirus
  • Ein rekombinanter Retrovirus, der das große T-Antigen-Gen des SV40-Virus trägt, wird durch Insertion des BgII-HpaI-Fragmentes der SV40-viralen DNA (Nukleotide 5235–2666) in die BamHI-Stelle des pZipNeoSVX (12) retroviralen Vektors hergestellt, indem BamHI-Linker und standardmäßige rekombinante DNA-Techniken benutzt werden. Dem Fragment des angewendeten SV40-Genoms fehlt sowohl der frühe Promotor als auch die Polyadenylierungsstelle.
  • Infektiöse rekombinante Viruspartikel werden hergestellt, indem die amphotropen Durchgangszelllinien PA317 mit dem oben erhaltenen ecotropischen rekombinaten Vektor transfiziert werden. Transfizierte Zellen werden durch Neomycinselektion isoliert, und 10 Klone werden isoliert. Die klonierten PA317 Zellen werden in einem DMEM-Medium, ergänzt mit 10% FBS, vermehrt. Das Medium wird gegen ein serumfreies PC-1-Medium (Ventrex Laboratories, Portland, ME) ausgetauscht, und der Virus wird per Titer bestimmt, indem 8 × 104 NIH 3T3-Zellen in einer 60 mm Schale mit verschiedenen Verdünnungen des überstehenden Mediums, das den Virus der in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren enthält, infiziert und die Kolonien nach 10 Tagen einer Selektion, die 750 μg/ml Neomycin benutzt, gezählt werden.
  • iii) Infektion von primären Lebergewebe-Kulturzellen
  • Ein Pool des Virus aus 7 der 10 Klone der transfizierten PA317-Zellen wird benutzt, um die primären Lebergewebekulturen zu infizieren. 8 × 104-Zellen der primären Kulturen wurden mit 0,1 pfu des rekombinanten Virus für 2 Stunden in der Gegenwart von 8 μg/ml Polybren in einem PC-1-Medium infiziert. Nach der Infektion werden die Kulturen mit HEPES gepuffertem Salin (HBS) gewaschen und in einem LCM-Medium inkubiert. Die Infektion mit dem rekombinanten Virus veranlaßt praktisch alle der Leberzellen in der Kultur, sich einer schnellen Teilung zu unterziehen. Mehrere Kulturen sind so etabliert worden. Von diesen werden THLE-2 und THLE-3 als Massenkulturen passieren gelassen. Anfänglich unterziehen sich die THLE-2- und THLE-3-Zellen während den ersten sechs Wochen nach Infektion ungefähr 25 Populationsverdopplungen, dann nimmt das Wachstum merklich ab. Die Zellen werden bei jedem Durchgang während dieser frühen Wachstumsperiode kryokonserviert.
  • Die THLE-2-Zellinie wurde unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD, am 16. Mai, 1989 hinterlegt, und ihr wurde die Zugangsnummer CRL 10149 zugewiesen. Die THLE-3-Zellinie wurde unter den Bestimmungen und Bedingungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection am 14. Januar, 1993 hinterlegt, und ihr wurde die Zugangsnummer CRL 11233 zugewiesen.
  • Die THLE-2-Zellen aus solchen kryokonservierten frühen Passagebeständen werden benutzt, um die Wachstumsantworten der Zellen auf die verschiedenen Supplemente des LCM-Mediums zu bestimmen. Einzelne Eliminationsexperimente zeigen, daß die klonale Wachstumsrate der frühen Passage-THLE-2-Zellen erhöht wird, indem das Ex-Cyte V und das Choleratoxin aus dem LCM weggelassen wird und auch indem das Ornithin gegen Arginin ersetzt wird. Der Gebrauch eines Mediums, kon ditioniert durch THLE-2-Zellen eher als durch HepG2-Zellen, verbessert weiter das Wachstum der THLE-2-Zellen. Modifiziertes LCM-Medium (MLCM) ist somit ein reformuliertes LCM durch die Auslassung von Ex-Cyte V und Choleratoxin und durch den Gebrauch von Arginin eher als von Ornithin (bei 0,3 mM) und durch Hinzufügen zu 30% des Mediumvolumens, konditioniert durch THLE-2-Zellen eher als durch HepG2-Zellen.
  • Die THLE-2-Zellen sind für mehr als 130 Populationsverdopplungen ohne Evidenz für eine Seneszenz kultiviert worden, indem MLCM für die Haltung der Kultur benutzt worden ist. Die apparente maximale klonale Wachstumsgenerationszeit ist 24 Stunden, und ihre koloniebildende Wirksamkeit beträgt im Durchschnitt 15%. Die THLE-3-Zellen wurden zu einem frühen Durchgang auf MLCM gewechselt, und infolgedessen betrat diese Zellinie nie ein Ruhestadium. Die THLE-3-Zellen sind über mehr als 100 Populationsverdopplungen hinweg gezüchtet worden. Ihre Wachstumsrate ist 0,7 PDL/Tag, und ihre koloniebildende Wirksamkeit beträgt im Durchschnitt 15%.
  • Beispiel 2: Analyse von leberspezifischer Genexpression in THLE-Zellen
  • Die THLE-Zellen wurden für die Expression einer Anzahl von leberspezifischen Genen sowohl auf den transkriptionellen als auch auf den translationalen Ebenen evaluiert.
  • Die Karyotyp-Analyse wird durchgeführt, indem in der Wissenschaft gebräuchliche Standardtechniken benutzt werden.
  • Für die Southern Blot Analyse wird die zelluläre DNA durch in der Wissenschaft typische Methoden extrahiert und mit dem ClaI-Restriktionsenzym verdaut. Die DNA wird auf einem 0,7% Agarosegel elektropho resiert und auf Gene Screen PlusTM (DuPont, Wilmington, DE) transferiert. Genomische DNA wird auf die Anwesenheit von SV40-T-Antigen DNA analysiert, indem sie mit dem 1.17 Kilobasenpaar (kb) HindIII-Fragment des großen T-Antigen-Gens, markiert mit 32P, durch den Gebrauch einer Einschnittübersetzung entsprechend der Methode, beschrieben durch den Hersteller (DuPont), untersucht wird.
  • Die mRNA-Expression wird sowohl durch Northern Blot Analyse als auch durch in situ Hybridisierung bestimmt. Für das Northern Blotting wird die RNA, wie vorher beschrieben (15), durch Hybridisierung an ein biotinyliertes Oligo-dT, gefolgt durch das Einfangen der hybridisierten RNA mit paramagnetischen Streptavidin Beads (Promega, Madison, WI), isoliert. Das Hybridisierungsprotokoll ist auch vorher beschrieben worden (15).
  • Für eine in situ Hybridisierung werden die Zellen für 10 Tage in Kulturkammer-Objektträgern inkubiert, dann zwei mal mit PBS (pH 7,4) gewaschen und für 3 Minuten in PBS, das 4% Paraformaldehyd, 2% Saccharose, 5 mM MgCl2 und 0,02% Diethylpyrocarbonat enthält, fixiert. Die Folien werden dann mit zweimaligem Austausch von PBS, das 5 mM MgCl2 enthält, gewaschen und dann für 10 Minuten in 0,1 M Glycin/0,2 M Tris inkubiert und anschließend durch eine 10minütige Inkubation in 5% Acetanhydrid/0,1 M Triethanolamin, pH 8,0 acetyliert. Die Objektträger werden dann in PBS gewaschen und in 50% Formamid, 2× SSC, 10 mM Dithiothreitol (DTT) bei 52°C für 10 Minuten vorhybridisiert. Die Hybridisierung wird bei 50°C, wenn cRNA-Proben benutzt werden, oder bei 42°C, wenn cDNA-Proben benutzt werden, in 50 Formamid, 2× SSC, 0,1 M DTT, 1 mg/ml tRNA, 10 mg/ml sonorisiertes Lachssperma DNA, 2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 6 × 104 cpm/μl der Probe durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Folien, untersucht mit cRNA, in 50% Formamid, 5× SSC, bei 50°C für eine Stunde gewaschen, dann RNAse verdaut, wie durch Maier et al. (16) beschrieben. Die Objektträger werden dann bei 45°C in 50% Formamid, 2× SSC für 30 Minuten und schließlich in 2× SSC für 30 Minuten bei 45°C gewaschen. Die Objektträger, untersucht mit cDNA-Proben, werden in 50% Formamid, 2× SSC bei 37°C für 30 Minuten, dann in 50 Formamid, 1 × SSC bei Raumtemperatur und schließlich in 1 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen. Die hybridisierten Objektträger werden dann autoradiographiert, indem eine NBT2-Emulsion (Eastman Kodak) benutzt wird, exponiert bei 4°C für 7 bis 10 Tage und entwickelt mit einem Kodak D19-Entwickler, dann gegengefärbt mit Hematoxylin und Eosin, dehydratisiert und befestigt mit Permount.
  • Die cDNA-Proben werden durch Einschnittübersetzung markiert, indem 35S dCTP als Substrat benutzt wird. Die Durchschnittslänge solcher Proben ist 0,2 kb. Riboproben (cRNA) werden durch das Transkriptionsprotokoll von Melton et al. (17) vorbereitet, indem 35S UTP als das markierte Nukleotid benutzt wird. Die Transkripte werden dann teilweise mit Alkali hydrolysiert, so daß das meiste der Markierung aus 100–200 nukleotidlangen Fragmenten besteht.
  • Die Anwesenheit der Epoxidhydrolase wird in den Zellinien durch Hybridisierung mit einer humanen Genprobe bestimmt; entweder die SmaI-XhoI-Fragmente (0,4 kb) oder die NcoI-NspI-Fragmente (0,9 kb) des Plasmids R60 (Oxford Biochemicals, Oxford, MI 48051). Die NADPH-Cytochrom p450 Reduktaseprobe stammt vom Plasmid hp450 (F. Gonzales, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD) durch EcoRI-Verdau und Isolierung des 2,4 kb-Fragments. Die Expression von Superoxid-Dismutase (SOD) wird durch Hybridisierung an ein 0,45 kb EcoRI-HindIII-Fragment der humanen cDNA, die von dem Plasmid sp65/SOD (18) erhalten wird, bestimmt. Die Gluthathionperoxidase wird durch den Gebrauch eines 0,8 kb EcoRI-Fragments der humanen cDNA, die von dem Plasmid pSPT19/GPX (19) erhalten wird, analysiert. Die Expression der Glutathion-S-Transferase πi, α und μ werden durch Hybridisierung mit dem 0,73 kb EcoRI-Fragment des Plasmids pGEM4/GSTπi (J. A. Moxow, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD) und an das 0,7 kb EcoRI-Fragment des Plasmids pGST2-PvuII (20) bzw. an das 0,67 kb PstI-EcoRI-Fragment des Plasmids pGST-T-Nco (Geschenk von P. G. Board, Australian National University) bestimmt. Die Probe für Albumin mRNA wird aus dem Plasmid B44 isoliert (21). Die 0,73 kb Insertions-cDNA von B44 wird in pGEM4 (Promega Madison, WI) zwischen den PstI- und den HindIII-Orten subkloniert. Zur Detektion der mRNA Katalase wird die einschnittübersetzte Probe aus dem 1,25 kb EcoRI-HindIII-Fragment eines Plasmids, das das HindIII-PvuII-Fragment der humanen Katalase-cDNA enthält (22), vorbereitet. Die Proben für die Cytochrome p450 Isoenzyme entsprechend dem 1,0 kb 3' EcoRI 1A2, 1,0 kb 3' EcoRI 1A1, 1,3 kb 3' BamHI-EcoRI IIA3, dem 3' 1.6 kb BamHI-EcoRI IIE1, dem 1,1 kb 3' EcoRI IIIA4, dem 0,8 kb 5' EcoRI IIB1 cDNA Fragment oder der vollständigen 1,6 kb IID6 cDNA, isoliert durch EcoRI Verdau des Plasmids, geliefert von F. Gonzales (National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD).
  • Für die Immuncytochemie werden die Zellen auf nahe Konfluenz auf den Glaskammerträgern (Lab-Tek) gezüchtet und in Phosphat-gepuffertem Salin (PBS) gewaschen. Die Zellen werden durch Eintauchen der Träger in einen Phosphatpuffer, der Paraformaldehyd (für Albuminanfärbung) oder 100% Methanol bei 4°C (für Cytokeratin und TAg-Anfärbung) enthält, fixiert. Die Träger werden dann in PBS gewaschen, und das entsprechende Blockserum (1 : 100 Verdünnung) wird auf jede Folie für 20 Minuten gelegt. Die primären Antikörper (IgG) gegen Albumin (1 : 20 Verdünnung, ICN, Costa Mesa, CA), allgemeine Cytokeratine (1 : 15 Verdünnung, ICN), Cytokeratin 18 und Cytokeratin 19 (beide bei 1 : 20 Verdünnung, ICN) und SV40 T-Antigen (1 : 5 Verdünnung, Oncogene Science, Manhasset, NY) werden auf die Träger appliziert und für 30 Minuten bis 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Träger werden in PBS gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Für Immunfluoreszenzstudien werden die mit Fluorescein-Isothiocyanat oder Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat markierten sekundären Antikörper auf die Folien für 1 Stunde bei Raumtemperatur gelegt. Zum Anfärben mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) werden die Träger mit Schwein-anti-Maus-sekundärem Antikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, in PBS gewaschen und dann mit HRP-verbundenen Kaninchen-anti-Schwein-tertiärem Antikörper unter den gleichen Bedingungen inkubiert. HRP wird durch den Umsatz eines Benzidinsubstrats detektiert.
  • Für negative Kontrollexperimente wurden 3T6 Maus Fibroblastenzellen benutzt. HepG2-Zellen wurden als eine positive Kontrollzellinie benutzt.
  • Die Albuminsekretion von den THLE-Zellen wurde durch Western Blot Analyse von immunpräzipitiertem Albumin untersucht. Die Zellüberstände (10 ml von 72 h Kulturen von ungefähr 0,6 × 106 Zellen/ml in Kolben oder 1,2 × 106 Zellen/ml in Rollflaschen, die Zellen wurden auf LCM ohne konditioniertes Medium 24 Stunden von dem Assay verlegt) wurden auf die Salz- und Detergenzienkonzentration von RIPA (1×) (40), immunpräzipitiertes Albumin (4°C : 1 h) mit anti-humanem Ziegen-Albumin (Dako, Santa Barbara, CA) eingestellt und einer Western Blot Analyse und einer quantitativen Densitometrie unterworfen (2). Albumin wurde aus Zellen isoliert, die in einem serumfreien Medium für 24 Stunden in Rollerflaschen (Rb) oder Kolben (F1) (0,5 × 106/ml; 72 h) mit 10 μl des anti-humanen Ziegen-Albumins, gefolgt von einer Extraktion (1 h) mit Protein A Sepharose (Zymed, South San Francisco, CA) gezüchtet wunden. Die Immunkomplexe wurden zwei mal mit RIPA-Puffer, einmal in einer Mischung von gleichen Volumina von RIPA und TNE (0,15 M NaCl; 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) und einmal in TNE gewaschen. Das Albuminprotein wurde in einem Probepuffer (200 μl, 0,06 M Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerol, 5% β-Mercaptoethanol, 0,002% Bromphenol Blau) eluiert, auf einem 7,5 SDS Polyacrylamidgel elektrophoresiert und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Membran wurde gegen nicht spezifische Bindung bei Raumtemperatur vor der Hybridisierung mit einem anti-humanen Kaninchen-Albumin-Antikörper (Dako, Santa Barbara, CA), verdünnt 1 : 800 in TBST einschließlich einer 5% fettlosen Milch, mit einer fettlosen Milch (5%), verdünnt in TBST (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) blockiert. Anschließend wurde die Membran drei mal in TBST (10 min.) gewaschen, bei Raumtemperatur mit einem biotinylierten Schwein-anti-Kaninchen-Antikörper, verdünnt 1 : 2000 in TBST (30 min.) inkubiert, erneut wie oben gewaschen und bei Raumtemperatur in Streptavidin-Alkalischer-Phosphatase in TBST (30 min.) inkubiert, die eine Farbreaktion in der Gegenwart des Chromogens (ABComplex, Dako, Santa Barbara, CA) erzeugte.
  • Die Karyotypanalyse der THLE-2 und THLE-3-Zellen zeigt, daß beide Linien hypodipolid (aneuplod) sind, wobei die meisten Karyotypen beinahe dipolid sind. Der Karyotyp jeder Zelllinie ist unverkennbar; keiner ist vollständig normal. Beide zeigen strukturelle Veränderungen, wie beispielsweise Chromatidenbrüche, Deletionen und azentrische Fragmente. Sowohl die THLE-2 als auch die THLE-3 sind bei der Tumorbildung durch subkutane Injektion in athymische Nacktmäuse getestet worden; keine Tumore sind 12 Monaten nach Injektion der Zellen entstanden.
  • Die Southern Blot Analyse der DNA aus den THLE-2-Zellen zeigt, daß diese Zellen eine einzige Kopie des SV40 T-Antigen-Gens pro haploidem Genom enthalten. Kulturen der SV40 TAg immortalisierten Zellen werden als Massenkulturen passagiert. Die immuncytochemische Analyse sowohl von THLE-2- als auch von THLE-3-Zellen zwischen der dritten und fünften Passage zeigt, daß von beiden Linien alle Zellen TAg in ihren Kernen exprimieren.
  • Bei früher Passage (Passage 3) zeigen sowohl die THLE-2- als auch die THLE-3-Zellen eine immuncytochemische Evidenz der Expression von Cytokeratin 18, aber nicht von Cytokeratin 19. Die Zellen von frühen Passagen färben auch positiv auf Albumin an. α-Fetoprotein ist durch Immunanfärbung nicht detektierbar. Die in situ Hybridisierung an mRNA-Demonstrat bestätigt die positive Expression von Albumin und das Fehlen der Expression von α-Fetoprotein. Die in situ Hybridisierung detektiert auch mRNA, die Transferrin, α2-Macroglobulin und α-1-Antitrypsin kodiert.
  • Die Wiederuntersuchung von der Cytokeratinexpression durch Immunanfärbung bei Passage 10 zeigt, daß sowohl Cytokeratin 18 als auch Cytokeratin 19 zu einer späteren Passage in beiden Zellinien exprimiert werden. Die Albuminexpression in späteren Passagezellen (Passage 12) ist abhängig von den Kulturbedingungen. Wachstum unter Bedingungen, die schnelle Proliferation begünstigen, führt zu einer geringeren Albuminexpression. Wachstum unter Bedingungen, die Proliferation verlangsamen, wie beispielsweise Rollflaschenkultur oder Ausplattieren auf Collagen oder MATRIGELTM-Oberflächen, führt zu einer erhöhten Albuminexpression. Die Albuminsekretion durch THLE-2-Zellen in Rollkulturen war ungefähr 300 pg/ml des Kulturmediums. In der Kolbenkultur produzierten die THLE-2- und THLE-3-Zellen 70 pg/ml bzw. 14,5 ng/ml des Albumins. Immuncytochemische Analyse der Albuminexpression zeigt, daß Albumin leicht in frühen Durchgangs-THLE-2- und THLE-3-Zellen detektiert wird. Zellinseln, die auf Albumin anfärbten, wurden von Clustern weniger intensiv anfärbender Zellen umgeben, was die Anwesenheit verschiedener Klontypen in der Kultur bei einem geringen PDL anzeigte.
  • Die THLE-2-Zellen sind für die Expression einer Anzahl von hepatocytenspezifischen Markern evaluiert worden. Die THLE-2-Zellen exprimieren Cytokeratin 18 und nicht Cytokeratin 19 bei einer frühen Passage, während bei einer späteren Passage die Expression von beiden dieser Cytokeratine beobachtet wird. Da Cytokeratin 19 normalerweise nicht in vivo in Leberepithelzellen exprimiert wird, sondern in Gallengangszellen exprimiert wird, ist dies ein Hinweis darauf, daß die THLE-Zellinien entweder zu einem primitiveren, weniger festgelegten Zelltyp während der Passage dedifferenzieren oder daß ein Stammzellentyp einen selektiven Vorteil in der Kultur gewinnt. Die Evidenz, daß Gallengangszellen und Leberepithelzellen aus einer gewöhnlichen Stammzelle entstehen, ist kürzlich durch andere gezeigt worden (44).
  • Zellen für die γ-GT-Anfärbung wurden auf beschichtete Glaskammerträger plattiert, in PBS gewaschen, in eisgekühltem Aceton (2 min.) fixiert und bei –20°C bis zum Gebrauch gelagert. Die histochemische Enzymreaktion für γ-GT wurde, wie beschrieben, durchgeführt (41). Die HepG2-Zellinie wurde als eine positive Kontrolle und die embryonische Hamsterzellinie 3T6 als eine negative Kontrolle benutzt. γ-GT wurde schwach durch Immuncytochemie in einigen Kolonien von THLE-2 und THLE-3 detektiert, genauso wie in primären Kulturen vor der viralen Transformation. 3T6-Zellen waren negativ, wohingegen HepG2-Zellen einheitlich hohe Werte der Enzyme aufwiesen.
  • Für die Faktor VIII-Analyse, wurden die Zellen in eisgekühltem Aceton fixiert (2 min.) und mit einem monoklonalen Mausantikörper gegen den humanen Faktor VIII bei Raumtemperatur inkubiert (45 min.; Zymed). Primäre Kulturen der humanen Nabelschnur-Endothelzellen wurden als eine positive Kontrolle benutzt. Die Expression des Faktors VIII wurde in einer frühen oder späten Passage in THLE-Zellen nicht detektiert.
  • Die Expression der Katalase, Superoxid-Dismutase und der Glutathionperoxidase wird in THLE-2-Zellen durch Northern Blot Analyse evaluiert. Die Zellen zeigen die Expression von mRNA für jedes dieser Proteine.
  • Bei der Evaluierung der mRNA-Expression stellt sich heraus, daß die frühen Passage-THLE-2-Zellen Botschaften für Albumin, Transferrin, α-1-Antitrypsin, α-2-Macroglobulin, Katalase, Superoxid-Dismutase und Glutathionperoxidase exprimieren. α-Fetoproteinexpression ist weder auf der mRNA-Ebene noch auf der Proteinebene detektierbar. α-Fetoprotein wird normalerweise nicht durch reife Leberepithelzellen exprimiert, sondern wird durch regenerierende Leber und häufig durch ein hepatozelluläres Karzinom sekretiert. So zeigen die THLE-2-Zellen ein den in vivo normalen Leberepithelzellen ähnliches Genexpressionsmuster. Dieses Genexpressionsmuster zeigt an, daß die Kulturen von THLE-2-Zellen (und wahrscheinlich von THLE-3-Zellen, obwohl sie nicht so gut charakterisiert sind) hauptsächlich eine Teilungspopulation von Leberzellen sind, die zumindest einen teilweise differenzierten Phänotyp aufrechterhalten.
  • Frühe Passage-THLE-2- und THLE-3-Zellen bildeten Kolonien mit einer gemischten Fähigkeit, Albumin zu sekretieren. Wir nehmen an, daß diese Zellen dedifferenzierte Leberepithelzellen konstituieren und eine unterschiedliche Fähigkeit haben, Albumin zu exprimieren, oder aus Leberstammzellen, differenziert zu Zellen mit Leberepithelzelleneigenschaften, entstanden. In Ratten, die mit hepatischen karzinogenen oder toxischen Verbindungen behandelt werden, werden ovale Zellen, die viel kleiner als parenchymale Leberepithelzellen oder knotenförmige Zellen sind, beobachtet (42–45). Ovale Zellen können zu Leberepithelzellen unter besonderen Bedingungen in vivo differenzieren (43, 45, 46) und legen nahe, dass diese Zellen Stammzellen mit der Möglichkeit, neoplastisch sowohl zu cholangiozellulären als auch zu hepatozellulären Karzinomen transformiert zu werden, sein können (44). Rattenovalzellen werden durch die Expression phänotypischer Marker, wie beispielsweise Albumin, Cytokeratin 18 und 19, γ-GT, α-Fetoprotein und Glutathion-S-Transferase pi, charakterisiert, wohingegen die 6-Glucose-Phosphatase-Aktivität nur schwach positiv ist (43, 45). Die THLE-Zellen haben eine epitheliale Morphologie; frühe Passagezellen sekretierten Albumin, exprimierten Cytokeratin 18, Transferrin, α1-Antitrypsin, α-Macroglobulin, GST (1 und 2) und sehr kleine Mengen von γ-GT. Sie waren einheitlich negativ für α-Fetoprotein und den Faktor VIII. Daher repräsentieren die THLE-Zellen eine Population mit einem Differenzierungsgrad zwischen ovalen Zellen und Leberepithelzellen. Die Möglichkeit, daß die THLE-Zellen von den Leberepithelzellenvorläufern abstammen, wie beispielsweise ovale Zellen, kann nicht ausgeschlossen werden. Die Tatsache jedoch, daß Cytokeratin 18 exprimiert wird und α-Fetoprotein abwesend ist, in einem sehr frühen Stadium ihrer Etablierung, zeigt eine Abstammung von differenzierten Leberepithelzellen eher an als von ovalen Zellen. Das Auftreten von Cytokeratin 19 und die Abnahme in der Albuminsekretion zu späteren Durchgängen legt nahe, daß die Zellen in der Kultur dedifferenzieren, ein Prozeß, der oft als eine Konsequenz der Transformation gesehen wird (47). In dem hier beschriebenen in vitro Modell von normalen Leberepithelzellen ist die Dedifferenzierung reversibel, weil die Albuminexpression in Rollflaschen induziert werden kann, und indem Zellen auf extrazellulären Matrizen oder in dreidimensionalen Aggregaten gezüchtet werden.
  • Eine zweite Konsequenz der Dedifferenzierung von Leberepithelzellen ist der Verlust von Arzneistoff metabolisierenden Enzymen, einschließlich Cytochrom P-450 und assoziierte gemischt-funktionale Oxidasen (48). Es ist berichtet worden, daß Kulturbedingungen, wie beispielsweise extrazelluläre Matrizen (49–51), Co-Kultursysteme (43, 52) und Hormonergänzung (7, 53, 54) die differenzierten Funktionen, einschließlich der Phase I und II Enzymaktivitäten von primären Leberepithelzellen, positiv beeinflussen (50, 55). Obwohl immortalisierte SV-40 Rattenleberzellinien nicht umfangreich auf ihr metabolisches Potential charakterisiert worden sind, sind die Aufrechterhaltung und/oder Induzierbarkeit von CYP2B und CYPIA, NADPH-Dytochrom P450 Reduktase, Glutathion-S-Transferasen und UDP-Glucuronyltransferasen mit Werten höher als in hu manen Hepatomzellinien oder Rattenhepatomzellinien berichtet worden (48). Die THLE-Zellen exprimierten mRNAs der Phase II Enzyme, wie beispielsweise die Epoxidhydrolase, CAT, GPD, SOD und GSTs in Mengen, vergleichbar mit der humanen Leber. GST pi und α- mRNAs sind die dominanten Formen, die in beiden THLE-Zellen bzw. der menschlichen Leber beobachtet werden. Die NADPH-Cytochrom P450 Reduktase wurde erhalten, aber auf einem niederen stabilen Zustand der mRNA-Ebene als in humaner Leber.
  • Beispiel 3: Karzinogener Metabolismus durch THLE-Zellinien, DNA-Adduktbildung
  • Der Metabolismus von drei karzinogenen Vorläuferverbindungen, die DNA-Addukte bilden, wurde in den THLE-Zellinien evaluiert. Benzo-[a]-pyren wurde als eine Prototypverbindung der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffklasse von karzinogenen Vorläufern benutzt. Ähnlich diente Dimethylnitrosamin als der Prototyp für die N-Nitrosaminklasse der karzinogenen Vorläufer und Aflatoxin B1 dient als Prototyp für Mikrotoxine, die von Mikroorganismen gemachte Verbindungen sind, bei denen gezeigt worden ist, daß sie durch die Säugerleber zu karzinogenen Verbindungen metabolisiert werden.
  • Für einige Experimente wird die Hälfte der Kulturen in MLCM gehalten. Der Rest der Kulturen wird mit 10 μg/ml Arochlor 1254 (NCl Chemical Repository, Kansas City, MO) 24 Stunden vor der Inkubation entweder mit Tritium behandeltem Benzo-a-pyren (B[a]P) oder mit Tritium behandeltem Aflatoxin B1 (AFB1) behandelt. In anderen Experimenten werden die experimentellen Kulturen mit [3H]-B[a]P, [3H]-AFB1 oder [3H]-Dimethylnitrosamin (DMN) für 24 Stunden ohne eine vorherige Arochlorbehandlung behandelt. Die Zellen werden durch Trypsination isoliert und durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 Minuten pelletiert. Der Über stand wird verworfen, und das Zellpellet wird in 5–10 ml des Lysepuffers (Applied Biosystems, Foster City, CA) resuspendiert. Die Lyselösung wird in RNAse für 2 Stunden inkubiert, gefolgt von einer 2-stündigen Behandlung mit Proteinase K. Die DNA wird von der Lysemischung durch Ethanolfällung aus der wäßrigen Lösung nach von einer Chloroform/Phenolextraktion gereinigt.
  • Gereinigte AFB1-adduktierte DNA, in Wasser neu gelöst, wird auf 0.15 N HCl eingestellt und für 15 Minuten bei 90–95°C, wie vorher beschrieben, inkubiert (Groopman et al. (23)). Dieses Verfahren setzt mehr als 95,5% des kovalent gebundenen Aflatoxins von der modifizierten DNA frei. Die Hydrolysate werden schnell auf Eis gekühlt und auf pH 5,3 mit 1 M Ammoniumformiat eingestellt. Methanol mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Qualität wird zu einer Endkonzentration von 5 hinzugefügt, und die Proben werden auf eine C-18 Sep-Pak-Säule (Waters Assoc., Milford, MA) aufgetragen, mit 5% Methanol in Wasser gewaschen, um nicht hydrolysierte DNA zu entfernen, und dann mit 80% Methanol in Wasser eluiert. Anschließend wird das Lösungsmittel aus dem Eluat durch rotierende Evaporation unter reduziertem Druck bis auf 200–300 μl Probengröße für eine Standard-HPLC-Analyse entfernt (23).
  • Die DMN-DNA-Addukt-Analyse wird mit einer kombinierten HPLC und 32P-Postmarkierten-Assaz, wie vorher berichtet, durchgeführt (24). Kurz dargestellt, 100 μg der DNA werden enzymatisch zu 3'-Monophosphatnukleotiden verdaut und dann mit Ionenpaar, reverse Phasen HPLC gereinigt. Fraktionen, die N7-Methyldeoxyguanosin (N7medGp) enthalten, werden mit Deoxyguanosin (dGp) als einem internen Standard in der Gegenwart von Polynucleotidkinase und 32P-gamma-ATP gemischt. Radioaktive Orthophosphate werden dabei auf unmodifizierte und adduktierte Nucleotide transferiert. Diese werden gelöst und quantifiziert, indem zweidimensionale Dünnschichtchromatographie, Autoradiographie oder Szintillationszählung benutzt wird.
  • Die Analyse von B[a]P-DNA (BPDE-DNA)-Addukten wird, wie vorher beschrieben, durchgeführt. Kurz dargestellt, die DNA wird mit DNAse I, alkalischer Phosphatase und Phosphodiesterase hydrolysiert und dann mit UV-absorbierenden Mengen von authentischen BPDE-DNA-Addukten gemischt. Die Mischungen werden auf Sephadex LH20-Säulen (90 cm × 5 cm, Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) appliziert und mit Wasser-Methanol-Gradienten (30–100% über 1 Liter) eluiert. Die Fraktionen (5 ml) werden auf Fluoreszenzemission (Anregung 340 nm, Emission 400 nm) analysiert, und die Portionen (1 ml) von jeder werden einer flüssigen Szintillationszählung unterworfen. Fraktionen, die radioaktive und fluoreszente Materialien enthalten, werden weiter durch HPLC zur Bestätigung der Adduktidentität charakterisiert.
  • THLE-2-Zellen, die Dimethylnitrosamin, Aflatoxin B1 und Benzo-[a]-pyren ausgesetzt werden, zeigen eine dosisabhängige Cytotoxizität, nahelegend, daß diese Zellen die Fähigkeit haben, diese Verbindungen zu genotoxischen Metaboliten zu metabolisieren. Daher wird die Bildung von DNA-Addukten durch diese Metaboliten untersucht, indem THLE-2- und THLE-3-Zellen, kultiviert in Kolben oder in Rollflaschen, benutzt werden. Die Ergebnisse solcher Studien werden in Tabelle 2 und 5 zusammengefaßt. Rollflaschenkulturen sowohl von THLE-2- als auch von THLE-3-Zellen zeigen höhere Mengen der Adduktbildung als die beobachtete Menge in Zellen, die in Kolben gezüchtet werden. Kein Metabolismus von AFB1 oder B[a]P durch THLE-2-Zellen ist detektierbar, wenn die Kulturen in Kolben gehalten werden. Jedoch werden beide dieser Karzinogene leicht durch Zellen, inkubiert in Rollflaschenkulturen, metabolisiert. Der Metabolismus von AFB1 durch THLE-3-Zellen ist dem in THLE-2-Zellen beobachteten ähnlich. Jedoch ist der Metabolismus von B[a]P zu DNA-bindenden Eletrophilen durch THLE-3 unabhängig von dem Gefäß, in dem die Kultur gehalten wird.
  • Das p450-induzierende Agens Arochlor erhöht signifikant die Rate der Adduktbildung durch B[a]P, hat aber keine Wirkung auf die AFB1-Adduktbildung. Die Zunahme an DNA-Adduktbildung durch Arochlorbehandlung wird durch Induktion von Cytochrom p450 1A1 mRNA parallel geschaltet (5). In Zellen, die nicht mit Arochlor behandelt werden, sind Cytochrom p450 1A1 und andere p450 Enzyme unter den beschriebenen Kulturbedingungen nicht detektierbar. Der Metabolismus der B[a]P Ausgangsverbindung zu dem reaktiven Elektrophil hat die Aktivität einer der beiden Cytochrom p450 Enzyme (P4501A1 und P450IIIA4) als auch die Aktivität des Phase II Biotransformationsenzyms Epoxidhydrolase zur Folge (14). Die gefundene Menge an B[a]P Dihydrodiolepoxid-Addukt nach der Exposition der THLE-2-Zellen zu B[a]P zeigt an, daß zumindest eines der P450 Enzyme genauso wie die Epoxidhydrolase aktiv sind und durch Arochlor 1254 reguliert werden. Da gezeigt worden ist, daß Arochlor 1254 die enzymatische Aktivität mehrerer Formen von P450 in vivo induziert (25), antworten sowohl die THLE-2- als auch die THLE-3-Zellinien auf eine solche Behandlung in einer physiologisch relevanten Weise.
  • Die Ergebnisse der karzinogenen Metabolismusstudien werden in Tabelle I gezeigt.
  • Tabelle I: Karzinogene DNA Addukte, gebildet in THLE-2-Zellen
    Figure 00270001
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Claims (10)

  1. Zellen, umfassend eine Zellinie, abgeleitet von normalem adultem humanem Lebergewebe, die folgende Eigenschaften aufweisen: 1.) immortalisiert durch Transformation mit dem Virus SV40, 2.) die Fähigkeit, wenn sie mit einer Verbindung kontaktiert wurden, diese Verbindung zu einem Produkt umzuwandeln, das mit DNA ein Addukt bildet, und 3.) sie zeigen ein ähnliches Genexpressionsmuster wie das von normalen adulten humanen Leberepithelzellen einschließlich der Expression von Cytokeratin 18 und Albumin.
  2. Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung Benzo-[a]-Pryren ist.
  3. Die Zellen nach Anspruch 1, die ebenfalls mRNA exprimieren, die mindestens eines der Proteine ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Transferrin, α-1 Antitrypsin, α-2 Macroglobulin, Catalase, Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase exprimieren.
  4. Die Zellen nach Anspruch 1, welche auch mindestens ein Cytochrom P450 in auf induzierbare Art exprimieren.
  5. Die Zellen nach Anspruch 1, die THLE-2 (ATCC CRL 10149) Zellen sind.
  6. Die Zellen nach Anspruch 1, die THLE-3 (ATCC CRL 11233) Zellen sind.
  7. Ein Verfahren zur Bewertung der Gentoxizität einer Verbindung, umfassend: 1.) Kultivierung der Zellen nach Anspruch 1 in einem Medium, welches die zu bewertende Verbindung enthält, 2.) Kultivierung der Zellen nach Anspruch 1 in einem Medium, welches die zu bewertende Verbindung nicht enthält, 3.) Messen des Überlebens der Zellen aus Schritt 1, 4.) Messen des Überlebens der Zellen aus Schritt 2, und 5.) Vergleichen der Ergebnisse der Schritte 3 und 4.
  8. Ein Verfahren zur Bewertung der Gentoxizität einer Verbindung, umfassend: 1.) Inkubieren der Zellen nach Anspruch 1 in einem Medium, welches die Verbindung nicht enthält, 2.) Inkubieren der Zellen nach Anspruch 1 in einem Medium, welches die Verbindung enthält, 3.) Isolieren der DNA aus Zellen aus Schritt 1, 4.) Messen der Bildung von Addukten an die in Schritt 3 isolierte DNA, 5.) Isolieren der DNA aus Zellen aus Schritt 2, 6.) Messen der Bildung von Addukten an die in Schritt 5 isolierte DNA, und 7.) Vergleichen der Mengen an gebildeten Addukten, die in Schritt 4 gemessen wurden, mit den in Schritt 6 gemessenen.
  9. Verfahren zum Screeening einer Verbindung auf mögliche Karzinogenität, umfassend: 1.) Inkubieren der Zellen nach Anspruch 1 in einem Medium, welches die Verbindung nicht enthält, 2.) Inkubieren der Zellen nach Anspruch 1 in einem Medium, welches die Verbindung enthält, 3.) Messen der Expression mindestens eines Cytochrom P450 Enzyms in den Zellen aus Schritt 1, 4.) Messen der Expression mindestens eines Cytochrom P450 Enzyms in den Zellen aus Schritt 2, und 5.) Vergleichen der Menge der Cytochrom P450 Expression gemessen in Schritt 3 mit der in Schritt 4 gemessenen Menge.
  10. Ein Verfahren nach Anspruch 8, welches weiterhin folgende Schritte umfaßt: a) ferner Messen der Expression an Epoxidhydrolase in den Zellen aus Schritt 1, und b) ferner Messen der Expression der Epoxidhydrolase in den Zellen aus Schritt 2, und c) ferner Vergleichen der Expression der Epoxidhydrolase gemessen in Schritt (a) mit der in Schritt (b) gemessenen Menge.
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