DE69924718T2

DE69924718T2 - Gen 62 des attenuierten windpocken-virusstammes oka und verfahren zur identifikation eines attenuierten, lebenden windpockenvirusstammes unter verwendung dieses genes.

Info

Publication number: DE69924718T2
Application number: DE69924718T
Authority: DE
Inventors: Yasuyuki Kanonji-shi GOMI; Tadashi Kanonji-shi IMAGAWA; Juichiro Kanonji-shi OSAME; Toshiaki Suita-shi TAKAHASHI; Koichi Yamanishi
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 1999-10-05
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2019-10-06
Also published as: CA2326699C; EP1074624A1; DE69924718D1; CA2326699A1; EP1074624A4; EP1074624B1; JP4676063B2; CN1306574A; CN1163604C; KR20010043009A; WO2000050603A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Anmeldung betrifft Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus und ein Verfahren zur Identifizierung eines Virusstamms für attenuiertes bzw. abgeschwächtes Varicella-Zoster-Lebendvakzin (im Folgenden "abgeschwächter bzw. attenuierter Varicella-Zoster-Virus-Stamm" genannt), das die DNA-Sequenz von Gen 62 verwendet. Die Anmeldung betrifft insbesondere das Gen 62 zur Verwendung bei der Unterscheidung des Oka-Vakzin-Virus und eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, der als wirksame Komponente des abgeschwächten Vakzins für Varicella-Zoster annehmbar ist, vom Wildtyp-Oka-Vakzin-Virus (im Folgenden als "virulenter Elternstamm" oder "Elternstamm" bezeichnet) und anderen Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämmen; und ein Verfahren zur Identifizierung eines abgeschwächten oder attenuierten Varicella-Zoster-Virus, das auf der Nukleotidsequenz des Gens 62 basiert.
Stand der Technik
Varicella-Zoster-Virus (als VZV abgekürzt; im Folgenden als "Varicella-Virus" oder "VZV" bezeichnet) ist das pathogene Virus von Windpocken und Zoster beim Menschen. Virus, das vom "Oka-Vakzin-Virus" abgeleitet ist (Japanische Patentpublikation Nr. 41202/1978 Lancet 2: 1288–1290, 1974) als einem attenuierter bzw. abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamm abgeleitet ist, wurde als "single unique seed" zur Herstellung von lebenden attenuierten Varicella-Vakzinen verwendet, die weltweit in großem Umfang eingesetzt werden [Anforderungen für Varicella-Vakzin (lebend), eingeführt 1984: WHO Technical Report Series, Nr. 725, S. 102–124, 1985].
Derzeit werden die Sicherheit und Wirksamkeit der lebenden attenuierten Varicella-Vakzine durch die Regulierung der Passagenzahl des Varicella-Impfvirus mit Genehmigung zur Herstellung bescheinigt (Impfchargensystem). Spezifischer ausgedrückt, um die Gefahr einer genetischen Modifikation des abgeschwächten bzw. attenuierten Virus im Verlauf kontinuierlicher Passagen des Impfvirus, so dass das resultierende Virus die Pathogenität wieder annimmt, zu vermeiden, ist unter der Regulierung definiert, dass unter der Vorgabe, dass die Passagenzahl des Impfguts, wenn es zugelassen ist, mit 0 bezeichnet ist, Virus innerhalb der Gesamtpassagenzahl von 10 aus der Passagenzahl 0 im wesentlichen für solche Vakzine verwendet wird. Mit anderen Worten, die Qualitätskontrolle und das Qualitätszertifikat der lebenden attenuierten Varicella-Vakzine hängt von der Beachtung des Impfchargensystems durch jeden Vakzin-Hersteller ab.
Mittlerweile tritt bei gesunden Kindern nach Impfung mit den lebenden attenuierten Varicella-Vakzinen keine klinische Reaktion auf. Ein Auftreten von Windpocken oder Zoster tritt bei geimpften Personen mit Störungen der Immunfunktion nur selten auf. Es wurde allerdings nie geklärt, ob eine solche klinische Reaktion infolge der Impfung oder eine spontane Infektion mit Wildtyp-Varicella-Virus ist oder nicht. Somit ist es epidemiologisch von Bedeutung, die Differenzierung des Oka-Vakzin-Virus als Impfvirus des lebenden attenuierten Varicella-Vakzins von anderen VZV-Wildtyp-Stämmen zu analysieren. So wurde eine Reihe von Verfahren für die Analyse vorgeschlagen. Seit die Struktur der genomischen VZV-Gene beschrieben wurde (Journal of General Virology, 67: 1759–1816, 1986) wurden Verfahren z.B. auf der Basis des Unterschieds in der DNA-Nukleotidsequenz unter VZV-Stämmen (Journal of Virology, 59: 660–668, 1986), dem Vorliegen oder Fehlen einer Restriktionsenzym-PstI-Stelle (Japanese Journal of Experimental Medicine, 59: 233–237, 1989), der Bestimmung auf der Basis von RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) durch PCR (Polymerasekettenreaktion) (Journal of Virology, 66: 1016–1020, 1992) und einer Kombination des Vorliegens oder des Fehlens der PstI-Stelle und der RFLP-Analyse von PCR-Produkten (Journal of Clinical Microbiology, 33: 658–660, 1995) vorgeschlagen. Allerdings haben diese Verfahren eine geringe Zuverlässigkeit, wenn sie einzeln verwendet werden. So war es schwierig, definitiv das Oka-Vakzinvirus von anderen VZV-Wildtyp-Stämmen zu unterscheiden.
Alternativ haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung eine unterschiedliche Genanalyse des Oka-Vakzin-Virus und anderer Varicella-Virus-Stämme (z.B. bekannte Wildtypstämme und Wildtypstämme, die neu von Patienten mit spontaner Varicella-Infektion isoliert worden waren und dergleichen) durchgeführt und haben acht Anforderungen identifiziert, um die zwei Arten von Stammtypen zu unterscheiden. Außerdem haben die Anmelder festgestellt, dass ein unbekanntes Virus als lebendes Varicella-Vakzin nur akzeptabel ist, wenn das Virus allen acht Anforderungen genügt; auf der Basis dieser Feststellung haben sie eine Patentanmeldung gemacht (WO 97/43420; hier als "frühere Erfindung" bezeichnet).
Das Verfahren der früheren Erfindung kann das Oka-Vakzin-Virus von anderen Varicella-Zoster-Virus-Stämmen unterscheiden, kann aber das Oka-Vakzin-Virus nicht vom Eltern-Stamm unterscheiden. Da im wesentlichen alle acht erforderlichen Indikatoren untersucht werden, benötigt das Verfahren ungünstigerweise eine Menge an Zeit und Arbeit, bis die Unterscheidung erfolgt ist.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben Untersuchungen über ein Verfahren zur möglichen Unterscheidung des Oka-Vakzin-Virus vom Eltern-Stamm gemacht, und sie haben festgestellt, dass das Oka-Vakzin-Virus, der Eltern-Stamm und andere Varicella-Wildtyp-Virusstämme in einfacher und zuverlässiger Weise voneinander unterschieden werden können, indem die Mutation des Varicella-Virus-Gens 62 detektiert wird.
Die Erfindung der vorliegenden Anmeldung wurde auf der Basis einer solch neuen Feststellung gemacht, und der Zweck der Erfindung ist die Bereitstellung des Oka-Vakzin-Virus-spezifischen Gens 62.
Ein zusätzlicher Zweck der Erfindung ist die Bereitstellung des Proteins, das durch das Gen 62 codiert wird, und eines Peptids davon, eines Antikörpers und eines zytotoxischen T-Lymphozyten (abgekürzt als CTL), der unter Verwendung dieser als Antigen herstellbar ist.
Ein weiterer Zweck der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms unter Verwendung des Vorliegens oder Fehlens der Mutation des Gens 62 als Indikator.
Offenbarung der Erfindung
Zur Erfüllung der oben genannten Zwecke stellt die vorliegende Erfindung die folgenden einzelnen Erfindungen bereit:

(1) Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus, das die folgenden Basensubstitutionen (a) bis (d) in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 umfasst:
(a) die Base A in Position 2110 ist G;
(b) die Base A in Position 3100 ist G;
(c) die Base T in Position 3818 ist C und
(d) die Base A in Position 4006 ist G.
(2) Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus nach dem obigen Abschnitt (1), das eine oder mehrere der folgenden Basensubstitutionen (e) bis (g) zusätzlich zu den Basensubstitutionen (a) bis (d) umfasst:
(e) die Base A in Position 1251 ist G;
(f) die Base A in Position 2226 ist G und
(g) die Base A in Position 3657 ist G.
(3) Das Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus nach dem obigen Abschnitt (2), das eine oder mehrere der folgenden Basensubstitutionen (h) bis (o) zusätzlich zu den Basensubstitutionen (a) bis (d) und einer oder mehreren der Basensubstitutionen (e) bis (g) umfasst:
(h) die Base T in Position 162 ist C;
(i) die Base T in Position 225 ist C;
(j) die Base T in Position 523 ist C;
(k) die Base T in Position 1565 ist C;
(l) die Base T in Position 1763 ist C;
(m) die Base T in Position 2652 ist C;
(n) die Base T in Position 4052 ist C und
(o) die Base T in Position 4193 ist C.
(4) DNA-Fragment, das für das Gen 62 nach einem der obigen Abschnitte (1) bis (3) codiert, das die Basen-substituierten Teile enthält und das als Sonde zur Differenzierung der abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stämme von Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämmen eingesetzt werden kann.
(5) Protein, das durch das Gen des Oka-Vakzin-Virus nach dem obigen Abschnitt (1) codiert wird, das die folgenden Aminosäuresubstitutionen (A) bis (D) in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst:
(A) der Aminosäurerest Ser in Position 628 ist Gly;
(B) der Aminosäurerest Arg in Position 958 ist Gly;
(C) der Aminosäurerest Val in Position 1197 ist Ala und
(D) der Aminosäurerest Ile in Position 1260 ist Val.
(6) Protein nach dem obigen Abschnitt (5), das eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresubstitutionen (E) bis (H) zusätzlich zu den Aminosäuresubstitutionen (A) bis (D) umfasst:
(E) der Aminosäurerest Met in Position 99 ist Thr;
(F) der Aminosäurerest Leu in Position 446 ist Pro;
(G) der Aminosäurerest Val in Position 512 ist Ala und
(H) der Aminosäurerest Leu in Position 1275 ist Ser.
(7) Peptid als Teil des Proteins nach den obigen Abschnitten (5) oder (6), das die Aminosäure-substituierten Teile enthält und das als Antigen zur Herstellung eines Antikörpers oder eines cytotoxischen T-Lymphozyten verwendet werden kann, der das Protein nach den obigen Abschnitten (5) oder (6) erkennt, aber nicht das Protein, das durch Gen 62 der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme codiert wird.
(8) Antikörper oder cytotoxischer T-Lymphozyt, der das Protein nach einem der obigen Abschnitte (5) oder (6) oder das Peptid nach dem obigen Abschnitt (7) als Antigen erkennt, nicht aber das Protein von Gen 62 der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme erkennt.
(10) Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, umfassend Sequenzieren des Gens 62 von Varicella-Zoster-Viren und Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus mit denselben Basensubstitutionen in Gen 62 wie das Gen 62 nach einem der obigen Abschnitte (1) bis (3).
(11) Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, umfassend Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus, das genomische DNA trägt, an die das DNA-Fragment nach dem obigen Abschnitt (4) hybridisiert.
(12) Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, umfassend Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus, das ein Antigen produziert, das durch den Antikörper oder den cytotoxischen T-Lymphozyten nach dem obigen Abschnitt (8) erkannt wird.
(13) Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, umfassend Verdauen eines DNA-Fragments, das wenigstens von 2107. bis 2229. in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 umfasst, durch Verwendung der Restriktionsenzyme NaeI und BssHII und Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus, bei dem das DNA-Fragment in zwei oder drei Fragmente verdaut ist.
(14) Verfahren nach dem obigen Abschnitt (13), wobei die DNA-Sequenz durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 und 3 als Primer und Varicella-Zoster-Virus-Gen 62 als Matrize hergestellt wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1, oberer Teil, zeigt die schematische Darstellung der Struktur des Varicella-Virus-Gens 62; 1, unterer Teil, zeigt die Sequenzierungsresultate der 9 Klone, die vom Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus abgeleitet sind, und die Sequenzierungsresultate des Gens 62 des virulenten Eltern-Stamms zusammengefasst.
2 ist das Agarosegelelektrophorese-Diagramm der RFLP-Resultate der PCR-Produkte des Gens 62 für jeden der folgenden Varicella-Zoster-Virus-Stämme: Bahn 1 für das Oka-Vakzin-Virus; Bahn 2 für den hochtoxischen Eltern-Stamm; Bahn 3 für den Stamm Kawaguchi; Bahnen 4 bis 8 für den von Varicella abgeleiteten Stamm; Bahnen 9 bis 13 für einen von Zoster abgeleiteten Stamm; die Bahnen an beiden Seiten sind für Größenmarker.
3 zeigt die Resultate eines CAT-Assays, um die Transaktivierungsaktivität von Gen 62-Produkten (IE62) des Oka-Vakzin-Virus und des virulenten Oka-Eltern-Stamms auf einzelne Promotoren zu testen; 3A zeigt, dass IE62s, die von den Effektor-Plasmiden exprimiert werden, den Gen 4 (IE4)-Promotor in dosisabhängiger Weise transaktivieren, wobei die CV1-Zelle mit pCAT-IE4 in konstanter Menge (0,25 μg) und pVac-G62 (offenes Quadrat) oder pPar-G62 (geschlossener Kreis) bei verschiedenen Mengen co- transfiziert wird; 3B, C, D, E und F zeigen die Aktivitäten von IE62s auf die einzelnen Promotoren des Gens 62, das für IE62 codiert, des Gens 28 für DNA-Polymerase, des Gens 29 für Haupt-DNA-Bindungsprotein (abgekürzt MDBP), des Gens 14 für Glycoprotein C (gC abgekürzt) bzw. des Gens 68 für gE.
Bester Modus zur Durchführung der Erfindung
Varicella-Virus-Gen 62 ist eines der Gene, die für die Transaktivierungsfunktion (Funktion zur Aktivierung der Transkription in der trans-Form) verantwortlich sind und befindet sich in der Region der Basen-Nummern 105142 bis 109242 in der Gesamtsequenz des Varicella-Virus-Genoms (Journal of General Virology, 67: 1759–1816, 1986). Wie im oberen Teil von 1 gezeigt ist, beginnt eine Transkription von der Transkriptionsstartstelle aus in Richtung des Pfeils, so dass der Nukleotidstrang der Basen-Nummern 109242 bis 105142 in der Gesamtgenomsequenz als "+"-Strang im Gen 62 dient. Somit entspricht die erste Base "A" in SEQ ID NO: 1 der 5'-terminalen Base (Base in Position 109242 in der Gesamtgenomsequenz) des +-Strangs. In der folgenden Beschreibung wird die Basenzahl manchmal als Basenzahl in der Gesamtgenomsequenz beschrieben. Da die Sequenz des Gens 62 in der Gesamtgenomsequenz allerdings ein "–"-Strang ist, ist das Gen 62 zu den in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotiden komplementär.
Das Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus der Erfindung ist ein Gen mit den Basensubstitutionen (a) bis (d), die in Tabelle 1 gezeigt sind, in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1. Ansonsten ist das Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus ein Gen mit einer oder mehreren der Basensubstitutionen (e) bis (g) in Tabelle 1 zusätzlich zu den Basensubstitutionen (a) bis (d) oder das Gen mit zusätzlich einer oder mehreren der Basensubstitutionen (h) bis (o) in Tabelle 1.
Das Protein des abgeschwächten Varicella-Virus der Erfindung wird durch das Gen 62 codiert, wobei das Protein mit den Aminosäuresubstitutionen (A) bis (D), die in Tabelle 1 gezeigt sind, in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 ausgestattet ist. Ansonsten hat das Protein eine oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen (E) bis (H), die in Tabelle 1 gezeigt sind, zusätzlich zu den Aminosäuresubstitutionen (A) bis (D).
Tabelle 1
Es wird außerdem nahegelegt, dass das Oka-Vakzin-Virus, das das Gen 62 mit den Basensubstitutionen trägt, welche solche Aminosäuresubstitutionen bewirken, wahrscheinlich infolge der Gesamtreduktion der Expression eines Proteins, die für die Bildung eines Viruspartikels notwendig ist, wegen der Defektion oder Schwächung der Transaktivatorfunktion geschwächt ist.
Ein solches Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus kann z.B. aus dem bekannten Oka-Vakzin-Virus (BIKEN Lot-65: The Research Foundation of Microbial Diseases of Osaka University oder ATCC VR-795) in herkömmlicher Weise isoliert werden. Ansonsten kann ein solches Oka-Vakzin-Virus-Gen 62 aus einem abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamm, der durch ein Verfahren, wie es unten beschrieben wird, identifiziert wird, isoliert werden.
Das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung codiert für das Gen 62, das oben beschrieben wurde, welches die basensubstituierten Teile umfasst und welches als Sonde zur Unterscheidung der abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stämme von Varicella-Zoster-Virus-Stämmen des Wildtyps verwendet werden kann. Das DNA-Fragment kann hergestellt werden, indem die genomische DNA von Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, der durch das erfindungsgemäße Verfahren neu identifiziert wurde, mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten wird. Das DNA-Fragment kann z.B. als DNA-Sonde zur Unterscheidung des Oka-Vakzin-Virus oder des abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms von dem hochtoxischen Eltern-Stamm oder den Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämmen verwendet werden.
Außerdem kann das Protein der Erfindung hergestellt werden, indem das Gen 62 in Mikroorganismen, z.B. Escherichia coli oder Hefe, exprimiert wird. Spezifischer ausgedrückt, ein DNA-Fragment, das die codierende Region des Gens 62 trägt, wird in einen Expressionsvektor mit einem in Mikroorganismen replizierbaren Ursprung, einem Promotor, einer Ribosomenbindungsstelle, einer DNA-Klonierungsstelle und einem Terminator unter Herstellung eines Expressionsvektors insertiert, um dadurch eine Wirtszelle zu transformieren; durch nachfolgendes Kultivieren der resultierenden Transformante kann das durch das Gen 62 codierte Protein in großem Maßstab in Mikroorganismen produziert werden. Ansonsten kann das Gen 62 in Form eines Fusionsproteins mit anderen Proteinen exprimiert werden. Durch Spaltung des resultierenden Fusionsproteins mit einer geeigneten Protease kann nur das Zielprotein gewonnen werden.
Diese Proteine können als Antigene zur Herstellung von beispielsweise einem Antikörper und CTL verwendet werden.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst die Aminosäuresubstitutionen in der Aminosäuresequenz des Proteins des obigen Abschnitts (5) oder (6). Diese Peptide können als Antigene zur Herstellung von Antikörpern und CTLs, die das Protein von (5) oder (6) erkennen, nicht aber das Protein erkennen, das durch das Gen 62 der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme codiert wird, verwendet werden.
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann in Form eines polyklonalen Antikörpers oder eines monoklonalen Antikörpers hergestellt werden, wobei das Protein per se oder ein Teilpeptid davon als ein Antigen nach einem bekannten Verfahren verwendet wird. Zusätzlich können die CTL der vorliegenden Erfindung durch Verwendung des Proteins per se oder eines Teilpeptids davon als Antigen durch ein bekanntes Verfahren hergestellt werden. Diese Antikörper und CTL können für das Verfahren zur Identifizierung eines neu isolierten, abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms eingesetzt werden.
Der hier genannte abgeschwächte Varicella-Zoster-Virus-Stamm hat die identischen Basensubstitutionen wie die des Gens 62 des Oka-Vakzin-Virus. Daher ist der hier genannte abgeschwächte Varicella-Zoster-Virus-Stamm als Virusstamm für ein lebendes abgeschwächtes Varicella-Vakzin annehmbar. Solche neuen abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stämme können identifiziert werden, indem das Gen 62 der Varicella-Zoster-Viren sequenziert wird und ein Varicella-Virus selektiert wird, das dieselben Basensubstitutionen im Gen 62 trägt. Spezifischer ausgedrückt, solche neuen abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stämme können vom Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stamm durch das Verfahren unter Verwendung z.B. des DNA-Fragments oder des Antikörpers oder CTL unterschieden werden.
Im übrigen kann der neue abgeschwächte Varicella-Zoster-Virus-Stamm durch das in dieser Anmeldung vorgeschlagene Verfahren identifiziert werden, nämlich durch das Verfahren, das Spalten einer DNA-Sequenz, die wenigstens von 2107. bis 2229. in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, durch Verwendung der Restriktionsenzyme NaeI und BssHII und Selektieren eines Varicella-Virus, aus dem die DNA-Sequenz in zwei bis drei Fragmente gespalten wird, umfasst. Wie oben beschrieben wurde, ist die Base A in Position 2110 im Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus durch G ersetzt. Zusätzlich ist die Base A in Position 2226 manchmal durch G ersetzt. Folglich resultiert die Basensubstitution A gegen G in dieser Position zur Schaffung einer Restriktionsenzym-NaeI-Stelle (GCCGGC) in den Positionen 2107 bis 2112 in SEQ ID NO: 1. Ähnlich erzeugt die Basensubstitution A vs. G in Position 2226 eine BssHII-Stelle (GCGCGC) in den Positionen 2224 bis 2229 in SEQ ID NO: 1. Wenn das DNA-Fragment, das wenigstens die Nukleotide von 2107. bis 2229. in SEQ ID NO: 1 umfasst, mit den zwei Restriktionsenzymen gespalten wird, wird das DNA-Fragment in zwei oder drei Fragmente gespalten, wenn das DNA-Fragment vom Oka-Vakzin-Virus oder dem abgeschwächten Varicella-Virus stammt. Wenn die DNA-Sequenz von einem Wildtyp-Varicella-Virus oder dem virulenten Eltern-Stamm des Oka-Vakzin-Virus abgeleitet ist, wird dagegen die DNA-Sequenz durch keines der Restriktionsenzyme gespalten und bleibt infolge keines Vorliegens solcher Basissubstitutionen, wie sie oben beschrieben wurden, als einzelnes Fragment zurück. Das DNA-Fragment, das durch die Restriktionsenzyme gespalten wurde, kann durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide, deren Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 und NO: 3 als Primer und des Varicella-Virus-Gens 62 als Identifizierungssubjekt als Matrize hergestellt werden.
Ein lebendes, abgeschwächtes Varicella-Vakzin kann durch Verwendung des abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, der durch das oben beschriebene Verfahren als Impfvirus identifiziert wurde, hergestellt werden. Ein derartiges lebendes Vakzin kann in der gleichen Weise wie das Verfahren zur Herstellung herkömmlicher lebender abgeschwächter Varizella-Vakzine unter Verwendung des Oka-Vakzin-Virus als Impfvirus hergestellt werden.
Beispiele
Die Erfindung wird nun spezifisch in den folgenden Beispielen detailliert beschrieben, allerdings wird die Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
Die Nukleotidsequenz des Gens 62 des Oka-Vakzin-Virus und des Gen 62 des hochtoxischen Eltern-Stamms wurden bestimmt. Das Oka-Vakzin-Virus (lebender Vakzin-Stamm), Biken Lot-65: The Research Foundation for Microbial Diseases der Universität von Osaka, wurde verwendet. Der virulente Eltern-Stamm (Oka-Vakzin-Virus-Wildtyp) wurde in MRC-5-Zellen vermehrt und wurde dann verwendet.
Nach dem Verfahren, das in Beispiel 1 der früheren Erfindung (WO 97/43420) beschrieben wurde, wurde genomische DNA aus dem Oka-Vakzin-Virus und dem virulenten Eltern-Stamm extrahiert und jede DNA wurde durch PCR unter Verwendung von Primern, die unter Bezugnahme auf die Nukleotidsequenz des Stamms Dumas entwickelt worden waren, amplifiziert (J. Gen. Virol., 67: 1759–1816, 1986). Das gesamte Gen 62 wurde als drei ganze überlappende Stücke amplifiziert, wobei drei Sätze an Primerpaaren verwendet wurden (Sense-Primer G62N1, G62N2 und G62N3 und Antisense-Primer G62R1, G62R2 und G62R3), wie sie in Tabelle 2 angegeben sind. Jeder Sense-Primer hatte die M13 Vorwärts-(-38)-Sequenz (Nukleotide in Positionen 1 bis 19 in G62N1-3) an seinem 5'-Ende und jeder Antisense-Primer hatte an seinem 5'-Ende die reverse M13-Sequenz (Nukleotide in den Positionen 1 bis 20 in G62R1-3) gebunden.
Tabelle 2
Jede PCR-Reaktion bestand aus 200 mM Desoxynukleotidtriphosphat [jeweils], 0,3 μM jedes Primers, einer extrem geringen Menge an Matrizen-DNA und 2,5 E Ex Taq (hergestellt von TaKaRa) in 50 μl Ex Taq-Puffer. Ein Satz an Primerpaaren (SEQ ID NOS: 3 und 8) enthielten 6% DMSO im Reaktionsgemisch. Eine Amplifikation wurde mit 30 Zyklen Denaturierung (94°C für 1 min), Anlagern (annealing, 55°C für 1,5 min) und Extension 72°C für 2 min) durchgeführt, wobei ein Thermocycler (Perkin-Elmer, USA) verwendet wurde.
Alle PCR-Produkte wurden unter Verwendung des PCR-Reinigungs-Kits (QIAGEN GmbH, Deutschland) gereinigt, um Primer zu entfernen. Die direkte Sequenzierung der gereinigten PCR-Produkte wurde mit einem Sequenzierungskit (Amersham, Co., GB) unter Verwendung des M13-Vorwärts-Primers oder des reversen Primers, markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff IRO-40, durchgeführt, wobei mit einem DNA-Sequenzer-Modell 4000L (LI-COR Co., USA) analysiert wurde.
Durch dasselbe Verfahren wurde die DNA-Sequenz der Gene 4, 14 und 61 des Oka-Vakzin-Virus und des virulenten Eltern-Stamms bestimmt.
Folglich gab es keine Nukleotidänderung in den Genen 4, 14 und 61 zwischen dem Oka-Vakzin-Virus und dem virulenten Eltern-Stamm. Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, wurden im Gen 62 zwischen dem Oka-Vakzin-Virus und dem virulenten Eltern-Stamm 15 Basendifferenzen festgestellt. Jede Basensubstitution war eine T vs C- oder eine A vs G-Substitution. Es wurde gefunden, dass in acht Positionen die Nukleotidänderungen im Vakzin-Virus aus einem Gemisch der zwei Nukleotidarten in einer einzelnen Position (R in Tabelle 3) resultierten. Außerdem unterschieden sich das Gen 62 jedes des Oka-Vakzin-Virus und des virulenten Eltern-Stamms bezüglich 9 Basen vom Gen 62 des Stamms Dumas.
Auf der Basis der vorstehenden Resultate wurde bestätigt, dass das abgeschwächte Oka-Vakzin-Virus durch die Sequenzdifferenz von Gen 62 vom virulenten Eltern-Stamm unterschieden werden konnte.
Tabelle 3
Beispiel 2
Das ganze Gen 62 wurde aus dem Oka-Vakzin-Virus und dem virulenten Eltern-Stamm durch PCR kloniert.
Die PCR-Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1, außer der Verwendung der Oligonukleotide G62N und G62R in Tabelle 1 als Primerpaare, dem Zusatz von 6% DMSO zum Reaktionsgemisch und einer Extensionszeit von 6 min für jeden Zyklus. Die volle Länge jedes Gens 62 wurde durch PCR amplifiziert.
Da die Primer individuell XbaI- und PstI-Restriktionsenzymstellen hatten, wurde das gereinigte PCR-Produkt mit diesen Restriktionsenzymen verdaut. Dann wurde das verdaute Produkt im pUC19 insertiert, welches vorab mit den entsprechenden Enzymen verdaut worden war. Nach der Transformation von E. coli JM109 mit Hybridplasmiden wurden 9 Plasmide aus dem Oka-Vakzin und dem virulenten Eltern-Transformanten zur DNA-Sequenzierung extrahiert.
Die Resultate sind in 1 gezeigt. Wie in 1 gezeigt ist, waren mehrere Basen unter den Basen in 15 Positionen in jedem der 9 Klone des Oka-Vakzin-Virus zu denen des virulenten Eltern-Stamms unterschiedlich. Insbesondere waren die 7 Basen in den Basenpositionen 1251, 2110, 2226, 3100, 3657, 3818 und 4006 in allen Klonen von den Basen in denselben Positionen im Eltern-Stamm verschieden. In keinem der 9 Klone aus den virulenten Eltern-Stämmen wurden Nukleotidänderungen für diese 15 Stellen beobachtet.
Beispiel 3
Partialsequenzen des Gens 62s verschiedener Variacella-Zoster-Virus-Stämme wurden durch RFLP analysiert.
Das Oka-Vakzin-Virus und der virulente Eltern-Stamm wurden wie in Beispiel 1 verwendet. Außerdem wurde der Stamm Kawaguchi, einer der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme, und 10 Proben von Wildtyp-Virus-Stämmen, isoliert aus vesikulären Fluiden von nicht geimpften Patienten mit Varicella und 5 Patienten mit Zoster, verwendet. Hier wurden der Kawaguchi-Stamm und die Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme, isoliert aus diesen Patienten, 2 bis 3 Mal in HEL-Zellen oder MRC-5-Zellen vermehrt und dann verwendet.
Das Gen 62 jedes Varicella-Virus wurde durch PCR amplifiziert, wobei die Oligonukleotide von SEQ ID NOS: 2 und 3 als Primer verwendet wurden. Das Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 war der reverse Primer und entspricht den Basen in Positionen 1846 bis 1863 im Varicella-Virus-Gen 62 (SEQ ID NO: 1), während das Oligonukleotid von SEQ ID NO: 3 der Vorwärts-Primer war, der den Basen in den Positionen 2609 bis 2620 davon entspricht. Die PCR-Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1, außer dass die Extensionszeit in jedem Zyklus 1 Minute war. Drei Mikroliter jedes PCR-Produktes wurden der Reihe nach mit 4 E NaeI (TaKaRa) bei 37°C für 1,5 h und 4 E BssHII (TaKaRa) bei 50°C für 1,5 h verdaut. Die verdauten DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese an 4 Agarosegel (NuSieve 3:1, FMC BioProducts, Co.) mit Ethidiumbromid-Färbung analysiert.
Die Resultate sind in 2 gezeigt. Wie in 2 deutlich gezeigt wird, wurde das PCR-Produkt (Bahn 1) des Gens 62 aus Oka-Vakzin-Virus in 3 Fragmente (402 bp, 264 bp und 116 bp) durch NaeI und BssHII gespalten, wohingegen die PCR-Produkte (Bahnen 2–13) des virulenten Eltern-Stamms und der Wildtyp-Virus-Stämme, die von den Patienten isoliert worden waren, durch keines der Restriktionsenzyme verdaut wurden und als einzelnes Fragment zurückblieben.
Die genannten Resultate liefern die Bestätigung, dass durch Spalten einer DNA-Sequenz, die wenigstens die Basen in Position 2107 bis 2229 im Varicella-Virus-Gen 62 umfasst, mit den Restriktionsnukleasen NaeI und BssHII ein Varicella-Virus mit einer DNA-Sequenz, die dadurch in 2 bis 3 Fragmente gespalten wurde, als das Oka-Vakzin-Virus oder ein Virus-Stamm, der als abgeschwächtes Varicella-Virus annehmbar ist, identifiziert werden konnte.
Beispiel 4
Um die Korrelation zwischen den 8 Aminosäuremutationen mit den Transaktivierungsaktivitäten f der Gen 62-Produkte, IE62, zu analysieren, wurden Chloramphenicol-Transferase (CAT)-Assays in Zellen durchgeführt, die mit einem Reporterplasmid, das eine Promotorsequenz jedes VZV-Gens stromaufwärts des CAT-Gens hat, und einem Effektorplasmid, das das Gen 62 von Oka-Vakzin-Virus oder dem hochtoxischen Eltern-Stamm trägt, co-transfiziert waren.
1. Materialien und Verfahren
1.1 Plasmide
Die Reporterplasmide pIE4-CAT, pgC-CAT, pPOL-CAT, pMDBP-CAT, pIE62-CAT und pgE-CAT enthielten etwa 750 Basen stromaufwärts des Initiationscodons der Promotorregion der Gene 4, 14, 28, 29, 62 bzw. 68. Jede Promotorregion wurde aus dem Oka-Vakzin-Stamm durch PCR unter Verwendung spezifischer Primer, die eine NheI- oder BglII-Stelle am 5'-Ende hatten, amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1, außer dass die Extensionszeit 1 Minute war. Die amplifizierten Produkte wurden mit NheI und BglII verdaut und dann stromabwärts zum CAT-Gen des pCAT3-Basic Plasmid (Promega, Co., USA) insertiert.
Das Effektorplasmid pPar-G62 wurde unter 9 Klonen aus Gen 62 Klon des virulenten Eltern-Stamms selektiert. Klon 9 von 1 (der Klon enthielt 13 Basensubstitutionen und 8 Aminosäuresubstitutionen) wurde unter den 9 Klonen aus dem Oka-Vakzin-Stamm selektiert und als Effektorplasmid pVac-G62 verwendet.
1.2 Transfektion
CV1-Zellen wurden in einer 35 mm-Kunststoffschale mit 10⁵ Zellen/Schale kultiviert und wurden durch Lipofection transfiziert, wobei Superfect (QIAGEN GmbH) verwendet wurde. Jedes Reaktionsgemisch zur Transfektion bestand aus 0,25 μg Reporterplasmid und verschiedenen Mengen (0–1 μg) jedes Effektorplasmids. Die Gesamt-DNA-Menge in jeder Transfektion wurde durch Zugabe des Vektors pUC19 konstant bei 2,5 μg gehalten. Alle Experimente wurden wenigstens 3 Mal mit unabhängiger DNA-Transfektion wiederholt.
1.3 CAT-Assay
44 Stunden nach der Transfektion wurden die Gesamtprotein- und CAT-Level in der Zelle analysiert. Die Zelle wurde 3 Mal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und dann in Lysepuffer (Boehringer Mannheim, Deutschland) lysiert. Die CAT-Konzentration des einzelnen Lysats wurde durch einen CAT-ELISA-Kit (Boehringer Mannheim, Deutschland) bestimmt und für jede Proteinkonzentration standardisiert, die durch das Bio-Rad-Proteinreagens (Bio-Rad, USA) bestimmt worden war.
2. Resultate
Alle getesteten VZV-Gen-Promotoren zeigten sehr niedrige Level der Grundaktivität; wenn kein Effektorplasmid transfiziert wurde, wurde geringe oder keine CAT-Expression beobachtet.
Der Gen 4-Promotor, der aus einem Oka-Stamm stammte, wurde durch beide Gen 62-Produkte (IE62s) des virulenten Eltern-Stamms und des Oka-Stamms transaktiviert (3A). Die Transaktivierungsaktivität von IE62 des virulenten Eltern-Stamms war stärker als die des IE62 durch den Oka-Vakzin- Stamm. Wenn die geringste Dosis (0,25 μg) der Effektorplasmide transfiziert wurde, war die Aktivität des virulenten Eltern-Stamms IE62 7,8-fach höher als die durch den Oka-Stamm IE62. Wenn die Effektorkonzentration erhöht war, war die Differenz bei der Aktivität der zwei IE62-Proteine vermindert.
Ein geringer CAT-Werte konnte in den Zellen detektiert werden, die mit dem Reporterplasmid pCAT-IE62 transfiziert waren (3B).
Darüber hinaus wurden pCAT-Pol und pCAT-MDBP, die die VZV-Gene 28- bzw. -29-Promotoren tragen (3C und 3D), und pCAT-gE, das die Promotorsequenz des Gens 68 trägt (3F), durch beide IE62s aus dem virulenten Elternstamm und dem Oka-Vakzin-Stamm aktiviert. Jede Dosis-abhängige Kurve war ähnlich der pCAT-IE4-Antwort, und die Aktivität des virulenten Eltern-Stamms IE62 war bei allen Dosen höher als die des Oka-Vakzin-Stamms IE62. Bei der niedrigsten Dosis an Effektorplasmiden war die Aktivität des virulenten Eltern-Stamms IE62 7,6 Mal, 5,6 Mal und 1,8 Mal höher als die des Oka-Vakzin-Stamms IE62. Geringe CAT-Aktivität wurde in der Zelle detektiert, die mit pCAT-gC transfiziert war, das die Promotorregion des Gens 14 trägt (3E).
Die vorher genannten Resultate liefern die Bestätigung, dass das Expressionsprodukt (IE62) des VZV-Gens 62 die Promotoren des prä-früheren Gens 4 (ORF4), des früheren Gens 28 (DNA-Polymerase: Pol) und des Gens 29 (Haupt-DNA-Bindungsprotein: MDBP) und des verzögerten Gens 68 (Glycoprotein: gE) aktivierte. Es ist außerdem von größerer Bedeutung, dass die Transkriptionsaktivität des Oka-Vakzin-Stamms IE62 konstant niedriger war als die des hochtoxischen Eltern-Stamms IE62. Mit anderen Worten, die Mutationen im Gen 62 des Oka-Vakzin-Stamms haben einen gewissen Einfluss auf die Virusreplikation, die die Abschwächung von VZV induziert.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung können das Oka-Vakzin-Virus oder ein Varicella-Zoster-Virus-Stamm, der als abgeschwächtes Varicella-Vakzin annehmbar ist, in einfacher Weise genau von anderen Wildtyp-Varicella-Viren und dem hochtoxischen Eltern-Stamm des Oka-Vakzin-Virus unterschieden werden. Gemäß der Erfindung können außerdem abgeschwächte Varicella-Virus-Antigene für Lebend-Vakzin in großem Maßstab hergestellt werden. Aufgrund der Erfindungen können die Vakzin-Herstellung und die Sicherheit und Wirksamkeit der Impfung in einer zuverlässigeren Weise erreicht werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus, das die folgenden Basensubstitutionen (a) bis (d) in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 umfaßt: (a) die Base A in Position 2110 ist G; (b) die Base A in Position 3100 ist G; (c) die Base T in Position 3818 ist C und (d) die Base A in Position 4006 ist G.
Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus nach Anspruch 1, das eine oder mehrere der folgenden Basensubstitutionen (e) bis (g) zusätzlich zu den Basensubstitutionen (a) bis (d) umfaßt: (e) die Base A in Position 1251 ist G; (f) die Base A in Position 2226 ist G und (g) die Base A in Position 3657 ist G.
Das Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus nach Anspruch 2, das eine oder mehrere der folgenden Basensubstitutionen (h) bis (o) zusätzlich zu den Basensubstitutionen (a) bis (d) und einer oder mehreren der Basensubstitutionen (e) bis (g) umfaßt: (h) die Base T in Position 162 ist C; (i) die Base T in Position 225 ist C; (j) die Base T in Position 523 ist C; (k) die Base T in Position 1565 ist C; (l) die Base T in Position 1763 ist C; (m) die Base T in Position 2652 ist C; (n) die Base T in Position 4052 ist C und (o) die Base T in Position 4193 ist C.
DNA-Fragment, das für das Gen 62 nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, das die Basen-substituierten Teile enthält und das als Sonde zur Differenzierung der abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stämme von Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämmen eingesetzt werden kann.
Protein, das durch das Gen des Oka-Vakzin-Virus nach Anspruch 1 codiert wird, das die folgenden Aminosäuresubstitutionen (A) bis (D) in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst: (A) der Aminosäurerest Ser in Position 628 ist Gly; (B) der Aminosäurerest Arg in Position 958 ist Gly; (C) der Aminosäurerest Val in Position 1197 ist Ala und (D) der Aminosäurerest Ile in Position 1260 ist Val.
Protein nach Anspruch 5, das eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresubstitutionen (E) bis (H) zusätzlich zu den Aminosäuresubstitutionen (A) bis (D) umfaßt: (E) der Aminosäurerest Met in Position 99 ist Thr; (F) der Aminosäurerest Leu in Position 446 ist Pro; (G) der Aminosäurerest Val in Position 512 ist Ala und (H) der Aminosäurerest Leu in Position 1275 ist Ser.
Peptid als Teil des Proteins nach Anspruch 5 oder 6, das die Aminosäure-substituierten Teile enthält und das als Antigen zur Herstellung eines Antikörpers oder eines cytotoxischen T-Lymphozyten verwendet werden kann, der das Protein nach Anspruch 5 oder 6 erkennt, aber nicht das Protein, das durch Gen 62 der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme codiert wird.
Antikörper oder cytotoxischer T-Lymphozyt, der das Protein nach Anspruch 5 oder 6 oder das Peptid nach Anspruch 7 erkennt, nicht aber das Protein von Gen 62 der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme erkennt.
Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, umfassend Sequenzieren des Gens 62 von Varicella-Zoster-Viren und Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus mit denselben Basensubstitutionen in Gen 62 nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, umfassend Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus, das genomische DNA trägt, an die das DNA-Fragment nach Anspruch 4 hybridisiert.
Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, umfassend Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus, das ein Antigen produziert, das durch den Antikörper oder den cytotoxischen T-Lymphozyten von Anspruch 8 erkannt wird.
Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms, umfassend Verdauen eines DNA-Fragments, das wenigstens vom 2107, bis 2229. in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 umfaßt, durch Verwendung der Restriktionsenzyme NaeI und BssHII und Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus, bei dem das DNA-Fragment in zwei oder drei Fragmente verdaut ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die DNA-Sequenz durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 und 3 als Primer und Varicella-Zoster-Virus-Gen 62 als Matrize hergestellt wird.