DE3787002T2

DE3787002T2 - Synthetische Peptide, die zelluläre Immunität gegen den AIDS-Virus und dessen Proteine erzeugen.

Info

Publication number: DE3787002T2
Application number: DE87311391T
Authority: DE
Inventors: Jay A Berzofsky; Kemp B Cease; James L Cornette; Charles Delisi; Hanah Margalit; Cecilia Spencer Ouyang
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1986-12-30
Filing date: 1987-12-23
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2007-12-24
Also published as: WO1988005051A1; EP0273716B1; AU592258B2; JPH0762031B2; IL84980A0; DE3787002D1; EP0273716A3; AU1365788A; CA1340896C; IL84980A; JPS63503227A; EP0273716A2

Description

Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines Impfstoffs zur Verhinderung des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) auf teilweiser oder alleiniger Basis synthetischer Peptide, die T-Zellenimmunität erzeugen. T-Zellenimmunität ist eine wichtige Waffe zur Verteidigung gegen Virusinfektionen, aber ist in Bezug auf AIDS bisher kaum untersucht. T-Helferzellen werden sowohl für eine Antikörperimmunantwort wie auch für eine cytotoxische T-Zellenimmunantwort und zum Herbeiführen einer Makrophage- und LAK-Zellabtötung benötigt. Während noch nicht klar ist, ob zelluläre Immunität oder humorale Immunität das kritische Element für den Schutz gegen ein Virus darstellt, sind die Peptide nach der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in einem Impfstoff besonders geeignet, der zum sicheren Hervorrufen beider Arten von Immunität in der Lage ist:
(1) Die Peptide werden synthetisch hergestellt und enthalten daher keinen lebenden Virus oder andere Sequenzen, die schädliche Effekte hervorrufen könnten (z. B. die an T4 bindende Sequenz oder die Zellverschmelzung hervorrufende Sequenz);
(2) Die Peptide können allein verwendet werden, um zelluläre Immunität herbeizuführen;
(3) Die Peptide können in Verbindung mit anderen Molekülen verwendet werden, um Antikörpererzeugung oder eine humorale Immunantwort hervorzurufen; und
(4) Die Peptide können für eine bestimmte Art von T-Zellenimmunantwort ohne Nebenwirkungen durch andere unerwünschte Immunantworten zielgerichtet werden.
Große Anstrengung wurde der Analyse von Antikörpern zu AIDS- Virusantigenen gewidmet, aber keine früheren Untersuchungen haben antigene Sequenzen dieses Virus definiert, die T-Zellenimmunität hervorrufen, obwohl eine solche Immunität zum Schutz gegen viele andere Viren wichtig ist. Die Analyse von immundominanten T-Helferzellensequenzen legt nahe, daß solche Sequenzen zur Bildung amphipathischer Spiralen tendieren. Unter Verwendung eines auf diesem Modell basierenden Algorithmus wurden zwei mögliche T-Zellensequenzen, env T1 und env T2, im Hüllprotein des menschlichen lymphotropen T-Zellenvirus Typ IIIb (HTLV-IIIb) identifiziert, die in anderen Humanimmundefektvirus(HIV)-Isolaten konserviert wurden. Entsprechende Peptide wurden synthetisch hergestellt und in genetisch definierten Inzucht- und T&sub1;-Mäusen zur Induktion von Lymphknotenvermehrung untersucht. Nach Immunisierung mit einem rekombinanten 425-Rest-Hüllproteinfragment wurden signifikante Immunantworten sowohl auf natives gp120 wie auch auf jedes Peptid in beiden untersuchten F&sub1;-Kombinationen beobachtet. Umgekehrt bewirkte eine Immunisierung mit env-T1- Peptid eine T-Zellenimmunität gegen das native gp120-Hüllprotein. Die Genetik der Immunantwort auf env-T1-Peptide wurde weiter geprüft und zeigte eine signifikante Immunantwort bei drei von vier getesteten unabhängigen Haupthistokopatibilitäts-Haplotypen, also ein Indiz sehr häufiger Reaktion in der Bevölkerung.
Eine Identifizierung von T-Helferzellensequenzen müßte die Entwicklung eines in hohem Maße immunogenen trägerfreien Impfstoffs erleichtern, der sowohl T-Zellen-als auch B-Zellenimmunität erzeugt. Die Fähigkeit zum Hervorrufen von T- Zellenimmunität gegen das native AIDS-Virusprotein durch Immunisieren mit einem 16-Rest-Peptid läßt vermuten, daß solche Sequenzen möglicherweise wichtige Komponenten eines wirksamen AIDS-Impfstoffs darstellen.
Seit der Entdeckung der menschlichen Immundefektviren, den Auslösern des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS), wurde ein wesentlicher Fortschritt im Hinblick auf die Charakterisierung der viralen Gene und ihrer Produkte in infizierten Zellen erreicht. Obwohl sie für einen tiefgreifenden Immundefekt verantwortlich ist, erzeugt eine Virusinfektion im Menschen durchweg eine nachweisbare Immunantwort, wie durch Serumantikörper gegen die hauptsächlichen Virusproteine erwiesen ist. Untersuchungen der Serumreaktion auf spezifische Virusproteine haben bis heute keine folgerichtigen prognostischen Zuordnungen ergeben. Ein großer Teil der Wirt-Antikörperreaktion konzentriert sich auf die Hüllproteine gp120 und gp 41. Die Fähigkeit von nativem gp120 oder einem größeren rekombinanten Fragment zum Hervorrufen neutralisierender Antikörper ist demonstriert worden. Zwei anscheinend immundominante Antikörperbindungsstellen in dem gp41-Hüllprotein sind auf der Ebene kleiner synthetischer Peptide definiert worden. Obwohl solche Antikörperstellen klar von diagnostischer Bedeutung und möglicherweise für die Impfstoffauslegung von Wichtigkeit sind, läßt das typische Fortschreiten von AIDS bei Patienten trotz der Anwesenheit dieser Antikörper vermuten, daß die effektive T-Zellenimmunität für die Immunabwehr gegen dieses Pathogen wichtig ist.
Ein idealer Impfstoff ist in hohem Maße immunogen, erzeugt virusspezifische T-Zellen- wie auch B-Zellenimmunität, und ist frei von irrelevanten Trägerproteinen. Während herkömmliche Versuche unter Verwendung eines ganzen Virions bzw. von Virion-Untereinheiten dies grundsätzlich erreichen, haben praktische Überlegungen beispielsweise im Hinblick auf Sicherheit und Verfügbarkeit von nativem Antigen viele Fachleute dazu geführt, höher entwickelte Impfstoff-Konstrukte für AIDS in Betracht zu ziehen. Die Lokalisierung von immundominanten T-Zellen- und B-Zellen-Erkennungsstellen wird kritisch, wenn man einen auf rekombinanten Proteinen oder synthetischen Peptiden basierenden Impfstoff entwerfen will. Eine T-Zellen-Imunantwort auf das gp120-Hüllprotein ist neulich von Zarling u. a. in Nature, 323 : 344-345 (1986), in mit Vaccubua-Konstrukten, welche die gp120-Codiersequenz enthielten, immunisierten Rhesus-Affen demonstriert worden. Jedoch sind eine Identifizierung und Charakterisierung von immundominanten T-Zellensequenzen innerhalb dieses 518-Rest- Proteins oder anderer HIV-Proteine nicht berichtet worden.
Antikörper erkennen typischerweise freies Antigen in nativer Übereinstimmung und können möglicherweise fast jede der Antigenoberfläche ausgesetzte Stelle erkennen. Im Gegensatz dazu erkennen typische CD4&supmin;-T-Helferzellen Antigen nur im Zusammenhang mit dem Haupthistokompatibilitäts-Molekül (MHC-Molekül) der Klasse II und nur nach geeigneter Antigenaufbereitung, die gewöhnlich in einer Proteolyse oder Denaturierung besteht. Zusätzlich konzentriert sich die polyklonale T-Zellenimmunantwort nur auf verhältnismäßig wenige diskrete Stellen. Diese begrenzte Immunantwort zeigt sich sogar bei nicht eukariontischen Proteinen (z. B. Influenza-Hemagglutinin und Staphylokokken-Nuclease) bei welchen die Toleranz für homologe Wirtsproteine die Anzahl antigener Stellen nicht begrenzt. Deshalb ist es wichtig, Stellen zu finden, welche T-Zellenimmunität gegen AIDS-Virusproteine tatsächlich hervorrufen. Die Aufklärung sowohl antigeneigener als auch antigenfremder Immundominanz bestimmender Merkmale liegt im Brennpunkt des gegenwärtigen grundsätzlichen und klinischen Interesses. Eine detaillierte Charakterisierung von immundominanten T-Zellensequenzen hat die Erforschung allgemeiner Merkmale ermöglicht. Eine solche Analyse führte zu der Beobachtung, daß immundominante T-Zellensequenzen dazu neigen, eine Aminosäuresequenz entsprechend der Bildung einer amphipathischen Spirale mit hydrophilen Resten auf einer Seite und hydrophoben Resten auf der entgegengesetzten Seite zu haben. Bei einer amphipathischen Alpha-Spirale verändert sich die Hydrophobie sinusförmig mit einer Periode von 3,6 Resten pro Spiralwindung oder einer Frequenz von 1000 pro Rest. Eine amphipathische 3&sub1;&sub0;-Spirale hat eine Periode von 3 und eine Frequenz von 120º. Auf der Basis dieses Modells ist ein mit AMPHI betitelter Algorithmus zur Identifizierung solcher Sequenzen in Proteinen entwickelt worden, wo nur Primärsequenzdaten gegeben sind.
Obwohl Zarling u. a., Nature 323 : 344 (1986), zeigte, daß T- Zellenimmunität gegen die AIDS-Virushülle in Affen unter Verwendung eines rekombinanten Impfvirus erzeugt werden könnte, der das Gen für das gesamte Hüllprotein trägt, konnte ihre Untersuchung keine diese T-Zellen stimulierende antigene Stellen identifizieren. Außerdem wurde die Vaccinia-Immunisierung in den Vereinigten Staaten wegen der Gefahr einer verbreiteten Vaccinia-Infektion und anderer Nebenwirkungen nicht fortgesetzt. Ein synthetischer Peptidimpfstoff würde keines dieser Risiken aufweisen. Da er synthetisch wäre, bestünde keine Gefahr einer Kontaminierung mit dem lebenden AIDS-Virus, wie sie bei einem Impfstoff mit abgetöteten Viren auftreten könnte. Ein synthetisches Peptid, das keine für die Syncytia-Bildung verantwortlichen Sequenzen enthält, könnte weniger Nebenwirkungen erzeugen als ein solche Sequenzen enthaltendes großes rekombinantes Hüllprotein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Hervorrufen von Zellenimmunität gegen native Proteine des AIDS-Virus durch Immunisierung mit kurzen synthetischen Peptiden. Fünf mögliche Peptide sind durch Suchen nach Regionen identifiziert, die als maximal amphipatische Spirale faltbar ist. Zwei davon werden durch T-Zellen erkannt, die gegen das AIDS-Virushüllprotein immun sind. Eines davon wurde zur Immunisierung von Mäusen benützt und kann unter Verwendung dieses in drei von vier Mäusensträngen getesteten 16-Rest-Peptids erfolgreich T-Zellenimmunität gegen das gesamte AIDS- Hüllprotein (480 Aminosäurereste lang) erzeugen. Die Erfindung schließt ein aber beschränkt sich nicht auf diese spezifischen Peptide und irgendwelche synthetischen Peptide, die diese Sequenzen oder Variationen hiervon enthalten oder überlappen, einschließlich Peptiden mit Aminosäuresubstitutionen, welche die dokumentierte Aktivität erhalten oder verstärken. Diese können allein oder in Kombination mit anderen Materialien als Impfstoff verwendet werden (z. B. Primärimmunisation mit Peptid, Verstärkung mit rekombinantem Fragment). Sie können außerdem an sequenzbindende neutralisierende Antikörper angelagert sein, um eine neutralisierende Antikörperreaktion hervorzurufen. Insbesondere sind nach der Erfindung isolierte Peptide oder Teile hiervon vorgesehen, die dafür ausgebildet sind, als Komponenten eines Impfstoffs für das erworbene Immundefektsyndrom (AIDS) zu dienen, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide in der Lage sind, eine spezifische T-Zellenimmunantwort auf den Virus des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) zu induzieren, und daß die genannten Peptide aus Aminosäuresequenzen ausgewählt sind, die im Einbuchstabencode lauten:
T-Zellensequenzen env T&sub1;, Reste 428-443, und env T&sub2;, beste 112-124, oder Teile hiervon.
Die vorliegende Erfindung ist für die Herstellung von Peptid- Impfstoffen kritisch, die in der Lage sind, T-Zellenimmunität hervorzurufen. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung gewisser Eigenschaften, die den meisten T-Zellenstimulierenden Proteinsegmenten gemeinsam zu sein scheint. Solche Peptid-Impfstoffe könnten optimal solche Proteinsegmente sein, die
a) eine Neigung zur Bildung amphipathischer Alpha-Spiralen haben;
b) keine Bereiche mit einer Neigung zur Wendelbildung haben;
c) ein Lysin an ihrem COOH-Ende haben.
Die letzten zwei Beobachtungen sind von besonderer Nützlichkeit bei der Herstellung von Peptid-Impfstoffen: Sie zeigen n, wo die synthetischen Peptide beendet sein sollten.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt das HTLV-III-gp160-Hüllprotein. Die gp120- und gp41-Proteine sind zusammen mit rekombinanten Proteinen und synthetischen Peptiden dargestellt, auf die in dieser Studie Bezug genommen wird. Ausgewählte Restriktions-Schnittstellenorte sind in der Karte oben zusammen mit dem schattierten führenden Peptid (1-37) und dem Transmembranbereich (519-534) dargestellt. Das Vorläufer-pg160 ist gespalten, um die gp120- und gp41-Proteine zu bilden. Die Abmessungen und Lagen der rekombinanten R10- und PB1-Proteine und der synthetischen env-T1- und -T2-Peptide, die in dieser Studie untersucht werden, sind dargestellt. Die Lagen von bekannten B-Zellenepitopen (B1 und B2) im gp41-Protein sind ebenfalls dargestellt.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der AMPHI-Analyse im Bereich der env-T1- und env-T2-Sequenzen.
Fig. 3 zeigt Lymphknotenvermehrungsversuche von HTLV-III- Hüll-gp120 und zugehörigen rekombinanten synthetischen Peptidantigenen. F&sub1;-Hybridmäuse wurden mit entweder 10 Mikrogramm des großen rekombinanten Proteins R10 (mit NP bezeichnete Tafeln A und B) oder drei Nanomol Peptid-env-T1 (mit PN bezeichnete Tafeln C und D) in 50 Mikroliter vollständigem Freund-Adjuvans (DIFCO, Detroit, MI) am Schwanzansatz immunisiert. Acht Tage später wurden ableitungsinguinale und periaortale Lymphknoten entfernt und eine Einzellen-Suspension zubereitet. Versuche wurde vierfach mit geeignetem Antigen in 96-Mulden-Platten mit 3·10 Zellen pro Mulde in vollständigem Medium durchgeführt, das aus RPMI 1640 mit 44% Eagle-Hanks-Aminosäuremedium, 10% fötalem Rinderserum, 5·10&supmin;&sup5; M 2-Merkaptoethanol, 2 mM frisch gefrorenem L-Glutamin (Gibco, Grand Island, NY), 100 U/ml Penicillin, und 100 Mikrogramm/ml Streptomycin (Gibco) bestand. Die Platten wurden während 4 Tagen bei 37ºC in einem 5% CO&sub2;-Incubator incubiert, mit 1 Mikro-Ci (³H)-Thymidin (New England Nuclear, Boston MA) impulsbeaufschlagt, und 18 Stunden später auf Glasfaserpapier geerntet. Der Thymidin-Einbau in die DNA wurde dann durch Flüssig-Szintillationszählung quantifiziert.
Der geometrisch mittlere und Standardfehler des Mittelwerts für jede Gruppe wurde bestimmt und der Kein-Antigen-Hintergrund subtrahiert, um den Delta-cpm-Wert zu erhalten. Die Kein-Antigen-Hintergründe waren: A: 21.771; B: 17.844; C: 30.674; D: 29.298. Die angenommenen Intervalle für die Hintergrundwerte sind in der Nullposition jeder vertikalen Achse (n=8) dargestellt. Die Tafeln sind entsprechend der Größe der PPD-positiven Kontrollantwort skaliert.
Fig. 4 zeigt die Antwort von env-T1-Peptidimmunen Lymphknotenzellen auf gp120 und zugehörige Antigene in den unabhängigen Eltern-Mäusestämmen. C57BL/6-, C3H/HeJ-, A.SW-, und BALB/c-Mäuse wurden mit dem 16-Rest-env-T1-Peptid immunisiert, und Lymphknotenvermehrungsversuche wurden durchgeführt, wie in der Erläuterung zu Fig. 3 beschrieben. SW102 ist ein Peptid, das Pottwal-Myoglobinreste 102-118 darstellt. Die Kein-Antigen ( ) und PPD-negativen und -positiven Kontrollen sind in der ersten Position jeder Tafel dargestellt. Die Tafeln sind entsprechend der Größe der i? PD-Antwort skaliert. Die Kein-Antigen-Hintergründe waren: B6 : 16.334; C3H: 74.253; A.SW: 28.771; BALB/c: 34.600.
Fig. 5 zeigt eine Alpha-Spiralen-Netzdarstellung der env-T2- und env-T1-Sequenzen. Diese Darstellung kann als Auftrennen des Zylinders der Spirale in Längsrichtung entlang einer Seite, Öffnen und flaches Abwickeln derselben betrachtet werden. Es sind 3,6 Reste pro Spiralwindung vorhanden. Die hydrophoben Reste sind schattiert. Beiden Seiten gemeinsame Reste sind umrahmt. Bereiche außerhalb der Peptide sind entsprechend der Hydrophobizitäten der Reste in der gp120-Sequenz schattiert.

Detaillierte Beschreibung und bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung

Die Vorhersage von T-Zellen-antigenen Peptiden hat wichtige Bedeutungen für die Entwicklung künstlicher Impfstoffe. Solche Impfstoffe sind insbesondere bei Krankheiten wie Lepra wichtig, die durch Organismen verursacht werden, die schwer zu züchten sind und gegen welche die zellulare Waffe des Immunsystems die Hauptverteidigung darstellt. Selbst wenn die Antikörperproduktion das Hauptziel der Impfung ist, erfordert eine sekundäre bzw. Anamneseantwort die Herbeiführung von T- Helferzellenimmunität. Die Voraussage von Peptiden zur Verwendung als Impfstoffe erfordert die Entdeckung und Bestätigung von Eigenschaften, die mit T-Zellen-Antigenzität in Korrelation stehen. Einer der Zwecke dieser Erfindung ist die Verwendung solcher Eigenschaften in einem Verfahren, das eine zuverlässige Vorhersage von T-Zellenstimulierung durch ein Proteinsegment ermöglicht.
T-Zellenimmunität ist nicht nur zur Abwehr gegen viele Virusinfektionen wichtig; T-Zellenunterstützung ist auch für eine Gedächtnis-Antikörperantwort notwendig. Jedoch ruft nur eine begrenzte Anzahl von Segmenten von Proteinantigenen T-Zellenimmunität hervor. Für irgendwelche Proteine des AIDS-Virus aufgefunden sind bisher keine worden. Die T-Zellen-antigene Stellen von AIDS-Virusproteinen, die von der vorliegenden Erindung abgedeckt werden, sollten in irgendeinem für diesen Virus entwickelten Impfstoff sehr nützlich sein. Die vorliegende Erfindung zeigt außerdem, daß eines der Peptide T-Zelenimmunität gegen das native AIDS-gp120-Hüllprotein hervorruft. Folglich können diese Peptide den ganzen oder einen Teil eines synthetischen Impfstoffs darstellen. Außerdem sollte ein durch rekombinante DNA hergestellter Fragmentimpfstoff oder eine andere Technologie entworfen werden, um diese Zellen mitzuumfassen.
Die Versuchspeptide, welche die immundominanten Stellen entalten, sind hier als antigene Stellen definiert. "Antigenizität" bezieht sich bei dieser Erfindung stets auf T-Zellen- Antigenizität
In vivo durchläuft ein antigenes Protein vermutlich drei Hauptschritte, bevor eine T-Helferzellen-Antwort erfolgt:
a) "Verarbeitung": Eine Antigen-darstellende Zelle (APC), gewöhnlich ein Makrophage, eine Dendrit- oder B-Zelle, nimmt das Protein auf und baut es dann zu kleineren Peptiden ab;
b) "Präsentation": Diese Peptide werden dann den T-Zellen präsentiert, vermutlich in Verbindung mit einem Klasse-II- Haupthistokompatibilitätskomplexprotein auf der APC-Oberfläche; und
c) "Erkennung": Ein T-Helferzellenrezeptor erkennt dann eine gewisse Kombination von Peptid und Klasse-II-Protein, und löst T-Zellenimmunantwort aus.
Zwei antigene Eigenschaften dürften zu diesem Prozeß beitragen, nämlich Amphipathizität und Alpha-Spiraligkeit, basierend auf den Erkenntnissen dieser Erfindung.
Eine Struktur ist amphipathisch, wenn sie sowohl einen hydrophoben Teil als auch einen hydraulischen Teil aufweist. Ein Peptid ist segmentell amphipathische, wenn das Peptid mindestens zwei unzusammenhängende Unterpeptide enthält, von denen eines hydrophob und das andere hydrophil ist. Ein Peptid ist alpha-amphipathisch, wenn, falls das Peptid in eine alphaspiralige Form eingesetzt ist, eine Seite der Alpha-Spirale hydrophob und die andere Seite hydrophil ist. Ein Peptid ist spiralig amphipathisch, wenn, falls es in eine alpha- oder 3&sub1;&sub0;-Spirale oder oder eine ähnliche Sprialstruktur eingebaut ist, eine Seite der Spirale hydrophob und die andere Seite hydrophil ist. Sowohl Segmentelle Amphipathizität als auch spiralige Amphipathizität tragen vermutlich zu T-Zellenantigenizität bei, obwohl die Meinungen über ihre relative Bedeutung auseinandergehen
AMPHI wurde zum Analysieren des gp120-Hüllproteins der HTLV- IIIb-Isolate von HIV auf Sequenzen benutzt, die der Bildung amphipathischer Spiralen als mögliche T-Zellenstellen entsprechen. Die Stellen wurden nach der in Erscheinung tretenden Stärke der spiraligen Amphipathizität eingeordnet, wie sie sich im amphipathischen Muster wiederspiegelt, und die Frequenzen wurden auf Folgerichtigkeit geprüft. Die Stellen wurden des weiteren nach dem Auftreten in konstanten Bereichen von gp120 (basierend auf einem Vergleich der Sequenz von 6 Isolaten) und nach der Abwesenheit von N-gekoppelten Glykosylierungsstellen ausgewählt. Die AMPHI-Parameter für die beiden günstigsten Stellen sind in Fig. 2 dargestellt. In Betracht kommende T-Zellenstellen wurden durch Einschluß geeigneter flankierender Reste ausgewählt. In Frage kommende T- Zellenstellen env T1 und env T2 wurden als Reste 428 bis 443 bzw. 112 bis 124 definiert. Die verwendete Standard-Epitopnomenklatur besteht aus viralem Isolat, Proteinbezeichnung, Sequenztyp und zugeordnete Nummer bzw. Rest-Nummer (z. B. HTLV- III (bH10) env T1).
Diesen Stellen entsprechende synthetische Peptide wurden durch Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Die Peptide wurden unter Verwendung von Standardmethoden der Festphasen- Peptidsynthese auf einem Vega-250-Peptidsynthesegerät unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid-vermittelten Zweifachkopplungen synthetisch hergestellt. HOBT-Preaktivierungskopplungen wurden beim Koppeln von Gln oder Asn vorgeformt. Es wurde die Standard-t-boc/Benzyl-Aminosäureschutzstrategie mit Seitenkettenschutz der folgenden Aminosäuren angewendet: Asp(O-benzyl), Glu(O-benzyl), His(tosyl), Lys(2-Chlorbenzyloxycarbonyl), Ser(benzyl), Trp(formyl), Tyr(2,6-Dichlorbenzyl). Das Ausmaß der Kopplung wurde unter Verwendung des qualitativen Ninhydrin-Tests überwacht und die Wiederkopplung durchgeführt, wenn weniger als 99,4% Kopplung beobachtet wurde. Die Peptide wurde von dem Harz unter Anwendung der schwach/stark-Fluorwasserstoff (HF)-Methode gespalten (J.P. Tam, W.F. Heath, and R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 105, 6442 (1983)). Für das Peptid env T2 wurde die Standard-HF- Spaltung angewendet, da das Entfernen der Tryptophanformyl- Schutzgruppe sich als für die antigene Aktivität nicht erforderlich erwiesen hat. Die Peptide wurden durch Gelfiltration auf Biogel T4 in 9%iger Ameisensäure mit anschließender Umkehrphasen-HPLC, wie vorstehend beschrieben, auf Homogenität gereinigt. Durch Aminosäureanalyse wurde die Zusammensetzung bestätigt und die Konzentration bestimmt. Natives gp120 wurde durch selektive Waschmittelextraktion und Immunoaffinitäts- Chromatographie mit nachfolgender Dialyse gereinigt. Die rekombinanten Proteine R10 und PB1 wurden durch Klonieren von Restriktionsfragmenten KpnI (5923) zu Bgl II (7197) oder Pvu II (6659) zu Bgl II (7197) aus dem BH10-clone von HTLV-IIIb in den Repligen-Expressionsvektor (REV) mit anschließender Expression in E. coli und Reinigung erzeugt. Das Protein R10 enthält Reste 49 bis 474 und PB1 enthält Reste 294 bis 474 des Hüllproteins.
Als genetisch definiertes Modell einer Kreuzungszüchtungspopulation wurde die Immunantwort auf diese Proteine in (C57BL/6·C3H/HeJ)F&sub1;- und (A.SW·BALB/c)F&sub1;-Mäusen (H-2bxk bzw. H-&sub2;sxd) untersucht. Diese Strategie sorgt für vollständige H-2-Expression und Komplementierung im Kontext von 4 verschiedenen Stammhintergründen. T-Zellen haben sich als verantwortlich für die Vermehrung erwiesen, die in Antigenspezifischen Lymphknotenvermehrungsversuchen beobachtet wurde, und demzufolge wurden solche Versuche als Maß der T- Zellenimmunität benutzt.
Die verfügbaren Mengen von gereinigtem gp120 schlossen eine Verwendung zur Immunisierung aus, und deshalb war das den größten Teil der gp120-Sequenz in nicht glykosylierter Form enthaltende R10-Protein das größte verwendete Immunogen. Figur 3, Tafeln A und B, zeigen die Lymphknotenvermehrungsantwort von mit nativen gp120, rekombinanten Proteinen, und synthetischem Peptid env T1 getesteten R10-immunen Mäusen. Bei beiden F&sub1;-Hybriden wurde eine starke Antwort nicht nur auf das Immunogen R10, sondern auch auf gp120 beobachtet. Daher wurde die Antwort weitgehend auf die Hüllsequenz und nicht auf die irrelevanten vektorabgeleiteten flankensequenzkodierten Reste in dem rekombinanten Protein gerichtet. Infolgedessen ist das rekombinante R10-Fragment ein wirksames Immunogen zum Starten einer Antwort auf das native gp120. Die Antwort auf das synthetische Peptid env T1 zeigt an, daß eine wesentliche Komponente der T-Zellenimmunantwort auf das 425-Rest- R10 tatsächlich auf die 16-Rest-env-T1-Stelle konzentriert ist. Bei anderen Experimenten mit R10-immunen Lymphknotenzellen wurde eine Antwort auf das Peptid env T2 ähnlich derjenigen auf das Peptid env T1 beobachtet (Tafel I). Tafel I Antwort auf env T2-Peptid in R10(49-474 )-immunen F&sub1;-Hybridmäusen in Relation zu nativem gp120 und env T1-Peptid Hybridmäuse Antigen Medium
Der (³H)-Thymidin-Einbau ist für jede Gruppe dargestellt, und zwar ausgedrückt als das geometrische Mittel der Zählungen pro Minute, wobei der Standardfehlerausdruck für Vierfachproben in Klammern angegeben ist. Für die Mediumkontrollen beträgt n=8. Die Antigenkonzentrationen waren 0,075-mikromolar für gp120 und 4,8-mikromolar für die env T1- und env T2-Peptide.
Unter der Vorgabe, daß die Immunisierung mit einem großen, den größten Teil der gp120-Sequenz überspannenden Fragment eine Antwort hervorruft, die teilweise auf eine kleine, durch ein synthetisches Peptid (ein natives Immunogen/Peptid-Testantigen oder NP-Experiment) definierte Stelle konzentriert ist, lautete unsere nächste Frage, ob eine Immunisierung nicht dem synthetischen Peptid Immunität gegen das native Protein (ein Peptid-Immunogen/natives Testantigen oder PN- Experiment) hervorrufen würde. Immunogenizität in der PN- Richtung würde als Voraussetzung für eine Wirksamkeit als Impfstelle erscheinen. Die Ergebnisse eines solchen Experiments an den F&sub1;-Mäusen ist in Fig. 3, Tafeln C und D, dargestellt. Mit dem env T1-Peptid immunisierte Mäuse zeigten wesentliche Immunität nicht nur gegen das env T1-Immunogen, sondern auch gegen das native gp120 sowie auch gegen die rekombinanten Proteine. Infolgedessen kann ein synthetisches 16-Rest-Peptid, das auf der Basis der Amphipathizität ausgewählt ist, T-Zellenimmunität gegen das native AIDS-Virusprotein hervorrufen.
Um die genetische Restriktion der Antwort auf env T1 weiter zu charakterisieren, wurden die unabhängigigen ungleichen Elternstämme untersucht, von denen die F&sub1;-Hybriden abgeleitet worden sind: C57BL/6, C3H/HeJ, A.SW und BALB/c. Die Mäuse wurden mit env T1-Peptid immunisiert und mit nativen und Peptid-Antigenen erforscht. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, wurde C57BL/6 (H-2b-Haplotyp) als schwach ansprechend ermittelt, während die anderen Stämme (H-2k-, H-2s-, und H-2d-Haplotypen) mittel oder stark auf das env T1-Peptidansprachen. Die Antwort auf natives gp120 entsprach derjenigen auf das Peptid. Ein entsprechendes Antwortmuster wird auch in Experimenten unter Verwendung von H-2-kongenen Mäusestämmen beobachtet (Tafel II). Infolgedessen stellt das Peptid env T1 ein 16-Rest-Peptid dar, das T-Zellen bezüglich einer Sekundärantwort auf das glykosylierte native 518-Rest-gp120 in zahlreichen MHC-Haplotypen sensibilisieren kann. Tafel II

Antwort auf gp120 in env T1-Peptid-immunen H-2 kongenen Mäusen

Kongene Stämme

Der (³H)-Thymidin-Einbau ist für jede Gruppe dargestellt, und zwar ausgedrückt als das geometrische Mittel der Zählungen pro Minute, wobei der Standardfehlerausdruck für Vierfachproben in Klammern angegeben ist. Für die Mediumkontrollen war n=8. Die Antigenkonzentrationen waren 0,075-mikromolar für gp120 und 32 Mikrogramm pro Milliliter für PPD.
Eine unerwartete Beobachtung war die auffallende Kreuzreaktion zwischen env T1- und env T2-Peptiden. Die env T1-immunen Zellen antworteten sowohl auf env T2 wie auch auf das immunisierende Peptid. Die Kreuzreaktivität von env T2 war bei dem H-2k-Haplotyp am ausgeprägtesten. Durch diese Beobachtung veranlaßt, wurden die beiden Sequenzen verglichen, und es bestand ein Grad an Homologie, der bei Betrachtung im Kontext möglicher Alpha-Spiralstruktur, wie in Fig. 5 gezeigt, sogar noch stärker evident war. Dabei haben env T1 und env T2 nicht nur die hydrophobe Ile-Ile-Xxx-Yyy-Trp-Gruppe auf der hydrophoben Seite und das Lys auf der hydrophilen Seite der Spirale gemeinsam, sondern auch das räumliche Verhältnis zwischen diesen ist identisch. Außerdem wurden in beiden Fällen Gln und saure Aminosäuren (Glu, Asp) in der Nachbarschaft des Lys beobachtet. Die schwache Reaktivität auf Peptid 102-118 von Pottwal-Myoglobin, das von einem nicht verwandten Protein abgeleitet ist und nur minimale Homologie mit env T1 hat, zeigt an, daß die Eigenschaft, ein amphipathisches alphaspiraliges Peptid zu sein, für eine Kreuzreaktivität nicht ausreicht. Als zusätzliche Spezifizitätskontrolle wurden gp120, env T1 und env T2 unter Verwendung von gegen ein nicht verwandtes Antigen, Pottwal-Myoglobin, immunen Lymphknotenzellen getestet und als nicht stimulierend erkannt (Daten nicht dargestellt).
Obwohl Artenunterschiede mit Sicherheit das T-Zellenrepertoin beeinflussen, werden die Moleküle und Mechanismen, die zu einer T-Zellenimmunantwort führen, durch Arten hindurch erhalten, und folglich sind die Immundominanz bestimmenden Faktoren ebenfalls gleich. Die eine T-Helferzellenstelle (aus dem Influenza-Virus), die auf der Stufe des Synthetischen Peptids beim Menschen charakterisiert worden ist, ist tatsächlich in Mäusen ebenso immundominant und weist eine Aminosäuresequenz auf, die der Bildung einer in hohem Maße amphipathischen Alpha-Spirale entspricht.
Die Analyse der verschiedenen Virusproteine in den dreizehn publizierten HIV-Isolatsequenzen zeigt, daß das Hüllgen am variabelsten ist. Diese Analyse bringt diskrete variable und erhaltene Bereiche zum Vorschein. Ein polyvalenter Impfstoff kann demzufolge geeignet sein. Sowohl die env T1- als auch die env T2-Stellen sind in den bis heute berichteten HIV-Sequenzen in hohem Maße erhalten. Die env T2-Stelle ist die stärker erhaltene der beiden Stellen, insbesondere in dem LAVELI-Isolat. Die zuvor beschriebenen B-Zellenstellen (B1 und B2 in Fig. 1) fallen ebenfalls unter die erhaltenen Bereiche.
Die Induktion von T-Zellenimmunität kann in verschiedener leise zum Schutz gegen HIV-Infektion beitragen. Obwohl AIDS trotz des Vorhandenseins nachweisbarer Antikörper gegen Virusproteine in den meisten Patienten fortschreitet, sind in vielen solchen Patienten schwach konzentrierte neutralisierende Antikörper gezeigt wurden. Neutralisierende Titer sind in gesunden Patienten mit AIDS-bezogenem Komplex und in HIV- Antikörper-positiven Blutern wesentlich höher. Ob dieser Zusammenhang kausal oder einfach korrelativ ist, ist bisher unbekannt. Wenn diese oder andere Antikörper tatsächlich schützend sind, würde die Schaffung einer optimalen T-Zellenunterstützung im Zeitpunkt der Immunisierung sowie auch bei Konfrontation mit einem Infektionsangriff als wichtig erscheinen. Eine wesentliche T-Zellenunterstützung sollte auch schon für eine effektive zellenvermittelte Immunantwort auf infizierte Zellen erforderlich sein. Es wurde gezeigt, daß NK- Zellen selektiv HIV-infizierte Zellen in Vitro abtöten. Unter der Vorgabe, daß in dem infizierten Patienten der hauptsächliche Modus der Virusübertragung von Zelle zu Zelle stattfindet, -St für eine effektive Impfung ein Impfstoff wichtig, der T-Helferzellen zur Verstärkung der NK-Zellen und möglicherweise Lymphokin-aktivierte Killerzellenaktivität startet. Das Hervorrufen von virusspezifischer cytotoxische- T- Lymphocyt(CTL)-Immzunität, die ebenfalls T-Helferzellen erfordert, ist auch wünschenswert. Während in manchen Fällen die durch CTL erkannten Determinanten tatsächlich durch kleine Peptide definiert sein können, kann für ein wirksames Hervorrufen einer klassischen CTL-Immunantwort eine Expression von Antigenen in vivo, wie beispielsweise in einem Vaccinia- oder adenoviralen Vektor, erforderlich sein. Der AMPHI-Algorythmus wurde entwickelt, um T-Helferzellenstellen zu identifizieren, und folglich ist seine Relevanz mit Bezug auf CTL-Spezifizität unbekannt. Jedoch identifiziert er erfolgreich die beiden charakterisierten Stellen in von menschlicher und Mäuse-CTL erkanntem Influenza-Nukleoprotein.
Die Tatsache, daß T-Helferzellenimmunität mit kurzen Peptiden ebenso oder besser als mit nativen Proteinen induziert werden dann steht in scharfem Gegensatz zu der Situation bei B-Zellenimmunität, für welche die Tertiärstruktur häufig wichtig ist und zeigt an, daß auf T-Zellenimmunität gerichtete Impfstoffe erfolgreicher als auf Antikörperproduktion gerichtete Peptid-Impfstoffe sind. Bei einem Synthetischen Peptid oder einem auf einem rekombinanten Fragment basierenden Konstrukt könnte man wahlweise wichtige T-Helferzellenstellen einschließen, gewünschtenfalls in vielfachen Replikationen, und Supressor-T-Zellenstellen ausschließen, welche die Immunantwort abstumpfen können. Stellen, die spezifischen Funktionen oder möglicherweise unerwünschten Nebenwirkungen zugeordnet sind, wie beispielsweise die CD4-Bindungsstelle(n), die Syncytia-Bildung vermittelnde(n) Stelle(n), oder die Neuroleukin-Homologiestelle, können systematisch eingeschlossen oder ausgeschlossen werden. Für Impfstoffe, die zum Induzieren von Antikörpern sowie von T-Zellenimmunität ausgelegt sind, vermeidet der Einbau von Pathogen-abgeleiteten T-Zellenstellen zusammen mit wichtigen B-Zellenstellen die Notwendigkeit, kleine Peptide an irrelevante Träger zu koppeln, und vermeidet somit Kopplungs- und trägerbezogene Probleme. Folglich sind die hier identifizierten T-Zellenstellen potentiell wichtige Komponenten eines effektiven AIDS-Impfstoffs.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Vorhersage, welche Segmente eines Proteins (gewünschtenfalls längs seiner Gesamtsequenz) antigen sind. Mit anderen Worten, die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung dar, welche Stellen einer Gesamtproteinsequenz von T-Zellen (Aktivier- oder Stimulier-T-Zellen) erkannt werden. Die Anwendung dieses Verfahrens ist nur durch Kenntnis der Aminosäuresequenzen eines Proteins begrenzt, d. h. es kann auf jedes Protein in der Proteindatenbank der National Biomedical Research Foundation oder irgendein Protein angewendet werden, dessen Sequenz später veröffentlicht wird. Darüberhinaus kann die Analyse unter Verwendung der von einer DNA-Gensequenz translatierten Aminosäuresequenz durchgeführt werden, ohne jemals das Protein zu isolieren. Die Hintergrundexperimente, welche dieses Verfahren möglich machen, umfassen in ihrer Gesamtheit eine Prüfung einer Anzahl von Eigenschaften zur Bestimmung, ob eine besondere Eigenschaft bzw. Eigenschaften bei T-Zellenstimulation impliziert ist bzw. sind.
Die folgenden Eigenschaften wurden als fundamental wichtig (mit einem hohen Maß an Signifikanz) zur Bestimmung der potentiellen Immunogenizität gewisser Proteinsequenzen bestimmt:
a) Die spiralige Amphipathizität von Segmenten entlang der Gesamtsequenz eines Proteins,
b) die Konformationsneigung von Segmenten entlang der Gesamtsequenz des Proteins,
c) das Vorhandensein oder Fehlen von Spiralbrechern in Segmenten entlang der Gesamtsequenz des Proteins, und
d) das Vorhandensein und die Lage von T-Zellenerkennung begünstigenden Aminosäureresten in der Proteinsequenz
Diese Eigenschaften wurden zur Entwicklung eines optimierten Algorithmus zum Nachweis von T-Zellen-antigenen Stellen (basierend auf dem amphipathischen Spiralmodell) in einem Protein mit bekannten Sequenzen benutzt. Der optimale Algorythmus identifiziert 18 von 23 bekannten Stellen (75% Empfindlichkeit) mit einem hohen Maß an Signifikanz (p< 0,001). Der Erfolg des Algorithmus zeigt außerdem, daß stabile amphipathische Strukturen, wie beispielsweise amphipathische Spiralen, bei der Bestimmung von Immundominanz fundamental wichtig sind. Der optimierte Algorithmus ermöglicht die Vorhersage von immundominanten T-Zellenstellen an einem Protein. Die Vorhersagefähigkeit erleichtert den rationellen Entwurf Synthetischer Impfstoffe und erleichtert andere Lösungs versuche zur Antigen spezifischen T-Zellenerkennung.

Beispiele

Beispiel 1

Der AMPHI-Algorithmus wurde benutzt, um die HTLV-III-Hüllprotein-Aminosäuresequenz auf Stellen mit Periodischer Variation der Hydrophobizität entsprechend der Bildung einer amphipathischen Spirale (Alpha oder 3&sub1;&sub0; zu prüfen. Überlappende Blöcke von 11 Resten wurden geprüft, und resultierende Parameter dem mittleren Rest zugeordnet. Die Ergebnisse für die env T2- bzw. env T1-Stellen umfassenden 100- bis 200- und 400- bis 500-Rest-Bereiche erscheinen auf der linken und rechten Seite von Fig. 2. Die oberen Tafeln zeigen den amphipathischen Index, ein Maß der Intensität der Amphipathizität, bestimmt bei einer Frequenz von 100º bzw. 120º pro Rest. Der höhere Wert von den beiden ist dargestellt. Die unteren Tafeln zeigen die Häufigkeit an, mit welcher das maximale amphipathische Signal beobachtet wurde. Die Stellen wurden aufgrund ihrer entsprechend hohen amphipathischen Indizes mit Maxima im spiraligen Frequenzbereich ausgewählt. Die Aminosäuresequenzen der angegebenen Stellen sind: env T2(112-124): His-Glu-Asp-Ile-Ile-Ser-Leu-Trp-Asp-Gln-Ser-Leu-Lys; env T1(428-443): Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Glu-Val-Gly-Lys- Ala-Met-Tyr-Ala.

Beispiel 2

Die Anwendung des Algorithmus ist ein hauptsächlicher Schritt bei der Vorhersage der wahrscheinlichsten immundominanten Stellen, die amphipathische spiralige Potenz zeigen. Die Anzahl und Länge der Stellen entlang eines spezifischen Proteins hängen von dem Hydrophobizitätsprofil dieses Proteins ab. Es gibt Proteine, die ein hohes Maß an amphipathischer spiraliger Potenz zeigen (und viele vorhergesagte Stellen enthalten), während andere kaum amphipathische Segmente haben. Nachdem alle möglichen amphipathischen spiraligen Segmente vorhergesagt worden sind, müssen die Segmente klassifiziert werden. Die vorliegende Erfindung bevorzugt die Verwendung von drei Faktoren zu Klassifizierungszwecken:
a) Amphipathischer Wert (insbesondere nützlich, wenn Segmente gleicher Länge verglichen werden);
b) Seltenheit von Prolin in Spiralen im allgemeinen (ausgenommen nahe dem NH&sub2;-Terminus) und in den meisten der spiraligen antigenen Stellen im besonderen; und
c) das Auftreten von Lysin am Carboxyl-Ende in einer großen Anzahl spiraliger antigener Stellen.
Es wurde herausgefunden, daß Lysin als letzter oder vorletzter C-terminaler Rest an immundominanten Stellen viel häufiger auftritt. Kurz gesagt, eine bevorzugte Sequenz enthält amphipathische Segmente mit Prolin, falls vorhanden, nur nahe dem N-Terminus, und Lysin nahe dem C-Terminus.
Ein weiterer möglicher Indikator ist das Vorhandensein von N- Glycosylierungsstellen - diese Stellen zeigen eine weniger günstige Möglichkeit einer immundominanten Stelle an, weil das T-Zellenepitop durch das Kohlenhydrat maskiert sein kann.

Beispiel 3

Unter Verwendung des Verfahrens nach dieser Erfindung wurden die folgenden Segmente als T-Zellen stimulierende Stellen vorhergesagt: 1) Segment 93-127 2) Segment 415-437
Die in dieser Erfindung benutzte Nummeriersequenz entspricht Ratner u. a., Nature, 313 : 277-284 (1985).
Der unterstrichene Teil jedes Segments ist durch andere Methoden als eine T-Zellen-Stimulationsstelle gezeigt worden.

Beispiel 4

Die folgenden Segmente aus der Hüllregion des HIV-Genoms sind als mögliche Stellen für T-Zellen-Stimulationsstellen vorhergesagt worden:
Segment 231-250 Segment 615-652
Segment 307-331 Segment 659-681
Segment 335-357 Segment 777-808
Segment 553-574 Segment 827-856
Die folgenden Segmente aus der gag-Region des HIV-Genoms sind als mögliche Stellen für T-Zellen-Stimulationsstellen vorhergesagt worden:
Segment 5-22 Segment 148-162
Segment 52-70 Segment 284-309
Segment 93-110 Segment 360-376
Die in dieser Erfindung benutzte Nummeriersequenz entspricht Ratner u. a., Nature, 313 : 277-284 (1985).
Die Aminosäuresequenzen für diese Peptide sind in Tafel 3 dargestellt.

Tafel 3

Aus dem env-Protein: Segment 93-127 Segment 231-250 Segment 307-331 Segment 335-357 Segment 415-437 Segment 553-574 Segment 615-652 Segment 659-681 Segment 777-808 Segment 827-856
Aus dem gag-Protein: Segment 5-22 Segment 52-70 Segment 93-110 Segment 148-162 Segment 284-309 Segment 360-376 Alanin Leucin Arginin Lysin Asparagin Methionin Asparaginsäure Phenylalanin Cystein Prolin Glutamin Serin Glutaminsäure Threonin Glycin Tryptophan Histidin Tyrosin Isoleucin Valin

Claims

1. Isolierte Peptide oder Teile hiervon, die dafür ausgebildet sind, als Komponenten eines Impfstoffs für das erworbene Immundefektsyndrom (AIDS) zu dienen, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide in der Lage sind, eine spezifische T-Zellen- Immunantwort auf den Virus des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) zu induzieren, und daß die genannten Peptide aus Aminosäuresequenzen ausgewählt sind, die im Einbuchstabencode lauten:

T-Zellensequenzen HTLV-IIIb env T1, Reste 428-443, und env T2, Reste 112-124 oder Teile hiervon.

2. Synthetische Peptide mit T-Zellensequenzen HTLV-IIIb env T1 und env T2, wobei es sich um Reste 428-443 bzw. 112-124 handelt, unter Anwendung der Standard-Epitop nomenklatur.

3. Synthetische Peptide entsprechend den Sequenzen nach Anspruch 2.

4. Synthetische Peptide im wesentlichen entsprechend den Sequenzen nach Anspruch 2 oder Teilen hiervon.

5. Peptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die genannten Peptide Sequenzen von HIV-Virusproteinen entsprechen und, wenn sie in einen Impfstoff eingebracht sind, in der Lage sind, eine T-Zellenimmunität gegen das erworbene Immundefektsyndrom zu induzieren.

6. Peptide nach Anspruch 5, wobei die T-Zellen-Immunantwort die Induktion von T-Zellen-Immunität ist.

7. Peptide nach Anspruch 5, wobei die T-Zellen-Immunantwort die Induktion von T-Zellen-Hilfe für eine Antikörper-Immunantwort ist.

8. Synthetisches Peptid, das in der Lage ist, eine T-Zellen- Immunantwort herbeizuführen, wobei das genannte Peptid im wesentlichen den Aminosäuresequenzen 428-443 des HIV-Hüllproteins entspricht.

9. Synthetisches Peptid, das in der Lage ist, eine T-Zellen- Immunantwort beizuführen, wobei das genannte Peptid im wesentlichen den Aminosäuresequenzen 112 bis 124 des HIV-Hüllproteins entspricht.

10. Herstellung synthetischer Peptide entsprechend den Sequenzen nach Anspruch 2, welches die Schritte des Definierens von Peptiden durch Suchen nach Segmenten, die Periodizität von Hydrophobie-Eigenschaften haben, wobei die genannten Segmente die Fähigkeit zeigen, amphipathische Spiralen zu bilden, die von antigenen T-Zellenbereichen erkannt werden, und des synthetischen Herstellens der genannten Peptide umfaßt.

11. Verwendung der Peptide nach Anspruch 1 bei der Zubereitung eines Medikaments zur AIDS-Behandlung.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Medikament ein Impfstoff ist.