DE60035523T2 - Optimierte minigene und dadurch kodierte peptide - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biologie. Sie betrifft vor allem Polyepitop-Vakzine und Verfahren zum Entwickeln derartiger Vakzine, die eine erhöhte Immunogenität aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen werden die Polyepitop-Vakzine durch ein Minigen codiert, das eine optimierte Immunogenität des Konstrukts liefert.
  • Die für Multiepitop-Vakzine ("Minigen"-Vakzine) relevante Technologie befindet sich in der Entwicklung. Mehrere unabhängige Studien haben ergeben, dass das Induzieren simultaner Immunantworten gegen mehrere Epitope erreicht werden kann. Es können beispielsweise Antworten gegen eine große Zahl von T-Zell-Spezifitäten induziert und nachgewiesen werden. In natürlichen Situationen haben Doolan et al. [Immunity, Bd. 7(1):97-112 (1997)] gleichzeitig Recall-T-Zell-Antworten gegen 17 verschiedene P. falciparum-Epitope unter Verwendung von PBMC von einem einzelnen Spender nachgewiesen. Ähnlich haben Bertoni et coll. [J. Clin Invest, Bd. 100(3):503-13 (1997)] simultane Antworten gegen 12 verschiedene HBV-abgeleitete Epitope in einem einzige Spender nachgewiesen. Im Hinblick auf die Immunisierung mit Multiepitop-DNA-Minigen-Vakzinen ist über mehrere Beispiele berichtet worden, bei denen mehrere T-Zell-Antworten induziert wurden. Beispielsweise ist über Minigen-Vakzine berichtet worden, die aus etwa zehn MHC-Klasse-I-Epitopen zusammensetzt sind, in denen alle Epitope immunogen und/oder antigen waren. Es wurde speziell für Minigen-Vakzine, die aus 9 EBV-Epitopen [Thom son et al., Proc Natl Acad Sci USA, Bd. 92(13):5845-9 (1995)], 7 HIV-Epitopen [Woodberry et al., J. Virol, Bd. 73(7):5320-5 (1999)], 10 murinen Epitopen (Epitope der Maus) [Thomson et al., J. Immunol. Bd. 160(4): 1717-23 (1998)] und 10 Tumor-abgeleiteten Epitopen [Mateo et al., J. Immunol, Bd. 163(7):4058-63 (1999)] bestehen, gezeigt, dass sie wirksam sind. Es ist auch gezeigt worden, dass ein Multiepitop-DNA-Plasmid, das neun verschiedene HLA-A.2.1- und A11-restringierte Epitope ("restricted epitopes"), die vom HBV und HIV abgeleitet waren, CTL gegen alle Epitope induzierte [Ishioka et al., J. Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)].
  • Demnach können Minigen-Vakzine, die mehrere MHC-Klasse-I-Epitope (d.h. CTL-Epitope) enthalten, entwickelt werden, und die Präsentation und die Erkennung kann für alle Epitope erhalten werden. Die Immunogenität der Multiepitop-Konstrukte scheint jedoch stark durch eine Zahl von Variablen beeinflusst zu werden, eine Zahl, die bislang unbekannt gewesen ist. Beispielsweise kann die Immunogenität (oder Antigenität) des gleichen Epitops, das im Rahmen verschiedener Vakzin-Konstrukte exprimiert wird, über mehrere Größenordnungen variieren. Es gibt demnach einen Bedarf am Erkennen von Strategien für die Optimierung von Multiepitop-Vakzin-Konstrukten. Eine derartige Optimierung ist wichtig im Hinblick auf das Induzieren kräftiger Immunantworten und schlussendlich für die klinische Wirksamkeit. Die vorliegende Erfindung liefert dementsprechend Strategien für die Optimierung der Antigenizität und Immunogenität von Polyepitop-Vakzinen, die eine große Zahl von Epitopen umfassen, und optimierte Polyepitop-Vakzine, vor allem Minigen-Vakzine, die diesen Strategien entsprechend erzeugt werden.
  • Die folgenden Absätze geben einen kurzen Überblick über die Hauptvariablen, die potentiell die Minigen-Immunogenität, die Epitopprozessierung und die Präsentation auf antigenpräsentierenden Zellen (APCs) in Verbindung mit Klasse-I- und Klasse-II-MHC-Molekülen beeinflussen.
  • Immundominanz
  • Von den vielen tausenden möglichen Peptiden, die durch ein komplexes Fremdpathogen codiert werden, findet sich nur ein kleiner Teil in einer Peptidform wieder, die imstande ist, an MHC-Klasse-I-Antigene zu binden und somit von T-Zellen erkannt zu werden. Dieses Phänomen mit offensichtlicher möglicher Auswirkung auf die Entwicklung eines Multiepitop-Vakzins ist als Immundominanz bekannt [Yewdell et al., Annu Rev Immunol, 17:51-88 (1999)]. Mehrere Hauptvariablen tragen zur Immundominanz bei. Hier beschreiben wir Variable, die die Erzeugung der geeigneten Peptide, sowohl in qualitativer als auch in quantitativer Hinsicht, als Ergebnis einer intrazellulären Prozessierung, beeinflussen.
  • Verknüpfungsepitope ("Junctional Epitopes")
  • Ein Verknüpfungsepitop ist als ein Epitop definiert, das durch die Nebeneinanderstellung von zwei anderen Epitopen erzeugt wird. Das neue Epitop ist aus einem C-terminalert Abschnitt, der von einem ersten Epitop stammt, und einem N-terminalen Abschnitt, der von einem zweiten Epitop stammt, zusammengesetzt. Die Entstehung von Verknüpfungsepitopen stellt aus den folgenden Gründen ein potentielles Problem bei der Entwicklung von Multiepitop-Minigen-Vakzinen, sowohl für Klasse-I- als auch Klasse-II-restringierte Epitope, dar. Erstens könnte bei der Entwicklung eines Mingens, das aus humanen Epitopen zusammengesetzt ist oder diese enthält, die typischerweise hinsichtlich der Immunogenität in HLA-transgenen Labortieren getestet werden, die Erzeugung von murinen Epitopen unerwünschte Immundominanzeffekte hervorrufen. Zweitens könnte die Erzeugung neuer, unbeabsichtigter Epitope für humane HLA-Klasse-I- oder HLA-Klasse-II-Moleküle in Vakzin-Empfängern neue T-Zell- Spezifitäten hervorbringen, die von infizierten Zellen oder Tumoren nicht exprimiert werden, die den von den Zielzellen induzierten T-Zell-Antworten entsprechen. Diese Antworten sind definitionsgemäß nicht relevant und wirkungslos und könnten sogar kontraproduktiv sein, wenn unerwünschte Immundominanzeffekte erzeugt werden.
  • Die Existenz von Verknüpfungsepitopen ist in einer Vielzahl verschiedener experimenteller Situationen dokumentiert worden. Gefter et coll. haben den Effekt als erste in einem System gezeigt, in dem zwei verschiedene Klasse-II-restringierte Epitope nebeneinander gestellt und kollinear synthetisiert wurden [Perkins et al., J Immunol, Bd. 146(7):2137-44 (1991)]. Der Effekt war so ausgeprägt, dass die Immunsystemerkennung der Epitope durch diese neuen Verknüpfungsepitope vollständig "stillgelegt" werden könnte [Wang et al., Cell Immunol, Bd. 143(2):284-97 (1992)]. Helfer-T-Zellen, die gegen Verknüpfungsepitope gerichtet sind, wurden auch in Menschen als Folge einer Immunisierung mit einem synthetischen Lipopeptid beobachtet, das aus einem HLA-A2-restringierten, HBV-abgeleiteten immundominanten CTL-Epitop und einem universellen Tetanus-Toxoid-abgeleiteten HTL-Epitop zusammengesetzt war [Livingston et al., J Immunol, Bd. 159(3):1383-92 (1997)]. Die Erzeugung von Verknüpfungsepitopen stellt demnach einen wesentlichen, abzuwägenden Punkt bei der Entwicklung von Polyepitop-Konstrukten dar.
  • Die vorliegende Erfindung gibt Verfahren für die Adressierung dieses Problems und zum Vermeiden oder Minimieren des Auftretens von Verknüpfungsepitopen an.
  • Flankierende Regionen
  • Klasse-I-restringierte Epitope werden durch ein komplexes Verfahren erzeugt [Yewdell et al., Annu Rev Immunol, 17:51-88 (1999)]. Die begrenzte Proteolyse, an der Endoproteasen beteiligt sind, und ein mög liches Bearbeiten durch Exoproteasen werden von einer Translokation durch die Membran des endoplasmatische Retikulums (ER) mit Hilfe eines Transporters, die mit antigenprozessierenden Molekülen (TAP) assoziiert ist, gefolgt. Der wesentliche cytosolische Proteasekomplex, der an der Erzeugung antigener Peptide und deren Vorläufern beteiligt ist, ist das Proteasom [Niedermann et al., Immunity, Bd. 2(3):289-99 (1995)], obwohl die ER-Bearbeitung von CTL-Vorläufern ebenfalls gezeigt worden ist [Paz et al., Immunity, Bd. 11(2):241-51 (1999)]. Es hat lange Diskussionen gegeben, ob die Reste, die den C- und den N-Terminus des Epitops unmittelbar flankieren, einen Einfluss auf die Effizienz der Epitoperzeugung haben oder nicht.
  • Die Ausbeute und die Verfügbarkeit eines prozessierten Epitops ist als eine wesentliche Variable bei der Bestimmung der Immunogenität einbezogen worden und könnte daher deutlich einen wesentlichen Einfluss auf die Gesamtpotenz eines Minigens haben, weil die Stärke der Immunantwort direkt proportional zur Menge an Epitop sein kann, die durch MHC gebunden wird und die für die T-Zellerkennung präsentiert wird. Verschiedene Studien haben Beweise dafür geliefert, dass dies in der Tat der Fall ist. Beispielsweise ist eine Induktion von Virus-spezifischen CTL, die im Wesentlichen proportional zur Epitopdichte ist [Wherry et al., J Immunol, Bd. 163(7):3735-45 (1999)], beobachtet worden. Weiterhin sind rekombinante Minigene, die ein vorprozessiertes optimales Epitop codieren, verwendet worden, um ein höheres Ausmaß der Epitopexpression hervorzurufen, als natürlicherweise für ein Protein voller Länge beobachtet wird [Anton et al., J Immunol, Bd. 158(6):2535-42 (1997)]. Ganz allgemein ist gezeigt worden, dass das Priming mit einem Minigen effizienter ist als das Priming mit dem vollständigen Antigen [Restifo et al., J Immunol, Bd. 154(9):4414-22 (1995); Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)], obwohl einige Ausnahmen festgestellt worden sind [Iwasaki et al., Vaccine, Bd. 17(15-16):2081-8 (1999)].
  • Frühe Studien haben gefolgert, dass Reste innerhalb des Epitops [Hahn et al., J Exp Med, Bd. 176(5):1335-41 (1992)] die Immunogenität primär regulieren. Ähnliche Schlussfolgerungen waren das Ergebnis anderer Studien, die überwiegend auf dem Pfropfen eines Epitops in ein nicht damit zusammenhängendes Gen oder in das gleiche Gen, aber an einer verschiedenen Stelle, basierten [Chimini et al., J Exp Med, Bd. 169(1):297:302 (1989); Hahn et al., J Exp Med, Bd. 174(3):733-6 (1991)]. Andere Experimente [Del Val et al., Cell, Bd. 66(6):1145-53 (1991); Hahn et al., J Exp Med, Bd. 176(5):1335-41 (1992)], haben jedoch vorgeschlagen, das Reste, die unmittelbar benachbart zum CTL-Epitop lokalisiert sind, die Erkennung unmittelbar beeinflussen können [Couillin et al., J Exp Med, Bd. 180(3):1129-34 (1994); Bergmann et al., J Virol. Bd. 68(8):5306-10 (1994)]. Im Zusammenhang mit Minigen-Vakzinen sind die Diskussionen erneut aufgetreten. Shastri et coll. [Shastri et al., J Immunol, Bd. 155(9):4339-46 (1995)] haben herausgefunden, dass T-Zell-Antworten durch die Variation des N-terminalen flankierenden Rests nicht signifikant beeinflusst wurden, aber durch die Zugabe eines einzigen C-terminalen flankierenden Rests gehemmt wurden. Die dramatischste Hemmung wurde mit Isoleucin, Leucin, Cystein und Prolin als C-terminale flankierende Reste beobachtet. Im Gegensatz hierzu hat Gileadi [Gileadi et al., Eur J Immunol, Bd. 29(7):2213-22 (1999)] über tiefgreifende Effekte in Abhängigketi von den Resten berichtet, die am N-Terminus von Maus-Influenzavirus-Epitopen lokalisiert sind. Bergman et coll. haben herausgefunden, dass aromatische, basische und Alaninreste eine effiziente Epitoperkennung unterstützten, während G- und P-Reste stark hemmend wirkten [Bergmann et al., J Immunol, Bd. 157(8):3242-9 (1996)]. Im Gegensatz hierzu zog Lippolis [Lippolis et al., J Virol, Bd. 69(5):3134-46 (1995)] die Schlussfolgerung, dass die Substitution fflankierender Reste die Erkennung nicht beeinflusst. Es wurden jedoch nur eher konservative Substitutionen getestet, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie die Proteasomspezifität beeinflussen.
  • Es scheint so zu sein, dass die Spezifität dieser Effekte und allgemein von natürlichen Epitopen näherungsweise mit der Proteasomspezifität korreliert. Beispielsweise ist die Proteasomspezifität teilweise trypsinartig [Niedermann et al., Immunity, Bd. 2(3):289-99 (1995)], mit Spaltung nach basischen Aminosäuren. Eine effiziente Spaltung der Carboxyseite von hydrophoben und sauren Reste ist jedoch auch möglich. Die Studien von Shermann et coll., die herausgefunden haben, dass eine R-zu-H-Mutation in der Position, die auf den C-Terminus eines p53-Epitops folgt, die Proteasom-vermittelte Prozessierung des Proteins beeinflusst, stehen im Einklang mit diesen Spezifitäten [Theobald et al., J Exp Med, Bd. 188(6):1017-28 (1998)]. Verschiedene andere Studien [Hanke et al., J Gen Virol, Bd 79 (Pt 1):83-90 (1998); Thomson et al., Proc Natl Acad Sci USA, Bd. 92(13):5845-9 (1995)] wiesen darauf hin, dass Minigene unter Verwendung minimaler Epitope konstruiert werden können und dass diese flankierenden Sequenzen nicht erforderlich zu sein scheinen, auch wenn das Potential für die weitere Optimierung durch die Verwendung von flankierenden Regionen ebenfalls anerkannt wurde.
  • In der Summe sind bei HLA-Klasse-I-Epitopen die Auswirkungen flankierender Regionen auf die Prozessierung und Präsentation von CTL-Epitopen weiterhin nicht definiert. Eine systematische Analyse des Effekts der Veränderung flankierender Regionen ist für Minigen-Vakzine nicht durchgeführt worden. Daher ist eine Analyse, bei der Minigen-Vakzine verwendet werden, die Epitope codieren, die allgemein durch die humane Klasse I restringiert sind, erforderlich. Die vorliegende Erfindung liefert eine solche Analyse und liefert dem gemäß Polyepitop-Vakzinkonstrukte, die hinsichtlich Immunogenität und Antigenizität optimiert sind, und Verfahren für die Entwicklung derartiger Konstrukte.
  • HLA-Klasse-II-Peptidkomplexe werden ebenfalls als Ergebnis einer komplexen Reihe von Ereignissen erzeugt, die verschieden von der HLA-Klasse-I-Prozessierung sind. Der Prozessierungsweg schließt die Assoziierung mit Invarianter Kette (Ii), ihren Transport in spezialisierte Kompartimente, den Abbau von Ii zu CLIP, und die HLA-DM-katalysierte Entfernung von CLIP ein [siehe Blum et al., Crit Rev Immunol, Bd. 17 (5-6):411-7 (1997); Arndt et al., Immunol Res, Bd. 16(3):261-72 (1997) für einen Überblick). Weiterhin gibt es eine potentielle wichtige Rolle verschiedener Cathepsine im Allgemeinen, und von Cathepsin S und L im Besonderen, beim Ii-Abbau [Nakagawa et al., Immunity, Bd. 10(2):207-17 (1999)]. Hinsichtlich der Erzeugung von funktionellen Epitopen scheint der Vorgang etwas weniger selektiv zu sein [Chapman H.A., Curr Opin Immunol, Bd. 10(1):93-102 (1998)], und Peptide mit vielen Größen können an MHC-Klasse II binden [Hunt et al., Science, Bd. 256(5065):1817-20 (1992). Die meisten oder alle möglichen Peptide scheinen erzeugt zu werden [Moudgil et al., J Immunol, Bd. 159(6):2574-9 (1997); und Thomson et al., J Virol, Bd. 72(3):2246-52 (1998)]. Demnach kann, verglichen mit dem Thema der flankierenden Regionen, die Entstehung von Verknüpfungsepitopen in besonderen Ausführungsformen eine ernstere Angelegenheit sein.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung liefert die Offenbarung von Parametern, die brauchbar sind für die Optimierung der Wirksamkeit von Polyepitop-Vakzinen. Ebenfalls offenbart werden Polyepitop-Konstrukte und Nucleinsäuren, die derartige Konstrukte (Minigene) codieren.
  • Nach einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines optimierten Multiepitop-Polypeptids bereit, das umfasst:
    • (i) Auswählen von mindestens zwei Epitopen, die HLA-Allelspezifische (HLA: humanes Leukocyten-Antigen) Motive oder Supermotive enthalten, wobei diese Epitope HLA-Klasse-I-CTL-Epitope (CTL: cytotoxischer T-Lymphocyt) sind; und
    • (ii) Einfügen dieser mindestens zwei CTL-Epitope in ein Multiepitop-Polypeptid, wobei während des Einfügeschrittes (ii)
    mindestens ein flankierender oder als Abstandshalter wirkender Aminosäurerest am C-Terminus von mindestens einem dieser mindestens zwei CTL-Epitope eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter Lysin (K), Arginin (R), Asparagin (N), Glutamin (Q), Glycin (G), Alanin (A), Serin (S), Cystein (C) und Threonin (T) ausgewählt wird; und
    wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines CTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines optimierten Multiepitop-Polypeptids bereit, das umfasst:
    • (i) Auswählen von mindestens zwei Epitopen, die HLA-Allel-spezifische (HLA: humanes Leukocyten-Antigen) Motive oder Supermotive enthalten, wobei diese Epitope HLA-Klasse-II-HTL-Epitope (HTL: Helfer-T-Lymphocyt) sind; und
    • (ii) Einfügen dieser mindestens zwei HTL-Epitope in ein Multiepitop-Polypeptid, wobei während des Einfügeschrittes (ii)
    mindestens ein flankierender oder als Abstandshalter wirkender Aminosäurerest am C-Terminus von mindestens einem der mindestens zwei HTL-Epitope eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter Glycin (G), Prolin (P) und Asparagin (N) ausgewählt wird; und
    wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  • Die als Abstandshalter wirkenden Aminosäurereste können unabhängig unter den Resten ausgewählt werden, die keine bekannten primären Humanes-Leukocyten-Antigen-Klasse-II-Verankerungsgruppen sind. In besonderen Ausführungsformen verhindert das Einführen der Abstandshalterreste das Auftreten eines HTL-Epitops. Ein derartiger Abstandshalter umfasst oft mindestens 5 Aminosäurereste, die unabhängig unter G, P und N ausgewählt werden. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Abstandshalter um GPGPG.
  • In einigen Ausführungsformen verhindert das Einführen der Abstandshalterreste das Auftreten eines CTL-Epitops, wobei der Abstandshalter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 Aminosäurereste umfasst, die unabhängig unter A und G ausgewählt werden. Der flankierende Rest wird oft an der C+1-Position eines CTL-Epitops eingeführt und wird unter K, R, N, G und A ausgewählt.
  • In einigen Ausführungsformen ist der flankierende Rest benachbart zu der Abstandshaltersequenz. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch die Substitution eines N-terminalen Rests eines HLA-Epitops, das benachbart zu einem C-Terminus eines HLA-Epitops ist, das von dem Polyepitop-Konstrukt umfasst wird, durch einen Rest einschließen, der unter K, R, N, G und A ausgewählt wird.
  • Es ist ebenfalls möglich, einen Schritt durchzuführen, in dem eine Struktur des Polyepitop-Konstrukts vorhergesagt wird, und weiterhin ein oder mehrere Konstrukte ausgewählt werden, die eine maximale Struktur haben, d. h. die auf einen HLA-Prozessierungsweg prozessiert werden, um alle Epitope zu erzeugen, die von dem Konstrukt umfasst werden.
  • Ebenfalls beschrieben wird ein Polyepitop-Konstrukt, das unter Anwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche hergestellt wird. Oft werden die Epitope, die von dem Polyepitop-Konstrukt umfasst werden, von einem Minigen codiert. Das Polyepitop-Konstrukt, das durch das Minigen codiert wird, kann HIV-TT, das in 9 gezeigt wird, HIV-DG, das in 9 gezeigt wird, oder HIV-TC, das in 9 gezeigt wird, sein.
  • DEFINITIONEN
  • Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Definitionen besser verstanden werden:
    In der gesamten Offenbarung werden "Bindungsdaten"-Ergebnisse oft in Form von "IC50" ausgedrückt.
  • IC50 ist die Peptidkonzentration in einem Bindungsassay, bei der 50 % Hemmung der Bindung eines Referenzpeptids beobachtet wird. Unter den gegebenen Bedingungen, unter denen die Assays ausgeführt wird (d.h. limitierende HLA-Proteine und Konzentration markierter Peptide), nähern sich diese Werte den KD-Werten an. Assays für die Ermittlung der Bindungsdaten werden detailliert beschrieben, z.B. in den PCT-Veröffentlichungen WO 94/20127 und WO 94/03205 . Es sollte beachtet werden, dass sich IC50-Werte andern können, oft dramatisch andern können, wenn die Assaybedingungen variiert werden, und in Abhängigkeit von den speziellen verwendeten Reagenzien (e.g., HLA-Aufbereitung etc.). Beispielsweise führen über höhte Konzentrationen an HLA-Molekülen zu einer Erhöhung des scheinbar gemessenen IC-50-Wertes eines gegebenen Liganden. Alternativ wird die Bindung bezogen auf ein Referenzpeptid ausgedrückt. Auch wenn ein spezieller Assay mehr oder weniger empfindlich wird, können sich die IC50-Werte der getesteten Peptide etwas ändern, während sich die Bindung, bezogen auf das Referenzpeptid, nicht bedeutend ändert. Beispielsweise ändern sich in einem Assay, der unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass der IC50-Wert des Referenzpeptids um das 10-fache steigt, auch die IC50-Werte der Testpeptide um etwa das 10-fache. Um Unklarheiten zu vermeiden, basiert die Untersuchung, ob ein Peptid gut, mittelmäßig oder schwach oder nicht anbindet, im Allgemeinen auf seinem IC50-Wert, bezogen auf den IC50-Wert eines Standardpeptids. Das Anbinden kann auch unter Verwendung anderer Assaysysteme untersucht werden, die verwenden : lebende Zellen (z. B., Ceppellini et al., Nature 339:392, 1989; Christnick et al., Nature 352:67, 1991; Busch et al., Int. Immunol. 2:443, 1990, Hill et al., J. Immunol. 147:189, 1991; del Guerico et al., J. Immunol. 154:685, 1995), zellfreie Systeme, die Detergenslysate verwenden (z. B. Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069, 1991), immobilisiertes gereinigtes MHC (z. B. Hill et al., J. Immunol. 152, 2890, 1994; Marshall et al., J. Immunol. 152:4946, 1994; ELISA-Systeme (z. B. Reay et al., EMBO J. 11:2829, 1992), Oberflächenplasmonresonanz (z. B. Khilko et al., J. Biol. Chem. 268:15425, 1993); "high flux soluble Phase assays" (Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353, 1994) und Messung der/des Klasse-I-MHC-Stabilisierung oder -Aufbaus (z. B., Ljunggren et al., Nature 346:476, 1990; Schumacher et al., Cell 62:563, 1990; Townsend et al., Cell 62:285, 1990; Parker et al., J. Immunol. 149:1896, 1992).
  • Die Bezeichnung der Position eines Rests in einem Epitop als "Carboxyterminus" oder die "Carboxy-terminale Position" bezieht sich auf die Position des Rests an dem Ende des Epitops, das am nächsten liegt zum Carboxy-Terminus eines Peptids, der unter Verwendung der herkömmlichen Nomenklatur bezeichnet wird, wie sie weiter unten definiert wird. "C + 1" bezieht sich auf den Rest oder die Position, der/die unmittelbar auf den C-terminalen Rest des Epitops folgt, d. h. es bezieht sich auf den Rest, der den C-Terminus des Epitops flankiert. Die "Carboxy-terminale Position" des Epitops, das am Carboxyende des Polyepitop-Konstrukts vorkommt, kann, muss aber nicht tatsächlich dem Carboxy-terminalen Ende des Polypeptids entsprechen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die in den optimierten Polyepitop-Konstrukten eingesetzten Epitope Motiv-tragende Epitope, und der Carboxy-Terminus des Epitops wird bezogen auf primäre Verankerungsreste definiert, die sich auf ein bestimmtes Motiv beziehenen.
  • Die Bezeichnung der Position eines Rests in einem Epitop als "Amino-Terminus" oder "Amino-terminale Position" bezieht sich auf die Position des Rests an dem Ende des Epitops, dass sich am nächsten beim Amino-Terminus eines Peptids befindet, der unter Verwendung der herkömmlichen Nomenklatur bezeichnet wird, wie sie weiter unten definiert wird. "N – 1" bezieht sich auf den Rest oder die Position, der/die unmittelbar benachbart zu dem Epitop am Amino-terminalen Ende (Position Nummer 1) eines Epitops ist. Die "Amino-terminale Position" des Epitops, die am Amino-terminalen Ende des Polyepitop-Konstrukts vorkommt, kann, muss aber nicht tatsächlich dem Amino-terminalen Ende des Polypeptids entsprechen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die in den optimierten Polyepitop-Konstrukten eingesetzten Epitope Motiv-tragende Epitope, und der Amino-Terminus des Epitops wird bezogen auf primäre Verankerungsreste definiert, die sich auf ein bestimmtes Motiv beziehen.
  • Ein "Computer" oder ein "Computersystem" umfasst im Allgemeinen: einen Prozessor, mindestens einen Apparat zum Speichern/Abrufen von Informationen, wie zum Beispiel eine Festplatte, ein Diskettenlaufwerk oder ein Bandlaufwerk; mindestens ein Eingabegerät, zum Beispiel eine Tastatur, eine Maus, ein Bildschirm mit Berührungseingabe oder ein Mikrophon; eine Anzeigestruktur. Zusätzlich kann der Computer einen Kommunikationskanal in Kommunikation mit einem Netzwerk einschließen. Ein derartiger Computer kann mehr oder weniger als das einschließen, was oben aufgelistet wird.
  • Ein "Konstrukt", so wie der Begriff hier verwendet wird, bezeichnet allgemein eine Zusammensetzung, die in der Natur nicht vorkommt. Ein Konstrukt kann durch Synthesetechnologien, z. B. die Erzeugung und Expression von rekombinanter DNA, oder durch chemische Synthesetechniken für Nucleinsäuren oder Aminosäuren erzeugt werden. Ein Konstrukt kann auch durch die Addition oder das Aneinanderreihen eines Materials an ein anderes Material hergestellt werden, wobei das Ergebnis nicht in dieser Form in der Natur gefunden wird. Ein "Polyepitop-Konstrukt" umfasst mehrere Epitope.
  • "Kreuzreaktives Binden" weist darauf hin, dass ein Peptid von mehr als einem HLA-Molekül gebunden wird; ein Synonym ist entartetes Binden.
  • Ein "kryptisches Epitop" ruft eine Antwort durch Immunisierung mit einem isolierten Peptid hervor, aber die Antwort ist in vitro nicht kreuzreaktiv, wenn das intakte vollständige Protein, das das Epitop umfasst, als Antigen verwendet wird.
  • Ein "dominantes Epitop" ist ein Epitop, das eine Immunantwort bei der Immunisierung mit einem vollständigen nativen Antigen (siehe z. B. Sercarz, et al., Annu. Rev. Immunol. 11:729-766, 1993) hervorruft. Eine derartige Antwort ist in vitro kreuzreaktiv mit einem isolierten Peptidepitop.
  • In Bezug auf eine bestimmte Aminosäuresequenz ist ein "Epitop" ein Satz von Aminosäureresten, der an der Erkennung durch ein bestimmtes Immunglobulin beteiligt ist, oder im Zusammenhang mit T-Zellen sind es die Reste, die für die Erkennung durch T-Zellrezeptorproteine und/oder MHC-Rezeptoren ("Major Histocompatibility Complex") erforderlich sind. In einem Immunsystem-Szenario, in vivo oder in vitro, stellt ein Epitop die kollektiven Merkmale eines Moleküls, wie Primär-, Sekundär- und Tertiärpeptidstruktur, und Ladung, dar, die zusammen eine Stelle bilden, die von einem Immunglobulin, einem T-Zellrezeptor oder einem HLA-Molekül erkannt wird. In der gesamten Offenbarung werden Epitop und Peptid oft gegeneinander austauschbar verwendet. Es soll jedoch verstanden werden, dass isolierte oder gereinigte Protein- oder Peptidmoleküle, die größer als ein erfindungsgemäßes Epitop sind und ein derartiges Epitop umfassen, immer noch innerhalb der Grenzen der Erfindung liegen.
  • Ein "flankierender Rest" ist ein Rest, der benachbart zu einem Epitop positioniert ist. Ein flankierender Rest kann an einer Stelle benachbart zum N-Terminus oder zum C-Terminus eines Epitops eingeführt oder insertiert werden.
  • Ein "immunogenes Peptid" oder "Peptidepitop" ist ein Peptid, das ein Allel-spezifisches Motiv oder Supermotiv umfasst, so dass das Peptid an ein HLA-Molekül bindet und eine CTL- und/oder HTL-Antwort induziert. Immunogene Peptide der Erfindung sind demnach imstande, an ein geeignetes HLA-Molekül zu binden und anschließend eine cytotoxische-T-Zellantwort oder eine Helfer-T-Zellantwort auf das Antigen, von dem das immunogene Peptid abgeleitet ist, hervorzurufen.
  • "Heteroklitische Analoga" sind hier als ein Peptid mit einer erhöhten Wirksamkeit bei einer spezifischen T-Zelle definiert, was durch ver stärkte Antworten auf eine vorgegebene Dosis oder durch geringere erforderliche Mengen, um die gleiche Antwort zu erzielen, gemessen wird. Zu den Vorteilen heteroklitischer Analoga gehört, dass die Antigene potenter sein können, oder ökonomischer (da eine geringe Menge erforderlich ist, um den gleichen Effekt zu erzielen). Zusätzlich könnten modifizierte Epitope das Ausbleiben antigenspezifischer T-Zellantworten überwinden (T-Zelltoleranz).
  • "Humanes Leukocyten-Antigen" oder "HLA" ist ein humanes Klasse I oder Klasse II Haupthistokompatibilitätskomplex-Protein ("MHC" = Major Histocompatibility Complex) (siehe z. B. Stites et al., IMMUNOLOGY, B. Auflage, Lange Publishing, Los Altos, CA (1994).
  • Ein "HLA-Supertyp oder eine HLA-Familie", so wie der Begriff hier verwendet wird, beschreibt Sätze von HLA-Molekülen, die auf der Basis von gemeinsamen Peptid-Bindungsspezifitäten gruppiert werden. HLA-Klasse-I-Moleküle, die eine einigermaßen ähnliche Bindungsaffinität für Peptide teilen, die bestimmte Aminosäuremotive aufweisen, werden in derartige HLA-Supertypen gruppiert. Die Ausdrücke HLA-Superfamilie, HLA-Supertyp-Familie, HLA-Familie und HLA-xx-ähnliche Moleküle (worin xx einen speziellen HLA-Typ bezeichnet) sind synonym.
  • Der Begriff "hohe Affinität" in Bezug auf HLA-Klasse-I-Moleküle, so wie er hier verwendet wird, ist definiert als ein Binden mit einem IC50- oder KD-Wert von 50 nM oder darunter; "mittlere Affinität" ist ein Binden mit einem IC50- oder KD-Wert von etwa 50 bis etwa 500 nM. "Hohe Affinität" in Bezug auf das Binden an HLA-Klasse-II-Moleküle ist definiert als ein Binden mit einem IC50- oder KD-Wert von 100 nM oder darunter; "mittlere Affinität" ist ein Binden mit einem IC50- oder KD-Wert im Bereich von etwa 100 bis etwa 1000 nM.
  • Ein "IC50"-Wert ist die Konzentration eines Peptids in einem Bindungsassay, bei der 50 % Hemmung des Anbindens eines Referenzpeptids beobachtet wird. Unter den gegebenen Bedingungen, unter denen der Assay durchgeführt wird (d. h. limitierende HLA-Proteine und Konzentrationen markierter Peptide) nähern sich diese Werte den KD-Werten an.
  • Die Ausdrücke "identisch" oder prozentuale "Identität" im Zusammenhang mit mindestens zwei Peptidsequenzen beziehen sich auf mindestens zwei Sequenzen oder Subsequenzen, die gleich sind oder einen angegebenen prozentualen Anteil an Aminosäureresten aufweisen, die gleich sind, wenn sie verglichen werden und für eine maximale Übereinstimmung über ein Vergleichsfenster aneinander ausgerichtet werden, was unter Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus oder durch die manuelle Ausrichtung und visuelle Untersuchung gemessen wird.
  • Das "Einführen" eines Aminosäurerests in eine spezielle Position in einem Polyepitop-Konstrukt, z. B. auf der C-terminalen Seite benachbart zum C-Terminus eines Epitops, umfasst das Konfigurieren mehrerer Epitope in einer solchen Weise, dass sich ein gewünschter Rest in einer speziellen Position befindet, z. B. benachbart zu dem Epitop, oder dass ein schädlicher Rest nicht benachbart zu dem C-Terminus des Epitops ist. Der Ausdruck schließt auch das Insertieren eines Aminosäurerests, vorzugsweise eines bevorzugten oder dazwischen liegenden Aminosäurerests, in eine spezielle Position ein. Ein Aminosäurerest kann auch in eine Sequenz eingeführt werden, indem ein Aminosäurerest durch einen anderen ersetzt wird. Eine solche Substitution wird vorzugsweise in Übereinstimmung mit den "Analoging"-Prinzipien durchgeführt, die z. B. in der gleichzeitig anhängigen U. S. S. N. 09/206,714, eingereicht am 3/1/99, und in der Anmeldung PCT/US00/19774 dargestellt werden.
  • Die Ausdrücke "isoliert" oder "biologisch rein" beziehen sich auf ein Material, das im Wesentlichen oder weitgehend frei von Bestandteilen ist, die das Material normalerweise in dem Zustand, in dem es in seinem nativen Zustand gefunden wird, begleiten. Isolierte Peptide gemäß der Erfindung enthalten demnach vorzugsweise keine Materialien, die normalerweise mit den Peptiden in ihrer in situ-Umgebung assoziiert sind.
  • "Verknüpfen" oder "Verbinden" bezieht sich auf jedes Verfahren, das in der Technik bekannt ist, um Peptide funktionell zu verbinden, eingeschlossen, jedoch ohne Einschränkung, die rekombinante Fusion, kovalente Bindung, Disulfidbindung, ionische Bindung, Wasserstoffbindung, und elektrostatische Bindung.
  • "Haupthistokompatibilitätskomplex" oder "MHC" (Major Histocompatibility Complex" ist ein Cluster von Genen, der eine Rolle bei der Steuerung der zellulären Wechselwirkungen spielt, die für die physiologischen Immunantworten verantwortlich sind. In Menschen ist der MHC auch als HLA-Komplex bekannt. Für eine detaillierte Beschreibung von MHC- und HLA-Komplex siehe Paul, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3. Auflage, Raven Press, New York, 1993.
  • So wie der Begriff "Mitte des Peptids" hier verwendet wird, handelt es sich um eine Position in einem Peptid, die weder ein Amino- noch ein Carboxyterminus ist.
  • Eine "minimale Zahl von Verknüpfungsepitopen", so wie der Ausdruck hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Zahl von Verknüpfungsepitopen, die kleiner ist als die Zahl, die erzeugt würde, wenn ein Zufallsauswahlkriterium verwendet würde.
  • Der Ausdruck "Motiv" bezieht sich auf das Muster von Resten in einem Peptid mit einer definierten Länge, üblicherweise ein Peptid aus etwa 8 bis etwa 13 Aminosäuren für ein Klasse-I-HLA-Motiv und etwa 6 bis etwa 25 Aminosäuren für ein Klasse-II-HLA-Motiv, das von einem speziellen HLA-Molekül erkannt wird. Peptidmotive sind typischerweise verschieden für jedes Protein, das von jedem humanen HLA-Allel codiert wird, und unterscheiden sich in dem Muster der primären und sekundären Verankerungsreste.
  • Ein "negativer Bindungsrest" oder "schädlicher Rest" ist eine Aminosäure, die, wenn sie in bestimmten Positionen (typischerweise nicht primäre Verankerungspositionen) in einem Peptidepitop vorhanden ist, zu einer verringerten Bindungsaffinität des Peptids für das dem Peptid entsprechende HLA-Molekül führt.
  • Das "Optimieren" eines Polyepitop-Konstrukts bezieht sich auf die Erhöhung der Immunogenität oder Antigenität eines Konstrukts durch das Sortieren von Epitopen, um das Auftreten von Verknüpfungsepitopen zu minimieren, das Einsetzen flankierender Reste, die den C-Terminus oder N-Terminus eines Epitops flankieren, und das Insertieren von Abstandshalterresten, um das Auftreten von Verknüpfungsepitopen weiter zu verhindern oder um einen flankierenden Rest bereitzustellen. Eine Erhöhung der Immunogenität oder der Antigenität eines optimierten Polyepitop-Konstrukts wird bezogen auf ein Polyepitop-Konstrukt, das nicht auf der Basis der Optimierungsparameter konstruiert worden ist, und unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Assays, z. B. der Untersuchung der Immunogenität in transgenen Tieren, ELISPOT, Interferon-γ-Freisetzungsassays, Tetramerfärbung, Chromfreisetzungsassays und der Präsentation dendritischer Zellen, gemessen.
  • Der Ausdruck "Peptid" wird in der vorliegenden Patentschrift austauschbar mit "Oligopeptid" verwendet, um eine Reihe von Resten, typischerweise L-Aminosäuren, die miteinander verbunden sind, typischerweise durch Peptidbindungen zwischen der α-Aminogruppe und der Carboxygruppe benachbarter Aminosäuren, zu bezeichnen. Die bevorzugten CTL-induzierenden Peptide der Erfindung haben eine Länge von 13 oder weniger als 13 Resten, und sie bestehen üblicherweise aus etwa 8 bis etwa 11 Resten, vorzugsweise 9 oder 10 Resten. Die bevorzugten HTL-induzierenden Oligopeptide haben eine Länge von weniger als etwa 50 Resten und bestehen üblicherweise aus etwa 6 bis etwa 30 Resten, noch üblicher etwa 12 bis 25 Resten, und oft aus etwa 15 bis 20 Resten.
  • Ein "PanDR-bindendes Peptid oder PADRETM-Peptid" ist ein Mitglied aus einer Familie von Molekülen, die mehr als ein HLA-Klasse-II-DR-Molekül binden. Das Muster, dass die PADRETM-Familie von Molekülen definiert, kann als ein HLA-Klasse-II-Supermotiv verstanden werden. PADRE bindet an die meisten HLA-DR-Moleküle und stimuliert in vitro und in vivo HTL-Antworten (HTL: humaner Helfer-T-Lymphocyt).
  • "Pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf eine im Allgemeinen nicht toxische, inerte und/oder physiologisch kompatible Zusammensetzung.
  • "Einem HLA-Klasse-I-Prozessierungsweg präsentiert" bedeutet, dass die Polypeptid-Konstrukte in eine Zelle eingeführt werden, so dass sie weitgehend durch einen HLA-Klasse-I-Prozessierungsweg prozessiert werden. Typischerweise werden Polyepitop-Konstrukte unter Verwendung von Expressionsvektoren in die Zellen eingeführt, die die Polyepitop-Konstrukte codieren. HLA-Klasse-II-Epitope, die von einem solchen Minigen codiert werden, werden ebenfalls auf Klasse-II-Molekü len präsentiert, obwohl der Mechanismus des Eintritts der Epitope in den Klasse-II-Prozessierungsweg nicht definiert ist.
  • Ein "primärer Verankerungsrest" oder ein "primärer MHC-Anker" ist eine Aminosäure in einer spezifischen Position auf einer Peptidsequenz, die so aufgefasst wird, dass sie einen Kontaktpunkt zwischen dem immunogenen Peptid und dem HLA-Molekül liefert. Ein bis drei, üblicherweise zwei primäre Verankerungsreste innerhalb eines Peptids mit einer definierten Länge definieren im Allgemeinen ein "Motiv" für ein immunogenes Peptid. Von diesen Resten wird angenommen, dass sie in engem Kontakt in Peptidbindungsfurchen eines HLA-Moleküls passen, wobei ihre Seitenketten in spezifischen Taschen der Bindungsfurchen selbst vergraben sind. In einer Ausführungsform sind die primären Verankerungsreste eines HLA-Klasse-I-Epitops beispielsweise in der Position 2 (von der Amino-terminalen Position aus) und in der Carboxy-terminalen Position eines Peptidepitops aus 9 Resten gemäß der vorliegenden Erfindung angeordnet. Die primären Verankerungspositionen für jedes Motiv und Supermotiv werden beispielsweise in den Tabellen I und III von PTC/US00/27766 oder PCT/US00/19774 beschrieben. Weiterhin können analoge Peptide erzeugt werden, indem das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter Reste in diesen primären Verankerungspositionen geändert wird. Derartige Analoga werden verwendet, um die Bindungsaffinität eines Peptids, das ein bestimmtes Motiv oder Supermotiv aufweist, zu verändern.
  • "Promiske Erkennung" findet statt, wo ein anderes Peptid durch den gleichen T-Zellklon im Rahmen verschiedener HLA-Moleküle erkannt wird. Promiskes Erkennen oder Binden ist synonym mit kreuzreaktivem Binden.
  • Eine "schützende Immunantwort" oder "therapeutische Immunantwort" bezieht sich auf eine CTL- und/oder eine HTL-Antwort auf ein Antigen, das von einem infektiösen Agens oder ein Tumorantigen stammt, die in irgendeiner Weise die Symptome einer Krankheit, Nebeneffekte oder deren Fortschreiten verhindert oder mindestens teilweise stoppt. Die Immunantwort kann auch eine Antikörperantwort einschließen, die durch die Stimulierung von Helfer-T-Zellen erleichtert worden ist.
  • Der Ausdruck "Rest" bezieht sich auf eine Aminosäure oder ein Aminosäuremimetikum, die/das durch eine Amidbindung oder ein Amidbindungsmimetikum in ein Peptid oder Protein eingefügt ist.
  • Ein "sekundärer Verankerungsrest" ist eine Aminosäure in einer Position verschieden von einer primären Verankerungsposition in einem Peptid, der die Peptidbindung zu beeinflussen vermag. Ein sekundärer Verankerungsrest kommt mit einer signifikant größeren Häufigkeit unter gebundenen Peptiden vor als bei der zufälligen Verteilung von Aminosäuren bei einer Position erwartet würde. Man sagt, dass die sekundären Verankerungsreste an "sekundären Verankerungspositionen" vorkommen. Ein sekundärer Verankerungsrest kann als ein Rest bezeichnet werden, der in einer größeren Häufigkeit unter mit einer hohen oder mittleren Affinität bindenden Peptiden vorhanden ist, oder als ein Rest, der ansonsten mit einem Binden mit hoher oder mittlerer Affinität verbunden ist. Beispielsweise können analoge Peptide erzeugt werden, indem das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter Reste in diesen sekundären Verankerungspositionen verändert wird. Derartige Analoga werden verwendet, um die Bindungsaffinität eines Peptids, das ein spezielles Motiv oder Supermotiv aufweist, fein einzustellen. Der Ausdruck "fixiertes Peptid" wird manchmal verwendet, um sich auf ein analoges Peptid zu beziehen.
  • "Sortieren von Epitopen" bezieht sich auf das Ermitteln oder Erstellen einer Reihenfolge der Epitope in einem Polyepitop-Konstrukt.
  • Ein "Abstandshalter" bezieht sich auf eine Sequenz, die zwischen zwei Epitope in einem Polyepitop-Konstrukt insertiert wird, um das Auftreten von Verknüpfungsepitopen zu verhindern. Für HLA-Klasse-II-Epitope hat der Abstandshalter eine Länge von fünf Aminosäuren oder darüber, und die Aminosäurereste in der Abstandshaltersequenz, wie G, P oder N, sind typischerweise nicht dafür bekannt, primäre Verankerungsreste eines HLA-Klasse-II-Motivs zu sein (siehe z. B. PCT/US00/19774).
  • Ein "subdominantes Epitop" ist ein Epitop, das eine kleine oder keine Antwort bei der Immunisierung mit vollständigen Antigenen, die das Epitop enthalten, hervorruft, für das aber eine Antwort erhalten werden kann durch die Immunisierung mit einem isolierten Peptid, und diese Antwort (anders als im Fall kryptischer Epitope) wird nachgewiesen, wenn vollständiges Protein verwendet wird, um eine Recall-Antwort in vitro oder in vivo hervorzurufen.
  • Ein "Supermotiv" ist eine Peptidbindungsspezifität, die von HLA-Molekülen geteilt wird, die von mindestens zwei HLA-Allelen codiert wird. Ein Supermotiv-tragendes Peptid wird vorzugsweise mit hoher oder mittlerer Affinität (wie hier definiert) durch mindestens zwei HLA-Antigene erkannt.
  • "Synthetisches Peptid" bezieht sich auf ein Peptid, das nicht natürlich vorkommt, sondern von Menschen hergestellt wurde unter Verwendung von Verfahren wie chemischer Synthese oder rekombinanter DNA-Technologie.
  • Ein "TCR-Kontaktrest" oder "T-Zellrezeptor-Kontaktrest" ist ein Aminosäurerest in einem Epitop, von dem angenommen wird, dass er von einem T-Zellrezeptor gebunden wird; diese werden hier als Reste definiert, die keinerlei primäre MHC-Anker sind. T-Zellrezeptor-Kontaktreste sind als die Position/Positionen in dem Peptid definiert, bei der/denen alle getesteten Analoga eine negative IFNγ-Produktion hervorrufen, bezogen auf die Produktion, die mit Wildtyp-Peptid hervorgerufen wird.
  • Die Nomenklatur, die angewendet wird, um Peptidverbindungen zu beschreiben, folgt der herkömmlichen Praxis, in der für jeden Aminosäurerest die Aminogruppe links (der N-Terminus) und die Carboxygruppe rechts (der C-Terminus) dargestellt wird. Wenn Aminosäurerestpositionen in einem Peptidepitop angegeben werden, werden sie in einer Amino-nach-Carboxyrichtung nummeriert, wobei die Position eins die Position ist, die sich am nächsten beim Amino-terminalen Ende des Epitops oder des Peptids oder Proteins, von dem es ein Teil sein kann, befindet. In den Formeln, die ausgewählte spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, sind die Amino- und Carboxy-terminalen Gruppen, auch wenn nicht speziell gezeigt, in der Form vorliegen, die sie bei physiologischen pH-Werten annehmen würden, soweit nichts anderes angegeben wird. In den Aminosäurestrukturformeln wird im Allgemeinen jeder Rest durch Standardbezeichnungen aus drei oder einem Buchstaben dargestellt. Die L-Form eines Aminosäurerests wird durch einen einzigen Großbuchstaben oder einen ersten Großbuchstaben aus einem Dreibuchstabensymbol dargestellt, und die D-Form derjenigen Aminosäuren, die eine D-Form aufweisen, wird durch einen einzelnen Kleinbuchstaben oder ein Symbol aus drei Kleinbuchstaben dargestellt. Glycin hat kein asymmetrisches Kohlenstoffatom und wird einfach als "Gly" oder G bezeichnet. Symbole für die Aminosäuren werden im Folgenden gezeigt.
    Einbuchstabensymbol Dreibuchstabensymbol Aminosäuren
    A Ala Alanin
    C Cys Cystein
    D Asp Asparaginsäure
    E Glu Glutaminsäure
    F Phe Phenylalanin
    G Gly Glycin
    H His Histidin
    I Ile Isoleucin
    K Lys Lysin
    L Leu Leucin
    M Met Methionin
    N Asn Asparagin
    P Pro Prolin
    Q Gin Glutamin
    R Arg Arginin
    S Ser Serin
    T Thr Threonin
    V Val Valin
    W Trp Tryptophan
    Y Tyr Tyrosin
  • Die "chemischen Merkmale" der Aminosäure sind wie folgt definiert: aromatisch (F, W, Y); aliphatisch-hydrophob (L, I, V, M); schwach polar (S, T, C); stark polar (Q, N); sauer (D, E); basisch (R, H, K); Prolin; Alanin; und Glycin.
  • Die folgenden Akronyme werden hier benutzt:
    • APC:
    antigenpräsentierende Zelle
    CD3:
    Pan-T-Zell-Marker
    CD4:
    Helfer-T-Lymphocyt-Marker
    CD8:
    cytotoxischer T-Lymphocyt-Marker
    CEA:
    carcinoembryonales Antigen
    CTL:
    Cytotoxische T-Lymphocyten
    DC:
    dendritische Zellen. DC funktionieren als potente antigenpräsentierende Zellen durch das Stimulieren der Cytokinfreisetzung aus CTL-Linien, die spezifisch für ein Modellpeptid waren, das vom Hepatitis-B-Virus (HBV) stammt. In vitro-Experimente unter Verwendung von DC gepulst ex vivo mit einem HBV-Peptid-Epitop haben CTL-Immunantworten in vitro stimuliert nach dem Einbringen in naive Mäuse.
    DMSO:
    Dimethylsulfoxid
    ELISA:
    Enzyme-linked immunosorbant assay
    E:T:
    Effektor:Zielzellen-Verhältnis (T = "target")
    FCS:
    fetales Kälberserum
    G-CSF:
    Granulocyten-Kolonie stimulierender Faktor
    GM-CSF:
    Granulocyten-Makrophagen(Monocyten)-Kolonie stimulierender Faktor
    HBV:
    Hepatitis-B-Virus
    HER2/Neu:
    c-erbB-2
    HLA:
    humanes Leukocyten-Antigen
    HLA-DR:
    humanes Leukocyten-Antigen Klasse II
    HPLC:
    Hochdruckflüssigkeitschromatographie
    HTC:
    Helfer-T-Zellen
    HTL:
    Helfer-T-Lymphocyten
    ID:
    Identität
    IFNγ:
    Interferon γ
    IL-4:
    Interleukin-4-Cytokin
    IV:
    intravenös
    LU30%:
    Cytotoxische Aktivität, die erforderlich ist, um 30 % Lyse bei einem 100:1 (E:T)-Verhältnis zu erzielen
    MAb:
    monoklonaler Antikörper
    MAGE:
    Melanom-Antigen
    MLR:
    gemischte Lymphocytenreaktion
    MNC:
    mononukleare Zellen
    PB:
    peripheres Blut
    PBMC:
    mononukleare Zellen im peripheren Blut
    SC:
    subkutan
    S.E.M.:
    mittlere Standardabweichung
    QD:
    Einmal-täglich-Dosierung
    TAA:
    Tumor-assoziiertes Antigen
    TCR:
    T-Zell-Rezeptor
    TNF:
    Tumornekrosefaktor
    WBC:
    weiße Blutzellen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Daten von drei verschiedenen Multiepitop-Konstrukten, von denen jedes 20 bis 25 verschiedene CTL-Epitope umfasst.
  • 2 zeigt zwei verschiedene synthetische Polypeptide (2a), wobei das erste Konstrukt vier verschiedene, linear cosynthetisierte Epitope und das zweite Konstrukt einen GPGPG-Abstandshalter einschließt. 2b veranschaulicht die Fähigkeit von 2 Nanomol dieser verschiedenen Konstrukte, proliferative Antworten auf die verschiedenen Epitope in IAb-positiven Mäusen zu primen, verglichen mit den Antworten, die durch äquimolare Mengen eines Pools der gleichen Peptide (3 Mikrogramm von jedem Peptid) induziert werden.
  • 3 zeigt die Struktur von Multiepitop-DNA-Konstrukten. Die HLA-Restriktion wird über jedem Epitop gezeigt, die A*0201-Epitope sind fettgedruckt. Die HLA-Bindungsaffinität (IC50 nM) wird unter jedem Epitop angegeben. (a) Schemadarstellung von HIV-FT, die die Anordnung der codierten Epitope veranschaulicht. (b) Schemadarstellungen der HBV-spezifischen Konstrukte. Die C+1-Aminosäure relativ zu Core 18 wird mit einem Pfeil angezeigt. Die HVB-spezifischen Konstrukte mit Insertionen einer einzigen Aminosäure in der C1-Position von Core 18 werden als HBV.1X. dargestellt.
  • 4 veranschaulicht die Immunogenität der HLA-A*0201-Epitope in HIV-FT in HLA-A*0201/Kb-transgenen Mäusen. (a) Repräsentative CTL-Antworten gegen die Epitope Pol 498 (Kreise), Vpr 62 (Dreieck), Gag 386 (Quadrat). Die Cytotoxizität wurde in einem 51Cr-Freisetzungsassay gegen Jurkat-HLA-A*0201/Kb-Zielzellen in Gegenwart (gefüllte Symbole) oder Abwesenheit (leere Symbole) jedes Peptids geprüft. (b) Zusammenfassung der CTL-Antworten der Immunogenität von HIV-FT in HLA-A*0201/Kb-transgenen Mäusen. Die Balken zeigen das geometrische Mittel der CTL-Antwort positiver Kulturen. Die Häufigkeit positiver CTL-Kulturen wird ebenfalls angegeben.
  • 5 zeigt den Einfluss der C+1-Aminosäure auf die Epitop-Immunogenität. Eine Datenbank, die die CTL-Antworten einer Vielzahl von Minigenen enthält, die 94 Epitop/C1+-Aminosäure-Kombinationen repräsentieren, wurde analysiert, um die Häufigkeit (%) der Fälle zu ermitteln, in denen eine spezielle Kombination mit einer optimalen CTL-Antwort verbunden war. CTL-Antworten wurden als optimal betrachtet, wenn sie größer als 100 SL oder 20 LU in mindestens 30 % der gemessenen Kulturen waren. Die Häufigkeit, mit der eine gegebene Epitop/C+1-Aminosäurekombination beobachtet wurde, wird ebenfalls angegeben.
  • 6 zeigt CTL-Antworten auf HBV-spezifische Konstrukte (a) CTL-Antworten auf Core 18-Epitop nach DNA-Immunisierung von HLA- A*0201/Kb-transgenen Mäusen. (b) CTL-Antworten auf HBV Core 18 nach DNA-Immunisierung von HLA-A*0201/Kb-transgenen Mäusen mit Konstrukten, die sich durch eine einzige Aminosäureinsertion in der C+1-Position von Core 18 unterschieden.
  • 7 zeigt das Ausmaß der HBV-Core-18-Präsentation in HBV. 1-(schattierte "shaded" Balken) und HBV.1K-(schraffierte "hatched" Balken) transfizierten Zelllinien. Die Epitop-Präsentation wurde unter Verwendung von Peptid-spezifischen CTL-Linien quantifiziert. Die Präsentation von HBV Pol 455 wird für Vergleichszwecke gezeigt.
  • 8 stellt die Daten für 221A2Kb-Zielzellen dar, die mit dem HIV-1-Minigen transfiziert sind. Diese transfizierten Zellen wurden hinsichtlich ihres Vermögens geprüft, CTL-Linien, die von HLA-transgenen Mäusen stammen und spezifisch für verschiedene HIV-abgeleitete CTL-Epitope sind, Epitope zu präsentieren. Um Korrekturen bezüglich der Unterschiede in der Antigenempfindlichkeit verschiedener CTL-Linien vorzunehmen, wurden parallel Peptidmengentitrationen unter Verwendung von nicht transfizierten Zellen als APC durchgeführt.
  • 9 zeigt HIV-Polyepitop-Konstrukte, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren optimiert wurden.
  • BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • 1. Einleitung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich Verfahren zum Konstruieren von Multiepitop-Vakzinen mit optimierter Immunogenität. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Vakzin CTL- und HTL- Epitope. Erfindungsgemäß erzeugte Vakzine ermöglichen eine signifikante, nicht ethnisch beeinflusste Bevölkerungserfassung, und sie können vorzugsweise auf Epitope fokussieren, die in verschiedenen viralen oder anderen antigenen Isolaten konserviert sind. Das Vakzin kann hinsichtlich der Stärke und der Breite der Antworten optimiert werden und kann die einfachste Epitopkonfiguration ermöglichen. Schließlich werden allgemeine Verfahren für die Beurteilung der Immunogenität eines Polyepitop-Vakzins in Menschen beschrieben.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das Konstruieren eines Polyepitop-Konstrukts auf der Basis der hier aufgezeigten Prinzipien. Nach einem Aspekt stellt die Erfindung das simultane Induzieren von Antworten gegen spezifische CTL- und HTL-Epitope unter Verwendung einzelner Promotor-Minigen-Vakzine zur Verfügung. Derartige Minigen-Konstrukte können viele verschiedene Epitope, vorzugsweise mehr als 10, oftmals mehr als 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 oder mehr Epitope enthalten.
  • Bei der Entwicklung eines Polyepitop-Konstrukts werden die folgenden Gesichtspunkte berücksichtigt:
    • (i) die in das Polyepitop-Konstrukt einzufügenden Epitope werden sortiert, um eine Reihenfolge zu ergeben, die die Zahl der gebildeten Verknüpfungsepitope minimiert. In einigen Ausführungsformen wird das Sortieren von einem Computer durchgeführt. Als sekundärer Gesichtspunkt beim Sortieren der Epitope werden die Epitope so positioniert, dass Reste am N-Terminus eines Epitops, die die CTL-Immunogenität fördern, neben den C-Terminus eines anderen CTL-Epitops angeordnet werden.
    • (ii) flankierende Reste, die die Immunogenität verstärken, werden in den flankierenden Positionen von Epitopen insertiert. In besonderen Ausführungsformen werden flankierende Reste in die C+1-Position von CTL-Epitopen insertiert.
    • (iii) Abstandshaltersequenzen werden zwischen Epitope insertiert, um das Auftreten von Verknüpfungsepitopen zu verhindern. In besonderen Ausführungsformen können die Abstandshaltersequenzen auch einen Rest einschließen, der die Immunogenität am N-Terminus des Linkers fördert, so dass der Rest den C-Terminus eines CTL-Epitops flankiert.
  • In besonderen Ausführungsformen wird zur Verhinderung von HTL-Verknüpfungsepitopen ein Abstandshalter verwendet, der aus Aminosäureresten zusammengesetzt ist, die nicht einem beliebigen bekannten HLA-Klasse-II-Verankerungsrest entsprechen, z. B. werden alternierende G- und P-Reste (ein GP-Abstandshalter) zwischen zwei HTL-Epitope eingefügt.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung (obiger Gesichtspunkt (ii)) schließt das Einführen oder die Substitution spezieller Aminosäurereste in Positionen ein, die Epitope flankieren, z. B. in eine Position unmittelbar benachbart zum C-Terminus des Epitops, wodurch Polyepitop-Konstrukte mit verstärkter Antigenität und Immunogenität erzeugt werden, verglichen mit Konstrukten, die den speziellen Rest, der an dieser Stelle eingeführt oder substituiert wurde, nicht enthalten, d. h. optimierte Minigene. Die Verfahren zur Optimierung von Polyepitop-Konstrukten umfassen einen Schritt, in dem ein flankierender Rest, vorzugsweise K, N, G, R oder A, in die C+1-Position des Epitops eingeführt wird, d. h. in die Position, die dem C-Terminus des Epitops unmittelbar benachbart ist. Reste, die zu einer verringerten Immunogenität beitragen, d. h. negativ geladene Reste, z. B. D, aliphatische Reste (I, L, M, V) oder aromatische Nicht-Tryptophan-Reste, können ersetzt werden. Der flankierende Rest kann eingeführt werden, indem geeignete Epitope positioniert werden, um den günstigen flankierenden Rest bereitzustellen, oder indem ein spezieller Rest insertiert wird.
  • GESICHTSUNKTE FÜR DIE ENTWICKLUNG OPTIMIERTER POLYEPITOP-VAKZIN-KONSTRUKTE
  • Wie in dem den Hintergrund betreffenden Abschnitt erwähnt wurde, sind Minigene, die bis zu 10 Epitope codieren, verwendet worden, um Antworten gegen eine Anzahl verschiedener Epitope auszulösen. Die Daten, die ein experimentelles Minigen betreffen, pMin.1, sind veröffentlicht worden [Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)]. Darin werden Parameter für die Entwicklung und Bewertung von Multiepitop-Konstrukten mit optimierter Immunogenität offenbart, die sich auf unzählige interessierende Krankheitsindikationen beziehen.
  • Es wurden Parameter für die Entwicklung auf der Basis einer Anzahl von Studien identifiziert. In einer vorläufigen Bewertung von Polyepitop-Konstrukten werden Daten zu drei verschiedenen Multiepitop-Konstrukten, von denen jedes 20 bis 25 verschiedene CTL-Epitope aufweist, präsentiert (1). Ein Konstrukt basiert auf HIV-abgeleiteten Epitopen, (HIV-1), während die beiden anderen HCV-abgeleitete Epitope (HCV1 bzw. HCV2) enthalten. Die Immunogenität dieser verschiedenen Minigene ist entweder in A2- oder A11-HLA-transgenen Mäusen gemessen worden (A1, A24 und B7-restringierte Epitope wurden nicht bewertet).
  • Elf Tage nach einer einzelnen i.m.-DNA-Vakzininjektion wurden Antworten gegen 8 bis 14 verschiedene repräsentative Epitope bewertet, folgend auf eine einzelne erneute in vitro-Stimulierung nach 6 Tagen, unter Verwendung von Assays zur Messung der CTL-Aktivität (ent weder Chromfreisetzung oder in situ-IFN-Produktion wie hier beschrieben). Das Priming der Epitop-spezifischen CTL konnte für 6/8 (75 %), 10/14 (72%) und 13/14 (93 %) der im Fall von HIV-1, HCV1 bzw. HCV2 getesteten Epitope gezeigt werden. Demnach können Multiepitop-Minigene, die zu einem simultanen Priming von CTL-Antworten gegen eine große Zahl von Epitopen imstande sind, problemlos entwickelt werden. Es soll jedoch hervorgehoben werden, dass das CTL-Priming bei einigen Epitopen nicht nachgewiesen wurde, und in mehreren der 36 berücksichtigten Fälle waren Antworten selten oder variierten beträchtlich in ihrer Stärke über mindestens drei Größenordnungen (1000-fach). Diese Ergebnisse weisen stark darauf hin, dass eine sorgfältigere Analyse und Optimierung der Minigenkonstrukte erforderlich war.
  • Die Möglichkeit, dass die suboptimale Leistungsfähigkeit bestimmter Epitope beim Priming mit der Größe des Minigens zusammenhing, wurde ebenfalls untersucht. Tatsächlich beschreiben die meisten veröffentlichten Berichte Minigene aus bis zu zehn Epitopen, und die wenigen Fälle, in denen über 20-Epitop-Mingene berichtet wurde, wurde nur die gegen zwei oder drei Epitope gerichtete Aktivität gemessen. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden zwei kleinere Minigene (HIV-1.1 und HIV-1.2) synthetisiert und getestet, von denen jedes zehn Epitope umfasst und die einer Hälfte des HIV-1-Mingens entsprechen. Die Antworten gegen vier repräsentative Epitope wurden gemessen.
    Tabelle 1. Immunogenität scheint unabhängig von der Minigengröße zu sein
    CTL-Antwort auf verschiedene Minigene
    HIV 1 HIV 1.1 HIV 1.2
    CTL (20-mer) (10-mer) (10-mer)
    Epitop Häufigkeit1) Stärke2) Häufigkeit Stärke Häufigkeit Stärke
    Pol 774 0/8 * 0/4 * NA3) NA
    Pol 498 18/19 46,7 4/4 16,4 NA Na
    Gag 271 4/13 4,0 NA NA 0/4 *
    Env 134 5/8 16,1 NA NA 4/4 14,8
    1) Stellt den Anteil unabhängiger Kulturen dar, die positive Antworten liefern
    2) Lytische Einheiten (LU)
    3) nicht anwendbar
  • Es wurde gefunden, dass die Antworten, die von den kleineren Minigenen hervorgrufen wurden, vergleichbar und wenn überhaupt etwas kleiner waren als die Antworten, die von dem Zwanzig-Epitop-Konstrukt induziert werden (Tabelle 1.) Demnach sind Faktoren, die sich auf die Minigengröße beziehen, unwahrscheinlich als Erklärungen für das beobachtete suboptimale Priming durch bestimmte Epitope, und demnach werden andere Parameter, die hier offenbart werden, verwendet, um wirksame Polyepitop-Konstrukte zu entwickeln.
  • Die Minimierung von Verknüpfungsmotiven
  • Einer der Gesichtspunkte für die Entwicklung von Polyepitop-Konstrukten ist die versehentliche Erzeugung von Verknüpfungsepitopen, wenn Epitope nebeneinander angeordnet werden. Das Vorhandensein derartiger Epitope in einem Minigen könnte die Leistungsfähigkeit eines Minigens beträchtlich beeinträchtigen. Strategien für den Schutz vor diesem unerwünschten Effekt werden hier offenbart zur Anwendung bei der Entwicklung von Polyepitop- oder Minigen-Vakzinen. Erstens können Verknüpfungsepitope minimiert werden, indem die Epitope sortiert werden, um eine Reihenfolge zu bestimmen, in der die Anzahl der Verknüpfungsepitope minimiert ist. Ein derartiges Sortierverfahren kann unter Verwendung eines Computers oder erforderlichenfalls mit dem Auge oder in Abhängigkeit von der Zahl der Epitope, die in das Polyepitop-Konstrukt eingeführt werden sollen, durchgeführt werden.
  • Beispielsweise kann für die Entwicklung von Multiepitop-Minigenen ein Computerprogramm, das Muster findet, z. B. Panorama, bei der Entwicklung von Minigen-Vakzinen verwendet werden. Eine sehr große Zahl verschiedener Epitop-Anordnungen kann bei der Entwicklung eines speziellen Minigenkonstrukts in Betracht gezogen werden. Ein Computerprogramm nimmt als Eingabe den speziellen Satz der in Betracht gezogenen Epitope und der Einheiten auf, die durchgemustert werden, um zu bewerten, ob es Verknüpfungsepitope gibt, die diese Motive tragen. Beispielsweise kann ein Programm das Zusammenstellen eines Minigens simulieren, und ein heuristischer Berechnungsalgorithmus kann Epitop-Paare untersuchen, um das Auftreten von Verknüpfungsmotiven zu verhindern oder zu minimieren. Das Programm kann beispielsweise 6 × 105 (etwa eine halbe Million) Minigenkonfigurationen/Sekunde bewerten. Als eine weniger bevorzugte Alternative, weil sie zeitaufwändiger ist, kann eine nicht von einem Computer unterstützte Analyse durchgeführt werden.
  • Die vollständige Analyse eines 10-Epitop-Konstrukts unter Verwendung eines wie in dem vorhergehenden Absatz beschriebenen Computerprogramms erfordert die Untersuchung von Faktor 10 ≅ 3,6 × 106 Kombinationen und kann in sechs Sekunden vollständig durchgeführt werden. Ein Vierzehn-Epitope-Konstrukt kann in wenigen Tagen vollständig analysiert werden. Die Analysezeit nimmt jedoch sehr schnell zu, wenn größere Minigene in Betracht gezogen werden. Eine vollständige Analyse ist nicht erforderlich, und das Programm kann über einen beliebig langen Zeitraum ausgeführt werden. In die sem Fall wird die Konfiguration geliefert, die die geringste Zahl von Verknüpfungsepitopen ergibt.
  • Ein Beispiel für die Ergebnisse dieses Ansatztyps wird in Tabelle 2 dargestellt. Die Anzahl der Verknüpfungsmotive in zehn verschiedenen Zufallsmischungen der gleichen Epitope, die in dem HCV1-Minigen enthalten sind, das 25 Epitope enthält, war das Ergebnis einer zweitägigen Computeranalyse, das in dieser Tabelle dargestellt wird. In diesen nicht-optimierten Mischungen wurde eine große Anzahl an A2-, A11- und Kb-Motiven im Bereich von 25 bis 38 mit einem Mittelwert von 31 gefunden. Durch Vergleich sind nur zwei derartige Verknüpfungsepitope in der HCV1-Minigenmischung vorhanden. Schlussfolgernd kann ein Computerprogramm verwendet werden, um die Zahl der Verknüpfungsmotive, die in einem Minigen-Konstrukt vorhanden ist, effizient zu minimieren. Tabelle 2: Auftreten von Verknüpfungsepitopen.
    Minigen-Konstrukt Auswahlkriterien Verknüpfungsmotive
    HCV.a zufällig 33
    HCV.b zufällig 26
    HCV.c zufällig 28
    HCV.d zufällig 27
    HCV.e zufällig 30
    HCV.f zufällig 26
    HCV.g zufällig 38
    HCV.h zufällig 33
    HCV.i zufällig 33
    HCV.j zufällig 34
    HCV.l minimiert 2
  • Vermeiden von Klasse-II-Verknüpfungsepitopen und Testen auf Klasse-II-restringierte Antworten in vivo
  • Als weitere Komponenten zum Vermeiden von Verknüpfungsepitopen können zwischen zwei Epitope, die ein Verknüpfungsepitop bilden, wenn sie nebeneinander liegen, Abstandshaltersequenzen insertiert werden.
  • Zum Beheben des Problems von Verknüpfungsepitopen bei HTL-Epitopen wird ein Abstandshalter mit einer Länge von mindestens fünf Aminosäuren zwischen die beiden Epitope insertiert. Die Aminosäurereste, die in einen derartigen Abstandshalter eingebracht werden, sind vorzugsweise diejenigen Aminosäurereste, die nicht dafür bekannt sind, dass sie primäre Verankerungsreste für irgendeines der HLA-Klasse-II-Bindungsmotive sind. Derartige Reste schließen G, P und N ein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Abstandshalter mit der Sequenz GPGPG zwischen zwei Epitope insertiert. Eine frühere Arbeit hat gezeigt, dass der GP-Abstandshalter Klasse-II-Bindungswechselwirkungen besonders wirksam unterbricht [Sette et al., J. Immunol., 143:1268-73 (1989)]. Alle bekannten humanen Klasse-II-Bindungsmotive und die Maus IAb (die Klasse-II, die von HLA-transgenen Mäusen exprimiert wird) vertragen entweder G oder P nicht in diesen Hauptverankerungspositionen, die einen Abstand von vier Resten zueinander haben. Dieser Ansatz garantiert praktisch, dass keine Klasse-II-restringierte Epitope als Verknüpfungsepitope gebildet werden können.
  • In einem Beispiel, das dieses Gesichtspunkt bei der Entwicklung bestätigt, haben wir Polypeptide synthetisiert, die HIV-abgeleitete HTL-Epitope enthalten. Diese Epitope sind weitgehend kreuzreaktive HLA-DR-Bindungsepitope. Es wurde dann bestimmt, dass diese Epitope auch effizient das murine IAb-Klasse-II-Molekül binden. Ein Diagramm, das die beiden verschiedenen berücksichtigten Polypeptide veranschaulicht, wird in 2a gezeigt.
  • Das erste Konstrukt enthält vier verschiedene Epitope, die in Reihe angeordnet sind, während das zweite Konstrukt den GPGPG-Abstandshalter enthält. Synthetische Peptide, die den drei möglichen Verknüpfungsepitopen entsprechen, wurden ebenfalls synthetisiert.
  • Die Fähigkeit von 2 Nanomol dieser verschiedenen Konstrukte, Proliferationsantworten auf die verschiedenen Epitope in IAb-positiven Mäusen zu primen, wurde getestet und mit den Antworten verglichen, die durch äquimolare Mengen eines Pools der gleichen Peptide (3 Mikrogramm eines jeden Peptids) hervorgerufen werden. Genauer wurden 3 Gruppen von Mäusen Injektionen aus CFA-Emulsionen verabreicht, 11 Tage nach der Injektion wurden ihre Lymphknotenzellen 3 zusätzliche Tage in vitro kultiviert, und der Einbau von Thymidin wurden in den letzten 24 h der Kultivierung gemessen. Es wurde gefunden (2b), dass, wie auf der Basis ihrer Fähigkeit zur IAb-Bindung mit hoher Affinität vorhergesagt, alle vier Epitope gute Proliferationsantworten hervorriefen. Stimulationsindex-Werte (SI-Werte) im Bereich von 4,9 bis 17,9 wurden beobachtet, wenn diese Peptide in einem Pool injiziert wurden. Wenn jedoch das lineare Polypeptid, das die gleichen Epitope enthielt, getestet wurde, ging die gegen Pol 335 gerichtete Antwort verloren. Dies wurden mit dem Erscheinen einer Antwort in Verbindung gebracht, die gegen ein Verknüpfungsepitop gerichtet ist, das sich von Gag 171 bis Pol 335 erstreckt. Durch die Verwendung des GPGPG-Abstandshalters wird dieses Problem beseitigt, wahrscheinlich durch das Zerstören des Verknüpfungsepitops, und die Pol 335-Antwort wurde wiedergewonnen. Die beobachteten Antworten hatten eine Stärke, die ähnlich der Stärke war, die mit dem Pool isolierter Peptide beobachtet wurde.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die Antworten gegen mehrere HIV-abgeleitete Klasse-II-Epitope gleichzeitig induziert werden können, und sie veranschaulichen auch, wie die IAb/DR-Kreuzreaktivität verwendet werden kann, um die Immunogenität verschiedener Konstrukte, die HTL-Epitop-Kandidaten einschließen, zu untersuchen. Schließlich zeigen sie, dass geeignete Abstandshalter eingesetzt werden können, um Klasse-II-Verknüpfungsepitope, die ansonsten die wirksame Vakzin-Immunogenität stören würden, wirksam zu unterbrechen.
  • Im Fall von Klasse-I-restringierten Antworten wurde ein Fall eines natürlich vorkommenden Verknüpfungsepitops und die daraus folgende Hemmung der Epitop-spezifischen Antworten durch McMichael und Kollegen vorgestellt [Tussey et al., Immunity, Bd. 3(1):65-77 (1995)]. Um das Problem von Verknüpfungseptiopen für die Klasse I anzugehen, können ähnliche Analysen durchgeführt werden. Beispielsweise wird ein spezielles Computerprogramm eingesetzt, um mögliche Klasse-I-beschränkte Verknüpfungsepitope zu identfizieren, indem auf ausgewählte murine Motive und auf die häufigsten humanen Klasse-I-HLA-A- und -B-Motive durchgemustert wird.
  • Die Abstandshaltersequenz kann auch ähnlich eingesetzt werden, um CTL-Verknüpfungsepitope zu verhindern. Oft stellen sehr kleine Reste wie A oder G bevorzugte Abstandshalterreste dar. G kommt auch relativ selten als ein bevorzugter primärer Verankerungsrest (siehe z. B. PCT/US00/24802) eines HLA-Klasse-I-Bindungsmotivs vor. Diese Abstandshalter können hinsichtlich ihrer Länge variieren, z. B. können Abstandshaltersequenzen typischerweise eine Länge von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 Aminosäuren haben, und manchmal sind sie länger. Kürzere Längen sind oft bevorzugt wegen der physikalischen Einschränkungen bei der Herstellung der Polyepitop-Konstrukte.
  • Der Einfluss flankierender Regionen auf die CTL-Minigen-Immunogenität
  • Ein anderer Faktor, der bei der Entwicklung von Minigenen berücksichtigt werden muss, besteht darin, Reste zu insertieren, die die Immunogenität in der Position fördern, die den C-Terminus eines CTL-Epitops flankiert.
  • Hier wird die Identifizierung derartiger Reste offenbart. Flankierende Regionen können, zumindest in einigen Fällen, die sichtbare Präsentation von CTL-Epitopen verändern. Bislang ist jedoch nur eine begrenzte Analyse des Effekts der Veränderung flankierender Regionen durchgeführt worden, und in allen Fällen (mit Ausnahme der Studie von Ishioka, 1998 [Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)] waren die Epitope durch Mäuse-MHC restringiert. Dies ist besonders wichtig, da die Mäuse-MHC-Motive und humanen MHC-Motive dazu neigen, sich an ihrem C-Terminus zu unterscheiden und sie wiederum durch Präferenzen bei der Proteasomenspaltung unterschiedlich beeinflusst werden können. Weiterhin haben wenige Studien, wenn überhaupt, mögliche Unterschiede bei der Spezifität der Prozessierung zwischen Mäuseproteasom und humanem Proteasom und/oder bei den ER-Proteasen berücksichtigt. Daher könnten Versuche, in denen Mäuseepitope und humane Epitope verwendet werden, abweichende Ergebnisse und "Regeln" über flankierende Reste ergeben. Hier werden Studien offenbart, durch die Reste identifiziert werden, die die Immunogenität erhöhen, und demnach Reste, die in Polyepitop-Konstrukte insertiert werden, um die Immunogenität zu optimieren.
  • Der molekulare Zusammenhang, in dem ein Epitop exprimiert wurde, hat die Häufigkeit und/oder die Stärke des Primings des CTL, der spezifisch für dieses Epitop in HLA-transgenen Mäusen ist, oft dramatisch beeinflusst. In Tabelle 3 werden zwei Beispiele gezeigt.
    Tabelle 3. Unterschiede in der Effizienz des T-Zell-Primings für bestimmte Epitope in verschiedenen Minigen.
    flankiert Epitop flankiert Antworten
    Epitop Minigen N-Terminus Sequenz C-Terminus Häufigkeit Stärke1)
    Core 18 pMmin 5 TLKAAA FLPSDFFPSV FLLSLG 6/6 5,5
    PMin1 TLKAAA FLPSDFFPSV KLTPLC 6/6 1074,5
    Core 132 HCV 1 ILGGWV DLMGYIPLV YLVAYQ 2/12 107,7
    HCV2 VPGSRG DLMGYIPLV AKFVA 17/18 929,2
  • 1) IFN-γ sekretorische Einheiten
  • Die Immunogenität des HBV-Core 18-Epitops, exprimiert in dem pMin5-Minigen, war in Bezug auf die Stärke ungefähr 200fach geringer als die Immunogenität, die im Fall des pMin1-Minigens beobachtet wurde. Ähnlich war die Immunogenität des HCV-Core 132-Epitops im Rahmen des HCV1-Minigens geringfügig, wobei ein merkliches T-Zell-Priming nur in 2 von 12 durchgeführten verschiedenen unabhängigen CTL-Experimenten/Kulturen nachgewiesen werden konnte. Diese beiden positiven Experimente ergaben Antworten von etwa 100 SU IFN-γ. Wenn das gleiche Epitop im Rahmen des HCV2-Minigens exprimiert wurde, wurden positive Antworten in 17/18 Fällen beobachtet, mit mittleren Stärken, die ungefähr fünffach höher lagen.
  • Immunogenität von HIV-FT in HLA A*0201/Kb-transgenen Mäusen
  • Ein HIV-Multiepitop-DNA-Vakzin, HIV-FT (3a) codiert 20 HIV-abgeleitete CTL-Epitope. Von diesen 20 Epitopen sind acht durch HLA-A*0201, neun durch HLA-A* 1101 und drei durch HLA-B*070118 restringiert. Alle Epitope banden ihr relevantes Restriktionselement mit einer guten Affinität. Alle HLA-A*0201-restringierte Epitope banden gereinigte HLA-A*0201-Moleküle mit etwa ähnlichen Affinitäten mit IC50-Werten im Bereich von 19-192 nm (3a). Die HLA-A*0201-Epitope, die für den Einschluss in HIV-FT ausgewählt wurden, werden in HIV-1-infizierten Menschen erkannt und waren auch hoch wirksam beim Priming der Recall-CTL-Antworten, wenn sie mit IFA emulgiert waren und verwendet wurden, um HLA-A*0201/Kb-transgene Mäuse zu primen. Das Konstrukt wurde so entworfen, dass es die Epitope sequentiell ohne jegliche dazwischen geschaltete Abstandshaltersequenzen zwischen ihnen codiert, und eine Konsensus-Igκ-Signalsequenz wurde mit dem 5'-Ende des Konstrukts verbunden, um den Transport des codierten Antigens in das endoplasmatische Retikulum zu erleichtern (Ishioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999).
  • Die Fähigkeit von HIV-FT, Recall-CTL-Antworten in vivo zu primen, wurde durch die intramuskuläre Immunisierung von HLA-A*0201-Kb-transgenen Mäusen abgeschätzt. Splenocyten von Tieren, die mit 100 μg HIV-FT-Plasmid-DNA immunisiert wurden, wurden mit jedem der HLA-A*0201-Epitope, die in HIV-FT codiert waren, stimuliert und hinsichtlich einer Peptid-spezifischen CTL-Aktivität nach sechstägiger Kultivierung untersucht. Repräsentative CTL-Antworten gegen drei der Epitope in HIV-FT werden in 4a gezeigt. Um die Ergebnisse verschiedener Experimente bequemer zusammentragen zu können, wurden die prozentualen Cytotoxizitätswerte für jeden Splenocytenkultur in lytischen Einheiten ausgedrückt, wie zuvor bereits be schrieben wurde (Vitiello, et al., J. Clin. Invest 95:341-349, 1995). Von, den acht HLA-A*0201-restringierten Epitopen, die in HIV-FT codiert sind, führten Pol 498, Env 134, Pol 448, Vpr 62, Nef 221 und Gag 271 zu einem Priming von CTL-Antworten nach der DNA-Immunisierung aus, (4b). Die Größe der CTL-Antworten variierte über einen größeren Bereich als Faktor 10, von nahezu 50 LU gegen Pol 498 bis nur 4 LU gegen Nef 221 und Gag 271. Ähnlich variierte die Häufigkeit der Recall-CTL-Antworten zwischen Epitopen, wobei das Pol 498-Epitop Antworten in 94 % der Fälle hervorruft, während CTL-Antworten auf Gag 271 in nur 31 % der Experimente nachgewiesen wurden. Schlussfolgernd führte die DNA-Immunisierung mit HIV-FT, das sequentiell die Epitope ohne jegliche Abstandshalteraminosäuren codiert, zur Induktion von Recall-CTL-Antworten gegen die Mehrzahl der analysierten Epitope. Die Größe und die Häufigkeit der Antworten variierte jedoch sehr stark zwischen den Epitopen.
  • Korrelation zwischen Epitop-Immunogenität und Ausmaß der HIV-FT-Epitop-Präsentation in transfizierten Zelllinien
  • Die differentielle Immunogenität der HLA-A*0201-Epitope in HIV-FT wurde dann untersucht. Differentielle MHC-Bindungsaffinität konnte ausgeschlossen werden, da alle Epitope HLA-A*0201 mit hoher Affinität binden (3a). Zusätzlich konnte auch das Fehlen eines geeigneten Repertoires von TCR-Spezifitäten in HLA-A*0201/Kb-transgenen Mäusen ausgeschlossen werden, da alle Epitope vergleichbare CTL-Antworten ergaben nach der Immunisierung von HLA-transgenen Mäusen mit dem optimalen, vorprozessierten, in IFA emulgierten Peptid. Schwankungen in den relativen Mengen jedes Epitops, das für die T-Zell-Erkennung präsentiert wird, können mindestens zum Teil die unterschiedliche Immunogenität der Epitope bedingen.
  • Um dies zu prüfen, wurden Jurkat-Zellen, eine humane T-Zelllinie, die das HLA-A*0201/Kb-Gen exprimieren (Vitiello et al., J. Exp. Med. 173, 1007-1015, 1991), mit dem HIV-FT transfiziert, das in einem episomalen Vektor exprimiert wird. Eine humane Zelllinie wurde für die Verwendung ausgewählt, um alle möglichen Artefakte auszuschließen, die mit Unterschieden in den Prozessierungsfähigkeiten zwischen Menschen und Mäusen in Zusammenhang gebracht werden können. Diese transfizierte Zelllinie gleicht die MHC-Präsentation mit der Antigen-Prozessierungsfähigkeit ab und liefert eine mögliche Unterstützung für die nachfolgende Entwicklung von DNA-Vakzinen auf CTL-Epitop-Basis zur Verwendung in Menschen.
  • Peptidspezifische CTL-Linien wiesen die Präsentation in den transfizierten Zielzellen von vier der HLA-A*0201-Epitope nach, codiert in HIV-FT, Pol 498, Env 134, Pol 448 und Nef 221. Für die Quantifizierung des Ausmaßes, in dem jedes dieser Epitope erzeugt und präsentiert wurde, wurden die CTL-Linien, die spezifisch für die verschiedenen Epitope sind, mit nicht infizierten Zielzellen und verschiedenen Mengen jedes Epitops inkubiert. Diese CTL-Dosis-Antwortkurven wurden als Standardkurven verwendet, um die Peptidkonzentration zu bestimmen, die ein Ausmaß der IFN-γ-Sekretion hervorruft, das äquivalent mit dem Ausmaß ist, das als Antwort auf HIV-FT-transfizierte Zielzellen beobachtet wird. Dieser Wert wird als die "Peptidäquivalentdosis" bezeichnet und wird als ein relatives Maß für die Menge des Epitops, die auf der transfizierten Zelle präsentiert wird, genommen.
  • Tabelle 5 fasst die Ergebnisse dieser Analyse für sieben der HLA-A*0201-Epitope, die in dem HIV-FT codiert sind, zusammen. Die Peptidäquivalentdosen variierten von einem Höchstwert von 33,3 ng/ml für Nef 221 bis weniger als 0,4 ng/ml Peptidäquivalente für die Epitope Gag 271, Gag 386 und Pol 774. Gesammelt weisen diese Ergeb nisse darauf hin, dass es in menschlichen Zelllinien, die mit HIV-FT transfiziert sind, eine mindestens 100-fache Variation gibt hinsichtlich des Ausmaßes der Präsentation der verschiedenen HLA-A*0201-restringierten Epitope. Alle Epitope, die in nachweisbarem Ausmaß in Antigenitätsassays präsentiert wurden, waren auch in vivo immunogen. Das einzige Epitop, das immunogen und nicht antigen war, war Gag 271. In diesem Fall rief die Immunisierung von HLA-A*0201/Kbtransgenen Mäusen mit HIV-FT eine schwache CTL-Antwort in weniger als einem Drittel der geprüften Kulturen hervor. Die anderen beiden Epitope, die unterhalb der Empfindlichkeitsgrenze für die Antigenitätsanalyse präsentiert wurden, Gag 386 und Pol 774, waren nicht immunogen. Schlussfolgernd schlagen diese Ergebnisse vor, dass die Heterogenität der CTL-Antworten, die durch die HIV-FT-Immunisierung hervorgerufen wird, mindestens teilweise einer suboptimalen Epitop-Präsentation zugeschrieben werden kann. Tabelle 5: Vergleich der HIV-FT-Immunogenität und -Antigenität
    Epitop HIV-FT-Immunogenität HIV-FT-Antigenität
    Stärke1 Häufigkeit2 Peptidäquivalente3 n4
    Pol 498 58,8 (2,2) 94 % (16/17) 23,8(2.() 4
    Env 134 16,1 (5,0) 63 % (5/8) 6,2 (1,2) 3
    Pol 448 15,7 (2,6) 54%(7/13) 24,7 (3,9) 3
    Vpr 62 9,9 (1,9) 83%(10/12) ND –
    Nef 221 4,4 (1,3) 78%(7/9) 33,3 (6,0) 3
    Gag 271 4,0 (1,4) 31%(4/13) < 0,4 6
    Gag 386 0 0 % (0/17) < 0,4 3
    Pol 774 0 0 % (0/8) < 0,4 1
    • 1 Stärke, ausgedrückt als LU (Ref.); der Korrelationskoeffizient relativ zu Peptidäquivalenten R + 0,44
    • 2 Häufigkeit positiver Kulturen (Zahl der Kulturen > 2 LU/insgesamt getestet); der Korrelationskoeffizient relativ zu Peptidäquivalenten R + 0,8
    • 3 Stärke ausgedrückt in ng/ml
    • 4 Zahl der unabhängigen Experimente
  • Flankierende Aminosäuren beeinflussen die CTL-Epitop-Immunogenität in vivo nach der Impfung
  • Wie hier beschrieben sind die speziellen Aminosäuren, die einzelne CTL-Epitope flankieren, ein Faktor, der die Effizienz beeinflusst, mit der ein Epitop prozessiert wird, indem die Empfindlichkeit des Antigens für die proteolytische Spaltung verändert wird. Für die Untersuchung des Einflusses flankierender Aminosäuren auf die Epitop-Immunogenität wurden die Immunogenitätsdaten von HLA-A*0201, -A*1101 und -B*0701-transgenen Mäusen aufgenommen, die mit einer Anzahl nicht zusammenhängender experimenteller Multiepitop-DNA-Konstrukte, die minimale CTL-Epitope ohne dazwischenliegende Sequenzen codieren, immunisiert wurden. Eine Datenbank, die 94 verschiedene Epitop/flankierender Rest-Kombinationen umfasst, wurde erstellt, um den möglichen Einfluss der unmittelbar flankierenden Aminosäuren auf die Epitop-Immunogenität zu bestimmen. Eine gegebene Kombination aus Epitop und flankierender Aminosäure wurde nur einmal eingeschlossen, um ein künstliches Verzerren der Analyse durch Redundanz zu verhindern. Die Epitop-Immunogenität in HLA-transgenen wurde als optimal eingestuft, wenn sie größer als 100 SU oder 20 LU in mindestens 30 % der gemessenen Kulturen war. Die CTL-Antworten wurden typischerweise in einer von vier Kategorien gezählt: (+++), außergewöhnlich – mehr als 200 LU oder 1000 SU; (++), gut-20-200 LU oder 100-1000 SU; (+), durchschnittlich-2 bis 20 LU oder 10 bis 100 SU; und (+/–) schwach oder negativ-weniger als 2 LU oder 10 SU. Die Anzahl der optimalen gegenüber der Anzahl der suboptimalen Antworten wurde auf der Basis des chemischen Typs der Aminosäure in den flankierenden Positionen kategorisiert, und die Bedeutung von Unterschieden wurden unter Verwendung eines Chi-Quadrat-Tests ermittelt.
  • Diese Analyse fand keine Verbindung zwischen dem Typ der am Amino-Terminus eines Epitops vorhandenen Aminosäuren und der Immunogenität. Es wurden jedoch signifikante Effekte des flankierenden Rests am Carboxy-Terminus, des C+1-Rests, nachgewiesen. Positiv geladene Aminosäuren, K oder R, hingen am häufigsten mit optimalen CTL-Antworten zusammen, eine Häufigkeit von 68 % (5). Die Gegenwart der Aminosäuren N und Q beim C+1-Rest war ebenfalls mit starken CTL-Antworten in 55,5 % der untersuchten Fälle verbunden; wenn Epitope in der C+1-Position durch N flankiert wurden, riefen sie in 3/4 der Fälle optimale CTL-Antworten hervor. Ganz allgemein förderten kleine Reste wie C, G, A, T und S mittlere CTL-Antworten, wobei starke Antworten in 54 % der für die Analyse verfügbaren Kombinationen hervorgerufen wurden. Umgekehrt induzierten Epitope, die von aromatischen und aliphatischen Aminosäuren flankiert werden, optimale in vivo-Antworten in nur 36 % bzw. 17 % der Fälle. Der negativ geladene Rest D ergab eine suboptimale CTL-Antwort. Der Einfluss der C+1-Aminosaure auf die Epitop-Immunogenität erwies sich bei Anwendung eines Chi-Quadrattests (P < 0,03) als statistisch signifikant. Kein signifikanter Einfluss auf die Epitop-Immunogenität wurde festgestellt, wenn eine ähnliche Analyse für C-terminale Reste weiter entfernt als die C+1-Position durchgeführt wurde.
  • Direkte Beurteilung des Effekts des C1-Rests auf die Epitop-Immunogenität
  • Für die direkte Untersuchung des Effekts bevorzugter Typen im Vergleich zu schädlichen Typen von Aminosäuren in der C+1-flankierenden Position wurden auch zwei Multiepitop-Konstrukte, die als HBV.1 und HBV.2 (3b) bezeichnet werden, untersucht. Wie bei HIV-FT codieren diese HBV-Konstrukte die Epitope nacheinander ohne dazwischen eingefügte Abstandshalter. Tatsächlich wurden HBV.1 und HBV.2 erzeugt, indem die HIV-1-Epitope in pMin1, einem experimentellen Multiepitop-Konstrukt, das zuvor charakterisiert wurde (Ishioka, s.o.), durch ähnliche, von HBV abgeleitete Epitope ersetzt wurden.
  • Für HBV.1 wurde das HIV-1-Epitop, das unmittelbar auf das hoch immunogene HBV Core 18-Epitop folgt, durch das HBV Pol 562-Epitop ersetzt. Dies veränderte den C+1-Rest von K in F. Das zweite Konstrukt, HBV.2, wurde durch die Insertion eines zusätzlichen Epitops, HBV Pol 629, zwischen dem HBV Core 18-Epitop und dem Pol 562-Epitop hergestellt; eine Änderung, die die C+1-Aminosäure durch einen K-Rest ersetzte. Wenn die Immunogenität des Core 18-Epitops, das in diesen verschiedenen Zusammenhängen präsentiert wurde, in HLA-A*0201/Kb-transgenen Mäusen präsentiert wurde, wurde ermittelt, dass das Core 18-Epitop in HBV.1 nahezu nicht immunogen war, während es in HBV.2 stark immunogen war (6a). Die Verringerung der in vivo-Immunogenität bei diesem Epitop war so, wie es durch unsere vorherige Analyse vorhergesagt wurde.
  • Um die Auswirkungen der C1-flankierenden Aminosäure auf die CTL-Epitop-Immunogenität weiter zu prüfen, wurde ein Satz von Konstrukten untersucht, die sich von HBV.1 durch die Insertion einzelner Aminosäuren in der C+1-Position relativ zum Core 18-Epitop (3c) unterscheiden. Eine geringe oder keine CTL-Antwort gegen das Core 18-Epitop wurde beobachtet, wenn es in der C+1-Position durch W, Y oder L (6b) flankiert wird. Im Gegensatz hierzu wurde die CTL-Antwort auf Core 18 durch die Insertion eines einzigen K-Rests dramatisch erhöht. Die Antworten waren vergleichbar mit den Antworten, die in HBV.2 beobachtet wurden, in dem das Core 18-Epitop durch Pol 629 flankiert wird, ein Epitop mit einem K an dem N-Terminus des Epitops. Eine Verstärkung der Core 18-CTL-Antwort wurde auch bei der Insertion von R, C, N oder G beobachtet. Der Effekt dieser Insertionen ist spezifisch, da die Immunogenität anderer Epitope in diesen Konstrukten hinsichtlich der CTL-Antworten keine signifikanten Änderungen zeigte (Daten nicht gezeigt). Schlussfolgernd weisen diese Daten daraufhin, dass die C+1-Aminosäure die Epitop-Immunogenität dramatisch beeinflussen kann.
  • Unterschiede der CTL-Epitop-Immunogenität korrelieren mit der präsentierten Menge
  • Falls die Variation der Immunogenität von Core 18, die mit verschiedenen C+1-Resten zusammenhängt, die Folge einer unterschiedlichen Empfindlichkeit gegenüber der proteolytischen Spaltung ist, dann sollten große Unterschiede im Ausmaß der Epitop-Präsentation in verschiedenen Konstrukten nachweisbar sein. Um dies zu prüfen, wurden Jurkat-Zellen, die das gleiche HLA-A*0201/Kb-Gen exprimieren, exprimiert in den transgenen Mäusen 20, mit einem episomalen Vektor transfiziert, der entweder HBV.1 oder HBV.1K exprimiert. Das Core 18-Epitop wurde in einem > 105-fachen Ausmaß präsentiert, wenn ein K in der C+1-Position war, verglichen mit dem Vorhandensein eines F in der gleichen Position (7). Es ist unwahrscheinlich, dass dieser Unterschied in der Core 18-Präsentation Unterschieden in der Genexpression zwischen Zielzelllinien zugeschrieben werden kann, da die Präsentation von Pol 455 um weniger als das 10-fache variierte. Diese Daten zeigen den markanten Effekt, den Aminosäuren in der C+1-Position auf die Effizienz der Epitop-Präsentation in Multiepitop-DNA-Vakzinen ausüben können. Diese Daten zeigen demnach, dass die Immunogenität von CTL-Epitopen in einem DNA-Vakzin durch Erwägungen hinsichtlich der Konzeption optimiert werden kann, die das Ausmaß der Epitoppräsentation beeinflussen. Dieser Typ der Optimierung ist auf Impfstoffe auf Epitopbasis, die unter Anwendung anderer Formate eingebracht werden, wie virale Vektoren sowie andere Expressionsvektoren, die dem Fachmann bekannt sind, anwendbar, da die Effekte ausgeübt werden, nachdem das Antigen transkribiert und translatiert worden ist.
  • Zusammenfassend wurde für flankierende Reste gefunden, dass entweder sehr kleine Reste, wie A, C oder G, oder große Reste, wie Q, W, K oder R, ganz allgemein mit guten oder außergewöhnlich guten Antworten zusammenhingen. Das Fehlen eines C+1-Restes auf Grund eines Stopcodons in dem Minigen oder das Vorhandensein von mittelgroßen Resten, wie S oder T, war mit einem eher mittleren Antwortmuster verbunden. Schließlich wurden im Fall eines negativ geladenen Restes, D, von aliphatischen (V, I, L, M) oder aromatischen Nicht-Tryptophan-Resten (Y, F) relativ schwache Antworten beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass der spezielle Rest, der den C-Terminus des Epitops flankiert, die Antworthäufigkeit und Stärke der Antwort dramatisch beeinflussen kann. Flankierende Reste in der C+1-Position können auch in Kombination mit Abstandshaltersequenzen eingeführt werden. Dann wird ein Rest, der die Immunogenität fördert, vorzugsweise K, R, N, A oder G, als ein flankierender Rest eines Abstandshalters eingeführt.
  • SORTIEREN UND OPTIMIERUNG VON POLYEPITOP-KONSTRUKTEN
  • Für die Entwicklung von Polyepitop-Konstrukten unter Anwendung der Erfindung werden die Epitope für den Einschluss in das Polyepitop-Konstrukt unter Verwendung der hier definierten Parameter sortiert und optimiert. Das Sortieren und die Optimierung können unter Verwendung eines Computers oder, für eine kleinere Zahl von Epitopen, auch ohne einen Computer durchgeführt werden.
  • Die computergesteuerte Optimierung kann typischerweise folgendermaßen durchgeführt werden. Im Folgenden wird ein Beispiel für ein computerisiertes System gegeben, das Epitop-Kombinationen identifiziert und optimiert, d. h. das eine minimale Anzahl an Verknüpfungsepitopen und eine maximale Anzahl an flankierenden Resten liefert.
  • Eine Komponente beim Sortieren der Epitope ist ein "Junctional Analyzer" ("Verknüpfungs-Analysator"). Dieses Programm verwendet beispielsweise eine Textdatei, um Parameter für seinen Betrieb festzulegen. Fünf Typen von Eingabedaten werden dem Programm zugeführt: 1) Ein Satz von abzuarbeitenden Peptiden. 2) Ein Satz mit der Gewichtung aller Aminosäure, wenn sie in einer C+1- und N-1-Position erscheinen. 3) Ein Satz von Motiven, die beim Nachweisen von Verknüpfungen verwendet werden. 4) Die Maximalzahl der Aminosäuren, die zwischen jedes Paar von Peptiden eingesetzt wird. 5) Andere Werte für die Steuerung des Betriebs des Programms. Das Programm untersucht alle möglichen Paare von Peptiden und berechnet die Zahl der Verknüpfungen, die C+1- und N-1-Gewichtung und kombiniert sie gemäß einer vorgegebenen Gleichung. Gegenwärtig ist die Gleichung nur das Produkt der Gewichtungen geteilt durch die Zahl der Verknüpfungen. Falls die Zahl der Verknüpfungen Null ist, wird das Produkt durch 0,5 geteilt. Andere Gleichungen für die Bewertung von Peptidpaaren können leicht und jederzeit zu dem Programm hinzugefügt werden. Das Ergebnis, das dieses Programm liefert, ist eine Textdatei, die für jedes Peptidpaar die Insertion aufzählt, die das maximale Funktionsergebnis liefert. Die Datei schließt auch die Originalliste der Peptide und die Befehle ein, die den Betrieb jedes der beiden Programme steuern, die den nächsten Schritt der Abarbeitung durchführen. Diese beiden Programme heißen "Exhaustive J Search" und "Stochastic J Search".
  • "Exhaustive J Search" schaut sich alle Permutationen der Peptide an und wählt diejenigen aus, die die größte Summe des Funktionsergebnisses haben. Dieses Programm findet die Permutation mit der größten Funktionssumme. Auf Grund der faktoriellen Natur der Permutationen kann es jedoch nur für ein Maximum von 12 oder 13 Peptiden verwendet werden. Die geschätzte Laufzeit für 13 Peptide beträgt 2,9 h, und sie läge bei etwa 40 h für 14 Peptide. "Stochastic J Search" wurde so entworfen, dass es viele Bereiche der Permutationssequenz durchsucht und die beste Funktionssumme, die es findet, ausgibt. Indem nur Permutationen ausgegeben werden, die dem gegenwärtigen Gesamtmaximalfunktionswert entsprechen oder ihn übertreffen, ist es möglich, ein größeres Gebiet der Permutationssequenz zu durchsuchen. Diese Technik ist mit bis zu 20 Peptiden erfolgreich gewesen. Die Zeit für das erschöpfende Durchsuchen von 20 Peptiden würde in der Größenordnung von 1,3 × 105 Jahren liegen.
  • Das Programm kann folgendermaßen arbeiten:
    Diese Parameter stellen Eingaben in das Programm dar:
    • 1. die zu sortierenden Epitope
    • 2. die "Gewichtung" von Aminosäure C+1 & N-1, wie oben beschrieben
    • 3. Motive für den Nachweis von Verknüpfungsepitopen
    • 4. Maximale Abstandshalterreste
    • 5. Parameter zum Steuern der Programmoptionen
  • Das "Junctional Analyzer"-Programm führt dann die folgenden Operationen durch:
    • 1. Erzeugen aller Epitop-Paare
    • 2. Für jedes Peptidpaar Bestimmung des Satzes von Insertionen, der zur minimalen Anzahl an Verknüpfungsepitopen und zum maximalen Effekt vom C+1- und N-1-Beitrag der Abstandshaltenderreste führt.
    • 3. Ausgabe der optimalen Abstandshalterreste für jedes Paar und des Wertes der optimierten Verknüpfung.
  • Wenn 14 oder mehr als 14 Epitope in das Polyepitop-Konstrukt eingeschlossen werden sollen, wird eine stochastische Suche ("Stochastic Search") verwendet. Ein "Stochastisches Suchprogramm" verwendet eine Monte Carlo-Technik, die dem Fachmann bekannt ist, um viele Bereiche im Permutationsraum zu untersuchen, um die beste Schätzung der optimalen Anordnung der Peptide zu finden.
  • Wenn weniger als 14 Epitope eingeschlossen werden, wird ein "Erschöpfendes Such-Programm" ("Exhaustive Search Program") verwendet. Das "Exhaustive Search-Programm" untersucht alle Permutationen der Epitope, die das Polyepitop-Konstrukt bilden, um diejenige mit dem besten Wert für die Summe der Optimierungsfunktionen für alle Epitop-Paare zu finden. Hierdurch wird garantiert, dass die "beste" Permutation gefunden wird, weil alle untersucht werden.
  • Die "Programmausgabe" liefert eine Liste der besten Anordnungen der Epitope. Da viele Permutationen den gleichen Wert der Bewertungsfunktion haben, werden mehrere erzeugt, so dass beim Auswählen der optimalen Anordnung andere Faktoren in Betracht gezogen werden können.
  • Beispiele für Polyepitop-Konstrukte, die unter Verwendung dieses System der Programmanalyse erzeugt wurden, werden in 9 angegeben.
  • Andere Faktoren wie Ladungsverteilung, Analyse des hydrophoben/hydrophilen Bereichs oder Faltungsvorhersage können ebenfalls in die Beurteilungsfunktion eingeführt werden, um die Minigen-Konstrukte weiter zu optimieren.
  • Makromolekulare Strukturen, wie Polypeptidstrukturen, können hinsichtlich ihrer verschiedenen Organisationsniveaus beschrieben werden. Für eine allgemeine Diskussion dieser Organisation siehe z. B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3. Auflage, 1994) und Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). "Primärstruktur" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz eines speziellen Peptids. "Sekundärstruktur" bezieht sich auf lokal geordnete, dreidimensionale Strukturen innerhalb eines Polypeptids. Diese Strukturen sind allgemein als Domänen bekannt. Domänen sind Teile eines Polypeptids, die eine kompakte Einheit des Polypeptids bilden. Typische Domänen sind aus Abschnitten mit geringerer Organisation aufgebaut, wie Strecken von β-Blättern und α-Helices. "Tertiärstruktur" bezieht sich auf die vollständige dreidimensionale Struktur eines Polypeptidmonomers. "Quartärstruktur" bezieht sich auf die dreidimensionale Struktur, die durch die nicht kovalente Assoziation unabhängiger Tertiäreinheiten gebildet wird.
  • Strukturelle Vorhersagen, wie Ladungsverteilung, Analyse des hydrophoben/hydrophilen Bereichs, oder Vorhersagen zur Faltung können unter Verwendung von Sequenzanalyseprogrammen durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind, zum Beispiel können hydrophobe und hydrophile Domänen identifiziert werden (siehe z. B. Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982) und Stryer, Biochemistry (3. Auflage, 1988); siehe auch jedes beliebige Programm aus einer Anzahl von Sequenzanalyseprogrammen im Internet, wie diejenigen, die unter dot.imagen.bcm.tcm.edu gefunden werden.
  • Ein dreidimensionales Strukturmodell eines Polyepitop-Konstrukts kann ebenfalls erzeugt werden. Dies geschieht im Allgemeinen, indem die zu analysierende Aminosäuresequenz in das Computersystem eingegeben wird. Die Aminosäuresequenz stellt die Primärsequenz oder eine Subsequenz des Proteins dar, die die Strukturinformation des Proteins codiert. Das dreidimensionale Strukturmodell wird dann durch die Interaktion des Computersystems unter Verwendung einer Software, die den Fachleuten bekannt ist, erzeugt.
  • Die Aminosäuresequenz stellt eine Primärstruktur dar, die die Information codiert, die erforderlich ist, um die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur des interessierenden Proteins zu erzeugen. Die Software schaut nach bestimmten Parametern, die durch die Primärsequenz codiert werden, um das Strukturmodell zu erzeugen. Diese Parameter werden als "Energieterme" bezeichnet und schließen primär elektrostatische Potentiale, hydrophobe Potentiale, Lösemittel-zugängliche Oberflächen und Wasserstoffbindungen ein. Sekundäre Energieterme schließen van der Waals-Potentiale ein. Biologische Moleküle bilden die Strukturen, die die Energieterme in einer kumulativen Weise minimieren. Das Computerprogramm verwendet daher diese Terme, die durch die Primärstruktur oder Aminosäuresequenz codiert werden, um das Sekundärstrukturmodell zu erzeugen.
  • Die Tertiärstruktur des Proteins, die durch die Sekundärstruktur codiert wird, wird dann auf der Basis der Energieterme der Sekundärstruktur gebildet. Der Anwender kann zusätzliche Variable eingeben, wie ob das Protein membrangebunden oder löslich ist, seinen Ort im Körper, und seine Lokalisierung in der Zelle, z. B. im Zytoplasma, an der Oberfläche oder im Kern. Diese Variablen werden zusammen mit den Energietermen verwendet, um das Modell der Tertiärstruktur zu erzeugen. Bei der Modellierung der Tertiärstruktur bringt das Computerprogramm die hydrophoben Flächen der Sekundärstruktur untereinander und die hydrophilen Flächen der Sekundärstruktur untereinander zusammen.
  • Diejenigen Polyepitop-Konstrukte, die dem HLA-Prozessierungsapparat am leichtesten zugänglich sind, werden dann ausgewählt.
  • II. Untersuchung der Immunogenität von Multiepitop-Vakzinen
  • Die Entwicklung von Multiepitop-Minigenen stellt eine einzigartige Herausforderung dar wegen der Spezies-Spezifität des Peptidbindens an MHC. Verschiedene MHC-Typen verschiedener Spezies neigen dazu, verschiedene Sätze von Peptiden zu binden [Rammensee et al., Immunogenetics, Bd. 41(4):178-228 (1995)]. Im Ergebnis ist es nicht möglich, in normalen Labortieren ein Konstrukt zu testen, das aus humanen Epitopen besteht. Alternativen, um diese Einschränkung zu überwinden, stehen im Allgemeinen zur Verfügung. Diese schließen ein: 1) das Testen analoger Konstrukte, die Epitope einschließen, die durch nicht-humane MHC restringiert sind; 2) das Vertrauen auf Kontroll-Epitope, die durch nicht-humane MHC restringiert sind; 3) das Vertrauen auf die Kreuzreaktivität zwischen humanen und ichthumanen MHC); 4) die Verwendung von HLA-transgenen Tieren; und 5) Antigenitäts-Assays, die in vivo menschliche Zellen verwenden. Das Folgende stellt einen kurzen Überblick über die Entwicklung der Technik zum Analysieren der Antigenität und der Immunogenität dar.
  • Klasse I-HLA-transgene Tiere
  • Die Brauchbarkeit von HLA-transgenen Mäusen für den Zweck der Epitopidentifizierung [Sette et al., J Immunol, Bd. 153(12):5586-92 (1994); Wentworth et al., Int Immunol, Bd. 8(5):651-9 (1996); Engelhardt et al., J Immunol, Bd. 146(4):1226-32 (1991); Man et al., Int Immunol, Bd. 7(4):597-605 (1995); Shirai et al., J Immunol, Bd. 154(6):2733-42 (1995)] und der Vakzinentwicklung [Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)] ist einwandfrei festgestellt worden. In den meisten veröffentlichten Artikeln ist die Verwendung von HLA A*0201/Kb-Mäusen untersucht worden, es sollte jedoch zur Kenntnis genommen werden, dass B*27- und B*3501-Mäuse auch zur Verfügung stehen. Weiterhin sind auch HLA A*11/Kb-Mäuse [A lexander et al., J Immunol, Bd. 159(10):4753-61 (1997)] und HLA B7/Kb- und HLA A1/Kb-Mäuse erzeugt worden.
  • Daten von 38 verschiedenen möglichen Epitopen wurden analysiert, um den Grad der Überlappung zwischen dem A2.1-restringierten CTL-Repertoire von A2.1/Kb-transgenen Mäusen und A2.1+-Menschen zu ermitteln [Wentworth et al., Eur J Immunol, Bd. 26(1):97-101 (1996)]. Sowohl in Menschen als auch in Mäusen korreliert eine MHC-Peptidbindungsaffinitätsschwelle von etwa 500 nM mit der Fähigkeit eines Peptids, in vivo eine CTL-Antwort auszulösen. Ein hoher Grad der Konkordanz zwischen den Daten vom Menschen in vivo und den Daten der Maus in vivo wurde für 85 % der stark bindenden Peptide, für 58 % der durchschnittlich bindenden Peptide, und 83 % der schwach oder nicht bindenden Peptide beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit HLA A11- und HLA B7-transgenen Mäusen erhalten [Alexander et al., J Immunol, Bd. 159(10):4753-61 (1997)]. Aufgrund der weitreichenden Überlappung, die zwischen den T-Zell-Rezeptor-Repertoires der CTLs von HLA-transgenen Mäusen und vom Menschen existieren, sind demnach transgene Mäuse wertvoll für die Beurteilung der Immunogenität der hier beschriebenen Polyepitop-Konstrukte.
  • Die verschiedenen Spezifitäten des TAP-Transports, bezogen auf HLA A11-Mäuse, hindert nicht an der Verwendung von HLA-A11-transgenen Mäusen für die Beurteilung der Immunogenität. Während sowohl murines als auch humanes TAP Peptide mit einem hydrophoben Ende effizient transportiert, ist nur für humanes TAP berichtet worden, dass es Peptide mit positiv geladenen C-terminalen Enden, wie diejenigen, die von A3, A11 und anderen Mitgliedern des A3-Supertyps gebunden werden, effizient transportiert. Diese Besorgnis trifft auf A2, A1 oder B7 nicht zu, da sowohl murines als auch humanes TAP gleichermaßen befähigt sein sollte, Peptide zu transportieren, die von A2, B7 oder A1 gebunden werden. Im Einklang mit diesem Verständnis haben Vitiello [Vitiello et al., J Exp Med, Bd. 173(4):1007-15 (1991)] und Rotzschke [Rotschke O., Falk K., Curr Opin Immunol, Bd. 6(1):45-51 (1994] vorgeschlagen, dass die Prozessierung in Mäusezellen und humanen Zellen ähnlich ist, während Cerundolo [Rotzschke O, Falk K., Curr Opin Immunol, Bd. 6(1):45-51 (1994)] Unterschiede in murinen Zellen gegenüber humanen Zellen, die beide HLA A3-Moleküle exprimieren, vorgeschlagen hat. Bei der Verwendung von HLA A11-transgenen Tieren ist jedoch die Expression von HLA-Molekülen auf T- und B-Zellen in vivo beobachtet worden, was darauf hinweist, dass die berichtete unvorteilhafte Spezifität von murinem TAP die Stabilisierung und den Transport von A11/Kb-Molekülen in vivo nicht verhinderte [Alexander et al., J Immunol, Bd. 159(10):4753-61 (1997)]. Diese Daten stimmen mit der früheren Beobachtung überein, dass Peptide mit einem geladenen C-Terminus aus murinen Zellen eluiert werden können, die mit A11-Molekülen transfiziert sind [Maier et al., Immunogenetics; Bd. 40(4):306-8 (1994)]. Antworten in HLA-A11-Musen auf komplexe Antigene, wie Influenza, und höchst wichtig auf A11-restringierte Epitope, die von Multiepitop-Minigenen codiert werden [Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)] sind ebenfalls nachgewiesen worden. Demnach scheint das TAP-Thema bei transgenen Mäusen von geringerem Belang zu sein.
  • Ein anderes Thema von potentieller Bedeutung bei der Verwendung von HLA-transgenen Mäusen ist der mögliche Einfluss von β2-Mikroglobulin auf die HLA-Expression und die Bindungsspezifität. Es ist wohlbekannt, dass humanes β2 sowohl humanes MHC als auch MHC der Maus mit höherer Affinität und Stabilität bindet als das β2-Mikroglobulin der Maus [Shields et al., Mol Immunol Bd. 35(14-15:919-28 (1998)]. Es ist ebenfalls wohlbekannt, dass stabilere Komplexe der schweren Kette von MHC und β2 das exogene Laden von MHC-Klasse I erleichtern [Vitiello et al., Science, Bd. 250(4986):1423- 6 (1990)]. Wir haben den potentiellen Effekt dieser Variablen untersucht, indem Mäuse erzeugt wurden, die doppelt transgen für HLA/Kb und humanes β2 sind. Die Expression von humanem β2 war im Fall von HLA B7/Kb-Mäusen günstig, und sie war absolut wichtig, um gute Expressionsniveaus im Fall von HLA A1-transgenen Mäusen zu erzielen. Dem gemäß werden gegenwärtig und routinemäßig HLA/Kb- und β2-doppelt transgene Mäuse gezüchtet und von den Erfindern dieser Erfindung verwendet. Demnach können HLA-transgene Mäuse verwendet werden, um die HLA-restringierte Erkennung von vier Haupt-HLA-Spezifitäten (nämlich A2, A11, B7 und A1) zu modellieren, und transgene Mäuse für andere HLA-Spezifitäten können als geeignete Modelle für die Beurteilung der Immunogenität entwickelt werden.
  • Antigenitätstest für Klasse-I-Epitope
  • Mehrere unabhängige Reihen von Experimenten weisen darauf hin, dass die Dichte der Klasse I/Peptidkomplexe auf der Zelloberfläche mit dem Ausmaß des T-Zell-Primings korrelieren können. Dem gemäß liefert die Messung des Ausmaßes, in dem ein Epitop erzeugt und auf einer APC-Oberfläche präsentiert wird, eine Möglichkeit, um die Wirksamkeit eines Minigen-Vakzins in humanen Zellen in vitro indirekt zu beurteilen. Als eine Ergänzung zur Verwendung von HLA-Klasse-I-transgenen Mäusen bringt dieser Ansatz den Vorteil mit sich, dass die Prozessierung in humanen Zellen untersucht wird [Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)].
  • Zahlreiche mögliche Ansätze sind verfügbar, um die prozessierten Peptide experimentell zu quantifizieren. Die Peptidmenge auf der Zelloberfläche kann quantifiziert werden, indem die Peptidmenge gemessen wird, die von der APC-Oberfläche eluiert wird [Sijts et al., J Immunol, Bd. 156(2):683-92 (1996); Demotz et al., Nature, Bd. 342(6250):682-4 (1989)]. Alternativ kann die Zahl der Peptid-MHC-Komplexe geschätzt werden, indem das Ausmaß der Lyse oder der Lymphokinfreisetzung, hervorgerufen durch infizierte oder transfizierte Zielzellen, gemessen wird und dann die Peptidkonzentration ermittelt wird, die erforderlich ist, um ein äquivalentes Ausmaß der Lyse oder Lymphokinfreisetzung zu erhalten [Kageyama et al., J Immunol, Bd. 154(2):567-76 (1995)].
  • Ein ähnlicher Ansatz ist verwendet worden, um die Epitop-Präsentation in Minigen-transfizierten Zelllinien zu messen. Spezifisch werden Minigenkonstrukte, die in HLA-transgenen Mäusen immunogen sind, auch durch humane Zellen, die mit dem gleichen Minigen transfiziert sind zu optimalen Epitopen prozessiert, und die Stärke der Antwort, die in transgenen Mäusen beobachtet wird, korreliert mit der Antigenität, die bei den transfizierten humanen Zielzellen beobachtet wird [Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)].
  • Bei Verwendung von Antigenitätsassays kann eine Anzahl verwandter Minigene, die sich hinsichtlich der Anordnung der Epitope oder der flankierenden Reste unterscheiden, in APCs transfiziert werden, und der Einfluss der oben erwähnten Variablen auf die Epitop-Präsentation kann beurteilt werden. Dies kann ein bevorzugtes System für ein Testen sein, wo eine relativ große Zahl verschiedener Konstrukte beurteilt werden muss. Auch wenn dies große Zahlen von Epitopspezifischen CTLs erfordert, sind Protokolle entwickelt worden, die die Erzeugung hochempfindlicher CTL-Linien [Alexander-Miller et al., Proc Natl Acad Sci USA, Bd. 93(9):4102-7 (1996)] und auch deren Expansion in große Zahlen [Greenberg P.D, Riddell S.R., Sciene, Bd. 285(5427):546-51 (1999)] erlauben, um dieses potentielle Problem anzugehen.
  • Es sollte auch daran gedacht werden, dass irreführende Ergebnisse erhalten werden könnten, falls die Zelle, die für die Transfektion verwendet wird, nicht die Zelle widerspiegelt, die in vivo die APC-Funktion ausübt. Zellen aus der B-Zelllinie, die als "professionelle" APCs bekannt sind, werden typischerweise als Transfektionsempfänger eingesetzt. Die Verwendung von transfizierten B-Zellen dieses Typs ist auf dem Fachgebiet eine akzeptierte Praxis. Weiterhin wurde bereits eine gute Korrelation zwischen in vitro-Daten, für die transfizierte menschliche B-Zellen verwendet wurden, und in vivo-Ergebnissen, für die HLA-transgene Mäuse verwendet wurden, festgestellt, was hier detaillierter beschrieben wird.
  • Messung von HTL-Antworten
  • In bevorzugten Ausführungsformen werden Vakzin-Konstrukte so optimiert, dass sie Klasse-II-restringierte Immunantworten induzieren. Ein Verfahren für die Bewertung von Polyepitop-Konstrukten, die Klasse-II-Epitope einschließen, besteht in der Verwendung von HLA-DR-transgenen Mäusen. Verschiedene Gruppen haben HLA-DR-transgene Mäuse erzeugt und charakterisiert [Taneja V., David C.S., Immunol Rev, Bd. 169:67-79 (1999)].
  • Es gibt auch eine Alternative, die auf der Kreuzreaktivität zwischen bestimmten humanen MHC-Molekülen und speziellen MHC-Molekülen, die von Labortieren exprimiert werden, beruht. Bertoni et coll. [Bertoni et al., J. Immunol, Bd. 161(8):4447-55 (1998)] haben festgestellt, dass zwischen bestimmten HLA-Klasse-I-Supertypen und bestimmten PATR-Molekülen, die von Schimpansen exprimiert werden, eine merkliche Kreuzreaktivität nachgewiesen werden kann. Eine Kreuzreaktivität zwischen dem Menschen und Affen auf der Ebene der Klasse-II-Molekülen [Geluk et al., J Exp Med, Bd. 177(4):979-87 (1993)] und Klasse-I-Molekülen [Dzuris, et al., J. Immunol., Juli 1999] ist ebenfalls festgestellt worden. Schließlich kann auch festgestellt werden, dass das Motiv, das vom humanen HLA B7-Supertyp erkannt wird, im Wesentlichen das Gleiche ist wie dasjenige, das vom murinen Klasse I Ld erkannt wird [Rammensee et al., Immunogenetics, Bd. 41(4):178-228 (1995)]. Von Relevanz für das Testen von HLA-DR-restringierten Epitopen in Mäusen ist, wie von Wall, et al. gezeigt worden ist [Wall et al., J. Immunol., 152:4526-36 (1994)], dass es Ähnlichkeiten in dem Motiv von DR1 und IAb gibt. Wir haben routinemäßig unsere transgenen Mäuse so gezüchtet, dass diese zufällige Ähnlichkeit ausgenutzt wird. Weiterhin haben wir auch gezeigt, dass die meisten unserer Peptide an IAb binden, so dass wir diese Mäuse für die Untersuchung der CTL- und HTL-Immunogenität verwenden.
  • Messung und Quantifizierung der Immunantworten von klinischen Proben
  • Ein wichtiges Element bei der Untersuchung der Leistungsfähigkeit eines Vakzins besteht darin, seine Fähigkeit zu beurteilen, Immunantworten auszulösen. Analysen der CTL- und HTL-Antwort gegen das Immunogen sowie gegen übliche Recall-Antigene werden allgemein verwendet und sind auf dem Fachgebiet bekannt. Eingesetzte Assays schließen den Chromfreisetzungs-, den Lymphokinsekretions- und den Lymphoproliferationsassay ein.
  • Empfindlichere Techniken, wie der ELISPOT-Assay, das intrazelluläre Färben von Cytokinen und die Tetramerfärbung, sind auf dem Fachgebiet verfügbar geworden. Es wird geschätzt, dass diese neueren Methoden 10- bis 100-mal empfindlicher sind als übliche CTL- und HTL-Assays [Murali-Krishna et al., Immunity, Bd. 8(2):177-87 (1998)], weil die herkömmlichen Verfahren nur den Subsatz von T-Zellen messen, die sich in vitro vermehren können, und faktisch nur für ei nen Teil des Gedächtnis-T-Zell-Kompartiments repräsentativ sein können [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Bd. 10(4):393-6 (1998)]. Speziell im Fall von HIV sind diese Techniken verwendet worden, um Antigen-spezifische CTL-Antworten von Patienten zu messen, die mit früheren Techniken nicht nachweisbar gewesen wären [Ogg et al., Science, Bd. 279(5359):2103-6 (1998); Gray et al., J Immunol, Bd. 162(3):1780-8 (1999); Ogg et al., J Virol., Bd. 73(11): 9153-60 (1999); Kalams et al., J Virol, Bd 73(8):6721-8 (1999); Larsson et al., AIDS, Bd. 13(7):767-77 (1999); Corne et al., J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrouirol, Bd. 20(5):442-7 (1999)].
  • Mit relativ wenigen Ausnahmen war es schwierig, die direkte Aktivität von frisch isolierten Zellen mit Hilfe der herkömmlichen Assays nachzuweisen [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Bd. 10(4):393-6 (1998)]. Die erhöhte Empfindlichkeit der neueren Techniken hat es den Forschern erlaubt, Antworten von Zellen nachzuweisen, die von infizierten Menschen oder Versuchstieren frisch isoliert werden [Murali-Krishna et al., Immunity, Bd. 8(2):177-87 (1998); Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Bd. 10(4):393-6 (1998)]. Die Verfügbarkeit dieser empfindlichen Assays, die nicht von einem Schritt der erneuten in vitro-Stimulierung abhängen, hat die Untersuchung der CTL-Funktion bei einer natürlichen Infektion und Krebs deutlich erleichtert. Im Gegensatz dazu werden Assays, die als ein Endpunkt verwendet werden, um die Effektivität experimenteller Vakzine zu bewerten, üblicherweise in Verbindung mit einem oder mehreren Schritten der erneuten in vitro-Stimulierung durchgeführt [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Bd. 10(4):393-6 (1998)]. Tatsächlich ist es bis auf wenige Ausnahmen [Hanke et al., Vaccine, Bd. 16(4):426-35 (1998)] (Allen et al., eingereicht) mit frisch isolierten Klasse-I-restringierten CD8+-T-Zellen schwierig gewesen, eine Antwort auf die Immunisierung mit experimentellen Vakzinen nachzuweisen, die so konzipiert sind, dass CTL-Antworten ausgelöst werden. Die Verwendung empfindlicher Assays, wie ELISPOT oder in sitze-IFN-γ-ELISA, wurde mit einem Schritt der erneuten Stimulierung kombiniert, um die maximale Empfindlichkeit zu erzielen; MHC-Tetramere werden ebenfalls für diesen Zweck verwendet.
  • MHC-Tetramere wurden erstmals 1999 von Altman et coll. beschrieben. Sie erzeugten lösliche HLA-A2-Klasse-I-Moleküle, die mit HIV-spezifischen Peptiden gefaltet wurden, die ein CTL-Epitop enthalten, das zusammen zu Tetrameren komplexiert wurde, die mit Fluoreszenzmarkern markiert waren. Diese werden verwendet, um Populationen von T-Zellen von HIV-infizierten Menschen zu markieren, die das Epitop erkennen [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Bd. 10(4):393-6 (1998)]. Diese Zellen wurden dann durch Flusscytometrie quantifiziert, was eine Häufigkeitsmessung für die T-Zellen liefert, die für das Epitop spezifisch sind. Diese Technik ist in der HIV-Forschung sowie bei anderen infektiösen Krankheiten sehr beliebt geworden [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Bd. 10(4):393-6 (1998); Ogg et al., Science, Bd. 279 (5359):2103-6 (1998); Gray et al., J. Immunol, Bd. 162(3):1780-8 (1999); Ogg e al., J Virol, Bd. 73(11):9153-60 (1999); Kalams et al., J Virol, Bd. 73(8):6721-8 (1999)]. Der HLA-Polymorphismus kann die allgemeine Anwendbarkeit dieser Technik jedoch einschränken, da die Tetramer-Technologie auf definierten HLA/Peptid-Kombinationen beruht. Es ist jedoch gezeigt worden, dass eine Vielzahl von Peptiden, eingeschlossen HIV-abgeleitete Peptide, durch Peptid-spezifische CTL-Linien im Rahmen von verschiedenen Mitgliedern der A2-, A3- und B7-Supertypen erkannt werden [Threlkeld et al., J Immunol, Bd. 159(4):1648-57 (1997); Bertoni et al., J Clin Invest, Bd. 100(3):503-13 (1997)]. Zusammen genommen weisen diese Beobachtungen nach, dass ein T-Zell-Rezeptor (TCR) für eine gegebene MHC/Peptid-Kombination eine nachweisbare Affinität für das gleiche Peptid haben kann, das von einem anderen MHC-Molekül des gleichen Supertyps präsentiert wird.
  • Unter Umständen, unter denen die Wirksamkeit einer prophylaktischen Impfung primär mit dem Induzieren einer lang anhaltenden Gedächtnisantwort korreliert ist, können Assays auf der Basis der erneuerten Stimulierung die am besten geeigneten und empfindlichsten Messungen sein, um die durch einen Impfstoff induzierten immunologischen Antworten zu beobachten. Umgekehrt kann im Fall von therapeutischen Vakzinen das wesentliche immunologische Korrelat der Aktivität das Induzieren der Effektor-T-Zell-Funktion sein, die am geeignetsten durch primäre Assays gemessen wird. Die Verwendung von empfindlichen Assays ermöglicht demnach die am besten geeignete Teststrategie für die immunologische Überwachung der Wirksamkeit eines Vakzins.
  • ANTIGENITAT VON MULTIEPITOP-MINIGENEN IN TRANSFIZIERTEN HUMANEN APCs
  • Antigenitätsassays werden durchgeführt, um die Epitop-Prozessierung und Präsentation in humanen Zellen zu beurteilen. Ein episomaler Vektor für die effiziente Transfektion humaner Zielzellen mit Minigen-Vakzinen auf Epitop-Basis wird verwendet, um eine derartige Analyse durchzuführen.
  • Beispielsweise wurden 221A2Kb-Zielzellen mit einem HIV-1-Minigen-Vakzin transfiziert. Die 221 A2Kb-Zielzelle exprimiert das A2Kb-Gen, das in HLA-transgenen Mäusen exprimiert wird, exprimiert aber keine endogene Klasse I [Shimizu Y, DeMars R., J Immunol, Bd. 142(9):3320-8 (1989)]. Diese transfizierten Zellen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, CTL-Linien, die von HLA-transgenen Mäusen stammen und spezifisch für verschiedene HIV-abgeleitete CTL-Epitope sind, ein Antigen zu präsentieren. Für eine Korrektur hinsichtlich der Unterschiede in der Antigen-Empfindlichkeit ver schiedener CTL-Linien wurden parallel Titrationen der Peptidmenge unter Verwendung von nicht transfizierten Zellen als APC durchgeführt.
  • Repräsentative Daten werden in 8 dargestellt. Im Fall der HIV-Pol 498-spezifischen CTL lösten die transfizierten Zielzellen die Freisetzung von 378 pg/ml IFN-γ aus. Die Betrachtung der Peptidmengen-Antworten offenbart, dass 48 ng/ml exogen zugegebenes Peptid erforderlich waren, um ein ähnliches Ausmaß der IFN-γ-Freisetzung zu erzielen. Diese Ergebnisse zeigen, dass relativ große Mengen Pol 498-Epitop von den transfizierten Zellen präsentiert werden, die zu 48 ng/ml exogen zugegebenem Peptid äquivalent sind.
    Tabelle 4. Vergleich zwischen der Antigenität des HIV-1-Minigens in transfizierten humanen Zellen und der Immunogenität in HLA-transgenen Mäusen
    Antigenität Immunogenität
    Epitop Peptid-Äquivalente1) n2) % Antwort3 ) Stärke4)
    HIV Pol 498 30,5 (6) 95 % 46,7
    HIV Env 134 6,2 (3) 62 % 16,1
    HIV Nef 221 2,1 (5) 82 % 3,8
    HIV Gag 271 < 0,2 (6) 31 % 4
    1) ng/ml 2) Zahl der unabhängigen Experimente 3) % der CTL-Kulturen, die positive Ergebnisse liefern; 4) Lytische Einheiten
  • Durch Vergleich wurden weniger als 25 pg/ml γ-IFN nachgewiesen bei Verwendung der CTL, die spezifisch für das Gag 271-Epitop sind. Die als Kontrolle dienende Peptidtitration mit nicht transfizierten Zielzellen zeigte, dass dieses negative Ergebnis nicht der schwachen Empfindlichkeit der verwendeten speziellen CTL-Linie zugeschrieben werden konnte, da nur 0,2 pg/ml "Peptid-Äquivalente" (PÄ) nachgewiesen werden konnten. Es scheint demnach so zu sein, dass das Gag 271-Epitop in den HIV-1-transfizierten Zielzellen nicht effizient prozessiert und präsentiert wird. Bei Verwendung der "Peptid-Äquivalente"-Zahl als eine ungefähre Quantifizierung der Effizienz der Prozessierung kann abgeschätzt werden, dass mindestens 200-mal weniger Gag 271 von den transfizierten Zielzellen präsentiert wird, verglichen mit dem Pol 498-Epitop.
  • Die Ergebnisse verschiedener unabhängiger Messungen für vier verschiedene Epitope, die in HIV-1 enthalten sind, sind in Tabelle 4 aufgelistet. Die Menge jedes Epitops, die von den HIV-1-transfizierten Zellen erzeugt wird, liegt im Bereich von 30,5 PÄ für Pol 498 bis zu einem Minimalwert von weniger als 0,2 PÄ für Gag 271. Die beiden Epitope Env 134 und Nef 221 waren mit mittleren Werten von 6,1 bzw. 2,1 PÄ verbunden.
  • Diese Ergebnisse wurden dann mit den in vivo-Immunogenitätswerten in Zusammenhang gebracht, die für jedes Epitop nach der Immunisierung mit dem HIV-1-Konstrukt beobachtet wurden. Wie vorhergesagt werden konnte, war das Pol 498-Epitop auch das am stärksten immunogene Epitop. Das Env 134- und das Nef 221-Epitop, für die in vivo eine mittlere Immunogenität beobachtet wurde, wurden auch in vitro mit einer mittleren Effizienz durch die transfizierten humanen Zellen prozessiert. Schließlich wurde das Gag 271, für das keine nachweisbare in vitro-Prozessierung beobachtet wurde, auch mit einer in vivo-Immunogenität in Zusammenhang gebracht, die sowohl hinsichtlich der Häufigkeit als auch der Stärke suboptimal ist.
  • Diese Daten erlauben verschiedene wichtige Schlussfolgerungen. Erstens lassen sie darauf schließen, dass verschiedene Epitope, die in einem gegebenen Minigen enthalten sind, mit unterschiedlicher Effizienz prozessiert und präsentiert werden können. Zweitens lassen sie darauf schließen, dass die Immunogenität proportional zu der Menge an erzeugtem prozessiertem Epitop ist. Schließlich liefern diese Ergebnisse eine wichtige Validierung der Verwendung von transgenen Mäusen für den Zweck der Optimierung von Multiepitop-Vakzinen, die für die Awendung beim Menschen vorgesehen sind.
  • III. Herstellung von Polyepitop-Konstrukten
  • Epitope für den Einschluss in die Polyepitop-Konstrukte tragen typischerweise HLA-Klasse-I- oder HLA-Klasse-II-Bindungsmotive, was beispielsweise in den PCT-Anmeldungen PCT/US0027766 oder PCT/US00/19774 beschrieben wird.
  • Mehrere HLA-Klasse-II- oder HLA-Klasse-I-Epitope, die in einem Polyepitop-Konstrukt vorhanden sind, können vom gleichen Antigen oder von verschiedenen Antigenen abgeleitet werden. Ein Polyepitop-Konstrukt kann beispielsweise ein oder mehrere HLA-Epitope enthalten, die von zwei verschiedenen Antigenen vom gleichen Virus oder von zwei verschiedenen Antigenen von verschiedenen Viren stammen. Epitope für den Einbau in ein Polyepitop-Konstrukt können vom Fachmann ausgewählt werden, indem beispielsweise ein Computer verwendet wird für die Auswahl von Epitopen, die HLA-Allel-spezifische Motive oder Supermotive enthalten. Die Polyepitop-Konstrukte, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können auch ein oder mehrere weitgehend kreuzreaktive bindende oder universelle HLA-Klasse-II-Epitope, z.B. PADRETM (Epimmune, San Diego, CA), (z. B. in dem US-Patent Nr. 5,736,142 bschrieben) oder ein Molekül aus der PADRE-Familie codieren.
  • Universelle HLA-Klasse-II-Epitope können vorteilhaft mit anderen HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Epitopen kombiniert werden, um die Zahl der Zellen zu erhöhen, die als Antwort auf ein gegebenes Antigen aktiviert werden, und um für eine breitere Erfassung von Popu lationen von HLA-reaktiven Allelen zu sorgen. Die Polyepitop-Konstrukte, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, können HLA-Epitope, die spezifisch für ein Antigen sind, universelle HLA-Klasse-II-Epitope oder eine Kombination aus einem spezifischen HLA-Epitop und mindestens einem universellen HLA-Klasse-II-Epitop einschließen.
  • HLA-Klasse-I-Epitope haben im Allgemeinen eine Länge von etwa 8 bis etwa 13 Aminosäuren, vor allem eine Länge von 8, 9, 10 oder 11 Aminosäuren. HLA-Klasse-II-Epitope haben im Allgemeinen eine Länge von etwa 6 bis 25 Aminosäuren und vor allem eine Länge von etwa 13 bis 21 Aminosäuren. Ein HLA-Klasse-I- oder HLA-Klasse-II-Epitop kann von jedem gewünschten interessierenden Antigen abgeleitet werden. Das interessierende Antigen kann ein virales Antigen, ein Oberflächenrezeptor, ein Tumorantigen, ein Onkogen, ein Enzym oder ein beliebiges Pathogen, eine beliebige Zelle oder ein beliebiges Molekül sein, für das/den/die eine Immunantwort erwünscht ist. Epitope können auf der Basis ihrer Fähigkeit, ein oder mehrere HLA-Allele zu binden, ausgewählt werden. Epitope, die Analoga zu natürlich vorkommenden Sequenzen sind, können ebenfalls in die hier beschriebenen Polyepitop-Konstrukte eingeschlossen werden. Derartige analoge Peptide werden beispielsweise in den PCT-Anmeldungen PCT/US97/03778, PCT/US00/19774 und in der gleichzeitig anhängigen U.S.S.N. 09/260,714, die am 3.1.99 eingereicht wurde, beschrieben.
  • Polyepitop-Konstrukte können unter Anwendung der auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Methodik erzeugt werden. Beispielsweise können Polypeptide, die die Polyepitop-Konstrukte umfassen, synthetisiert und verknüpft werden. Typischerweise werden Polyepitop-Konstrukte jedoch als Minigene unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technik erzeugt.
  • IV. Expressionsvektoren und Konstruktion eines Minigens
  • Die Polyepitop-Konstrukte, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, werden typischerweise als ein Expressionsvektor bereitgestellt, der ein Minigen umfasst, das das Polyepitop-Konstrukt codiert. Die Konstruktion derartiger Expressionsvektoren wird beispielsweise in PCT/US99/10646 beschrieben. Die Expressionsvektoren enthalten mindestens ein Promotorelement, das imstande ist, eine Transkriptionseinheit, die das Minigen codiert, in den geeigneten Zellen eines Organismus zu exprimieren, so dass das Antigen exprimiert wird und zu dem geeigneten HLA-Molekül dirigiert wird. Für die Verabreichung beim Menschen wird beispielsweise ein Promotorelement in den Expressionsvektor eingeführt, der in einer humanen Zelle funktioniert.
  • Die Erfindung stützt sich auf Routinetechniken auf dem Gebiet der rekombinanten Gentechnik. Grundlagentexte, die die allgemeinen Verfahren zur Anwendung in dieser Erfindung offenbaren, schließen ein: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Auflage 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990) und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg., 1994); Oligonucleotide Synthesis: A practical Approach (Gait, Hrsg., 1984); Kuijpers, Nucleic Acids Research 18(17):5197 (1994); Dueholm, J. Org. Chem. 59:5767-5773 (1994); Methods in Molecular Biology, Band 20 (Agrawal, Hrsg.); und Tijssen; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, z. B. Teil I, Kapitel 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" (1993)).
  • Die Nucleinsäure, die die Epitope codiert, wird unter Anwendung von Standardtechniken in einem Minigen zusammengestellt. Im Allge meinen werden die Nucleinsäuresequenzen, die Minigen-Epitope codieren, unter Anwendung von Amplifikationstechniken mit Oligonucleotid-Primern isoliert oder chemisch synthetisiert. Rekombinante Klonierungstechniken können, wenn dies zweckdienlich erscheint, ebenfalls verwendet werden. Es werden Oligonucleotidsequenzen ausgewählt, die die gewünschten Epitope entweder vervielfältigen (wenn die PCR für die Zusammenstellung des Minigens verwendet wird) oder codieren (wenn synthetische Oligonucleotide für die Zusammenstellung des Minigens verwendet werden).
  • Amplifikationstechniken, die Primer verwenden, werden typischerweise verwendet, um die Sequenzen, die die Epitope der Wahl codieren, von DNA oder RNA zu vervielfältigen und zu isolieren (siehe die US-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202 ; PCR Protocols: A guide to Methods and Applications (Innis et al., Hrsg., 1990)). Verfahren wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Ligasekettenreaktion (LCR) können verwendet werden, um Epitop-Nucleinsäuresquenzen direkt von mRNA, von cDNA, von Genombibliotheken oder cDNA-Bibliotheken zu vervielfältigen. In die Primer können Restriktionsendonucleasestellen eingebaut werden. Minigene, die durch die PCR-Reaktion vervielfältigt wurden, können in Agarosegelen gereingt werden und in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
  • Synthetische Oligonucleotide können ebenfalls verwendet werden, um Minigene zu konstruieren. Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem eine Reihe überlappender Oligonucleotide, die sowohl den Sense- als auch den Antisense-Strang des Gens repräsentieren, verwendet wird. Diese DNA-Fragmente werden dann hybridisiert, verknüpft und kloniert. Oligonucleotide, die im Handel nicht erhältlich sind, können gemäß dem Festphasen-Phosphoramidit-Triesterverfahren, das erstmals von Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981) beschrieben wurde, unter Verwendung einer automatisierten Synthesevorrichtung chemisch synthetisiert werden, wie von Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984) beschrieben wurde. Die Reinigung der Oligonucleotide erfolgt entweder durch die ursprüngliche Acrylamidgelelektrophorese oder durch Anionenaustausch-HPLC, wie in Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983) beschrieben wurde.
  • Die Epitope des Minigens werden typischerweise in einen Expressionsvektor subkloniert, der einen starken Promotor für die Steuerung der Transkription sowie andere regulatorische Sequenzen, wie Verstärker und Polyadenylierungsstellen enthält. Geeignete Promotoren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden z. B. in Sambrook et al. und Ausubel et al. beschrieben. Eukaryotische Expressionssysteme für Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind im Handel erhältlich. Derartige Promotorelemente schließen beispielsweise das Cytomegalovirus (CMV), das Rous sarcoma-Virus LTR und SV40 ein.
  • Der Expressionsvektor enthält typischerweise eine Transkriptionseinheit oder eine Expressionskassette, die alle zusätzlichen Elemente enthält, die für die Expression des Minigens in Wirtszellen erforderlich sind. Eine typische Expressionskassette enthält demnach einen Promotor, der betriebsfähig mit dem Minigen verknüpft ist, und Signale, die für die effiziente Polyadenylierung des Transkripts erforderlich sind. Zusätzliche Elemente der Kassette können Verstärker und Introns mit funktionellen Spleißdonor- und Spleißakzeptorstellen einschließen kann.
  • Zusätzliche zur Promotorsequenz kann die Expressionskassette auch eine Transkriptionsterminationsregion stromabwärts des Strukturgens enthalten, um für einen effizienten Abbruch zu sorgen. Die Ter minationsregion kann vom gleichen Gen wie die Promotorsequenz erhalten werden, oder sie kann von anderen Genen erhalten werden.
  • Der spezielle Expressionsvektor, der für den Transport der genetischen Information in die Zelle verwendet wird, ist nicht besonders kritisch. Alle herkömmlichen Vektoren, die für die Expression in eukaryotischen Zellen verwendet wird, können verwendet werden. Expressionsvektoren, die regulatorische Elemente von eukaryotischen Viren enthalten, werden typischerweise in eukaryotischen Expressionsvektoren verwendet, z. B. SV40-Vektoren, CMV-Vektoren, Papilloma-Virus-Vektoren und Vektoren, die vom Epstein-Barr-Virus abgeleitet sind.
  • Die Polypeptid-Konstrukte, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, können von einer Vielzahl von Vektoren exprimiert werden, eingeschlossen Plasmidvektoren, virale oder bakterielle Vektoren. Beispiele für virale Expressionsvektoren schließen abgeschwächte virale Wirte, wie Kuhpocken oder Geflügelpocken, ein. Als Beispiel für diesen Ansatz wird das Kuhpockenvirus als Vektor für die Expression von Nucleotidsequenzen verwendet, die die Peptide der Erfindung codieren. Beim Einführen in einen Wirt, der einen Tumor trägt, exprimiert das rekombinante Kuhpockenvirus das immunogene Peptid und löst dadurch eine Wirts-CTL-Antwort und/oder Wirts-HTL-Antwort aus. Kuhpockenvektoren und Verfahren, die in Immunisierungsprotokollen brauchbar sind, werden z. B. in dem US-Patent Nr. 4,722,848 beschrieben.
  • Eine große Vielzahl anderer Vektoren, die für die therapeutische Verabreichung oder Immunisierung brauchbar sind, z. B. Adenovirusvektoren und Adenovirus-assoziierte Vektoren, retrovirale Vektoren, nichtvirale Vektoren, wie BCG (Bacille Calmette Guerin), Salmonella typhi-Vektoren, entgiftete Anthraxtoxin-Vektoren und dergleichen sind dem Fachmann unmittelbar ersichtlich.
  • Die Immunogenität und die Antigenität der Polyepitop-Konstrukte wird wie hier beschrieben beurteilt.
  • Zielsteuerungssequenzen ("Targeting Sequences")
  • Die Expressionsvektoren codieren ein oder mehrere MHC-Epitope, die funktionsfähig mit einer MHC-Zielsteuerungssequenz verknüpft sind. Die Verwendung einer MHC-Zielsteuerungssequenz verstärkt die Immunantwort auf das Antigen, bezogen auf die Wirkung des Antigens allein, indem das Epitop zu der Stelle der MHC-Molekülgruppe dirigiert wird und zu der Zelloberfläche transportiert wird, wodurch eine erhöhte Zahl von MHC-Molekül-Peptidepitop-Komplexen bereitgestellt wird, die für das Binden an und die Aktivierung von T-Zellen verfügbar sind.
  • MHC-Klasse-I-Zielsteuerungssequenzen können verwendet werden, z. B. diejenigen Sequenzen, die ein MHC-Klasse-I-Epitop-Peptid auf einen cytosolischen Weg oder zum endoplasmatischen Retikulum lenken (siehe z. B. Rammensee et al., Immunogenetics 41:178-228 (1995)). Der cytosolische Weg prozessiert zum Beispiel endogene Antigene, die innerhalb der Zelle exprimiert werden. Auch wenn es nicht erwünscht ist, durch eine spezielle Theorie gebunden zu werden, wird angenommen, dass cytosolische Proteine mindestens teilweise durch eine Endopeptidaseaktivität eines Proteasoms abgebaut werden und dann durch das TAP-Molekül (transporter associated with processing) zum endoplasmatischen Retikulum transportiert wird. Im endoplasmatischen Retikulum bindet das Antigen an MHC-Klasse-I-Moleküle. Signalsequenzen des endoplasmatischen Retikulums umgehen den cytosolischen Prozessierungsweg und lenken endogene Antigene di rekt zum endoplasmatischen Retikulum, wo der proteolytische Abbau zu Peptidfragmenten stattfindet. Derartige MHC-Klasse-I-Zielsteuerungssequenzen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und schließen z. B. Signalsequenzen, wie diejenigen von Ig-κ, Gewebe-Plasminogenaktivator oder Insulin, ein. Ein bevorzugtes Signalpeptid ist die humane Ig-κ-Kettensequenz. Signalsequenzen des endoplasmatischen Retikulum können ebenfalls verwendet werden, um MHC-Klasse-II-Epitope zum endoplasmatischen Retikulum zu lenken, der Stelle der MHC-Klasse-I-Molekülgruppe.
  • MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen können ebenfalls verwendet werden, z. B. diejenigen, die ein Peptid auf den endocytischen Weg lenken, was dazu führt, dass das Antigen an das lysosomale Kompartiment abgegeben wird, wo das Antigen proteolytisch in Antigenpeptide gespalten wird, die an MHC-Klasse-II-Moleküle binden. Wie bei der normalen Prozessierung von exogenem Antigen ist eine Sequenz, die ein MHC-Klasse-II-Epitop zu den Endosomen des endocytischen Wegs und/oder anschließend zu den Lysosomen lenkt, wo das MHC-Klasse-II-Epitop an ein MHC-Klasse-II-Molekül binden kann, eine MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenz. Eine Gruppe von MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen, die in der Erfindung brauchbar ist, sind die lysosomalen Zielsteuerungssequenzen, die Polypeptide auf Lysosomen lokalisieren. Da MHC-Klasse-II-Moleküle typischerweise an Antigenpeptide binden, die von der proteolytischen Prozessierung von endocytosierten Antigenen in Lysosomen stammen, kann eine lysosomale Zielsteuerungssequenz die Funktion einer MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenz haben. Lysosomale Zielsteuerungssequenzen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und schließen Sequenzen ein, die in den lysosomalen Proteinen LAMP-1 und LAMP-2 gefunden werden, was von August et al. beschrieben wurde ( US-Patent Nr. 5,633,234 , erteilt am 27. Mai 1997).
  • Andere lysosomale Proteine, die lysosomalen Zielsteuerungssequenzen enthalten, schließen HLA-DM ein. HLA-DM ist ein endosomales/lysosomales Protein, dessen Funktion darin besteht, das Binden von Antigenpeptiden an MHC-Klasse-II-Moleküle zu erleichtern. Da es in den Lysosomen lokalisiert ist, hat HLA-DM eine lysosomale Zielsteuerungssequenz, die die Funktion einer MHC-Klasse-II-Molekül-Zielsteuerungssequenz haben kann (Copier et al., J. Immunol. 157:1017-1027 (1996).
  • Das residente lysosomale Protein HLA-DO kann ebenfalls die Funktion einer lysosomalen Zielsteuerungssequenz haben. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen residenten lysosomalen Proteinen LAMP-1 und HLA-DM, die spezifische Tyr-haltige Motive codieren, die Proteine zu Lysosomen lenken, wird HLA-DO durch die Assoziation mit HLA-DM zu Lysosomen gelenkt (Liljedahl et al., EMBO J. 15:4817-4824 (1996)). Daher können die Sequenzen von HLA-DO, die die Assoziation mit HLA-DM und demzufolge die Translokation von HLA-DO zu Lysosomen verursachen, als MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen verwendet werden. In ähnlicher Weise kann das murine Homolog von HLA-DO, H2-DO, verwendet werden, um eine MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenz zu erzielen. Ein MHC-Klasse-II-Epitop kann mit HLA-DO oder H2-DO vereinigt werden und hin zu den Lysosomen dirigiert werden.
  • In einem anderen Beispiel vermitteln die cyctoplasmatischen Domänen von B-Zell-Rezeptor-Untereinheiten IG-α und IG-β die Internalisierung von Antigenen und erhöhen die Wirksamkeit der Antigenpräsentation (Bonnerot et al., Immunity 3:335-347 (1995)). Daher können die cytoplasmischen Domänen der Ig-α- und Ig-β-Proteine die Funktion von MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen haben, die ein MHC-Klasse-II-Epitop auf den endocytischen Weg für die Prozessierung und Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle lenken.
  • Ein weiteres Beispiel für eine MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenz, die MHC-Klasse-II-Epitope auf den endocytischen Weg lenkt, ist eine Sequenz, die zu sezernierende Polypeptide lenkt, wo das Polypeptid in den endosomalen Weg eintreten kann. Diese MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen, die zu sezernierende Polypeptide lenken, ahmen den normalen Weg nach, auf dem exogene, extrazelluläre Antigene zu Peptiden prozessiert werden, die an MHC-Klasse-II-Moleküle binden. Jede beliebige Signalsequenz, die die Funktion hat, ein Polypeptid durch das endoplasmatische Retikulum zu lenken, das abschließend sezerniert wird, kann die Funktion einer MHC-Klasse-II Zielsteuerungssequenz haben, solange das sezernierte Polypeptid in den endosomalen/lysosomalen Weg eintreten kann und zu Peptiden gespalten werden kann, die an MHC-Klasse-II-Moleküle binden.
  • In einem weiteren Beispiel bindet das Ii-Protein an MHC-Klasse-II-Moleküle im endoplasmatischen Retikulum, wo es die Funktion hat, Peptide, die im endoplasmatischen Retikulum vorhanden sind, daran zu hindern, an MHC-Klasse-II-Moleküle zu binden. Die Verbindung eines MHC-Klasse-II-Epitops mit dem Ii-Protein lenkt daher das MHC-Klasse-II-Epitop zum endoplasmatischen Reticulum und einem MHC-Klasse-II-Molekül. Beispielsweise kann die CLIP-Sequenz des Ii-Proteins entfernt werden und durch eine MHC-Klasse-II-Epitop-Sequenz ersetzt werden, so dass das MHC-Klasse-II-Epitop zum endoplasmatischen Retikulum gelenkt wird, wo das Epitop an ein MHC-Klasse-II-Molekül bindet.
  • In einigen Fällen können Antigene selbst als MHC-Klasse-II- oder MHC-Klasse-I-Zielsteuerungssequenzen dienen, und sie können mit einem universellen MHC-Klasse-II-Epitop verbunden werden, um eine Immunantwort zu stimulieren. Obwohl cytoplasmatische virale Antigene im Allgemeinen als Komplexe mit MHC-Klasse-I-Molekülen pro zessiert und präsentiert werden, können langlebige cytoplasmatische Proteine, wie das Influenzamatrix-Protein, in den MHC-Klasse-II-Molekül-prozessierenden Weg eintreten (Guéguen & Long, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14692-14697 (1996). Daher können langlebige cytoplasmatische Proteine die Funktion einer MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenz haben. Beispielsweise kann ein Expressionsvektor, der das Influenzamatrixprotein codiert, das mit einem universellen MHC-Klasse-II-Epitop verbunden ist, vorteilhaft verwendet werden, um das Influenzantigen und das universelle MHC-Klasse-II-Epitop auf den MHC-Klasse-II-Weg zu lenken, um eine Immunantwort auf die Influenza zu stimulieren.
  • Andere Beispiele für Antigene, die die Funktion von MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen haben, schließen Polypeptide ein, die spontan Partikel bilden. Die Polypeptide werden von der Zelle, die sie erzeugt, sezerniert und bilden spontan Partikel, die durch Endocytose, wie Rezeptor-vermittelte Endocytose, in eine antigenpräsentierende Zelle aufgenommen oder durch Phagozytose aufgenommen werden. Die Partikel werden nach dem Eintreten in den endosomalen/lysosomalen Weg proteolytisch in Antigenpeptide gespalten.
  • Ein derartiges Polypeptid, das spontan Partikel bildet, ist das HBV-Oberflächenantigen (HBV-S) (Diminsky et al., Vaccine 15:637-647 (1997); Le Borgne et al., Virology 240:304-315 (1998). Ein anderes Polypeptid, das spontan Partikel bildet, ist das HBV-Core-Antigen (Kuhröber et al., International Immunol. 9:1203-1212 (1997). Ein weiteres Polypeptid, das spontan Partikel bildet, ist das Hefe-Ty-Protein (Weber et al., Vaccine 13:831-834 (1995)). Beispielsweise kann ein Expressionsvektor, der das HBV-S-Antigen verbinden mit einem universellen MHC-Klasse-II-Epitop enthält, vorteilhaft verwendet werden, um das HBV-S-Antigen und das universelle MHC-Klasse-II-Epitop auf den MHC-Klasse-II-Weg zu lenken, um eine Immunantwort gegen HBV zu stimulieren.
  • In vivo-Verabreichung
  • Es werden Verfahren für die Stimulierung einer Immunantwort durch Verabreichen eines geeigneten Expressionsvektors beim Menschen beschrieben. Die Verabreichung eines Expressionsvektors für die Stimulierung einer Immunantwort ist vorteilhaft, weil die Expressionsvektoren MHC-Epitope zu MHC-Molekülen lenken, wodurch die Zahl der CTL und HTL erhöht wird, die durch die Antigene aktiviert werden, die von dem Expressionsvektor codiert werden.
  • Zu Beginn werden die Expressionsvektoren in der Maus durchgemustert, um die Expressionsvektoren zu ermitteln, die eine optimale Aktivität hinsichtlich der Stimulierung einer gewünschten Immunantwort haben. Erste Studien werden daher, wo möglich, mit Mäusegenen der MHC-Zielsteuerungssequenzen durchgeführt. Verfahren für die Ermittlung der Aktivität der Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und schließen beispielsweise die Aufnahme von 3H-Tymidin zur Messung der T-Zell-Aktivierung und die Freisetzung von 51Cr zur Messung der CTL-Aktivität ein, was weiter unten in den Beispielen II und III beschrieben wird. Experimente, die den Experimenten ähneln, die in Beispiel IV beschrieben werden, werden durchgeführt, um die Expressionsvektoren zu ermitteln, die hinsichtlich der Stimulierung einer Immunantwort eine Aktivität haben. Die Expressionsvektoren, die eine Aktivität haben, werden im Menschen weiter getestet. Um mögliche nachteilige immunologische Antworten auf codierte Maussequenzen zu verhindern, werden die Expressionsvektoren, die eine Aktivität haben, so modifiziert, dass die MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen von menschlichen Genen stammen. Beispielsweise werden Substitutionen der analogen Regionen der huma nen Homologe von Genen, die verschiedene MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen enthalten, in die Expressionsvektoren eingesetzt. Expressionsvektoren, die humane MHC-Klasse-II-Zielsteuerungssequenzen enthalten, wie diejenigen, die im Beispiel I weiter unten beschrieben werden, werden hinsichtlich der Aktivität bei der Stimulierung einer Immunantwort im Menschen getestet.
  • Außerdem werden pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einen geeigneten Expressionsvektor umfassen. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und schließen wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen einschließlich physiologisch gepufferte Kochsalzlösungen, alkoholisch/wässrige Lösungen oder andere Lösemittel oder Vehikel, wie Glycole, Glycerin, Öle, wie Olivenöl, oder injizierbare organische Ester ein.
  • Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger kann physiologisch akzeptable Verbindungen enthalten, deren Wirkung darin besteht, den Expressionsvektor zu stabilisieren oder die Absorption des Expressionsvektors zu erhöhen. Derartige physiologisch akzeptable Verbindungen schließen beispielsweise Kohlenwasserstoffe, wie Glucose, Saccharose oder Dextrane, Antioxidantien, wie Ascorbinsäure oder Glutathion, Chelatbildner, Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht, antimikrobielle Mittel, Inertgase oder andere Stabilisierungsmittel oder Exzipientien ein. Expressionsvektoren können zusätzlich mit anderen Bestandteilen, wie Peptiden, Polypeptiden und Kohlenwasserstoffen komplexiert werden. Exprssionsvektoren können auch mit Partikeln oder Kügelchen komplexiert werden, die einem Menschen verabreicht werden können, beispielsweise unter Verwendung einer Impfpistole. Der Fachmann weiß, dass die Auswahl des pharmazeutisch akzeptablen Trägers, eingeschlossen eine physiologisch akzep table Verbindung, beispielsweise von dem Weg abhängt, auf dem der Expressionsvektor verabreicht wird.
  • Weiterhin werden Verfahren für die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung beschrieben, die einen hier beschriebenen Expressionsvektor enthält, um eine Immunantwort zu stimulieren. Die Expressionsvektoren werden durch Verfahren verabreicht, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, die in Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); Felgner et al. ( US-Patent Nr. 5,580,859 , erteilt am 3. Dezember 1996); Felgner ( US-Patent Nr. 5,703,055 , erteilt am 30. Dezember 1997); und Carson et al. ( US-Patent Nr. 5,679,647 , erteilt am 21. Oktober 1997) beschrieben werden. Das Minigen kann als nackte Nucleinsäure verabreicht werden.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Expressionsvektor enthält, kann für die Stimulierung einer Immunantwort in einem Menschen auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, beispielsweise oral, intravaginal, rektal oder parenteral, wie intravenös, intramuskulär, subkutan, intraorbital, intracapsulär, intraperitoneal, intracisternal, oder durch passive oder erleichterte Absorption durch die Haut unter Verwendung beispielsweise eines Hautpflasters bzw. durch transdermale Iontophorese. Weiterhin kann die Zusammensetzung durch Injektion, Intubieren oder topisch verabreicht werden, wobei letztere Verabreichung passiv sein kann, zum Beispiel durch die direkte Anwendung einer Salbe oder eines Pulvers, oder aktiv sein kann, beispielsweise unter Verwendung eines Nasensprays oder eines Inhalationsmittels. Ein Expressionsvektor kann auch als topisches Spray verabreicht werden, wobei in diesem Fall ein Bestandteil der Zusammensetzung ein geeignetes Treibmittel ist. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch gewünschtenfalls in Liposomen, Mikrokugeln oder andere Polymermatrices eingebracht werden (Felgner et al., US-Patent Nr. 5,703,055 ; Gregoriadis, Liposome Tech nology, Bd. I bis III (2. Auflage 1993). Liposomen zum Beispiel, die aus Phospholipiden oder anderen Lipiden bestehen, sind nicht toxische, physiologisch akzeptable und metabolisierbare Träger, die relativ einfach hergestellt und verabreicht werden können.
  • Die Expressionsvektoren können in die interstitiellen Räume von Geweben eines Tierkörpers abgegeben werden (Felgner et al., US-Patent Nr. 5,580,859 und 5,703,055 ). Die Verabreichung von Expressionsvektoren in den Muskel stellt ein besonders effizientes Verabreichungsverfahren dar, eingeschlossen intradermale und subkutane Injektionen und die transdermale Verabreichung. Die transdermale Verabreichung, wie durch Iontophorese, ist ebenfalls ein effektives Verfahren für die Abgabe der Expressionsvektoren in den Muskel. Die epidermale Verabreichung von Expressionsvektoren kann ebenfalls eingesetzt werden. Die epidermale Verabreichung ist mit der mechanischen oder chemischen Reizung der äußersten Schicht der Epidermis verbunden, um eine Immunantwort auf den reizenden Stoff zu stimulieren (Carson et al., US-Patent Nr. 5,679,647 ).
  • Andere effektive Verfahren für die Verabreichung eines Expressionsvektors der Erfindung für die Stimulierung einer Immunantwort schließen die mucosale Verabreichung (Carson et al., US-Patent Nr. 5,679,647 ) ein. Im Rahmen der mucosalen Verabreichung gehört die intranasale Verabreichung eines geeigneten Aerosols, das den Expressionsvektor und eine pharmazeutische Zusammensetzung enthält, zu den effektivsten Verfahren. Suppositorien und topische Zubereitungen sind ebenfalls effektiv beim Aufbringen der Expressionsvektoren auf Schleimhautgewebe von genitalen, vaginalen und okulären Stellen. Zusätzlich können die Expressionsvektoren mit Partikeln komplexiert werden und mit Hilfe einer Impfpistole verabreicht werden.
  • Die zu verabreichende Dosis hängt vom Verabreichungsverfahren ab und liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 μg bis etwa 200 μg. Die Dosis kann beispielsweise im Bereich von etwa 0,05 μg/kg bis etwa 50 mg/kg und vor allem 0,005-5 mg/kg liegen. Eine wirksame Dosis kann beispielsweise ermittelt werden, indem die Immunantwort nach der Verabreichung eines Expressionsvektors gemessen wird. Beispielsweise kann die Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch für die MHC-Klasse-II-Epitope oder MHC-Klasse-I-Epitope sind, die von dem Expressionsvektor codiert werden, durch Verfahren gemessen werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, eingeschlossen ELISA oder andere immunologische Assays. Zusätzlich kann die Aktivierung von T-Helferzellen oder eine CTL-Antwort durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, gemessen werden, eingeschlossen zum Beispiel die Aufnahme von 3H-Tymidin für die Messung der T-Zellaktivierung und die Freisetzung von 51Cr für die Messung der CTL-Aktivität (siehe Beispiele II und III weiter unten).
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die einen wie hier beschriebenen Expressionsvektor enthalten, können Säugern, vor allem dem Menschen, für prophylaktische oder therapeutische Zwecke verabreicht werden. Beispiele für Krankheiten, die unter Verwendung der Expressionsvekoren behandelt oder verhindert werden können, sind Infektionen mit HBV, HCV, HIV und CMV sowie Prostatakrebs, Nierenkarzinome, Zervikalkarzinome, Lymphome, Condyloma acuminatum und Erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS).
  • In therapeutischen Anwendungen werden die Expressionsvektoren einer Person verabreicht, die bereits an Krebs, einer Autoimmunerkrankung leidet oder die mit einem Virus infiziert ist. Diejenigen in der Inkubationsphase oder der akuten Phase der Krankheit können mit Expressionsvektoren behandelt werden, diejenigen eingeschlossen, die alle universellen MHC-Klasse-II-Epitope exprimieren, soweit angemessen als alleinige Behandlung oder in Verbindung mit anderen Behandlungen.
  • In therapeutischen und prophylaktischen Anwendungen werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die hier beschriebenen Expressionsvektoren enthalten, einem Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um eine effektive Immunantwort auf ein Antigen auszulösen und die Anzeichen oder Symptome einer Krankheit zu verbessern. Die zu verabreichende Menge des Expressionsvektors, die ausreichend ist, um eine therapeutisch wirksame Dosis zu erzielen, hängt von der pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen Expressionsvektor der Erfindung enthält, der Art der Verabreichung, dem Stadium und der Schwere der behandelten Krankheit, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und der Beurteilung des verschreibenden Arztes ab.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, aber nicht der Einschränkung der beanspruchten Erfindung.
  • Die Beispiele 1-9 geben Beispiele für Assays zur Bewertung der Immunogenität und Antigenität von Polyepitop-Konstrukten an.
  • BEISPIEL 1:
  • ANTIGENITÄTS-ASSAYS
  • Peptid-spezifische CTL-Linien mit hoher Affinität können aus Splenocyten von transgenen Mäusen erzeugt werden, die mit DNA, Peptid/IFA oder Lipopeptid einem Priming unterzogen wurden. Kurz gesagt werden Splenocyten von transgenen Mäusen mit 0,1 μg/ml Peptid und LPS-Glasts stimuliert. Zehn Tage nach der ersten Stimulie rung und wöchentlich danach wurden Zellen erneut mit LPS-Glasts stimuliert, gepulst für 1 Stunde mit 0,1 μg/ml Peptid. Die CTL-Linien werden 5 Tage nach der erneuten Stimulierung wie weiter oben beschrieben in einem in situ IFN-γ ELISA untersucht. Alternativ können CTL-Linien, die zum Beispiel von Patienten, die mit dem anvisierten Pathogen infiziert sind, stammen oder die die zum Ziel gesetzte Krankheit, z. B. Krebs, haben, verwendet werden. Spezifische CTL-Linien, die weder von transgenen Mäusen noch von Patienten verfügbar sind, werden aus PBMC gewöhnlicher Spender erzeugt, wobei man sich hierfür auf die Fachkenntnisse auf dem Fachgebiet bezieht.
  • Zielzellen, die in diesen Assays verwendet werden, sind Jurkat- oder .221-Zellen, die mit A2.1/Kb, A11/Kb, A1/Kb oder B7/Kb transfiziert sind für Zelllinien, die von transgenen Mäusen stammen. All diese Zelllinien stehen uns derzeit zur Verfügung (Epimmune Inc., San Diego, CA. Im Fall von humanen CTL-Linien werden .221-Zellen verwendet, die mit dem geeigneten humanen HLA-Allel transfiziert sind. Wir verfügen derzeit über .221-Zellen, die mit A2 und A1 transfiziert sind, und erzeugen mit A11, A24 und B7 transfizierte Zellen. In einer alternativen Ausführungsform, falls es zu unvorhersehbaren Problemen in Bezug auf die Zielzellen kommt, werden LPS-Glasts bzw. EBV-transformierte Linien für murine und humane CTL-Linien verwendet.
  • Für die Untersuchung der Antigenität werden in Reihe verdünnte CTLs mit 105 Zielzellen und verschiedenen Peptidkonzentrationen, die im Bereich von 1 bis 106 μg/ml liegen, inkubiert. CTLs werden zusätzlich mit Zielzellen inkubiert, die mit einem episomalen Vektor transfiziert sind, der ein interessierendes Minigen enthält. Episomale Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Die relative Peptidmenge, die durch das natürliche Prozessieren in den mit dem Minigen transfizierten APS erzeugt wird, wird folgen dermaßen quantifiziert. Die Menge IFN-γ, die durch die CT-Linien bei der Erkennung der transfizierten Zielzellen erzeugt wird, wird aufgezeichnet. Die Menge synthetisches Peptid, die erforderlich ist, um die gleiche Menge IFN-γ zu erzielen, wird von einer Standardkurve interpoliert, die erzeugt wird, wenn die gleiche CTL-Linie parallel mit bekannten Peptidkonzentrationen inkubiert wird.
  • BEISPIEL 2:
  • IMMUNISIERUNG VON MÄUSEN UND ZELLKULTUREN
  • Die Herkunft der HLA-A2.1/Kb [Vitiello et al., J Exp Med, Bd. 173(4):1007-15 (1991)] und A 11/Kb [Alexander et al., J. Immunol, Bd. 159 (10):4753-61 (1997)] transgenen Mäusen, die in dieser Studie verwendet werden, ist beschrieben worden. HLA B7 Kb- und A1/Kb-transgene Mäuse stehen im Haus zur Verfügung (Epimmune Inc., San Diego, CA). HLA DR2-, DR3- und DR4-transgene Mäuse werden von C. David (Mayo Clinic) erhalten. Nicht transgene H-2b-Mäuse werden von den Charles River Laboratories oder anderen kommerziellen Lieferanten erworben. Immunisierungen werden wie zuvor beschrieben durchgeführt [Ishioka et al., J. Immunol., Bd. 162(7):3915-25 (1999)]. Alle Zellen wurden in einem Kulturmedium gezüchtet, das aus RPMI 1640-Medium mit HEPES (Gibco Life Technologies) ergänzt durch 10 % fetales Kälberserum, 4 mM L-Gutamin, 50 μM 2-ME, 0,5 mM Natriumpyruvat, 100 μg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin, besteht.
  • HLA-transgene Mäuse und und Antigenitätsassays werden für den Zweck der Prüfung und Optimierung von CTL-Antworten verwendet. Die natürliche Kreuzreaktivität zwischen HLA-DR und IAb kann ebenfalls ausgenutzt werden, um HTL-Antworten zu prüfen. Diese Auswertung ermöglicht die Beurteilung der Antigenität und Immunogenität von Polyepitop-Konstrukten.
  • BEISPIEL 3:
  • VERMEHRUNGSASSAYS
  • Für die Beurteilung der Fähigkeit von HTL-Epitopen, eine Immunantwort zu induzieren, werden häufig Assays wie Proliferationsassays durchgeführt. Beispielsweise werden CD4-T-Lymphocyten der Maus aus Milzeinzelzellsuspensionen unter Verwendung von DynaBeads Mouse CD4 (L3T4) (Dynaml) immunomagnetisch isoliert. Kurz gesagt werden 2 × 107 Milzzellen mit 5,6 × 107 Magnetkügelchen 40 min bei 4 °C inkubiert und dann dreimal gewaschen. Die magnetischen Kügelchen werden unter Verwendung von DetachaBead Mouse CD4 (Dynal) abgelöst. Isolierte CD4-T-Lymphocyten (2 × 105 Zellen/Vertiefung) werden mit 5 × 105 bestrahlten (3500 rad) syngenetischen Milzzellen in dreifacher Ausfertigung in 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten mit Flachboden kultiviert. Gereinigte Peptide werden in einer Endkonzentration von 20, 1, 0,05 und 0 μg/ml in die Vertiefungen gegeben, und die Zellen werden insgesamt 4 Tage kultiviert. Etwa 14 h vor der Ernte wird 1 μCi 3H-Thymidin (ICN) in jede Vertiefung gegeben. Die Vertiefungen werden auf Unifilter-GF/B-Platten (Packard) unter Verwendung des Filtermate Harvester (Packard) geerntet. Der 3H-Thymidin-Einbau wird durch Flüssigkeitsszintillationszählung unter Verwendung eines TopCountTM Mikroplatten-Szintillationszählers (Packard) ermittelt.
  • BEISPIEL 4:
  • 51Chrom-Freisetzungsassay
  • Dieser Assay für die Messung der CTL-Aktivität ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Der Assay quantifiziert die lytische Aktivität der T-Zellpopulation durch Messung der prozentualen Menge an 51Cr, die von einer 51Cr-markierten Zielzellpopulation freigesetzt wird [Brunner et al., Immunology, Bd. 14(2):181-96 (1968)]. Daten, die aus dem Chrom-Freisetzungsassay abgeleitet werden, werden üblicherweise entweder als CTL-Häufigkeit/106 Zellen [Limiting dilution analysis, LDA; [Current Protocols in Immunology, Bd. 1, John Wiley & Sons, Inc., USA 1991 Kapitel 3; Manual of Clinical Laboratory Immunology, Fünfte Auflage, ASM Press, 1997 Abschnitt R] oder durch die weniger mühsame quantitative Bewertung der Volumen-CTL-Aktivität [lytic Units; LU-Assay] ausgedrückt. In einem LU-Assay werden die StandardE:T-Verhältnis/prozentuale Cytotoxizitäts-Datenkurven, die in einem 51 Cr-Freisetzungsassay erzeugt werden, in lytische Einheiten (LU) pro 106 Effektorzellen umgewandelt, wobei 1 LU als die lytische Aktivität definiert ist, die erforderlich ist, um eine 30%ige Lyse der Zielzellen zu erreichen [Wunderlick, J., Shearer, G., und Livingston, A. In: J. Coligan, A. Kruisbeek, D. Margulies, E. Shevach und W. Strober (Hrsg.), Current Protocols in Immunology, Bd. 1, "Assays for T cell function: induction and measurement of cytotoxic T lympocyte activity." John Wiley & Sons, Inc., USA, S. 3.11.18]. Die LU-Berechnung erlaubt die Quantifizierung der Antworten und demnach den einfachen Vergleich verschiedener experimenteller Daten.
  • BEISPIEL 5:
  • IN SITU IFN-γ-ELISA
  • Ein in situ-IFN-γ-ELISA-Assay ist entwickelt und optimiert worden sowohl für frisch isolierte als auch für erneut peptidstimulierte Splenocyten (siehe z. B. McKinney, D.M., Skvoretz, R., Mingsheng, Q., Ishioka, G., Sette, A. Characterization Of An In Situ IFN-γ ELISA Assay Which is Able to Detect Specific Peptide Responses From Freshly Isolated Splenocytes Induced by DNA Minigene Immunization, im Druck). Dieser Assay basiert auf dem ELISPOT-Assay, verwendet aber ein lösliches Chromagen, was den Assay einfach anpassbar ein eine Analyse mit hohem Durchsatz macht. Sowohl in den primären Assays als auch in den Assays mit erneuter Stimulierung ist diese Technik insoweit empfindlicher als ein herkömmlicher ELISA mit Überstand oder der 51Cr-Freisetzungsassay als in dem in situ ELISA Antworten beobachtet werden, die in diesen anderen Assays nicht nachweisbar sind. Bezogen auf eine Zelle ist die Empfindlichkeit des in situ-ELISA etwa eine IFN-γ-sezernierende Zelle/104 plattierte Zellen.
  • ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen werden über Nacht bei 4 °C mit anti-IFN-γ (Ratte-anti-Maus IFN-α mAB, Klon R4-6A2, Pharmingen) beschichtet und dann 2 h bei Raumtemperatur mit 10 % fetalem Kälberserum in PBS blockiert. Die in Reihe verdünnten primären Splenocyten oder CTLs werden 20 h mit Peptid und 105 Jurkat A2.1/Kb-Zellen/Vertiefung bei 37 °C mit 5 % CO2 kultiviert. Am folgenden Tag werden die Zellen herausausgewaschen, und die Menge IFN-γ, die in die Vertiefungen sezerniert wurde, wird in einem Sandwich-ELISA unter Verwendung von biotinyliertem α-IFN-γ nachgewiesen (Ratte anti-Maus IFN-γ mAb, Klon XMG1.2, Pharmingen), um sezerniertes IFN-γ nachzuweisen. HRP-gekoppeltes Streptavidin (Zymed) und TMB (ImmunoPure® TMB Substrate Kit, Pierce) werden gemäß der Gebrauchsanleitung des Herstellers für die Farbentwicklung verwendet. Die optische Dichte wird bei 450 nm in einem Labsystems Multiskan RC ELISA Plattenleser abgelesen. In situ-IFN-γ ELISA-Daten werden in sekretorischen Einheiten (SU) ermittelt, bezogen auf die Zahl der Zellen, die 100 pg IFN-γ sezernieren als Antwort auf ein spezielles Peptid, korrigiert um die Hintergrundmenge IFN in Abwesenheit des Peptids.
  • BEISPIEL 6:
  • ELISPOT-ASSAY
  • Der ELISPOT-Assay quantifiziert die Häufigkeit von T-Zellen, die spezifisch für ein gegebenes Peptid sind, indem die Fähigkeit individueller Zellen gemessen wird, für die Erzeugung und Freisetzung spezifischer Lymphokine, üblicherweise IFN-γ, induziert zu werden. Die erhöhte Empfindlichkeit des ELISPOT-Assays hat es den Forschern erlaubt, Antworten von Zellen nachzuweisen, die von infizierten Menschen oder Labortieren frisch isoliert wurden [Murali-Krishna et al., Immunity, Bd. 8(2):177-87(1998); Ogg et al., Science, Bd. 279(5359): 2103-6 (1998)]. Die ELISPOT-Assays werden wie oben für den IFN-γ-ELISA bis zu den abschließenden Schritten durchgeführt, in denen ExtrAvidin-AP (Sigma, 1:500-Verdünnung) anstelle von HRP-Streptavidin verwendet wird. Die Farbe wird gemäß der Gebrauchsanleitung des Herstellers unter Verwendung des Substrats 5-BCIP (Bio-Rad) entwickelt. Die Spots werden unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops gezählt. Alternativ werden die Spots unter Verwendung des Zeiss KS ELISPOT-Lesegeräts gezählt. In diesem Fall wird das BCIP/NBT-Substrat verwendet.
  • Der ELISPOT-Assay wird routinemäßig verwendet, um Immunantworten zu quantifizieren. Die Spots können manuell gezählt werden, in einer bevorzugten Ausführungsform wird jedoch ein KS ELISPOT-Lesegerät von Zeiss, ein System auf Mikroskopbasis mit Softwäre, die spezifisch für die Erkennung und Zählung der Spots entwickelt wurde, verwendet.
  • BEISPIEL 7:
  • TETRAMER-FÄRBUNG
  • Die Tetramer-Färbung ist eine Durchflusscytometrie-Technik, die Epitop-spezifische humane CD8+-T-Lymphocyten auf der Basis der Wechselwirkung zwischen Peptidepitop, Klasse-I-Antigen und dem T-Zell-Rezeptor, der spezifisch für das Epitop ist, nachweist. Dieser Assay erlaubt die schnelle Quantifizierung der Epitop-spezifischen humanten CD8+-T-Lymphocyten in frisch isolierten Blutproben. MHC-Tetramere für verschiedene HIV-Peptid/HLA-Kombinationen werden z. B. vom NIH-Depot erhalten (Tetramer Core Facility: htpp//www.miaid.nih.gov/reposit/tetramer/index.htlm). Für die Markierung Epitop-spezifischer Zellen werden 1 × 106 PBMC in einem 100 μl Volumen 40 min um Dunkeln mit 5 μg/ml des geeigneten Tetramers plus monoklonalen Antikörpern, die humanes CD3 und CD8 (verfügbar in verschiedenen Fluorochrom-konjugierten Formen aus kommerziellen Quellen einschließlich PharMingen, San Diego, CA oder BioSource, Camarillo, CA) erkennen, inkubiert. Die Zellen werden gewaschen und mit Paraformaldehyd fixiert vor der Analyse unter Verwendung eines FACsan- oder FACSCalibur-Durchflusscytometers (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Die Probendaten werden unter Verwendung der CellQuest-Software analysiert.
  • BEISPIEL 8:
  • ASSAYS VON KLINISCHEN PROBEN
  • Verschiedene Assays für die Beurteilung der spezifischen CD8+-CTL-Aktivität in gefrorenen PBMC-Proben von Patienten oder Freiwilligen können verwendet werden. ELISPOT-, Chromfreisetzungs-, in situ IFN-γ-Freisetzungs-, Proliferations- und Tetramerassays sind allesamt brauchbar für die Beurteilung der Antworten von verschiedenen ex perimentellen Modellen, z. B. denjenigen von muriner Herkunft und/oder von Primaten.
  • Experimentelle Verfahren für die murine Version dieser Assays werden oben beschrieben, und diese sind wie beschrieben an humane Systeme angepasst [Livingston et al., J Immunol, Bd. 159(3):1383-92 (1997); Heathcote et al., Hepatology, Bd. 30(2):531-6 (1999); Livingston et al., J Immunol, Bd. 162(5):3088-95 (1999)] und können weiter angepasst werden, was dem Durchschnittsfachmann unmittelbar ersichtlich ist. Berechnungen zu den Mengen gefrorener PBMC-Proben, die für die Komplettierung des Assays erforderlich sind, werden detaillierter in Beispiel 14 beschrieben.
  • BEISPIEL 9
  • TRANSGENE TIERE
  • Transgene Mäuse (HLA-A2.1/KbH2b; HLA-A 11/Kb; HLA-A11/Kb, HLA-B7/Kb) werden intramuskulär in den vorderen Tibialis-Muskel oder subkutan in die Basis des Schwanzes mit Dosen von bis zu 100 μg DNA oder Peptid in 10-100 μl Volumina immunisiert. DNA wird in Kochsalzlösung formuliert, und Peptide werden in inkomplettem Freunds Adjunvans formuliert. 11 bis 21 Tage später werden die Tiere durch Ersticken mit CO2 getötet, ihre Milz wird entnommen und als Quelle für Zellen für die in vitro-Bestimmung der CTL-Funktion verwendet. Typischerweise werden 3 bis 6 Mäuse pro experimenteller Gruppe verwendet. Zusätzlich wird die Milz von nicht immunisierten Mäusen als APC-Quelle für die erneute Stimulierung von CTL-Kulturen verwendet. Sowohl männliche als auch weibliche Tiere mit einem Alter von 8 bis 12 Wochen werden verwendet.
  • BEISPIEL 10:
  • VERANSCHAULICHUNG DER GLEICHZEITIGEN INDUKTION VON ANTWORTEN GEGEN MEHRERE CTL- UND HTL-EPITOPE
  • Konstruktion und Testen von CTL-Epitop-Ketten:
  • Dieses Beispiel liefert ein Beispiel für das Testen von mehreren CTL- und HTL-Epitopen. Es werden beispielsweise Epitopketten, die 10 bis 12 verschiedene CTL-Epitope unter der Kontrolle eines einzigen Promoters umfassen, synthetisiert und in ein Standard-Plasmid, pcDNA 3.1 (Invitron, San Diego) oder ein Plasmid vom NGVL (National Gene Vector Laboratory, University of Michigan) eingebracht. Diese Konstrukte umfassen eine Standardsignalsequenz und ein universelles HTL-Epitop, PADRETM. Jeder Satz von Epitopen wird so ausgewählt, dass eine ausgewogene Populationsabdeckung möglich ist. Um das Testen und Optimieren zu erleichtern, ist eine ausgewogene Beteiligung von Epitopen, für die gezeigt wurde, dass sie in transgenen Mäusen immunogen sind und/oder in Menschen antigen wirken, eingeschlossen.
  • Die genaue Reihenfolge dieser CTL-Epitope wird wie hier beschrieben so gewählt, dass Klasse-I-Verknüpfungsmotive minimiert werden, wofür wie hier beschriebe das Computerprogramm EPISORTTM verwendet wird. Falls trotz größter Anstrengungen bezüglich der Optimierung der Reihenfolge potentielle Verknüpfungsepitope immer noch in einem Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung vorhanden sind, werden entsprechende Peptide synthetisiert, um CTL-Antworten gegen derartige Epitope in HLA-tansgenen Mäusen zu beobachten. Im Allgemeinen ist die Minimierung von Verknüpfungsepitopen erfolgreich und ausreichend. Falls jedoch Antworten gegen Verknüpfungsepitope nachgewiesen werden, werden diese Verknüpfungsepitope durch die Verwendung kurzer Abstandshalter aus ein oder zwei Res ten, wie K, AK, KA, KK oder A, unterbrochen, die wie in den vorherigen Abschnitten besprochen mit erwarteten Präferenzen für die proteolytische Spaltung kompatibel sind.
  • Da die endgültige Verwendung optimierter Konstrukte ein Vakzin für den Menschen ist, werden optimierte humane Codons verwendet. Um jedoch den Optimierungsprozess in HLA-transgenen Mäusen zu vereinfachen, werden, wo immer möglich, mit Sorgfalt humane Codons ausgewählt, die auch für Mäuse optimal sind. Die Verwendung von humanen und murinen Codons ist sehr ähnlich (Datenbank für die Verwendung von Codons unter http://www.kazusa.or.jp/codon/).
  • Humane Zellen, die mit den verschiedenen Minigen-Vakzinkonstrukten transfiziert sind, können in Antigenitätsassays verwendet werden, die parallel zu einem in vivo-Testen in HLA-transgenen Mäusen durchgeführt werden. Alle potentiellen Unterschiede in der Wirksamkeit von Minigenvakzinen durch die Verwendung von unterschiedlichen Codons wird durch die Verfügbarkeit dieser beiden verschiedenen Assaysysteme berücksichtigt.
  • Typischerweise wird das Testen der Antigenität und der Immunogenität der Plasmidkonstrukte parallel durchgeführt. Das in vivo-Testen transgener Mäuse wird mit A2-, A11-, B7- und A1-HLA-transgenen Mäusen durchgeführt. Nach einem in unserem Labor gut etablierten Protokoll werden mit Cardiotoxin vorbehandelten Mäusen 100 μg jedes Plasmids i.m. injiziert, und die Antworten werden elf Tage später ausgewertet [Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)]. Die Assays schließen den ELISPOT von frisch isolierten Zellen sowie einen Interferon-γ-Freisetzungs- und Cytotoxizitäts-Chromfreisetzungsassay von erneut stimulierten Zellen ein. Alle oben erwähnte Techniken sind auf dem Fachgebiet gut etabliert. Beim anfänglichen Testen wird auf die 8 HLA A2, 9 HLA All und 6 HLA B7 restringierte Epitope fokussiert, für die die Immunogenität in HLA-transgenen Mäusen bereits gut gezeigt worden ist. Die gleichzeitige Messung der Antworten gegen diese Epitope ist nicht problematisch, da große Kolonien transgener Mäuse für diese HLA-Typen bereits "im Haus" etabliert sind. Gruppen von vier bis sechs Mäusen sind passend für die Messung der Antworten gegen sechs bis zehn verschiedene Epitope in mehrfachen Ausleseassays. Das Testen der HLA A1-restringierten, von HIV abgeleiteten Epitope in HLA A1-transgenen Mäusen wird typischerweise eingesetzt. Wenn man jedoch auf Probleme treffen sollte, kann das Testen der Antigenität unter Verwendung humaner APC als eine alternative Strategie verwendet werden oder kann verwendet werden, um die Studien an transgenen Mäusen zu ergänzen.
  • Für den Zweck der Ausdehnung der Korrelation zwischen der Immunogenität in transgenen Tieren und der Antigenität wird, wie in den hier beschriebenen Studien angemerkt, das Testen der Antigenität verwendet, um die Antworten gegen Epitope wie Pol 498, Env 134, Nef 221, Gag 271 auszuwerten, für die CTL-Linien mit hoher Affinität im Haus verfügbar sind. Für den Zweck der Erzeugung zusätzlicher geeigneter CTL-Linien wird die direkte Immunisierung von HLA-transgenen Mäusen mit Peptiden, die in einem Hilfsstoff emulgiert sind, oder mit Lipopeptiden verwendet, wie dies hier beschrieben wird, und routinemäßig in unserem Labor angewendet, um Linien zur Verwendung in Antigenitätsassays zu erzeugen.
  • Antigenitätsassays werden auch als eine erste Anzeige für Epitope verwendet, für die in vivo-Optimierungsexperimente nicht realisierbar sind. Diese Epitope schließen A24- und möglicherweise A1-restringierte Epitope ein, wie auch alle Epitope, die in HLA-transgenen Mäusen nicht immunogen sind. In jedem dieser Fälle verwenden wir humane CTL-Linien, die von HIV-infizierten Menschen erzeugt werden. Alternativ erzeugen wird CTL-Linien für die in vitro-CTL-Induk tion unter Verendung von GMCSF/IL4-induzierten dendritischen Zellen und peripheren Blutlymphocyten [Celis et al., Proc Natl Acad Sci USA, Bd. 91(6):2105-9 (1994)].
  • Episomale Vektoren, die die Minigene codieren, werden erzeugt und in geeignete humane Zelllinien transfiziert, um Zielzellen zu erzeugen. Es kann beispielsweise die humane T-Zelllinie Jurkat verwendet werden, Lymphoblastoidzelllinien sind aber ebenfalls erfolgreich verwendet worden. Für Experimente, bei denen CTL-Linien humaner Herkunft verwendet werden, werden üblicherweise gut charakterisierte HLA-angepasste, homozygote EBV-Zelllinien als Quelle für gereinigtes MHC und als Zielzellen verwendet, und sie werden als Empfänger der Minigen-Transfektionen verwendet. Für Experimente, bei denen CTL-Linien verwendet werden, die von HLA-transgenen Mäusen stammen wird eine Sammlung Klasse-I-negativer, EBV-transformierter Mutantenzellinien .221 verwendet [Shimizu Y, DeMars R., J Immunol, Bd. 142(9):3320-8 (1989), die mit angepassten HLA/Kb chimären Konstrukten transfiziert sind, als Empfänger der Minigen-Transfektionen verwendet. Derartige Zellen präsentieren den CTL-Linien effizient Peptid-Antigene [Celis et al., Proc Natl Acad Sci USA, Bd.91(6):2105-9 (1994)].
  • Konstruktion und Testen von HTL-Epitop-Ketten:
  • Epitop-Ketten, die 3 bis 5 verschiedene HTL-Epitope unter der Kontrolle eines einzigen Promotors umfassen, werden synthetisiert und in ein Standardplasmid, pcDNA 3.1 (Invitrogen, San Diego), eingeführt. Alle Konstrukte schließen eine Ig-α-Zielsetzungssequenz ein. Zum Vereinfachen des Testens und der Optimierung wird jeder Satz von Epitopen für ein gegebenes Minigen so ausgewählt, dass eine ausgewogenen Repräsentation von Epitopen, von denen man bereits weiß, dass sie in IAb-Mäusen immunogen sind, bereitgestellt wird. Die Rei henfolge der Epitope wird unter Verwendung des EPISORT-Programms so gewählt, dass das Vorhandensein von Verknüpfungsepitopen minimiert ist. Zusätzlich werden alle Peptide, die Verknüpfungen entsprechen, synthetisiert und hinsichtlich ihres Bindens an IAb und wichtiger hinsichtlich des Bindens an ein Panel von vierzehn verschiedenen DR-Molekülen, die für die üblichsten DR-Allele weltweit repräsentativ sind [Southwood et al., J Immunol, Bd. 160(7): 3363-73 (1998)], getestet. HTL-Epitope, die nicht gegen ein interessierendes Antigen gerichtet sind, werden demnach in diesen Plasmiden nicht erzeugt. Sollten jedoch Verknüpfungsregionen mit gutem DR-Bindungspotential (und demnach potentieller DR-restrinierter Immunogenität in vivo) nachgewiesen werden, wird ein Abstandshalter, wie GPGPG eingeführt, um sie zu beseitigen. In allen Konstrukten wird die Zahl der Klasse-I-Verknüpfungsmotive wie hier beschrieben minimiert.
  • Experimentelle Vakzinplasmide werden unter Verwendung von HLA-DR-transgenen Mäusen und/oder Mäusen des H2b-Haplotyps auf ihre Immunogenität getestet. Die Proliferation und/oder Cytokinerzeugung werden gemessen (IL5, IFN-γ). In einem typischen Protokoll werden Cardiotoxin-behandelten Mäusen 100 μg jedes Plasmids i.m. injiziert, und die Antworten werden elf Tage später ausgewertet [Ishioka et al., J Immunol, Bd. 162(7):3915-25 (1999)]
  • Testen der Wechselwirkungen zwischen CTL- und HTL-Epitopen
  • Die oben beschriebenen Aktivitäten liefern kleine, funktionelle Blöcke von Epitopen, die verwendet werden, um die gleichzeitigen Antworten/die Antigenität gegen alle analysierbaren Epitope zeigen. Diese Blöcke sind der Gegenstand einer weiteren Optimierung, was im nächsten Beispiel beschrieben wird. Unter Verwendung dieser gleichen Minigene wird die Immundominanz beurteilt. Spezifisch werden alle CTL-Plasmide zusammengemischt, oder alle HTL-Plasmide werden zusammengemischt. Die mit dem Minigenpool erhaltenen Ergebnisse werden dann mit den Ergebnissen verglichen, die mit dem gleichen Minigen erhalten werden, das separat injiziert wird.
  • Diese Minigenplasmide werden auch verwendet, um die Auswirkungen von HTL-Epitopen auf die Antworten auf CTL-Epitope zu ermitteln. Spezifisch werden HTL- und CTL-haltige Plasmide zu einem Pool zusammengefasst und Mäusen injiziert, und CTL- und HTL-Antworten auf ausgewählte Epitope werden wie hier beschrieben gemessen. Es wird oft untersucht, ob das Vorhandensein z. B. von HTL-Epitopen, die vom Zielantigen abgeleitet sind, CTL-Antworten über das Ausmaß der Antwort verstärkt, das bei Verwendung eines Plasmids, das ein pan DR-Bindungsepitop, z. B. PADRETM, oder ein Molekül aus der PADRE-Familie enthält, in dem CTL-Minigen erhalten wird. Typischerweise wird auch untersucht, ob PADRE Antworten auf Zielantigen-abgeleitete HTL-Epitope hemmt oder verstärkt oder umgekehrt ob HTL-Epitope, die von dem interessierenden Antigen abgeleitet sind, Antworten auf PADRE hemmen oder verstärken.
  • Antworten auf eine große Zahl von Epitopen sind erreichbar, wenn diese Methodik angewendet wird. Es ist möglich, dass die Bildung eines Pools der Konstrukte Antworten gegen einige der schwächeren Epitope hemmen kann. In diesem Fall werden die Poolbildungsexperimente nach einer Optimierung wiederholt.
  • BEISPIEL 11:
  • OPTIMIERUNG VON CTL- UND HTL-MINIGENKONSTRUKTEN
  • Dieses Beispiel beschreibt die Optimierung der CTL- und HTL-Konstrukte, die in Beispiel 10 beschrieben werden. Der potentielle Einfluss flankierender Reste auf die Antigenität und Immunogenität wird ebenfalls bei der Optimierung von Minigenkonstrukten untersucht. Diese Studien betreffen den Einschluss flankierender Reste, wofür "Abstandshalter" ein Synonym ist, die entworfen worden sind, um die effiziente Prozessierung zu vereinfachen.
  • Eine derartige Analyse kann wie folgt durchgeführt werden. Zunächst werden die Ergebnisse der Tests der CTL-Multiepitop-Konstrukte, die in Beispiel 10 beschrieben werden, hinsichtlich Trends und Korrelationen zwischen der Aktivität und dem Vorhandensein spezieller Reste bei den 3 Resten, die den N- und den C-Terminus des Epitops flankieren, analysiert. Epitope, für die ein suboptimales CTL-Priming festgestellt wird, die hinsichtlich der Stärke der Antwort suboptimal sind, sind die Ziele für die Optimierung der flankierenden Region. Für jedes CTL-Minigenvakzin, das 10 bis 12 verschiedene CTL-Epitope codiert, werden Minigenvakzine der "zweiten Generation" mit optimierter Konfiguration erzeugt.
  • Die erste Ausführung der Optimierung besteht darin, entweder einen Alanin- (A) oder einen Lysinrest (K) in der C+1-Position bei allen Epitope, die mit einer suboptimalen Leistungsfähigkeit in Verbindung gebracht werden, einzuführen. Eine zweite Ausführung der Optimierung besteht darin, in der C+1-Position den Rest einzuführen, der in dem Zielantigen, z. B. HIV, natürlich vorkommt, der mit Antigenität assoziiert wird.
  • Bei ausgewählten Epitopen werden zusätzliche Veränderungen eingeführt. Genauer werden auch die Auswirkungen des Einführens anderer Abstandshalter aus Resten am C- und-N-Terminus des Epitops untersucht. In Abhängigkeit von den Ergebnissen der Analyse der Minigen-Vakzine, die in Beispiel 10 beschrieben werden, können die Reste, die untersucht werden, weiterhin zum Beispiel G, Q, W, S und T einschließen. Falls durch diese Veränderungen Verknüpfungsepi tope erzeugt werden, werden wie hier beschrieben alternative Epitop-Reihenfolgen, durch die die Verknüpfungsepitope beseitigt werden, rationell entwickelt. Alle Konstrukte der zweiten Generation werden wie hier beschrieben hinsichtlich der Antigenität und der Immunogenität getestet.
  • Als ein Ergebnis dieser Veränderungen werden Aktivitätsänderungen, die mit den spezifischen Veränderungen der Minigene zusammenhängen, nachgewiesen. Bestimmte Veränderungen werden gefunden, die allgemeine günstige Auswirkungen haben. Um dies zu bestätigen, werden zusätzliche Minigenvakzine erzeugt und getestet, in denen alle Epitope (auch diejenigen, die eine akzeptable Antigenität und Immunogenität zeigten) der gleichen Veränderung unterzogen werden. In einigen Fällen wird für einige Epitope eine erhöhte Aktivität festgestellt, jedoch nicht für andere Epitope, oder weniger wünschenswert wird festgestellt, dass bestimmte Veränderungen die Aktivität von einigen Epitopen erhöhen, aber die Aktivität von anderen Epitopen senken. In derartigen Fällen werden zusätzliche Minigenvakzine entworfen und getestet, um die günstigen Veränderungen beizubehalten, während die Abwandlungen, für die nachgewiesen wurde, dass sie nachteilig sind oder keinen Effekt haben, ausgeschlossen werden.
  • Diese Minigenvakzine werden so gestaltet, dass a) ein Minimum vorhergesagter Verknüpfungsepitope vorhanden ist; und b) die Epitope, die in den vorherigen Minigenvakzinen nicht funktionsfähig waren, nun in einem neuen, effizienteren Zusammenhang stehen.
  • Für HTL-Minigenvakzine werden die Daten, die von Minigenvakzinen der "ersten Generation" erhalten werden, ausgewertet in Bezug auf Trends hinsichtlich Verknüpfungsepitopen und Epitop-Positionen innerhalb des Minigens und die Nähe zu Abstandshaltern, z. B. zum GPGPC-Abstandshalter. Falls besondere Trends nachgewiesen wer den, werden Minigenvakzine der zweiten Generation auf der Basis dieser Trends entwickelt. Alternativ wird im Fall von Minigenen, die eine suboptimale Aktivität liefern, die mögliche Effektivität anderer Zielsteuerungsstrategien, wie die jenigen, die auf Ii und LAMP basieren, erneut bewertet und mit einer fehlenden Zielsteuerung und einfacher Anfangssequenz-Zielsteuerung verglichen.
  • Wenn große Veränderungen der Aktivität entweder der CTL- oder der HTL-Minigenvakzine, die in diesem Abschnitt beschrieben werden, nachgewiesen werden, sind die Ergebnisse konsistent mit Einflüssen wie konformativen Effekten oder "langreichweitigen" Effekten, die sich auf die Aktivität von Minigenen auswirken. Diese Variablen können mit Hilfe von aktuellen Techniken der Molekularbiologie und Zellbiologie analysiert werden. Es könnten beispielsweise Zelllinien, die mit den verschiedenen Minigenen transfiziert sind, hinsichtlich des Ausmaßes der mRNA-Expression und der Stabilität durch Northern-Analyse oder Primerextensionsassays analysiert werden [Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 3, John Wiley & Sons, Inc. USA 1999].
  • In alle Minigenvakzinen kann ein Antikörper-Tag, wie MYC/his, eingeführt werden. Dieser Tag ermöglicht das Testen des Ausmaßes der Proteinexpression. Der Einbau des MYC/his-Tags [Manstein et al., Gene, Bd. 162(1): 129:34 (1995)] erlaubt außerdem die Ermittlung der Stabilität der exprimierten Produkte durch "Pulse-Chase"-Experimente. Die Ergebnisse dieser Assays können dann mit den Ergebnissen der Experimente zur Antigenität und Immunogenität verglichen werden. Die Ergebnisse werden in Bezug auf das Vorhandensein von Trends und allgemeiner Regeln und eine Korrelation zwischen den verschiedenen untersuchten Variablen überprüft.
  • BEISPIEL 12
  • ERMITTLUNG DER EINFACHSTEN PLASMIDKONFIGURATION, DIE ZUR EFFEKTIVEN BEREITSTELLUNG AUSGEWÄHLTER EPITOPE IMSTANDE IST.
  • Die in den Beispielen 11 und 12 beschriebenen Experimente sind so konzipiert worden, dass Variable behandelt werden, die die Entwicklung von Minigenvakzinen betreffen. Idealerweise wird in dem ganzen Programm ein Vektor verwendet, der in Menschen verwendet werden kann, aber für die Studien zur Optimierung der Vakzinepitope kann ein DNA-Vakzinplasmid verwendet werden, wonach zu einem Vektor gewechselt wird, der für die Verwendung beim Menschen geeignet ist. Die tatsächliche Auswahl des Vektors hängt von verschiedenen Variablen ab. Beispielsweise stellt die Verfügbarkeit von Vektoren, die für die Verwendung beim Menschen geeignet sind, durch eine zuverlässige Quelle, wie das National Gene Vector Laboratory (University of Michigan), einen Faktor dar.
  • In diesem Beispiel werden die optimierten Minigene auch verknüpft, um größere Blöcke von Epitopen zu bilden. Alle Konstrukte sind vorzugsweise so gestaltet, dass sie im Fall von CTL-Minigenen PADRE und eine Anfangssequenz-Zielsteuerung bzw. Ig-α im Fall von HTL-Epitop-Minigenen enthalten. Speziell werden zwei Paare der 10-12-CTL-Epitop-Minigene verknüpft, um zwei 20-24-CTL-Epitop-Minigene zu erzeugen. In einer Situation, in der die Ligation von Epitopen eine suboptimale (verringerte) Aktivität liefert, verglichen mit den kleineren Minigenen, werden andere Kombinationen und Anordnungen bei der Ligation untersucht. Wegen der relativ großen Größe dieses Konstrukts werden die speziellen Effekt von Zielsteuerungssequenzen bestätigt, da es möglich ist, dass die Anfangssequenz-Zielsteuerung bei Minigenen von kleiner Größe effektiver ist, während Konstrukte mit einer größeren Größe am effektivsten durch Ubiquitin-Signale ad ressiert werden können. Spezifisch wird ein Konstrukt ohne eine spezifische Zielsteuerungssequenz erzeugt und mit einem Konstrukt verglichen, das für den Abbau durch die Zugabe eines Ubiquitin-Moleküls adressiert ist.
  • Eine ähnliche Strategie wird für HTL verwendet. Zwei Paare von Minigenen aus 3-5-HTL-Epitopen werden unter Erzeugung von zwei Minigenen aus 7-9 HTL-Epitopen ligiert. Wiederum werden in einer Situation, in der die Ligation dieser Epitope eine suboptimale (verringerte) Aktivität liefert, alternative Kombinationen und Anordnungen der Ligation untersucht. Das spezifische Paar von Minigenen aus 7-9-HTL-Epitopen, die eine optimale Aktivität liefern, wird ligiert, und das resultierende Minigen, das alle HTL-Epitope umfasst, wird hinsichtlich seiner Aktivität untersucht. Wiederum werden bis zu zwei alternative Orientierungen untersucht.
  • Auf der Basis dieser Ergebnisse wird eine optimierte Plasmidkonfiguration, die zu einer effektiven Bereitstellung eines Panels z.B. von HIV-Epitopen imstande ist, für die Untersuchung in klinischen Versuchen ausgewählt. Selbstverständlich können Epitope von jedem beliebigen interessierenden Gen (infektiös oder mit der Krankheit zusammenhängend) allein oder in Kombination verwendet werden. Diese Konfiguration führt zu einem oder mehreren HTL-Epitop-Minigenen und einem oder mehreren CTL-Epitop-Minigenen. Eine Kombination eines langen CTL-Minigens und eines langen HTL-Minigens, die imstande ist, alle Epitope effektiv bereitzustellen, ist am bevorzugtesten, da es die weitere klinische Entwicklung des Vakzins vereinfacht. Falls unerwünschte Wechselwirkungen zwischen den beiden Minigenen beobachtet werden, wenn sie gemeinsam injiziert werden, wird die Injektion der verschiedenen Plasmide in die gleichen Tiere, aber an verschiedenen Injektionsstellen oder zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Alternativ werden Pools von Minigenen für die weitere Entwicklung in Betracht gezogen, falls ein einziges CTL-Minigen und HTL-Minigen, das alle erwünschten Epitope codiert, nicht ermittelt wird.
  • BEISPIEL 13:
  • BEURTEILUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON CD8+ LYMPHOCYTENANTWORTEN, DIE INFOLGE DER IMMUNISIERUNG MIT EINEM MULTIEPITOP-VAKZIN INDUZIERT WERDEN
  • CD8+-Lymphocytenantworten werden meistens unter Verwendung der ELISPOT-Technik gemessen. Der ELISPOT-Assay ist auf dem Fachgebiet bekannt und wird in unserem Labor regelmäßig eingesetzt. Ein automatisiertes ELISPOT-Lesegerät von Zeiss wird ebenfalls so verwendet, wie dies hier ausgeführt wird. Der für die Messung der CD8+-Antworten verwendete Assay ist in erster Linie der IFN-γ-ELISPOT-Assay, der mit frisch isolierten Zellen sowie Zellen, die in vitro mit einem Peptid erneut stimuliert wurden, durchgeführt wird. Zusätzlich werden in ausgewählten Situationen Chrom-Freisetzungsassays verwendet, ebenfalls mit erneut stimulierten Zellen, und die Ergebnisse werden mit den Ergebnissen in Beziehung gebracht, die im Fall der ELISPOT-Assays beobachtet werden. Das Tetramerfärben von ausgewählten Peptid/MHC-Kombinationen wird ebenfalls durchgeführt. Es soll jedoch darauf hingewiesen werden, dass für die große Zahl potentieller HLA/Peptid-Kombinationen, auf die das Vakzin abzielt, die Verwendung von Reagenzien für das Tetramerfärben als erstem klinischen Assay unpraktisch machen könnte, was detaillierter im den Hingergrund betreffenden Abschnitt unter der Unterüberschrift "Messung und Quantifizierung der Immunantworten von klinischen Proben" diskutiert wird.
  • Der klinische Assay wird entwickelt und validiert. Die Wahl des Zeitpunktes für diese Aktivität fällt mit dem Zeitraum zusammen, der auf die Auswahl eines klinischen Vakzin-Minigens folgt, und sie liegt vor der Verfügbarkeit tatsächlicher Proben der Einzelpersonen, die in den klinischen Versuch eingebunden sind. Assays für die CTL-Beurteilung können auf der Basis des Fachwissens auf dem Gebiet entwickelt werden, beispielsweise auf der Basis des Fachwissens bei der Entwicklung von Assays für CTL-Beurteilungen in den Phase-I- und Phase-II- Studien des experimentellen HBV-Impfstoffs, Theradigm [Livingston et al., J Immunol, Bd. 159(3):1383-92 (1997); Heathcote et al., Hepatology, Bd. 30(2):531-6 (1999); Livingston et al., J Immunol, Bd. 162(5):3088-95 (1999)]. Besonders können Ficoll-gereinigte PBMC, die von gesunden Probanden oder auch z. B. von HIV-infizierten, nicht geimpften Freiwilligen stammen, verwendet werden. Wie zuvor angegeben, können gemäß der Erfindung andere antigene Ziele Die verwendeten Epitope bestehen aus einem Satz von A2-, A3- und B7-Influenza-abgeleiteten Supertyp-Epitopen [Gianfrani et al, Eur. J. of Immunol., (1999)] sowie den Epitopen, die von Ennis et coll, beschrieben werden [Tamura et al., J Virol, Bd. 72(11):9404-6 (1998)]. Dies erlaubt die Validierung des Assays sowie die Definition der Größe der die Basislinie bildenden Antwort in der Patientenpopulation, die behandelt wird.
  • Nach dem Festlegen des Assays werden klinische Proben untersucht. Die allgemeine Assaystrategie ist wie folgt: PBMC-Aliquote, die als gefrorenes Material versendet werden, werden verwendet. Für APC-Autologe werden typischerweise PBMC, die mit Peptiden gepulst sind, verwendet, da dann die in den Polyepitop-Konstrukten eingesetzten Epitope durch eine große Sammlung verschiedener MHC-Klasse-I-Allele restringiert sind, was die Verwendung typisierter EBV-Linien als APC und Zielzellen unpraktisch macht.
  • Sowohl nicht stimulierte Kulturen wie Peptid-stimulierte Kulturen werden bewertet. Einige Antworten können in nicht stimulierten Kulturen nachgewiesen werden, schwächere Antworten/Epitope können aber eine oder zwei erneute Stimulierungen in vitro erforderlich machen. Ein Assayverfahren kann wie folgt durchgeführt werden: Falls beispielsweise Antworten auf ca. fünfzig Klasse-I-restringierte Epitope untersucht werden, können sieben Pools von etwa sieben Peptiden verwendet werden. Pools von Peptiden werden auch für die erneute Stimulierung verwendet. Antworten gegen das PADRE-Epitop werden auch gemessen. Im Fall von Peptidpools, die positive Ergebnisse liefern, werden einzelne Peptide untersucht, um die Epitope nachzuweisen, die für die beobachtete(n) Antwort(en) verantwortlich sind. Positive Kontrollen schließen Gesamt-Tetanustoxoid und/oder das Mitogen PHA sowie den Pool von Influenzavirus-abgeleiteten Epitopen ein. Potentielle Verknüpfungsepitope werden ebenfalls synthetisiert und als ein einzelner Pool getestet.
  • Anschließend wird im Fall von einigen ausgewählten Responder-Peptiden und Personen eine Tetramerfärbung entweder mit frischen Proben oder erneut stimulierten Proben durchgeführt und mit ELISPOT-Daten in Beziehung gebracht. Es sollte berücksichtigt werden, dass nur Tetramere für ausgewählte Peptide, die an übliche Allele gebunden sind, wie A*0201, A*0301, A*1101 und B*0702, erzeugt werden. Die Fähigkeit dieser Tetramere, Zellen zu färben, die postiv für die Antwort gegen die gleichen Peptide sind, die aber durch anderen Mitglieder eines gegebenen Supertyps restringiert sind, werden getestet. Diese Ergebnisse sind von Interesse für die Bestimmung der breiten Anwendbarkeit dieser Reagenzien als diagnostische Marker/Surrogatmarker der Therapie.
  • Im Hinblick auf die Mengen der Zellen, die für diese Analysen erforderlich sind, kann ein Standardassay beispielsweise sieben Peptid gruppen, eine negative und zwei positive Kontrollen (insgesamt 10 Gruppen) einschließen. Für das doppelte Testen, 2 × 105 Zellen/Vertiefung, entspricht dies 10 × 2 × 2 × 105 = 4 × 106 Zellen. Eine konservative Schätzung von 50 % Rückgewinnung nach dem Auftauen liefert eine geschätzte Menge von etwa 106 PBMC/ml Blut. Große Schwankungen der gezählten PBMC in klinischen Probanden werden nicht erwartet, da alle Menschen entweder gesunde Freiwillige oder, für das Beispiel HIV-infizierter Patienten, HAART-Therapieempfänger sind. Schlussfolgernd sollte ein Aliquot von PBMC, das von 4-8 ml Blut stammt, üblicherweise ausreichend für eine Runde des Assays sein. Die Assays müssen üblicherweise wiederholt werden, entweder um die Bestimmung zu ermöglichen, welche Peptide positiv sind, und/oder um die erneute Stimulierung in vitro für eine maximale Empfindlichkeit zu ermöglichen oder um beides zu ermöglichen. Dementsprechend könnte eine Gesamtzahl von 3 bis 4 Aliquoten erforderlich sein, was einer Gesamtmenge von etwa 20 ml Blut entspricht.

Claims (29)

  1. Verfahren zum Herstellen eines optimierten Multiepitop-Polypeptids, das umfasst: (i) Auswählen von mindestens zwei Epitopen, die HLA-Allelspezifische (HLA: humanes Leukocyten-Antigen) Motive oder Supermotive enthalten, wobei diese Epitope HLA-Klasse-I-CTL-Epitope (CTL: cytotoxischer T-Lymphocyt) sind; und (ii) Einfügen dieser mindestens zwei CTL-Epitope in ein Multiepitop-Polypeptid, wobei während des Einfügeschrittes (ii) mindestens ein flankierender oder als Abstandshalter wirkender Aminosäurerest am C-Terminus von mindestens einem dieser mindestens zwei CTL-Epitope eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter Lysin (K), Arginin (R), Asparagin (N), Glutamin (Q), Glycin (G), Alanin (A), Serin (S), Cystein (C) und Threonin (T) ausgewählt wird; und wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines CTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  2. Verfahren zum Herstellen eines optimierten Multiepitop-Polypeptids, das umfasst: (i) Auswählen von mindestens zwei Epitopen, die HLA-Allelspezifische (HLA: humanes Leukocyten-Antigen) Motive oder Supermotive enthalten, wobei diese Epitope HLA-Klasse-II-HTL-Epitope (HTL: Helfer-T-Lymphocyt) sind; und (ii) Einfügen dieser mindestens zwei HTL-Epitope in ein Multiepitop-Polypeptid, wobei während des Einfügeschrittes (ii) mindestens ein flankierender oder als Abstandshalter wirkender Aminosäurerest am C-Terminus von mindestens einem der mindestens zwei HTL-Epitope eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter Glycin (G), Prolin (P) und Asparagin (N) ausgewählt wird; und wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die flankierenden oder als Abstandshalter wirkenden Aminosäurereste mindestens 5 Aminosäurereste umfassen, die unabhängig unter G, P und N ausgewählt werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die flankierenden oder als Abstandshalter wirkenden Aminosäurereste aus GPGPG (SEQ Nr.: 369) bestehen.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die flankierenden oder als Abstandshalter wirkenden Aminosäurereste 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 Aminosäurereste umfassen, die unter A und G ausgewählt werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die flankierenden oder als Abstandshalter wirkenden Aminosäurereste unter K, R, N, G und A ausgewählt werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Substitution eines N-terminalen Restes eines HLA-Epitops, das einem C-Terminus eines HLA-Epitops benachbart ist, das von dem Multiepitop-Polypeptid umfasst wird, durch einen Rest umfasst, der unter K, R, N, G und A ausgewählt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem das anfängliche Sortieren der Epitope, die in das Multiepitop-Polypeptid eingefügt werden sollen, umfasst, um für eine Reihenfolge zu sorgen, in der die Anzahl der gebildeten Verknüpfungsepitope minimiert ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem umfasst: (i) Einfügen des Multiepitop-Polypeptids in eine Zelle; und (ii) Festlegen, dass das Multiepitop-Polypeptid auf einem HLA-prozessierenden Bearbeitungsweg prozessiert wird, so dass alle Epitope, die in dem Multiepitop-Polypeptid enthalten sind, auf einem HLA-prozessierenden Bearbeitungsweg erzeugt werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 2, das außerdem das anfängliche Sortieren der Epitope, die in das Multiepitop-Polypeptid eingefügt werden sollen, umfasst, um für eine Reihenfolge zu sorgen, die die Anzahl der gebildeten Verknüpfungsepitope minimiert.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem umfasst: (i) Auswählen von mindestens zwei Epitopen, die HLA-Allelspezifische (HLA: humanes Leukocyten-Antigen) Motive oder Supermotive enthalten, wobei die Epitope HLA-Klasse-II-HTL-Epitope (HTL: Helfer-T-Lymphocyt) sind; und (ii) Einfügen der mindestens zwei HTL-Epitope in ein Multiepitop-Polypeptid, wobei während des Einfüge schritte (ii) mindestens ein flankierender oder als Abstandshalter wirkender Aminosäurerest am C-Terminus von mindestens einem der mindestens zwei HTL-Epitope eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter Glycin (G), Prolin (P) und Asparagin (N) ausgewählt wird; und wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  12. Verfahren nach Anspruch 2, das außerdem umfasst: (i) Auswählen von mindestens zwei Epitopen, die HLA-Allelspezifische (HLA: humanes Leukocyten-Antigen) Motive oder Supermotive enthalten, wobei die Epitope HLA-Klasse-I-CTL-Epitope (CTL: cytotoxischer T-Lymphocyt) sind; und (ii) Einfügen dieser mindestens zwei CTL-Epitope in ein Multiepitop-Polypeptid, wobei während des Einfüge schrittes (ii) mindestens ein flankierender oder als Abstandshalter wirkender Aminosäurerest am C-Terminus von mindestens einem der mindestens zwei CTL-Epitope eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter K, R, N, Q, G, A, S, C und T ausgewählt wird; und wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines CTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Multiepitop-Polypeptid mindestens 10 CTL-Epitope enthält.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Multiepitop-Polypeptid mindestens 20 CTL-Epitope enthält.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Multiepitop-Polypeptid mindestens 30 CTL-Epitope enthält.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Multiepitop-Polypeptid mindestens 40 CTL-Epitope enthält.
  17. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Multiepitop-Polypeptid mindestens 10 HTL-Epitope enthält.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Multiepitop-Polypeptid mindestens 20 HTL-Epitope enthält.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Multiepitop-Polypeptid mindestens 30 HTL-Epitope enthält.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Multiepitop-Polypeptid mindestens 40 HTL-Epitope enthält.
  21. Verfahren zum Herstellen eines Polynucleotids, das ein optimiertes Multiepitop-Polypeptid codiert, das umfasst: (i) Auswählen von mindestens zwei Nucleinsäuresequenzen, die Epitope codieren, die HLA-Allel-spezifische (HLA: humanes Leukocyten-Antigen) Motive oder Supermotive enthalten, wobei diese Epitope HLA-Klasse-I-CTL-Epitope (CTL: cytotoxischer T-Lymphocyt) sind; und (ii) Einfügen dieser mindestens zwei CTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuresequenzen in ein Multiepitop-Polynucleotid, wobei während des Einfügeschrittes (ii) ein Polynucleotid, das mindestens einen flankierenden oder als Abstandshalter wirkenden Aminosäurerest codiert, am C-Terminus von mindestens einer der mindestens zwei CTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuresequenzen eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter K, R, N, Q, G, A, S, C und T ausgewählt wird; und wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines CTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  22. Verfahren zum Herstellen eines Polynucleotids, das ein optimiertes Multiepitop-Polypeptid codiert, das umfasst: (i) Auswählen von mindestens zwei Nucleinsäuresequenzen, die Epitope codieren, die HLA-Allel-spezifische (HLA: humanes Leukocyten-Antigen) Motive oder Supermotive enthalten, wobei diese Epitope HLA-Klasse-II-HTL-Epitope (HTL: Helfer-T-Lymphocyt) sind; und (ii) Einfügen dieser mindestens zwei HTL- Epitop-codierenden Nucleinsäuresequenzen in ein Multiepitop-Polynucleotid, wobei während des Einfügeschrittes (ii) ein Polynucleotid, das mindestens einen flankierenden oder als Abstandshalter wirkenden Aminosäurerest codiert, am C-Terminus von mindestens einer der mindestens zwei HTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuresequenzen eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter G, P und N ausgewählt wird; und wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  23. Verfahren nach Anspruch 2, das außerdem umfasst: (i) Einfügen des Multiepitop-Polypeptids in eine Zelle; und (ii) Festlegen, dass das Multiepitop-Polypeptid auf einem HLA-prozessierenden Bearbeitungsweg prozessiert wird, so dass alle Epitope, die in dem Multiepitop-Polypeptid enthalten sind, auf einem HLA-prozessierenden Bearbeitungsweg erzeugt werden.
  24. Verfahren nach Anspruch 11, das außerdem das Einfügen der mindestens zwei CTL-Epitope und der mindestens zwei HTL-Epitope in ein Multiepitop-Polypeptid umfasst, wobei während des Einfügeschritts ein Abstandshalter zwischen den mindestens zwei CTL-Epitopen und den mindestens zwei HTL-Epitopen eingeführt wird, wobei der Abstandshalter das Auftreten eines CTL/HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  25. Verfahren nach Anspruch 12, das außerdem das Einfügen der mindestens zwei HTL-Epitope und der mindestens zwei CTL-Epitope in ein Multiepitop-Polypeptid umfasst, wobei während des Einfügeschritts ein Abstandshalter zwischen den mindestens zwei HTL-Epitopen und den mindestens zwei CTL-Epitopen eingeführt wird, wobei der Abstandshalter das Auftreten eines CTL/HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  26. Verfahren nach Anspruch 21, das außerdem umfasst: (i) Auswählen von mindestens zwei Nucleinsäuresequenzen, die Epitope codieren, die HLA-Allel-spezifische Motive oder Supermotive enthalten, wobei diese Epitope HLA-Klasse-II-HTL-Epitope (HLA: humanes Leukocyten-Antigen; HTL: Helfer-T-Lymphocyt) sind; und (ii) Einfügen dieser mindestens zwei HTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuresequenzen in ein Multiepitop-Polynucleotid, wobei während des Einfügeschrittes (ii) ein Polynucleotid, das mindestens einen flankierenden oder als Abstandshalter wirkenden Aminosäurerest codiert, am C-Terminus von mindestens einer der mindestens zwei HTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuresequenzen eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter G, P und N ausgewählt wird; und wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  27. Verfahren nach Anspruch 22, das außerdem umfasst: (i) Auswählen von mindestens zwei Nucleinsäuresequenzen, die Epitope codieren, die HLA-Allel-spezifische Motive oder Supermotive enthalten, wobei diese Epitope HLA-Klasse-I-CTL-Epitope (HLA: humanes Leukocyten-Antigen; CTL: cytotoxischer T-Lymphocyt) sind; und (ii) Einfügen dieser mindestens zwei CTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuresequenzen in ein Multiepitop-Polynucleotid, wobei während des Einfügeschrittes (ii) ein Polynucleotid, das mindestens einen flankierenden oder als Abstandshalter wirkenden Aminosäurerest codiert, am C-Terminus von mindestens einer der mindestens zwei CTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuresequenzen eingefügt wird; wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest unter K, R, N, Q, G, A, S, C und T ausgewählt wird; und wobei der flankierende oder als Abstandshalter wirkende Aminosäurerest das Auftreten eines CTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  28. Verfahren nach Anspruch 26, das außerdem das Einfügen der mindestens zwei CTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuren und der mindestens zwei HTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuren in ein Multiepitop-Polypeptid umfasst, wobei während des Einfügeschritts ein einen Abstandshalter codierendes Polynucleotid zwischen den mindestens zwei CTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuren und den mindestens zwei HTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuren eingeführt wird, wobei der Abstandshalter das Auftreten eines CTL/HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
  29. Verfahren nach Anspruch 27, das außerdem das Einfügen der mindestens zwei HTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuren und der mindestens zwei CTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuren in ein Multiepitop-Polypeptid umfasst, wobei während des Einfügeschritts ein einen Abstandshalter codierendes Polynucleotid zwischen den mindestens zwei HTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuren und den mindestens zwei CTL-Epitop-codierenden Nucleinsäuren eingeführt wird, wobei der Abstandshalter das Auftreten eines CTL/HTL-Verknüpfungsepitops verhindert.
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