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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Virologie, insbesondere
den humanen Cytomegalovirus und die Immunreaktion auf diese Infektion.
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Der
humane Cytomegalovirus (HCMV) gehört zur Herpesvirusfamilie.
Eine Infektion mit HCMV tritt häufig
auf, was durch den hohen Prozentsatz (über 50%) von Erwachsenen bewiesen
wird, die Antikörper
gegen dieses Virus aufweisen. Die Infektion in einem normal immunkompetenten
Individuum ist mild oder asymptomatisch. Allerdings entwickelt sich
in Neugeborenen und in immunsupprimierten Wirten wie Organ- und
Knochenmarkstransplantatempfängern
und AIDS-Patienten eine ernste Erkrankung (zusammengefasst durch
Ho (1991) in: Cytomegalovirus: Biology and Infection, (2. Ausgabe),
Plenum Med. Press, New York).
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Wie
andere Herpesviren kann HCMV nach einer anfänglichen Infektion eine lebenslange
Latenz etablieren (Stevens (1989) Microbiol. Rev. 53: 318–332; Bruggeman
(1993) Virchows Arch, B cell Pathol. (64: 325–333)). Der Ort der Latenz
ist unbekannt. Es gibt einige Daten, die anzeigen, dass mehrere
Organe und Gewebe wie Niere, Herz und Gefäßwand großer Gefäße die Orte der Latenz sind.
Darüber
hinaus können
Blutzellen wie Makrophagen latentes Virus enthalten (Hendrix et
al. (1989) Am. J. Pathol. 134: 1151–1157; Yomashiroya et al. (1988)
Am. J. Pathol. 130: 71–79;
Tanake et al. (1992) J. Vasc. Surg. 16: 274–279; Stanier et al. (1989)
Br. Med. J. 299: 897–898;
Bevan et al. (1991) Br. J. Haematol. 78: 94–99; Taylor-Wiedeman et al.
(1991) J. Gen. Virol. 72: 2059–2064).
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Ausgehend
von der latenten Infektion kann das Virus reaktiviert werden, was
zu einer endogenen Infektion führt,
und ein Risiko für
den immundefizienten Wirt darstellt. Sowohl primäre Infektionen als auch Re-Infektionen
(entweder endogene durch Reaktivierung von latentem Virus innerhalb
des Wirts oder exogene durch Re-Infektion mit einem neuen Virus
von außerhalb)
können
zur akuten (oder aktiven) Infektion führen. Insbesondere primäre Infektionen
können
in einer lebensbedrohenden Erkrankung resultieren (Rubin (1990) Rev.
Infect. Dis. 12 (Suppl. 7): 5754–5766; Schooley (1990) Rev.
Infect. Dis. 12 (Suppl. 7): S811–S819).
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Obwohl
die zelluläre
Immunität
den wichtigsten Teil der Immunreaktion zur Beendigung oder Reduktion
der HCMV-Infektion im Wirt darstellt, wird aus Studien in humanen
und Tiermodellen klar, dass auch die humorale Immunität eine Wirkung
auf den Verlauf der Infektion besitzt, indem sie CMV-assoziierte
Symptome reduziert oder verhindert (Meyers et al. (1983) Ann. Intern.
Med. 98: 442–446;
Snijdman et al. (1987) New Engl. J. Med. 317: 1049–1054; Stals
et al. (1994) Antiviral Res. 25: 147–160).
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Vor
kurzem haben Experimente in Tiermodellen gezeigt, dass klinische
Symptome durch Impfung verhindert werden können, was den Befund stützt, dass
das Vorliegen von Antikörpern
eine CMV-Infektion und, folglich, eine Erkrankung reduzieren kann.
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Obwohl
eine antivirale Chemotherapie für
einige Herpesviren erfolgreich war, insbesondere für Herpes-simplex-Viren,
verbleibt die Prophylaxe und Behandlung von HCMV-Infektionen schwierig. Die besten Resultate
für eine
HCMV-Therapie werden erreicht, wenn die Therapie sehr früh in der
Infektion begonnen wird (Whitley & Gnann
(1992) New Engl. J. Med. 327: 782–789; Meyers et al. (1988)
New Engl. J. Med. 318: 70–75; Collaborative
DHPG treatment study group (1986) New Engl. J. Med. 314: 801–806; Walmsley
(1988) J. Infect. Dis. 157: 569; Goodrich et al. (1991) New Engl.
J. Med. 325: 1601–1607;
Merigan et al. (1992) New Engl. J. Med. 326: 1182–1186).
Daher ist ein früher
Nachweis einer aktiven HCMV-Infektion wichtig. Für diesen frühen Nachweis einer akuten HCMV-Infektion
(entweder eine primäre
Infektion oder die Reaktivierung einer latenten Infektion) besteht
ein verstärkter
Bedarf an neuen spezifischen und sensitiven Techniken. Neben dem
Nachweis des Virus, viraler Antigene und des viralen Genoms, ist
der Nachweis von Anti-HCMV-Antikörpern,
insbesondere IgM (und zu einem geringeren Ausmaß IgA) wichtig (Landini (1993)
Prog. Med. Virol. 4: 157–177; Bij
vd W et al. (1988) J. Med. Virol. 25: 179–188; Genna et al. (1991) J.
Inf. Dis. 164: 488–498;
Nielsen et al. (1980) J. Clin. Microbiol. 26: 654–661; Sarov
et al. (1982) Clin. Exp. Immunol. 48: 321–328).
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WO
96/01321 und Landini et al. ((1995), J. Clin. Microbiol. 33: 2535–2542) offenbaren
ein Gemisch, umfassend ein Fusionsprotein, das zwei Epitope von
pp150 (UL32) und ein Epitop von pp52 (UL44) kombiniert mit einem
pp65-Antigen (UL83) und einem pp38-Antigen (UL80), die benötigt werden,
um das CMV-Virus in einem Assay auf Anti-CMV-Antikörper zu
ersetzen.
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Die
vorliegende Erfindung stillt das Bedürfnis auf einen frühen Nachweis
von HCMV, indem ein synthetisches Protein bereitgestellt wird, das
in einem Assay zum frühen
Nachweis von Anti-HCMV-Antikörpern nützlich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein HCMV-Vakzin bereit.
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Die
Erfindung betrifft ein humanes Cytomegalovirusprotein, auch „kombiniertes
Antigen" genannt,
das in einer einzigen Aminosäurekette
immunogene Teile der Aminosäuresequenz
von drei HCMV-Proteinen, die von UL32, UL80 und UL83 kodiert werden,
umfasst, und das als ein HCMV-Vakzin und in einem Assay zum frühen Nachweis
einer HCMV-Infektion nützlich
ist. Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren für die Zubereitung
des kombinierten Antigens der Erfindung durch rekombinante DNA-Techniken.
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In
einer spezifischen Ausführungsform
ist das kombinierte Antigen der Erfindung ein Fusionsprotein, das
die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NR:12 besitzt. In dieser Ausführungsform besteht das kombinierte Antigen
aus sechs Histidin-Resten und definiert Teile der HCMV-Proteine
UL32, UL83 und UL80. Der Typ oder die Anzahl von HCMV-Antigenen,
die in dem „kombinierten" Antigen beinhaltet
sind, ist nicht beschränkt,
und kann mehr als drei Epitope beinhalten. Die Antigene (Epitope),
die in diesem Assay verwendet werden, zeigen eine verstärkte Fähigkeit,
IgM zu binden, wobei sie im Vergleich zu einem einzelnen Antigen
einen 2- bis 3-fachen Anstieg in einer IgM-Antikörper-Bindung aufweisen.
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Die
Erfindung umfasst Nukleotidsequenzen, die das erfindungsgemäße kombinierte
Antigen kodieren. Diese Nukleotidsequenzen beinhalten DNA-, cDNA-
und RNA-Sequenzen, welche das erfindungsgemäße kombinierte Antigen kodieren.
In einer spezifischen Ausführungsform
beinhaltet die Erfindung Nukleotidsequenzen mit der Nukleotidsequenz
von SEQ ID NR:11. Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
kleine Modifikationen der Nukleotidsequenzen, die das erfindungsgemäße kombinierte
Antigen kodieren, beinhalten, solange die resultierenden Proteine
dieselbe in vitro und/oder in vivo-Aktivität und -Funktion des Proteins
besitzen, das durch die Sequenz von SEQ ID NR:11 kodiert wird.
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Die
Erfindung umfasst ferner Vektoren, welche die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
enthalten, und Wirtszellen, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren
transformiert sind.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen Assay zum Nachweis des Vorliegens
und der Menge von Antikörpern
gegen HCMV-kodierte Antigene in Gewebe und biologischen Flüssigkeiten
von infizierten Menschen. Dieser Assay erreicht eine verbesserte
Sensitivität
der Immundetektion durch die Kombination von immundominanten Bereichen
der früh
hergestellten Proteine in ein einzelnes Protein. Darüber hinaus
kann das erfindungsgemäße kombinierte
Antigen an einer festen Phase angebracht werden, um es in einem
Festphasen-Assay, wie einem Immunoassay oder in ähnlichen Assays, zu verwenden,
wie sie weithin für
den Nachweis von sowohl Antigenen als auch Antikörpern (IgG, IgM und IgA) in
Körperproben
verwendet werden. Die verstärkte Fähigkeit
des erfindungsgemäßen kombinierten
Antigens, HCMV-spezifische Antikörper
zu binden, stellt einen sensitiven Assay bereit, der in der Lage
ist, HCMV-vermittelte Erkrankungen in einem frühen Stadium der Infektion nachzuweisen,
was den Beginn einer frühen
Behandlung erlaubt.
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In
einem Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines kombinierten
Antigens als ein humanes Cytomegalovirus-Vakzin. Das als ein Vakzin
nützliche
kombinierte Antigen enthält
Teile der Proteine, die von den HCMV-Sequenzen ppUL32, ppUL80 und
ppUL83 kodiert werden, in einer einzigen Aminosäurekette, die wie unten beschrieben
hergestellt wird. Das erfindungsgemäße Vakzin ist nützlich,
um eine schützende
Immunität
auf Menschen zu übertragen,
die ein Risiko für
eine HCMV-vermittelte Erkrankung aufweisen.
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Diese
und weitere Aspekte, Vorteile und Eigenschaften der Erfindung werden
dem Fachmann nach dem Lesen der Details der Verfahren, Assays und
Peptide der Erfindung, wie sie unten vollständig beschrieben sind, offensichtlich
werden.
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1A und 1B zeigen
die Nukleinsäuresequenz
und entsprechende Aminosäuresequenz
des erfindungsgemäßen beispielhaften
kombinierten Antigens.
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Bevor
die vorliegenden Proteine, Assays und Verfahren zu ihrer Verwendung
beschrieben werden, muss man verstehen, dass diese Erfindung nicht
auf besondere Verfahren, Assays oder Proteine, wie sie beschrieben
sind, beschränkt
ist, da solche Verfahren, Assays und Proteine natürlich variieren
können.
Es versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich
dem Zweck der Beschreibung besonderer Ausführungsformen dient und dass
sie nicht beschränkend
sein soll, da der Umfang der vorliegenden Erfindung ausschließlich durch
die anhängenden
Ansprüche
beschränkt
wird.
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Wenn
nicht anders definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen
Ausdrücke,
wie sie hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung wie sie im Allgemeinen
vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet verstanden werden, zu dem
diese Erfindung gehört. Obwohl
beliebige Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent
sind, für
die Ausübung
oder das Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden
im Folgenden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben.
Alle hierin genannten Veröffentlichungen
offenbaren und beschreiben die Verfahren und/oder Materialien in
Verbindung mit den in ihnen zitierten Veröffentlichungen.
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Kombiniertes
Antigen
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein „kombiniertes Antigen", mit Teilen der
Aminosäuresequenzen
des Town-Stamms des humanen Cytomegalovirus. Mit dem Ausdruck „kombiniertes
Antigen" ist ein
nicht natürlich auftretendes
Protein gemeint, das in einer einzigen Aminosäurekette alle oder einen immunogene(n)
Teil(e) der Aminosäuresequenzen
der Proteine umfasst, die durch UL32 (ppUL32), UL80 (ppUL80) und
UL83 (ppUL83) kodiert werden. Diese Aminosäuresequenzen definieren Epitope,
die effizient mit humanen Immunglobulinen reagieren. Das natürlich auftretende
intakte UL32-Protein kodiert ein basisches Phosphoprotein von 150
kDa, das das Serum von HCMV-infizierten Patienten bindet. UL83 und
UL80 kodieren das Haupt-HCMV-Matrixprotein bzw. -Assemblierungsprotein.
Das kombinierte Antigenprotein der vorliegenden Erfindung bindet
HCMV-spezifische IgM im Vergleich mit dem natürlicherweise vorkommenden einzelnen
Epitop mit einer 2- bis 3-fach verstärkten Affinität. Das kombinierte
Antigen der vorliegenden Erfindung weist die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NR:12 auf.
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Durch
die Ausdrücke „verstärkte Bindungsfähigkeit" oder „verstärkte Bindungsaffinität" ist eine verbesserte
Bindung des erfindungsgemäßen kombinierten
Antigens an HCMV-spezifische
Antikörper
im Vergleich zu einem einzelnen Epitop gemeint. Daher stellt das
Vorliegen multipler Epitope in einem einzigen Molekül einen
synergistischen Effekt auf die Bindung an HCMV-spezifische Antikörper dar.
Die Ausdrücke „synergistisch", „synergistischer
Effekt" und dergleichen
werden hierin verwendet, um eine verbesserte Bindung des erfindungsgemäßen kombinierten
Antigens an HCMV-spezifische Antikörper im Vergleich zu einem
einzelnen Epitop zu beschreiben. Obwohl ein synergistischer Effekt
in einigen Fachgebieten einen Effekt bedeutet, der mehr als additiv
ist (z.B. 1 + 1 = 3), kann auf medizinischem Gebiet ein synergistischer
Effekt additiv (1 + 1 = 2) oder weniger als additiv (1 + 1 = 1,6)
sein. Daher geht man bei dem Vorliegen multipler antigener Domänen in einem einzigen
Molekül
davon aus, dass es einen synergistischen Effekt auf eine HCMV-spezifische
Antikörperbindung
(z.B. > 1,0) im Vergleich
zu einer einzelnen Domäne
(1,0) aufweist.
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Das
erfindungsgemäße kombinierte
Antigen besteht aus antigenen Domänen aus Proteinen des HCMV-Town-Stamms,
die effektiv Anti-HCMV-Antikörper
in biologischen Proben nachweisen können. Das erfindungsgemäße kombinierte
Antigen besteht weiter aus einem Tag aus 6 Histidinresten, die verwendet
werden, um das Antigen aufzureinigen. Der Histidin-Tag ist nicht
immunogen und stört
den Antikörpernachweis nicht.
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Die
Erfindung beinhaltet Nukleotidsequenzen, die das erfindungsgemäße kombinierte
Antigen kodieren. Diese Nukleotidsequenzen können entweder in prokaryotischen
oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert werden, einschließlich mikrobiellen,
Hefe-, Insekten- und nicht-menschlichen Säugetierorganismen. Verfahren
zur Expression von DNA-Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt.
Biologisch funktionale virale und Plasmid-DNA-Vektoren, die in der
Lage sind, in einem Wirt zu exprimieren und zu replizieren, sind
im Stand der Technik bekannt. Solche Vektoren werden verwendet,
um die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aufzunehmen.
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Die
Transformation einer Wirtszelle mit Vektoren, die DNA enthalten,
die das erfindungsgemäße Antigen
kodiert, kann mittels konventioneller Techniken, wie sie dem Durchschnittsfachmann
bekannt sind, ausgeführt
werden. Solche transformierten Wirtszellen sind in der Lage, das
kombinierte Antigen zu exprimieren. Die Isolierung und Aufreinigung
des exprimierten kombinierten Antigens kann mit konventionellen
Mitteln, die im Stand der Technik bekannt sind, ausgeführt werden.
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Assay-Verfahren
zum Nachweis von HCMV-Antikörpern
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Das
erfindungsgemäße kombinierte
Antigen besitzt Vorteile gegenüber
Antigen-Zubereitungen
des Stands der Technik, einschließlich einer 2- bis 3-fachen
verbesserten Bindung an IgM-Antikörper. Diese verbesserte IgM-Bindung
stellt einen genaueren und sensitiveren Assay für den Nachweis von HCMV-Antikörpern bereit,
die während
einer frühen
HCMV-vermittelten
Infektion eines Menschen vorhanden sind.
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Durch „HCMV-vermittelte
Infektion" oder „HCMV-vermittelte
Erkrankung" wird
ein pathologischer Zustand gemeint, der aus einer Infektion eines
Menschen mit einem humanen Cytomegalovirus resultiert, einschließlich kongenitaler
Infektionen.
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Diejenigen,
die sich in der Entwicklung immun-reaktiver Techniken auskennen,
werden verstehen, dass es eine Anzahl gut bekannter Verfahren für den Nachweis
von Antikörpern
und Verwendungen von Antigenen zu diesem Zweck gibt. Daher ist die
vorliegende Erfindung nicht auf jene Assays, die spezifisch beschrieben
sind, beschränkt,
auch wenn nur eine geringe Anzahl von Assay-Verfahren hierin beschrieben
ist. Sowohl kompetitive als auch nicht-kompetitive Assay-Verfahren
sind in den Nachweis-Assay der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Beispiele für
Assay-Verfahren, in denen das erfindungsgemäße kombinierte Antigen verwendet
werden kann, beinhalten einen Radio-Immun-Assay (RIA), Western Blot,
enzymgebundener Immunosorbent-Assay (ELISA) und indirekte Immunfluoreszenz
(IF)-Assays.
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Für den Nachweis
akuter HCMV-Infektionen sind zwei Ansätze möglich. Der erste beruht auf
dem Nachweis von Virus oder von Teilen von diesem (Antigene oder
Genom). Obwohl im Allgemeinen dieser Ansatz gute Resultate ergibt,
benötigt
er eine besondere Ausrüstung
und Kenntnis und kann üblicherweise
nur in akademischen Zentren oder großen Laboratorien angewendet
werden.
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Der
zweite Ansatz beruht auf dem Nachweis von IgM-Antikörpern im
Serum der Patienten und auf einem Anstieg von Antikörpern der
IgG-Klasse. Der Nachweis von Antikörpern kann leicht unter Verwendung
von Techniken wie der ELISA-Technik erreicht werden. Im Prinzip
ist diese Technik relativ leicht zu handhaben und kann in Routinelaboratorien
verwendet werden (Kraat et al. (1992) J. Clin. Microbiol. 30: 522–524; Lazzaroto et
al. (1992) J. Clin. Lab. Anal. 6: 216–218; Stagno et al. (1985)
J. Clin. Microbiol. 21: 930–935;
Smith & Shelley (1988)
J. Virol. Meth. 21: 87–96;
Marsano et al. (1990) J. Inf. Dis. 161: 454–461).
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Obwohl
von einem theoretischen Standpunkt aus ELISA eine einfache Technik
zum Nachweis von IgM-Antikörpern
ist, gibt es viele Probleme, die mit der Verwendung kommerzieller
ELISA-Kits verbunden sind. Die zurzeit erhältlichen CMV-IgM-Antikörpernachweisverfahren
leiden an beachtlichen Schwankungen in der Spezifität und Sensitivität. Dies
beruht im Großen
und Ganzen auf Unterschieden in der Antigenzusammensetzung und in
einer fehlenden Antigenstandardisierung.
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Diese
Probleme werden gelöst
durch die Kombination dreier rekombinanter viraler Proteine (ppUL80 (p38),
ppUL83 (pp65) und ppUL32 (pp150)) in einem einzelnen synthetischen
Protein, das für
den Nachweis von IgM-Antikörpern
geeignet ist. Diese viralen Proteine wurden verwendet, um ein sensitives
Verfahren zum frühen
Nachweis akuter HCMV-Infektionen
in „risikobehafteten
Patienten" wie Organempfängern, Kleinkindern und
Patienten, die am erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) leiden, zu
entwickeln.
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Humanes Cytomegalovirus-Vakzin
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Die
Vakzinierung mit inaktivierten oder attenuierten Organismen oder
ihren Produkten hat sich als ein effektives Verfahren zur Erhöhung der
Wirtsresistenz erwiesen und hat letztendlich zur Ausrottung bestimmter allgemeiner
und ernster Infektionskrankheiten geführt. Die Verwendung von Vakzinen
beruht auf der Stimulierung spezifischer Immunreaktionen innerhalb
des Wirts.
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Das
in dieser Erfindung beschriebene kombinierte Antigen erzeugt eine
Immunreaktion. Der Ausdruck „Immunreaktion" betrifft eine cytotoxische
T-Zell-Reaktion oder erhöhte
Serumkonzentrationen von Antikörpern,
die gegenüber
einem Antigen spezifisch sind, oder die Anwesenheit neutralisierender
Antikörper
gegen ein Antigen. Die Immunreaktion ist vorzugsweise ausreichend,
um das erfindungsgemäße kombinierte
Antigen als ein Vakzin zum Schutz von Menschen vor einer Infektion
mit humanem Cytomegalovirus nützlich
zu machen. Darüber
hinaus können
die durch das erfindungsgemäße kombinierte
Antigen erzeugten Antikörper
extrahiert und verwendet werden, um ein Virus in einer Probe von
Körperflüssigkeit
nachzuweisen. Der Ausdruck „Schutz" oder „schützende Immunität" betrifft hierin
die Fähigkeit
der Serum-Antikörper
und cytotoxischen T-Zell-Reaktion, die während der Immunisierung induziert
werden, (teilweise oder völlig)
gegen eine Erkrankung zu schützen,
die durch ein infektiöses
Agens, z.B. humanes Cytomegalovirus, verursacht wird. Von der Verwendung
des kombinierten Antigens als ein Vakzin wird erwartet, dass es
Menschen eine schützende
Immunität
gegen ernste HCMV-Infektionen durch Induktion von Antikörpern gegen
HCMV verleiht, von denen man weiß, dass sie ernste klinische
Symptome verhindern.
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Die
Erfindung beinhaltet ein Verfahren, eine Immunreaktion und schützende Immunität für einen
Menschen gegen humane Cytomegalovirus-vermittelte Erkrankungen bereitzustellen.
Das Verfahren beinhaltet die Verabreichung des erfindungsgemäßen kombinierten
Antigens an einen Menschen. Das erfindungsgemäße kombinierte Antigen wird
vorzugsweise als eine Formulierung verabreicht, die einen physiologisch
verträglichen
Träger
und eine effektive Menge des kombinierten Antigens umfasst. Eine
Vielzahl von physiologisch verträglichen
Trägern
ist im Stand der Technik bekannt, einschließlich beispielsweise Kochsalzlösung. Verabreichungswege,
Mengen und Verabreichungshäufigkeit,
um in einem Empfänger
schützende
Immunität
zu erreichen, sind dem Fachmann bekannt. Verabreichungswege beinhalten
jedes Verfahren, mit dem der humane Empfänger mit schützender
Immunität
ausgestattet wird, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Inhalieren, intravenöse,
intramuskuläre,
intraperitoneale, intradermale und subkutane Verabreichung. Vorzugsweise
wird das erfindungsgemäße kombinierte
Antigen einem Menschen durch subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht.
Ein Mengenbereich und eine Verabreichungsfrequenz ist verträglich, solange
wie eine schützende Immunität für den Empfänger erreicht
wird. Beispielsweise können
5 bis 20 μg
durch intramuskuläre
Injektion verabreicht werden, wobei die Injektionen 2 bis 4 Mal über einen
Dreimonatszeitraum erfolgen.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele sollen den Fachmann mit einer vollständigen Offenbarung
und Beschreibung, wie die erfindungsgemäßen Assays zu machen und zu
verwenden sind, ausstatten, und sollen nicht den Umfang dessen begrenzen,
was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten. Es wurden Anstrengungen
unternommen, um im Bezug auf die verwendeten Zahlen (z.B. Mengen,
Temperaturen, etc.) Genauigkeit sicherzustellen, aber es sollten
auch einige experimentelle Fehler und Abweichungen in Betracht gezogen
werden. Wenn nicht anders angegeben, ist die Temperatur in Grad
Celsius, das Molekulargewicht als durchschnittliches Molekulargewicht
angegeben, und der Druck ist der atmosphärische Druck oder in der Nähe des atmosphärischen Drucks.
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Beispiel 1. Herstellung
eines Vektors, der einen Teil von ppUL80 von HCMV (Town-Stamm) als
eine Fusion mit sechs Histidinen exprimiert.
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Bakterienstämme. Alle
DNA-Klonierungsstudien wurden unter Verwendung des Escherichia coli-Stamms
DH5α unternommen.
Proteinexpressionsexperimente wurden mit E. coli BL21 (DE3) plysS
ausgeführt.
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Proteinexpression
und Aufreinigung. Bakterien wurden in TB-Medium mit Ampicillin und
Chloramphenicol bis zu einer OD600 von 1,0
kultiviert, wonach die Proteinexpression durch Hinzugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
(IPTG) in einer Konzentration von 0,1 mM induziert wurde. Es wurde
eine Ein-Schritt-Affinitätschromatographie
von 6 Histidin (6H)-Fusionsproteinen über Ni2+-chelierende Sepharose (Probond, Invitrogen),
im Wesentlichen wie es von den Herstellern des Säulenmaterials beschrieben ist,
ausgeführt.
Immunoblots und ELISA-Experimente wurden unter Verwendung von Standardtechniken
ausgeführt.
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DNA-Fragment.
Das DNA-Fragment, das einen Teil des ppUL80-Proteins von HCMV (Town-Stamm) kodiert,
wurde mittels PCR-Amplifikation erzeugt. Um Oligonukleotide für die PCR
zu entwickeln, mussten wir zunächst
die DNA-Sequenz eines Teils des UL80-Gens des Town-Stamms bestimmen.
Zu diesem Zweck wurden zwei Oligonukleotide erzeugt, die mit der
UL80-Sequenz des AD169-Stamms von HCMV homolog sind. Diese Oligonukleotide
haben die folgende Sequenz:
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Die
in Fettdruck dargestellten Sequenzen von ppUL80-N-EI sind zu den
Nukleotiden 116475 bis 116493 von HCMV AD169 identisch, und die
Sequenzen von ppUL80-C-EI sind komplementär zu den Nukleotiden 117363
bis 117386. Die kursiv gedruckten Sequenzen stellen eine Erkennungsstelle
für die
Restriktionsendonuklease EcoRI dar. Die Oligonukleotide wurden in
einer PCR verwendet (1 Zyklus: 5 Min bei 94°C; 30 Zyklen: 1 Min bei 94°C, 1 Min
bei 55°C,
1 Min bei 72°C;
1 Zyklus: 10 Min bei 72°C)
mit DNA des HCMV-Town-Stamms als Matrize. Das resultierende PCR-Produkt
wurde kloniert und sequenziert. Basierend auf dieser Sequenz wurden
Town-Stamm-spezifische Oligonukleotide entworfen, die verwendet
wurden, um einen Teil des Town-UL80-Gens zu amplifizieren. Um die
Klonierung zu erleichtern, wurden EcoRI-Restriktionsendonuklease-Schnittstellen
in die DNA-Primer eingeführt;
diese EcoRI-Stellen sind unten in Kursivschrift angegeben. Die Sequenzen
der Primer sind:
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Die
in Fettdruck dargestellten Nukleotide von ppUL80-N2-EI entsprechen
den Nukleotiden 116497 bis 116515 von HCMV AD169, und den Nukleotiden
117259 bis 117278 für
ppUL80-C2-EI. Nach Amplifikation wurde das PCR-Produkt aufgereinigt,
mit EcoRI verdaut und in die EcoRI-Stelle des Vektors pRSET B (Invitrogen)
kloniert. In dem resultierenden Plasmid liegt das UL80-Genfragment
am 3'-Ende und im
Leseraster mit einem Fragment, das sechs Histidine (6H) kodiert,
vor.
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Beispiel 2. Herstellung
eines Vektors, der einen Teil von ppUL83 von HCMV (Town-Stamm) als
eine Fusion mit sechs Histidinen exprimiert.
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Das
DNA-Fragment, das einen Teil des ppUL83-Proteins von HCMV (Town-Stamm)
kodiert, wurde mittels PCR erzeugt. Es wurden Oligonukleotide entwickelt,
die mit der Sequenz des Town-UL82-Gens (Pande et al. (1991) Virology
182: 220–228)
homolog sind. In die DNA-Primer
wurden BamHI-Restriktionsendonuklease-Spaltungsstellen eingeführt; diese
Stellen sind unten in Kursivschrift angegeben. Die Sequenzen der
Primer sind:
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Die
in Fettdruck dargestellten Sequenzen von ppUL83-N-BI sind identisch
zu den Nukleotiden 855 bis 871 der ppUL83-Gensequenz. Die in Fettdruck
dargestellte Sequenz von ppUL83-C-BI ist komplementär zu den
Nukleotiden 1380 bis 1396 der ppUL83-Gensequenz. Nach PCR-Amplifikation,
wurde das PCR-Produkt aufgereinigt, mit BamHI verdaut und in die
BglII-Stelle des Vektors pRSET C (Invitrogen) kloniert. In dem resultierenden
Plasmid liegt das UL82-Genfragment am 3'-Ende und im Leseraster mit einem Fragment
vor, das 6H kodiert.
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Beispiel 3. Herstellung
eines Vektors, der einen Teil von ppUL32 von HCMV (Town-Stamm) als
eine Fusion mit sechs Histidinen exprimiert.
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Das
DNA-Fragment, das einen Teil des ppUL32-Proteins von HCMV (Town-Stamm)
kodiert, wurde mittels PCR, ähnlich
wie es für
die Klonierung eines Teils des UL80-Gens beschrieben ist (siehe
oben), erzeugt. Oligonukleotide für die PCR wurden erst nach
Sequenzierung eines Teils des UL32-Gens des Town-Stamms entwickelt.
Zu diesem Zweck wurden zwei Oligonukleotide erzeugt, die mit UL32-Sequenzen des
AD169-Stamms von HCMV homolog sind. Die Sequenzen dieser Oligonukleotide
sind:
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Die
kursiv gedruckten Sequenzen stellen HindIII-Spaltungsstellen dar.
Die in Fettdruck dargestellten Sequenzen von ppUL32-N-HIII sind
zu den Nukleotiden 40288 bis 40306 von HCMV AD169 komplementär, und identisch
zu den Nukleotiden 39783 bis 39804 für ppUL32-C-HIII. Die PCR wurde mit DNA des HCMV-Town-Stamms
als Matrize ausgeführt.
Das resultierende PCR-Produkt wurde kloniert und sequenziert. Basierend
auf dieser Sequenz wurden Town-Stamm-spezifische Oligonukleotide
entwickelt, die anschließend verwendet
wurden, um einen Teil des Town-UL32-Gens zu amplifizieren. HindIII
Restriktionsendonuklease-Spaltungsstellen wurden in die Primer eingeführt; diese
Stellen sind in der unten gezeigten Sequenz in Kursivschrift dargestellt.
Die Sequenzen der Primer sind:
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Die
in Fettdruck dargestellten Nukleotide von ppUL32-N2-HIII entsprechen
den Nukleotiden 40244 bis 40262 von HCMV AD169 und den Nukleotiden
39850 bis 39874 für
ppUL32-C2-HIII. Nach Amplifikation wurde das PCR-Produkt aufgereinigt,
mit HindIII gespalten und in die HindIII-Stelle des Vektors pRSET
B (Invitrogen) kloniert. Im resultierenden Plasmid liegt das UL32-Genfragment
am 3'-Ende und im
Leseraster mit einem Fragment vor, das 6 Histidine kodiert.
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Beispiel 4. Herstellung
eines Vektors, der Teile von ppUL83, ppUL80 und ppUL32 von HCMV
(Town-Stamm) als Fusionen mit 6H im Leseraster exprimiert.
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Um
ein Plasmid zu erzeugen, das ein Fusionsprotein mit 6H und Teilen
von ppUL83, ppUL80 und ppUL32 exprimiert, wurden die DNA-Fragmente,
die ppUL80 und ppUL32 kodieren, in die EcoRI- bzw. HindIII-Stellen
des Plasmids inseriert, das den 6H-ppUL83 offenen Leseraster enthält (siehe
Beispiel 2 oben). Das resultierende Nukleinsäurekonstrukt enthält eine
Leseraster-Fusion des offenen Leserasters von 6H-ppUL83 und Teilen
der ppUL80- und ppUL32-Gene, die oben beschrieben wurden. Die Aminosäuresequenz
(SEQ ID NR:12), die dem Nukleinsäurekonstrukt
des erfindungsgemäßen kombinierten
Antigens (SEQ ID NR:11) entspricht, ist in den 1A bis 1B gezeigt.
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Beispiel 5. Sensitiver
Assay für
HCMV-Antikörper
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Das
kombinierte Antigen kann in einem enzymgebundenen Immunosorbent-Assay
(ELISA) als Antigen verwendet werden, das an eine feste Trägerphase
adsorbiert ist oder in einem Kompetitionsassay, in dem bekannte
spezifische Antikörper
mit Antikörpern,
die im Serum des Patienten vorliegen, um spezifische Epitope auf
dem kombinierten Antigen kompetitieren. Das kombinierte Antigen
kann auch an ein Nachweissystem konjugiert werden, wie Enzyme, um
Serumantikörper
nachzuweisen, die im Serum des Patienten vorliegen können. Ein
wichtiger Vorteil, der durch die Verwendung des erfindungsgemäßen kombinierten
Antigens bereitgestellt wird, besteht darin, dass in dem Nachweissystem
gleichzeitig gleiche molare Mengen jedes dieser drei immundominanten
Antigene vorliegen, was in einer verbesserten Sensitivität des vorliegenden
Assays resultiert.
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