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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Anmeldung betrifft Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus und ein Verfahren
zur Identifizierung eines Virusstamms für attenuiertes bzw. abgeschwächtes Varicella-Zoster-Lebendvakzin (im
Folgenden "abgeschwächter bzw.
attenuierter Varicella-Zoster-Virus-Stamm" genannt), das die DNA-Sequenz von Gen
62 verwendet. Die Anmeldung betrifft insbesondere das Gen 62 zur
Verwendung bei der Unterscheidung des Oka-Vakzin-Virus und eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms,
der als wirksame Komponente des abgeschwächten Vakzins für Varicella-Zoster
annehmbar ist, vom Wildtyp-Oka-Vakzin-Virus (im Folgenden als "virulenter Elternstamm" oder "Elternstamm" bezeichnet) und
anderen Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämmen;
und ein Verfahren zur Identifizierung eines abgeschwächten oder
attenuierten Varicella-Zoster-Virus, das auf der Nukleotidsequenz
des Gens 62 basiert.
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Stand der
Technik
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Varicella-Zoster-Virus
(als VZV abgekürzt;
im Folgenden als "Varicella-Virus" oder "VZV" bezeichnet) ist
das pathogene Virus von Windpocken und Zoster beim Menschen. Virus,
das vom "Oka-Vakzin-Virus" abgeleitet ist (Japanische
Patentpublikation Nr. 41202/1978 Lancet 2: 1288–1290, 1974) als einem attenuierter bzw.
abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stamm
abgeleitet ist, wurde als "single
unique seed" zur
Herstellung von lebenden attenuierten Varicella-Vakzinen verwendet,
die weltweit in großem
Umfang eingesetzt werden [Anforderungen für Varicella-Vakzin (lebend),
eingeführt
1984: WHO Technical Report Series, Nr. 725, S. 102–124, 1985].
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Derzeit
werden die Sicherheit und Wirksamkeit der lebenden attenuierten
Varicella-Vakzine durch die Regulierung der Passagenzahl des Varicella-Impfvirus
mit Genehmigung zur Herstellung bescheinigt (Impfchargensystem).
Spezifischer ausgedrückt,
um die Gefahr einer genetischen Modifikation des abgeschwächten bzw.
attenuierten Virus im Verlauf kontinuierlicher Passagen des Impfvirus,
so dass das resultierende Virus die Pathogenität wieder annimmt, zu vermeiden,
ist unter der Regulierung definiert, dass unter der Vorgabe, dass
die Passagenzahl des Impfguts, wenn es zugelassen ist, mit 0 bezeichnet
ist, Virus innerhalb der Gesamtpassagenzahl von 10 aus der Passagenzahl
0 im wesentlichen für
solche Vakzine verwendet wird. Mit anderen Worten, die Qualitätskontrolle
und das Qualitätszertifikat
der lebenden attenuierten Varicella-Vakzine hängt von der Beachtung des Impfchargensystems
durch jeden Vakzin-Hersteller
ab.
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Mittlerweile
tritt bei gesunden Kindern nach Impfung mit den lebenden attenuierten
Varicella-Vakzinen keine klinische Reaktion auf. Ein Auftreten von
Windpocken oder Zoster tritt bei geimpften Personen mit Störungen der
Immunfunktion nur selten auf. Es wurde allerdings nie geklärt, ob eine
solche klinische Reaktion infolge der Impfung oder eine spontane
Infektion mit Wildtyp-Varicella-Virus ist oder nicht. Somit ist
es epidemiologisch von Bedeutung, die Differenzierung des Oka-Vakzin-Virus
als Impfvirus des lebenden attenuierten Varicella-Vakzins von anderen
VZV-Wildtyp-Stämmen
zu analysieren. So wurde eine Reihe von Verfahren für die Analyse
vorgeschlagen. Seit die Struktur der genomischen VZV-Gene beschrieben
wurde (Journal of General Virology, 67: 1759–1816, 1986) wurden Verfahren
z.B. auf der Basis des Unterschieds in der DNA-Nukleotidsequenz
unter VZV-Stämmen
(Journal of Virology, 59: 660–668,
1986), dem Vorliegen oder Fehlen einer Restriktionsenzym-PstI-Stelle
(Japanese Journal of Experimental Medicine, 59: 233–237, 1989),
der Bestimmung auf der Basis von RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)
durch PCR (Polymerasekettenreaktion) (Journal of Virology, 66: 1016–1020, 1992)
und einer Kombination des Vorliegens oder des Fehlens der PstI-Stelle
und der RFLP-Analyse
von PCR-Produkten (Journal of Clinical Microbiology, 33: 658–660, 1995)
vorgeschlagen. Allerdings haben diese Verfahren eine geringe Zuverlässigkeit,
wenn sie einzeln verwendet werden. So war es schwierig, definitiv
das Oka-Vakzinvirus
von anderen VZV-Wildtyp-Stämmen
zu unterscheiden.
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Alternativ
haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung eine unterschiedliche
Genanalyse des Oka-Vakzin-Virus und anderer Varicella-Virus-Stämme (z.B.
bekannte Wildtypstämme
und Wildtypstämme,
die neu von Patienten mit spontaner Varicella-Infektion isoliert worden waren und
dergleichen) durchgeführt
und haben acht Anforderungen identifiziert, um die zwei Arten von
Stammtypen zu unterscheiden. Außerdem
haben die Anmelder festgestellt, dass ein unbekanntes Virus als
lebendes Varicella-Vakzin nur akzeptabel ist, wenn das Virus allen
acht Anforderungen genügt;
auf der Basis dieser Feststellung haben sie eine Patentanmeldung
gemacht (WO 97/43420; hier als "frühere Erfindung" bezeichnet).
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Das
Verfahren der früheren
Erfindung kann das Oka-Vakzin-Virus
von anderen Varicella-Zoster-Virus-Stämmen unterscheiden, kann aber
das Oka-Vakzin-Virus nicht vom Eltern-Stamm unterscheiden. Da im wesentlichen
alle acht erforderlichen Indikatoren untersucht werden, benötigt das
Verfahren ungünstigerweise eine
Menge an Zeit und Arbeit, bis die Unterscheidung erfolgt ist.
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Die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben Untersuchungen über ein
Verfahren zur möglichen Unterscheidung
des Oka-Vakzin-Virus
vom Eltern-Stamm gemacht, und sie haben festgestellt, dass das Oka-Vakzin-Virus,
der Eltern-Stamm und andere Varicella-Wildtyp-Virusstämme in einfacher
und zuverlässiger Weise
voneinander unterschieden werden können, indem die Mutation des
Varicella-Virus-Gens 62 detektiert wird.
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Die
Erfindung der vorliegenden Anmeldung wurde auf der Basis einer solch
neuen Feststellung gemacht, und der Zweck der Erfindung ist die
Bereitstellung des Oka-Vakzin-Virus-spezifischen Gens 62.
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Ein
zusätzlicher
Zweck der Erfindung ist die Bereitstellung des Proteins, das durch
das Gen 62 codiert wird, und eines Peptids davon, eines Antikörpers und
eines zytotoxischen T-Lymphozyten (abgekürzt als CTL), der unter Verwendung
dieser als Antigen herstellbar ist.
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Ein
weiterer Zweck der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens
zur Identifizierung eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms
unter Verwendung des Vorliegens oder Fehlens der Mutation des Gens
62 als Indikator.
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Offenbarung
der Erfindung
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Zur
Erfüllung
der oben genannten Zwecke stellt die vorliegende Erfindung die folgenden
einzelnen Erfindungen bereit:
- (1) Gen 62 des
Oka-Vakzin-Virus, das die folgenden Basensubstitutionen (a) bis
(d) in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 umfasst:
- (a) die Base A in Position 2110 ist G;
- (b) die Base A in Position 3100 ist G;
- (c) die Base T in Position 3818 ist C und
- (d) die Base A in Position 4006 ist G.
- (2) Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus nach dem obigen Abschnitt (1),
das eine oder mehrere der folgenden Basensubstitutionen (e) bis
(g) zusätzlich
zu den Basensubstitutionen (a) bis (d) umfasst:
- (e) die Base A in Position 1251 ist G;
- (f) die Base A in Position 2226 ist G und
- (g) die Base A in Position 3657 ist G.
- (3) Das Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus nach dem obigen Abschnitt
(2), das eine oder mehrere der folgenden Basensubstitutionen (h)
bis (o) zusätzlich
zu den Basensubstitutionen (a) bis (d) und einer oder mehreren der
Basensubstitutionen (e) bis (g) umfasst:
- (h) die Base T in Position 162 ist C;
- (i) die Base T in Position 225 ist C;
- (j) die Base T in Position 523 ist C;
- (k) die Base T in Position 1565 ist C;
- (l) die Base T in Position 1763 ist C;
- (m) die Base T in Position 2652 ist C;
- (n) die Base T in Position 4052 ist C und
- (o) die Base T in Position 4193 ist C.
- (4) DNA-Fragment, das für
das Gen 62 nach einem der obigen Abschnitte (1) bis (3) codiert,
das die Basen-substituierten
Teile enthält
und das als Sonde zur Differenzierung der abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stämme von
Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämmen eingesetzt
werden kann.
- (5) Protein, das durch das Gen des Oka-Vakzin-Virus nach dem
obigen Abschnitt (1) codiert wird, das die folgenden Aminosäuresubstitutionen
(A) bis (D) in der Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 1 umfasst:
- (A) der Aminosäurerest
Ser in Position 628 ist Gly;
- (B) der Aminosäurerest
Arg in Position 958 ist Gly;
- (C) der Aminosäurerest
Val in Position 1197 ist Ala und
- (D) der Aminosäurerest
Ile in Position 1260 ist Val.
- (6) Protein nach dem obigen Abschnitt (5), das eine oder mehrere
der folgenden Aminosäuresubstitutionen (E)
bis (H) zusätzlich
zu den Aminosäuresubstitutionen
(A) bis (D) umfasst:
- (E) der Aminosäurerest
Met in Position 99 ist Thr;
- (F) der Aminosäurerest
Leu in Position 446 ist Pro;
- (G) der Aminosäurerest
Val in Position 512 ist Ala und
- (H) der Aminosäurerest
Leu in Position 1275 ist Ser.
- (7) Peptid als Teil des Proteins nach den obigen Abschnitten
(5) oder (6), das die Aminosäure-substituierten Teile
enthält
und das als Antigen zur Herstellung eines Antikörpers oder eines cytotoxischen
T-Lymphozyten verwendet werden kann, der das Protein nach den obigen
Abschnitten (5) oder (6) erkennt, aber nicht das Protein, das durch
Gen 62 der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme codiert
wird.
- (8) Antikörper
oder cytotoxischer T-Lymphozyt, der das Protein nach einem der obigen
Abschnitte (5) oder (6) oder das Peptid nach dem obigen Abschnitt
(7) als Antigen erkennt, nicht aber das Protein von Gen 62 der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme erkennt.
- (10) Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder
eines abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stamms,
umfassend Sequenzieren des Gens 62 von Varicella-Zoster-Viren und
Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus mit denselben Basensubstitutionen
in Gen 62 wie das Gen 62 nach einem der obigen Abschnitte (1) bis
(3).
- (11) Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder
eines abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stamms,
umfassend Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus, das genomische DNA trägt, an die
das DNA-Fragment
nach dem obigen Abschnitt (4) hybridisiert.
- (12) Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder
eines abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stamms,
umfassend Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus, das ein Antigen produziert, das
durch den Antikörper
oder den cytotoxischen T-Lymphozyten nach dem obigen Abschnitt (8)
erkannt wird.
- (13) Verfahren zur Identifizierung des Oka-Vakzin-Virus oder
eines abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stamms,
umfassend Verdauen eines DNA-Fragments, das wenigstens von 2107.
bis 2229. in der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 umfasst, durch Verwendung
der Restriktionsenzyme NaeI und BssHII und Selektieren eines Varicella-Zoster-Virus,
bei dem das DNA-Fragment in zwei oder drei Fragmente verdaut ist.
- (14) Verfahren nach dem obigen Abschnitt (13), wobei die DNA-Sequenz
durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide der Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 2 und 3 als Primer und Varicella-Zoster-Virus-Gen 62 als
Matrize hergestellt wird.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1,
oberer Teil, zeigt die schematische Darstellung der Struktur des
Varicella-Virus-Gens 62; 1, unterer Teil, zeigt die Sequenzierungsresultate
der 9 Klone, die vom Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus abgeleitet sind,
und die Sequenzierungsresultate des Gens 62 des virulenten Eltern-Stamms zusammengefasst.
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2 ist
das Agarosegelelektrophorese-Diagramm der RFLP-Resultate der PCR-Produkte des Gens 62
für jeden
der folgenden Varicella-Zoster-Virus-Stämme: Bahn 1 für das Oka-Vakzin-Virus; Bahn
2 für den hochtoxischen
Eltern-Stamm; Bahn 3 für
den Stamm Kawaguchi; Bahnen 4 bis 8 für den von Varicella abgeleiteten
Stamm; Bahnen 9 bis 13 für
einen von Zoster abgeleiteten Stamm; die Bahnen an beiden Seiten
sind für
Größenmarker.
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3 zeigt
die Resultate eines CAT-Assays, um die Transaktivierungsaktivität von Gen
62-Produkten (IE62) des Oka-Vakzin-Virus und des virulenten Oka-Eltern-Stamms
auf einzelne Promotoren zu testen; 3A zeigt,
dass IE62s, die von den Effektor-Plasmiden exprimiert werden, den
Gen 4 (IE4)-Promotor in dosisabhängiger
Weise transaktivieren, wobei die CV1-Zelle mit pCAT-IE4 in konstanter
Menge (0,25 μg)
und pVac-G62 (offenes Quadrat) oder pPar-G62 (geschlossener Kreis)
bei verschiedenen Mengen co- transfiziert wird; 3B, C, D, E und F zeigen die Aktivitäten von
IE62s auf die einzelnen Promotoren des Gens 62, das für IE62 codiert,
des Gens 28 für
DNA-Polymerase,
des Gens 29 für
Haupt-DNA-Bindungsprotein (abgekürzt MDBP),
des Gens 14 für
Glycoprotein C (gC abgekürzt)
bzw. des Gens 68 für
gE.
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Bester Modus
zur Durchführung
der Erfindung
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Varicella-Virus-Gen
62 ist eines der Gene, die für
die Transaktivierungsfunktion (Funktion zur Aktivierung der Transkription
in der trans-Form) verantwortlich sind und befindet sich in der
Region der Basen-Nummern 105142 bis 109242 in der Gesamtsequenz
des Varicella-Virus-Genoms (Journal of General Virology, 67: 1759–1816, 1986).
Wie im oberen Teil von 1 gezeigt ist, beginnt eine
Transkription von der Transkriptionsstartstelle aus in Richtung
des Pfeils, so dass der Nukleotidstrang der Basen-Nummern 109242 bis
105142 in der Gesamtgenomsequenz als "+"-Strang im Gen 62
dient. Somit entspricht die erste Base "A" in
SEQ ID NO: 1 der 5'-terminalen
Base (Base in Position 109242 in der Gesamtgenomsequenz) des +-Strangs.
In der folgenden Beschreibung wird die Basenzahl manchmal als Basenzahl
in der Gesamtgenomsequenz beschrieben. Da die Sequenz des Gens 62
in der Gesamtgenomsequenz allerdings ein "–"-Strang ist, ist
das Gen 62 zu den in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotiden komplementär.
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Das
Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus der Erfindung ist ein Gen mit den Basensubstitutionen
(a) bis (d), die in Tabelle 1 gezeigt sind, in der Nukleotidsequenz
von SEQ ID NO: 1. Ansonsten ist das Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus
ein Gen mit einer oder mehreren der Basensubstitutionen (e) bis
(g) in Tabelle 1 zusätzlich zu
den Basensubstitutionen (a) bis (d) oder das Gen mit zusätzlich einer
oder mehreren der Basensubstitutionen (h) bis (o) in Tabelle 1.
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Das
Protein des abgeschwächten
Varicella-Virus der Erfindung wird durch das Gen 62 codiert, wobei das
Protein mit den Aminosäuresubstitutionen
(A) bis (D), die in Tabelle 1 gezeigt sind, in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 1 ausgestattet ist. Ansonsten hat das Protein eine
oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen
(E) bis (H), die in Tabelle 1 gezeigt sind, zusätzlich zu den Aminosäuresubstitutionen
(A) bis (D).
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Es
wird außerdem
nahegelegt, dass das Oka-Vakzin-Virus, das das Gen 62 mit den Basensubstitutionen
trägt,
welche solche Aminosäuresubstitutionen
bewirken, wahrscheinlich infolge der Gesamtreduktion der Expression
eines Proteins, die für
die Bildung eines Viruspartikels notwendig ist, wegen der Defektion
oder Schwächung
der Transaktivatorfunktion geschwächt ist.
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Ein
solches Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus kann z.B. aus dem bekannten
Oka-Vakzin-Virus (BIKEN Lot-65: The Research Foundation of Microbial
Diseases of Osaka University oder ATCC VR-795) in herkömmlicher
Weise isoliert werden. Ansonsten kann ein solches Oka-Vakzin-Virus-Gen
62 aus einem abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stamm, der durch ein Verfahren, wie es unten
beschrieben wird, identifiziert wird, isoliert werden.
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Das
DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung codiert für das Gen
62, das oben beschrieben wurde, welches die basensubstituierten
Teile umfasst und welches als Sonde zur Unterscheidung der abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stämme von
Varicella-Zoster-Virus-Stämmen
des Wildtyps verwendet werden kann. Das DNA-Fragment kann hergestellt
werden, indem die genomische DNA von Oka-Vakzin-Virus oder eines abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms,
der durch das erfindungsgemäße Verfahren
neu identifiziert wurde, mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten
wird. Das DNA-Fragment
kann z.B. als DNA-Sonde zur Unterscheidung des Oka-Vakzin-Virus oder
des abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stamms
von dem hochtoxischen Eltern-Stamm oder den Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämmen verwendet
werden.
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Außerdem kann
das Protein der Erfindung hergestellt werden, indem das Gen 62 in
Mikroorganismen, z.B. Escherichia coli oder Hefe, exprimiert wird.
Spezifischer ausgedrückt,
ein DNA-Fragment, das die codierende Region des Gens 62 trägt, wird
in einen Expressionsvektor mit einem in Mikroorganismen replizierbaren Ursprung,
einem Promotor, einer Ribosomenbindungsstelle, einer DNA-Klonierungsstelle
und einem Terminator unter Herstellung eines Expressionsvektors
insertiert, um dadurch eine Wirtszelle zu transformieren; durch nachfolgendes
Kultivieren der resultierenden Transformante kann das durch das
Gen 62 codierte Protein in großem
Maßstab
in Mikroorganismen produziert werden. Ansonsten kann das Gen 62
in Form eines Fusionsproteins mit anderen Proteinen exprimiert werden.
Durch Spaltung des resultierenden Fusionsproteins mit einer geeigneten
Protease kann nur das Zielprotein gewonnen werden.
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Diese
Proteine können
als Antigene zur Herstellung von beispielsweise einem Antikörper und
CTL verwendet werden.
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Das
Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst die Aminosäuresubstitutionen
in der Aminosäuresequenz
des Proteins des obigen Abschnitts (5) oder (6). Diese Peptide können als
Antigene zur Herstellung von Antikörpern und CTLs, die das Protein
von (5) oder (6) erkennen, nicht aber das Protein erkennen, das
durch das Gen 62 der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme codiert wird, verwendet
werden.
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Der
Antikörper
der vorliegenden Erfindung kann in Form eines polyklonalen Antikörpers oder
eines monoklonalen Antikörpers
hergestellt werden, wobei das Protein per se oder ein Teilpeptid
davon als ein Antigen nach einem bekannten Verfahren verwendet wird.
Zusätzlich
können
die CTL der vorliegenden Erfindung durch Verwendung des Proteins
per se oder eines Teilpeptids davon als Antigen durch ein bekanntes
Verfahren hergestellt werden. Diese Antikörper und CTL können für das Verfahren
zur Identifizierung eines neu isolierten, abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms
eingesetzt werden.
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Der
hier genannte abgeschwächte
Varicella-Zoster-Virus-Stamm hat die identischen Basensubstitutionen
wie die des Gens 62 des Oka-Vakzin-Virus. Daher ist der hier genannte
abgeschwächte
Varicella-Zoster-Virus-Stamm als Virusstamm für ein lebendes abgeschwächtes Varicella-Vakzin
annehmbar. Solche neuen abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stämme
können
identifiziert werden, indem das Gen 62 der Varicella-Zoster-Viren sequenziert
wird und ein Varicella-Virus selektiert wird, das dieselben Basensubstitutionen
im Gen 62 trägt.
Spezifischer ausgedrückt,
solche neuen abgeschwächten
Varicella-Zoster-Virus-Stämme
können
vom Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stamm
durch das Verfahren unter Verwendung z.B. des DNA-Fragments oder
des Antikörpers
oder CTL unterschieden werden.
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Im übrigen kann
der neue abgeschwächte
Varicella-Zoster-Virus-Stamm
durch das in dieser Anmeldung vorgeschlagene Verfahren identifiziert
werden, nämlich
durch das Verfahren, das Spalten einer DNA-Sequenz, die wenigstens
von 2107. bis 2229. in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst,
durch Verwendung der Restriktionsenzyme NaeI und BssHII und Selektieren
eines Varicella-Virus, aus dem die DNA-Sequenz in zwei bis drei
Fragmente gespalten wird, umfasst. Wie oben beschrieben wurde, ist
die Base A in Position 2110 im Gen 62 des Oka-Vakzin-Virus durch
G ersetzt. Zusätzlich
ist die Base A in Position 2226 manchmal durch G ersetzt. Folglich
resultiert die Basensubstitution A gegen G in dieser Position zur
Schaffung einer Restriktionsenzym-NaeI-Stelle (GCCGGC) in den Positionen
2107 bis 2112 in SEQ ID NO: 1. Ähnlich erzeugt
die Basensubstitution A vs. G in Position 2226 eine BssHII-Stelle (GCGCGC) in
den Positionen 2224 bis 2229 in SEQ ID NO: 1. Wenn das DNA-Fragment,
das wenigstens die Nukleotide von 2107. bis 2229. in SEQ ID NO:
1 umfasst, mit den zwei Restriktionsenzymen gespalten wird, wird
das DNA-Fragment in zwei oder drei Fragmente gespalten, wenn das
DNA-Fragment vom Oka-Vakzin-Virus oder dem abgeschwächten Varicella-Virus
stammt. Wenn die DNA-Sequenz von einem Wildtyp-Varicella-Virus oder dem virulenten
Eltern-Stamm des Oka-Vakzin-Virus abgeleitet ist, wird dagegen die
DNA-Sequenz durch keines der Restriktionsenzyme gespalten und bleibt
infolge keines Vorliegens solcher Basissubstitutionen, wie sie oben
beschrieben wurden, als einzelnes Fragment zurück. Das DNA-Fragment, das durch die Restriktionsenzyme
gespalten wurde, kann durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide,
deren Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 und NO: 3 als Primer und
des Varicella-Virus-Gens 62 als Identifizierungssubjekt als Matrize
hergestellt werden.
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Ein
lebendes, abgeschwächtes
Varicella-Vakzin kann durch Verwendung des abgeschwächten Varicella-Zoster-Virus-Stamms,
der durch das oben beschriebene Verfahren als Impfvirus identifiziert
wurde, hergestellt werden. Ein derartiges lebendes Vakzin kann in
der gleichen Weise wie das Verfahren zur Herstellung herkömmlicher
lebender abgeschwächter
Varizella-Vakzine unter Verwendung des Oka-Vakzin-Virus als Impfvirus
hergestellt werden.
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Beispiele
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Die
Erfindung wird nun spezifisch in den folgenden Beispielen detailliert
beschrieben, allerdings wird die Erfindung nicht auf die folgenden
Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1
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Die
Nukleotidsequenz des Gens 62 des Oka-Vakzin-Virus und des Gen 62
des hochtoxischen Eltern-Stamms wurden bestimmt. Das Oka-Vakzin-Virus
(lebender Vakzin-Stamm), Biken Lot-65: The Research Foundation for
Microbial Diseases der Universität
von Osaka, wurde verwendet. Der virulente Eltern-Stamm (Oka-Vakzin-Virus-Wildtyp)
wurde in MRC-5-Zellen vermehrt und wurde dann verwendet.
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Nach
dem Verfahren, das in Beispiel 1 der früheren Erfindung (WO 97/43420)
beschrieben wurde, wurde genomische DNA aus dem Oka-Vakzin-Virus
und dem virulenten Eltern-Stamm extrahiert und jede DNA wurde durch
PCR unter Verwendung von Primern, die unter Bezugnahme auf die Nukleotidsequenz
des Stamms Dumas entwickelt worden waren, amplifiziert (J. Gen.
Virol., 67: 1759–1816,
1986). Das gesamte Gen 62 wurde als drei ganze überlappende Stücke amplifiziert,
wobei drei Sätze
an Primerpaaren verwendet wurden (Sense-Primer G62N1, G62N2 und
G62N3 und Antisense-Primer G62R1, G62R2 und G62R3), wie sie in Tabelle
2 angegeben sind. Jeder Sense-Primer hatte die M13 Vorwärts-(-38)-Sequenz
(Nukleotide in Positionen 1 bis 19 in G62N1-3) an seinem 5'-Ende und jeder Antisense-Primer
hatte an seinem 5'-Ende
die reverse M13-Sequenz (Nukleotide in den Positionen 1 bis 20 in
G62R1-3) gebunden.
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Jede
PCR-Reaktion bestand aus 200 mM Desoxynukleotidtriphosphat [jeweils],
0,3 μM jedes
Primers, einer extrem geringen Menge an Matrizen-DNA und 2,5 E Ex
Taq (hergestellt von TaKaRa) in 50 μl Ex Taq-Puffer. Ein Satz an
Primerpaaren (SEQ ID NOS: 3 und 8) enthielten 6% DMSO im Reaktionsgemisch.
Eine Amplifikation wurde mit 30 Zyklen Denaturierung (94°C für 1 min),
Anlagern (annealing, 55°C
für 1,5
min) und Extension 72°C
für 2 min)
durchgeführt,
wobei ein Thermocycler (Perkin-Elmer, USA) verwendet wurde.
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Alle
PCR-Produkte wurden unter Verwendung des PCR-Reinigungs-Kits (QIAGEN GmbH,
Deutschland) gereinigt, um Primer zu entfernen. Die direkte Sequenzierung
der gereinigten PCR-Produkte
wurde mit einem Sequenzierungskit (Amersham, Co., GB) unter Verwendung
des M13-Vorwärts-Primers
oder des reversen Primers, markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff
IRO-40, durchgeführt,
wobei mit einem DNA-Sequenzer-Modell
4000L (LI-COR Co., USA) analysiert wurde.
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Durch
dasselbe Verfahren wurde die DNA-Sequenz der Gene 4, 14 und 61 des
Oka-Vakzin-Virus und des virulenten Eltern-Stamms bestimmt.
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Folglich
gab es keine Nukleotidänderung
in den Genen 4, 14 und 61 zwischen dem Oka-Vakzin-Virus und dem
virulenten Eltern-Stamm. Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, wurden im
Gen 62 zwischen dem Oka-Vakzin-Virus und dem virulenten Eltern-Stamm
15 Basendifferenzen festgestellt. Jede Basensubstitution war eine T
vs C- oder eine A vs G-Substitution. Es wurde gefunden, dass in
acht Positionen die Nukleotidänderungen im
Vakzin-Virus aus einem Gemisch der zwei Nukleotidarten in einer
einzelnen Position (R in Tabelle 3) resultierten. Außerdem unterschieden
sich das Gen 62 jedes des Oka-Vakzin-Virus und des virulenten Eltern-Stamms
bezüglich
9 Basen vom Gen 62 des Stamms Dumas.
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Auf
der Basis der vorstehenden Resultate wurde bestätigt, dass das abgeschwächte Oka-Vakzin-Virus durch
die Sequenzdifferenz von Gen 62 vom virulenten Eltern-Stamm unterschieden
werden konnte.
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Beispiel 2
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Das
ganze Gen 62 wurde aus dem Oka-Vakzin-Virus und dem virulenten Eltern-Stamm
durch PCR kloniert.
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Die
PCR-Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1, außer der
Verwendung der Oligonukleotide G62N und G62R in Tabelle 1 als Primerpaare,
dem Zusatz von 6% DMSO zum Reaktionsgemisch und einer Extensionszeit
von 6 min für
jeden Zyklus. Die volle Länge
jedes Gens 62 wurde durch PCR amplifiziert.
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Da
die Primer individuell XbaI- und PstI-Restriktionsenzymstellen hatten, wurde
das gereinigte PCR-Produkt
mit diesen Restriktionsenzymen verdaut. Dann wurde das verdaute
Produkt im pUC19 insertiert, welches vorab mit den entsprechenden
Enzymen verdaut worden war. Nach der Transformation von E. coli JM109
mit Hybridplasmiden wurden 9 Plasmide aus dem Oka-Vakzin und dem
virulenten Eltern-Transformanten
zur DNA-Sequenzierung extrahiert.
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Die
Resultate sind in 1 gezeigt. Wie in 1 gezeigt
ist, waren mehrere Basen unter den Basen in 15 Positionen in jedem
der 9 Klone des Oka-Vakzin-Virus zu denen des virulenten Eltern-Stamms
unterschiedlich. Insbesondere waren die 7 Basen in den Basenpositionen
1251, 2110, 2226, 3100, 3657, 3818 und 4006 in allen Klonen von
den Basen in denselben Positionen im Eltern-Stamm verschieden. In
keinem der 9 Klone aus den virulenten Eltern-Stämmen wurden Nukleotidänderungen
für diese
15 Stellen beobachtet.
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Beispiel 3
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Partialsequenzen
des Gens 62s verschiedener Variacella-Zoster-Virus-Stämme wurden durch RFLP analysiert.
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Das
Oka-Vakzin-Virus und der virulente Eltern-Stamm wurden wie in Beispiel
1 verwendet. Außerdem wurde
der Stamm Kawaguchi, einer der Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme, und
10 Proben von Wildtyp-Virus-Stämmen,
isoliert aus vesikulären
Fluiden von nicht geimpften Patienten mit Varicella und 5 Patienten
mit Zoster, verwendet. Hier wurden der Kawaguchi-Stamm und die Wildtyp-Varicella-Zoster-Virus-Stämme, isoliert
aus diesen Patienten, 2 bis 3 Mal in HEL-Zellen oder MRC-5-Zellen vermehrt und
dann verwendet.
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Das
Gen 62 jedes Varicella-Virus wurde durch PCR amplifiziert, wobei
die Oligonukleotide von SEQ ID NOS: 2 und 3 als Primer verwendet
wurden. Das Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 war der reverse Primer und entspricht
den Basen in Positionen 1846 bis 1863 im Varicella-Virus-Gen 62
(SEQ ID NO: 1), während
das Oligonukleotid von SEQ ID NO: 3 der Vorwärts-Primer war, der den Basen
in den Positionen 2609 bis 2620 davon entspricht. Die PCR-Bedingungen
waren dieselben wie in Beispiel 1, außer dass die Extensionszeit
in jedem Zyklus 1 Minute war. Drei Mikroliter jedes PCR-Produktes
wurden der Reihe nach mit 4 E NaeI (TaKaRa) bei 37°C für 1,5 h
und 4 E BssHII (TaKaRa) bei 50°C
für 1,5
h verdaut. Die verdauten DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese
an 4 Agarosegel (NuSieve 3:1, FMC BioProducts, Co.) mit Ethidiumbromid-Färbung analysiert.
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Die
Resultate sind in 2 gezeigt. Wie in 2 deutlich
gezeigt wird, wurde das PCR-Produkt (Bahn 1) des Gens 62 aus Oka-Vakzin-Virus
in 3 Fragmente (402 bp, 264 bp und 116 bp) durch NaeI und BssHII
gespalten, wohingegen die PCR-Produkte (Bahnen 2–13) des virulenten Eltern-Stamms
und der Wildtyp-Virus-Stämme, die
von den Patienten isoliert worden waren, durch keines der Restriktionsenzyme
verdaut wurden und als einzelnes Fragment zurückblieben.
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Die
genannten Resultate liefern die Bestätigung, dass durch Spalten
einer DNA-Sequenz, die wenigstens die Basen in Position 2107 bis
2229 im Varicella-Virus-Gen 62 umfasst, mit den Restriktionsnukleasen NaeI
und BssHII ein Varicella-Virus mit einer DNA-Sequenz, die dadurch
in 2 bis 3 Fragmente gespalten wurde, als das Oka-Vakzin-Virus oder
ein Virus-Stamm,
der als abgeschwächtes
Varicella-Virus annehmbar ist, identifiziert werden konnte.
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Beispiel 4
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Um
die Korrelation zwischen den 8 Aminosäuremutationen mit den Transaktivierungsaktivitäten f der Gen
62-Produkte, IE62, zu analysieren, wurden Chloramphenicol-Transferase
(CAT)-Assays in
Zellen durchgeführt,
die mit einem Reporterplasmid, das eine Promotorsequenz jedes VZV-Gens
stromaufwärts
des CAT-Gens hat, und einem Effektorplasmid, das das Gen 62 von
Oka-Vakzin-Virus oder dem hochtoxischen Eltern-Stamm trägt, co-transfiziert
waren.
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1. Materialien
und Verfahren
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1.1 Plasmide
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Die
Reporterplasmide pIE4-CAT, pgC-CAT, pPOL-CAT, pMDBP-CAT, pIE62-CAT
und pgE-CAT enthielten etwa 750 Basen stromaufwärts des Initiationscodons der
Promotorregion der Gene 4, 14, 28, 29, 62 bzw. 68. Jede Promotorregion
wurde aus dem Oka-Vakzin-Stamm
durch PCR unter Verwendung spezifischer Primer, die eine NheI- oder
BglII-Stelle am 5'-Ende
hatten, amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren dieselben wie in
Beispiel 1, außer
dass die Extensionszeit 1 Minute war. Die amplifizierten Produkte
wurden mit NheI und BglII verdaut und dann stromabwärts zum
CAT-Gen des pCAT3-Basic Plasmid (Promega, Co., USA) insertiert.
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Das
Effektorplasmid pPar-G62 wurde unter 9 Klonen aus Gen 62 Klon des
virulenten Eltern-Stamms selektiert. Klon 9 von 1 (der
Klon enthielt 13 Basensubstitutionen und 8 Aminosäuresubstitutionen)
wurde unter den 9 Klonen aus dem Oka-Vakzin-Stamm selektiert und
als Effektorplasmid pVac-G62 verwendet.
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1.2 Transfektion
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CV1-Zellen
wurden in einer 35 mm-Kunststoffschale mit 105 Zellen/Schale
kultiviert und wurden durch Lipofection transfiziert, wobei Superfect
(QIAGEN GmbH) verwendet wurde. Jedes Reaktionsgemisch zur Transfektion
bestand aus 0,25 μg
Reporterplasmid und verschiedenen Mengen (0–1 μg) jedes Effektorplasmids. Die
Gesamt-DNA-Menge in jeder Transfektion wurde durch Zugabe des Vektors
pUC19 konstant bei 2,5 μg
gehalten. Alle Experimente wurden wenigstens 3 Mal mit unabhängiger DNA-Transfektion
wiederholt.
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1.3 CAT-Assay
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44
Stunden nach der Transfektion wurden die Gesamtprotein- und CAT-Level in
der Zelle analysiert. Die Zelle wurde 3 Mal mit Phosphat-gepufferter
Salzlösung
gewaschen und dann in Lysepuffer (Boehringer Mannheim, Deutschland)
lysiert. Die CAT-Konzentration des einzelnen Lysats wurde durch
einen CAT-ELISA-Kit
(Boehringer Mannheim, Deutschland) bestimmt und für jede Proteinkonzentration
standardisiert, die durch das Bio-Rad-Proteinreagens (Bio-Rad, USA) bestimmt
worden war.
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2. Resultate
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Alle
getesteten VZV-Gen-Promotoren zeigten sehr niedrige Level der Grundaktivität; wenn
kein Effektorplasmid transfiziert wurde, wurde geringe oder keine
CAT-Expression beobachtet.
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Der
Gen 4-Promotor, der aus einem Oka-Stamm stammte, wurde durch beide
Gen 62-Produkte (IE62s) des virulenten Eltern-Stamms und des Oka-Stamms transaktiviert
(3A). Die Transaktivierungsaktivität von IE62
des virulenten Eltern-Stamms
war stärker
als die des IE62 durch den Oka-Vakzin- Stamm. Wenn die geringste Dosis (0,25 μg) der Effektorplasmide
transfiziert wurde, war die Aktivität des virulenten Eltern-Stamms
IE62 7,8-fach höher
als die durch den Oka-Stamm IE62. Wenn die Effektorkonzentration
erhöht war,
war die Differenz bei der Aktivität der zwei IE62-Proteine vermindert.
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Ein
geringer CAT-Werte konnte in den Zellen detektiert werden, die mit
dem Reporterplasmid pCAT-IE62 transfiziert waren (3B).
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Darüber hinaus
wurden pCAT-Pol und pCAT-MDBP, die die VZV-Gene 28- bzw. -29-Promotoren tragen
(3C und 3D),
und pCAT-gE, das die Promotorsequenz des Gens 68 trägt (3F), durch beide IE62s aus dem virulenten
Elternstamm und dem Oka-Vakzin-Stamm
aktiviert. Jede Dosis-abhängige
Kurve war ähnlich
der pCAT-IE4-Antwort, und die Aktivität des virulenten Eltern-Stamms
IE62 war bei allen Dosen höher
als die des Oka-Vakzin-Stamms IE62. Bei der niedrigsten Dosis an
Effektorplasmiden war die Aktivität des virulenten Eltern-Stamms IE62 7,6 Mal,
5,6 Mal und 1,8 Mal höher
als die des Oka-Vakzin-Stamms IE62. Geringe CAT-Aktivität wurde
in der Zelle detektiert, die mit pCAT-gC transfiziert war, das die
Promotorregion des Gens 14 trägt
(3E).
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Die
vorher genannten Resultate liefern die Bestätigung, dass das Expressionsprodukt
(IE62) des VZV-Gens 62 die Promotoren des prä-früheren Gens 4 (ORF4), des früheren Gens
28 (DNA-Polymerase:
Pol) und des Gens 29 (Haupt-DNA-Bindungsprotein: MDBP) und des verzögerten Gens
68 (Glycoprotein: gE) aktivierte. Es ist außerdem von größerer Bedeutung,
dass die Transkriptionsaktivität
des Oka-Vakzin-Stamms IE62 konstant niedriger war als die des hochtoxischen
Eltern-Stamms IE62. Mit anderen Worten, die Mutationen im Gen 62
des Oka-Vakzin-Stamms
haben einen gewissen Einfluss auf die Virusreplikation, die die
Abschwächung
von VZV induziert.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können
das Oka-Vakzin-Virus oder ein Varicella-Zoster-Virus-Stamm, der
als abgeschwächtes
Varicella-Vakzin annehmbar ist, in einfacher Weise genau von anderen Wildtyp-Varicella-Viren
und dem hochtoxischen Eltern-Stamm
des Oka-Vakzin-Virus unterschieden werden. Gemäß der Erfindung können außerdem abgeschwächte Varicella-Virus-Antigene für Lebend-Vakzin
in großem Maßstab
hergestellt werden. Aufgrund der Erfindungen können die Vakzin-Herstellung und die
Sicherheit und Wirksamkeit der Impfung in einer zuverlässigeren
Weise erreicht werden.
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