DE69333303T2 - Exogene cytochrom p450 gene enthaltende immortalisierte menschliche zelllinien - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion und Anwendung von rekombinanten Vektoren, die DNA-Sequenzen zum Kodieren und zur effizienten Expression von enzymatisch aktiven Cytochromen P450 in Säugerzellen enthalten. Die Erfindung betrifft auch immortalisierte humane Bronchial-Epithel-Zellen, die verschiedene Cytochrome-P450-Gene enthalten und die Verwendung dieser Zellen.
  • Die Cytochrome-P450 sind eine große Familie von Hämoproteinenzymen, die in der Lage sind, Xenobiotika wie Arzneistoffe, Karzinogene und Umweltverschmutzungen sowie Endobiotika wie Steroide, Fettsäuren und Prostaglandine zu verstoffwechseln. Einige Mitglieder der Cytochrom-P450-Familie sind sowohl in Tier- als auch in kultivierten Zellen induzierbar, während andere konstitutive Formen nicht induzierbar sind. Diese Gruppe von Enzymen führen nützliche Stoffwechselaktivitäten durch Entgiftung von Xenobiotika sowie schädliche Stoffwechselumwandlungen von Xenobiotika in toxische, mutagene und karzinogene Formen durch (Gelboin, Physiol. Rev., 60: 1107–1166, 1980).
  • In Tieren werden multiple molekulare Formen von Cytochromen-P450 simultan exprimiert und sie alle zeigen übliche physikalische und biologische Eigenschaften. Die Multiplizität und die allgemeinen Eigenschaften von Cytochromen-P450 machen es schwierig, ihre verschiedenen Formen, insbesondere die kleineren Formen abzutrennen. Selbst in Situationen, in denen P450-Cytochrome in gereinigter Form durch herkömmliche Enzymreinigungsverfahren isoliert worden sind, sind sie aus dem natürlichen biologischen Membranverbund entfernt worden und daher ist die Zugabe von NADPH-Cytochrom P450-Reduktase und anderen Zellfraktionen für enzymatische Aktivität erforderlich. Diese zusätzlichen Faktoren haben ein klareres Verständnis der Rolle und der Funktion der individuellen Cytochromformen in Stoffwechsel, Entgiftung und Aktivierung sowohl von xenobiotischen als auch endobiotischen Substraten verhindert.
  • Die toxikologische Prüfung von Arzneistoffen, potentiellen Karzinogenen, Nahrungsmittelprodukten, Nahrungsmittelzusätzen und Nahrungsmittelverunreinigungen ist in Tieren und in jüngerer Zeit in in vitro-Systemen wie Bakterien (Ames Test) und Tierzellkulturmodellen durchgeführt worden. Diese Systeme sind nachteilig, da sie keinen humanspezifischen Stoffwechsel aufweisen. Eine Extrapolation, um das menschliche Risiko zu bestimmen, ist daher schwierig, und potenziell ungenau. Den bakteriellen Testsystemen und einigen der Tierzellkulturmodelle fehlt eine vollständige Stoffwechselaktivität und sie weisen daher schädliche Verbindungen, die von der Aktivierung durch Stoffwechselwege, beispielsweise durch Cytochrom-P450-Enzyme, abhängen, nicht nach. In der Vergangenheit wurde diese Situation umgangen, indem aus Rattenlebern isolierte metabolisierende Enzyme zu den kultivierten Tierzellen zugegeben wurden. Bei diesem Ansatz ergeben sich zwei signifikante Probleme. Zunächst ist der resultierende Metabolismus nicht notwendigerweise derselbe wie beim Menschen. Zweitens erreichen hochreaktive Metaboliten ihr Zielmolekül vielleicht nicht und entgehen daher folglich einem Nachweis.
  • Obwohl humane metabolisierende Enzyme in Humanzelllinien eingefügt worden sind, leidet dieses System unter ernsthaften Mängeln (Crespi, Progress in Clinical and Biological Research, Bd. 340B Mendelsohn and Albertini (Hrsg.) Wiley-Liss, New York 97–106, 1990.) Die menschlichen Zellen sind Lymphoblasten, die für Cytotoxine, Mutagene oder Karzinogene kein hauptsächliches Zielgewebe bilden und in Abwesenheit von Induktoren keine natürliche Cytochrom-P450-Aktivität aufweisen. Darüber hinaus fehlen in diesen Zellen andere Enzyme, die in den Aktivierungsprozess eingebunden sind, beispielsweise Epoxidhydrolase, und müssen mittels Gentransfermethodologie eingeführt werden. Dieses System umfasst daher ein künstliches Modell mit einer fraglichen Korrelation zu der in vivo-Situation.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist daher ein in vitro-Humanzellliniensystem erwünscht, das zu den menschlichen in vivo-Bedingungen enge Parallelen aufweist. Die vorliegende Erfindung stellt eine nichttumorigene humane Bronchial-Epithelial-Zelllinie bereit, wobei die Zelllinie in der Lage ist, ohne Altern zu wachsen, wenn sie in einem Wachstumsmedium in vitro kultiviert ist und sie in der Lage ist, exogenes Cytochrom-P450-Gen zu exprimieren, das in die Zelllinie insertiert worden ist. Das Gen kann durch Transfektion oder Infektion insertiert werden. In dieser Zelllinie exprimierte P450-Gene schließen IA1, IA2, IIC9, IID6, IIE1 und/oder IIIA4 mit ein. Eine bevorzugte erfindungsgemäß beschriebene Zelllinie ist BEAS-2B-IA2, die eine mit dem IA2-Cytochrom-P450-Gen transfizierte BEAS-2B-Zelllinie ist.
  • In Ausführungsformen dieser Erfindung werden verschiedene Verfahren der Benutzung der Zelllinien beschrieben. Beispielsweise wird ein Verfahren zum Identifizieren oder Prüfen der Mutagenizität, Cytotoxizität oder Karzogenizität eines Agens beschrieben, das die Schritte umfasst: a) Umsetzen, Kultivieren oder Inkontaktbringen der Zelllinie mit einem Agens, von dem angenommen wird, dass es ein Mutagen, Cytotoxin oder Karzinogen ist, und b) Bestimmen oder Überwachen dieser Effekte auf die Zelllinie oder Veränderungen der Zelllinie, die auf Mutagenizität, Cytotoxizität oder Karzinogenität hinweist.
  • Ebenfalls erfindungsgemäß beschrieben wird ein Verfahren zum Identifizieren oder Testen der chemotherapeutischen Aktivität eines Agens, das die Schritte umfasst: a) Umsetzen, Kultivieren oder Inkontaktbringen der Zelllinie mit einem Agens, von dem angenommen wird, dass es ein Chemotherapeutikum ist, in Gegenwart eines Karzinogens, und b) Bestimmen oder Überwachen dieser Effekte auf die Zelllinie oder Veränderungen der Zelllinie, die auf chemotherapeutische Aktivität hinweisen. Das Agens kann vor dem Karzinogen zugegeben werden, um die präventativen Wirkungen des Agens zu messen.
  • In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um die Metaboliten zu bestimmen, die durch ein Karzinogen oder Xenobiotikum aktiviert werden, umfassend die Schritte: a) Umsetzen, Kultivieren oder Inkontaktbringen der Zelllinie mit dem angenommenen Karzinogen oder Xenobiotikum, und b) Identifizieren der Metaboliten und/oder ihrer Wirkungen.
  • Es wird auch ein diagnostischer Kit bereitgestellt, der die Zelllinie zur Verwendung in einem der Verfahren bereitstellt.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden infektiöse rekombinante Vektoren bereitgestellt, die DNA-Sequenzen in voller Länge für Cytochrome enthalten, wie beispielsweise P1-450 und P3-450, die auch als CYPIA1 bzw. CYPIA2 bekannt sind. Die vorliegende Erfindung stellt auch Systeme bereit, die enzymatisch aktive Cytochrom-P450-Proteine in menschlichen Zellen exprimieren.
  • Verschiedene andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der ausführlichen Beschreibung der Erfindung ersichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Diese und andere Ziele, Merkmale und viele der erwarteten Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der vorliegenden ausführlichen Beschreibung besser verstanden, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird, in denen:
  • 1 die schematische Konstruktion rekombinanter Vacciniaviren zur Expression der Maus-Cytochrome P1-450 und P3-450 zeigt. P11 und 7,5 transkriptionsregulatorische Sequenzen von Vaccinia für 11K bzw. 7,5K-Polypeptide. Lac Z, Escherichia Coli β-Galactosidase-Gen; TKL und TKR, Splittsegmente der Vacciniavirus-DNA aus linken bzw. rechten Positionen des TK-Gens. Amp. ist das Ampicillinresistenzgen;
  • 2 zeigt die Identifizierung von Cytochrom-P1-450 und P3-450-Polypeptiden. Lysate (100 μg) wurden elektrophoresiert und mittels Immunoblotting nachgewiesen. Gefärbte Proteinmolekulargewichtsmarker sind rechts gezeigt. 2A. Expression in WI-38 und NIH 3T3-Zellen. 2B. Zeitverlauf der Synthese in NIH 3T3-Zellen. Die in sämtlichen Zellspuren (cell lanes) nachgewiesene kleinere Bande Mr = 80 000 wurde nicht nachgewiesen, wenn verdünnte Antiseren verwendet wurden;
  • 3 zeigt Cytochrom-P1-450 und P3-450-Polypeptide in subzellulären Fraktionen. In jeder Spur wurden 100 μg Protein einer Elektrophorese und Immunoblotting unterzogen.
  • 4 zeigt das CO-Differenzspektrum von mit Dithionit reduzierten microsomalen Fraktionen. Microsome wurden mit Emulgen 913 solubilisiert und der Überstand für die Spektren verwendet. ---- Dithionit-reduzierte Spektren, ––– reduzierte und CO-gesättigte Spektren;
  • 5 zeigt die Expression der AHH-Aktivität. Infizierte Zellen wurden zu den angegebenen Zeitintervallen geerntet und die Lysate auf AHH-Aktivität geprüft. NIH 3T3-Zellen infiziert mit VV-P1, VV-P3 und WT-VV. In nichtinfizierten Kontrollzellen (nicht gezeigt) wurde keine nachweisbare Aktivität gefunden;
  • 6 zeigt eine TLC-Analyse der Acetanilidhydroxylase-Aktivität. Zelllysate (500 μg) wurden getestet und die Produkte mittels TLC aufgetrennt;
  • 7 zeigt die schematische Konstruktion der rekombinanten Vektoren für die Expression von Cytochrom-P450-Genen und die Transfektion der Vektoren in die BEAS-2B-Zellen; und
  • 8 zeigt die Cytotoxizität von Aflatoxin B1 oder Aflatoxin G1 in den Linien BEAS-2B-pXT1 und BEAS-2B-IA2.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die zuvor beschriebenen und verschiedene andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden erreicht durch (a) Konstruieren rekombinanter Vektoren, die cDNA-Sequenzen für die Kodierung von Cytochrom-P450-Polypeptiden enthalten, sodass Säugerzellen, insbesondere menschliche Zellen, wenn sie mit diesen rekombinanten Vektoren infiziert werden, die P450-Polypeptide wirksam exprimieren; und (b) Bereitstellen von funktionell intakten Zelllinien, die Cytochrom-Polypeptide enthalten, ohne dass es erforderlich ist, von außen NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase für die enzymatische Aktivität zuzugeben.
  • Wenn nichts anderes angegeben ist, weisen sämtliche der hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die selbe Bedeutung auf wie sie von einem Durchschnittsfachmann des Gebiets, zu dem diese Erfindung gehört, üblicherweise verstanden werden. Obwohl bei der Durchführung oder Überprüfung der vorliegenden Erfindung beliebige Methoden und Materialien verwendet werden können, die den beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, werden die bevorzugten Methoden und Materialien nun beschrieben.
  • Bronchialzelllinien
  • Die immortalisierten humanen Bronchialepithelzelllinien, die in dieser Erfindung verwendet werden, sind im US-Patent 4,885,238 beschrieben. Diese Zelllinien werden wie folgt hergestellt.
  • Normale humane Bronchialepithel-(NHBE)-Zellen wurden aus Explantaten gezüchtet, die aus Tracheobronchial-Proben nichtkanzeröser Individuen mittels Necropsie erhalten worden waren, wie bei Lechner, et al., J. Tissue Culture Methods, 9: 43–48, 1985 beschrieben ist. Die NHBE-Zellen wurden mit Adenovirus-12 SV40 Hybridvirus infiziert. In sämtlichen Fällen war die Lebensspanne dieser Kulturen verglichen mit NHBE verlängert; die meisten der Kulturen durchliefen eine verlängerte Periode des Alterns, die als "Krise" bezeichnet wird. Bei fortgesetzter Kultur entstanden in manchen Fällen Zellkolonien, die dem Altern entgangen waren; solche überlebenden Kolonien wurden im folgenden für verlängerte Zeiträume stehen gelassen und zeigten unbegrenztes Wachstumspotenzial.
  • Wie NHBE-Zellen, jedoch anders als Bronchialkarzinomzellen, behielten einige der so erhaltenen Zelllinien die Fähigkeit, in Antwort auf eine Serumexposition ein squamöse Differenzierung zu durchlaufen. Injektion dieser Zellen in bestrahlte athymische Nacktmäuse (athymic nude mice) führte nach Zeitspannen von bis zu neun Monaten nicht zu einer Bildung von Tumoren. Darüber hinaus wurde gefunden, dass diese Zelllinien geeignete Empfänger für die Transfektion zusätzlicher Gene und zum Testen des cytotoxischen Potenzials chemischer und physikalischer Mittel, der Wachstumsinhibierung oder Kapazitätsförderung biologischer Mittel und dem squamösen Differenzierungspotenzial chemischer und biologischer Mittel sind.
  • Entwicklung der BEAS-2B-Zelllinie
  • Eine bevorzugte Zelllinie zur Verwendung in dieser Erfindung ist BEAS-2B, das wie folgt hergestellt wird. NHBE-Zellen werden aus Explantaten von Proben von Autopsien aus nichtkanzerösen Individuen gezüchtet, wie bei Lechner, et al., J. Tissue Culture Methods, 9: 43–48, 1985 beschrieben ist. Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium, LHC-9, gezüchtet, mittels Trypsinisierung geerntet und in 10 ml Wachstumsmedium in 100 mm Kulturschalen (Lux, Miles Scientific, Naperville, IL.) gesät, dessen Wachstumsoberflächen mit einer Lösung von Rinderserumalbumin, Fibronectin und Kollagen (Lechner, et al., a. a. O.) beschichtet waren.
  • Adenovirus 12-SV40 (Ad12SV40) Hybridvirus (Schell, et al. Proc. 'Natl. Acad. Sci. U.S.A. 55: 81–88, 1966) wurde in Verozellen gezüchtet, wie bei Rhim, et al., Proc. Natl. Sci. U.S.A., 78: 313–317, 1981 beschrieben ist. NHBE-Zellen wurden dem Virus vier Stunden lang bei 37°C ausgesetzt, und zwar bei einer Multiplizität der Infektion von etwa 100. Wenn die Kulturen Konfluenz erreicht hatten, wurde ihre Schale in zwei 75 cm2-Kolben subkultiviert. Man ließ die Zellen wieder Konfluenz erreichen und dann wurden sie zweimal wöchentlich gefüttert, bis transformierte Kolonien auftraten, und die normalen Zellen alterten. Das Altern der normalen Zellen wurde beschleunigt, indem die Kulturen 28 Tage lang 1% FCS in LHC-9 ausgesetzt wurden (Lechner, et al., Differentiation, 25: 229–237, 1984); jede folgende Kultur dieser Zellen war in serumfreiem LHC-9-Medium. Individuelle Kolonien wurden 41 Tage nach der viralen Infektion subkultiviert und Zellstränge, die auf diese Weise aus diesem Experiment abstammten, wurden als BEAS-2 bezeichnet.
  • Da BEAS-2B-Zellen von humanen Bronchialepithelzellen abstammen, die höchstwahrscheinlich die Vorläuferzellen sämtlicher Typen von Lungenkrebs sind, sollten BEAS-2B-Zellen die in vivo Situation repräsentieren. Sie sind in der Lage, IA1 und andere Enzyme, die in dem Aktivierungsprozess von Karzinogenen und Mutagenen beteiligt sind, wie Glutathion-S-Transferase, Epoxidhydrolase und NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase zu exprimieren.
  • Cytochrom-P450-Gene und -Vektoren
  • Genomische oder cDNA-Klone, die Cytochrom-P450 kodieren, können aus Klonbibliotheken isoliert werden, wobei Hybridisierungssonden verwendet werden, die auf der Basis der Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen des gewünschten Gens konzipiert sind. Die Sonden können durch chemische Synthese oder Polymerasekettenreaktionen aufgebaut werden, wobei Primer verwendet werden, die auf Sequenzdaten zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten aus Pools oder Bibliotheken basieren (US-Patent 4,683,195 und 4,683,202). Nukleotidsubstitutionen, Deletionen, Additionen und dergleichen können in die Polynukleotide ebenfalls eingebaut werden, solange die Fähigkeit des Polynukleotids zum Hybridisieren nicht wesentlich zerstört wird (Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aus. 1989 und Bergen und Kimmel, Methods in Enzymology, Bd. 152, Guide to Molecular Cloning Technigues (1987). Die Klone können exprimiert werden oder das interessierende P450-Gen kann ausgeschnitten werden oder zur Verwendung in anderen Systemen synthetisiert werden. Die Sequenzen verschiedener cDNA-Isolate sind für Cytochrom P45011C9 beschrieben (Umbenhauer, et al., Biochem., 26: 1094–1099, 1987 und Kimura, et al., Nucl. Acids Res., 15.10053-10054, 1987); P450IIE1 (Song, et al., J. Biol. Chem., 261: 16689–16697, 1986 und Umeno, et al., Biochem., 27: 9006–9013, 1988), und P450IIIA4 (Beaune, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 8064–8068, 1986 und Gonzales, et al., DNA, 7: 79–86, 1988). Cytochrom-P450IA2 ist beschrieben bei Jaiswal, et al., Nucl. Acids Res., 14: 6773–6774, 1986; IIA3 bei Yamano, et al., Biochem., 29: 1322–1329, 1990; und IID6 bei Gonzalez, et al., Genomics, 2: 174–179, 1988.
  • Die Cytochrom-P450-Gene können durch Transkription von Plasmid-DNA oder durch retrovirale Infektion in die Zelllinien übertragen werden. Die Transfektion von Zellen kann durch die üblicherweise verwendeten Verfahren geschehen, wie beispielsweise Kalzium oder Strontiumphosphat-Behandlung, Mikroinjektion, Elektroporation oder Lipofektion. Beispielsweise können die Zellen mit einem Molony-LTR-angetriebenen Promotor injiziert werden oder mit einem Adenovirus, Vacciniavirus, HIV, oder CMV-Promotor-Konstrukt lipofiziert werden. Das transfizierte DNA-Plasmid kann ein selektierbares Markergen enthalten oder mit einem Plasmid co-transfiziert werden, das einen selektierbaren Marken enthält und in manchen Fällen enthält der retrovirale Vektor ein selektierbares Markergen. Wenn ein oder mehrere selektierbare Marker zusammen mit dem P450-Gen in die Zellen transferiert werden, können die das P450-Gen enthaltenden Zeltpopulationen identifiziert werden und durch Selektieren des oder der Marker angereichert werden. Marken sind normalerweise antibiotikaresistent gegen solche Antibiotika wie Tetracyclin, Hygromycin, Neomycin und dergleichen. Andere Marken können Thymidinkinase und dergleichen mit einschließen.
  • Immortalisierte humane Bronchialepithelialzelllinie, die Cytochrom-P450-Gene enthält
  • Komplementäre cDNAs für die Cytochrom-P450-Enzyme, IA2, IIA3, IID6, IIE1 und IIIA4 wurden durch rekombinante hochtitrige amphotrope Retroviren in die BEAS-2B Zellen eingeführt. Diese Retroviren wurden durch Klonieren der entsprechenden cDNAs in ein Plasmid pXT1 (Boulter, et al., Nucleic Acid, 15: 7194, 1987) und Transfizieren der rekombinanten Plasmide in co-kultivierte Verpackungslinien mit amphotropen (PA317) und ecotropen Hüllen (Psi2) unter Verwendung von Kalziumphosphatpräzipitation (Bestwick, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5404–5408, 1988) erzeugt (siehe 7).
  • Nach 10 Tagen wurde das Virus aus konfluenten PA317/Psi2-Kulturen in serumfreiem PC-1-Medium (Ventrex Laboratories, Inc., Portland, OR) gesammelt. Die Titer wurden auf NIH3T3-Zellen bestimmt und als neomycinresistente Kolonien/ml Überstand exprimiert. Die BEAS-2B-Zellen wurden zwei Stunden lang mit den P450-Viren oder dem Kontrollvirus pXT1 in PC-1-Medium, das mit 8 μg/ml Polybren ergänzt war, infiziert (Tabelle 1). TABELLE 1 Erzeugung hochtitriger amphotropischer P450 Retroviren
    Figure 00070001
    • AA,
    aromatische Amine;
    HAA,
    heterozyklische aromatische Amine;
    NNK,
    4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon;
    AFB1,
    Aflatoxin B1;
    DEN,
    Diethylnitrosamin;
    DMN,
    Dimethylnitrosamin;
    MeiQ,
    2-Amino-3,8-dimethyl-imidazo[4,5-f]chinoxalin.
  • Es wurde ein gleiches Verhältnis von Zellen zu koloniebildenden Einheiten des Virus eingesetzt. 48 Stunden nach Infektion wurden die BEAS-2B Zellen mit 125 μg/ml Neomycin 8 Tage lang auf G418-Neomycin Resistenz selektiert. Nachfolgend wurden die Zellen mittels Western-Blot-Analyse auf das Vorliegen der eingeführten Gene selektiert. Am Beispiel des P450IA2 veranschaulicht, exprimierten die Population und 3 Klone (Klon 8 > Klon 3 > Klon 6) das Protein, das dem jeweiligen P450 Retrovirus entspricht. Demgemäß zeigte Klon 8 (cl 8) die höchste Empfindlichkeit, und zeigte gegenüber dem cytotoxischen Effekt eine bis zu 150mal größere Reaktion und gegenüber dem genotoxischen Effekt einer Modellverbindung AFB, eine bis zu 250mal größere Reaktion als die Kontrolle.
  • 8 zeigt auch die Analyse der Cytotoxizität für Aflatoxin B, oder Aflatoxin G, auf die Klone BEAS-2B-pXT1 und BEAS-2B-IA2. Die Zellen wurden 28 Stunden lang verschiedenen Konzentrationen der Mutagene ausgesetzt. Jede Kultur enthielt 250 Zellen pro 60 mm Schale. Nach 7–10 Tagen wurde die Cytotoxizität festgestellt, indem die Kolonienanzahljeder Platte bestimmt wurde. Die Kolonienanzahl der mutagen-behandelten Kulturen wurden durch die Kolonienanzahl der nicht-behandelten Kulturen dividiert, wobei die relativ Überlebenden erhalten wurden. Jeder Zeitpunkt steht für mindestens 3 unabhängige Versuche.
  • Tabelle 2 gibt die DNA-Addukt-Bildung mit AFB, an. Die Bildung wurde in Klon 8 durch einen Faktor von 1000 erhöht.
  • TABELLE 2 Bindung von [3H]AFB1 an zelluläre DNA
    Figure 00080001
  • Etwa 1 × 107 Zellen wurden 0,1 oder 1,0 μg/ml [3H]AFB1(0,2 Ci/mmol) unter den Bedingungen des Cytotoxizitäts-Assays ausgesetzt. Zelluläre DNA wurde isoliert und die Bindung wurde durch Flüssig-Szintillations-Zählung gemessen (und.: nicht nachweisbar).
  • Nutzung der Zelllinien
    • (1) Identifizierung potentieller chemotherapeutischer Arzneistoffe: Diese Zellen sind zum Screenen von chemischen Stoffen brauchbar, die zur Behandlung von Krebs und verwandten Erkrankungen geeignet sind, indem sie in vitro in einem Medium gezüchtet werden, das den zu testenden chemischen Stoff enthält und dann nach einem geeigneten Expositionszeitraum bestimmt wird, ob und in welchem Ausmaß Cytotoxizität eingetreten ist, z. B. durch Trypan-Blau-Ausschlusstest oder verwandte Tests (Paterson, Methods Enzymol., 58: 141, 1979) oder durch Wachstumstests wie Koloniebildungseffizienz (colony formatting efficiency) (MacDonald. et al., Exp. Cell. Res., 50: 417, 1968), die sämtliche auf diesem Gebiet gut bekannte Standardtechniken sind. Wenn das potentielle Chemotherapeutikum identifiziert ist, können es und die Zellen in weiteren Untersuchungen wie beispielsweise Arzneistoff-Design verwendet werden. Diese Zellen sind auch bei der Identifizierung potentieller Karzinogene brauchbar.
    • (2) Untersuchungen der Kontrolle der squamösen Differenzierung und Identifizierung von chemischen und biologischen Mitteln, die squamöse Differenzierung induzieren: Dies wird durch Tests erreicht, die für normale humane Bronchial-Epithelial-Zellen bereits beschrieben wurden (Masui, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 2438, 1986). Einige Zellen behalten die Fähigkeit, als Antwort auf Serum eine squamöse Differenzierung zu durchlaufen. Die Induktion einer terminalen Differenzierung kann ein effektiver Weg zur Kontrolle des Wachstums von Krebs sein. Chemische und biologische Substanzen werden auf ihre Fähigkeit gescreent, eine Differenzierung zu induzieren, indem sie dem Wachstumsmedium dieser Zellen zugegeben werden und dann nach einem geeigneten Zeitintervall bestimmt wird, ob ein Komplex von Veränderungen, der das Aufhören der DNA-Synthese und das Auftreten von squamösen Morphologie mit einschließt, eingetreten ist. Die Zellen sind auch brauchbar für Untersuchungen für die biologischen Mechanismen der squamösen Differenzierung und die Existenz von sowohl serum-resistenten als auch serum-empfindlichen Zelllinien macht Vergleiche und Identifizierungen von Genen möglich, die am Prozess der Differenzierung beteiligt sind.
    • (3) Untersuchungen des Metabolismus von Karzinogenen und anderen Xenobiotikas: Karzinogene und andere Xenobiotika können zu dem Wachstumsmedium dieser Zellen zugegeben werden und dann kann das Auftreten von Stoffwechselprodukten dieser Verbindungen durch Techniken wie Dünnschichtchromatographie oder Hochleistungs- Flüssigkeits-Chromatographie und dgl. überwacht werden. Die Wechselwirkungen der Verbindungen und/oder ihrer Metaboliten mit DNA wird dann bestimmt.
    • (4) Untersuchungen der DNA Mutagenese: Substanzen, von denen bekannt ist oder angenommen wird, dass sie Mutagene sind, können zu dem Wachstumsmedium der Zellen zugegeben werden und dann können die Mutationen getestet werden, beispielsweise durch Nachweisen des Auftretens von arzneistoffresistenten mutanten Zellkolonien (Thompson, Methods Enzymol., 58: 308, 1979). In gleicher Weise, zell-vermittelte DNA-Mutagenese durch Cokultivieren der Zellen mit Zelltypen, von denen bekannt ist oder angenommen wird, dass sie in der Lage sind, mutagene Verbindungen zu sekretieren (Hsu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 2003, 1978). Das P450 Enzym kann auch mit einem Mutagen-Nachweistest wie dem Ames Salmonella/Microsom System verknüpft werden, um die mutagene Frequenz nachzuweisen oder zu bestimmen, die durch umweltverschmutzende Stoffe, Karzinogene und dgl. induziert wird (Ames, et al., Mut. Res., 31: 347, 1975). Andere in der Technik gut bekannt Standardverfahren wie Chromosomen-Aberration und die Induktion von Schwester-Chromatid-Austausch in Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (Galloway, et al., Environ. Mutagen., 7: 1, 1985) oder Maus-Lymphoma-Zell-Mutagenese-Tests (Myhr, et al., Prog. In Mut. Res., 5: 555–568, 1985) können selbstverständlich auch zum Testen der Mutagenizität verwendet werden.
    • (5) Untersuchungen der chromosomenschädigenden Mittel: Substanzen, von denen bekannt ist oder angenommen wird, dass sie Chromosomenschäden verursachen, können zu dem Kulturmedium dieser Zelllinien zugegeben werden und dann kann der Umfang der Chromosomenschäden durch Techniken wie beispielsweise der Messung der Frequenz bzw. Häufigkeit des Schwester-Chromatid-Austauschs bestimmt werden (Latt, et al., In: Tice, R. R. und Hollaender, A. Sister Chromatid Exchanges, New. York: Plenum Press, S. 11 ff., 1984).
    • (6) Untersuchung von maligner Transformation durch chemische, physikalische und virale Mittel und transferrierte Gene einschließlich Oncogene, Mutanten-Tumor-Suppressor-Genen und genomische DNA mit hohem Molekulargewicht aus Tumoren, unter Verwendung von Standardtests wie Anker-unabhängiges Wachstum oder Tumorbildung in athymischen Nacktmäusen.
    • (7) Verwendung von Zellen, die durch Transfer von Oncogenen wie in dem obigen Absatz 6 verändert wurden, um nach potentiellen chemotherapeutischen Mitteln (durch die in dem vorherigen Absatz 1 beschriebenen Techniken) zu screenen, insbesondere denjenigen, die für Zellen spezifisch sein können, die durch die Aktivierung von besonderen Oncogenen, der Kombination von Oncogenen oder mutanten Tumor-Suppressor-Genen transformiert sind.
    • (8) Untersuchungen der zellulären Biochemie einschließlich Veränderungen des intrazellulären pH und Kalziumspiegels, in Korrelation mit dem Zellwachstum und der Wirkung von exogenen Mitteln einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, den in den vorherigen Absätzen 1–7 beschriebenen. Um den intrazellulären pH- und Kalziumspiegel zu untersuchen, werden Zellen in geeigneten Kulturgefäßen fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen ausgesetzt und die Fluoreszenz-Emissionen dann mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer nachgewiesen (Grynkiewicz, et al., J. Biol. Chem., 260: 3440–3450, 1985).
    • (9) Untersuchungen von Zellantworten auf Wachstumsfaktoren und Herstellung von Wachstumsfaktoren: Identifizierung und Reinigung von Wachstumsfaktoren, die für das Wachstum und die Differenzierung humaner Bronchial-Epithel-Zellen wichtig sind. Diese Zellen sind insbesondere brauchbar für eine derartige Anwendung, da sie in serumfreien Medien wachsen. Antworten auf Wachstumsfaktoren können daher in genau definierten Wachstumsmedien untersucht werden und jegliche Faktoren, die von den Zellen produziert werden können, können ohne Komplikation durch die Gegenwart des Serums identifiziert und gereinigt werden.
    • (10) Verwendung von rekombinanten DNA Expressions-Vektoren zum Erzeugen von interessierenden Proteinen. Beispielsweise kann das Gen, das ein Protein von therapeutischem Wert kodiert, mit kontrollierenden DNA-Segmenten rekombiniert werden (d. h. einen Promotor mit oder ohne einer Enhancer-Sequenz enthalten), in die Zelle transferiert werden (z. B. durch Strontiumphosphat-Transfektion) und dann kann das erzeugte Protein aus dem Kulturüberstand oder einem Zellextrakt mittels Routineverfahren, die in der Technik bekannt sind, geerntet werden.
    • (11) Untersuchungen der intrazellulären Kommunikation, z. B. durch sog. Farbstoff-Scrape-Loading-Tests. Um zu bestimmen, ob die Zellen, die in vitro wachsen, die Fähigkeit aufweisen, mittels sog. Gap junctions zu kommunizieren; die Kulturen können gekratzt werden, z. B. mit einem Skalpell in Gegenwart eines fluoreszierenden Farbstoffs in dem Wachstumsmedium. Zellen am Rand der Wunde werden mechanisch aufgerissen und nehmen daher den Farbstoff auf; ob interzelluläre Kommunikation stattgefunden hat, kann sichergestellt werden, indem bestimmt wird, ob Zellen entfernt von der Wunde ebenfalls Farbstoff enthalten.
    • (12) Charakterisierung der Zelloberflächen-Antigene: Die Zellen werden mit einem Anitkörper gegen das interessierende Zelloberflächen-Antigen inkubiert und dann mit einem zweiten Anitkörper umgesetzt, der an einem fluoreszierenden Farbstoff konjugiert ist. Die Zellen werden dann evaluiert, wobei ein fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer verwendet wird, um zu bestimmen, ob sie fluoreszierend sind und daher das Zellobertlächen-Antigen besitzen.
    • (13) Hybrid-Untersuchungen zur Identifizierung der Tumor-Suppressor-Aktivität (Stanbridge, et al., Science, 215: 252–259, 1982). Um zu bestimmen, ob diese Zelllinien Tumor-Suppressor-Gene enthalten, werden sie mit malignen Tumorzellen fusioniert bzw. verschmolzen. Die Gegenwart von Tumor-Suppressor-Genen wird durch einen Verlust der Malignität angezeigt, z. B. wie sie durch den Verlust der Fähigkeit zur Bildung von Tumoren in athymischen Nacktmäusen in den Hybridzellen nachgewiesen wird.
    • (14) Identifizierung neuer Gene, einschließlich transformierenden Genen in natürlich auftretenden Krebsen, die in dem vorherigen Absatz 6 beschrieben sind, Wachstumsfaktor-Gene wie in dem obigen Absatz 9 beschrieben wird, Tumor-Suppressor-Gene, in dem obigen Absatz 13 beschrieben, wobei molekular biologische Standardtechniken verwendet werden (Davis, et al., Methods in Molecular Biology, New York: Elseveier, 1986) und Techniken wie cDNA Substraktions-Klonen und dgl.. Diese Gene oder ihre Derivate können in der Gentherapie verwendet werden.
  • Selbstverständlich ist ein Kit zum Screenen von Karzinogenen oder antineoplastischen Mitteln und jede andere hier beschriebene Verwendung einfach zusammenzusetzen und umfasst (einen) Behälter, (der) die Zelllinie(n) der vorliegenden Erfindung umfasst (umfassen). Andere Komponenten, die üblicherweise in derartigen Kits zu finden sind, können ebenfalls mit Anweisungen zur Durchführung des Tests enthalten sein.
  • Herstellung und Expression von P1-450 und P3-450 in Vacciniaviren ist im Folgenden beschrieben.
  • Enzyme und Chemikalien: Restriktionsendonuklease, DNA-Polymerase-1 und ihr Klenow-Fragment und T4-DNA-Ligase wurden von handelsüblichen Quellen erworben und entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet. 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactosidase (X-gal) wurde von Boehringer Mannheim erworben (Smith et al, Biotechnigues, Nov/Dez: 306–312, 1984). C-Acetanilid (31,7 mCi/mmol) wurde California Bionuclear gekauft.
  • Viren und Zellen: Vacciniavirus (Stamm WR) HeLa Zellen, CV-1-Zellen, BSC-1-Zellen und menschliche TK-143 Zellen wurden von NIH, Bethesda, MD, erhalten. Das Virus wurde in HeLa Zellen gezüchtet und aus zytoplasmischen Extrakten mittels Sucrose-Dichtegradienten-Zentrifugation gemäß den bei Joklik, Virolo, 18: 9–18, 1962 beschriebenen Vorgehensweisen gereinigt. Sämtliche Zellen wurden in Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium gezüchtet, das 10% fetales Kälberserum enthielt und die TK- Zellen wiesen zusätzlich 25 μg BrdUrd pro ml auf.
  • Vektoren und DNA: Koexpressions-Insertions-Vektor pSC-11 (Chakrabarti, et al, Mol. Cell. Biol., 5: 3403–3409, 1985) und komplimentäre DNA-Klone von Cytochrom P1-450 und P3-450 (Kimura, et al., J. Biol. Chem., 259: 10705–10713, 1974) wurden bei der Konstruktion der Rekombinanten eingesetzt. Die Plasmide wurden in Bakterien gezüchtet und ihre DNAs mittels zweier sequentieller Zentrifugationen auf CsCI-EtBr Gleichgewichts-Dichtegradienten gereinigt. DNA-Fragmente wurden auf Agarose-Gelen aufgetrennt und mittels Elektroelution gereinigt. Andere rekombinante DNA-Verfahren wurden mittels Standardverfahren durchgeführt (Maniatis et al, Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: New York, 1982). Vacciniavirus DNA wurde aus den gereinigten Virionen extrahiert, wie von Garon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. U.S.A., 75: 4865– 4867, 1978 beschrieben wurde.
  • Infektion, Transfektion und Isolation rekombinanter Viren: Die Verfahren wurden im Wesentlichen durchgeführt wie von B. Moss und Kollegen beschrieben ist (Mackett, et al., J. Virol., 49: 857–864, 1984; Smith, aaO; Mackett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 7415–7419, 1982). Subkonfluente CV-1 Affennieren-Zellen, die mit Wildtyp-Vacciniavirus infiziert waren (WT-VV) wurden mit 10 μg Rekombinationsvektor und 1 μg Wildtyp-Vacciniavirus-DNA transfiziert. Zwei Tage nach Inkubation wurden die in den Zellen gebildeten rekominanten TK–-Viren von dem Wildtyp mittels eines Plaque-Tests auf TK–-Zellen in Gegenwart von BrdUrd unterschieden (Chakrabarti, et al., 1985, a. a. O.). Die TK–-Zellen mit den TK–-Plaques wurden mit Agar überlegt, das 400 μg X-gal pro ml enthielt, um die gleichzeitige Expression von β-Galactosidase zu prüfen und auch um TK–-Rekombinanten von TK–-Mutanten zu unterscheiden. Die TK–, β-gal + Rekombinanten wurden mittels zweier Selektionszyklen gereinigt. Die Rekombinanten wurden dann auf die Gegenwart von P1-450 und P3-450 cDNA Inserts mittels Dot-Blot-Hybridisierung gescreent (Macket, et al., 1982, aaO) und die Virus-Stocks in HeLa Zellen hergestellt.
  • Protein-Analyse durch Immunoblotting: Die Zellen wurden durch Abkratzen geerntet und die Lysate wurden durch drei Frost-Tau-Zyklen und kurze Schallbehandlung in einem Puffer, der 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, + 0,25 M Sucrose enthielt, hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde durch das Lowry-Verfahren bestimmt (Lowry, et al., J. Bio. Chem., 193: 265–275, 1951). Elektrophorese in 7,5%igen Polyacryamid-Gelen in Gegenwart von NaDodSO4 wurde, wie von Laemmli (Nature, 227: 680–685, 1970) beschrieben, durchgeführt. Vorgefärbte Protein-Molekular-Gewichts-Standards (Bethesda Research Laboratories) wurden verwendet, um die Größe der Polypeptide zu bewerten. Die elektrophoresierten Proteine wurden auf Nitrocellulosemembranen übertragen und die übertragenen Proteine mittels Western-Blotting nachgewiesen (Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76: 4350–4354, 1979) wobei ein Gemisch aus Kaninchen-Antiseren gegen P-450c und P-450d verwendet wurde. Die Formen P-450c und P-450d sind die Rattenhomologen von Maus P1-450 bzw. P3-450. Diese Proteine teilen einen hohen Grad ihrer Homologie und ihre Antiseren kreuzreagieren miteinander. Die Immunoblots wurden nachgewiesen durch Inkubieren mit Ziege-Antikaninchen-Immunoglobulin G, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist (KPL Labs, Gaithersburg, Md) in Verbindung mit dem chromogenen Substrat 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat/p-Nitro-Blau-Tetrazoliumchlorid.
  • Messung der Co-reduzierten Differenzspektren:
  • Es wurden microsomale Fraktionen aus den Zelllysaten hergestellt. Die Lysate wurden bei etwa 700 g 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand wurde bei etwa 8.000 g 10 Minuten lang nochmals zentrifugiert. Der erhaltene 8.000 g Überstand wurde 60 Minuten lang bei etwa 100.000 g nochmals zentrifugiert, um die Microsomen zu pelletieren. Die microsomale Fraktion wurde in 0,11 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, der 20% Glyzerin enthielt, suspendiert. Für die Differenzspektren wurde die microsomale Fraktion mit 0,14% Emulgen 913 (15 Minuten) solubilisiert, 60 Minuten lang bei 100.000 g zentrifugiert und der Überstand verwendet. Die Spektren wurden in einem Spektrophotometer Modell DW-2a der Aminco Instruments Company gemessen, wie von Omura, et al., J. Biol. Chem., 239: 2370–2378, 1964 beschrieben wurde.
  • Enzymassays: Arylkohlenwasserstoffhydroxylase-(aryl hydrocarbon hydroxylase, AHH) Aktivität wurde durch Messung der Fluoreszenz von aus Benzo(a)pyren gebildeten phenolischen Metaboliten bestimmt, Nebert, et al., J. biol. Chem., 234: 6242–6249, 1968. Das Reaktionsgemisch enthielt in 1,0 ml: 50 μmol Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 μmol MgCl2; 0,6 μmol NADPH; 100 nmol Benzo(a)pyren und 400 μg Zellhomogenisat. Die AHH-Aktivität wird als pmole Produkt äquivalent zu 3-OH-Benzo(a)pyren, das pro mg Protein pro Minute gebildet wird, angegeben. Die Acetanilidhydroxylaseaktivität wurde bestimmt durch Messen der Konversion von 14-C-Acetanilid in seine hydroxylierten Derivate. Die Substrate und ihre Metaboliten wurden durch Silikagel-Dünnschichtchromatographie (TLC) gemäß Standardverfahren aufgetrennt. Der Assay wurde in einem Endvolumen von 1,0 ml durchgeführt, das enthielt: 50 μmol Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 μmol MgCl2, 0,6 μmol NADPH, 2 μmol 14C-Acetanilid bei einer spezifischen Aktivität von 1,0 m Ci/m mol und 500 μg Gesamtzellhomogenisat. Die Enzymaktivität wird in picomol Produkt gebildet pro mg Protein/Minute aus angegeben. Ein Aliquot des Reaktionsprodukts in Methanol wurde auf 250 μ Dünnschicht-Silikagelplatte (Whatman) aufgetragen und mit 95% Chloroform + 5% Methanol eluiert. Die Rf-Werte für Acetanilid und 4-Hydroxy-Acetanilid unter diesen Bedingungen betrugen etwa 0,74 bzw. 0,2. Die Gelplatte wurde autoradiographiert und das Produkt durch Zählen der Radioaktivität nach Abkratzen von der Platte quantifiziert.
  • Konstruktion von Plasmiden und Virusrekombinanten: Konstruktion der chimären Gene, die die transkriptionsregulatorischen Signale und die RNA-Start-Stelle der Vacciniavirusgene enthalten, der Translationsstartstelle der kodierenden Sequenzen des Maus P1-450 und P3-450 und den Einbau dieser Sequenzen in den Wildtyp Vacciniavirus, um Rekombinanten zu bilden, sind in 1 als Diagramm dargestellt. Das Startplasmid in der Konstruktionssequenz der Bildung des rekombinanten Virus ist der Insertionsvektor pSC-11. Dieser Coexpressionsinsertions-Vektor enthält: Das Escherichi-coli-β-galactosidase-Gen unter der Kontrolle des Vacciniapromotors für 11-K-Protein, einen zweiten Promotor für 7,5-K-Protein für die Transkription von Kodierungssequenzen, eine einzelne Sma-1-Stelle stromabwärts des 7,5-K-Promotors für die Insertion fremder proteinkodierender Sequenzen und flankierende Vacciniavirus-TK-Sequenzen für die homologe Rekombination in infizierten Zellen (Mackett, et al., 1984, a. a. O. Eine vollständige (full-length) 2,6-Kb-cDNA für Cytochrom-P1-450 und eine vollständige (full-length) cDNA für Cytochrom P3-450 (Kimura, et al., 1984, a. a. O.) wurden modifiziert und in die einzige Sma-1-Stelle des Insertionsplasmids insertiert, um die Rekombinationsvektoren zu bilden, die die individuellen P1-450 und P3-450 enthalten. Selektion der Rekombinationsplasmide, die die P1-450 und P3-450-Inserts in korrekter Orientierung enthalten wurde durch Restriktionsenzymkartierung erreicht. Die zwei Rekombinationsplasmide wurden dann einzeln verwendet, um CV-1-Zellen zu transfizieren, die vorher mit WT-VV infiziert wurden. Homologe Rekombination zwischen Vaccinia-TK-Sequenzen in dem Rekombinationsplasmid und dem Virusgenom führten zur Insertion der P450 und der β-Galaktosidase-Sequenzen in den Vacciniavirus. Die Virusnachkommen wurden dann auf TK–-Zellen in Gegenwart von BrdUrd Plaque-getestet um TK–-Virus zu selektieren und mit Agar überlegt, das X-gal enthielt (chromogenes Substrat für β-Galaktosidase), um β-gal+-Virus zu selektieren. Die Gegenwart der P1-450 und P3-450-Inserts in den TK–- und β-gal+-Rekombinanten wurde mittels Dot-Blot-Hybridisierung bestätigt (Mackett, et al., Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A, 79: 7415–7419, 1982). Nach zwei sequenziellen Plaquereinigungen wurden die rekombinanten Virusstocks als VV-P1 bzw. W-P3 bezeichnet.
  • Der rekombinante Vacciniavirus, der die gesamte Kodierungssequenz für das P1-450 und P3-450 enthält, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland unter den Hinterlegungsnummern VR-2168 bzw. VR-2169 hinterlegt. Die BEAS-2B-Zelllinie wurde ebenfalls als CRL 9609 hinterlegt. Die Hinterlegungen werden lebensfähig gehalten, ersetzt wenn sie unlebensfähig werden, und zwar für einen Zeitraum von 30 Jahren ab dem Datum der Hinterlegung oder für 5 Jahre von dem letzten Datum eines Antrags auf eine Probe der Hinterlegung, je nachdem, welcher Zeitraum länger ist, und der Öffentlichkeit ohne Einschränkung entsprechend den gesetzlichen Bestimmungen zugänglich gemacht. Der Commissioner of Patents and Trademarks wird auf Anfrage zu der Hinterlegung Zugang haben.
  • Analyse der P1-450 und P3-450-Proteine in mit VV-P1 und W-P3-infizierten Zellen: Lysate von menschlichen und Mauszellen, die mit jedem der rekombinanten Viren infiziert waren, wurden auf NaDodSO4-Polyacrylamidgelen elektrophoresiert und mittels Immunoblotting analysiert (2a). Sowohl menschliche WI-38 Zellen als auch Maus NIH 3T3 Zellen, die mit dem rekombinanten Virus W-P1 infiziert waren, zeigten eine Peptidbande, die mit P1-450 von Mauslebermicrosomen bei Mr ≈ 55.000 cochromatographiert. Diese selben mit dem rekombinanten Virus VV-P3 infizierten Zellen zeigten eine geringfügig schneller wandernde Proteinbande, die mit P3-450 von Mauslebermicrosomen bei Mr ≈ 54.000 cochromatographiert. In Lysaten von nichtinfizierten Kontrollzellen oder mit WT-W infizierten Zellen wurden weder die P1-450 noch die P3-450-Banden nachgewiesen. Der Zeitverlauf der Synthese von P1-450 und P3-450 in virusinfizierten 3T3-Zellen ist in den Immunoblots in 2B gezeigt. Cytochrom P1-450 und P3-450 wurde bereits zwei Stunden nach Infektion nachgewiesen und die Menge des Expressionsprodukts nahm während des folgenden 15-Stundenzeitintervalls zu. Basierend auf den relativen Intensitäten der Proteinbanden von P1-450 und P3-450, die in infizierten menschlichen und Mauszellen gefunden wurden, und dem P450-Gehalt der Mauslebermicrosomen, wird geschätzt, dass der spezifische Gehalt im Bereich von etwa 15–90 pmol pro mg infizierten Zelllysats liegt. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die infektiösen Vacciniavirusrekombinanten die Synthese von Cytochrom P1-450 und P3-450 steuerten. Die gebildeten Polypeptidprodukte waren von den aktiven P1-450 und P3-450 der Mausmicrosomen nicht unterscheidbar. Die Synthese der P1-450 und P3-450-Polypeptide in korrekter Größe zeigt, dass keine Fusionspolypeptide gebildet wurden, noch inkorrekte Leserahmen exprimiert wurden. Der Nachweis der P450-Expressionsprodukte zu einem frühen Zeitpunkt nach der Infektion ist mit der Verwendung von frühem Vacciniapromotor konsistent.
  • Subzellulare Lokalisation der neu synthetisierten P1-450 und P3-450:
  • Native zelluläre P450-Apoproteine bilden mit Häm normalerweise einen Komplex unter Bildung von Hämoproteinen, die nachfolgend zu microsomalen Membranen transportiert werden. Es musste daher bestimmt werden, ob die neu exprimierten P1-450 und P3-450 in gleicher Weise zu den Microsomen in der Zelle transportiert werden. Die Verteilung von P1-450 und P3-450-Polypeptiden in verschiedenen subzellularen Fraktionen von VV-P1 und VV-P3-infizierten Zellen wurde folglich mittels Immunoblot bestimmt. Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die neu exprimierten Cytochrom-P450 in der microsomalen Fraktion konzentriert waren (100.000 g Pellet). Es wurden entweder keine oder vernachlässigbare Mengen in dem 100.000 g Überstand nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Cytochrom P450, die durch rekombinante Vacciniaviren W-P1 und VV-P3 synthetisiert wurden, zu den microsomalen Membranen translortert werden. Ein Vergleich der relativen Bandenintensitäten und infizierten Zelllysate und Microsomen zeigt eine zehnfache Anreicherung der exprimierten P450 in der microsomalen Fraktion.
  • Spektrale Charakterisierung von Cytochromen P1-450 und P3-450: Ein charakteristisches Merkmal der microsomalen Cytochrom P450-Hämoproteine ist, dass die nativen katalytisch aktiven Formen Absorptionsmaxima des reduzierten CO-Komplexes bei 450 nm zeigen und die denaturierten katalytisch inaktiven Formen Absorptionsmaxima um 420 nm zeigen. Eine Untersuchung der microsomalen Fraktion mit VV-P1-infizierten NIH 3T3-Zellen zeigte ein Absorptionsmaximum des reduzierten CO-Komplexes bei 450 nm, was zeigte, dass die neu exprimierten Cytochrom P1-450 in Microsomen in nativer Konfiguration vorliegt (4). Die microsomale Fraktion von mit W-P3 infizierten Zellen zeigte ebenfalls einen 450 nm Peak, der für natives P450 charakteristisch ist. Der spezifische Gehalt von Cytochrom P1-450 betrug 0,028 ng pro mg und der von P3-450 betrug 0,033 ng pro mg der mit Detergens solubilisierten microsomalen Fraktion. Diese Ergebnisse zeigen, dass die in virusinfizierten Zellen synthetisierten Cytochrom P1-450 und P3-450-Proteine eine Hämgruppe enthalten und in die microsomale Fraktion transportiert und abgesondert werden, und zwar auf eine Weise, die von den nativen in vivo erzeugten zellulären P450 ununterscheidbar ist.
  • Enzymaktivität der P450 in VV-P1 und W-P3-infizierten Zellen: Die AHH-Aktivität in Lysaten von mit W-P1-infizierten 3T3-Zellen zeigt (5) nachweisbare Enzymaktivität bereits eine Stunde nach Infektion und eine Zunahme der Enzymaktivität noch 12 Stunden danach. Die Lysate von mit W-P3-infizierten Zellen zeigten jedoch lediglich einen kleinen Bruchteil der Aktivität verglichen mit derjenigen von W-P1 selbst 12 Stunden nach Infektion. Es wurde keine nachweisbare Aktivität in nichtinfizierten Kontrollzellen oder in WT-W-infizierten Zellen gefunden. Die AHH-Aktivität wurde durch Antiseren gegen P450c und P450d vollständig inhibiert (Daten nicht angegeben). Die spezifische AHN-Aktivität in verschiedenen Präparationen variierte im Bereich von etwa 10–70 p mol pro mg Zelllysat. Die ANH-Aktivität war mindestens 30mal größer bei P1-450 als bei P3-450.
  • Lysate von 3T3-Zellen, die für verschiedene Zeitintervalle mit VV-P1 und VV-P3 infiziert wurden, wurden auf Acetanilidhydroxylase-Aktivität getestet und die Autoradiogramme der TLC-Analyse der gebildeten Produkte ist in 6 dargestellt. Lysate von mit VV-P3 infizierten Zellen zeigten zusätzlich zu der intensiven Substratbande (Rf-Wert von 0,74) eine sich langsam bewegende Bande (Rf-Wert von 0,2), der die TLC-Wanderungsposition der hydroxylierten Produkte von Acetanilid angab. Die Bildung von hydroxylierten Metaboliten nahm mit der Zeit zu. In mit VV-P1 infizierten Zellen gab es jedoch keine nachweisbare Bande bei einem Rf-Wert von 0,2. In den nichtinfizierten Kontrollzellen oder in mit WT-VV infizierten Zellen war keine Aktivität nachweisbar. Eine kleine Bande bei einem Rf-Wert von 0,12 wurde in mit VV-P1 infizierten Hepa 1-Zellen nach einer verlängerten Exposition nachgewiesen (Ergebnis nicht gezeigt). Die spezifische Acetani lidhydroxylase-Aktivität betrug etwa 45 pmol mg Zelllysat. Die Acetanilidhydroxylase-Aktivität war mindestens 20mal größer mit P3-450 als mit P1-450.
  • Die Zusammenstellung des Holoenzyms und Expression der Enzymaktivität ohne die Notwendigkeit einer Zugabe irgendeines Coenzyms oder Cofaktors und dergleichen von außen zeigt deutlich, dass die P1-450 und P3-450-Proteine, die durch mit rekombinanten virusinfizierten Zellen kodiert werden, als ein vollständiges katalytisch aktives Molekül synthetisiert werden. Im Gegensatz dazu ist anzumerken, dass P450-Cytochrome, die mit herkömmlichen Mitteln hergestellt werden, keine Enzymaktivität zeigen, wenn nicht NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase und andere Zellfraktionen von außen zugefügt werden (Goldstein, et al., J. Biol. Chem., 257: 2702, 1982; Guengerich, et al., Biochem., 21: 6019–6030, 1982, Negishi, et al., J. Biol. Chem., 254: 11015–11023, 1979). Darüber hinaus weist das erfindungsgemäße Cytochrom P1-450 eine 30–40mal höhere AHN-Aktivität auf als P3-450 und Cytochrom P3-450 zeigte ein 20mal höher Acetanilidhydroxylase-Aktivität als P1-450, ein charakteristisches und unterscheidungskräftiges Merkmal dieser beiden Enzyme. Mit rekombinanten Viren infizierte Zellen exprimierten 107–108 Moleküle der neu synthetisierten Moleküle pro Zelle und dies stellt 0,1– 1,0% der gesamten Zellproteine dar.
  • Die Verfügbarkeit von funktionell intaktem reinem P1-450 und P3-450-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung macht es nun zum ersten Mal möglich, den Metabolismus, die Entgiftung, Mutagenese oder Aktivierung von xenobiotischen und endobiotischen Substanzen in vitro zu testen. Die Verfügbarkeit eines solchen reinen enzymatischen Systems erleichtert das Testen und die Entwicklung neuer Arzneistoffe, das Testen karzinogener Metabolismen, chemischer Umweltmutagene und dergleichen signifikant, ohne auf kostspielige und zeitaufwändige in vivo-Systeme zurückzugreifen. Darüber hinaus stellt das rekombinante Vacciniavirus-Expressionssystem der vorliegenden Erfindung eine einfaches, effizientes und ökonomisches Verfahren zur Herstellung großer Mengen reiner katalytisch aktiver Cytochrom P450-Enzyme bereit, was bislang nicht möglich war. Um reine P1-450 oder P3-450-Enzyme zu erhalten, werden Säuger oder andere geeignete Zellen einfach mit erfindungsgemäßem rekombinanten Vacciniavirus infiziert und die infizierten Zellen werden direkt als Quelle für P1-450 oder P3-450-Enzym verwendet, die als Ergebnis der Infektion synthetisiert werden. Alternativ kann die microsomale oder endoplasmische Retikulumfraktion der transfizierten Zellen abgetrennt werden und als eine Quelle für das reine Enzym verwendet werden.

Claims (10)

  1. Nicht-tumorigene humane Bronchial-Epithel-Zelllinie, die ein exogenes Cytochrom P450-Gen enthält, das in der Zelllinie exprimiert werden kann.
  2. Zelllinie nach Anspruch 1, wobei das Cytochrom P450-Gen IA1, IA2, IIC9, IID6, IIE1 und/oder IIIA4 ist.
  3. Zelllinie nach Anspruch 2, die eine BEAS-2B-Zelllinie (ATCC CRL 9609) ist, die ein exogenes Cytochrom P450 IA2-Gen enthält.
  4. Zelllinie nach Anspruch 1, wobei die Zelllinie vor der Cytochromgen-Insertion BEAS-2B-Zelllinie ist, die als ATCC CRL 9609 hinterlegt ist.
  5. Verfahren zum Identifizieren oder Testen der Mutagenizität, Cytotoxizität oder Karzinogenizität eines Agens, umfassend die Schritte: a) Umsetzen, Kultivieren oder In-Kontakt-Bringen der Zelllinie von Anspruch 1 mit einem Agens, von dem angenommen wird, dass es mutagen, cytotoxisch oder karzinogen ist; b) Bestimmen oder Aufzeichnen jener Wirkungen auf die Zelllinie, die auf Mutagenizität, Cytotoxizität oder Karzinogenizität hinweisen.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelllinie BEAS-2B (ATCC CRL 9609) ist, die ein exogenes Cytochrom P450 IA2-Gen enthält.
  7. Verfahren zum Identifizieren oder Testen der chemotherapeutischen Aktivität eines Agens, umfassend die Schritte: a) Umsetzen, Kultivieren oder In-Kontakt-Bringen der Zelllinie von Anspruch 1 mit einem Agens, von dem angenommen wird, dass es ein Chemotherapeutikum ist, in Gegenwart eines Karzinogens; und b) Bestimmen oder Aufzeichnen jener Wirkungen auf die Zelllinie, die auf eine chemotherapeutische Aktivität hinweisen.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Agens vor der Zugabe des Karzinogens mit der Zelllinie umgesetzt, kultiviert oder in Kontakt gebracht wird.
  9. Verfahren zum Bestimmen der Metaboliten, die durch ein Karzinogen oder Xenobiotikum aktiviert werden, umfassend die Schritte: a) Umsetzen, Kultivieren oder In-Kontakt-Bringen der Zelllinie von Anspruch 1 mit dem angenommenen Karzinogen oder Xenobiotikum; und b) Identifizieren der Metaboliten und/oder ihrer Wirkungen.
  10. Diagnostischer Kit, der die Zelllinie von Anspruch 1 umfasst.
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