ES2288885T3

ES2288885T3 - Minigenes optimizados y peptidos codificados por los mismos.

Info

Publication number: ES2288885T3
Application number: ES00989585T
Authority: ES
Inventors: Alessandro Sette; Robert Chesnut; Brian D. Livingston; Denise Marie Baker; Mark J. Newman
Original assignee: Pharmexa Inc
Current assignee: Pharmexa Inc
Priority date: 1999-12-28
Filing date: 2000-12-28
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2020-12-28
Also published as: JP2011168592A; EP1242108A4; DK1242108T3; BR0017052A; JP2004512815A; CA2394748A1; MXPA02006554A; DE60035523T2; AU2607501A; JP5628716B2; KR100838507B1; AU780064B2; KR20020084424A; HK1048068A1; ATE366582T1; CN1437476A; DE60035523D1; HK1048068B; EP1242108A1; WO2001047541A1

Abstract

Un método para la preparación de un polipéptido multiepítopo optimizado que comprende: (i) la selección de dos o más epítopos que contengan motivos o supermotivos alelo-específicos del antígeno leucocitario humano (HLA), donde dichos epítopos son epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) HLA de Clase I; y (ii) la incorporación de dichos dos o más epítopos CTL en un polipéptido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación (ii): al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de uno o más de dichos dos o más epítopos CTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por lisina (K), arginina (R), asparagina (N), glutamina (Q), glicina (G), alanina (A), serina (S), cisteína (C), y treonina (T); y donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador evita la aparición de un epítopo de unión CTL.

Description

Minigenes optimizados y péptidos codificados por los mismos.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología. En concreto, se relaciona con las vacunas poliepitópicas y con los métodos para el diseño de tales vacunas para proporcionar una inmunogenicidad aumentada. En ciertas realizaciones, las vacunas poliepitópicas están codificadas por un minigén que proporciona una inmunogenicidad optimizada de la construcción.

La tecnología relacionada con las vacunas multiepítopo ("minigén") se está desarrollando. Varios estudios independientes han establecido que puede conseguirse la inducción de respuestas inmunes simultáneas contra múltiples epítopos. Por ejemplo, se pueden inducir y detectar respuestas contra un gran número de especificidades de células T. En situaciones naturales, Doolan et al [Immunity, Vol. 7(1):97-112 (1997)] detectaron simultáneamente respuestas de reclutamiento de células T contra tantos como 17 epítopos diferentes de P. falciparum usando PBMC de un único donante. De modo similar, Bertoni y colaboradores [J Clin Invest, Vol. 100(3):503-13 (1997)] detectaron respuestas simultáneas contra 12 epítopos diferentes derivados del HBV en un único donante. Por lo que se refiere a la inmunización con vacunas minigén de ADN multiepítopo, se han comunicado varios ejemplos en los que se indujeron múltiples respuestas de células T. Por ejemplo, se han descrito vacunas minigén compuestas por aproximadamente diez epítopos MHC de Clase I en las que todos los epítopos eran inmunogénicos y/o antigénicos. En concreto, vacunas minigén compuestas por 9 epítopos del EBV [Thomsom et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 92(13):5845-9 (1995)], 7 epítopos del HIV [Woodberry et al., J Virol, Vol. 73(7):5320-5 (1999)], 10 epítopos murinos [Thomson et al., J Immunol, Vol. 160(4):1717-23 (1998)] y 10 epítopos derivados de tumor [Mateo et al., J Immunol, Vol. 163(7):4058-63 (1999)] han demostrado ser activas. También se ha demostrado que un plásmido de ADN multiepítopo que codifica nueve epítopos diferentes restringidos a HLA-A2.1 y a AII derivados del HBV y del HIV indujo CTL contra todos los epítopos [Ishioka et al, J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)].

De este modo, pueden diseñarse vacunas minigén que contengan múltiples epítopos MHC de Clase I (es decir, CTL), y puede obtenerse presentación y reconocimiento para todos los epítopos. No obstante, la inmunogenicidad de las construcciones multiepítopo parece estar fuertemente influenciada por varias variables, algunas de las cuales se desconocían hasta ahora. Por ejemplo, la inmunogenicidad (o antigenicidad) de un mismo epítopo que se expresa en el contexto de distintas construcciones de vacunas puede variar hasta en varios órdenes de magnitud. De este modo, existe la necesidad de identificar estrategias para optimizar las construcciones de vacunas multiepítopo. Tal optimización es importante por lo que respecta a la inducción de respuestas inmunes potentes y, en última instancia, para su eficacia clínica. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona estrategias para optimizar la antigenicidad y la inmunogenicidad de las vacunas poliepitópicas que contienen un gran número de epítopos, y vacunas poliepitópicas optimizadas, particularmente vacunas minigén, generadas de acuerdo con estas estra-
tegias.

Los párrafos siguientes proporcionan una breve revisión de algunas de las variables más importantes que potencialmente influencian la inmunogenicidad del minigén, el procesamiento de epítopos, y la presentación en las células presentadoras de antígenos (APC) conjuntamente con las moléculas MHC de Clase I y de Clase II.

Inmunodominancia

De los muchos miles de posibles péptidos codificados por un patógeno extraño complejo, sólo una pequeña fracción da lugar a una forma peptídica capaz de unirse a los antígenos MHC de Clase I y, por tanto, de ser reconocida por las células T. Este fenómeno, que tiene un evidente impacto potencial en el desarrollo de una vacuna multiepítopo, se conoce como inmunodominancia [Yewdell et al., Annu Rev Immunol, 17:51-88 (1999)]. Hay varias variables fundamentales que contribuyen a la inmunodominancia. En este documento, se describen las variables que afectan a la generación de los péptidos apropiados, tanto en términos cualitativos como en términos cuantitativos, como resultado del procesamiento celular.

Epítopos de unión

Un epítopo de unión se define como un epítopo originado por la yuxtaposición de otros dos epítopos. El nuevo epítopo se compone de una sección C-terminal obtenida de un primer epítopo, y de una sección N-terminal obtenida de un segundo epítopo. La generación de epítopos de unión es un problema potencial en el diseño de las vacunas minigén multiepítopo, tanto para epítopos restringidos a Clase I como a Clase II por las siguientes razones. En primer lugar, cuando se desarrolla un minigén compuesto por, o que contiene epítopos humanos, cuya inmunogenicidad típicamente se analiza en animales de laboratorio transgénicos HLA, la generación de epítopos murinos puede originar efectos indeseables de inmunodominancia. En segundo lugar, la generación de nuevos epítopos no intencionados para moléculas humanas HLA de Clase I o Clase II puede provocar en los destinatarios de vacunas nuevas especificidades de células T que no se expresan por células infectadas o tumores, que son las respuestas de células T inducidas por las dianas. Estas respuestas son por definición irrelevantes e ineficaces, y pueden incluso ser contraproducentes si originan efectos indeseables de inmunodominancia.

Se ha documentado la existencia de epítopos de unión en una variedad de situaciones experimentales diferentes. Gefter y colaboradores demostraron por primera vez este efecto en un sistema en el que se yuxtapusieron y sintetizaron colinealmente dos epítopos diferentes restringidos a Clase II [Perkins et al., J Immunol, Vol. 146(7):2137-44 (1991)]. El efecto fue tan marcado que el reconocimiento de estos epítopos por el sistema inmune pudo "silenciarse" completamente mediante estos nuevos epítopos de unión [Wang et al., Cell Immunol, Vol. 143(2):284-97 (1992)]. También se observaron en humanos células T auxiliares dirigidas contra epítopos de unión como resultado de la inmunización con un lipopéptido sintético, que estaba compuesto por un epítopo CTL inmunodominante restringido a HLA-A2 y derivado del HBV, y por un epítopo universal HTL derivado del Toxoide Tetánico [Livingston et al, J Immunol, Vol. 159(3):1383-92 (1997)]. De este modo, la generación de epítopos de unión es una consideración fundamental a tener en cuenta en el diseño de construcciones poliepitópicas.

La presente invención proporciona métodos para abordar este problema y para evitar o minimizar la aparición de epítopos de unión.

Regiones flanqueantes

Los epítopos restringidos a Clase I se generan mediante un proceso complejo [Yewdell et al., Annu Rev Immunol, 17:51-88 (1999)]. A la proteolisis limitada por endoproteasas y al recorte potencial por exoproteasas le sigue la translocación a través de la membrana del retículo endoplasmático (RE) mediante un transportador asociado con moléculas del procesamiento de antígenos (TAP). El complejo más importante de proteasas citosólicas que está implicado en la generación de antígenos peptídicos, y sus precursores, es el proteasoma [Niedermann et al. Immunity, Vol 2(3):288-99 (1995)], aunque también se ha demostrado el recorte de los precursores de CTL en el RE [Paz et al., Immunity Vol. 11(2):241-51 (1999)]. Se ha discutido durante mucho tiempo si los restos inmediatamente flanqueantes de los extremos C- y N-terminales del epítopo tienen o no influencia sobre la eficacia de generación de los epítopos.

Se ha implicado a la producción y disponibilidad del epítopo procesado como una variable fundamental en la determinación de la inmunogenicidad y puede de este modo tener claramente un impacto fundamental sobre la potencia global del minigén en tanto que la magnitud de la respuesta inmune puede ser directamente proporcional a la cantidad de epítopo unido por MHC y presentado para su reconocimiento por las células T. Varios estudios han aportado evidencias de que éste es, en efecto, el caso. Por ejemplo, se ha observado que la inducción de CTL específica de virus es esencialmente proporcional a la densidad del epítopo [Wherry et al., J Immunol, Vol. 163(7):3735-45 (1999)]. Adicionalmente, se han utilizado minigenes recombinantes, que codifican un epítopo óptimo preprocesado, para inducir niveles mayores de expresión del epítopo que las que se observan naturalmente con la proteína de longitud completa [Anton et al., J Immunol, Vol. 158(6):2535-42 (1997)]. En general, la sensibilización con minigenes ha demostrado ser más eficaz que la sensibilización con el antígeno completo [Restifo et al., J Immunol, Vol. 154(9):4414-22 (1995); Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)], aunque se han señalado algunas excepciones [Iwasaki et al., Vaccine, Vol. 17(15-16):2081-8 (1999)].

Los primeros estudios concluyeron que los restos dentro del epítopo [Hahn et al., J Exp Med, Vol. 176(5):1335-41 (1992)] regulaban esencialmente la inmunogenicidad. En otros estudios se llegó conclusiones similares, en su mayoría basados en injertar un epítopo en un gen no relacionado, o en el mismo gen pero en distinta localización [Chimini et al. J Exp Med, Vol. 169(1):297-302 (1989); Hahn et al. J Exp Med, Vol. 174(3):733-6 (1991)]. Otros experimentos sin embargo [Del Val et al., Cell, Vol. 66(6):1145-53 (1991); Hahn el al., J Exp Med, Vol. 176(5):1335-41 (1992)] sugirieron que los restos que se localizan directamente adyacentes al epítopo CTL pueden influenciar directamente el reconocimiento [Coullin et al., J Exp Med, Vol. 180(3):1129-34 (1994); Bergmann et al., J Virol. Vol. 68(8):5306-10 (1994)]. En el contexto de las vacunas minigén, se ha reanudado la polémica. Shastri y colaboradores [Shastri et al., J Immunol, Vol. 155(9):4339-46 (1995)] encontraron que las respuestas de células T no se afectaban de forma significativa por la variación del resto flanqueante N-terminal pero se inhibían por la adición de un único resto flanqueante C-terminal. La inhibición más espectacular que se observó fue con isoleucina, leucina, cisteína y prolina como restos flanqueantes del extremo C-terminal. Por el contrario, Gileadi [Gileadi et al., Eur J Immunol, Vol. 29(7):2213-22 (1999)] describió profundos efectos como función de los restos localizados en el extremo N-terminal de los epítopos del virus de la influenza del ratón. Bergmann y colaboradores encontraron que los restos aromáticos, básicos y los restos de alanina apoyaban el reconocimiento eficiente del epítopo, mientras que los restos G y P fueron fuertemente inhibidores [Bergmann et al., J Immunol, Vol. 157(8):3242-9 (1996)]. Por el contrario, Lippolis [Lippolis et al., J Virol, Vol. 69(5):3134-46 (1995)] concluyó que la sustitución de los restos flanqueantes no afectaba al reconocimiento. No obstante, sólo analizó sustituciones muy conservativas, que era poco probable que afectaran a la especificidad del proteasoma.

Parece ser que la especificidad de estos efectos y, en general de los epítopos naturales, se correlaciona en líneas generales con la especificidad del proteasoma. Por ejemplo, la especificidad del proteasoma es en parte tipo tripsina [Niedermann et al., Immunity, Vol. 2(3):289-99 (1995)], con escisión a continuación de aminoácidos básicos. Sin embargo, también es posible la escisión eficiente del lado carboxilo de restos hidrófobos y ácidos. Estas especificidades concuerdan con los estudios de Sherman y colaboradores, que encontraron que una mutación de R a H en la posición siguiente al extremo C-terminal en un epítopo p53 afecta al procesamiento de la proteína mediado por el proteasoma [Theobald et al., J Exp Med, Vol. 188(6):1017-28 (1998)]. Varios otros estudios [Hanke et al., J Gen Virol, Vol. 79 (Pt 1):83-90 (1998); Thomsom et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 92(13):5845-9 (1995)] indicaron que los minigenes pueden construirse utilizando epítopos mínimos, y que estas secuencias flanqueantes parecen no ser necesarias, aunque se reconocía también el potencial del uso de estas regiones flanqueantes para una optimización adicional.

En resumen, para los epítopos HLA de Clase I, los efectos de las regiones flanqueantes sobre el procesamiento y la presentación de los epítopos CTL no están todavía definidos. No se ha realizado un análisis sistemático del efecto de la modulación de las regiones flanqueantes en vacunas minigén. De este modo, en general es necesario realizar un análisis utilizando vacunas minigén que codifiquen epítopos restringidos a la Clase I humana. La presente invención proporciona un análisis de este tipo y por lo tanto, proporciona construcciones de vacunas poliepitópicas optimizadas para inmunogenicidad y antigenicidad, y los métodos para el diseño de tales construcciones.

Los complejos peptídicos HLA de Clase II también se generan como resultado de una compleja serie de eventos distintos de los del procesamiento HLA de Clase I. La ruta de procesamiento implica la asociación con la cadena invariable (li), su transporte a compartimentos especializados, la degradación de li a CLIP y la remoción de CLIP catalizada por HLA-DM (véase [Blue et al., Crit Rev Immunol, Vol. 17(5-6):411-7 (1997); Arndt et al., Immunol Res, Vol. 16(3):261-72 (19997)] para revisión). Es más, varias catepsinas en general, y las catepsinas S y L en particular, desempeñan un papel potencial crucial en la degradación de li [Nakagawa et al., Immunity, Vol. 10(2):207-17 (1999)]. Por lo que respecta a la generación de epítopos funcionales sin embargo, el proceso parece ser algo menos selectivo [Chapman H.A., Curr Opin Immunol, Vol. 10(1):93-102 (1998)], y péptidos de muchos tamaños pueden unirse al MHC de Clase II [Hunt et al., Science, Vol. 256(5065):1817-20 (1992)]. Parecen generarse todos o la mayoría de los péptidos posibles [Moudgil et al., J Immunol, Vol. 159(6):2574-9 (1997); y Thomsom et al., J Virol, Vol. 72(3):2246-52 (1998)]. De este modo, en comparación con la cuestión de las regiones flanqueantes, la generación de epítopos de unión puede ser un asunto más serio en determinadas realizaciones.

Resumen de la invención

Esta invención proporciona una descripción de los parámetros útiles para optimizar la eficacia de las vacunas poliepitópicas. También se describen construcciones poliepitópicas y ácidos nucleicos que codifican tales construcciones (minigenes).

En un aspecto, la invención proporciona un método para la preparación de un polipéptido multiepítopo optimizado que comprende:

(i): la selección de dos o más epítopos que contengan motivos o supermotivos alelo-específicos del antígeno leucocitario humano (HLA), donde dichos epítopos son epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) HLA de Clase I; y

(ii): la incorporación de dichos dos o más epítopos CTL en un polipéptido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación (ii):

: al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de uno o más de los dichos dos o más epítopos CTL; donde dichos restos flanqueantes o aminoácidos espaciadores se seleccionan del grupo formado por lisina (K), arginina (R), asparagina (N), glutamina (Q), glicina (G), alanina (A), serina (S), cisteína (C) y treonina (T), y

donde dichos restos flanqueantes o aminoácidos espaciadores evitan la aparición de un epítopo de unión CTL.

La invención también proporciona un método para la preparación de un polipéptido multiepítopo optimizado, que comprende:

(i): la selección de dos o más epítopos que contengan motivos o supermotivos alelo-específicos del antígeno leucocitario humano (HLA), donde dichos epítopos son epítopos de linfocitos T auxiliares (HTL) HLA de Clase II; y

(ii): la incorporación de dichos dos o más epítopos HTL en un polipéptido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación (ii):

: al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de uno o más de dichos dos o más epítopos HTL; donde dichos restos flanqueantes o aminoácidos espaciadores se seleccionan del grupo formado por glicina (G), prolina (P) o asparagina (N), y

donde dichos restos flanqueantes o aminoácidos espaciadores evitan la aparición de un epítopo de unión HTL.

Los restos aminoacídicos espaciadores pueden seleccionarse independientemente de entre restos que no son restos de anclaje primarios a antígenos leucocitarios humanos (HLA) de Clase II conocidos. En realizaciones particulares, la introducción de restos espaciadores evita la aparición de un epítopo HTL. Tal espaciador consta generalmente de al menos 5 restos aminoacídicos independientemente seleccionados del grupo formado por G, P y N. En algunas realizaciones este espaciador es GPGPG.

En algunas realizaciones, la introducción de restos espaciadores evita la aparición de un epítopo CTL y adicionalmente, donde el espaciador es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 restos aminoacídicos seleccionados independientemente del grupo formado por A y G. Con frecuencia, el resto flanqueante se introduce en la posición C+1 de un epítopo CTL y se selecciona del grupo formado por K, R, N, G y A.

En algunas realizaciones, el resto flanqueante es adyacente a la secuencia espaciadora. Los métodos de la invención pueden también incluir la sustitución de un resto N-terminal de un epítopo HLA que sea adyacente al extremo C-terminal de un epítopo HLA contenido en la construcción poliepitópica con un resto seleccionado del grupo formado por K, R, N, G y A.

También es posible llevar a cabo una etapa de predicción de la estructura de la construcción poliepitópica y, adicionalmente, la selección de una o más construcciones que tengan una estructura máxima, es decir, que sean procesadas por una ruta de procesamiento HLA para producir todos los epítopos contenidos en la construcción.

También se describe una construcción poliepitópica preparada usando un método que está de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones. Con frecuencia los epítopos contenidos en la construcción poliepitópica están codificados por un minigén. La construcción poliepitópica codificada por el minigén puede ser HTV-TT como se expone en la Figura 9, HIV-DG como se expone en la Figura 9, o HIV-TC como se expone en la Figura 9.

Definiciones

La invención puede entenderse mejor con referencia a las siguientes definiciones:

A lo largo de esta descripción, los resultados de "datos de unión" se expresan a menudo en términos de "CI_{50}". La CI_{50} es la concentración de péptido en un ensayo de unión a la que se observa una inhibición del 50% de la unión de un péptido de referencia. Dadas las condiciones en las que se llevan a cabo estos ensayos (es decir, limitando las proteínas HLA y las concentraciones de péptidos marcados), estos valores se aproximan a los valores de K_{D}. Los ensayos para la determinación de la unión se describen con detalle, por ejemplo, en las publicaciones PCT WO 94/20127 y WO 94/03205. Debe señalarse que los valores de CI_{50} pueden cambiar, a menudo drásticamente, si se varían las condiciones del ensayo, y dependiendo de los reactivos concretos que se usen (por ejemplo, preparación de HLA, etc.). Por ejemplo, concentraciones excesivas de moléculas HLA incrementarán la CI_{50} aparente medida para un ligando dado. Alternativamente, la unión se expresa en relación a un péptido de referencia. Aunque a medida que un ensayo concreto se vuelve más, o menos, sensible, la CI_{50} de los péptidos analizados puede cambiar algo, la unión relativa al péptido de referencia no cambiará significativamente. Por ejemplo, en un ensayo llevado a cabo bajo condiciones tales que la CI_{50} del péptido de referencia aumenta 10 veces, los valores de CI_{50} de los péptidos analizados también cambiarán aproximadamente 10 veces. Por lo tanto, para evitar ambigüedades, la evaluación de si un péptido es un ligante bueno, intermedio, débil o negativo se basa generalmente en su CI_{50,} en relación con la CI_{50} de un péptido estándar. La unión puede también determinarse usando otros sistemas de ensayo incluyendo aquellos que utilizan: células vivas (por ejemplo, Ceppellini et al., Nature 339:392, 1989; Christnick et al., Nature 352:67, 1991; Busch et al., Int. Immunol. 2:443, 1990; Hill et al., J. Immunol. 147:189, 1991; del Guercio et al., J. Immunol. 154:685, 1995), sistemas sin células que usan lisados de detergentes (por ejemplo, Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069, 1991), MHC purificado inmovilizado (por ejemplo, Hill et al., J. Immunol. 152, 2890, 1994; Marshall et al., J. Immunol. 152:4946, 1994), sistemas de ELISA (por ejemplo, Reay et al., EMBO J. 11:2829, 1992), resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, Khilko et al., J. Biol. Chem. 268:15425, 1993); ensayos de fase soluble de alto flujo (Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353, 1994), y medición de la estabilización o ensamblaje del MHC de Clase I (por ejemplo, Ljunggren et al., Nature 346:476, 1990; Schumacher et al., Cell 62:563, 1990; Townsend et al., Cell 62:285, 1990; Parker et al., J. Immunol. 149:1896, 1992).

La designación de la posición de un resto en un epítopo como el "extremo carboxilo terminal" o la "posición carboxilo terminal" se refiere a la posición del resto al final del epítopo que está más cerca del extremo carboxilo terminal de un péptido, el cual se designa usando la nomenclatura convencional como se define abajo. "C+1" se refiere al resto o posición inmediatamente siguiente al resto C-terminal del epítopo, es decir, se refiere al resto que flanquea el extremo C-terminal del epítopo. La "posición carboxilo terminal" del epítopo que aparece en el extremo carboxilo de la construcción poliepitópica puede o no corresponderse en realidad con el extremo carboxilo terminal del polipéptido. En las realizaciones preferidas, los epítopos que se emplean en las construcciones poliepitópicas optimizadas son epítopos que portan motivos y el extremo carboxilo terminal del epítopo se define con respecto a los restos de anclaje primarios que corresponden a un motivo concreto.

La designación de la posición de un resto en un epítopo como "extremo amino terminal" o "posición amino-terminal" se refiere a la posición del resto al final de epítopo que está más cerca del extremo amino terminal de un péptido, el cual se designa usando la nomenclatura convencional como se define abajo. "N-1" se refiere al resto o posición inmediatamente adyacente al epítopo que se encuentra en el extremo amino terminal (posición número 1) de un epítopo. La "posición amino terminal" del epítopo que aparece en el extremo amino terminal de la construcción poliepitópica puede o no corresponderse en realidad con el extremo amino terminal del polipéptido. En las realizaciones preferidas, los epítopos que se emplean en las construcciones poliepitópicas optimizadas son epítopos que portan motivos y el extremo amino terminal del epítopo se define con respecto a los restos de anclaje primarios que corresponden a un motivo concreto.

Un "ordenador" o "sistema informático" generalmente incluye: un procesador; al menos un aparato de almacenaje/recuperación de la información tal como, por ejemplo, un disco duro, un mecanismo impulsador de discos o un mecanismo impulsador de cintas; al menos un aparato de entrada de datos tal como, por ejemplo, un teclado, un ratón, una pantalla táctil o un micrófono; y una estructura de visualización. Adicionalmente, el ordenador puede incluir un canal de comunicación en comunicación con una red. Tal ordenador puede incluir más o menos lo enumerado arriba.

Una "construcción" tal y como se utiliza en este documento generalmente denota una composición que no se da en la naturaleza. Una construcción puede producirse mediante tecnologías sintéticas, por ejemplo, la preparación de ADN recombinante y su expresión, o por técnicas de química sintética para nucleótidos o aminoácidos. Una construcción puede también producirse mediante la adición o la afiliación de un material con otro de tal forma que el resultado no se encuentre en la naturaleza en esa forma. Una "construcción poliepitópica" consta de múltiples epítopos.

Una "reacción cruzada de unión" indica que un péptido puede unirse por más de una molécula HLA; un sinónimo es unión degenerada.

Un "epítopo críptico" provoca una respuesta por inmunización con un péptido aislado, pero la respuesta no presenta reactividad cruzada in vitro cuando se utiliza como antígeno la proteína completa intacta que contiene el epítopo.

Un "epítopo dominante" es un epítopo que induce una respuesta inmune tras la inmunización con un antígeno nativo completo (véase, por ejemplo, Sercarz et al., Annu. Rev. Immunol. 11:729-766, 1993). Tal respuesta presenta reactividad cruzada in vitro con el epítopo peptídico aislado.

Con respecto a una secuencia aminoacídica concreta, un "epítopo" es un conjunto de restos aminoacídicos que están implicados en el reconocimiento por una inmunoglobulina concreta o, en el contexto de las células T, los restos necesarios para el reconocimiento por las proteínas de los receptores de células T y/o por los receptores del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). En el entorno de un sistema inmune, in vivo o in vitro, un epítopo es el conjunto de características de una molécula, tales como su estructura peptídica primaria, secundaria y terciaria, y su carga, que en conjunto forman un sitio de reconocimiento para una inmunoglobulina, receptor de células T o molécula HLA. A lo largo de esta exposición epítopo y péptido a menudo se usan indistintamente. Debe apreciarse, no obstante, que las proteínas o moléculas peptídicas aisladas o purificadas mayores que y que contienen un epítopo de la invención siguen estando dentro de los límites de la invención.

Un "resto flanqueante" es un resto que se sitúa a continuación de un epítopo. Un resto flanqueante puede introducirse o insertarse en una posición adyacente al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de un epítopo.

Un "péptido inmunogénico" o "epítopo peptídico" es un péptido que contiene un motivo o supermotivo alelo-específico tal que el péptido se unirá a una molécula HLA e inducirá una respuesta de CTL y/o de HTL. De este modo, los péptidos inmunogénicos de la invención son capaces de unirse a una molécula apropiada de HLA y a continuación inducir una respuesta de células T citotóxicas o una respuesta de células T auxiliares, contra el antígeno del que procede el péptido inmunogénico.

Los "análogos heteroclíticos" se definen en este documento como péptidos con una potencia aumentada contra una célula T específica, medida como el incremento de la respuesta a una dosis dada, o por el requerimiento de menores cantidades para alcanzar la misma respuesta. Las ventajas de los análogos heteroclíticos incluyen que los antígenos pueden ser más potentes, o más económicos (ya que se requiere una cantidad menor para conseguir el mismo efecto). Adicionalmente, los epítopos modificados podrían superar la insensibilidad de células T antígeno-específicas (tolerancia de células T).

El "Antígeno Leucocitario Humano" o "HLA" es una proteína del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) humano de Clase I o de Clase II (véase, por ejemplo, Stites et al., INMUNOLOGY, 8TK ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)).

Un "supertipo HLA o familia HLA", como se usan en este documento, describen conjuntos de moléculas HLA que se agrupan en base a especificidades compartidas de unión a péptidos. Las moléculas HLA de Clase I que comparten una afinidad de unión algo similar por péptidos que portan determinados motivos aminoacídicos se agrupan en tales supertipos HLA. Los términos superfamilia HLA, familia de supertipos HLA, familia HLA, y moléculas HLA tipo xx (donde xx denota un tipo particular de HLA), son sinónimos.

Como se usa en este documento, una "afinidad alta" con respecto a moléculas HLA de Clase I se define como una unión con un valor de CI_{50} o de K_{D} de 50 nM o menos; una "afinidad intermedia" es una unión con un valor de CI_{50} o de K_{D} de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 500 nM. Una "afinidad alta" con respecto a la unión a moléculas HLA de Clase II se define como una unión con un valor de CI_{50} o de K_{D} de 100 nM o menos; una "afinidad intermedia" es una unión con un valor de CI_{50} o de K_{D} de entre aproximadamente 100 y aproximadamente
1000 nM.

Una "CI_{50}" es la concentración de péptido en un ensayo de unión a la cual se observa una inhibición de la unión de un péptido de referencia del 50%. Dadas las condiciones en las que los ensayos se llevan a cabo (por ejemplo, limitando las proteínas HLA y las concentraciones de péptidos marcados), estos valores se aproximan a los valores de K_{D}.

Los términos "idénticas" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias peptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de restos aminoacídicos que son iguales, cuando se comparan y alinean buscando la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, medidas usando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual.

La "introducción" de un resto aminoacídico en una posición concreta dentro de una construcción poliepitópica, por ejemplo, adyacente al lado C-terminal, o al extremo C-terminal del epítopo, abarca la configuración de múltiples epítopos de tal forma que el resto deseado esté en una posición concreta, por ejemplo, adyacente al epítopo, o de tal forma que un resto perjudicial no esté adyacente al extremo C-terminal del epítopo. El término también incluye la inserción de un resto aminoacídico, preferentemente un resto aminoacídico preferido o intermedio, en una posición concreta. Un resto aminoacídico puede también introducirse en una secuencia por sustitución de un resto aminoacídico por otro. Preferentemente, tal sustitución se realiza de acuerdo con los principios de analogía expuestos, por ejemplo, en el documento U.S.S.N. 09/260 en trámite junto con la presente, 714 presentada el 3/1/99 y en la solicitud PCT/US00719774.

Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a un material que está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan al material tal como se encuentra en su estado nativo. De este modo, los péptidos aislados de acuerdo con la invención preferentemente no contienen los materiales que normalmente se asocian con los péptidos en su entorno in situ.

"Conectar" o "unir" se refieren a cualquier método conocido en la técnica para conectar péptidos funcionalmente, incluyendo, sin limitaciones, la fusión recombinante, los enlaces covalentes, los puentes disulfuro, los enlaces iónicos, los enlaces de hidrógeno y las uniones electrostáticas.

El "Complejo Mayor de Histocompatibilidad" o "MHC" es un grupo de genes que desempeñan un papel en el control de las interacciones celulares responsables de las respuestas inmunes fisiológicas. En humanos, el complejo MHC se conoce también como complejo HLA. Para una descripción más detallada de los complejos MHC y HLA, véase, Paul, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3RD ED., Raven Press, New York, 1993.

Como se usa en este documento, el "centro del péptido" es una posición en un péptido que no es un extremo ni amino ni carboxilo terminal.

Un "número mínimo de epítopos de unión" como se usa en este documento se refiere a un número de epítopos de unión que es menor que el que se generaría usando un criterio de selección aleatorio.

El término "motivo" se refiere a un patrón de restos en un péptido de una longitud definida, generalmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo HLA de Clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo HLA de Clase II, que es reconocido por una molécula HLA concreta. Los motivos peptídicos son típicamente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo HLA humano y difieren en el patrón de los restos de anclaje primarios y secundarios.

Un "resto de unión negativa" o "resto perjudicial" es un aminoácido que, si está presente en ciertas posiciones (típicamente no en posiciones de anclaje primarias) en un epítopo peptídico, produce un descenso de la afinidad de unión del péptido por su molécula HLA correspondiente.

"Optimizar" una construcción poliepitópica se refiere a incrementar la inmunogenicidad o antigenicidad de una construcción mediante la clasificación de los epítopos para minimizar la aparición de epítopos de unión, la inserción de restos flanqueantes que flanqueen el extremo C-terminal o el extremo N-terminal de un epítopo, y la inserción de restos espaciadores que adicionalmente eviten la aparición de epítopos de unión o que proporcionen un resto flanqueante. El incremento de la inmunogenicidad o antigenicidad de una construcción poliepitópica optimizada se mide en relación a una construcción poliepitópica que no se ha construido en base a los parámetros de optimización y se hace usando ensayos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, evaluación de la inmunogenicidad en animales transgénicos, ELISPOT, ensayos de liberación de interferón gamma, tinción de tetrámeros, ensayos de liberación de cromo, y presentación en células dendríticas.

El término "péptido" se usa indistintamente al de "oligopéptido" en la presente memoria descriptiva para designar una serie de restos, típicamente L-aminoácidos, conectados unos a otros, típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos \alpha-amino y carboxilo de aminoácidos adyacentes. Los péptidos preferidos inductores de CTL de la invención tienen una longitud de 13 restos o menos y normalmente constan de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 11 restos, preferentemente 9 o 10 restos. Los oligopéptidos preferidos inductores de HTL tienen una longitud de menos de aproximadamente 50 restos y normalmente constan de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 30 restos, más frecuentemente entre aproximadamente 12 y 25, y a menudo entre aproximadamente 15 y 20 restos.

Un "péptido de unión a PanDR o péptido PADRE^{TM}" es un miembro de una familia de moléculas que unen más de una molécula HLA-DR de Clase II. El patrón que define a la familia de moléculas PADRE^{TM} puede asimilarse a un supermotivo HLA de Clase II. PADRE se une a la mayoría de las moléculas HLA-DR y estimula in vivo e in vitro respuestas de los linfocitos T auxiliares humanos (HTL).

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición generalmente no tóxica, inerte, y/o fisiológicamente compatible.

"Presentadas a una ruta de procesamiento HLA de Clase I" significa que las construcciones poliepitópicas se introducen en una célula de tal modo que son procesadas en su mayor parte por una ruta de procesamiento HLA de Clase I. Típicamente, las construcciones poliepitópicas se introducen en las células utilizando vectores de expresión que codifican las construcciones poliepitópicas. Los epítopos de HLA de Clase II que están codificados por tal minigén también se presentan por moléculas de Clase II, aunque el mecanismo de entrada de los epítopos en la ruta de procesamiento de Clase II no está definido.

Un "resto de anclaje primario" o un "anclaje primario MHC" es un aminoácido en una posición específica a lo largo de la secuencia peptídica que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula HLA. De uno a tres, normalmente dos, restos de anclaje primarios dentro de un péptido de una longitud definida generalmente definen un "motivo" para un péptido inmunogénico. Estos restos se entiende que encajan en estrecho contacto con las hendiduras de unión peptídica de una molécula HLA, con sus cadenas laterales alojadas en bolsillos específicos de las hendiduras de unión. En una realización, por ejemplo, los restos de anclaje primarios de un epítopo HLA de Clase I se localizan en la posición 2 (desde la posición amino terminal) y en la posición carboxilo terminal de un epítopo peptídico de 9 restos de acuerdo con la invención. Las posiciones de anclaje primarias para cada motivo y supermotivo se describen, por ejemplo, en las Tablas I y III de los documentos PCT/US00/27766, o PCT/US00/19774. Adicionalmente, pueden generarse péptidos análogos mediante la alteración de la presencia o ausencia de restos concretos en estas posiciones de anclaje primarias. Tales análogos se utilizan para modular la afinidad de unión de un péptido que contiene un motivo o supermotivo concreto.

El "reconocimiento promiscuo" aparece cuando un péptido distinto es reconocido por el mismo clon de células T en el contexto de varias moléculas HLA. El reconocimiento o la unión promiscua son sinónimos de la reacción cruzada de unión.

Una "respuesta inmune protectora" o "respuesta inmune terapéutica" se refiere a una respuesta de CTL y/o de HTL contra un antígeno derivado de un agente infeccioso o un antígeno tumoral, que de alguna forma previene o al menos detiene parcialmente el avance de los síntomas de la enfermedad, sus efectos colaterales o su progresión. La respuesta inmune puede también incluir una respuesta humoral favorecida por la estimulación de las células T auxiliares.

El término "resto" se refiere a un aminoácido o a un mimético de aminoácido incorporado en un péptido o proteína mediante un enlace tipo amida o mimético de enlace amida.

Un "resto de anclaje secundario" es un aminoácido en una posición distinta a la posición de anclaje primario en un péptido que puede influenciar la unión peptídica. Un resto de anclaje secundario aparece entre los péptidos unidos con una frecuencia significativamente más alta de la que cabría esperar mediante una distribución aleatoria de aminoácidos en una posición. Se dice que los restos de anclaje secundarios aparecen en "posiciones de anclaje secundarias". Un resto de anclaje secundario puede identificarse como un resto que está presente con una frecuencia mayor entre péptidos de afinidad de unión alta o intermedia, o un resto que se relaciona de otro modo con una afinidad de unión alta o intermedia. Por ejemplo, se pueden generar péptidos análogos mediante la alteración de la presencia o la ausencia de restos concretos en estas posiciones de anclaje secundarias. Tales análogos se usan para modular finamente la afinidad de unión de un péptido que contiene un motivo o supermotivo concreto. La terminología "péptido fijo" se utiliza a veces para referirse a un péptido análogo.

La "clasificación de epítopos" se refiere a la determinación o al diseño del orden de los epítopos en una construcción poliepitópica.

Un "espaciador" se refiere a una secuencia que se inserta entre dos epítopos en una construcción poliepitópica para evitar la aparición de epítopos de unión. Para los epítopos HLA de Clase II, el espaciador tiene una longitud de cinco aminoácidos o más, y los restos aminoacídicos en la secuencia espaciadora, tales como G, P o N típicamente no se conoce que sean restos de anclaje primarios de un motivo HLA de Clase II (véase, por ejemplo, PCT/US00/19774).

Un "epítopo subdominante" es un epítopo que suscita poca o ninguna respuesta tras la inmunización con antígenos completos que contengan el epítopo, pero para los cuales puede obtenerse una respuesta mediante la inmunización con un péptido aislado, y esta respuesta (a diferencia del caso de los epítopos crípticos) se detecta cuando se utiliza la proteína completa para generar una respuesta de recuerdo in vivo o in vitro.

Un "supermotivo" es una especificidad de unión peptídica compartida por las moléculas HLA codificadas por dos o más alelos HLA. Preferentemente, un péptido portador de un supermotivo es reconocido con una afinidad alta o intermedia (como se ha definido en este documento) por dos o más antígenos HLA.

"Péptido sintético" se refiere a un péptido que no se da naturalmente, pero que ha sido sintetizado por el hombre utilizando métodos tales como la síntesis química o la tecnología de ADN recombinante.

Un "resto de contacto TCR" o "resto de contacto con un receptor de células T" es un resto aminoacídico en un epítopo que se entiende que se une a un receptor de células T; estos se definen en este documento como que no son ningún anclaje primario de MHC. Los restos de contacto con un receptor de células T se definen como la posición o posiciones en el péptido donde todos los análogos analizados inducen una producción negativa de IFN\gamma en relación con la inducida con el péptido silvestre.

La nomenclatura utilizada para describir los compuestos peptídicos sigue la práctica convencional donde el grupo amino se presenta hacia la izquierda (el extremo N-terminal) y el grupo carboxilo hacia la derecha (el extremo C-terminal) de cada resto aminoacídico. Cuando se hace referencia a las posiciones de restos aminoacídicos en un epítopo peptídico, se numeran en dirección amino-carboxilo siendo la posición uno la más cercana al extremo amino terminal del epítopo, o del péptido o proteína del que pueda formar parte. En las fórmulas que representan realizaciones específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos amino y carboxilo terminales, aunque no se muestre específicamente, están en la conformación que adoptarían a valores fisiológicos de pH, salvo que se especifique lo contrario. En las fórmulas de estructura aminoacídica, cada resto se representa generalmente mediante las designaciones convencionales de tres letras o de una sola letra. La conformación L de un resto aminoacídico se representa mediante una sola letra mayúscula o mediante la primera letra en mayúscula de un símbolo de tres letras, y la conformación D para los aminoácidos que tienen conformación D se representa con una sola letra en minúscula o con un símbolo de tres letras en minúsculas. La glicina no tiene ningún átomo de carbono asimétrico y se denomina simplemente como "Gly" o G. Los símbolos para los aminoácidos se muestran abajo.

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Las "características químicas" de los aminoácidos los definen como: Aromáticos (F, W, Y); Alifático-hidrófobos (L, I, V, M); Poco polares (S, T, C); Muy polares (Q, N); Ácidos (D, E); Básicos (R, H, K); Prolina; Alanina; y Glicina.

Los acrónimos utilizados en este documento son como siguen:

APC:: Célula presentadora de antígenos

CD3:: Marcador de células T omnipresente

CD4:: Marcador de linfocitos T auxiliares

CD8:: Marcador de linfocitos T citotóxicos

CEA:: Antígeno carcinoembrionario

CTL:: Linfocitos T citotóxicos

DC:: Células dendríticas. Las DC funcionaron como potentes células presentadoras de antígenos mediante la estimulación de la liberación de citoquinas de líneas de CTL que eran específicas para un péptido modelo derivado del virus de la hepatitis B (HBV). Experimentos in vitro utilizando pulsos de DC ex vivo con un epítopo peptídico HBV estimularon las respuestas inmunes de CTL in vitro tras su administración en ratones sin tratamiento previo.

DMSO:: Dimetilsulfóxido

ELISA:: Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

E:T:: Proporción efector:diana

FCS:: Suero bovino fetal

G-CSF:: Factor estimulante de colonias de granulocitos

GM-CSF:: Factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (monocitos)

HBV:: Virus de la hepatitis B

HER2/Neu:: c-erbB-2

HLA:: Antígeno leucocitario humano

HLA-DR:: Antígeno leucocitario humano de Clase II

HPLC:: Cromatografía líquida de alta resolución

HTC:: Células T auxiliares

HTL:: Linfocitos T auxiliares

ID:: Identidad

IFN\gamma:: Interferón gamma

IL-4:: Citoquina interleuquina-4

IV:: Intravenosa

LU_{30%}:: Actividad citotóxica que se requiere para alcanzar un 30% de lisis a una proporción (E:T) de 100:1

MAb:: Anticuerpo monoclonal

MAGE:: Antígeno de melanoma

MLR:: Reacción linfocítica mixta

MNC:: Células mononucleares

PB:: Sangre periférica

PBMC:: Células mononucleares de sangre periférica

SC:: Subcutánea

S.E.M.:: Error estándar de la media

QD:: Dosificación una vez al día

TAA:: Antígeno asociado a tumor

TCR:: Receptor de células T

TNF:: Factor de necrosis tumoral

WBC:: Glóbulos blancos

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra datos de tres construcciones multiepítopo diferentes, que incorporan cada una de 20 a 25 epítopos CTL diferentes.

La Figura 2 ilustra dos polipéptidos sintéticos diferentes (Fig. 2a) donde la primera construcción incorpora cuatro epítopos diferentes cosintetizados linealmente, y la segunda construcción incorpora un espaciador GPGPG. La Fig. 2b ilustra la capacidad de 2 nanomoles de estas diferentes construcciones para sensibilizar para respuestas proliferativas contra varios epítopos en ratones IA^{b} positivos, en comparación con las respuestas inducidas por cantidades equimolares de una combinación de los mismos péptidos (3 microgramos de cada péptido).

La Figura 3 representa la estructura de construcciones de ADN multiepítopo. La restricción HLA se muestra encima de cada epítopo, los epítopos A*0201 están en negrita. La afinidad de unión a HLA (CI_{50} nM) se facilita debajo de cada epítopo. (a) Dibujo esquemático del HIV-FT que ilustra el orden de los epítopos codificados. (b) Dibujos esquemáticos de las construcciones HBV-específicas. El aminoácido C+1 en relación al Core 18 se indica con una flecha. Las construcciones HBV-específicas con inserciones de un solo aminoácido en la posición C_{1} del Core 18 se ilustran como HBV. 1X.

La Figura 4 ilustra la inmunogenicidad de los epítopos HLA-A*0201 en el HIV-FT en ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b}. (a) Respuestas de CTL representativas contra epítopos Pol 498 (círculos), Vpr 62 (triángulos), Gag 386 (cuadrados). La citotoxicidad se analizó en un ensayo de liberación de ^{51}Cr contra células diana Jurkat-HLA-A*0201/K^{b} en presencia (símbolos rellenos) o ausencia (símbolos abiertos) de cada péptido. (b) Resumen de las respuestas de CTL de la inmunogenicidad del HIV-FT en ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b}. Las barras indican la media geométrica de la respuesta de CTL de los cultivos positivos. También se indica la frecuencia de cultivos de CTL positivos.

La Figura 5 muestra la influencia del aminoácido C+1 en la inmunogenicidad del epítopo. Se analizó una base de datos que incorporaba las respuestas de CTL de una variedad de minigenes que representaban 94 combinaciones epítopo/aminoácido C+1 para determinar la frecuencia (%) de casos en que una combinación concreta se asociaba con una respuesta de CTL óptima. Las respuestas de CTL se consideraron óptimas si eran superiores a 100 SU o a 20 LU en al menos el 30% de los cultivos medidos. También se proporcionó el número de veces que se observó una combinación epítopo/aminoácido C+1 dada.

La Figura 6 muestra las respuestas de CTL contra construcciones específicas HBV. (a) Respuestas de CTL contra el epítopo Core 18 después de la inmunización con ADN de ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b}, (b) respuestas de CTL contra el Core 18 del HBV después de la inmunización con ADN de ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b} con construcciones que varían en la inserción de un solo aminoácido en la posición C+1 del Core 18.

La Figura 7 muestra los niveles de presentación del Core 18 del HBV en las líneas celulares transfectadas HBV.1 (barras sombreadas) y HBV.1K (barras rayadas). La presentación del epítopo se cuantificó utilizando líneas de CTL péptido-específicas. Se muestra la presentación del Pol 455 del HBV con fines comparativos.

La Figura 8 representa los datos de las células diana 221 A2K^{b} transfectadas con el minigén HIV-1. En estas células transfectadas se analizó su capacidad para presentar epítopos a líneas de CTL obtenidas de ratones transgénicos HLA y específicas para varios epítopos CTL derivados de HIV. Para corregir las diferencias en la sensibilidad a antígenos de diferentes líneas de CTL, se llevaron a cabo en paralelo titulaciones de la dosis de péptidos, utilizando células no transfectadas como APC.

La Figura 9 muestra construcciones poliepitópicas optimizadas del HIV utilizando los métodos de la presente invención.

Descripción de las realizaciones específicas Descripción detallada de la invención I. Introducción

La presente invención se relaciona con métodos de diseño de vacunas multiepítopo con inmunogenicidad. En las realizaciones preferidas, la vacuna contiene epítopos CTL y HTL. Las vacunas producidas de acuerdo con la invención permiten una cobertura significativa de la población, independientemente de la etnia, y pueden centrarse preferentemente en epítopos conservados entre diferentes aislados virales u otros aislados antigénicos. La vacuna puede optimizarse con respecto a la magnitud y a la amplitud de las respuestas, y puede tenerse en cuenta la configuración de epítopos más simple. Por último, se describen los métodos generales para evaluar la inmunogenicidad de una vacuna poliepitópica en humanos.

Los métodos de la invención comprenden el diseño de una construcción poliepitópica basada en los principios identificados en este documento. Por un lado, la invención proporciona la inducción simultánea de respuestas contra epítopos CTL y HTL específicos, usando vacunas minigén con un solo promotor. Tales construcciones minigén pueden contener muchos epítopos diferentes, preferentemente más de 10, a menudo más de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, o más.

Al diseñar una construcción poliepitópica, se tienen en cuenta las siguientes consideraciones:

(i): los epítopos a incorporar en la construcción poliepitópica se clasifican para proporcionar un orden que minimice el número de epítopos de unión que se forman. En algunas realizaciones, la clasificación se realiza mediante un ordenador. Preferentemente, como una consideración secundaria a tener en cuenta al ordenar epítopos, los epítopos se sitúan de tal modo que el extremo N-terminal de un epítopo que promueve la inmunogenicidad de CTL esté yuxtapuesto al extremo C-terminal de otro epítopo CTL.

(ii): los restos flanqueantes que aumentan la inmunogenicidad se insertan en las posiciones flanqueantes de los epítopos. En realizaciones particulares, los restos flanqueantes se insertan en la posición C+1 de los epítopos CTL.

(iii): las secuencias espaciadoras se insertan entre epítopos para evitar la aparición de epítopos de unión. En realizaciones particulares, las secuencias espaciadoras pueden también incluir un resto que promueva la inmunogenicidad en el extremo N-terminal del conector tal que el resto flanquee el extremo C-terminal de un epítopo CTL.

En realizaciones particulares para evitar los epítopos de unión HTL, se utilizan espaciadores compuestos por restos aminoacídicos que no se corresponden con ningún resto de anclaje HLA de Clase II conocido, por ejemplo, se incluyen restos G y P alternos (un espaciador GP) entre dos epítopos HTL.

Otro aspecto de la invención, (consideración (ii) arriba) implica la introducción o sustitución de restos aminoacídicos concretos en las posiciones que flanquean epítopos, por ejemplo, la posición inmediatamente adyacente al extremo C-terminal del epítopo, generando así construcciones poliepitópicas con una antigenicidad y una inmunogenicidad aumentadas en comparación con las construcciones que no contienen el resto concreto introducido o sustituido en ese sitio, por ejemplo, los minigenes optimizados. Los métodos para la optimización de las construcciones poliepitópicas comprenden una etapa de introducción de un resto flanqueante, preferentemente K, N, G, R o A en la posición C+1 del epítopo, es decir, la posición inmediatamente adyacente al extremo C-terminal del epítopo. Los restos que contribuyen a disminuir la inmunogenicidad, es decir, los restos cargados negativamente, por ejemplo, D, restos alifáticos (I, L, M, V) o restos aromáticos distintos del triptófano, pueden sustituirse. El resto flanqueante puede introducirse mediante el posicionamiento apropiado de los epítopos para proporcionar un resto flanqueante favorable, o mediante la inserción de un resto específico.

Consideraciones en el diseño de construcciones vacunales poliepitópicas optimizadas

Como se señala en la sección de antecedentes, se han utilizado minigenes que codificaban hasta 10 epítopos para inducir respuestas contra varios epítopos diferentes. Se han publicado los datos en relación con un minigén experimental, pMin. 1 [Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)]. En este documento se exponen los parámetros para el diseño y la evaluación de las construcciones multiepítopo con inmunogenicidad optimizada que abordan miríadas de indicaciones para enfermedades de interés.

La identificación de los parámetros de diseño se basó en varios estudios. En una evaluación preliminar de las construcciones poliepitópicas, se presentan los datos (Fig. 1) de tres construcciones multiepítopo diferentes, que incorporaban cada una de 20 a 25 epítopos CTL diferentes. Una de las construcciones se basa en epítopos derivados del HIV, (HIV-1), mientras que las otras dos incorporan epítopos derivados del HCV (HCV-1 y HCV-2, respectivamente). La inmunogenicidad de estos diferentes minigenes se ha medido en ratones transgénicos HLA A2 o bien A11 (los epítopos restringidos a AI, A24 y B7 no se evaluaron).

De este modo, once días después de una única inyección intramuscular de una vacuna de ADN, se evaluaron las respuestas contra 8 a 14 epítopos representativos diferentes después de una única reestimulación in vitro a día seis, utilizando ensayos para medir la actividad de CTL (liberación de cromo o bien producción de IFN in situ, como se describe en este documento). La sensibilización de CTL epítopo-específica pudo demostrarse para 6/8 (75%), 10/14 (72%) y 13/14 (93%) de los epítopos analizados en el caso del HIV-1, HCV-1 y HCV-2, respectivamente. Por lo tanto, minigenes multiepítopo, capaces de sensibilizar simultáneamente para respuestas de CTL contra un gran número de epítopos, pueden diseñarse fácilmente. No obstante, debe enfatizarse que no se detectó sensibilización de CTL para algunos epítopos, y en varios de los 36 casos considerados, las respuestas fueron infrecuentes, o variaron significativamente en magnitud por encima de al menos tres órdenes de magnitud (1000 veces). Estos resultados sugerían enérgicamente que se requería un análisis más cuidadoso y una optimización de las construcciones
minigén.

Se examinó también la posibilidad de que el rendimiento subóptimo de la sensibilización para ciertos epítopos pudiera relacionarse con el tamaño del minigén. De hecho, la mayoría de los informes publicados describen minigenes de hasta diez epítopos, y los pocos casos en los que se han publicado minigenes de 20 epítopos, sólo se ha medido la actividad dirigida contra dos o tres epítopos. Para abordar esta posibilidad, se sintetizaron y analizaron dos minigenes más pequeños (HIV-1.1 y HIV-1.2) cada uno conteniendo diez epítopos, y correspondiéndose con una mitad del minigén HIV-1. Se midieron las respuestas contra cuatro epítopos representativos.

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Se descubrió que las respuestas inducidas por los minigenes más pequeños eran comparables, y si acaso, menores que las inducidas por la construcción de veinte epítopos (Tabla 1). Por consiguiente, los factores relacionados con el tamaño del minigén son explicaciones poco probables para la sensibilización subóptima observada para ciertos epítopos y por lo tanto se utilizan otros parámetros, que se exponen en este documento, para diseñar construcciones poliepitópicas eficaces.

La minimización de motivos de unión

Una de las consideraciones a tener en cuenta al diseñar construcciones poliepitópicas es la generación involuntaria de epítopos de unión cuando se colocan los epítopos adyacentes unos a otros. La presencia de tales epítopos en un minigén puede afectar significativamente al funcionamiento del minigén. En este documento se exponen estrategias para proteger de este efecto indeseado para aplicarlas al desarrollo de vacunas poliepitópicas o vacunas minigén. Los epítopos de unión pueden minimizarse en primer lugar mediante la clasificación de los epítopos para identificar un orden en el cual se minimice el número de epítopos de unión. Tal procedimiento de clasificación puede realizarse utilizando un ordenador o a ojo, si fuera necesario, o dependiendo del número de epítopos a incluir en la construcción poliepitópica.

Por ejemplo, puede usarse un programa de ordenador que encuentra patrones, por ejemplo, Panorama, en el diseño de minigenes multiepítopo. Pueden considerarse un número muy grande de colocaciones diferentes en el diseño de una construcción minigén particular. Un programa de ordenador acepta como entrada, el conjunto concreto de epítopos considerados, y los motivos a explorar a fin de evaluar si hay algún epítopo de unión que porte estos motivos. Por ejemplo, un programa puede simular la construcción de un minigén, y en un algoritmo heurístico computacional, examinar las parejas de epítopos para evitar o minimizar la aparición de motivos de unión. El programa puede por ejemplo, evaluar 6 \times 10^{5} (aproximadamente medio millón) de configuraciones minigén/segundo. Como una alternativa menos preferida, ya que lleva mucho más tiempo, puede realizarse un análisis no asistido por ordenador.

Un análisis completo de una construcción de 10 epítopos usando un programa de ordenador como se describe en el párrafo anterior requiere examinar 10 factorial \cong 3,6 \times 10^{6} combinaciones y puede completarse en seis segundos. Una construcción de catorce epítopos puede analizarse completamente en un par de días. No obstante, el tiempo de análisis aumenta muy rápidamente a medida que se consideran minigenes más grandes. No se requiere un análisis completo y el programa puede ejecutarse por la extensión de tiempo que se desee. En este caso, se proporciona la configuración que proporciona el menor número de epítopos de unión.

En la Tabla 2 se presenta un ejemplo de los resultados de un planteamiento de este tipo. En esta tabla se presenta el resultado de un análisis por ordenador de dos días del número de motivos de unión en diez distribuciones aleatorias diferentes de los mismos epítopos contenidos en el minigén HCV1, que incorpora 25 epítopos. En las distribuciones no optimizadas, se encontró un gran número de motivos A2, A11 y K^{b}, en un intervalo de 25 a 38, con un promedio de 31. Por el contrario, sólo hay dos de tales motivos de unión en la distribución del minigén HCV1. En conclusión, se puede utilizar un programa de ordenador para minimizar eficazmente el número de motivos de unión presentes en las construcciones minigén.

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TABLA 2 Aparición de epítopos de unión

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Eliminación de epítopos de unión de Clase II y ensayo de las respuestas restringidas a Clase II in vivo

Como un elemento adicional a tener en cuenta en la eliminación de los epítopos de unión, las secuencias espaciadoras pueden insertarse entre dos epítopos que originan un epítopo de unión cuando se yuxtaponen.

Para corregir el problema de los epítopos de unión para los epítopos HTL, se inserta un espaciador de al menos cinco aminoácidos de longitud entre los dos epítopos. Los restos aminoacídicos que se incorporan en tal espaciador son preferentemente restos aminoacídicos que no se conoce que sean restos de anclaje primarios para ninguno de los motivos de unión HLA de Clase II. Tales restos incluyen G, P y N. En una resolución preferida, un espaciador con la secuencia GPGPG se inserta entre los dos epítopos. Un trabajo previo ha demostrado que el espaciador GP es particularmente eficaz en la interrupción de las interacciones de unión de Clase II [Sette et al., J. Immunol., 143:1268-73 (1989)]. Todos los motivos de unión humanos de Clase II conocidos y el IA^{b} de ratón (el de Clase II expresado por ratones transgénicos HLA) no toleran ni G ni P en estas posiciones de anclaje principales, que están a cuatro restos de separación. Este enfoque garantiza virtualmente que los epítopos restringidos a Clase II no puedan formarse como epítopos de unión.

En un ejemplo que valida esta consideración de diseño, se sintetizaron polipéptidos que incorporaban epítopos HTL derivados del HIV. Estos epítopos presentan en general reacciones cruzadas con epítopos de unión HLA DR. Se determinó entonces que estos epítopos también se unen eficientemente a moléculas murinas IA^{b} de Clase II. En la Fig. 2a se muestra un diagrama que ilustra los dos polipéptidos sintéticos diferentes que se consideraron.

La primera construcción incorpora cuatro epítopos diferentes colocados linealmente, mientras que la segunda construcción incorpora el espaciador GPGPG. También se sintetizaron los péptidos sintéticos que se correspondían con los tres epítopos de unión potenciales.

Se analizó la capacidad de 2 nanomoles de estas diferentes construcciones para sensibilizar para respuestas proliferativas contra los diversos epítopos en ratones positivos IA^{b}, y se comparó con las respuestas inducidas por cantidades equimolares de una combinación de los mismos péptidos (3 microgramos de cada péptido). En concreto, se inyectaron grupos de 3 ratones con emulsiones CFA, 11 días después de la inyección se cultivaron las células de sus ganglios linfáticos in vitro durante 3 días más, y se midió la incorporación de timidina en las últimas 24 horas del cultivo. Se encontró (Fig. 2b) que, como se predijo en base a su capacidad de unión a IA^{b} de alta afinidad, los cuatro epítopos indujeron buenas respuestas de proliferación. Se observaron valores del índice de estimulación (SI) en un intervalo de 4,9 a 17,9 cuando estos péptidos se inyectaban en combinación. No obstante, cuando se analizó el polipéptido lineal que incorporaba los mismos epítopos, se perdió la respuesta dirigida contra Pol 335. Esto se asoció con la aparición de una respuesta dirigida contra un epítopo de unión que abarcaba Gag 171 y Pol 335. El uso del espaciador GPGPG eliminaba este problema, presumiblemente por destrucción del epítopo de unión, y se recuperaba la respuesta Pol 335. Las respuestas que se observaron fueron de una magnitud similar a las que se observaron con la combinación de péptidos aislados.

Estos resultados demuestran que las respuestas contra múltiples epítopos de Clase II derivados del HIV pueden inducirse simultáneamente, y también ilustran cómo la reactividad cruzada IA^{b}/DR puede utilizarse para investigar la inmunogenicidad de diversas construcciones que incorporan epítopos candidatos HTL. Por último, demuestran que pueden emplearse espaciadores apropiados para interrumpir eficazmente los epítopos de unión de Clase II que de otro modo interferirían con una inmunogenicidad vacunal eficaz.

En el caso de las respuestas restringidas a Clase I, McMichael y colaboradores [Tussey et al., Immunity, Vol. 3(1):65-77 (1995)] presentaron un caso de epítopo de unión que se da naturalmente y la consiguiente inhibición de las respuestas epítopo-específicas. Para abordar el problema de los epítopos de unión para la Clase I, se pueden realizar análisis similares. Por ejemplo, se emplea un programa de ordenador específico para identificar epítopos de unión potenciales restringidos a Clase I, mediante exploración de motivos murinos seleccionados y de los motivos HLA A y B de Clase I humanos más comunes.

Pueden emplearse también secuencias espaciadoras de manera similar para evitar epítopos de unión CTL. Con frecuencia, restos muy pequeños tales como A o G se prefieren como restos espaciadores. G, también aparece con relativa poca frecuencia como resto de anclaje primario preferido (véase, por ejemplo, PCT/US00/24802) de un motivo de unión a HLA de Clase I. Estos espaciadores pueden variar en longitud, por ejemplo, las secuencias espaciadoras pueden ser típicamente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 restos aminoacídicos de longitud y son a veces más largas. Longitudes menores se prefieren a menudo debido a restricciones físicas en la generación de la construcción poliepitópica.

Influencia de las regiones flanqueantes en la inmunogenicidad de minigenes CTL

Otro factor a tener en cuenta al diseñar minigenes es la inserción de restos que favorezcan la inmunogenicidad en la posición flanqueante del extremo C-terminal de un epítopo CTL.

En este documento se describe la identificación de tales restos. Las regiones flanqueantes pueden, al menos en algunos casos, modular la presentación aparente de los epítopos CTL. No obstante, sólo se ha realizado hasta ahora un análisis limitado del efecto de la modulación de las regiones flanqueantes, y en todos los casos (salvo en el estudio de Ishioka, 1998) [Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)] los epítopos estaban restringidos al MHC del ratón. Esto es particularmente relevante ya que los motivos del MHC del ratón y humanos tienden a diferir en su extremo C-terminal y a su vez pueden estar influenciados de manera distinta por preferencias de escisión del proteasoma. Adicionalmente, pocos estudios, si hay alguno, han considerado las diferencias potenciales en la especificidad del procesamiento entre el proteasoma del ratón y el humano y/o las proteasas del ER. Por lo tanto, los experimentos que utilizan ratón contra epítopos humanos pueden producir diferentes resultados y "reglas" en lo que se refiere a los restos flanqueantes. En este documento se describen estudios que identifican restos que incrementan la inmunogenicidad y, por consiguiente, restos que se insertan en las construcciones poliepitópicas para optimizar la inmunogenicidad.

El contexto molecular en el que se expresaba un epítopo influenció a menudo drásticamente la frecuencia y/o la magnitud de la sensibilización de CTL específico para ese epítopo en ratones transgénicos HLA. Se muestran dos ejemplos en la Tabla 3.

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La inmunogenicidad del epítopo Core 18 del HBV expresado en el minigén pMin5 fue aproximadamente 200 veces menor en magnitud que la que se observó en el caso del minigén pMin1. De manera similar, la inmunogenicidad del epítopo Core 132 del HCV expresado en el contexto del minigén HCV1 fue marginal, con sensibilización de células T significativa demostrable en sólo 2 de los 12 diferentes experimentos/cultivos de CTL independientes que se realizaron. Estos dos experimentos positivos produjeron respuestas de aproximadamente 100 SU de IFN-\gamma. No obstante, cuando se expresó el mismo epítopo en el contexto del minigén HCV2, se observaron respuestas positivas en 17/18 casos, y con magnitudes medias aproximadamente cinco veces mayores.

Inmunogenicidad del HIV-FT en ratones transgénicos HLA-A *2021/K^{b}

Una vacuna HIV de ADN multiepítopo, HIV-FT (Fig. 3a) codifica 20 epítopos CTL derivados del HIV. De estos 20 epítopos, ocho están restringidos por HLA-A*0201, nueve por HLA-A*1101 y tres por HLA-B*070118. Todos los epítopos unían sus elementos de restricción pertinentes con buena afinidad. Todos los epítopos restringidos a HLA-A*0201 unían moléculas purificadas de HLA-A*0201 con afinidades aproximadamente similares, con valores de CI_{50} en el intervalo de 19-192 nM (Fig. 3a.). Los epítopos HLA*0201 elegidos para incluirlos en el HIV-FT son reconocidos por individuos infectados con HIV-1 y fueron también altamente eficaces en la sensibilización para respuestas de reclutamiento de CTL cuando se emulsionaron con IFA y se utilizaron para sensibilizar ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b}. La construcción se diseñó para que codificase los epítopos secuencialmente sin secuencias espaciadoras intermedias entre ellos y se fusionó una secuencia señal consenso Ig\kappa en el extremo 5' de la construcción para facilitar el transporte del antígeno codificado hacia el interior del retículo endoplasmático (Ishioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999).

La habilidad del HIV-FT para sensibilizar para respuestas de reclutamiento de CTL in vivo se evaluó mediante la inmunización intramuscular de ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b}. Los esplenocitos de los animales inmunizados con 100 \mug de ADN plasmídico del HIV-FT se estimularon con cada uno de los epítopos HLA-A*0201 codificados en el HIV-FT y se analizó su actividad de CTL péptido-específica después de seis días en cultivo. En la Fig. 4a se muestran respuestas representativas de CTL contra tres de los epítopos en el HIV-FT. Para recopilar de manera más conveniente los resultados de diferentes experimentos, los valores de porcentaje de citotoxicidad para cada cultivo de esplenocitos se expresaron en unidades líticas como se ha descrito anteriormente (Vitiello et al., J. Clin. Invest 95:341-349, 1995). De los ocho epítopos restringidos a HLA-A*0201 codificados en el HIV-FT, Pol 498, Env 134, Pol 448, Vpr 62, Nef 221, y Gag 271, sensibilizaron para respuestas de CTL después de la inmunización con ADN, (Fig. 4b). La magnitud de las respuestas de CTL varió en un intervalo de más de 10 veces, desde tanto como casi 50 LU contra Pol 498, hasta tan poco como 4 LU contra Nef 221 y Gag 271. De manera similar, la frecuencia de las respuestas de reclutamiento de CTL varió entre epítopos, con el epítopo Pol 498 induciendo respuestas en el 94% de los casos mientras que las respuestas de CTL contra Gag 271 se detectaron sólo en el 31% de los experimentos. En conclusión, la inmunización con ADN con el HIV-FT, que codifica los epítopos secuencialmente sin ningún aminoácido espaciador, produjo la inducción de respuestas de reclutamiento de CTL contra la mayoría de los epítopos analizados. No obstante, la magnitud y la frecuencia de las respuestas variaron enormemente entre epítopos.

Correlación entre la inmunogenicidad de los epítopos y los niveles de presentación de los epítopos del HIV-FT en líneas celulares transfectadas

Se evaluó entonces la inmunogenicidad diferencial de los epítopos HLA-A*0201 en el HIV-FT. Pudo excluirse una afinidad de unión diferencial a MHC ya que todos los epítopos unían HLA-A*0201 con gran afinidad (Fig. 3a). Adicionalmente, la falta de un repertorio adecuado de especificidades de TCR en ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b} pudo también excluirse, ya que todos los epítopos produjeron respuestas de CTL comparables después de la inmunización de ratones transgénicos HLA con el péptido preprocesado óptimo emulsionado en IFA. Variaciones en las cantidades relativas de cada epítopo presentadas para su reconocimiento por células T pueden justificar al menos en parte las diferencias en la inmunogenicidad de los epítopos.

Para analizar esto, células Jurkat, una línea de células T humanas, que expresan el gen HLA-A*0201/K^{b} (Vitiello et al., J. Exp. Med. 173, 1007-1015, 1991) se transfectaron con el HIV-FT expresado en un vector episomal. Se seleccionó para su uso una línea celular humana para eliminar cualquier posible artefacto que pudiera estar asociado con diferencias en las capacidades de procesamiento entre humanos y ratones. Esta línea celular transfectada compara la presentación de MHC con las capacidades de procesamiento de antígenos y proporciona un soporte posible para el posterior desarrollo de vacunas de ADN basadas en epítopos CTL para su uso en humanos.

Líneas de CTL péptido-específicas detectaron presentación en las dianas transfectadas de cuatro de los epítopos HLA-A*0201 codificados en el HIV-FT, Pol498, Env 134, Pol 448 y Nef 221. Para cuantificar el nivel al cual se producía y presentaba cada uno de estos epítopos, las líneas de CTL específicas para los diversos epítopos se incubaron con dianas no transfectadas y cantidades variables de cada epítopo. Estas curvas de dosis-respuesta de CTL se utilizaron como curvas patrón para determinar la concentración de péptido que induce niveles de secreción de IFN-\gamma equivalentes a los observados en respuesta a las células diana transfectadas con HIV-FT. Se hace referencia a este valor como "dosis de equivalentes peptídicos" y se toma como una medida relativa de la cantidad de péptido presentado en la célula transfectada.

La Tabla 5 resume los descubrimientos de este análisis para siete de los epítopos de HLA-A*0201 codificados en el HIV-FT. Las dosis de equivalentes peptídicos variaron desde los 33,3 ng/ml para Nef 221 hasta menos de 0,4 ng/ml equivalentes peptídicos para los epítopos Gag 271, Gag 386 y Pol 774. En su conjunto, estos resultados indican que en las líneas celulares humanas transfectadas con el HIV-FT existe al menos una variación de 100 veces en los niveles de presentación de los diferentes epítopos restringidos a HLA-A*0201. Todos los epítopos que se presentaron a niveles detectables en los ensayos de antigenicidad fueron también inmunogénicos in vivo. El único epítopo que fue inmunogénico y no antigénico fue Gag 271. En este caso la inmunización de ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b} con HIV-FT indujo una respuesta débil de CTL en menos de la tercera parte de los cultivos analizados. Los otros dos epítopos, que se presentaron por debajo de los límites de sensibilidad para los análisis de antigenicidad, Gag 386 y Pol 774, fueron no inmunogénicos. En conclusión estos resultados sugieren que la heterogenicidad en las respuestas de CTL inducidas por la inmunización con HIV-FT puede atribuirse al menos en parte a la presentación subóptima de los epítopos.

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TABLA 5 Comparación de la inmunogenicidad y antigenicidad de HIV-FT

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Los aminoácidos flanqueantes influyen en la inmunogenicidad de epítopos CTL in vivo después de la vacunación

Como se describe en este documento, los aminoácidos concretos que flanquean epítopos CTL particulares son uno de los factores que influencian la eficacia con la que un epítopo se procesa mediante la alteración de la susceptibilidad del antígeno a la escisión proteolítica. Para examinar la influencia de los aminoácidos flanqueantes en la inmunogenicidad de los epítopos, se obtuvieron datos de inmunogenicidad de ratones transgénicos HLA-A*0201, HLA-A*1101 y HLA-B*0701 inmunizados con varias construcciones de ADN multiepítopo experimentales no relacionadas que codifican epítopos CTL mínimos sin secuencias intermedias. Se compiló una base de datos que representaba 94 combinaciones diferentes epítopo/resto flanqueante para determinar la posible influencia de los aminoácidos inmediatamente flanqueantes en la inmunogenicidad de los epítopos. Una combinación dada de epítopo y aminoácido flanqueante se incluía una única vez para evitar sesgos artificiales del análisis debidos a redundancias. La inmunogenicidad de los epítopos en transgénicos HLA se consideraba óptima si era superior a 100 SU o 20 LU en al menos el 30% de los cultivos medidos. Las respuestas de CTL se valoraron y se clasificaron típicamente en una de cuatro categorías: (+++), excepcional - más de 200 LU o 1000 SU; (++), buena - 20-200 LU o 100-1000 SU; (+), intermedia - de 2 a 20 LU o de 10 a 100 SU; y (+/-), débil o negativa - menos de 2 LU o 10 SU. Los números de respuestas óptimas contra respuestas subóptimas se categorizaron en base al tipo químico del aminoácido en las posiciones flanqueantes y la significación de las diferencias se determinó mediante un ensayo de chi-cuadrado.

Este análisis no encontró ninguna asociación entre el tipo de aminoácidos presentes en el extremo amino-terminal de un epítopo y su inmunogenicidad. Sin embargo, se identificaron efectos significativos del resto flanqueante del extremo carboxilo-terminal, el resto C+1. Los aminoácidos cargados positivamente, K o R se asociaron más frecuentemente con respuestas de CTL óptimas, con una frecuencia del 68% (Fig. 5). La presencia de los aminoácidos N y Q en el resto C+1 también se asoció con respuestas de CTL fuertes en el 55,5% de los casos que se examinaron; cuando los epítopos estaban flanqueados en la posición C+1 por N, indujeron respuestas de CTL óptimas en 3/4 casos. Por lo general, restos pequeños como C, G, A, T y S promovieron respuestas de CTL intermedias induciendo respuestas fuertes en el 54% de las combinaciones disponibles para el análisis. Por el contrario, los epítopos flanqueados por aminoácidos aromáticos y alifáticos indujeron respuestas óptimas in vivo en sólo el 36% y el 17% de los casos, respectivamente. El resto cargado negativamente, D, produjo una respuesta de CTL subóptima. Se descubrió que la influencia del aminoácido C+1 en la inmunogenicidad de los epítopos era estadísticamente significativa mediante un ensayo de chi-cuadrado (P<0,03). No se observó una influencia significativa en la inmunogenicidad de los epítopos cuando se realizó un análisis similar para los restos C-terminales más distales que la posición C+1.

Evaluación directa del efecto del resto C+1 en la inmunogenicidad de los epítopos

Para evaluar directamente el efecto de tipos de aminoácidos preferidos contra perjudiciales en la posición flanqueante C+1, también se evaluaron dos construcciones multiepítopo, que se conocen como HBV.1 y HBV.2 (Fig. 3b). Como con el HIV-FT, estas construcciones del HBV codifican los epítopos secuencialmente sin espaciadores intermedios. De hecho, HBV.1 y HBV.2 se generaron por reemplazo de los epítopos de HIV-1 en el pMin1, una construcción multiepítopo experimental caracterizada anteriormente (Ishioka, supra) con epítopos similares derivados del HBV.

Para HBV.1, el epítopo del HIV-1 directamente siguiente al epítopo altamente inmunogénico Core 18 del HBV se reemplazó con el epítopo Pol 562 del HBV. Esto alteraba el resto C+1 de una K a una F. La segunda construcción, HBV.2, se produjo mediante la inserción de un epítopo adicional, el Pol 629 del HBV, entre los epítopos Core 18 y Pol 562 del HBV; un cambio que reemplazaba el aminoácido C+1 por un resto K. Cuando se evaluó la inmunogenicidad del epítopo Core 18 presentado en estos diferentes contextos en ratones transgénicos HLA-A*0201/K^{b}, se determinó que el epítopo Core 18 era virtualmente no inmunogénico en el HBV.1 pero fuertemente inmunogénico en el HBV.2 (Fig. 6a). La reducción de la inmunogenicidad in vivo para este epítopo fue como se predijo por los análisis previos.

Para analizar adicionalmente los efectos del aminoácido flanqueante de C1 en la inmunogenicidad del epítopo CTL, se evaluó un conjunto de construcciones que difieren del HBV.1 en la inserción de aminoácidos simples en la posición C+1 relativa al epítopo Core 18 (Fig. 3c). Se observó poca o ninguna respuesta de CTL contra el epítopo Core 18 cuando estaba flanqueado en la posición C+1 por W, Y o L (Fig. 6b). Por el contrario, la inserción de un único resto K incrementaba drásticamente la respuesta de CTL al Core 18. Las respuestas eran comparables a las observadas en el HBV.2 en el que el epítopo Core 18 está flanqueado por Pol 629, un epítopo que tiene una K en el extremo N-terminal del epítopo. Un aumento de la respuesta de CTL al Core 18 se observó también con la inserción de R, C, N o G. El efecto de estas inserciones es específico, ya que la inmunogenicidad de otros epítopos contenidos en estas construcciones no mostró cambios significativos en sus respuestas de CTL (los datos no se muestran). En conclusión, estos datos indican que el aminoácido C+1 puede influenciar drásticamente la inmunogenicidad del epítopo.

Variaciones en la inmunogenicidad del epítopo CTL se correlacionan con la cantidad que se presenta

Si la variación de la inmunogenicidad del Core 18 que se asociaba con diferentes restos C+1 era el resultado de una sensibilidad diferencial a la escisión proteolítica, entonces deberían poder detectarse grandes diferencias en los niveles de presentación de los epítopos en las diferentes construcciones. Para analizar esto, se transfectaron células Jurkat, que expresan el mismo gen HLA-A*0201/K^{b} que se expresa en los ratones transgénicos 20, con un vector episomal que expresaba HBV.1 o bien HBV.1K. El epítopo Core 18 se presentaba a niveles >10^{5} mayores cuando había una K en la posición C+1, en comparación con la presencia de una F en la misma posición (Fig.7). Es poco probable que esta diferencia en la presentación del Core 18 se atribuya a diferencias en la expresión génica entre las líneas celulares diana, ya que la presentación de Pol 455 varió menos de diez veces. Estos datos demuestran el acusado efecto que los aminoácidos en la posición C+1 pueden ejercer sobre la eficacia de la presentación de los epítopos en las vacunas de ADN multiepítopo. De este modo, estos datos demuestran que la inmunogenicidad de los epítopos CTL en una vacuna de ADN puede optimizarse a través de consideraciones de diseño que afectan al nivel de la presentación de los epítopos. Este tipo de optimización es aplicable a vacunas basadas en epítopos que se administran utilizando otros formatos, tales como vectores virales así como otros vectores de expresión conocidos por los especialistas en la técnica, ya que los efectos se ejercen después de que el antígeno es transcrito y traducido.

En resumen, para los restos flanqueantes, se encontró que tanto restos muy pequeños como A, C o G, como restos grandes como A, W, K, o R se asociaban en general con respuestas buenas o excepcionales. La ausencia de un resto C+1 debido a un codón de parada en el minigén, o la presencia de restos de tamaño intermedio como S o T se asoció con un patrón de respuesta más intermedio. Por último, en el caso del resto cargado negativamente, D; restos alifáticos (V, I, L, M) o restos aromáticos distintos del triptófano (Y, F), se observaron respuestas relativamente escasas. Estos resultados demuestran que el resto concreto que flanquea al extremo C-terminal del epítopo puede influenciar drásticamente la frecuencia y la magnitud de la respuesta. Pueden también introducirse restos flanqueantes en la posición C+1 en combinación con secuencias espaciadoras. De este modo, un resto que favorezca la inmunogenicidad, preferiblemente, K, R, N, A o G, se incluye como resto flanqueante de un espaciador.

Clasificación y optimización de las construcciones poliepitópicas

Para desarrollar construcciones poliepitópicas de acuerdo con la invención, los epítopos a incluir en la construcción poliepitópica se clasifican y optimizan usando los parámetros que se definen en este documento. La clasificación y la optimización pueden realizarse utilizando un ordenador o, para números menores de epítopos, sin un ordenador.

La optimización por ordenador puede realizarse típicamente como sigue. A continuación se aporta un ejemplo de un sistema informático que identifica y optimiza, es decir, proporciona las combinaciones de epítopos con el menor número de epítopos de unión, y el máximo número de restos flanqueantes.

Un componente de la clasificación de epítopos es un "Junctional Analyzer". Este programa, por ejemplo, utiliza un archivo de texto para especificar los parámetros para esta operación. Se le proporcionan al programa cinco tipos de datos de entrada: 1) Un conjunto de péptidos para procesar. 2) Un conjunto de valores para cada aminoácido cuando aparece en una posición C+1 y N-1. 3) Un conjunto de motivos para usar en la detección de uniones. 4) El número máximo de aminoácidos a insertar entre cada par de péptidos. 5) Otros valores para controlar el funcionamiento del programa. El programa evalúa todas las parejas posibles de péptidos y calcula el número de uniones, los valores de C+1 y N-1 y los combina de acuerdo con una ecuación predefinida. Actualmente la ecuación es exactamente el producto de los dos valores dividido por el número de uniones. Si el número de uniones es igual a cero el producto se divide por 0,5. Pueden añadirse fácilmente al programa otras ecuaciones para la evaluación de las parejas de péptidos en cualquier momento. El resultado de salida de este programa es un archivo de texto que enumera para cada pareja de péptidos la inserción que produce el resultado máximo de la función. El archivo también incluye la lista original de péptidos y comandos que controlan el funcionamiento de cualquiera de los dos programas que realizan la siguiente etapa del procesamiento. Estos dos programas son "Exhaustive J Search" y "Stochastic J Search".

"Exhaustive J Search" examina todas las permutaciones de péptidos y selecciona las que tengan la suma mayor como resultado de la función. Este programa encuentra la permutación con el mayor resultado de la función. No obstante, debido a la naturaleza factorial de las permutaciones, puede usarse tan sólo para un máximo de 12 ó 13 péptidos. El tiempo estimado de ejecución para 13 péptidos es de 2,9 horas y sería de aproximadamente 40 horas para 14 péptidos. "Stochastic J Search" se diseñó para examinar muchas áreas de la secuencia de permutación e informar del mejor resultado de la función que encuentre. Al informar sólo de las permutaciones que alcancen o excedan el actual total máximo de la función, es posible examinar un área mucho más amplia de la secuencia de permutación. Esta técnica ha tenido éxito hasta con 20 péptidos. El tiempo para realizar un examen exhaustivo de 20 péptidos sería del orden de 1,3 \times 10^{5} años.

El programa puede funcionar como sigue:

Estos son los parámetros que se introducen en el programa:

1.: Los epítopos a clasificar.

2.: Los "valores" de los aminoácidos C+1 y N-1, como se describe arriba.

3.: Los motivos para la detección de epítopos de unión.

4.: El máximo de restos espaciadores.

5.: Parámetros para controlas las opciones del programa.

El programa "Junctional Analyzer" entonces realiza lo siguiente:

1.: Genera todas las parejas de epítopos.

2.: Para cada pareja de epítopos, determina el conjunto de inserciones que tienen como resultado el menor número de epítopos de unión y el máximo efecto de contribución de los restos espaciadores C+1 y N-1.

3.: Obtiene como resultado los restos espaciadores óptimos para cada pareja y el valor de la optimización de la unión.

Si han de incluirse 14 o más epítopos en una construcción poliepitópica, se utiliza el Stochastic Search. Un programa de Stochastic Search utiliza una técnica Monte Carlo, conocida por los especialistas en la técnica, para examinar muchas regiones en el espacio de permutación para encontrar la mejor estimación de la colocación óptima de los péptidos.

Si han de incluirse menos de 14 epítopos, se usa un programa de Exhaustive Search. El programa de Exhaustive Search examina todas las permutaciones de los epítopos componiendo la construcción poliepitópica para encontrar la que tenga el mejor valor para el resultado de la función de optimización para todas las parejas de epítopos. Se garantiza que se encuentra la "mejor" permutación ya que se examinan todas.

El Resultado de Salida del Programa proporciona una lista de las mejores colocaciones de los epítopos. Dado que hay muchas permutaciones que tienen el mismo valor de la función de evaluación se generan varias para que puedan tenerse en cuenta otros factores al escoger la colocación óptima.

En la Figura 9 se aportan ejemplos de construcciones poliepitópicas generadas utilizando este sistema de programa de análisis.

Otros factores como la distribución de cargas, el análisis de regiones hidrófobas/hidrófilas, o la predicción de plegamiento pueden también incorporarse en la función de evaluación para optimizar adicionalmente las construcciones minigén.

Las estructuras macromoleculares tales como las estructuras polipeptídicas pueden describirse en cuanto a diversos niveles de organización. Para una discusión general de esta organización, véase, por ejemplo, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3ª ed., 1994) y Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). "Estructura primaria" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un péptido concreto. "Estructura secundaria" se refiere a las estructuras tridimensionales localmente ordenadas dentro de un polipéptido. Estas estructuras se conocen comúnmente como dominios. Los dominios son porciones de un polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido. Los dominios típicos están hechos de secciones de menor organización como tramos de láminas-\beta y hélices-\alpha. "Estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero peptídico. "Estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes.

Las predicciones estructurales tales como la distribución de cargas, el análisis de las regiones hidrófobas/hidrófilas, o las predicciones de plegamientos pueden realizarse utilizando programas de análisis de secuencias conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, pueden identificarse los dominios hidrófobos e hidrófilos (véase, por ejemplo, Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982) y Stryer, Biochemistry (3ª ed. 1988); véase también cualquiera de varios programas de análisis de secuencia basados en Internet, como los que se encuentran en dot.imgen.bcm.tmc.edu).

También puede generarse un modelo estructural tridimensional de una construcción poliepitópica. Esto generalmente se realiza mediante la introducción de la secuencia aminoacídica a analizar en un sistema informático. La secuencia aminoacídica representa la secuencia primaria o subsecuencia de la proteína, que codifica la información estructural de la proteína. El modelo tridimensional estructural de la proteína se genera entonces mediante la interacción del sistema informático, utilizando el software conocido por los especialistas en la técnica.

La secuencia de aminoácidos representa una estructura primaria que codifica la información necesaria para formar las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína de interés. El software examina ciertos parámetros codificados en la secuencia primaria para generar el modelo estructural. Se hace referencia a estos parámetros como "términos de energía", y esencialmente incluyen los potenciales electrostáticos, los potenciales hidrófobos, las superficies accesibles por el disolvente, y los enlaces de hidrógeno. Los términos de energía secundarios incluyen los potenciales de van der Waals. Las moléculas biológicas forman las estructuras que minimizan los términos de energía de un modo acumulativo. El programa de ordenador está, por lo tanto, utilizando estos términos codificados por la estructura primaria o secuencia aminoacídica para generar el modelo estructural secundario.

La estructura terciaria de la proteína codificada por la estructura secundaria se forma entonces en base a los términos de energía de la estructura secundaria. El usuario puede introducir variables adicionales tales como si la proteína está unida a membrana o soluble, su localización en el cuerpo, y su localización celular, por ejemplo, citoplasmática, superficial, o nuclear. Estas variables, junto con los términos de energía de la estructura secundaria, se utilizan para formar el modelo de la estructura terciaria. Cuando se modela la estructura terciaria, el programa de ordenador empareja las caras hidrófobas de la estructura secundaria con similares, y las caras hidrófilas de la estructura secundaria con similares.

Se seleccionan entonces las construcciones poliepitópicas que estén más fácilmente accesibles para el aparato de procesamiento de HLA.

II. Evaluación de la inmunogenicidad de las vacunas multiepitópicas

El desarrollo de minigenes multiepítopo representa un desafío único, debido a la especificidad de especie de la unión peptídica a MHC. Diferentes tipos de MHC de diferentes especies tienden a unir diferentes conjuntos de péptidos [Rammensee et al., Immunogenetics, Vol. 41(4):178-228 (1995)]. Como consecuencia, no es posible analizar en animales de laboratorio normales una construcción compuesta por epítopos humanos. En general hay alternativas disponibles para superar esta limitación. Éstas incluyen: 1) el ensayo de construcciones análogas que incorporen epítopos restringidos por MHC no humano; 2) la confianza en epítopos de control restringidos por MHC no humano; 3) la confianza en la reactividad cruzada entre MHC humano y no humano; 4) el uso de animales transgénicos HLA; y 5) los ensayos de antigenicidad que utilizan células humanas in vivo. A continuación se ofrece una breve visión general del desarrollo de la tecnología para analizar la antigenicidad y la inmunogenicidad.

Transgénicos HLA de Clase I

Se ha establecido la utilidad de los ratones transgénicos HLA con el propósito de la identificación de epítopos [Sette et al., J Immunol, Vol. 153 (12):5586-92 (1994); Wentworth et al., Int Immunol, Vol. 8(5):651-9 (1996); Engelhard et al., J Immunol, Vol. 146(4):1226-32 (1991); Man et al., Int Immunol, Vol. 7(4):597-605 (1995); Shirai et al., J Immunol, Vol.154(6):2733-42 (1995)], y del desarrollo de vacunas [Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)]. La mayoría de los informes publicados han investigado el uso de los ratones HLA A*0201/K^{b} pero debe señalarse que los ratones B*27, y B*3501 también están disponibles. Adicionalmente, también se han generado ratones HLA A*11/K^{b} [Alexander et al., J Immunol, Vol. 159(10):4753-61 (1997)], y HLA B7/K^{b} y HLA A1/K^{b}.

Los datos de 38 diferentes epítopos potenciales se analizaron para determinar el nivel de solapamiento entre el repertorio de CTL restringido a A2.1 de los ratones transgénicos A2.1/K^{b} y el de los humanos A2.1+ [Wentworth et al., Eur J Immunol, Vol. 26 (1):97-101 (1996)]. Tanto en humanos como en ratones, un umbral de afinidad de unión peptídica a MHC de aproximadamente 500 nM se correlaciona con la capacidad de un péptido para desencadenar una respuesta de CTL in vivo. Se observó un alto nivel de concordancia entre los datos humanos in vivo y los datos de ratón in vivo para el 85% de los péptidos de alta unión, el 58% de los de unión intermedia, y el 83% de los de unión baja/negativa. Se obtuvieron también resultados similares con ratones transgénicos HLA A11 y HLA B7 [Alexander et al., J Immunol, Vol. 159(10):4753-61 (1997)]. Por lo tanto, debido al gran solapamiento que existe entre los repertorios de receptores de células T del ratón transgénico HLA y los CTL humanos, los ratones transgénicos son valiosos para la evaluación de la inmunogenicidad de las construcciones poliepitópicas que se describen en este
documento.

Las diferentes especificidades del transporte TAP en lo que se refiere a los ratones HLA A11 no impide el uso de ratones transgénicos HLA-A11 para la evaluación de la inmunogenicidad. Mientras que tanto el TAP murino como el humano transportan eficazmente péptidos con un extremo hidrófobo, sólo se ha descrito para el TAP humano que transporte eficazmente péptidos con extremos C terminales cargados positivamente, tales como los unidos por A3, A11 y otros miembros del supertipo A3. Esta preocupación no se aplica a A2, A1 o B7 porque tanto el TAP murino como el humano, deberían ser igualmente capaces de transportar péptidos unidos por A2, B7 o A1. En concordancia con este conocimiento, Vitiello [Vitiello et al., J Exp Med, Vol. 173(4):1007-15 (1991)] y Rotzschke [Rotzschke O, Falk K, Curr Opin Immunol, Vol. 6(1):45-51 (1994)] sugirieron que el procesamiento es similar en células de ratón y humanas, mientras que Cerundolo [Rotzschke O, Falk K, Curr Opin Immunol, Vol. 6(1):45-51 (1994)] sugirió diferencias entre células murinas y células humanas, que expresaban ambas moléculas HLA A3. No obstante, usando transgénicos HLA A11, se ha observado expresión de moléculas HLA en células T y B in vivo, sugiriendo que la especificidad desfavorable descrita para el TAP murino no impide la estabilización y el transporte de las moléculas A11/K^{b} in vivo [Alexander et al., J Immunol, Vol. 159(10):4753-61 (1997)]. Estos datos están de acuerdo con la observación previa de que los péptidos con extremos C-terminales cargados podían eluirse de células murinas transfectadas con moléculas A11 [Maier et al., Immunogenetics; Vol. 40(4):306-8 (1994)]. Se han detectado también respuestas de ratones HLA A11 contra antígenos complejos, tales como influenza, y lo que es más importante, contra epítopos restringidos a A11 codificados por minigenes multiepítopo [Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)]. De este modo, la cuestión de TAP parece ser una preocupación menor con ratones transgénicos.

Otra cuestión de relevancia potencial en el uso de ratones transgénicos HLA es la posible influencia de la \beta2 microglobulina en la expresión de HLA y su especificidad de unión. Se conoce bien que la \beta2 humana une MHC tanto humano como de ratón con una afinidad y una estabilidad más altas que la \beta2 microglobulina de ratón [Shields et al., Mol Immunol, Vol. 35(14-15):919-28 (1998)]. Se conoce bien también que complejos más estables de cadena pesada MHC y \beta2 facilitan la carga exógena del MHC de Clase I [Vitiello et al., Science, Vol. 250(4986):1423-6 (1990)]. Se ha examinado el efecto potencial de esta variable mediante la generación de ratones que son dobles transgénicos para HLA/K^{b} y para la \beta2 humana. La expresión de \beta2 humana fue beneficiosa en el caso de los ratones HLA B7/K^{b}, y fue absolutamente esencial para alcanzar unos buenos niveles de expresión en el caso de los ratones transgénicos HLA A1. De acuerdo con esto, los ratones dobles transgénicos HLA/K^{b} y \beta2 se crían y utilizan actualmente de manera rutinaria por los presentes inventores. Por lo tanto, los ratones transgénicos HLA pueden utilizarse para modelar el reconocimiento restringido a HLA de cuatro especificidades HLA principales (es decir, A2, A11, B7 y AI) y pueden desarrollarse ratones transgénicos para otras especificidades de HLA como modelos adecuados para la evaluación de la inmunogenicidad.

Análisis de antigenicidad para epítopos de Clase I

Varias líneas de experimentación independientes indican que la densidad de complejos peptídicos de Clase I en la superficie celular puede correlacionarse con el nivel de sensibilización de células T. De este modo, la medición de los niveles a los que se genera y se presenta un epítopo en la superficie de una APC proporciona una vía para evaluar indirectamente la potencia de las vacunas minigén en células humanas, in vitro. Como complemento del uso de ratones transgénicos HLA de Clase I, este enfoque tiene la ventaja de examinar el procesamiento en células humanas. [Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)].

Hay disponibles varios procedimientos posibles para cuantificar experimentalmente péptidos procesados. La cantidad de péptido en la superficie celular puede cuantificarse mediante la medición de la cantidad de péptido que se eluye de la superficie de las APC [Sijts et al., J Immunol, Vol. 156(2):683-92 (1996); Demotz et al., Nature, Vol. 342(6250):682-4 (1989)]. Alternativamente, el número de complejos péptido-MHC puede estimarse mediante la medición de la cantidad de lisis o de liberación de linfoquinas inducida por células diana infectadas o transfectadas, y entonces determinando la concentración de péptido necesaria para obtener niveles equivalentes de lisis o de liberación de linfoquinas [Kageyama et al., J Immunol, Vol. 154(2):567-76 (1995)].

Un enfoque similar se ha utilizado también para medir la presentación de epítopos en líneas celulares transfectadas con minigenes. En concreto, construcciones minigén que son inmunogénicas en ratones transgénicos HLA se procesan también en epítopos óptimos por células humanas transfectadas con el mismo minigén, y la magnitud de la respuesta que se observa en ratones transgénicos se correlaciona con la antigenicidad que se observa en las células diana humanas transfectadas [Ishioka et al., J Immunol, Vol.162(7):3915-25 (1999)].

Usando ensayos de antigenicidad, se pueden transfectar varios minigenes relacionados que difieran en el orden de los epítopos o en los restos flanqueantes en APC y puede evaluarse el impacto de las variables anteriormente mencionadas en la presentación de los epítopos. Éste puede ser un sistema preferido para el análisis cuando deben evaluarse un número relativamente grande de construcciones diferentes. Aunque requiere un gran número de protocolos de CTL epítopo-específicos que permitan la generación de líneas CTL altamente específicas [Alexander-Miller et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 93(9):4102-7 (1996)] y también su expansión hacia grandes números [Greenberg P.D., Ridell S.R., Science, Vol. 285(5427):546-51 (1999)], se ha desarrollado para abordar este problema potencial.

También debe tenerse en cuenta que, si la célula seleccionada para la transfección no es reflejo del funcionamiento de la función de APC in vivo, pueden obtenerse resultados erróneos. Células del linaje de células B, que se conocen como APC "profesionales", se emplean típicamente como destinatarias de la transfección. El uso de células B transfectadas de este tipo es una práctica aceptada en el campo. Adicionalmente, se ha señalado ya una buena correlación entre los datos in vitro utilizando células B humanas transfectadas y los resultados in vivo utilizando ratones transgénicos HLA, como se describe con más detalle en este documento.

Medición de las respuestas de HTL

En realizaciones preferidas, las construcciones vacunales están optimizadas para inducir respuestas inmunes restringidas a Clase II. Un método para evaluar las construcciones poliepitópicas que incluyen epítopos de Clase II, es usar ratones transgénicos HLA-DR. Varios grupos han producido y caracterizado ratones transgénicos HLA-DR [Taneja V., David C.S., Immunol Rev, Vol. 169:67-79 (1999)].

También existe una alternativa que depende de la reactividad cruzada entre ciertas moléculas MHC humanas y moléculas MHC concretas expresadas por animales de laboratorio. Bertoni y colaboradores [Bertoni et al., J Immunol, Vol. 161(8):4447-55 (1998)] han señalado que puede demostrarse una reactividad cruzada apreciable entre ciertos supertipos HLA de Clase I y ciertas moléculas PATR expresadas por chimpancés. También se ha señalado reactividad cruzada entre humanos y macacos a nivel de moléculas de Clase II [Geluk et al., J Exp Med, Vol. 177(4):979-87 (1993)] y de Clase I [Dzuris et al., J. Immunol., julio 1999]. Por último, también puede señalarse que el motivo reconocido por el supertipo HLA B7 humano es esencialmente el mismo que el reconocido por el L^{d} de Clase I murino [Rammensee et al., Immunogenetics, Vol. 41(4):178-228 (1995)]. De relevancia para el análisis de los epítopos restringidos a HLA DR en ratón, Wall et al han demostrado [Wall et al., J Immunol, 152:4526-36 (1994)] que existen similitudes entre los motivos DR1 y IA^{b}. Nuestros ratones transgénicos se crían rutinariamente para sacar provecho de esta similitud fortuita. Adicionalmente, se ha demostrado que la mayoría de nuestros péptidos se unen a IA^{b}, por lo que se usan estos ratones para el estudio de la inmunogenicidad de CTL y HTL.

Medición y cuantificación de las respuestas inmunes de muestras clínicas

Un elemento crucial para evaluar el funcionamiento de una vacuna es evaluar su capacidad de inducir respuestas inmunes. Los análisis de las respuestas de CTL y HTL contra el inmunógeno, así como contra antígenos comunes de recuerdo son comúnmente usados y conocidos en la técnica. Los ensayos que se emplean incluyen la liberación de cromo, la secreción de linfoquinas y los ensayos de linfoproliferación.

Técnicas más sensibles como el ensayo ELISPOT, la tinción intracelular de citoquinas, y la tinción de tetrámeros se han convertido en ensayos disponibles en la técnica. Se estima que estos métodos más nuevos son de 10 a 100 veces más sensibles que los ensayos corrientes de CTL y HTL [Murali-Krishna et al., Immunity, Vol. 8(2):177-187 (1998)], porque los métodos tradicionales miden sólo el subconjunto de células T que pueden proliferar in vitro, y pueden, de hecho, ser representativas de sólo una fracción del compartimento de células T de memoria [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol. 10(4):393-6 (1998)]. Específicamente en el caso del HIV, estas técnicas se han usado para medir respuestas de CTL antígeno-específicas en pacientes en los que fueron indetectables con las técnicas anteriores [Ogg et al., Science, Vol. 279(5359):2103-6 (1998); Gray et al., J Immunol, Vol. 162(3):1780-8 (1999); Ogg et al., J Virol, Vol. 73(11):9153-60 (1999); Kalams et al., J Virol, Vol. 73(8):6721-8 (1999); Larsson et al., AIDS, Vol. 13(7):767-77 (1999); Corne et al., J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol, Vol. 20(5):442-7 (1999)].

Con relativamente pocas excepciones, la actividad directa de células recién aisladas ha sido difícil de demostrar por medio de los ensayos tradicionales [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol. 10(4):393-6 (1998)]. Sin embargo, la sensibilidad aumentada de las técnicas más nuevas ha permitido a los investigadores detectar respuestas de células recién aisladas de humanos infectados o animales de experimentación [Murali-Krishna et al., Immunity, Vol. 8(2):177-87 (1998); Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol. 10(4):393-6 (1998)]. La disponibilidad de estos ensayos sensibles, que no dependen de una etapa de reestimulación in vitro, ha facilitado enormemente el estudio de la función de CTL en infecciones naturales y cáncer. Por el contrario, los ensayos que se utilizan como criterios de valoración para juzgar la eficacia de las vacunas experimentales se realizan normalmente en conjunción con una o más etapas de reestimulación in vitro. [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol. 10(4):393-6 (1998)]. De hecho, con pocas excepciones [Hanke et al., Vaccine, Vol. 16(4):426-35 (1998)] (Allen et al., enviado), ha sido difícil demostrar células T CD8+ restringidas a Clase I recién aisladas en respuesta a la inmunización con vacunas experimentales diseñadas para provocar respuestas de CTL. El uso de ensayos sensibles, tales como el ELISPOT o el ELISA de IFN-\gamma in situ, se ha combinado con una etapa de reestimulación para alcanzar la sensibilidad máxima; también se utilizan para este propósito tetrámeros de MHC.

Los tetrámeros de MHC se describieron por primera vez en 1996 por Altman y colaboradores. Produjeron moléculas solubles HLA-A2 de Clase I que se plegaron con péptidos específicos de HIV que contenían un epítopo CTL formando complejos de tetrámeros marcados con marcadores fluorescentes. Estos se usan para marcar poblaciones de células T de individuos infectados con HIV que reconozcan al epítopo [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol. 10(4):393-6 (1998)]. Estas células se cuantificaron entonces mediante citometría de flujo, proporcionando una medición de la frecuencia para las células T que son específicas para el epítopo. Esta técnica se ha vuelto muy popular en la investigación del HIV así como en otras enfermedades infecciosas [Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol. 10(4):393-6 (1998); Ogg et al., Science, Vol. 279(5359):2103-6 (1998); Gray et al., J Immunol, Vol. 162(3):1780-8 (1999); Ogg et al., J Virol, Vol. 73(11):9153-60 (1999); Kalams et al., J Virol, Vol. 73(8):6721-8 (1999)]. No obstante, el polimorfismo de HLA puede limitar la aplicabilidad general de esta técnica, en cuanto que la tecnología de tetrámeros depende de combinaciones definidas HLA/péptido. Sin embargo, se ha visto que una variedad de péptidos, incluyendo péptidos derivados del HIV, son reconocidos por líneas de CTL péptido-específicas en el contexto de diferentes miembros de los supertipos A2, A3 y B7 [Threlkeld et al., J Immunol, Vol 159(4):1648-57 (1997); Bertoni et al., J Clin Invest, Vol. 100(3):503-13 (1997)]. Estas observaciones en conjunto demuestran que un receptor de célula T (TCR) para una combinación dada de MHC/péptido puede tener una afinidad detectable por ese mismo péptido presentado por una molécula MHC diferente del mismo supertipo.

En las circunstancias en las que la eficacia de una vacuna profiláctica está correlacionada esencialmente con la inducción de una respuesta de memoria de larga duración, los ensayos de reestimulación pueden ser las mediciones más apropiadas y sensibles para monitorizar las respuestas inmunológicas inducidas por vacunas. Por el contrario, en el caso de las vacunas terapéuticas, la correlación principal de la actividad inmunológica puede ser la inducción de la función efectora de las células T, que se mide más apropiadamente mediante ensayos primarios. Por lo tanto, el uso de ensayos sensibles tiene en cuenta la estrategia de análisis más apropiada para la monitorización inmunológica de la eficacia de una vacuna.

Antigenicidad de minigenes multiepítopo en APC transfectadas humanas

Se realizan ensayos de antigenicidad para evaluar el procesamiento y la presentación de epítopos en células humanas. Se usa un vector episomal para transfectar eficazmente células diana humanas con vacunas minigén basadas en epítopos para realizar un análisis de este tipo.

Por ejemplo, células diana 221 A2K^{b} se transfectaron con una vacuna minigén HTV-1. La célula diana 221 A2K^{b} expresa el gen A2K^{b} que se expresa en los ratones transgénicos HLA, pero no expresa Clase I endógeno [Shimizu Y, DeMars R, J Immunol, Vol. 142(9):3320-8 (1989)]. Se analizó la capacidad de estas células transfectadas para presentar el antígeno a líneas de CTL obtenidas de ratones transgénicos HLA y específicas para varios epítopos CTL derivados del HIV. Para corregir diferencias en la sensibilidad a antígenos de diferentes líneas de CTL, se realizaron en paralelo titulaciones de la dosis peptídica usando células no transfectadas como APC. Se presentan datos representativos en la Fig. 8. En el caso de CTL específicos de Pol 498 del HIV, las células diana transfectadas indujeron la liberación de 378 pg/ml de IFN-\gamma. La inspección de las respuestas a dosis peptídicas revela que, fue necesario añadir exógenamente 48 ng/ml de péptido para alcanzar niveles similares de liberación de IFN-\gamma. Estos resultados demuestran que las células transfectadas presentan cantidades relativamente grandes del epítopo Pol 498, equivalentes a 48 ng/ml de péptido adicionado exógenamente.

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En comparación, se detectaron menos de 25 pg/ml de IFN-\gamma utilizando los CTL específicos para el epítopo Gag 271. La titulación del péptido de control con células diana no transfectadas reveló que este resultado negativo no podía atribuirse a una sensibilidad baja de la línea concreta de CTL que se utilizó, porque podían detectarse cantidades tan pequeñas como de 0,2 pg/ml de "equivalentes peptídicos" (PE). Por lo tanto, parece que el epítopo Gag 271 no se procesa y presenta eficazmente en las células diana transfectadas con HIV-1. Utilizando la cifra de los "equivalentes peptídicos" como una cuantificación aproximada del rendimiento del procesamiento, puede estimarse que se presenta al menos 200 veces menos Gag 271 por las dianas transfectadas, en comparación con el epítopo Pol 498.

Los resultados de varias determinaciones independientes para cuatro epítopos diferentes contenidos en el HIV-1 se recopilan en la Tabla 4. La cantidad de cada epítopo que producen las células transfectadas HIV-1 oscila desde 30,5 PE para Pol 498, a un mínimo de menos de 0,2 PE para Gag 271. Los dos epítopos Env 134 y Nef 221 se asociaron con valores intermedios, de 6,1 y 2,1 PE, respectivamente.

Estos resultados se correlacionaron a continuación con los valores de inmunogenicidad in vivo que se observaron para cada epítopo después de la inmunización con la construcción HIV-1. El epítopo Pol 498 fue también el más inmunogénico, como se había predicho. Los epítopos Env 134 y Nef 221, para los que se observó una inmunogenicidad intermedia in vivo, también se procesaron in vitro por las células humanas transfectadas con rendimiento intermedio. Por último, el Gag 271, para el que no se observó un procesamiento in vitro detectable, se asoció también con inmunogenicidad subóptima in vivo tanto en frecuencia como en magnitud.

Estos dados tienen varias implicaciones importantes. En primer lugar, sugieren que diferentes epítopos contenidos en un minigén dado pueden procesarse y presentarse con una eficacia diferencial. En segundo lugar, sugieren que la inmunogenicidad es proporcional a la cantidad de epítopo procesado que se genera. Por último, estos resultados proporcionan una validación importante del uso de ratones transgénicos con el propósito de optimizar las vacunas multiepítopo destinadas al uso en humanos.

III. Preparación de construcciones poliepitópicas

Los epítopos a incluir en las construcciones poliepitópicas típicamente portan motivos de unión a HLA de Clase I o de Clase II como se ha descrito, por ejemplo, en las solicitudes PCT PCT/US00/27766, o PCT/US00/19774.

Los múltiples epítopos HLA de Clase I o de Clase II presentes en una construcción poliepitópica pueden proceder del mismo antígeno, o de diferentes antígenos. Por ejemplo, una construcción poliepitópica puede contener uno o más epítopos HLA que pueden proceder de dos antígenos diferentes del mismo virus o de dos antígenos diferentes de distintos virus. Los epítopos a incluir en una construcción poliepitópica pueden seleccionarse por un especialista en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un ordenador para seleccionar epítopos que contengan motivos o supermotivos de HLA alelo-específicos. Las construcciones poliepitópicas que se producen de acuerdo con los métodos de la invención pueden también codificar uno o más epítopos HLA de Clase II de unión con amplia reactividad cruzada o universales, por ejemplo, PADRE^{TM}(Epimmune, San Diego, California, EEUU), (descrito, por ejemplo, en la Patente de EEUU Número 5.736.142) o una molécula de la familia PADRE.

Los epítopos HLA de Clase II universales pueden ser provechosamente combinados con otros epítopos HLA de Clase I y de Clase II para incrementar el número de células que se activan en respuesta a un antígeno dado y proporcionar una cobertura más amplia de la población de alelos reactivos a HLA. Por lo tanto, las construcciones poliepitópicas que se producen de acuerdo con los métodos de la invención pueden incluir epítopos HLA específicos para un antígeno, epítopos universales HLA de Clase II, o una combinación de epítopos específicos HLA y al menos un epítopo universal HLA de Clase II.

Los epítopos HLA de Clase I son generalmente de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos de longitud, en concreto, de 8, 9, 10, u 11 aminoácidos de longitud. Los epítopos HLA de Clase II son generalmente de aproximadamente 6 a 25 aminoácidos de longitud, en concreto de aproximadamente 13 a 21 aminoácidos de longitud. Un epítopo HLA de Clase I o II puede proceder de cualquier antígeno de interés deseado. El antígeno de interés puede ser un antígeno viral, un receptor de superficie, un antígeno tumoral, un oncogén, una enzima, o cualquier patógeno, célula o molécula para la que se desee una repuesta inmune. Los epítopos pueden seleccionarse en base a su capacidad para unir uno o múltiples alelos de HLA. Los epítopos que son análogos de secuencias que se dan naturalmente pueden también incluirse en las construcciones poliepitópicas que se describen en este documento. Tales péptidos análogos se describen, por ejemplo, en las solicitudes PCT PCT/US97/03778, PCT/US00/19774, y en la U.S.S.N. 09/260 en trámite junto con la presente, 714 presentada el 3/1/99.

Las construcciones poliepitópicas pueden generarse utilizando la metodología bien conocida en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos que constituyen las construcciones poliepitópicas pueden sintetizarse y unirse. Típicamente, sin embargo, las construcciones poliepitópicas se generan como minigenes usando tecnología de ADN recombinante.

IV. Vectores de expresión y construcción de un minigén

Las construcciones poliepitópicas que se producen de acuerdo con los métodos de la invención se suministran típicamente como un vector de expresión que contiene un minigén que codifica la construcción poliepitópica. La construcción de tales vectores de expresión se describe, por ejemplo en PCT/LTS99/10646. Los vectores de expresión contienen al menos un elemento promotor que es capaz de expresar una unidad de transcripción que codifica el minigén en las células apropiadas de un organismo de manera que el antígeno se exprese y se dirija a la molécula HLA apropiada. Por ejemplo, para la administración en humanos, se incorpora en el vector de expresión el elemento promotor que funciona en una célula humana.

La invención depende de las técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que exponen los métodos generales útiles en esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994); Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Gait, ed., 1984); Kuijpers, Nucleic Acids Research 18(17):5197 (1994); Dueholm, J. Org. Chem. 59:5767-5773 (1994); Methods in Molecular Biology, volumen 20 (Agrawal, ed.); y Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, por ejemplo, Parte I, capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" (1993).

Los ácidos nucleicos que codifican los epítopos se ensamblan en un minigén de acuerdo con las técnicas convencionales. Por lo general, las secuencias de ácido nucleico que codifican los epítopos del minigén se aíslan utilizando técnicas de amplificación con cebadores de oligonucleótidos, o se sintetizan químicamente. Las técnicas de clonación recombinante pueden también usarse cuando sean oportunas. Las secuencias de oligonucleótidos se seleccionan para que amplifiquen (cuando se usa la PCR para ensamblar el minigén) o bien codifiquen (cuando se usan oligonucleótidos sintéticos para ensamblar el minigén) los epítopos deseados.

Las técnicas de amplificación que utilizan cebadores se usan típicamente para amplificar y aislar las secuencias que codifican los epítopos de elección del ADN o del ARN (véanse las Patentes de EEUU 4.683.195 y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)). Métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) pueden utilizarse para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos de los epítopos directamente del ARNm, del ADNc, de las bibliotecas genómicas o de las librerías de ADNc. Pueden incorporarse sitios de restricción para endonucleasas en los cebadores. Los minigenes que se amplifican mediante la reacción de PCR pueden purificarse de geles de agarosa y clonarse en el vector adecuado.

Pueden también utilizarse oligonucleótidos sintéticos para construir minigenes. Este método se realiza utilizando una serie de oligonucleótidos solapantes, que representan tanto las cadenas con sentido como las antisentido del gen. Estos fragmentos de ADN entonces se hibridan, se ligan y se clonan. Los oligonucleótidos que no están disponibles comercialmente pueden sintetizarse químicamente de acuerdo con el método de la fosforamidita triéster en fase sólida que se describió por primera vez por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981), usando un sintetizador automático, como se describe en Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984). La purificación de los oligonucleótidos es por electroforesis en gel de acrilamida nativo o bien por HPLC de intercambio iónico como se describe en Pearson y Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983).

Los epítopos del minigén típicamente se subclonan en un vector de expresión que contiene un promotor potente de la transcripción directa, así como otras secuencias reguladoras tales como potenciadores y sitios de poliadenilación. Promotores adecuados se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., y Ausubel et al. Sistemas de expresión eucariotas para células de mamíferos se conocen bien en la técnica y están disponibles comercialmente. Tales elementos promotores incluyen, por ejemplo, el citomegalovirus (CMV), y el virus del sarcoma de Rous LTR y SV40.

El vector de expresión típicamente está compuesto por una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales que se requieren para la expresión del minigén en las células hospedadoras. Un casete de expresión típico contiene por lo tanto un promotor unido operativamente al minigén y las señales que se requieren para la poliadenilación eficaz del transcrito. Los elementos adicionales del casete pueden incluir potenciadores e intrones con sitios donantes y aceptores para el corte y empalme funcional.

Adicionalmente a una secuencia promotora, el casete de expresión puede también contener una región de terminación de la transcripción cadena abajo del gen estructural para proporcionar una terminación eficaz. La región de terminación puede obtenerse del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse de genes distintos.

El vector de expresión concreto que se usa para transportar la información genética al interior de la célula no es particularmente crítico. Pueden utilizarse cualquiera de los vectores convencionales que se usan para la expresión en células eucariotas. Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas se utilizan típicamente en vectores de expresión eucariotas, por ejemplo, vectores SV40, vectores CMV, vectores de papilomavirus, y vectores derivados del virus de Epstein Bar.

Las construcciones poliepitópicas que se producen de acuerdo con los métodos de la invención pueden expresarse en una variedad de vectores que incluyen vectores plasmídicos así como vectores virales o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión virales incluyen hospedadores virales atenuados, tales como vaccinia (virus de la viruela) o fowlpox (virus de la viruela de aves de corral). Como ejemplo de este planteamiento, el virus vaccinia se utiliza como vector para expresar las secuencias nucleotídicas que codifican los péptidos de la invención. Tras su introducción en un hospedador que tiene un tumor, el virus vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de ese modo provoca en el hospedador una respuesta de CTL y/o de HTL. Se describen vectores vaccinia y métodos útiles en los protocolos de inmunización, por ejemplo, en la Patente de EEUU Número 4.722.848.

Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización, por ejemplo, vectores de adenovirus y vectores virales adenoasociados, vectores retrovirales, vectores no virales tales como BCG (Bacilo de Calmette-Guerin), vectores de Salmonella typhi, vectores detoxificados de toxina de ántrax, y similares, son evidentes para los especialistas en la técnica.

La inmunogenicidad y la antigenicidad de las construcciones poliepitópicas se evalúan como se describe en este documento.

Secuencias de dirección

Los vectores de unión codifican uno o más epítopos MHC unidos operativamente a una secuencia MHC de dirección. El uso de una secuencia MHC de dirección mejora la respuesta inmune contra un antígeno, en relación con la administración del antígeno solo, dirigiendo el epítopo peptídico hacia su sitio de ensamblaje con una molécula MHC y su transporte a la superficie celular, proporcionando de ese modo un número aumentado de complejos de moléculas MHC-epítopos peptídicos disponibles para la unión a y la activación de células T.

Pueden utilizarse secuencias diana MHC de Clase I por ejemplo, las secuencias que dirigen un epítopo peptídico MHC de Clase I hacia una ruta citosólica o hacia el retículo endoplasmático (véase, por ejemplo, Rammensee et al., Immunogenetics 41:178-228 (1995)). Por ejemplo, la ruta citosólica procesa antígenos endógenos que se expresan en el interior de la célula. Aunque sin ceñirse a ninguna teoría en particular, se piensa que las proteínas citosólicas se degradan al menos parcialmente por una actividad endopeptidasa del proteasoma y entonces una molécula TAP (transportador asociado con el procesamiento) las transporta al retículo endoplasmático. En el retículo endoplasmático, el antígeno se une a moléculas MHC de Clase I. Las secuencias de señalización del retículo endoplasmático evitan la ruta de procesamiento citosólico y dirigen los antígenos endógenos directamente al retículo endoplasmático, donde se produce la degradación proteolítica en fragmentos peptídicos. Tales secuencias diana del MHC de Clase I se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, secuencias señal como las de la Ig kappa, las del activador de plasminógeno tisular o las de la insulina. Una señal peptídica preferida es la secuencia de la cadena de la Ig kappa humana. Las secuencias señal del retículo endoplasmático pueden usarse también para dirigir los epítopos del MHC de Clase II hacia el retículo endoplasmático, el sitio de ensamblaje de las moléculas MHC de Clase I.

Pueden también utilizarse secuencias de dirección del MHC de Clase II por ejemplo, las que dirigen a un péptido hacia la ruta endocítica. Estas secuencias de dirección típicamente dirigen antígenos extracelulares para que entren en la ruta endocítica, lo que motiva que el antígeno se transfiera al compartimento lisosomal donde el antígeno se escinde proteolíticamente en péptidos antigénicos para unirse a moléculas MHC de clase II. Como en el procesamiento normal de un antígeno exógeno, una secuencia que dirige un epítopo MHC de Clase II hacia los endosomas de la ruta endocítica y/o posteriormente hacia los lisosomas, donde el epítopo MHC de Clase II puede unirse a una molécula MHC de Clase II, es una secuencia de dirección del MHC de Clase II. Por ejemplo, un grupo de secuencias de dirección del MHC de Clase II útiles en la invención son las secuencias de dirección lisosomales, que confinan polipéptidos a los lisosomas. Puesto que las moléculas MHC de Clase II típicamente se unen a péptidos antigénicos derivados del procesamiento proteolítico de los antígenos endocitados por lisosomas, una secuencia de dirección lisosomal puede funcionar como una secuencia de dirección del MHC de Clase II. Las secuencias de dirección lisosomales se conocen bien en la técnica e incluyen las secuencias que se encuentran en las proteínas lisosomales LAMP-1 y LAMP-2 como se describen por August et al. (Patente de EEUU Número 5.633.234, expedida el 27 de mayo de 1997).

Otras proteínas lisosomales que contienen secuencias de dirección lisosomales incluyen a HLA-DM. HLA-DM es una proteína endosomal/lisosomal que funciona facilitando la unión de péptidos antigénicos a moléculas MHC de Clase II. Puesto que se localiza en el lisosoma, HLA-DM tiene una secuencia de dirección lisosomal que puede funcionar como secuencia de dirección de una molécula MHC de Clase II (Copier et al., J. Immunol. 157:1017-1027 (1996)).

La proteína residente del lisosoma HLA-DO puede también funcionar como secuencia de dirección lisosomal. En contraste con las proteínas residentes lisosomales LAMP-1 y HLA-DM que se describen arriba, que codifican motivos específicos que contienen Tyr y que dirigen a proteínas hacia los lisosomas, HLA-DO se dirige a los lisosomas por asociación con HLA-DM (Liljedal et al., EMBO J., 15:4817-4824 (1996)). Por lo tanto, las secuencias de HLA-DO que se asocian con HLA-DM y, por consiguiente, provocan la translocación de HLA-DO a los lisosomas pueden usarse como secuencias de dirección del MHC de Clase II. De manera similar, el homólogo murino de HLA-DO, H2-DO, puede usarse para obtener una secuencia de dirección del MHC de Clase II. Un epítopo MHC de Clase II puede fusionarse a HLA-DO o a H2-DO y dirigirse hacia los lisosomas.

En otro ejemplo, los dominios citoplasmáticos de las subunidades Ig-\alpha e Ig-\beta del receptor de células B median la internalización antigénica e incrementan la eficacia de presentación de los antígenos (Bonnerot et al., Immunity 3:335-347 (1995)). Por lo tanto, los dominios citoplasmáticos de las proteínas Ig-\alpha e Ig-\beta pueden funcionar como secuencias de dirección del MHC de Clase II que dirigen a un epítopo MHC de Clase II hacia la ruta endocítica para su procesamiento y unión a moléculas MHC de Clase II.

Otro ejemplo de secuencia de dirección del MHC de Clase II que dirige epítopos MHC de Clase II hacia la ruta endocítica es una secuencia que dirige polipéptidos para su secreción, donde el polipéptido puede entrar en la ruta endosomal. Estas secuencias de dirección del MHC de Clase II que dirigen polipéptidos para su secreción mimetizan la ruta normal por la cual antígenos exógenos extracelulares se procesan a péptidos que se unen a moléculas MHC de Clase II. Cualquier secuencia señal que funcione dirigiendo a un polipéptido a través del retículo endoplasmático y en última instancia hacia su secreción puede funcionar como secuencia de dirección del MHC de Clase II mientras que el polipéptido secretado pueda entrar en la ruta endosomal/lisosomal y escindirse en péptidos que puedan unirse a las moléculas MHC de Clase II.

En otro ejemplo, la proteína li se une a moléculas MHC de Clase II en el retículo endoplasmático, donde funciona evitando la unión de los péptidos presentes en el retículo endoplasmático a moléculas MHC de Clase II. De este modo, la fusión de un epítopo MHC de Clase II a la proteína li dirige al epítopo MHC de Clase II hacia el retículo endoplasmático y hacia una molécula MHC de Clase II. Por ejemplo, la secuencia CLIP de la proteína li puede retirarse y reemplazarse por una secuencia de un epítopo MHC de Clase II de tal modo que el epítopo MHC de Clase II se dirija hacia el retículo endoplasmático, donde el epítopo se une a una molécula MHC de Clase II.

En algunos casos, los propios antígenos pueden servir como secuencias de dirección del MHC de Clase II o I y pueden fusionarse con un epítopo universal MHC de Clase II para estimular una respuesta inmune. Aunque los antígenos citoplasmáticos virales se procesan y presentan generalmente como complejos con moléculas MHC de Clase I, proteínas citoplasmáticas de larga vida tales como la proteína de la matriz de influenza pueden entrar en la ruta de procesamiento de las moléculas MHC de Clase II (Guéguen y Long, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14692-14697 (1996)). Por lo tanto, proteínas citoplasmáticas de larga vida pueden funcionar como secuencias de dirección del MHC de Clase II. Por ejemplo, un vector de expresión que codifica la proteína de la matriz de influenza fusionado con un epítopo universal MHC de Clase II puede usarse provechosamente para dirigir al antígeno de influenza y al epítopo universal MHC de Clase II hacia la ruta del MHC de Clase II para estimular una respuesta inmune contra influenza.

Otros ejemplos de antígenos que funcionan como secuencias de dirección del MHC de Clase II incluyen los polipéptidos que espontáneamente forman partículas. Los polipéptidos se secretan de la célula que los produce y espontáneamente forman partículas, que recoge una célula presentadora de antígenos por endocitosis del tipo de endocitosis mediada por receptor o que "traga" por fagocitosis. Las partículas se escinden proteolíticamente en péptidos antigénicos después de entrar en la ruta endosomal/lisosomal.

Un polipéptido tal que espontáneamente forma partículas es el antígeno de superficie del HBV (HBV-S) (Diminsky et al., Vaccine 15:637-647 (1997); Le Borgne et al., Virology 240:304-315 (1998)).

Otro polipéptido que espontáneamente forma partículas es el antígeno nuclear del HBV (Kuhröber et al., International Immunol. 9:1203-1212 (1997)). Todavía otro polipéptido más que espontáneamente forma partículas es la proteína de levadura Ty (Weber et al., Vaccine 13:831-834 (1995)). Por ejemplo, un vector de expresión que contiene el antígeno HBV-S fusionado con un epítopo universal del MHC de Clase II puede usarse provechosamente para dirigir el antígeno HBV-S y el epítopo universal MHC de Clase II hacia la ruta del MHC de Clase II para estimular una respuesta inmune contra HBV.

Administración in vivo

Se describen los métodos para la estimulación de una respuesta inmune mediante la administración de un vector de expresión adecuado en un individuo. La administración de un vector de expresión para la estimulación de una respuesta inmune es ventajosa porque los vectores de expresión dirigen los epítopos MHC hacia moléculas MHC, incrementando por tanto el número de CTL y HTL que se activan por los antígenos codificados por el vector de expresión.

Inicialmente, los vectores de expresión se exploran en ratón para determinar los vectores de expresión que tienen una actividad óptima en la estimulación de la respuesta inmune deseada. Los estudios iniciales se llevan a cabo por lo tanto, cuando es posible, con genes de ratón de las secuencias de dirección del MHC. Los métodos para la determinación de la actividad de los vectores de expresión se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, la captación de ^{3}H-timidina para medir la activación de células T y la liberación de ^{51}Cr para medir la actividad de CTL como se describe abajo en los Ejemplos II y III. Experimentos similares a los descritos en el Ejemplo IV se realizan para determinar los vectores de expresión que tienen actividad de estimulación de la respuesta inmune. Los vectores de expresión que tienen actividad se analizan adicionalmente en humanos. Para sortear respuestas inmunológicas adversas potenciales contra las secuencias de ratón codificadas, los vectores de expresión que tienen actividad se modifican para que las secuencias de dirección del MHC de Clase II procedan de genes humanos. Por ejemplo, las regiones análogas de los homólogos humanos de genes que contienen varias secuencias de dirección del MHC de Clase II se sustituyen en los vectores de expresión. Se analiza la actividad de estimulación de la respuesta inmune en humanos de los vectores de expresión que contienen secuencias de dirección del MHC de Clase II humano, como los que se describen en el Ejemplo I más abajo.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un vector de expresión adecuado. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones acuosas y no acuosas, suspensiones y emulsiones, incluyendo suero salino tamponado fisiológicamente, soluciones alcohol/acuosas u otros solventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites tales como aceite de oliva o ésteres inyectables orgánicos.

Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúen, por ejemplo, para estabilizar el vector de expresión o incrementar la absorción del vector de expresión. Tales compuestos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, carbohidratos, como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, polipéptidos de bajo peso molecular, agentes antimicrobianos, gases inertes u otros estabilizantes o excipientes. Los vectores de expresión pueden adicionalmente formar complejos con otros componentes tales como péptidos, polipéptidos y carbohidratos. Los vectores de expresión pueden también formar complejos de tipo partículas o perlas que pueden administrarse a un individuo, por ejemplo, utilizando una pistola vacunadora. Un especialista en la técnica sabe que la elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable, que incluya un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración del vector de expresión.

También hay descritos métodos de administración de una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión como se describe para estimular una respuesta inmune. Los vectores de expresión se administran mediante métodos que se conocen bien en la técnica como se describen en Donelly et al. (Ann. Rev. Immunol, 15:617-648 (1997)); Felgner et al. (Patente de EEUU Número 5.580.859, expedida el 3 de diciembre de 1996); Felgner (Patente de EEUU Número 5.703.055, expedida el 30 de diciembre de 1997); y Carson et al. (Patente de EEUU Número 5.679.647, expedida el 21 de octubre de 1997).

El minigén puede administrarse como un ácido nucleico desnudo.

Una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión puede administrarse para estimular la respuesta inmune en un sujeto por varias vías, que incluyen, por ejemplo, la vía oral, intravaginal, rectal, o parenteral, tal como la vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraorbital, intracapsular, intraperitoneal, intracisternal o mediante absorción pasiva o facilitada a través de la piel usando, por ejemplo, un parche dérmico o la iontoforesis transdérmica, respectivamente. Adicionalmente, la composición puede administrarse por inyección, intubación o tópicamente, pudiendo esta última ser pasiva, por ejemplo, mediante la aplicación directa de una pomada o polvo, o activa, por ejemplo, usando un pulverizador nasal o inhalador. Un vector de expresión puede también administrarse como pulverizador tópico, en cuyo caso uno de los componentes de la composición es un propulsor adecuado. La composición farmacéutica también puede incorporarse, si se desea, en liposomas, microesferas u otras matrices poliméricas (Felgner et al., Patente de EEUU Número 5.703.055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. I a III (2ª ed. 1993)). Los liposomas, por ejemplo, que se componen de fosfolípidos u otros lípidos, son vehículos no tóxicos, fisiológicamente aceptables y metabolizables que son relativamente sencillos de fabricar y de administrar.

Los vectores de expresión pueden administrarse en los espacios intersticiales de los tejidos de un cuerpo animal (Felgner et al., Patentes de EEUU Números 5.580.859 y 5.703.055). La administración de vectores de expresión en músculo es un método de administración particularmente eficaz, incluyendo las inyecciones intradérmicas y subcutáneas y la administración transdérmica. La administración transdérmica, tal como la iontoforesis, es también un método eficaz para administrar vectores de expresión en músculo. La administración epidérmica de los vectores de expresión también puede utilizarse. La administración epidérmica implica la irritación mecánica o química de la capa más externa de la epidermis para estimular una respuesta inmune contra el irritante (Carson et al., Patente de EEUU Número 5.679.647).

Otros métodos eficaces de administración de un vector de expresión de la invención para estimular una respuesta inmune incluyen la administración vía mucosa (Carson et al., Patente de EEUU Número 5.679.647). Para la administración vía mucosa, el método más eficaz de administración incluye la administración intranasal de un aerosol apropiado que contenga el vector de expresión y una composición farmacéutica. Los supositorios y las preparaciones tópicas son también eficaces para la administración de los vectores de expresión en los tejidos mucosos de localizaciones genital, vaginal u ocular. Adicionalmente, los vectores de expresión pueden formar complejos de tipo partículas y administrarse mediante una pistola vacunadora.

La dosis a administrar depende del método de administración y estará generalmente entre aproximadamente 0,1 \mug hasta aproximadamente 200 \mug. Por ejemplo, la dosis puede estar entre aproximadamente 0,05 \mug/kg y aproximadamente 50 mg/kg, en concreto aproximadamente 0,005-5 mg/kg. Se puede determinar una dosis eficaz, por ejemplo, mediante la medición de la respuesta inmune después de la administración de un vector de expresión. Por ejemplo, la producción de anticuerpos específicos para los epítopos del MHC de Clase II o los epítopos del MHC de Clase I codificados por el vector de expresión puede medirse mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo el ELISA u otros ensayos inmunológicos. Adicionalmente, la activación de células T auxiliares o la respuesta de CTL pueden medirse mediante métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, por ejemplo, la captación de ^{3}H-timidina para medir la activación de células T y la liberación de ^{51}Cr para medir la actividad de CTL (véanse los Ejemplos II y III más abajo).

Las composiciones farmacéuticas compuestas por un vector de expresión como se describe pueden administrarse a mamíferos, particularmente humanos, con propósitos profilácticos o terapéuticos. Ejemplos de enfermedades que pueden tratarse o prevenirse usando vectores de expresión incluyen la infección con HBV, HCV, HTV y CMV así como el cáncer de próstata, el carcinoma renal, el carcinoma cervical, el linfoma, el condiloma acuminado y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

En las aplicaciones terapéuticas, los vectores de expresión se administran a un individuo que ya padece un cáncer, una enfermedad autoinmune o está infectado con un virus. Los que están en la fase de incubación o en la fase aguda de la enfermedad pueden tratarse con vectores de expresión que incluyen los que expresan todos los epítopos universales del MHC de Clase II, de manera separada o en conjunción con otros tratamientos, como sea apropiado.

En las aplicaciones terapéuticas y profilácticas, las composiciones farmacéuticas compuestas por vectores de expresión como se describe se administran a un paciente en la cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune eficaz contra un antígeno para aliviar los signos o síntomas de la enfermedad. La cantidad de vector de expresión a administrar que es suficiente para aliviar los signos o síntomas de la enfermedad se denomina dosis terapéutica eficaz. La cantidad de vector de expresión suficiente para alcanzar una dosis terapéutica eficaz dependerá de la composición farmacéutica que contenga al vector de expresión de la invención, del modo de administración, del estado y de la severidad de la
enfermedad que se trata, del peso y del estado general de salud del paciente y del juicio del médico que lo prescribe.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la invención que se reivindica.

Los ejemplos 1-9 proporcionan ejemplos de ensayos para evaluar la inmunogenicidad y antigenicidad de las construcciones poliepitópicas.

Ejemplo 1 Ensayos de antigenicidad

Pueden generarse líneas de CTL péptido-específicas de alta afinidad a partir de esplenocitos de ratones transgénicos que se han sensibilizado con ADN, péptido/IFA, o lipopéptido. Brevemente, los esplenocitos de ratones transgénicos se estimulan con 0,1 \mug/ml de péptido y blastos LPS. Diez días después de la estimulación inicial, y semanalmente desde entonces, las células se reestimulan con pulsos de blastos LPS durante 1 hora con 0,1 \mug/ml de péptido. Las líneas de CTL se analizan 5 días después de la reestimulación en un ELISA de IFN-\gamma in situ como se describe arriba. Alternativamente, pueden usarse las líneas de CTL que se obtengan, por ejemplo, de pacientes infectados con el patógeno diana o que tengan la enfermedad diana, por ejemplo, cáncer. Las líneas específicas de CTL que no están disponibles ni de ratones transgénicos ni de pacientes se generan a partir de PBMC de donantes normales, recurriendo a los expertos en la técnica.

Las células diana que se usan en estos ensayos son células Jurkat o .221 transfectadas con A2.1/K^{b}, A11/k^{b}, A1/K^{b}, o B7/K^{b} para las líneas de CTL obtenidas de ratones transgénicos. Todas estas líneas celulares están actualmente disponibles (Epimmune Inc., San Diego, California, EEUU). En el caso de las líneas de CTL humanas, se utilizan células .221 transfectadas con el alelo de HLA humano apropiado. Actualmente se tienen células .221 transfectadas con A2 y A1, y se están generando células transfectadas con A11, A24 y B7. En una realización alternativa, si surgen problemas imprevistos con respecto a las células diana, se utilizan blastos LPS y líneas transformadas del EBV para las líneas de CTL murinas y humanas, respectivamente.

Para analizar la antigenicidad, se incuban diluciones seriadas de CTL con 10^{5} células diana y concentraciones múltiples de péptidos que oscilan desde 1 a 10^{-6} \mug/ml. Adicionalmente, los CTL también se incuban con células diana transfectadas con un vector episomal que contiene el minigén de interés. Los vectores episomales se conocen en la técnica.

La cantidad relativa de péptido generado por procesamiento natural dentro de las APC transfectadas con el minigén se cuantifica como sigue. Se registra la cantidad de IFN-\gamma generado por las líneas de CTL tras el reconocimiento de las células diana transfectadas. La cantidad de péptido sintético necesario para producir la misma cantidad de IFN-\gamma se interpola a partir de una curva estándar que se genera cuando la misma línea de CTL se incuba en paralelo con concentraciones conocidas del péptido.

Ejemplo 2 Inmunizaciones de ratones y cultivos celulares

Se ha descrito la obtención de los ratones transgénicos HLA-A2.1/K^{b} [Vitiello et al., J Exp Med, Vol. 173(4):1007-15 (1991)] y A11/K^{b} [Alexander et al., J Immunol, Vol. 159 (10):4753-61 (1997)] que se utilizan en este estudio. Los ratones transgénicos HLA B7 K^{b} y A1/K^{b} están disponibles localmente (Epimmune Inc., San Diego, CALIFORNIA, EEUU). Los ratones transgénicos HLA DR2, DR3 y DR4 se obtienen de C. David (Clínica Mayo). Los ratones no transgénicos H-2^{b} se compran a Charles River Laboratories u otras casas comerciales. Las inmunizaciones se realizan como se han descrito anteriormente [Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7)3915-25 (1999)]. Todas las células se desarrollan en medio de cultivo compuesto por medio RPMI 1640 con HEPES (Gibco Life Technologies) suplementado con FBS al 10%, L-glutamina 4 mM, 2-ME 50 \muM, piruvato sódico 0,5 mM, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina.

Los ratones transgénicos HLA y los ensayos de antigenicidad se usan con el propósito de analizar y optimizar las respuestas de CTL. La reactividad cruzada natural entre HLA-DR y IA^{b} puede también aprovecharse para analizar las respuestas de HTL. Esta evaluación proporciona una valoración de la antigenicidad y de la inmunogenicidad de las construcciones poliepitópicas.

Ejemplo 3 Ensayos de proliferación

Para evaluar la capacidad de los epítopos HTL para inducir una respuesta inmune, a menudo se realizan ensayos tales como los ensayos de proliferación. Por ejemplo, linfocitos T CD4 de ratón se aíslan inmunomagnéticamente a partir de suspensiones de bazo de una sola célula usando el DynaBeads Mouse CD4 (L3T4) (Dynal). Brevemente, se incuban 2 \times 10^{7} células de bazo con 5,6 \times 10^{7} perlas magnéticas durante 40 min a 4ºC, y después se lavan 3 veces. Se separan las perlas magnéticas utilizando el DetachaBead Mouse CD4 (Dynal). Los linfocitos T CD4 aislados (2 \times 10^{5} células/pocillo) se cultivan con 5 \times 10^{5} células de bazo singénicas irradiadas (3500 rad) por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo plano. Los péptidos purificados se añaden a los pocillos a una concentración final de 20, 1, 0,05 y 0 \mug/ml y las células se cultivan durante un total de 4 días. Aproximadamente 14 horas antes de recogerlas, se añade 1 \muCi de ^{3}H-timidina (ICN) a cada pocillo. Los pocillos se recogen en placas Unifilter GF/B (Packard) usando el Filtermate Harvester (Packard). La incorporación de ^{3}H-timidina se determina por recuento de centelleo líquido usando el contador de centelleo en microplaca TopCount^{TM} (Packard).

Ejemplo 4 Ensayo de liberación de ^{51}Cromo

Este ensayo para medir la actividad de CTL se conoce bien en la técnica. El ensayo cuantifica la actividad lítica de una población de células T midiendo el porcentaje de ^{51}C que se libera por una población diana marcada con ^{51}C [Brunner et al., Immunology, Vol. 14(2):181-96 (1968)]. Los datos que se obtienen del ensayo de liberación de cromo se expresan generalmente como frecuencia de CTL/10^{6} células [análisis de dilución límite, LDA]; [Current Protocols in Immunology, Vol 1, John Wiley & Sons, Inc., EEUU 1991, Capítulo 3; Manual of Clinical Laboratory Immunology, quinta edición, ASM Press, 1997 Sección R] o bien mediante una evaluación cuantitativa menos pesada del volumen de actividad de CTL [Unidades líticas; ensayo de LU]. En un ensayo de LU, las curvas de datos convencionales de proporción de E:T contra el porcentaje de citotoxicidad que se generan en un ensayo de liberación de ^{51}C se convierten en unidades líticas (LU) por 10^{6} células efectoras, donde 1 LU se define como la actividad lítica que se requiere para conseguir un 30% de lisis de células diana [Wunderlick, J., Shearer, G., y Livingston, A. en: J. Coligan, A. Kruisbeek, D. Margulies, E. Shevach, y W. Strober (Eds.), Current Protocols in Immunology, Vol 1, "Assays for T cell function: induction and measurement of cytotoxic T lymphocite activity." John Wiley & Sons, Inc., EEUU, p. 3.11.18]. El cálculo de LU permite cuantificar las respuestas y por lo tanto comparar fácilmente valores experimentales diferentes.

Ejemplo 5 ELISA de IFN-\gamma in situ

Se ha desarrollado y optimizado un ensayo de ELISA de IFN-\gamma in situ para tanto esplenocitos recién aislados como esplenocitos reestimulados con péptidos (véase, por ejemplo, McKinney, D.M., Skvoretz, R., Mingsheng, Q., Ishioka, G., Sette, A. Characterization Of An In Situ IFN-\gamma ELISA Assay Which is Able to Detect Specific Peptide Responses From Freshly Isolated Splenocytes Induced by DNA Minigene Immunization, in press). Este ensayo se basa en el ensayo ELISPOT, pero utiliza un cromógeno soluble, haciéndolo fácilmente adaptable a análisis de alto rendimiento. Tanto en ensayos primarios como en ensayos de reestimulación, esta técnica es más sensible que tanto el ELISA de sobrenadantes tradicional como el ensayo de liberación de ^{51}Cr, ya que las respuestas que se observan en el ELISA in situ no son detectables en estos otros ensayos. En una base por célula, la sensibilidad del ELISA in situ es de aproximadamente una célula secretora de IFN-\gamma/10^{4} células cultivadas en las placas.

Placas de ELISA de 96 pocillos se recubren con anti-IFN-\gamma (anticuerpo monoclonal de rata anti-ratón IFN-\alpha, Clon R4-6A2, Pharmingen) durante toda la noche a 4ºC, y luego se bloquean durante 2 horas a temperatura ambiente con FBS al 10% en PBS. Se cultivan diluciones seriadas de esplenocitos primarios o de CTL durante 20 horas con el péptido y 10^{5} células Jurkat A2.1/K^{b}/pocillo a 37ºC con un 5% de CO_{2}. Al día siguiente, se lavan las células y se detecta la cantidad de IFN-\gamma que se ha secretado en los pocillos mediante un ELISA tipo sandwich, usando \alpha- IFN-\gamma biotinilado (anticuerpo monoclonal de rata anti-ratón IFN-\gamma, Clon XMG1.2, Pharmingen) para detectar el IFN-\gamma secretado. Para el desarrollo del color se utiliza conjugado estreptavidina-HRP (Zymed) y TMB (Immunopure® TMB Substrate Kit, Pierce) según las indicaciones del fabricante. La absorbancia se mide a 450 nm en un lector de placas de ELISA Labsystems Multiskan RC. Los datos del ELISA de IFN-\gamma in situ se evalúan en unidades secretoras (SU), basadas en el número de células que secretan 100 pg de IFN-\gamma en respuesta a un péptido concreto, corregido por la cantidad de IFN de fondo en ausencia del péptido.

Ejemplo 6 Ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT cuantifica la frecuencia de células T específicas para un péptido dado mediante la medición de la capacidad de las células individuales para inducir la producción y liberación de linfoquinas específicas, generalmente IFN-\gamma. La mayor sensibilidad del ensayo ELISPOT ha permitido a los investigadores detectar respuestas de células recién aisladas de humanos infectados o de animales de experimentación [Murali-Krishna et al., Immunity, Vol. 8(2);177-87 (1998); Ogg et al., Science, Vol. 279(5359):2103-6 (1998)]. Los ensayos ELISPOT se realizan como se describe anteriormente para el ELISA de IFN-\gamma hasta las etapas finales, donde se usa ExtrAvidin-AP (Sigma, dilución 1:5000) en lugar del conjugado estreptavidina-HRP. El color se desarrolla usando el sustrato 5-BCIP (BioRad) según las indicaciones del fabricante. Los puntos se cuentan usando un microscopio de contraste de fases. Alternativamente, los puntos se pueden contar utilizando el lector Zeiss KS ELISPOT. En este caso se usa el sustrato BCIP/NBT.

El ensayo ELISPOT se utiliza rutinariamente para cuantificar respuestas inmunes. Los puntos pueden contarse manualmente, sin embargo, de manera preferida, se usa un lector KS ELISPOT de Zeiss, un sistema basado en un microscopio con software específicamente diseñado para reconocer y contar los puntos.

Ejemplo 7 Tinción de tetrámeros

La tinción de tetrámeros es una técnica de citometría de flujo que detecta linfocitos T CD8^{+} humanos epítopo-específicos basándose en la interacción entre el epítopo peptídico, el antígeno de Clase I y el receptor de célula T específico para el epítopo. Este ensayo permite la cuantificación rápida de linfocitos T CD8^{+} humanos epítopo-específicos en muestras de sangre recién aisladas. Existen tetrámeros MHC para varias combinaciones péptido HIV/HLA, obtenidas, por ejemplo, del depósito del Instituto Nacional de Salud (NIH) de EEUU (Tetramer Core Facility: http://www.miaid.nih.gov/reposit/tetramer/index.html). Para marcar las células epítopo-específicas, se incuban durante 40 minutos en la oscuridad 1 \times 10^{6} PBMC en un volumen de 100 \mul con 5 \mug/ml del tetrámero apropiado más anticuerpos monoclonales que reconozcan los CD3 y CD8 humanos (disponibles en forma de diferentes conjugados con fluorocromos en casas comerciales como Pharmingen, San Diego, California o BioSource, Camarillo, California, EEUU). Las células se lavan y se fijan con paraformaldehído antes de analizarlas utilizando un citómetro de flujo FACsan o FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José, California, EEUU). Los datos de las muestras se analizan utilizando el software CellQuest.

Ejemplo 8 Ensayos de muestras clínicas

Se pueden usar varios ensayos para evaluar la actividad específica de CTL CD8^{+} en muestras congeladas de PBMC de pacientes o voluntarios. El ELISPOT, la liberación de cromo, la liberación de IFN-\gamma in situ, los ensayos de proliferación y los ensayos de tetrámeros son todos ellos útiles para evaluar las respuestas de varios modelos experimentales, por ejemplo, aquellos de origen murino y/o primates.

Los métodos experimentales para la versión murina de los ensayos se describen arriba, y estos se adaptan a los sistemas humanos como se describe en [Livingston et al., J Immunol, Vol. 159(3):1383-92 (1997); Heathcote et al., Hepatology, Vol. 30(2):531-6 (1999); Livingston et al., J Immunol, Vol. 162(5):3088-95 (1999)] y pueden adaptarse adicionalmente por cualquier especialista en la técnica. Los cálculos de las cantidades de muestras de PBMC congeladas que son necesarias para completar los ensayos se describen también con más detalle en el Ejemplo 14.

Ejemplo 9 Animales transgénicos

Los ratones transgénicos (HI, A-A2.1/K^{b} H2^{b}; HLA-A11/K^{b}; HLA-A1/K^{b}; HLA-B7/K^{b}) se inmunizan por vía intramuscular en el músculo tibial anterior o por vía subcutánea en la base de la cola con dosis de hasta 100 \mug de ADN o péptido en volúmenes de 10-100 \mul. El ADN se formula en suero salino, y los péptidos en adyuvante incompleto de Freund. 11-21 días después, los animales se sacrifican mediante asfixia con CO_{2}, y sus bazos se extraen y se utilizan como fuente de células para la determinación in vitro de la función de CTL. Típicamente, se usan 3-6 ratones por grupo experimental. Adicionalmente, se usan los bazos de ratones no inmunizados como fuente de APC para la reestimulación de los cultivos de CTL. Se usan tanto machos como hembras de 8-12 semanas de edad.

Ejemplo 10 Demostración de la inducción simultánea de respuestas contra múltiples epítopos CTL y HTL Construcción y análisis de cadenas de epítopos CTL

Este ejemplo aporta un ejemplo de análisis de múltiples epítopos CTL y HTL. Por ejemplo, cadenas de epítopos que incluyen 10-12 epítopos CTL diferentes bajo el control de un único promotor se sintetizan e incorporan en un plásmido convencional, pcDNA 3.1 (Invitrogen, San Diego) o un plásmido del NGVL (Laboratorio Nacional de Vectores de Genes, Universidad de Michigan). Estas construcciones incluyen una secuencia señal convencional y un epítopo universal HTL, PADRE^{TM}. Cada conjunto de epítopos se selecciona para permitir una cobertura equilibrada de la población. Para facilitar el análisis y la optimización, se incluye una representación equilibrada de epítopos que hayan demostrado ser inmunogénicos en ratones transgénicos, y/o antigénicos en humanos.

El orden específico de estos epítopos CTL se escoge mediante el uso de un programa de ordenador, EPISORT^{TM}, para minimizar los motivos de unión de Clase I, como se describe en este documento. Si, pese a los mejores esfuerzos en lo que respecta a la optimización del orden, todavía están presentes epítopos de unión potenciales en una construcción de acuerdo con la invención, se sintetizan los epítopos correspondientes para monitorizar las respuestas de CTL contra tales epítopos en ratones transgénicos HLA. Generalmente, la minimización de los motivos de unión es satisfactoria y adecuada. No obstante, si se detectan respuestas contra cualquier epítopo de unión, estos epítopos de unión se interrumpen mediante el uso de espaciadores cortos de uno o dos restos, tales como K, AK, KA, KK, o A, compatibles con las preferencias de escisión proteolítica esperadas que se analizan en las secciones anteriores.

Puesto que la utilidad última de las construcciones optimizadas es la de ser una vacuna humana, se utilizan codones humanos optimizados. No obstante, para facilitar la optimización del proceso en ratones transgénicos HLA, se tiene cuidado de seleccionar, cuando es posible, codones humanos que también sean óptimos para ratones. El uso de codones humanos y murinos es muy similar (Base de datos de uso de codones en http://www.kazusa.or.jp/codon).

Se pueden utilizar células humanas transfectadas con las diversas construcciones de vacunas minigén en los ensayos de antigenicidad, realizados en paralelo a los análisis in vivo en ratones transgénicos HLA. Cualquier discrepancia potencial en la eficacia de la vacuna minigén, que se deba a un uso diferencial de codones, puede abordarse mediante la disponibilidad de estos dos diferentes sistemas de ensayo.

Típicamente, los análisis de antigenicidad e inmunogenicidad de las construcciones plasmídicas se realizan en paralelo. Los análisis in vivo en ratones transgénicos se realizan para ratones transgénicos HLA A2, A11, B7 y A1. Siguiendo un protocolo bien establecido en el laboratorio, se inyectaron 100 \mug de cada plásmido por vía intramuscular en ratones tratados previamente con cardiotoxina y se evaluaron las respuestas once días después [Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)]. Los ensayos incluyen el ELISPOT de células recién aisladas, así como los ensayos de liberación de interferón gamma y los ensayos de citotoxicidad de la liberación de cromo en cultivos celulares reestimulados. Todas las técnicas mencionadas arriba están bien establecidas en la técnica. Los análisis iniciales se centran en los 8 epítopos restringidos a HLA A2, los 9 restringidos a HLA A11 y los 6 restringidos a HLA B7, para los que ya se ha demostrado bien la inmunogenicidad en animales transgénicos HLA. La medición simultánea de respuestas contra estos epítopos no es problemática, puesto que se han establecido ya grandes colonias de ratones transgénicos para estos tipos HLA "locales". Grupos de cuatro a seis ratones son suficientes para medir las respuestas contra de seis a diez epítopos diferentes, en ensayos con lecturas de salida múltiples. Típicamente se emplea el análisis de los epítopos restringidos a HLA A1 derivados de HTV en ratones transgénicos HLA A1. No obstante, si aparecen problemas, se puede utilizar el análisis de antigenicidad que utiliza APC humanas como estrategia alternativa, o, como complemento de los estudios con ratones transgénicos.

Con el propósito de ampliar la correlación entre la inmunogenicidad en animales transgénicos y la antigenicidad, como se señala en los estudios que se mencionan en este documento, se utiliza el análisis de la antigenicidad para evaluar las respuestas contra epítopos tales como Pol 498, Env 134, Nef 221, Gag 271, para los que ya hay líneas de CTL de alta afinidad disponibles localmente. Con el propósito de generar líneas de CTL idóneas adicionales, se emplea la inmunización directa de ratones transgénicos HLA con péptidos emulsionados en adyuvante, o lipopéptidos, como se describe en este documento, y se aplica rutinariamente en el laboratorio, para generar líneas para su uso en los ensayos de antigenicidad.

Los ensayos de antigenicidad se usan también como lecturas de salida primarias para epítopos para los que los experimentos de optimización in vivo no son factibles. Estos epítopos incluyen epítopos restringidos a A24 y posiblemente a A1, así como cualquier epítopo que no sea inmunogénico en ratones transgénicos HLA. En cualquiera de tales casos, se usan líneas de CTL humanas, que se generan a partir de individuos expuestos al HIV. Alternativamente, se generan líneas de CTL para la inducción in vitro de CTL, usando células dendríticas inducidas por GMCSF/IL4 y linfocitos de sangre periférica [Celis et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 91(6):2105-9 (1994)].

Se generan vectores episomales que codifican los minigenes y se transfectan en líneas celulares humanas apropiadas para generar células diana. Por ejemplo, puede utilizarse la línea celular humana Jurkat, pero también se han utilizado líneas celulares linfoblastoides con éxito. Para los experimentos que utilizan líneas de CTL de origen humano, se utilizan generalmente líneas celulares del EBV, homozigotas, con una combinación de HLA bien caracterizada, como fuente de MHC purificado y como células diana, y se utilizan como destinatarias de las transfecciones con minigenes. Para los experimentos que utilizan líneas de CTL obtenidas de ratones transgénicos HLA, se usan como destinatarias de las transfecciones con minigenes una colección de líneas celulares del EBV transformadas, de Clase I negativas, líneas celulares mutantes 221 [Shimizu Y, DeMars R, J Immunol, Vol. 142(9):3320-8 (1989)] transfectadas con construcciones quiméricas adaptadas a HLA/K^{b}. Tales células presentan eficazmente los antígenos peptídicos a las líneas de CTL [Celis et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 91(6):2105-9 (1994)].

Construcción y análisis de las cadenas de epítopos HTL

Las cadenas de epítopos que incluyen 3-5 epítopos HTL diferentes bajo el control de un único promotor se sintetizan y se incorporan en un plásmido convencional, pcDNA 3.1 (Invitrogen, San Diego). Todas las construcciones incluyen una secuencia de dirección Ig-\alpha. Para facilitar el análisis y la optimización, cada conjunto de epítopos para un minigén dado se escoge de manera que proporcione una representación equilibrada de epítopos que ya se conoce que son inmunogénicos en ratones IA^{b}. El orden de los epítopos se escoge mediante el uso del programa EPISORT, para minimizar la presencia de epítopos de unión. Adicionalmente, todos los epítopos que se corresponden con uniones se sintetizan y se analiza su unión a IA^{b} y, lo que es más importante, su unión a un panel de catorce moléculas DR diferentes, representativas de los alelos DR más comunes en todo el mundo [Southwood et al., J Immunol, Vol. 160(7):3363-73 (1998)]. De este modo no se generan dentro de estos plásmidos epítopos HTL que no estén dirigidos contra un antígeno de interés. No obstante, si se detectan regiones de unión con un buen potencial de unión a DR (y por lo tanto, una inmunogenicidad potencialmente restringida a DR in vivo), se introduce un espaciador tal como GPGPG para eliminarlas. En todas las construcciones se minimizará también el número de motivos de unión de Clase I, como se describe en este documento.

Se analiza la inmunogenicidad de plásmidos vacunales experimentales usando ratones transgénicos HLA DR y/o ratones transgénicos del haplotipo H2b. Se mide la proliferación y/o la producción de citoquinas (IL5, IFN-\gamma). En un protocolo típico, se inyectan 100 microgramos de cada plásmido por vía intramuscular en ratones tratados con cardiotoxina y se evalúan las respuestas once días después [Ishioka et al., J Immunol, Vol. 162(7):3915-25 (1999)].

Análisis de las interacciones entre epítopos CTL y HTL

Las actividades que se describen arriba producen pequeños bloques funcionales de epítopos, que se utilizan para demostrar respuestas simultáneas/antigenicidad contra todos los epítopos analizables. Estos bloques están sujetos a una optimización adicional, como se describe en el ejemplo siguiente. Se evalúa la inmunodominancia usando los mismos minigenes. En concreto, se mezclan todos los plásmidos CTL, o todos los plásmidos HTL. Los resultados que se obtienen con la combinación de minigenes se comparan luego con los resultados que se obtienen con el mismo minigén, cuando se inyecta por separado.

Estos plásmidos de minigenes se utilizan también para determinar los efectos de los epítopos HTL sobre las respuestas contra epítopos CTL. En concreto, los plásmidos que contienen HTL y CTL se combinan e inyectan en ratones, y se miden las respuestas de CTL y HTL a los epítopos seleccionados como se describe en este documento. Con frecuencia se determina si la presencia, por ejemplo, de epítopos HTL derivados del antígeno diana incrementa las respuestas de CTL por encima del nivel de respuesta que se alcanza con un plásmido que contiene un epítopo de unión a DR omnipresente, por ejemplo, PADRE^{TM} o a una molécula de la familia PADRE, en el minigén CTL. Típicamente también se determina si PADRE inhibe o aumenta las respuestas contra epítopos HTL derivados de antígenos diana o por el contrario, si los epítopos HTL derivados del antígeno de interés inhiben o aumentan las respuestas contra PADRE.

Se pueden conseguir respuestas contra un gran número de epítopos usando esta metodología. Es posible que la combinación de construcciones inhiba las respuestas contra algunos de los epítopos más débiles. En este caso, se repiten los experimentos de combinación después de la optimización.

Ejemplo 11 Optimización de las construcciones minigén CTL y HTL

Este ejemplo describe la optimización de las construcciones CTL y HTL que se describen en el Ejemplo 10. La influencia potencial de los restos flanqueantes sobre la antigenicidad y la inmunogenicidad se evalúa también al optimizar construcciones minigén. Estos estudios implican la inclusión de restos flanqueantes, cuyo sinónimo es el de "espaciadores", que se diseñan para facilitar un procesamiento eficaz.

Tal análisis puede realizarse como sigue. En primer lugar, los resultados del análisis de las construcciones multiepítopo CTL que se describen en el Ejemplo 10 se analizan para buscar tendencias y correlaciones entre la actividad y la presencia de restos específicos en los tres restos flanqueantes de los extremos N- y C-terminales del epítopo. Los epítopos para los que se señala una sensibilización de CTL subóptima, que son subóptimos con respecto a la magnitud de la respuesta, son las dianas para la optimización con regiones flanqueantes. Para cada una de las vacunas minigén CTL, que codifican 10-12 epítopos CTL diferentes, se produce una "segunda generación" de vacunas minigén, con una configuración optimizada.

El primer diseño de optimización consiste en introducir un resto alanina (A) o bien lisina (K) en la posición C+1, para todos los epítopos que se asocian con rendimientos subóptimos. Un segundo diseño de optimización consiste en introducir en la posición C+1, el resto que aparece naturalmente en el antígeno diana, por ejemplo, HIV, que está asociado con la antigenicidad.

Para los epítopos seleccionados, se introducen también modificaciones adicionales. En concreto, también se investiga el efecto de la introducción de otros restos espaciadores en los extremos C- y N-terminales del epítopo. Dependiendo de los resultados del análisis de las vacunas minigén que se describen en el Ejemplo 10, los restos que se investigan pueden incluir adicionalmente, por ejemplo, G, Q, W, S y T. Si se generan epítopos de unión mediante estas modificaciones, se diseñan racionalmente colocaciones alternativas de los epítopos que eliminen los epítopos de unión, como se describe en este documento. Se analiza la antigenicidad y la inmunogenicidad de todas las construcciones de segunda generación, como se describe en este documento.

Como resultado de estas modificaciones, se identifican variaciones en la actividad que se corresponden con modificaciones específicas de los minigenes. Se han encontrado ciertas modificaciones que tienen en general efectos beneficiosos. Para confirmarlo, se lleva a cabo la generación y el análisis de vacunas minigén adicionales en las que todos los epítopos (incluso los que manifestaron una antigenicidad e inmunogenicidad aceptables) están sujetos a la misma modificación. En algunos casos, se indica un incremento de actividad para algunos epítopos pero no para otros, o lo que es menos deseable, que ciertas modificaciones incrementan la actividad de algunos, pero disminuyen la actividad de otros epítopos. En tales casos, se diseñan y analizan vacunas minigén adicionales, para mantener las modificaciones beneficiosas, y excluir las alteraciones que fueron perjudiciales o no tuvieron
efecto.

Estas vacunas minigén se designan de manera que: a) estén presentes un mínimo de los epítopos de unión predichos; b) los epítopos que no eran funcionales en las vacunas minigén anteriores estén ahora en un contexto nuevo más eficaz.

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Para las vacunas minigén HTL, los datos que se obtienen de la "primera generación" de vacunas minigén se inspeccionan en busca de tendencias, en cuanto a los epítopos de unión, la posición de los epítopos dentro del minigén, y la proximidad a espaciadores, por ejemplo espaciadores GPGPG. Si se detectan tendencias específicas, la segunda generación de vacunas minigén se diseña en base a estas tendencias. Alternativamente, en el caso de los minigenes que producen una actividad subóptima, se reevalúa la eficacia potencial de otras estrategias de dirección, como las basadas en li y LAMP, y se comparan con las no dirigidas y con la secuencia líder de dirección sencilla.

Cuando se detectan grandes variaciones en la actividad de vacunas minigén CTL o bien HTL que se describen en esta sección, los resultados concuerdan con influencias tales como efectos conformacionales o "de largo alcance" que afectan a la actividad del minigén. Estas variables pueden analizarse por medio de técnicas moleculares y de biología celular generales. Por ejemplo, pueden analizarse los niveles de expresión de ARNm en las líneas celulares transfectadas con los diversos minigenes, y su estabilidad mediante análisis Northern o ensayos de extensión de cebadores [Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley & Sons, Inc. USA 1999].

En todas las vacunas minigén, puede incluirse también un anticuerpo etiquetado tal como MYC/his. Esta etiqueta permite el análisis de los niveles de expresión de la proteína. La inclusión del MYC/his etiquetado [Manstein et al., Gene, Vol. 162(1):129-34 (1995)] también permite la determinación de la estabilidad de los productos que se expresan, mediante experimentos de pulso y caza. Los resultados de estos ensayos pueden compararse luego con los resultados de los experimentos de antigenicidad e inmunogenicidad. Se inspeccionan estos resultados en busca de tendencias y normas generales, y correlaciones entre las distintas variables que se examinan.

Ejemplo 12 Determinación de la configuración plasmídica más simple capaz de liberar eficazmente los epítopos seleccionados

Los experimentos que se describen en los Ejemplos 11 y 12 se diseñan para abordar variables que conciernen al diseño de la vacuna minigén. De manera ideal, se usa un vector que pueda utilizarse en humanos a lo largo de todo el programa, pero puede utilizarse un plásmido vacunal de ADN para los estudios de optimización de los epítopos vacunales y después cambiar a un vector adecuado para su uso en humanos. La selección actual de vectores depende de varias variables. Por ejemplo, un factor es la disponibilidad de los vectores, adecuados para su uso en humanos, a través de una fuente de confianza, como el Laboratorio Nacional de Vectores de Genes (Universidad de Michigan).

En este ejemplo, se ligan también los minigenes optimizados para formar grandes bloques de epítopos. Todas las construcciones se diseñan preferentemente para que incorporen PADRE y la secuencia líder de dirección en el caso de los minigenes CTL, y la Ig-\alpha en el caso de los minigenes de epítopos HTL, respectivamente. En concreto, dos pares de minigenes de 10-12 epítopos CTL se ligan para generar dos minigenes de 20-24 epítopos CTL. En una situación en la que la ligación de epítopos produzca una actividad subóptima (disminuida) en comparación con los minigenes más pequeños, se investigan combinaciones y órdenes de colocación alternativos de la ligación. La pareja específica de minigenes de 20-24 epítopos CTL que produce la actividad óptima se liga entonces y se evalúa la actividad del minigén resultante que contiene todos los epítopos CTL. De nuevo se examinan hasta dos orientaciones alternativas. Debido al tamaño relativamente grande de esta construcción, se confirma el efecto de las secuencias de dirección, ya que es posible que las secuencias líder de dirección sean más eficaces en minigenes de pequeño tamaño, mientras que construcciones de tamaños mayores pueden dirigirse más eficazmente mediante señales de ubiquitina. En concreto, se genera una construcción sin secuencias de dirección específicas y se compara con una construcción cuya degradación se dirige mediante la adición de una molécula de ubiquitina.

Una estrategia similar se utiliza para HTL. Dos pares de minigenes de 3-5 epítopos HTL se ligan para generar dos minigenes de 7-9 epítopos HTL. De nuevo, en una situación en la que la ligación de estos epítopos produzca una actividad subóptima (disminuida), se investigan combinaciones y órdenes de colocación alternativos de la ligación. La pareja específica de minigenes de 7-9 epítopos HTL que produce una actividad óptima se liga y se evalúa la actividad del minigén resultante, que contiene todos los epítopos HTL. De nuevo, se examinan hasta dos orientaciones alternativas.

Basándose en estos resultados, se selecciona una configuración plasmídica optimizada capaz de liberar eficazmente un panel de, por ejemplo, epítopos del HIV, para su evaluación mediante ensayos clínicos. Por supuesto, pueden usarse epítopos de cualquier antígeno de interés (infeccioso o asociado a enfermedad) solos o en combinación. Esta configuración implicará a uno o más minigenes de epítopos HTL y a uno o más minigenes de epítopos CTL. Es preferible una combinación de un minigén CTL largo y un minigén HTL largo capaces de liberar eficazmente todos los epítopos, ya que simplifica el desarrollo clínico adicional de la vacuna. En caso de que se observen interacciones indeseables entre los dos minigenes cuando se coinyectan, se investiga la inyección de los diferentes plásmidos en los mismos animales, pero en distintos puntos de inyección, o en diferentes momentos en el tiempo. Alternativamente, si no se identifican un único minigén CTL y un único minigén HTL que codifiquen todos los epítopos deseados, se consideran combinaciones de minigenes para un desarrollo adicional.

Ejemplo 13 Evaluación y caracterización de respuestas de linfocitos CD8+ inducidas tras la inmunización con una vacuna multiepítopo

Las respuestas de linfocitos CD8+ se miden en su mayoría confiando en la técnica ELISPOT. El ensayo ELISPOT se conoce en la técnica, y se usa regularmente en el laboratorio. También se usa un lector automatizado Zeiss ELISPOT como se explica en este documento. El ensayo que se utiliza principalmente para medir las respuestas de CD8+ es el ensayo ELISPOT de IFN-\gamma, tanto en células recién aisladas como en células reestimuladas in vitro con péptidos. Adicionalmente, en casos concretos se utilizan ensayos de liberación de cromo también con células reestimuladas, y los resultados se correlacionan con los que se observan en el caso de los ensayos ELISPOT. También se realiza la tinción de tetrámeros en combinaciones seleccionadas de péptido/MHC. Debe señalarse que el gran número de combinaciones potenciales HLA/péptido a las que se dirige la vacuna puede hacer que el uso de los reactivos de la tinción de tetrámeros como ensayo clínico primario sea poco práctico, como se discute con más detalle en la sección de Antecedentes, bajo el subtítulo "Medición y cuantificación de las respuestas inmunes de muestras clínicas".

El ensayo clínico se desarrolla y se valida. El momento en el que se realiza esta actividad coincide con el periodo de tiempo que sigue a la selección de una vacuna minigén clínica, y precede a la disponibilidad de muestras reales de individuos inscritos en el ensayo clínico. Los ensayos para la evaluación de CTL pueden establecerse en base a la experiencia en la técnica, por ejemplo, la experiencia en el establecimiento de ensayos para evaluaciones de CTL en los ensayos de Fase I y II de la vacuna HBV experimental, Theradigm [Livingston et al., J Immunol, Vol. 159(3):1383-92 (1997); Heathcote et al., Hepatology, Vol. 30(2):531-6 (1999); Livingston et al., J Immunol, Vol. 162(5):3088-95 (1999)]. En concreto, pueden usarse PBMC purificadas por gradiente de Ficoll obtenidas de sujetos normales, así como, por ejemplo, de voluntarios infectados por HIV no vacunados. Como se ha señalado anteriormente, pueden usarse otras dianas antigénicas de acuerdo con la invención.

Los epítopos que se utilizan son un conjunto de epítopos supertipo A2, A3 y B7 derivados de influenza [Gianfrani et al., Eur. J. of Immunol., (1999)], así como los epítopos descritos por Ennis y colaboradores [Tamura et al., J Virol, Vol. 72(11):9404-6 (1998)]. Esto permite la validación del ensayo, así como definir unas medidas basales de niveles de respuesta en la población de pacientes que se tratan.

Después de establecer el ensayo, se evalúan las muestras clínicas. La estrategia general de ensayo es como sigue. Se usan alícuotas de PBMC enviadas como material congelado. Típicamente se usan PBMC pulsadas con péptidos para APC autólogas, ya que los epítopos que se emplean en las construcciones poliepitópicas están restringidos por una gran colección de alelos MHC de Clase I diversos, haciendo que el uso de líneas del EBV tipificadas como APC y dianas sea poco práctico.

Se evalúan tanto los cultivos no estimulados como los estimulados con péptidos. Se pueden detectar algunas respuestas en los cultivos no estimulados, pero las respuestas/epítopos más débiles pueden requerir una o dos reestimulaciones in vitro. Se puede realizar un procedimiento de ensayo como sigue. Por ejemplo, si se analizan respuestas contra aproximadamente cincuenta epítopos restringidos a Clase I, se pueden usar siete combinaciones de aproximadamente siete péptidos. También pueden usarse estas combinaciones de péptidos para la reestimulación. Se miden también las respuestas contra el epítopo PADRE. En el caso de las combinaciones de péptidos que producen resultados positivos, se analizan los péptidos individuales para identificar los péptidos responsables de la respuesta observada. Los controles positivos incluyen el Toxoide Tetánico completo, y/o el mitógeno PHA, así como la combinación de epítopos derivados del virus influenza. También se sintetizan y analizan los epítopos de unión potenciales como una combinación única.

A continuación, se realiza la tinción de tetrámeros en los pocos péptidos seleccionados e individuos que responden sobre muestras recientes o bien sobre muestras reestimuladas y se correlacionan con los datos del ELISPOT. Debe señalarse que sólo se producen los tetrámeros para los péptidos seleccionados unidos a los alelos comunes, tales como A*0201, A*0301, A*1101 y B*0702. Se analiza la capacidad de estos tetrámeros para teñir las células que tienen respuestas positivas contra los mismos péptidos, pero que están restringidas por otros miembros de un supertipo dado. Estos resultados son de interés en la determinación de la extensión de la aplicabilidad de estos reactivos como marcadores diagnóstico/sustitutos de la terapia.

En cuanto a la cantidad de células que se requieren para estos análisis, un ensayo convencional puede incluir, por ejemplo siete grupos de péptidos, un control negativo y un control positivo (un total de 10 grupos). Para analizar por duplicado, de 2 \times 10^{5} células/pocillo cada uno, que se corresponde con 10 \times 2 \times 2 \times 10^{5} = 4 \times 10^{6} células. La asunción conservadora de un 50% de recuperación después de la descongelación proporciona una estimación de unas 10^{6} PBMC/ml de sangre. No se esperan grandes variaciones en los recuentos de PBMC en los sujetos clínicos, ya que todos los individuos son o bien voluntarios sanos, o, en el ejemplo de pacientes infectados con IRV, beneficiarios de terapia HAART. En conclusión, una alícuota de PBMC obtenida de 4-8 ml de sangre es generalmente suficiente para una ronda de ensayos. Generalmente los ensayos tendrán que repetirse, para permitir la determinación de qué péptidos son positivos, y/o para permitir la reestimulación in vitro para obtener una sensibilidad máxima, o ambos. De acuerdo con esto, pueden requerirse un total de 3-4 alícuotas que se corresponden con un total de aproximadamente 20 ml de sangre.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante son solamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar de que se ha tenido un gran cuidado al recopilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la EPO renuncia a toda responsabilidad a este respecto. Documentos de las patentes citadas en la descripción

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Claims

1. Un método para la preparación de un polipéptido multiepítopo optimizado que comprende:

: al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de uno o más de dichos dos o más epítopos CTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por lisina (K), arginina (R), asparagina (N), glutamina (Q), glicina (G), alanina (A), serina (S), cisteína (C), y treonina (T); y

donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador evita la aparición de un epítopo de unión CTL.

2. Un método para la preparación de un polipéptido multiepítopo optimizado que comprende:

: al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de uno o más de dichos dos o más epítopos HTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por glicina (G), prolina (P), o asparagina (N) y

donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador evita la aparición de un epítopo de unión HTL.

3. El método de la reivindicación 2, donde dichos restos aminoacídicos flanqueantes o espaciadores constan de al menos 5 restos aminoacídicos independientemente seleccionados del grupo formado por G, P, y N.

4. El método de la reivindicación 3, donde dichos restos aminoacídicos flanqueantes o espaciadores son GPGPG (SEQ ID Nº:369).

5. El método de la reivindicación 1, donde dichos restos aminoacídicos flanqueantes o espaciadores constan de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 restos aminoacídicos seleccionados del grupo formado por A y G.

6. El método de la reivindicación 1, donde dichos restos aminoacídicos flanqueantes o espaciadores se seleccionan del grupo formado por K, R, N, G, y A.

7. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la sustitución de un resto N-terminal de un epítopo HLA que sea adyacente al extremo C-terminal de un epítopo HLA contenido en el polipéptido multiepítopo con un resto seleccionado del grupo formado por K, R, N, G, y A.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la clasificación inicial de los epítopos a incorporar en el polipéptido multiepítopo para proporcionar un orden que minimice el número de epítopos de unión que se forman.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

(i): la introducción del polipéptido multiepítopo en una célula; y

(ii): la determinación de que el polipéptido multiepítopo se procesa mediante una ruta de procesamiento HLA tal que todos los epítopos que se incluyen en el polipéptido multiepítopo se produzcan mediante una ruta de procesamiento HLA.

10. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente la clasificación inicial de los epítopos a incorporar en el polipéptido multiepítopo para proporcionar un orden que minimice el número de epítopos de unión que se forman.

11. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

: al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de uno o más de dichos dos o más epítopos HTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por glicina (G), prolina (P), asparagina (N); y

12. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente:

: al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de uno o más de dichos dos o más epítopos CTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por K, R, N, Q, G, A, S, C, y T; y

13. El método de la reivindicación 1, donde dicho polipéptido multiepítopo contiene 10 o más epítopos CTL.

14. El método de la reivindicación 13, donde dicho polipéptido multiepítopo contiene 20 o más epítopos CTL.

15. El método de la reivindicación 14, donde dicho polipéptido multiepítopo contiene 30 o más epítopos CTL.

16. El método de la reivindicación 15, donde dicho polipéptido multiepítopo contiene 40 o más epítopos CTL.

17. El método de la reivindicación 2, donde dicho polipéptido multiepítopo contiene 10 o más epítopos HTL.

18. El método de la reivindicación 17, donde dicho polipéptido multiepítopo contiene 20 o más epítopos HTL.

19. El método de la reivindicación 18, donde dicho polipéptido multiepítopo contiene 30 o más epítopos HTL.

20. El método de la reivindicación 19, donde dicho polipéptido multiepítopo contiene 40 o más epítopos HTL.

21. Un método para la preparación de un polinucleótido que codifique un polipéptido multiepítopo optimizado que comprende:

(i): la selección de dos o más secuencias de ácido nucleico que codifiquen epítopos que contengan motivos o supermotivos alelo-específicos del antígeno leucocitario humano (HLA), donde dichos epítopos son epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) HLA de Clase I; y

(ii): la incorporación de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos CTL en un polinucleótido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación (ii):

: un polinucleótido que codifique al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de una o más de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos CTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por K, R, N, Q, G, A, S, C, y T; y

22. Un método para la preparación de un polinucleótido que codifique un polipéptido multiepítopo optimizado que comprende:

(i): la selección de dos o más secuencias de ácido nucleico que codifiquen epítopos que contengan motivos o supermotivos alelo-específicos del antígeno leucocitario humano (HLA), donde dichos epítopos son epítopos de linfocitos T auxiliares (HTL) HLA de Clase II; y

(ii): la incorporación de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos HTL en un polinucleótido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación (ii):

: un polinucleótido que codifique al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de una o más de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos HTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por G, P o N; y

23. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente:

(i): la introducción del polipéptido multiepítopo en una célula; y

24. El método de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente:

: la incorporación de dichos dos o más epítopos CTL y dichos dos o más epítopos HTL en un polipéptido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación, se introduce un espaciador entre dichos dos o más epítopos CTL y dichos dos o más epítopos HTL, donde dicho espaciador evita la aparición de un epítopo de unión CTL/HTL.

25. El método de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente:

: la incorporación de dichos dos o más epítopos HTL y dichos dos o más epítopos CTL en un polipéptido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación, se introduce un espaciador entre dichos dos o más epítopos HTL y dichos dos o más epítopos CTL, donde dicho espaciador evita la aparición de un epítopo de unión CTL/HTL.

26. El método de la reivindicación 21, que comprende adicionalmente:

(i): la selección de dos o más secuencias de ácido nucleico que codifiquen epítopos que contengan motivos o supermotivos HLA alelo-específicos, donde dichos epítopos son epítopos de linfocitos T auxiliares (HTL) del antígeno leucocitario humano (HLA) de Clase II; y

: un polinucleótido que codifique al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de una o más de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos HTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por G, P o N; y donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador evita la aparición de un epítopo de unión HTL.

27. El método de la reivindicación 22, que comprende adicionalmente:

(i): la selección de dos o más secuencias de ácido nucleico que codifiquen epítopos que contengan motivos o supermotivos HLA alelo-específicos, donde dichos epítopos son epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) del antígeno leucocitario humano (HLA) de Clase I; y

: un polinucleótido que codifique al menos un resto aminoacídico flanqueante o espaciador se introduce en el extremo C-terminal de una o más de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos CTL; donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador se selecciona del grupo formado por K, R, N, Q, G, A, S, C, y T; y donde dicho resto aminoacídico flanqueante o espaciador evita la aparición de un epítopo de unión CTL.

28. El método de la reivindicación 26, que comprende adicionalmente:

: la incorporación de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos CTL y dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos HTL en un polipéptido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación, se introduce un polinucleótido que codifica un espaciador entre dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos CTL y dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos HTL, y donde dicho espaciador evita la aparición de un epítopo de unión CTL/HTL.

29. El método de la reivindicación 27, que comprende adicionalmente:

: la incorporación de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos HTL y dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos CTL en un polipéptido multiepítopo, donde, durante la etapa de incorporación, se introduce un polinucleótido que codifica un espaciador entre dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos HTL y dichas dos o más secuencias de ácido nucleico codificantes de epítopos CTL, y donde dicho espaciador evita la aparición de un epítopo de unión CTL/HTL.