DE69534945T2

DE69534945T2 - Impfstoff für die infektiöse peritonitis der katzen

Info

Publication number: DE69534945T2
Application number: DE69534945T
Authority: DE
Inventors: Raphail Darteil; Wayne Staten Island CORAPI; Jean-Chirstophe Audonnet; Gilles-Emile Chappuis
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1994-08-29
Filing date: 1995-08-28
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2015-08-29
Also published as: CA2198743C; DE69534945D1; FR2724385B1; WO1996006934A1; ES2264128T3; CA2198743A1; FR2724385A1; AU3261295A; US6358512B1; US6080850A; BR9508645B1; DK0778894T3; EP0778894B1; BR9508645A; US6096535A; AU686000B2; PT778894E; ATE323767T1; JPH10505236A; EP0778894A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Impfstoffe gegen die infektiöse Katzenperitonitis (PIF), die ausgehend von dem SPIKE(S)-Glycoprotein des PIF-Virus hergestellt werden, dessen wichtigste infektionsfördernde Epitope durch Mutagenese modifiziert wurden. Diese Impfstoffe ermöglichen einen Schutz der geimpften Katzen gegen PIF ohne bei letzteren das Infektionsförderungsphänomen hervorzurufen, das zu einer beschleunigten Entwicklung der Krankheit führt.
Stand der Technik
Das Virus der infektiösen Katzenperitonitis (FIPV = Feline Infectious Peritonitis Virus) ist ein Positiveinzelstrang-RNA-Virus mit Hülle, das in der Familie der Coronaviridae der antigenischen Gruppe angehört, die das enterische Katzen-Coronavirus (FECV), das Hunde-Coronavirus (CCV), das Virus der übertragbaren Schweine-Gastroenteritis (TGEV) und das respiratorische Schweine-Coronavirus (PRCV) umfasst (Sanchez C. et al. Virology, 1990, 174, 410-417). Dieses Virus ruft eine komplexe und bei Katzen immer tödliche Krankheit hervor, die unter der Bezeichnung infektiöse Katzenperitonitis (PIF) bekannt ist. Das PIF-Virus fällt unter den Coronaviren auf, da es bei der Katze zum Auftreten von Antikörpern führt, die die Infektion durch das Virus fördern und die Entwicklung der Krankheit beschleunigen. Katzen, die nach einer natürlichen Vorinfektion durch dieses Virus, nach einer passiven Antikörper-Übertragung oder nach einer Impfung neutralisierende Anti-FIPV-Antikörper aufweisen, entwickeln sehr häufig eine sehr viel intensivere und sehr viel schnellere Erkrankung als diejenigen Katzen, die erstmalig einfach in Abwesenheit von spezifischen Antikörpern infiziert wurden (Pedersen N. und Boyle J., Am. J. Vet. Res. 1980, 41, 868-876; Weiss R. et al., Comp. Immunol. Microb. Infect. Dis. 1981, 4, 175-189; Weiss R. et al., Am. J. Vet. Res. 1980, 41, 663-671). Man geht davon aus, dass das Binden der Antikörper-Virus-Immunkomplexe an die an der Oberfläche von Makrophagen vorhandenen Fc-Rezeptoren den Mechanismus darstellt, der den beschleunigten Eintritt des Virus in die Zellen und seine schnelle Ausbreitung innerhalb des Organismus begünstigt (Porterfield, J. Advances in Virus research, 1986, 31, 335-355; Weiss et al. 1981). Dieses Infektionsförderungsphänomen wurde bei Coronaviren nur mit dem PIF-Virus festgestellt.
Das PIF-Virus umfasst drei Strukturproteine. Das größenmäßig bedeutendste ist das "SPIKE" oder Nadelprotein (S). Dieses Protein S ist stark glycosyliert, und gerade es induziert bei der Katze gleichzeitig neutralisierende und infektionsfördernde Antikörper. In vitro Untersuchungen, die mit monoklonalen neutralisierenden Antikörpern gegen das PIF-Virus durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass die wichtigsten neutralisierenden Epitope alle auf dem Glycoprotein S liegen und dass sie weitgehend den an dem Infektionsförderungsphänomen beteiligten Epitopen entsprechen (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965).
Eine wirksame Impfung gegen PIF sollte zum Auftreten von neutralisierenden Antikörpern führen, ohne dass es zu einer Induktion von infektionsfördernden Antikörpern kommt. Bisher konnte ein solcher Impfstoff nicht hergestellt werden. Die rekombinanten Impfstoffe, die nicht das Glycoprotein S enthalten, können wahrscheinlich die beste Alternative für die zukünftigen PIF-Impfstoffe darstellen, allerdings tragen diese Antigene nur teilweise zur Induktion der neutralisierenden Antwort gegen das PIF-Virus bei. Von den drei viralen Strukturantigenen ist allein das Glycoprotein S in der Lage, eine nennenswerte neutralisierende Antwort auszulösen. Leider induziert dieses Glycoprotein auch das gleichzeitige Auftreten von infektionsfördernden Antikörpern. Trotz seiner Bedeutung bei der Auslösung einer brauchbaren neutralisierenden Antwort (und demnach bei der protektiven Antwort) spielt das natürliche Glycoprotein S bei dem Infektionsförderungsphänomen von PIF anscheinend eine wesentliche Rolle und kann daher derzeit nicht zur Herstellung von Impfstoffen verwendet werden, die den vorstehend dargelegten Kriterien gehorchen.
Die Lokalisierung und Charakterisierung der auf S vorhandenen Epitope und insbesondere derjenigen, die für die Neutralisation und die Infektionsförderung verantwortlich sind, ist demnach zur Bestimmung der dem Glycoprotein S (oder dem Gen, das für dieses Protein codiert) zuzufügenden Modifizierungen notwendig, um daraus ein wirksames Immunogen für die Impfung von Katzen gegen PIF herzustellen. Die Nucleotidsequenz und die Proteinsequenz des Glycoproteins S des PIF-Virus wurden bereits bestimmt (de Groot R. et al., EP-A-0 264 979). Diese Patentanmeldung lehrt nicht, wie die neutralisierenden Epitope und/oder die infektionsfördernden Epitope auf S identifiziert werden. Das Dokument lehrt auch nicht, wie die Sequenz von S zur Herstellung eines wirksamen und nicht-infektionsfördernden Impfstoffs gegen PIF zu verwenden ist.
Die PCT-Patentanmeldung WO-A-93/23421 beansprucht die Verwendung eines verkürzten Glycoproteins S oder einer Nucleinsäuresequenz, die nur für einen Teil von S codiert. Insbesondere wird die sehr konservierte Region, die am Carboxy-terminalen Ende von S liegt (die 124 letzten Aminosäuren), zur Herstellung eines "universellen" Impfstoffs gegen die Coronaviren beansprucht. Dieses Dokument ist sehr allgemein und lehrt nicht, wie ein PIF-Impfstoff herzustellen ist, der bei der Katze keine infektionsfördernden Antikörper auslöst. Selbiges gilt für die PCT-Patentanmeldung WO-A-93/23422, die Mischkonstruktionen von chimärem Glycoprotein S, FECV-FIPV, beschreibt, die FIPV S-Fragmente 542-597, 594-1454 oder 651-1454 einschließen.
Die PCT-Patentanmeldung WO-A-92/08487 beansprucht die Verwendung von verschiedenen ausgewählten Peptiden des S-Proteins oder Peptiden, die von den S-Genen verschiedener FIPV-Virusstämme oder von der Sequenz des S-Gens von FECV codiert werden, zum Zweck der Diagnose, Behandlung oder Prävention von PIF bei der Katze. Insbesondere wird das Peptid 598-615 der Protein Sequenz von S des FIPV-Virus, Stamm 79-1146, zur Verwendung in Form eines Fusionsproteins mit Galactokinase beansprucht, wobei das rekombinante Protein anschließend zur Diagnose von Anti-PIF-Antikörpern bei infizierten Katzen oder als rekombinanter Impfstoff zur Auslösung eines Schutzes gegen PIF bei Katzen verwendet werden kann. Obgleich Variationen in den beanspruchten Peptidsequenzen betrachtet werden, lehrt dieses Dokument nicht genau, welche Änderungen in den vorgeschlagenen Sequenzen erfolgen müssen, und lehrt auch nicht, wie ein nicht-infektionsfördernder PIF-Impfstoff herzustellen ist, und auch nicht, welches die Regionen des Glycoproteins S sind, die an diesem Phänomen beteiligt sind.
Die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlichte Patentanmeldung GB-A-2282601 schlägt die Herstellung eines Impfstoffs auf der Grundlage von einem Protein S vor, das zur Vermeidung der Infektionsförderung durch Modifizierung oder Deletion von mindestens einer der antigenischen Stellen, die mit D (entsprechend den Aminosäuren 496-524), A1 (entsprechend den Aminosäuren 531-555), und A2 (entsprechend den Aminosäuren 584-604) bezeichnet sind, so modifiziert wurde, dass diese Stellen antigenisch inaktiv gemacht wurden.
Große Anstrengungen wurden unternommen, um die wichtigsten antigenischen Stellen auf den S-Proteinen des TGEV-Virus (Transmissible Gastro-Enteritis Virus) (Correa I. et al., J. Gen. Virol. 1990, 71, 271-279; Delmas B. et al., J. Gen. Virol. 1990, 71, 1313-1323), des BCV (Bovine Corona Virus) (Yoo D. et al., Virology 1991, 183, 91-98), des MHV (Mouse Hepatitis Virus) (Takase-Yoden S. et al., Virus Res. 1990, 18, 99-108; Stuhler A. et al., J. Gen Virol. 1991, 72, 1655-1658) und des FIPV (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965; Olsen C. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 745-749) zu identifizieren. In sämtlichen Fällen wurden mehrere neutralisierende Domänen identifiziert, und die immundominanten Domänen waren im Allgemeinen auf dem S1-Teil des Proteins lokalisiert.
Untersuchungen, die sich spezifisch mit dem PIF-Virus befassen, haben die Existenz von Epitopen auf dem Protein S gezeigt, die gleichzeitig eine neutralisierende und eine infektionsfördernde Antwort gegenüber der Infektion mit FIPV auslösen (Corapi W. et al., J. Virol 1992, 66, 6695-6705; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965; Olsen C. et al., J. Gen. Virol. 1993, 74, 745-749). Dieselben Autoren haben gezeigt, dass die neutralisierenden und infektionsfördernden monoklonalen Antikörper mit Anti-S-Spezifität in 6 Hauptgruppen unterteilt werden können, je nach ihrem Vermögen, verschiedene PIF-Virusstämme und verschiedene Mutanten, die gegenüber der Neutralisation durch diese monoklonalen Antikörper resistent sind ("mar"-Mutanten (resistent gegenüber monoklonalen Antikörpern)), zu erkennen. Gleichwohl wurden die Epitope, die den wichtigsten antigenischen Regionen auf dem S von FIPV entsprechen, noch nicht charakterisiert. Alle von diesen Autoren (Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965) beschriebenen monoklonalen nicht-neutralisierenden Antikörper sind bei einem in vitro Infektionsförderungstest zudem nicht infektionsfördernd, was die Hypothese einer engen Beziehung zwischen Neutralisation und Infektionsförderung im Falle des PIF-Virus untermauert. Die Förderung der viralen Infektion durch Antikörper erfolgt, wenn die Monozyten oder die Makrophagen durch die Immunkomplexe durch eine von spezifischen Rezeptoren abhängige Endozytose wirksamer infiziert werden als durch das Virus allein. Trotz aller Untersuchungen, die im Hinblick auf das von den Antikörpern abhängige Infektionsförderungsphänomen durchgeführt wurden, bleiben zahlreiche Antworten unbeantwortet. Insbesondere weiß man nicht, welches die spezifischen viralen Bestandteile sind, die jeweils für die Infektionsförderung des Virus verantwortlich sind. Die bis jetzt an FIPV durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass die Infektionsförderung im Wesentlichen von Epitopen abhängt, die auf S vorhanden sind (Olsen C. et al., 1993; Vennema N. et al., J. Virol. 1990, 64, 1407-1409).
Hohdatsu T. et al., (Arch. Virol. 1991, 120, 207-217) haben gefunden, dass monoklonale Anti-FIPV M-Antikörper eine Förderung der Infektion in vitro auslösen konnten. In vivo wurde dies bei Untersuchungen, die mit rekombinantem Impfstoff/FIPV M und Impfstoff/FIPV N durchgeführt wurden, nicht bestätigt. Durch die Immunisierung von Katzen mit diesen beiden Rekombinanten ließ sich keine durch das eine oder das andere von diesen beiden Proteinen ausgelöste Infektionsförderung feststellen (Vennema N. et al. 1990). Wenn M und N bei der Infektionsförderung eine Rolle spielen, erfolgt dies sicherlich zu einem sehr untergeordneten Grad gegenüber derjenigen, die von S gespielt wird. Während der mit den verschiedenen Virussystemen durchgeführten Untersuchungen, bei denen die Infektionsförderung beobachtet werden konnte, wurde eine reproduzierbare Tatsache gezeigt: einzelne Epitope sind in der Lage, gleichzeitig neutralisierende Antikörper und infektionsfördernde Antikörper auszulösen. Dies wurde für FIPV (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965; Hohdatsu T. et al., Arch. Virol. 1991, 120, 207-217), für das Denguevirus (Morens D. und Halstead S., J. Gen. Virol. 1990, 71, 2909-2917) und für HIV (Robinson W. Jr., J. Virol. 1991, 65, 4169-4176) gezeigt.
Die jüngsten Ergebnisse der mit PIF-Testimpfstoffen durchgeführten Tests liefern anscheinend das bisher stichhaltigste Argument für die Existenz einer direkten Beziehung zwischen der in vitro festgestellten Infektionsförderung und der in vivo bei der Katze beschleunigten Krankheit. Das Impfen von Katzen mit Rekombinanten des Virus des Impfstoffs, die das Protein S des Stamms FIPV 79-1146 exprimieren, sensibilisiert die Katzen und löst nach der Provokation bei den geimpften Katzen im Verhältnis zu nicht geimpft Kontrollkatzen eine beschleunigte Krankheit aus (Vennema H. et al., J. Virol. 1990, 64, 1407-1409). Die Impfung mit Impfstoff-Rekombinanten, die entweder das Protein M oder das Protein N exprimieren, hat die Katzen nicht für eine beschleunigte Krankheit prädisponiert. Diese Ergebnisse in vivo sind den Ergebnissen in vitro gegenüberzustellen, die eine überwiegende Lokalisierung von infektionsfördernden Epitopen auf S zeigen (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705; Olsen C. et al., J. Virol. 1992, 66, 956-965). Ferner haben neuere Experimente, die zum Studium der Wirksamkeit eines anderen Impfstoffkandidaten für PIF durchgeführt wurden, eine statistisch signifikante Korrelation zwischen dem Vermögen eines Katzenserums zur Auslösung einer Infektionsförderung in vitro und der Entwicklung einer beschleunigten Krankheit bei derselben Katze gezeigt (Olsen C., Vet. Microb. 1993, 36, 1-37).
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Charakterisierung von Epitopen, die an der Förderung der Infektion durch das PIF-Virus beteiligt sind. Die genaue Kenntnis der Molekülstrukturen, die für den Infektionsförderungsmechanismus verantwortlich sind, gestattet die Konzeption von Antigenen, die kein Auftreten von infektionsfördernden Antikörpern auslösen. Diese Antigene sind die wesentlichen Bestandteile eines wirksamen PIF-Impfstoffs.
Auf überraschende Weise wurde durch Analyse der Sequenz des S-Gens von FIPV-Virus-Mutanten, die resistent sind gegenüber der Neutralisation durch neutralisierende und infektionsfördernde Antikörper oder gegenüber monoklonalen nur neutralisierenden und nicht-infektionsfördernden Antikörpern, festgestellt, dass es möglich war, den Auslösungsmechanismus der Infektionsförderung durch das Glycoprotein S einzukreisen. Zwei wichtige antigenische Stellen wurden mit den untersuchten monoklonalen Antikörpern charakterisiert: A1 und A2. Diese Stellen liegen überraschenderweise alle beide in derselben Region des S-Proteins. Es scheint, dass die stark neutralisierenden und infektionsfördernden Antikörper die beiden Stellen gleichzeitig erkennen. Diese Information legt nahe, dass das gleichzeitige Binden der beiden Epitope durch ein und denselben Antikörper eine direkte Rolle bei der Infektionsförderung spielt. In der Tat wurde gleichzeitig mit dieser ersten Entdeckung die Feststellung gemacht, dass die neutralisierenden, allerdings nicht-infektionsfördernden Antikörper nur die A2-Stelle erkennen. Demnach beruht die Infektionsförderung auf einer Konformationsänderung durch Annäherung zwischen den beiden Epitopen A1 und A2. Die A2-Region umfasst die Aminosäuren 637-662 auf der Proteinsequenz von S (De Groot R. et al., J. Gen. Virol. 1987, 68, 2639-2646). Die hydrophile Natur dieser Region und die Tatsache, dass die 3 getesteten monoklonalen Antikörper alle diese kleine Domäne erkennen, legt nahe, dass A2 ein dominierendes neutralisierendes Epitop des S-Proteins ist. Ferner legt die gezeigte enge Homologie zwischen der A1-Stelle und einem Teil der Unterstelle Aa, die auf dem Protein S von TGEV identifiziert wurde (Gebauer F. et al., Virology 1991, 183, 225-238), nahe, dass A1, das die Aminosäuren 562-598 umfasst, ebenfalls ein wichtiges neutralisierendes Epitop für das FIPV-Virus sein muss.
Die Annäherung oder die gleichzeitige Bindung der Stellen A1 und A2 durch ein und denselben Antikörper ist zur Auslösung der Infektionsförderung durch die Antikörper notwendig.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Modifizierung durch Gentechnik der Sequenz des FIPV S-Gens in der Region der A1- und/oder A2-Stellen, insbesondere die Modifizierung von mindestens einer der beiden Stellen, vorzugsweise der A1-Stelle, derart, dass das exprimierte Protein ein modifiziertes Epitop so präsentiert, dass es keine infektionsfördernden Antikörper mehr auslöst, und/oder der A2-Stelle. Die A1-Region kann auf verschiedene Arten mit Mitteln, die dem Fachmann gut bekannt sind, modifiziert werden. Die Stellen A1 oder A2 können unabhängig oder gleichzeitig modifiziert werden.
Die Modifizierung der A2-Stelle kann in einer Modifizierung, wie einer totalen Deletion, die einen Antigenitätsverlust der Stelle zur Folge hat, bestehen, allerdings ist es bevorzugt, dass, wie für die A1-Stelle, die Modifizierung ein derart modifiziertes Epitop exprimiert, dass das Protein keine infektionsfördernden Antikörper mehr induziert.
Die Region A1 weist einen gemeinsamen Teil mit der Region auf, die in der Patentanmeldung GB-A-2282601 (WO-A-95/07987), vorstehend zitiert, als "A2" bezeichnet wird, allerdings sieht diese, im Gegensatz zu der Erfindung, Mutationen (Modifizierungen) oder Deletionen vor, die einen Antigenitätsverlust der modifizierten oder deletierten Region zur Folge haben.
Demnach hat die Erfindung insbesondere eine Nucleotidsequenz zum Gegenstand, die das komplette FIPV S-Gen umfasst; das mindestens eine Modifizierung, vorzugsweise eine Mutation und/oder begrenzte Deletion, in der antigenischen Region A2, die die Aminosäuren 637 bis 662 codiert, und/oder in der antigenischen Region A1, die die Aminosäuren 562-598 codiert, aufweist, mit der Ausnahme, zumindest für die A1-Stelle, einer totalen Deletion oder einer großen Mutation oder Deletion mit den gleichen Folgen wie eine totale Deletion, nämlich ein Verlust der Antigenität der modifizierten Region.
Die vorliegende Anmeldung beschränkt sich demnach nun auf den Teil der Erfindung, der die Modifizierungen betrifft, durch die sich die Auslösung von infektionsfördernden Antikörpern unterdrücken lässt, ohne die Antigenität, zumindest für die A1-Stelle, zu unterdrücken.
Natürlich umfasst die Expression einer Nucleotidsequenz, die das komplette FIPV S-Gen einschließt, die FIPV-Stämme vom Typ 1 und Typ 2 sowie die Varianten und die Sequenzen, die sekundäre Variationen aufweisen, d.h. die die Immunogenizität des Proteins S nicht beeinflussen, was auch sekundäre Mutationen und Deletionen außerhalb von den Stellen A1 und A2 einschließt. Vorzugsweise dürfen die Variationen der Sequenz nicht die Funktionalität des Glycoproteins S modifizieren.
Demnach umfasst dies die Sequenzen, die einen erhöhten Homologiegrad mit den vorhergehenden Sequenzen aufweisen, wobei, unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes, darin eingeschlossen ist, dass diese Homologie groß genug ist, damit sich durch das exprimierte Polypeptid ein wirksamer Impfschutz induzieren lässt.
Unter begrenzter Deletion wird vorzugsweise eine Punktdeletion (entsprechend 1 Aminosäure) oder eine Mikrodeletion (bis zu 6 Aminosäuren) verstanden.
Im Allgemeinen werden Mutationen oder Deletionen von Kodons vermieden, die für die in A1 und A2 liegenden Cysteine codieren.
Darüber hinaus werden Punktmutationen und an zweiter Stelle Punktdeletionen (außer Cys) gegenüber ausgedehnteren Mutationen und Deletionen bevorzugt.
Für die A1-Stelle umfassen die Modifizierungen a minima eine Mutation für mindestens eines und vorzugsweise für beide der zwei Kodons, die für Asp 568 und für Asp 591 codieren, um eine beliebige andere Aminosäure in diesen Positionen zu haben. Unter der Bedingung, dass die Aminosäuren 568 und 591 nicht Asp sind, kann jede andere Aminosäure in der Region 562-598 durch die natürliche Aminosäure der betrachteten Position substituiert werden.
Die Modifizierungen der A1-Stelle umfassen auch begrenzte Deletionen dieser Region, die die Aminosäuren 568 und/oder 591 umfassen.
Für die A2-Stelle umfassen die Modifizierungen a minima eine Mutation für mindestens eines und vorzugsweise für die drei der Kodons, die für Asp 643, Arg 649 und Arg 656 codieren, um eine beliebige andere Aminosäure in diesen Positionen zu haben. Die Modifizierungen der A2-Stelle umfassen auch die totale Deletion oder die partiellen Deletionen dieser Region, die die Aminosäuren 643, 649 und/oder 656 umfassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von so modifizierten FIPV-Genen zur Expression in vitro von rekombinanten FIPV S-Proteinen und zur Herstellung von gereinigten Untereinheitimpfstoffen zur Impfung von Katzen gegen PIF.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von so modifizierten FIPV S-Genen zur Konstruktion von rekombinanten viralen Vektoren, die diese modifizierten Gene exprimieren. Diese viralen Vektoren können replikative rekombinante Viren oder nicht-replikative rekombinante Viren und insbesondere Pockenviren (Beispiel: Virus des Impfstoffs und seine Derivate, Canarypoxvirus, ...), Herpesviren (insbesondere Katzenherpesvirus) oder Adenoviren sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Impfstoffen gegen PIF mit diesen rekombinanten Viren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Immunisierung von Katzen gegen PIF mit Plasmiden, die die FIPV S-Gene enthalten, die erfindungsgemäß modifiziert sind und unter der Kontrolle eines starken Promotors (beispielsweise HCMV IE, SV40, etc.) und von Transkriptions- und Translations-Regulationssignalen angeordnet sind. Die Plasmide befinden sich in einem Träger, der die direkte Injektion bei der Katze, insbesondere die intramuskuläre, ermöglicht. Insbesondere handelt es sich um nackte Plasmide, wie in der internationalen Patentanmeldung WO 90/11092 beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist schließlich die Herstellung von Impfstoffen gegen PIF, umfassend ein oder mehrere FIPV S-Proteine, die erfindungsgemäß modifiziert sind und vorzugsweise mit anderen Proteinen des FIPV-Virus assoziiert ist, wie beispielsweise dem Protein M.
Eine weitere Impf-Möglichkeit besteht in der Verwendung von Zellen (insbesondere felinen Ursprungs), die das Glycoprotein S erfindungsgemäß konstitutiv exprimieren.
Beispiele:
Beispiel 1: Klonierung und Expression von Fragmenten des FIPV S-Gens
Zum Zweck der Lokalisierung der Region des FIPV S-Gens, die für die Neutralisation und die Infektionsförderung verantwortlich ist, wurde die Klonierung von überlappenden Fragmenten des FIPV S-Gens so vorgenommen, dass diese Fragmente in Form von Fusionsproteinen mit dem Protein des Gens 10 des Phagen T7 exprimiert wurden. Die Sequenz der Oligunucleotide zur Amplifikation der verschiedenen Fragmente wurde so gewählt, dass die Gesamtheit der codierenden Region des S-Gens durch drei große Fragmente von ungefähr 1600 Basenpaaren (bp) und 12 kleinere Subfragmente von ungefähr 400-500 bp abgedeckt wurde. Diese Oligonucleotide enthielten die Restriktionsstellen BamHI, XbaI oder XhoI zur Begünstigung ihrer Klonierung. Die reverse Transkription der RNA und die Amplifikation der komplementären DNA durch eine Polymerasekettenamplifizierungsreaktion wurden nach Standardtechniken (Sambrook J. et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) durchgeführt. Die amplifizierte DNA wurde durch die geeigneten Enzyme verdaut und in den pBluescript-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA.) kloniert.
Die Grenzen der verschiedenen Fragmente, die ausgehend von dem S-Gen des Stammes 79-1146 des FIPV-Virus kloniert wurden, sind nachstehend angegeben: (sämtliche Positionen beziehen sich auf die Sequenz des S-Gens des Stammes FIPV 79-1146, veröffentlicht von De Groot R. et al. (J. Gen. Virol. 1987, 68, 2639-2646).
Fragment F1: Nucleotide 70 bis 1736.
Fragment F2: Nucleotide 1519 bis 3160.
Fragment F3: Nucleotide 2773 bis 4428.
Fragment S1: Nucleotide 70-535.
Fragment S2: Nucleotide 394-862.
Fragment S3: Nucleotide 742-1221.
Fragment S4: Nucleotide 1045-1539.
Fragment S5: Nucleotide 1339-1734.
Fragment S6: Nucleotide 1594-2089.
Fragment S7: Nucleotide 1963-2443.
Fragment S8: Nucleotide 2296-2838.
Fragment S9: Nucleotide 2743-3004.
Fragment S10: Nucleotide 2890-3506.
Fragment S11: Nucleotide 3352-4063.
Fragment S12: Nucleotide 3895-4428.
Anschließend wurden die verschiedenen klonierten FIPV-Fragmente aus den Bluescript-Klonen durch NotI- und XhoI-Verdau isoliert und sodann für den Transkriptions- und Translationsschritt in vitro in den Vektor pTOPE-SX rekloniert.
Die Konstruktion von pTOPE-SX ist nachstehend beschrieben:
Das Plasmid pTOPE-1b(+) (Novagen) enthält den T7-Promotor und einen Teil des Gens 10 des T7-Phagen, gefolgt von einem Polylinker. Dieser Polylinker wurde durch Verdau mit den Restriktionsenzymen SacII und XhoI komplett eliminiert und durch das Fragment SacII-XhoI von 82 bp, isoliert aus dem in pBluescript enthaltenen Polylinker, ersetzt. Diesem Fragment wurde ein ergänzendes Nucleotid so zugefügt, dass sämtliche in pBluescript klonierten FIPV-Fragmente in das gleiche Leseraster wie das Gen 10 gebracht wurden. Das neue Plasmid wurde pTOPE-SX genannt. Durch die in vitro Transkription und Translation der in pTOPE-SX enthaltenen Inserts mit der RNA-Polymerase des Phagen T7 lassen sich Fusionsproteine erhalten, die 260 Aminosäuren des Proteins des Gens 10 enthalten, gefolgt von Aminosäuren, die von den FIPV-Inserts codiert wurden.
Beispiel 2: Erkennung von FIPV S-Peptiden durch die monoklonalen Antikörper
Zur Lokalisierung der allgemeinen Region des S-Gens des FIPV-Virus, welche für die Neutralisation und Infektionsförderung verantwortlich ist, wurden überlappende Fragmente dieses Gens durch PCR in den pBluescript-Vektor in Form von 3 großen Fragmenten (F1, F2 und F3; 1) und von 12 kleinen Subfragmenten (S1 bis S12) kloniert. Diese FIPV-Inserts wurden anschließend im Hinblick auf ihre in vitro Transkription und Translation in den Vektor pTOPE-SX subkloniert.
Die gekoppelten in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen wurden unter Verwendung des Systems "TNT Reticulocyte Lysate" (Promega, Madison, WI) nach der vom Hersteller empfohlenen Technik in Gegenwart von ³⁵S-Methionin (Amersham Frankreich) durchgeführt. Zur Untersuchung der Auswirkung der posttranskriptionellen Reifung der Proteine wurden die Reaktionen auch in Gegenwart von mikrosomalen Hunde-Pankreasmembranen (Promega) durchgeführt. Die Translationsprodukte wurden durch Elektrophorese auf Polyacrylamid-SDS-Gel aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die Radioimmun-Präziptationstests (RIPA) wurden durch Mischen von 5 μl des Translationsgemisches des Fusionsproteins mit 5 μl monoklonalen Antikörpern oder Katzenserum in 200 μl TNE-Triton X-100-Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0), 5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100) und Schütteln dieses Gemisches für 1 h bei 4 °C durchgeführt. FIPV-positive und -negative Katzenseren sowie ein gegen die 10 ersten Aminosäuren des Gen-10-Proteins von T7 gerichteter monoklonaler Antikörper (monoklonaler T7-Tag-Antikörper, Novagen) wurden als Kontrollen verwendet. Die Immunkomplexe werden durch Zugabe von 50 μl eines Agarose-rekombinantes Protein G-Konjugats (Boehringer Mannheim, Deutschland) zu den Proben, die die monoklonalen Antikörper enthalten, oder durch Zugabe von 50 μl eines Agaroserekombinantes Protein A-Konjugat (Boehringer Mannheim) zu den Proben, die die Katzenseren enthielten, adsorbiert. Die an die Agarose fixierten Immunkomplexe wurden 30 s zentrifugiert und zweimal in RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0), 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS) und einmal mit Tris-Triton-Puffer (10 mM Tris (pH 8,0), 0,1 % Triton X-100) gewaschen. Anschließend werden die zentrifugierten Proben durch Elektrophorese aufgetrennt. Die Gele werden fixiert und mit einer Amplify-Lösung (Amersham) behandelt und durch Autoradiographie entwickelt.
Die großen Fragmente F1, F2 und F3 haben eine Größe von ungefähr 62 kDa, was Fusionsproteine von ungefähr 90 kDa ergibt, die tatsächlich den festgestellten Größen entsprechen. Die kleinen Fragmente S1 bis S12 haben Größen von ungefähr 18 kDa, was Fusionsproteine von ungefähr 46 kDa ergibt.
Zur Optimierung der Erkennungsbedingungen der FIPV S-Fusionspeptide durch die monoklonalen Antikörper wurden die Fusionsproteine auch in Gegenwart von Hundepankreas-Mikrosomenmembranen translatiert. Die Glycosylierung des N-terminalen Endes von S (Fragment 1) spiegelt sich in einer Änderung der Größe des Fusionsproteins F1 von 90 kDa auf 98 kDa oder 145 kDa, entsprechend jeweils einer Zunahme von 8 oder 55 kDa, wieder. Ein Anstieg von 8 kDa wird auch für die Größe des Subfragments S1 festgestellt, die von 48 auf 54 kDa übergeht. Die Größe der anderen FIPV S-Fragmente wird durch die in Gegenwart von Mikrosomenmembranen durchgeführte Translation nicht modifiziert.
Die spezifischen monoklonalen Anti-FIPV S-Antikörper 23F4.5, 24H5.4 und 18A7.4 (Corapi W. et al., J. Virol. 1992, 66, 6695-6705) erkennen das Fragment F2 und das Subfragment S6, denen eine Sequenz von 165 Aminosäuren (Positionen 509-673 auf der Sequenz des Protein S des Stamms 79-1146 (De Groot R. et al., J. Gen. Virol. 1987, 68, 2639-2646)) gemeinsam ist. Das Erkennen des F2-Fragments wird durch die Verwendung von Proteinen, die in Gegenwart von Mikrosomenmembranen translatiert wurden, nicht verbessert, was nahe legt, dass die Glycosylierung nicht für das Erkennen der gesuchten Epitope notwendig ist.
Beispiel 3: Sequenzierung der gegenüber Neutralisation durch monoklonale Anti-FIPV S-Antikörper resistenten Virusmutanten ("mar"-Mutanten)
Zur Lokalisierung der antigenen Stellen, die auf dem S6-Fragment liegen, wurde die S6-Region von mehreren FIPV-mar-Mutanten durch PCR amplifiziert und in den pBluescript SK+-Vektor kloniert und sequenziert. Die Sequenz der mar-Mutanten wurde bestimmt für mar-Mutanten, die unabhängig mit dem gleichen monoklonalen Antikörper erhalten wurden, sowie mit Klonen, die aus unabhängigen PCR-Amplifikationen mit der gleichen mar-Mutante hervorgingen. Die Sequenz von jedem Klon wurde für die beiden Stränge unter Verwendung des Sequenaee-Kits (Amersham) nach der vom Hersteller empfohlenen Technik bestimmt.
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der homologen Sequenz des Elternvirus 79-1146 verglichen. Die analysierten mar-Mutanten sind die Mutanten, die als mar 23F4.5, mar 18A7.4 und mar 24H5.4 identifiziert wurden. Diese Mutanten wurden jeweils mit den monoklonalen Antikörpern 23F4.5, 18A7.4 und 24H5.4, beschrieben von C. Olsen (Olsen C. et al., J. Virology 1992, 66, 956-965) und W. Corapi (Corapi W. et al., J. Virology 1992, 66, 6695-6705), erhalten.
Der monoklonale Antikörper 23F4.5 besitzt einen Neutralisationstiter von 20480 (Corapi, 1992) und löst eine Förderung der Infektion in vitro zumindest des 100fachen des normalen Niveaus aus (Olsen, 1992). Die Mutante mar 23F4.5 weist Mutationen an den Positionen 1840 und 2014 auf, die Änderungen von Aminosäuren in der Sequenz des Protein S an den Resten 591 (Asp -> Tyr) und 649 (Arg -> Gly) auslösen. Der monoklonale Antikörper 18A7.4 besitzt einen Neutralisationstiter von 5120 und löst eine Förderung der Infektion in vitro zumindest des 100fachen des normalen Niveaus aus. Die Mutante mar 18A7.4 weist Mutationen an den Positionen 1772 und 2036 auf, die Änderungen von Aminosäuren an den Resten 568 (Asp -> Val) und 656 (Arg -> Lys) auslösen.
Der monoklonale Antikörper 24H5.4 besitzt einen Neutralisationstiter von 96 und weist die Besonderheit auf, keine Förderung der Infektion auszulösen (Olsen 1992). Die Mutante mar 24H5.4 weist eine einzige Mutation an der Position 1996 auf, die eine Aminosäure-Änderung an dem Rest 643 (Asp -> Tyr) auslöst.
Beispiel 4: Mutagenese der A1-Stelle
Das zentrale Fragment des FIPV S-Gens, HindIII-HindIII von 1723 bp (Nucleotide 1696 bis 3418), wird in den pBS-SK+-Vektor kloniert, um das Plasmid pFIPV-S2 zu ergeben. Die A1-Stelle liegt auf dem HindIII-SspI-Subfragment (Positionen 1696 bis 1845) dieses Fragments. Die A1-Stelle wird durch PCR unter Verwendung der folgenden Strategie mutagenisiert:
Die folgenden Oligonucleotide werden synthetisiert:
OLIGO A11 (95mer) (SEQ ID NO: 1) =
5'ATGAAGCTTAGTGGTTATGGTCAACCCATAGCCTCGACACTAAGTAACATCACACTA CCAATGCAGGATAACAATACTGTTGTGTACTGTATTCG 3'
OLIGO A12 (88mer) (SEQ ID NO: 2) =
5'AAAAATATTGTACCATAAAGAACTTTTGCAAGTGGAATGAACATAAACTGAGAATTG GTTAGAACGAATACAGTACACAACAGTATTG 3'
OLIGO A13 (20 mer) (SEQ ID NO: 3) =
5' ATGAAGCTTAGTGGTTATGG 3'
OLIGO A14 (20 mer) (SEQ ID NO: 4) =
5' AAAAATATTGTACCATAAAG 3'
Die Oligonucleotide A11 und A12 werden auf Grund ihrer gemeinsamen komplementären Sequenz von 23 Basenpaaren miteinander hybridisiert. Das so erhaltene Hybrid dient anschließend nach Verlängerung seiner 3'-Enden als Matrix für eine PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonucleotide A13 und A14. Durch diese PCR-Amplifikationsreaktion lässt sich ein Fragment von 159 bp erhalten. Dieses Fragment wird nun mit den Restriktionsenzymen HindIII und SspI verdaut, um ein HindIII-SspI-Fragment von 149 bp (Fragment A) zu erzeugen. Dieses Fragment enthält die an zwei Positionen (Val anstelle von Asp in der Position 568 und Tyr anstelle von Asp in der Position 591) modifizierte A1-Stelle. Das Plasmid pFIPV-S2 wird durch HindIII verdaut und mit SspI partiell verdaut, um das SspI-HindIII-Fragment von 1569 bp (Fragment B) durch Geneclean (BI0101 Inc., La Jolla, Ca.) zu isolieren. Der pBS-SK+Vektor wird durch HindIII verdaut und dephosphoryliert, um das Fragment C (2960 bp) zu erzeugen.
Die Fragmente A, B und C werden nun zur Herstellung des Plasmids pFIPSA1* miteinander ligiert. Dieses Plasmid enthält das an 2 Aminosäuren der A1-Stelle modifizierte HindIII-HindIII-Fragment des FIPV S-Gens.
Anschließend wird das FIPV S-Gen rekonstituiert durch Ersatz des natürlichen HindIII-HindIII-Fragments (Positionen 1696 bis 3418) durch das in dem Plasmid pFIPSA1* enthaltene HindIII-HindIII-Fragment mittels einfacher Klonierung. Anschließend kann das komplette, an der A1-Stelle modifizierte FIPV S-Gen zur Konstruktionen von Expressionsplasmiden oder rekombinanten Viren verwendet werden.
Beispiel 5: Mutagenese der A2-Stelle
Die folgenden Oligonucleotide werden synthetisiert:
OLIGO A21 (20mer) (SEQ ID NO: 5) =
5' GGACAATATTTTTAATCAAG 3'
OLIGO A22 (36mer) (SEQ ID NO: 6) =
5' TTTAACAACCTGCTCATTGGTTCCTGTACGTGCAGC 3'
OLIGO A23 (36mer) (SEQ ID NO: 7) =
5' AAGTTTTATGTTGCTGCACGTACAGGAACCAATGAG 3'
OLIGO A24 (20mer) (SEQ ID NO: 8)
5' ATCACTAACATTTTTAAAGC 3'
Eine PCR-Reaktion (PCR A) wird mit den Oligonucleotiden A21 und A22 und mit dem Plasmid pFIPV-S2 als Matrix durchgeführt, um ein PCR-Fragment von 199 bp (Fragment A) zu synthetisieren.
Eine PCR-Reaktion (PCR B) wird mit den Oligonucleotiden A23 und A24 und mit dem Plasmid pFIPV-S2 als Matrix durchgeführt, um ein PCR-Fragment von 273 bp (Fragment B) zu ergeben.
Die PCR-A- und PCR-B-Fragmente werden auf Grund ihrer komplementären Region von 46 bp miteinander hybridisiert, und das Produkt dieser Hybridisierung wird nach Verlängerung der 3'-Enden durch eine PCR-Reaktion (PCR C) mit den Oligonucleotiden A21 und A24 amplifiziert, um ein PCR-Fragment von 424 bp zu ergeben. Dieses PCR-Fragment wird nun durch SspI und DraI verdaut, um das SspI-DraI-Restriktionsfragment von 402 bp (Fragment C) zu ergeben.
Das Plasmid pFIPV-S2 wird mit HindIII und SspI verdaut, um das HindIII-SspI-Fragment von 149 bp (Fragment D) zu isolieren.
Das Plasmid pFIPV-S2 wird mit HindIII und DraI verdaut, um das DraI-HindIII-Restriktionsfragment von 1170 bp (Fragment E) zu isolieren. Der pBS-SK+-Vektor wird mit HindIII verdaut und dephosphoryliert, um das Fragment F (2960 bp) zu ergeben.
Die Fragmente C, D, E und F werden miteinander ligiert, um das Plasmid pFIPSA2* zu ergeben. Das zentrale HindIII-HindIII-Fragment von 1723 bp des FIPV S-Gens, das in pFIPSA2* enthalten ist, besitzt eine an 3 Aminosäuren modifizierte A2-Stelle (Tyr anstelle von Asp an Position 643, Gly anstelle von Arg an Position 649 und Lys anstelle von Arg an Position 656).
Anschließend wird das FIPV S-Gen rekonstituiert durch Ersatz des natürlichen HindIII-HindIII-Fragments (Positionen 1696 bis 3418) durch das in dem Plasmid pFIPSA2* enthaltene HindIII-HindIII-Fragment mittels einfacher Klonierung. Das an der A2-Stelle modifizierte komplette FIPV S-Gen kann nun für die Konstruktionen von Expressionsplasmiden oder rekombinanten Viren verwendet werden.
Beispiel 6: Mutagenese der A1- und A2-Stellen
Die Fragmente A (Beispiel 4), C und E (Beispiel 5) werden mit dem pBS-SK+-Vektor, der zuvor durch HindIII verdaut und desphosphoryliert wurde, ligiert, um das Plasmid pFIPSA1*A2* zu ergeben. Das zentrale HindIII-HindIII-Fragment von 1723 bp des FIPV S-Gens, das in pFIPSA1*A2* enthalten ist, weist 2 Aminosäure-Austausche in der A1-Stelle (siehe Beispiel 4) und 3 Aminosäure-Austausche in der A2-Stelle auf (siehe Beispiel 5).
Anschließend wird das FIPV S-Gen rekonstituiert durch Ersatz des natürlichen HindIII-HindIII-Fragments durch das in pFIPSA1*A2* enthaltene HindIII-HindIII-Fragment von 1723 bp mittels einfacher Klonierung. Das komplette FIPV S-Gen, das Modifizierungen in den A1- und A2-Stellen umfasst, kann nun zur Konstruktion von Expressionsplasmiden oder rekombinanten Viren verwendet werden.
Beispiel 7: Konstruktion von Deletionen in den A1- und A2-Stellen
Nach der zuvor beschriebenen Klonierungsstrategie (Mutagenese unter Verwendung von PCR-Reaktionen) können Deletionen, die das Leseraster des Gens FIPV S berücksichtigen, in den A1- und/oder A2-Stellen eingeführt werden. Nach dem gleichen Schema wie zuvor beschrieben (siehe Beispiel 6) kann ein zentrales HindIII-HindIII-Fragment des FIPV S-Gens konstruiert werden, das in der A1-Stelle und/oder in der A2-Stelle eine Deletion aufweist.
Sequenzprotokoll

Claims

Nucleinsäure, die für ein S-Protein des Virus der infektiösen Katzenperitonitis (FIPV) codiert, das modifiziert worden ist, um keine begünstigenden Antikörper zu induzieren, und welche: a) mindestens eine partielle Deletion, welche die Aminosäuren Asp 568 und/oder Asp 591 der Antigenregion A1 des S-Proteins umfasst, wobei die Region von den Aminosäuren Met 562 bis Cys 598 begrenzt wird, und mindestens eine Modifizierung in den Nucleotiden, die für die Antigenregion A2 des S-Proteins codieren, wobei die Region von den Aminosäuren Gly 637 bis Tyr 662 begrenzt wird, b) eine Mutation von wenigstens einem und vorzugsweise den zwei Codons, die für Asp 568 und für Asp 591 der Antigenregion A1 codieren, um eine beliebige andere Aminosäure in dieser Position zu haben, und mindestens eine Modifizierung in den Nucleotiden, die für die Antigenregion A2 codieren, c) mindestens eine Mutation für jede Aminosäure der Antigenregion A1 unter der Bedingung, dass die Aminosäuren Asp 568 und Asp 591 keine Asp mehr sind, und mindestens eine Modifizierung in den Nucleotiden, die für die Antigenregion A2 codieren, d) eine partielle Deletion der Antigenregion A1, welche die Aminosäure Asp568 umfasst, e) eine partielle Deletion der Antigenregion A1, welche die Aminosäuren Asp 568 und Asp 591 umfasst, f) eine Mutation für das Codon, das für Asp 568 codiert, um eine beliebige andere Aminosäure in dieser Position zu haben, und vorzugsweise für die zwei Codons, die für Asp 568 und für Asp 59l der Antigenregion A1 codieren, g) mindestens eine Mutation für jede Aminosäure der Antigenregion A1 unter der Bedingung, dass die Aminosäuren Asp 568 und Asp 591 keine Asp mehr sind, oder h) mindestens eine Modifizierung in den Nucleotiden, die für die Antigenregion A2 codieren, umfasst, wobei die Modifizierung der Antigenregion A2, die in a), b), c) oder h) vorgesehen ist, entweder wenigstens eine Mutation für mindestens eines und vorzugsweise die drei Codons für Asp 643, Arg 649 und Arg 656, um eine beliebige andere Aminosäure in diesen Positionen zu haben, oder eine partielle Deletion, welche die Aminosäuren Asp 643, Arg 649 und/oder Arg 656 umfasst, umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, in welcher die für die Antigenregion A2 codierenden Nucleotide deletiert sind.
Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, die eine Mutation in mindestens einem der für Asp 568 und Asp 591 codierenden Codons enthält, wobei das mutierte Codon für eine andere Aminosäure codiert.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine Deletion von mindestens einem der Codons, die für Asp 568 und Asp 591 codieren, enthält.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die mindestens eine Deletion enthält, die wenigstens eines der Codons enthält, die für Asp 568 und Asp 591 codieren.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 5, die eine Mutation in mindestens einem der Codons enthält, die für Asp 643, Arg 649 und Arg 656 codieren, wobei das mutierte Codon für eine andere Aminosäure codiert.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 5, die eine Deletion von mindestens einem der Codons, die für Asp 643, Arg 649 und Arg 656 codieren, enthält.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 5, die wenigstens eine Deletion enthält, die mindestens eines der Codons einschließt, die für Asp 643, Arg 649 und Arg 656 codieren.
Polypeptid, für welches eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 codiert.
Rekombinantes Virus oder ein Plasmid, das eine Nucleotidsequenz enthält, die das Polypeptid des Anspruchs 9 codiert und exprimiert.
Impfstoff für die Impfung einer Katze gegen FIPV, der ein rekombinantes Virus umfasst, das eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält und exprimiert.
Impfstoff nach Anspruch 11, in welchem das rekombinante Virus ein rekombinantes Pockenvirus, Herpesvirus oder Adenovirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 12, in welchem das rekombinante Pockenvirus ein rekombinantes Virus des Impfstoffs oder ein rekombinantes Canarypoxvirus ist.
Impfstoff nach Anspruch 12, in welchem das rekombinante Herpesvirus ein rekombinantes Katzenherpesvirus ist.
Impfstoff, der ein Plasmid umfasst, das eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält und exprimiert, in einem Träger, der in der Lage ist, eine direkte Injektion des Plasmids in eine Katze zu erlauben, um diese gegen FIPV zu impfen.
Impfstoff nach Anspruch 15, in welchem das Plasmid die Nucleotidsequenz unter der Kontrolle des Promotors HCMV IE und/oder eines Promotors SV40 enthält.
Impfstoff, der ein Polypeptid nach Anspruch 9 umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 11, der außerdem ein anderes FIPV-Protein enthält.
Impfstoff nach Anspruch 11, der darüber hinaus das FIPV-M-Protein enthält.