WO1995014232A1 - Verfahren zur markierung von zellen, mit diesem verfahren markierte zellen, verwendung des wildtyp-adeno-assoziierten virus zur markierung von zellen und testkits zum nachweis des wildtyp-adeno-assoziierten virus in zellen - Google Patents

Verfahren zur markierung von zellen, mit diesem verfahren markierte zellen, verwendung des wildtyp-adeno-assoziierten virus zur markierung von zellen und testkits zum nachweis des wildtyp-adeno-assoziierten virus in zellen Download PDF

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WO1995014232A1
WO1995014232A1 PCT/EP1994/003727 EP9403727W WO9514232A1 WO 1995014232 A1 WO1995014232 A1 WO 1995014232A1 EP 9403727 W EP9403727 W EP 9403727W WO 9514232 A1 WO9514232 A1 WO 9514232A1
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cells
wild
associated virus
type adeno
adeno
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PCT/EP1994/003727
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Roland Mertelsmann
Lothar Kanz
Hendrik Veelken
Reinhard Henschler
Wolfram Brugger
Jean Rommelaere
Jürgen KLEINSCHMIDT
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KLINIKUM DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITäT FREIBURG
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Definitions

  • the present invention relates to a method for labeling cells, in which the cells are genetically labeled by infecting these cells with a virus which is integrated into the DNA of the cells to be labeled.
  • the JP 57156-422 extract from Teijin KK relates to the identification of viral serotypes by infection of virus-sensitive cells, for example human fetal lung or kidney cells with DNA viruses such as the adenovirus or herpes virus, cultivation, extraction and treatment by means of a restriction enzyme.
  • a corresponding cell and a corresponding test kit for the detection of such a virus in cells cannot be found in this document.
  • EP-A-0366448 according to claims 1, 3 and 9 relates to a detection or identification method for a nucleic acid-containing unit, preferably a virus such as a parvovirus or an adenovirus, by means of affinity separation of this unit from the surrounding medium, preferably by means of antibodies and detection of the Unit using amplification of the nucleic acid sequence, preferably the polymerase chain reaction.
  • This document further claims a detection / test kit for such a nucleic acid-containing unit, containing a means for affinity separation of this unit from the surrounding medium and a means for amplifying the nucleic acid sequences, which is characteristic of this unit (claim 11).
  • the description of this document relates exclusively to such a detection method for the hepatitis B virus. This publication therefore does not contain a test kit for detecting the wild-type adeno-associated virus in cells. A corresponding labeling method for cells and the labeled cell obtained in this way cannot be found in this document.
  • WO 92/01070 relates to a method for assessing the mutagenicity of a putative genotoxic agent 1. infection of the cell culture, preferably human cell culture, with a virus which contains an amber-colored mutation in its genome, this preferably being a genetically manipulated AAV plasmid,
  • step 3 Assessment of the cell culture obtained according to step 2 to determine the extent of virus regression in the wild-type or pseudowild-type cell culture by identifying and quantifying the virus DNA or the virus protein which has been produced by the regressed virus
  • the so-called adeno-associated virus is used for the genetic labeling of the cells to be labeled.
  • wild-type virus strains are used, i.e. these virus strains are not genetically manipulated by changing the virus.
  • the adeno-associated virus is a
  • DNA-type virus which normally requires co-infection with a second virus to cause infection.
  • the adeno-associated virus becomes the defective
  • Adenovirus or the herpes ⁇ implex virus which allow an efficient replication of the adeno-associated virus in vitro.
  • the adeno-associated virus is a human virus, its host range is unusually broad for lytic growth. Probably everyone
  • Eäugerz ⁇ lle which has been tested so far, including Human cells, rabbit cells, bovine cells or rodent cell lines can be infected with the adeno-associated virus (hereinafter AAV for short), provided that a suitable helper virus is used.
  • AAV adeno-associated virus
  • the helper viruses must of course match the host events. Despite the broad host range, the AAV does not observe any disease in either humans or animals.
  • the hematopoietic progenitor cells are not infected by the AAV in vivo in up to about 98% of the population. If such cells are infected with AAV in vitro, then this virus stably integrates into the chromosome of the cells and these cells are then marked by the content of the AAV genome in the genome of the marked cells.
  • the fate of the marked cells can be followed up. Since the AAV integrates into the chromosome of the marked cells, it is also multiplied when the cells multiply and the clones developing from the marked cells can be recognized from the marking. This is particularly advantageous in research work, since the further fate of the labeled cells and the descendants derived from them can be followed.
  • An advantage of the method according to the invention is that only wild-type adeno-associated viruses are used which are recognized to be apathogenic. An integration of the AAV into the host genome therefore means that no diseases or other disadvantages for the recipient organism can be expected.
  • Another advantage of the wild-type adeno-associated virus used according to the invention is that the virus can integrate into the host genome, but can no longer be mobilized from there. This means that the virus does not reproduce on its own and then infects other cells, which could lead to a falsification of the test results.
  • Another advantage of the method according to the invention is that the wild-type adeno-associated viruses are not genetically modified or need to be modified and that there are therefore no complications with the genetic engineering law to be feared.
  • the method according to the invention can in principle
  • Mammals and humans are used, the use of the method according to the invention in humans, in particular in clinical research and in
  • the method according to the invention can be used well in animal models.
  • the method according to the invention can be used, for example, in patients who are not infected with the corresponding subtype of the adeno-associated viruses. If an infection is present in an adeno-associated virus strain, another wild-type strain can be used in the method according to the invention, but care must be taken to ensure that there are sufficient differences in the nucleotide sequences so that a distinction is made between the wild-type strain used for labeling and the strain of the adeno-associated virus with which the patients to be examined are infected. It has been found that the marking method according to the invention is particularly suitable if it is used for marking mobilized blood stem cells.
  • peripheral blood stem cells can be mobilized by chemotherapy and subsequent treatment with various growth factors, for example interleukins, SCF, EPO, and expanded ex vivo.
  • various growth factors for example interleukins, SCF, EPO, and expanded ex vivo.
  • This method is, for example, the subject of DE-P 42 406 35.8, which goes back to the elderly, and is described in the publication by Brugger et al., Blood, 1993, Vol. 81, p of peripheral blood cells from blood, the accumulation of peripheral blood precursor cells, which express the CD34 antigen, before treatment with growth factors.
  • the blood stem cells with the W-ildtyp adeno-associated virus may be transduced.
  • the transduction of the blood stem cells to be infected takes place in cell culture medium, preferably in Iscove's Modified Dulbecco's medium, and the cell culture medium is preferably supplemented with autologous patient plasma.
  • the cell culture medium furthermore preferably contains growth factors, with the recombinantly produced growth factors interleukin-1, interleukin-3, interleukin-6, erythropoietin and stem cell factor being preferred.
  • the concentrations of the individual growth factors are 50 to 200 ng / ml, preferably 100 ng / ml.
  • the medium with cells and viruses is incubated at 37 ° C for six hours.
  • the AAV is in a virus stock of packaged AAV particles that were produced in cell cultures.
  • the AAV position is carried out according to generally known methods. These particles are able to infect the cells once. Since the wild-type viruses do not have the genetic information to mobilize the viruses, further infection of the labeled cells after the transduction step is no longer possible.
  • detection methods must be made available which provide information as to whether the cell to be examined was infected with adeno-associated virus or not before the infection. It is also necessary for the evaluation that after the cells have been marked, the marked cells can be distinguished from the unmarked cells.
  • PCR polymerase chain reaction
  • suitable oligonucleotides must be synthesized, which serve as primers for the PCR reaction.
  • the sequence of the oligonucleotide sequences can be determined on the basis of the nucleotide sequence disclosed in the Journal of Virology (1983, Vol. 45, pp. 555-564). Usually, one will select those oligonucleotide sequences which are located at the ends of the genomic sequence of the AAV to carry out the PCR reaction.
  • the DNA is therefore isolated from the labeled cells according to the invention, electrophoretically separated in an agarose gel and the DNA is denatured by alkali treatment of the gel and subsequent neutralization of the gel in saline. Now the DNA is transferred to nitrocellulose or nylon filters and bound to the filter. This sensation is then stabilized by heat (baking) or UV radiation. After prehybridization to saturate unspecific bindings and subsequent washing, the filters are hybridized with a labeled DNA probe.
  • the DNA probes can be radiolabelled or carry other labels. Suitable regions for the labeled DNA probes are selected from the known DNA sequence and are preferably produced synthetically. These DNA probes then hybridize with the AAV genome, provided that this has been integrated into the labeled cell. If no hybridization signal is obtained, the cell is not labeled.
  • the detection of the cells labeled with AAV can be demonstrated by the mature peripheral blood cells of different cell lines formed by these stem cells when the graft was successfully started.
  • the staining of individual cells fixed on specimen slides takes place simultaneously, on the one hand by means of "Fluorescent In Situ Hybridization” (FISH) for parts of the genome of AAV and on the other hand using colored antibodies for cell-specific surface markers.
  • FISH Fluorescent In Situ Hybridization
  • the examining cells can be identified on the one hand with the help of the antibodies for the cell-specific surface markers and on the other hand it can be determined by the fluorescence in situ hybridization whether these cells are labeled or not.
  • the present invention also relates to cells which are labeled with wild-type adeno-associated virus, it being possible for these cells to be obtained using the method according to the invention.
  • these cells are human peripheral blood scraping cells which carry the label with wild-type adeno-associated virus.
  • the present invention also relates to test kits which are suitable for detecting the adeno-associated virus in cells.
  • test kits have nucleotide sequences that are complementary to the DNA sequence of wild-type adeno-associated virus.
  • These test kits can be compilations which are suitable for carrying out the polymerase chain reaction which is known per se and which, as primers, have oligonucleotide sequences which are specific for AAV. The polymerase chain reaction can then be used to determine whether AAV is in the cells to be examined or not.
  • test kit can relate to a set that is suitable for in situ hybridization.
  • An essential component of this composition is then a labeled DNA sequence which is complementary to the sequence of AAV.
  • test kits according to the invention can be a compilation which is suitable for carrying out the known Southern blot.
  • This compilation contains a DNA sequence that is complementary to the DNA sequence of AAV.
  • the test kit has the reagents that are necessary for fluorescent in situ hybridization for parts of the genome of AAV on the one hand and for antibodies on the other hand marked with color for cell line-specific surface markers.
  • compilations have those components that are required to carry out the respective test procedure, such as buffers, enzymes, etc.
  • the wild-type adeno-associated virus simultaneously vector and marker in one i ⁇ t. This saves the step of cloning the marker into the vector.
  • the wild-type adeno-associated virus used according to the invention has been shown to be apathogenic. It is also advantageous that the wild-type adeno-associated virus specifically integrates into chromosome 19 at a known location and that there is therefore no "random" mutagenesis or that the wild-type adeno-associated virus does not develop any tumor potential, such as that is the case with retroviruses, for example. It is also advantageous that the AAV is independent of the cell cycle and integrated into the cells to be labeled with very high efficiency. Since the cells to be labeled do not have to be exposed to any treatment steps which can impair the metabolism, such as radiation, for example, the cells are not impaired in their ability to perform and to live.
  • example 1 The present invention is illustrated by the examples.
  • example 1 The present invention is illustrated by the examples.
  • PBSC peripheral blood stem cells
  • peripheral blood stem cells By leukapheresis human CD 34 + -enriched peripheral blood stem cells were recovered. The desired cells were in a concentration of 1 x 10 6 and in a purity of 50%.
  • the PBSC cells were resuspended in 2 ml of prewarmed expansion medium.
  • the expansion medium was Iscove's Modified Dulbecco's medium, which was enriched with 2% autologous ACD plasma and 100 ng / ml each of the cytokines rhSCF, rhIL-1, rhIL-3, rhIL-6 and EPO.
  • the cells were treated with AAV wild-type virus stocks (obtained by incubating cell line 293 (ATCC) in tissue culture in the presence of adenovirus type 2 and subsequent transfection with AAV wild-type DNA) and at 37 for 2 hours Leave ° C in a water bath, gassing with 5% CO 2 in air. After an incubation period of one hour, the cells were shaken up. Finally, it was filled with 10 ml of expansion medium and then washed twice with expansion medium, the cells being centrifuged off at 800 g for five minutes. The pellet was resuspended and the cell number was determined. A cytospin was performed as a control. The cells are applied next to one another on glass slides, and they can be stained well.
  • AAV wild-type virus stocks obtained by incubating cell line 293 (ATCC) in tissue culture in the presence of adenovirus type 2 and subsequent transfection with AAV wild-type DNA
  • Long-term human allogeneic bone marrow cultures which have a confluent stroma and are 3-4 weeks old, are irradiated with 10 Gy C ⁇ -gamma in 10 ml culture bottles. The dose rate is 3-5 Gy / min. These cells are first rinsed twice with PBS and then inoculated with 5 ⁇ 10 4 cells of the infection preparation in long-term culture medium.
  • the long-term medium is Iscove's Modified Dulbecco's medium, which contains 10% FCS, 10% horse serum and 5 x 10 ⁇ 7 M hydrccortisone.
  • Half of the culture medium is replaced by new medium every week.
  • the cell number is determined from the supernatant and the number of colony-forming cells is determined in 0.9% methyl cellulose, 20% FCS, 100 ng / ml rhIL-3 and 100 ng / ml rhGM-CSF.
  • the cells of the supernatant are applied next to each other on glass slides, which ensures good staining (cytospin preps).
  • the virus integration is analyzed by Southern blot, the DNA being isolated from 5 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 6 cells. This DNA is digested with the restriction enzyme Bgl II and separated electrophoretically. A 1.8 kb fragment from the adeno-associated viru rep gene is used as the detection probe and can be excised with the restriction endonucleases Xbal and Xhol.
  • the cells are hybridized in situ on slides.

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Abstract

Offenbart wird ein Verfahren zur Markierung von Zellen, bei dem die zu markierenden Zellen mit Wildtyp-Adeno-assoziiertem Virus inkubiert werden und die Zellen dabei von dem Virus infiziert werden. Diese Markierung erlaubt eine Verfolgung des Schicksales der markierten Zellen im Organismus.

Description

Verfahren zur Markierung von Zellen, mit diesem Verfahren markierte Zellen, Verwendung des
Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur Markierung von Zellen und Testkits zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus in Zellen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Markierung von Zellen, bei dem die Zellen genetisch dadurch markiert werden, daß diese Zellen mit einem Virus infiziert werden, das in die DNA der zu markierenden Zellen integriert wird.
Das Abεtract JP 57156-422 der Teijin KK betrifft die Identifizierung von viralen Serotypen durch Infizierung von virussensitiven Zellen, beispielsweise menschlichen fötalen Lungen- oder Nierenzellen mit DNA-Viren, wie dem Adenovirus oder Herpesvirus, Kultivation, Extraktion und Behandlung mittels eines Restriktionsenzyms. Ein Zeilmarkierungsverfahren mit dem zur Familie der DNA-Viren gehörenden Dependovirus oder defekten Parvovirus (Adeno-assoziierte Virus = AAV) ist diesem Abstract nicht zu entnehmen. Auch eine entsprechende Zelle sowie ein entsprechender Testkit zum Nachweis eines derartigen Virus in Zellen ist dieser Druckschrift nicht zu entnehmen.
Chemical Abstracts 95: 40251a (1981) (Basic Res.Clin.Med. 1981, 255 bis 263) beschreibt die Virusinfektion von menschlichen Zellen durch das adeno-assoziierte Virus.
Die EP-A-0366448 betrifft gemäß Ansprüchen 1, 3 und 9 ein Nachweis- oder Identifizierungsverfahren für eine Nukleinsäure enthaltende Einheit, vorzugsweise ein Virus wie beispielsweise einen Parvovirus oder einen Adenovirus, mittels Affinitätsabtrennung dieser Einheit vom umgebenden Medium, vorzugsweise mittels Antikörpern und Nachweis der Einheit unter Verwendung einer Amplifikation der Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise der Polymerase-Kettenreaktion. Weiter beansprucht diese Druckschrift ein Nachweis-/Testkit für eine derartige Nukleinsäure enthaltende Einheit, enthaltend ein Mittel zur Affinitätsabtrennung dieser Einheit vom umgebenden Medium und ein Mittel zur Verstärkung der Nukleinsäuresequenzen, welches charakteristisch für diese Einheit ist (Anspruch 11). Die Beschreibung diese Druckschrift bezieht sich ausschließlich auf ein derartiges Detektionsverfahren für das Hepatitis-B-Virus. Dieser Druckschrift ist daher kein Testkit zum Nachweis des Wildtyp-adeno-assoziierten Virus in Zellen zu entnehmen. Auch ein entsprechendes Markierungsverfahren von Zellen sowie die hierbei erhaltene markierte Zelle ist dieser Druckschrift nicht zu entnehmen.
Die WO 92/01070 betrifft ein Verfahren zur Beurteilung der Mutagenität eines vermeintlich gentoxischen Mittels durch 1. Infektion der Zellkultur, vorzugsweise humaner Zellkultur mit einem Virus, der in seinem Genom eine bernsteinfarbene Mutation enthält, wobei dies vorzugsweise ein genetisch manipuliertes AAV-Plasmid ist,
2. Umsetzung der gemäß Schritt 1 erhaltenen infizierten Zellkultur mit einem vermeintlich gentoxischen Mittel und
3. Beurteilung der gemäß Schritt 2 erhaltenen Zellkultur zur Bestimmung des Ausmaßes der Virusrückbildung in den Wildtyp oder Pseudowildtyp-Zellkultur durch Identifikation und quantitative Bestimmung der Virus-DNA oder des Virusproteins, welches durch das zurückgebildete Virus erzeugt worden ist (Anspruch
1). Im Gegensatz dazu wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kein genetisch manipuliertes AAV-Plasmid, sondern nur ein adeno-assoziiertes Virus vom Wildtyp, d. h. ein nicht genetisch manipuliertes Virus eingesetzt. Dieses Virus ist nur zu einer einmaligen Infektion in vitro in der Lage und ist (dann) apathogen, so daß eine Rückführung in den Organismus überhaupt möglich ist. Im Gegensatz dazu ist dies bei dem Verfahren der vorstehenden Druckschrift nicht beabsichtigt und führt aufgrund des mutagenen Mittels und des genetisch veränderten AAV-Plasmids, das offenbar nicht apathogen ist, höchstwahrscheinlich zu einer Schädigung in vivo. Der vorstehenden Druckschrift ist weiterhin keine Zelle, insbesondere eine periphere Blutzelle, zu entnehmen, die mit dem Wildtyp adeno-assoziierten Virus markiert ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Zellen ex vivo markiert werden und es wird hierdurch ermöglicht, das weitere Schicksal dieser Zellen, insbesondere nach Rückführung der Zellen in den Spenάerorganismus zu verfolgen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur genetischen Markierung der zu markierenden Zellen das sogenannte Adeno- asεoziierte Virus eingesetzt. In besonders bevorzugter Weise werden Virusstämme vom Wildtyp eingesetzt, d.h. diese Virusstämme werden nicht genetisch manipuliert durch Veränderung des Virus.
Das Adeno-assoziierte Virus ist bereits bekannt. In der Veröffentlichung von Srivastava et al., Journal of Virology,
Februar 19S3, Vol. 45, S. 555-564, wird die Nukleotiάseαuenz und die Organisation des Adeno-assozierten Virus-2 Genoms als Beispiel für ein AAV vom Wildtyp offenbart. Auf die in dieser Veröffentlichung offenbarte Nukleotidsequenz wird ausdrücklich Bezug genommen und die Sequenz zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht. Insbesondere wird auf die Abschnitte "Mate¬ rials and Methods" sowie "Results" Bezug genommen in Verbindung mit den Fig. 1 bis 4.
Bei dem Adeno-assoziierten Virus handelt es sich um ein
Virus vom DNA-Typ, das normalerweise eine Co-Infektion mit einem zweiten Virus benötigt, um eine Infektion zu erzielen.
Deshalb wird das Adeno-aεsσziierte Virus zu den defekten
Parvoviren gerechnet. Als Helferviren fungieren das
Adenovirus oder das Herpes-Ξimplex-Virus, die eine effiziente Replikation des Adeno-assoziierten Virus in vitro ermöglichen. Obwohl es sich bei dem Adeno-assoziierten Virus um ein menschliches Virus handelt, ist dessen Wirtsbsreich für das lytische Wachstum unüblich breit. Vermutlich jede
Eäugerzεlle, die bisher getestet wurde, einschließlich menschliche Zellen, Kaninchenzellen, Rinderzellen oder Nagerzellinien können mit dem Adeno-assoziierten Virus (im folgenden kurz AAV) infiziert werden, vorausgesetzt ein geeignetes Helfervirus wird verwendet. Die Helferviren müssen natürlich zu den Wirtszεllen passen. Trotz des weiten Wirtsbereichs wird durch das AAV weder bei Menschen noch bei Tieren eine Erkrankung beobachtet.
Obwohl ein bestimmter Prozentsatz der menschlichen Bevölkerung mit AAV infiziert ist, deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, daß das AAV nur in bestimmte Zellen integrieren kann. Bekannt ist, daß sich das AAV in das Chromosom 19 der Epithelzellen des Respirationstraktes integrieren kann. Bei anderen Zellen wurde nur in äußerst geringen Prozentsätzen (unter 2 %) eine natürliche Integration des AAV-Virus beobachtet. Diese Erkenntnis ermöglicht die Verwendung von AAV als genetischen Marker, da eine Infektion von anderen als den natürlicherweise befallenen Zellen nur dadurch erzielt werden kann, daß in vitro gezielt eine Infektion durchgeführt wird.
Insbesondere die hämatopoetischen Vorläuferzellen werden durch das AAV in vivo bei bis zu etwa 98 % der Bevölkerung nicht infiziert. Wenn also derartige Zellen in vitro mit AAV infiziert werden, dann integriert dieses Virus stabil in das Chromosom der Zellen und diese Zellen sind dann markiert durch den Gehalt des AAV-Genoms im Genom der markierten Zellen.
Mit Hilfe dieser genetischen Markierung kann das Schicksal der markierten Zellen weiterverfolgt werden. Da sich das AAV in das Chromosom der markierten Zellen integriert, wird es auch bei der Vermehrung der Zellen mit vermehrt und die sich aus den markierten Zellen entwickelnden Klone können anhand der Markierung erkannt werden. Dies ist besonders vorteilhaft bei der Forschungsarbeit, da das weitere Schicksal der markierten Zellen und der daraus abgeleiteten Nachfahren verfolgt werden kann. Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß lediglich Wildtyp-Adeno-assoziierte Viren verwendet werden, die anerkanntermaßen apathogen sind. Eine Integration des AAV in das Wirtsgenom läßt also keine Krankheiten oder sonstigen Nachteile für den Empfängerorganismus erwarten.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäß verwendeten Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus ist, daß sich das Virus zwar ins Wirtsgenom integrieren kann, aber von dort nicht mehr mobilisiert werden kann. Das heißt, das Virus vermehrt sich nicht selbständig und infiziert dann andere Zellen, was zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen könnte.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Wildtyp-Adeno-assoziierten Viren gentechnisch nicht verändert sind oder verändert werden müssen und, daß daher keine Komplikationen mit dem Gentechnikgesetz zu befürchten sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich bei
Säugern und bei Menschen eingesetzt werden, wobei die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beim Menschen, insbesondere bei der klinischen Forschung und bei der
Therapie bevorzugt ist. Auch bei der Forschung mit
Tiermodellen läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren gut einsetzen.
Angewendet werden kann das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweisε bei Patienten, die nicht mit dem entsprechenden Subtyp der Adeno-assoziierten Viren infiziert sind. Sofern eine Infektion in einem Adeno-assoziierten Virusstamm vorliegt, kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein anderεr Wildtyp-Stamm verwendet werden, wobei jedoch darauf zu achten ist, daß ausreichende Unterschiede in den Nukleotidsequenzen vorliegen, so daß eine Unterscheidung zwischen dem zur Markierung eingesetzten Wildtypstamm und dem Stamm des Adeno-assoziierten Virus möglich ist, mit dem die zu untersuchenden Patienten infiziert sind. Es hat sich herausgestellt, daß das erfindungsge äße Markierungsverfahren besonders geeignet ist, wenn es zur Markierung von mobilisierten Blutstammzellen verwendet wird.
Insbesondere bei Tumorerkrankungen können periphere Blutstamm¬ zellen durch Chemotherapie und eine anschließende Behandlung mit verschiedenen Wachstumsfaktoren, beispielsweise Interleu- kinen, SCF, EPO, mobilisiert und ex vivo expandiert werden. Dieses Verfahren ist beispiels-weise Gegenstand der auf die An elderin zurückgehenden DE-P 42 406 35.8 sowie in der Publi¬ kation von Brugger et al., Blood, 1993, Vol. 81, S. 2579-2582 beschrieben und umfasst insbesondere die Isolierung von peri¬ pheren Blutzellen aus Blut, die Anreicherung von peripheren Blutvorläuferzellen, die das CD34 Antigen exprimieren, vor der Behandlung mit Wachstumsfaktoren.
Wenn also periphere Blutstammzellen ex vivo expandiert werden, können die hierbei gewonnenen Blutstammzellen mit dem Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus transduziert werden. Die Transduktion der zu infizierenden Blutstammzellen erfolgt in Zellkulturmedium, in bevorzugter Weise in Iscove's Modified Dulbecco's Medium, in bevorzugter Weise ist das Zellkulturmedium mit autologem Patientenplasma supplementiert. Weiterhin enthält das Zellkulturmedium in bevorzugter Weise Wachstumsfaktoren, wobei die rekombinant hergestellten Wachstumsfaktoren Interleukin-1, Interleukin- 3, Interleukin-6, Erythropoetin und Stammzellfaktor bevorzugt sind. Die Konzentrationen der einzelnen Wachstumsfaktoren liegen bei 50 bis 200 ng/ml, bevorzugt bei 100 ng/ml. Das Medium mit Zellen und Viren wird bei 37°C über sechs Stunden inkubiert. Das AAV liegt vor in einem Virusstock von verpackten AAV-Partikeln, die in Zellkulturen hergestellt wurden. Die He stellung von AAV erfolgt nach allgemein bekannten Verfahren. Diese Partikel sind zur einmaligen Infektion der Zellen in der Lage. Da die Wildtypviren die genetische Information zur Mobilisierung der Viren nicht besitzen, ist eine weitere Infektion der markierten Zellen nach dem Transduktionsschritt nicht mehr möglich. Um das erfindungsgemäße Verfahren auswerten zu können, müssen Nachweismethoden zur Verfügung gestellt werden, die Auskunft darüber geben, ob die zu untersuchende Zelle vor der Infektion mit Adeno-assoziiertem Virus infiziert war oder nicht. Weiterhin ist es zur Auswertung erforderlich, daß nach der Markierung der Zellen die markierten Zellen von den nicht markierten Zellen unterschieden werden können.
Eines der Nachweisverfahren ist die an sich wohlbekannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) . Zur Durchführung dieser PCR-Reaktion müssen geeignete Oligonukleotide synthetisiert werden, die als Primer für die PCR-Reaktion dienen. Die Sequenz der Oligonukleotidseσuenzen kann anhand der im Journal of Virology (1983, Vol. 45, S. 555-564) offenbarten Nukleotidsequenz festgelegt werden. Üblicherweise wird man zur Durchführung der PCR-Reaktion solche Oligonukleotidsequenzen auswählen, die an den Enden der Genomsequenz des AAV lokalisiert sind.
Eine andere Möglichkeit stellt die in εitu-Hybridisierung oder die Durchführung von Southern Blots dar. Eei den an sich bekannten Southern Blots (Southern-Analyse) werden elektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente auf spezielle Filter oder Membranen übertragen. Durch anschließende Hybridisierung mit homologen DNA-Sonden können Aussagen über Vorkommen, Kopiezahl, Größe und Nukleotidsequenz gemacht werden.
Zum Nachweis der Markierung von Zellen wird daher erfindungsgemäß die DNA aus den markierten Zellen isoliert, elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt und die DNA wird durch Alkalibehandlung des Gels und anschließende Neutralisierung des Gels in Salzlösung denaturiert. Nun wird die DNA auf Nitrozellulose oder Nylonfilter übertragen und an den Filter gebunden. Diese Eindung wird dann durch Hitze (Einbacken) oder UV-Bestrahlung stabilisiert. Nach Prähybridisierung zur Absättigung von unspezifischεn Bindungen und anschließendem Waschen werden die Filter mit einer markierten DNA-Sonde hybridisiert. Die DNA-Sonden können radioaktiv markiert sein oder auch andere Markierungen tragen. Für die markierten DNA-Sonden werden aus der bekannten DNA-Sequenz geeignete Bereiche ausgewählt und in bevorzugter Weise synthetisch hergestellt. Diese DNA- Sonden hybridisieren dann mit dem AAV-Genom, sofern dieses in die markierte Zelle integriert wurde. Wenn kein Hybridisierungssignal erhalten wird, ist die Zelle nicht markiert.
Wenn die expandierten peripheren Blutstammzellen erfolgreich retransplantiert wurden, kann der Nachweis der mit AAV markierten Zellen durch die beim erfolgreichen Angang des Transplantats von diesen Stammzellen gebildeten reifen peripheren Blutzellen verschiedener Zellinien nachgewiesen werden. In bevorzugter Weise erfolgt die Anfärbung von auf Objektträgern fixierten Einzelzellen gleichzeitig, einerseits durch "Fluorescεnt In Situ Hybridization" (FISH) für Teile des Genoms von AAV und andererseits mit Hilfe gefärbter Antikörper für zellinienspezifische Oberflächenmarker. Auf diese Weise können einerseits die untersuchenden Zellen identifiziert werden mit Hilfe der Antikörper für die zellinienspezifiεchen Oberflächenmarker und andererseits kann durch die Fluoreεcεnt In Situ Hybridization festgestellt werden, ob diese Zellen markiert sind oder nicht markiert sind. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen, die mit Wildtyp-Adeno-asεoziiertem Virus markiert sind, wobei diese Zellen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden können. In besonders bevorzugter Form handelt es sich bei diesen Zellen um menschliche periphere Blutsrammzellen, die die Markierung mit Wildtyp-Adeno- assoziiertem Virus tragen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Testkits, die zum Nachweis des Adeno-assoziierten Virus in Zellen geεignet sind. Diese Testkits weisen Nukleotidsequenzen auf, die zu der DNA-Sequenz von Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus komplementär sind. Bei diesen Testkits kann es sich um Zusammenstellungen handeln, die zur Durchführung der an sich wohlbekannten Polymerase-Kettenreaktion geeignet sind und die als Primer Oligonukleotid-Sequenzen aufweisen, die spezifisch sind für AAV. Durch die Polymerase-Kettenreaktion kann dann nachgewiesen werden, ob sich AAV in den zu untersuchenden Zellen befindet oder nicht.
Ein weiteres Testkit kann eine Zusammenstellung betreffen, die zur in situ-Hybridisierung geeignet ist. Wesentlicher Bestandteil dieser Zusammensetzung ist dann eine markierte DNA-Sequenz, die zu der Sequenz von AAV komplementär ist.
Weiterhin kann es sich bei den erfindungsgemäßen Testkits um eine Zusammenstellung handeln, die zur Durchführung des an sich bekannten Southern Blots geeignet ist. Diese Zusammenstellung enthält eine DNA-Sequenz, die komplementär zur DNA-Sequenz von AAV ist. In einer besonders bevorzugten Auεführungsform weist das Testkit die Reagenzien auf, die einerseits zur Fluorescent In Situ Hybridization für Teile des Genoms von AAV erforderlich sind und andererseitε mit Farbe markierte Antikörper für zellinienspezifische Oberflächenmarker.
Darüber hinauε weisen die Zusammenstellungen diejenigen Komponenten auf, die zur Durchführung des jeweiligen Testverfahrens benötigt werden, wie Puffer, Enzyme etc.
Vorteilhaft bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus gleichzeitig Vektor und Marker in einem iεt. Man εpart εich also den Schritt der Klonierung des Markers in den Vektor. Außerdem ist das erfindungsgemäß verwendete Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus nachgewiesenermaßen apathogen. Vorteilhaft ist auch, daß sich das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus spezifisch an einer bekannten Steile in das Chromosom 19 integriert und, daß daher keine "Random"-Mutagenese erfolgt oder, daß das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus kein tumorgenes Potential entfaltet, wie das beispielsweise bei den Retroviren der Fall ist. Weiterhin ist vorteilhaft, daß das AAV zellzykluεunhabhängig ist und mit sehr hoher Effizienz in die zu markierenden Zellen integriert. Da die zu markierenden Zellen keinen Behandlungsschritten ausgesetzt werden müssen, die den Stoffwechsel beeinträchtigen können, wie beispielsweise Bestrahlung, sind die Zellen in ihrer eistungε- und Lebenεfähigkeit nicht beeinträchtigt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele näher erläutert. Beispiel 1
Infektion von peripheren Blutstammzellen (PBSC) mit Wildtyp- Adeno-assoziierte Virus
Durch Leukapherese wurden humane CD 34+-angereicherte periphere Blutstammzellen gewonnen. Die gewünschten Zellen lagen in einer Konzentration von 1 x 106 und in einer Reinheit von 50 % vor. Die PBSC-Zellen wurden in 2 ml vorgewärmtem Expansionsmedium resuspendiert. Bei dem Expansionsmedium handelte es sich um Iscove's Modified Dulbecco's Medium, das angereichert war mit 2 % autologem ACD-Plasma und je 100 ng/ml der Zytokine rhSCF, rhIL-1, rhIL-3, rhIL-6 und EPO. Nun wurden die Zellen mit AAV- Wildtyp-Virus-Stocks (erhalten durch Inkubation der Zell¬ linie 293 (ATCC) in Gewebekultur in Anwesenheit von Adeno¬ virus Typ 2 und anschließende Transfektion durch die AAV Wildtyp DNA) versetzt und für 2 Stunden bei 37°C im Wasserbad belassen, wobei mit 5 % C02 in Luft begast wurde. Nach einer Inkubationsdauer von einer Stunde wurden die Zellen aufgeschüttelt. Schließlich wurde mit 10 ml Expansionsmedium aufgefüllt und anschließend zweimal mit Expansionsmedium gewaschen, wobei die Zellen bei 800 g für fünf Minuten abzentrifugiert wurden. Das Pellet wurde resuspendiert und die Zellzahl bestimmt. Als Kontrolle wurde ein Zytospin durchgeführt. Hierbei werden die Zellen nebeneinander auf Glaεobjektträger aufgebracht, wobei sie gut angefärbt werden können.
Beispiel 2
Analyse der Virus Integration in pluripotente Blutstammzellen
Humane allogene Knochenmarks-Langzeitkulturen, die ein konfluentes Stroma aufweisen und 3-4 Wochen alt sind, werden in 10 ml Kulturflaschen mit 15 Gy Cε-gamma bestrahlt. Die Dosiεrate beträgt 3-5 Gy/min. Zunächst werden diese Zellen zweimal mit PBS gespült und dann mit je 5 x 104 Zellen des Infektionsansatzeε in Langzeitkulturmedium inokuliert. Bei dem Langzeitmedium handelt es sich um Iscove's Modified Dulbecco's Medium, das 10 % FCS, 10 % Pferdeserum und 5 x 10~7 M Hydrccortison enthält.
Jede Woche wird die Hälfte des Kulturmediums durch neues Medium ersetzt. Vom Überstand wird die Zellzahl bestimmt und eine Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Zellen erfolgt in 0,9 % Methylcellulose, 20 % FCS, 100 ng/ml rhIL-3 und 100 ng/ml rhGM-CSF.
Die Zellen des Überstandes werden auf Glasobjektträger nebeneinander aufgebracht, wodurch eine gute Anfärbbarkeit gewährleistet ist (Zytospin-Preps) .
Die Analyse der VirusIntegration erfolgt durch Southern Blot, wobei die DNA von 5 x 105 bis 2 x 106 Zellen isoliert wird. Diese DNA wird mit dem Restriktionsenzym Bgl II verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt. Als Nachweissonde dient ein 1,8 kB langes Fragment aus dem Adeno-asεoziierten Viruε-rep-Gen, das mit den Restriktionsendonukleasen Xbal und Xhol ausgeschnitten werden kann.
Alternativ hierzu wird eine in situ-Hybridisierung der Zellen auf Objektträgern durchgeführt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Markierung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit Wildtyp-Adeno¬ assoziiertem Virus inkubiert werden und, daß dabei die Zellen von dem Virus infiziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Säugerzellen handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um menschliche Zellen handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um periphere Blutzellen handelt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis , dadurch gekennzeichnet, daß das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus apathogen ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Wildtyp-Adeno-assoziierte Virus in das Wirtsgenom integrieren kann, aber, daß es von dort nicht mehr mobilisiert werden kann.
7. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Wildtyp- Adeno-assoziiertem Virus markiert ist.
8. Zelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich ist nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6.
9. Zelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine periphere Blutstammzelle handelt.
10. Verwendung eines Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur Markierung von Zellen.
11. Testkit zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus in Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Zusammenεtellung zur Durchführung deε Teεtes handelt, die wenigstenε ein Nukleotidfrag ent enthält, das im weεentlichen komplementär ist zu einem Teil des Wildtyp- Adeno-assoziierten Virus-Genoms.
12. Testkit nach Anεpruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eε sich um eine Zusammenstellung zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion handelt, die Oligonukleotide mit einer Sequenz enthält, die spezifisch ist für Wildtyp-Adeno- asεoziiertes Virus.
13. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Zusammenstellung zur in situ-Hybridisierung handelt, die zu der DNA-Sequenz von Wildtyp-Adeno- asεoziiertem Viruε komplementäre DNA-Sequenzen enthält.
14. Teεtkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Zusammenstellung zur Durchführung des Southern Blots handelt, die eine zu der Nukleotid-Sequenz von Adeno-assoziiertem Virus komplementäre, markierte DNA- Sequenz oder mehrere derartige DNA-Sequenzen enthält.
15. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, .daß es sich um eine Zusammenεtellung handelt, die einerseits mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Nukleotidsequenzen enthält, die komplementär zum Genom von Wildtyp-Adeno-assoziiertem Virus sind und andererseits markierte Antikörper aufweist, die spezifisch sind für zellinienspezifische Oberflächenmarker.
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