JP5628716B2 - 最適化されたミニ遺伝子及びそれによってコードされるペプチド - Google Patents

最適化されたミニ遺伝子及びそれによってコードされるペプチド Download PDF

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Description

本出願は、１９９９年１２月２８日に出願した米国仮出願第６０／１７３，３９０号に対して優先権を主張する。米国仮出願第６０／１７３，３９０号は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、連邦政府資金に補助されて行われた。従って、米国政府は、ここで本発明に対して一定の権利を有し得る。
本発明は、生物学の分野に関する。特に、本発明は、ポリエピトープワクチン及び増大した免疫原性を提供するためのこのようなワクチンを設計する方法に関する。特定の実施形態では、ポリエピトープワクチンは、最適化された免疫原性の構築物を提供するミニ遺伝子によってコードされる。
多重エピトープ（「ミニ遺伝子」）ワクチンに関する技術が開発されている。いくつかの独立した研究によって、複数のエピトープに対する同時免疫応答の誘導が達成され得ることが確立された。例えば、多数のＴ細胞特異性に対する応答が誘導され得、そして検出され得る。自然状況では、Ｄｏｏｌａｎら［Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第７巻（１）：９７−１１２（１９９７）：非特許文献１］は、１人のドナー由来のＰＢＭＣを用いて１７もの多くの異なるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍエピトープに対するリコール（ｒｅｃａｌｌ）Ｔ細胞応答を同時に検出した。同様に、Ｂｅｒｔｏｎｉ及び共同実験者［Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｖｅｓｔ，第１００巻（３）：５０３−１３（１９９７）：非特許文献２］は、１人のドナーにおいて１２の異なるＨＢＶ由来エピトープに対する同時応答を検出した。多重エピトープＤＮＡミニ遺伝子ワクチンでの免疫に関して、複数のＴ細胞応答が誘導されたいくつかの例が報告されている。例えば、全てのエピトープが免疫原性及び／又は抗原性である約１０個のＭＨＣクラスＩエピトープから構成されるミニ遺伝子ワクチンが報告されている。特に、９のＥＢＶエピトープから構成されるミニ遺伝子ワクチン［Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，第９２巻（１３）：５８４５−９（１９９５）：非特許文献３］、７のＨＩＶエピトープから構成されるミニ遺伝子ワクチン［Ｗｏｏｄｂｅｒｒｙら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，第７３巻（７）：５３２０−５（１９９９）：非特許文献４］、１０のマウスエピトープから構成されるミニ遺伝子ワクチン［Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６０巻（４）：１７１７−２３（１９９８）：非特許文献５］及び１０の腫瘍由来エピトープから構成されるミニ遺伝子ワクチン［Ｍａｔｅｏら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６３巻（７）：４０５８−６３（１９９９）：非特許文献６］が活性であることが示されている。ＨＢＶ及びＨＩＶに由来する９の異なるＨＬＡ−Ａ２．１拘束エピトープ及びＨＬＡ−Ａ１１拘束エピトープをコードする多重エピトープＤＮＡプラスミドが全てのエピトープに対してＣＴＬを誘導したことも示されている［Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６２巻（７）：３９１５−２５（１９９９）：非特許文献７］。
従って、複数のＭＨＣクラスＩ（すなわち、ＣＴＬ）エピトープを含むミニ遺伝子ワクチンが設計され得、そして提示及び認識が全てのエピトープについて得られ得る。しかし、多重エピトープ構築物の免疫原性は、多数の変動要因（そのうちの多くはこれまで未知である）によって強く影響されるようである。例えば、異なるワクチン構築物の状況で発現された同じエピトープの免疫原性（又は抗原性）は、数桁の大きさにわたって変動し得る。従って、多重エピトープワクチン構築物を最適化するためのストラテジーを同定する必要性が存在する。このような最適化は、強力な免疫応答の誘導に関して、そして最終的には臨床的効力のために重要である。従って、本発明は、多数のエピトープを含むポリエピトープワクチンの抗原性及び免疫原性を最適化するためのストラテジー、ならびにこれらのストラテジーに従って生成された最適化されたポリエピトープワクチン（特にミニ遺伝子ワクチン）を提供する。
以下の段落は、ミニ遺伝子免疫原性、エピトーププロセシングならびにクラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子と一緒での抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での提示に潜在的に影響を与える主な変動要因のいくつかの短い概説を提供する。
（免疫優性）
複雑な外来病原体によってコードされる数千の可能なペプチドのうち、ごく一部が、最終的にＭＨＣクラスＩ抗原に結合し得、従って、Ｔ細胞によって認識され得るペプチド形態になる。多重エピトープワクチンの開発に対して明らかな潜在的影響のある、この現象は、免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ）として公知である［Ｙｅｗｄｅｌｌら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７：５１−８８（１９９９）：非特許文献８］。いくつかの主な変動要因が、免疫優性に寄与する。本明細書中では、本発明者らは、細胞内プロセシングの結果として定性的条件及び定量的条件の両方で適切なペプチドの生成に影響を与える変動要因を記載する。
（連結エピトープ）
連結エピトープは、２つの他のエピトープの並列に起因して作製されるエピトープとして定義される。新たなエピトープは、第１エピトープに由来するＣ末端セクション、及び第２エピトープに由来するＮ末端セクションから構成される。連結エピトープの作製は、以下の理由から、クラスＩ拘束エピトープ及びクラスＩＩ拘束エピトープについての多重エピトープミニ遺伝子ワクチンの設計における潜在的問題である。第１に、ＨＬＡトランスジェニック実験動物において免疫原性について代表的に試験される、ヒトエピトープから構成されるか又はヒトエピトープを含むミニ遺伝子を開発する場合、マウスエピトープの作製は、所望でない免疫優性効果を生じ得る。第２に、ヒトＨＬＡクラスＩ分子又はヒトＨＬＡクラスＩＩ分子についての意図しない新たなエピトープの作製は、ワクチンレシピエントにおいて、標的によって誘導されるＴ細胞応答である、感染細胞又は腫瘍によって発現されない、新たなＴ細胞特異性を惹起し得る。これらの応答は、当然無関係及び無効であり、そして所望でない免疫優性効果を生じることによって、逆効果でさえあり得る。
連結エピトープの存在は、種々の異なる実験状況において実証されている。Ｇｅｆｔｅｒ及び共同実験者は最初に、２つの異なるクラスＩＩ拘束エピトープが並列しており、そして共直線的に合成された系における効果を実証した［Ｐｅｒｋｉｎｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１４６巻（７）：２１３７−４４（１９９１）：非特許文献９］。この効果は、極めて顕著であるので、エピトープの免疫系認識はこれらの新たな連結エピトープによって完全に「サイレンス」になり得る［Ｗａｎｇら，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１４３巻（２）：２８４−９７（１９９２）：非特許文献１０］。連結エピトープに対するヘルパーＴ細胞もまた、合成リポペプチドを用いた免疫の結果としてヒトにおいて観察された。この合成リポペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束ＨＢＶ由来免疫優性ＣＴＬエピトープ及びユニバーサル破傷風トキソイド由来ＨＴＬエピトープから構成されていた［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５９巻（３）：１３８３−９２（１９９７）：非特許文献１１］。従って、連結エピトープの作製は、ポリエピトープ構築物の設計における主な考慮事項である。
本発明は、この問題と取り組み、かつ連結エピトープの出現を回避又は最少化する方法を提供する。
（隣接領域）
クラスＩ拘束エピトープは、複雑なプロセスによって作製される［Ｙｅｗｄｅｌｌら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７：５１−８８（１９９９）：非特許文献１２］。エンドプロテアーゼを伴う制限されたタンパク質分解及びエキソプロテアーゼによる潜在的なトリミングの次に、抗原プロセシングに関連したトランスポーター（ＴＡＰ）分子による小胞体（ＥＲ）膜を横切ったトランスロケーションが起こる。抗原性ペプチドの生成に関与する主な細胞質ゾルプロテアーゼ複合体及びそれらの前駆体は、プロテオソームである［Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第２巻（３）：２８９−９９（１９９５）：非特許文献１３］が、ＣＴＬ前駆体のＥＲトリミングもまた実証されている［Ｐａｚら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第１１巻（２）：２４１−５１（１９９９）：非特許文献１４］。エピトープのＣ末端及びＮ末端に直接隣接する残基がエピトープ生成の効率に影響を有するか否かについて長い間議論されている。
プロセシングされたエピトープの収率及び利用可能性は、免疫原性の決定に主な変動要因として関連しており、従って免疫応答の大きさが、ＭＨＣによって結合され、そしてＴ細胞認識のために提示されるエピトープの量に直接比例し得るという点でミニ遺伝子の能力全体に主な影響を明らかに有し得る。いくつかの研究は、これがこの場合、実際にそうであるという証拠を提供した。例えば、エピトープ密度に対して本質的に比例するウイルス特異的ＣＴＬの誘導［Ｗｈｅｒｒｙら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６３巻（７）：３７３５−４５（１９９９）：非特許文献１５］が観察されている。さらに、予めプロセシングされた最適なエピトープをコードする組換えミニ遺伝子を用いて、全長タンパク質を用いて天然で観察されるよりも高レベルのエピトープ発現を誘導した［Ａｎｔｏｎら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５８巻（６）：２５３５−４２（１９９７）：非特許文献１６］。一般に、ミニ遺伝子のプライミングは、抗原全体でのプライミングよりも有効であることが示されている［Ｒｅｓｔｉｆｏら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５４巻（９）：４４１４−２２（１９９５）：非特許文献１７；Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６２巻（７）：３９１５−２５（１９９９）：非特許文献１８］が、いくつかの例外が注目されている［Ｉｗａｓａｋｉら，Ｖａｃｃｉｎｅ，第１７（１５−１６）：２０８１−８（１９９９）：非特許文献１９］。
初期研究によって、エピトープ内の残基［Ｈａｈｎら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１７６巻（５）：１３３５−４１（１９９２）：非特許文献２０］が免疫原性を主に調節することが結論付けられた。エピトープを無関係の遺伝子又は同じ遺伝子だが異なる位置にグラフト化することに大部分基づく他の研究によっても同様の結論に到達した［Ｃｈｉｍｉｎｉら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１６９巻（１）：２９７−３０２（１９８９）：非特許文献２１；Ｈａｈｎら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１７４巻（３）：７３３−６（１９９１）：非特許文献２２］。しかし、他の実験［Ｄｅｌ Ｖａｌら，Ｃｅｌｌ，第６６巻（６）：１１４５−５３（１９９１）：非特許文献２３；Ｈａｈｎら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１７６巻（５）：１３３５−４１（１９９２）：非特許文献２４］によって、ＣＴＬエピトープに直接隣接して位置する残基が認識に直接影響を与え得ることが示唆された［Ｃｏｕｉｌｌｉｎら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１８０巻（３）：１１２９−３４（１９９４）：非特許文献２５；Ｂｅｒｇｍａｎｎら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．第６８巻（８）：５３０６−１０（１９９４）：非特許文献２６］。ミニ遺伝子ワクチンの状況では、この論争が再燃した。Ｓｈａｓｔｒｉ及び共同実験者［Ｓｈａｓｔｒｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５５巻（９）：４３３９−４６（１９９５）：非特許文献２７］は、Ｎ末端隣接残基を変動させることによってＴ細胞応答が顕著には影響されないが、単一のＣ末端隣接残基の付加によって阻害されたことを見出した。最も劇的な阻害は、Ｃ末端隣接残基としてのイソロイシン、ロイシン、システイン及びプロリンについて観察された。対照的に、Ｇｉｌｅａｄｉ［Ｇｉｌｅａｄｉら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第２９巻（７）：２２１３−２２（１９９９）：非特許文献２８］は、マウスインフルエンザウイルスエピトープのＮ末端に位置する残基の関数としての顕著な効果を報告した。Ｂｅｒｇｍａｎｎ及び共同実験者は、芳香族、塩基性及びアラニン残基が効率的なエピトープ認識を支持し、一方、Ｇ残基及びＰ残基が強く阻害性であることを見出した［Ｂｅｒｇｍａｎｎら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５７巻（８）：３２４２−９（１９９６）：非特許文献２９］。対照的に、Ｌｉｐｐｏｌｉｓ［Ｌｉｐｐｏｌｉｓら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，第６９巻（５）：３１３４−４６（１９９５）：非特許文献３０］は、隣接残基の置換は、認識をもたらさないと結論付けた。しかし、プロテオソーム特異性に影響を与えないようである、かなり保存的な置換のみが試験された。
これらの影響の特異性、そして一般に天然のエピトープの特異性は、プロテオソーム特異性とおおよそ相関するようである。例えば、プロテオソーム特異性は、部分的にトリプシン様であり［Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第２巻（３）：２８９−９９（１９９５）：非特許文献３１］、塩基性アミノ酸の後ろで切断される。それにもかかわらず、カルボキシル側の疎水性残基及び酸性残基の効率的な切断もまた可能である。これらの特異性と一致するのは、Ｓｈｅｒｍａｎ及び共同実験者の研究であり、この研究によって、ｐ５３エピトープのＣ末端の後ろの位置でのＲからＨへの変異が、このタンパク質のプロテオソーム媒介プロセシングに影響を与えることが見出された［Ｔｈｅｏｂａｌｄら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１８８巻（６）：１０１７−２８（１９９８）：非特許文献３２］。いくつかの他の研究［Ｈａｎｋｅら，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，第７９巻（第１部）：８３−９０（１９９８）：非特許文献３３；Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，第９２巻（１３）：５８４５−９（１９９５）：非特許文献３４］は、ミニ遺伝子が最小エピトープを利用して構築され得ること、及びこれらの隣接配列が必要とされないようであることを示したが、隣接領域の使用によるさらなる最適化の可能性もまた認められた。
まとめると、ＨＬＡクラスＩエピトープについて、ＣＴＬエピトープのプロセシング及び提示に対する隣接領域の効果は、未だに不確定である。調節領域の改変の効果の系統的分析は、ミニ遺伝子ワクチンについて行われていない。従って、ヒトクラスＩ一般によって拘束されたエピトープをコードするミニ遺伝子ワクチンを利用した分析が必要とされている。本発明は、このような分析を提供し、従って、免疫原性及び抗原性について最適化されたポリエピトープワクチン構築物、ならびにこのような構築物を設計する方法を提供する。
ＨＬＡクラスＩＩペプチド複合体もまた、ＨＬＡクラスＩプロセシングとは異なる複雑な一連の事象の結果として生成される。このプロセシング経路は、インバリアント鎖（Ｉｉ）との会合、特化された区画へのその輸送、ＣＬＩＰへのＩｉの分解及びＨＬＡ−ＤＭによって触媒されたＣＬＩＰ除去を含む（概説については［Ｂｌｕｍら，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１７巻（５−６）：４１１−７（１９９７）：非特許文献３５；Ａｒｎｄｔら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ，第１６巻（３）：２６１−７２（１９９７）：非特許文献３６］を参照のこと）。さらに、Ｉｉ分解において種々のカテプシン一般、ならびに特にカテプシンＳ及びカテプシンＬの潜在的に重大な役割が存在する［Ｎａｋａｇａｗａら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第１０巻（２）：２０７−１７（１９９９）：非特許文献３７］。しかし、機能的エピトープの生成に関して、このプロセスは、いくらか選択性が低いようであり［Ｃｈａｐｍａｎ Ｈ．Ａ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１０巻（１）：９３−１０２（１９９８）：非特許文献３８］、そして多くのサイズのペプチドがＭＨＣクラスＩＩに結合し得る［Ｈｕｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２５６巻（５０６５）：１８１７−２０（１９９２）：非特許文献３９］。大部分又は全ての可能なペプチドは、生成されるようである［Ｍｏｕｄｇｉｌら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５９巻（６）：２５７４−９（１９９７）：非特許文献４０；及びＴｈｏｍｓｏｎら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，第７２巻（３）：２２４６−５２（１９９８）：非特許文献４１］。従って、隣接領域の問題と比較して、連結エピトープの生成は、特定の実施形態において、より深刻な懸念であり得る。
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第７巻（１）：９７−１１２（１９９７） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｖｅｓｔ，第１００巻（３）：５０３−１３（１９９７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，第９２巻（１３）：５８４５−９（１９９５） Ｊ Ｖｉｒｏｌ，第７３巻（７）：５３２０−５（１９９９） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６０巻（４）：１７１７−２３（１９９８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６３巻（７）：４０５８−６３（１９９９） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６２巻（７）：３９１５−２５（１９９９） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７：５１−８８（１９９９） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１４６巻（７）：２１３７−４４（１９９１） Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１４３巻（２）：２８４−９７（１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５９巻（３）：１３８３−９２（１９９７） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７：５１−８８（１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第２巻（３）：２８９−９９（１９９５） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第１１巻（２）：２４１−５１（１９９９） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６３巻（７）：３７３５−４５（１９９９） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５８巻（６）：２５３５−４２（１９９７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５４巻（９）：４４１４−２２（１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６２巻（７）：３９１５−２５（１９９９） Ｖａｃｃｉｎｅ，第１７（１５−１６）：２０８１−８（１９９９） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１７６巻（５）：１３３５−４１（１９９２） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１６９巻（１）：２９７−３０２（１９８９） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１７４巻（３）：７３３−６（１９９１） Ｃｅｌｌ，第６６巻（６）：１１４５−５３（１９９１） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１７６巻（５）：１３３５−４１（１９９２） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１８０巻（３）：１１２９−３４（１９９４） Ｊ Ｖｉｒｏｌ．第６８巻（８）：５３０６−１０（１９９４） Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５５巻（９）：４３３９−４６（１９９５） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第２９巻（７）：２２１３−２２（１９９９） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５７巻（８）：３２４２−９（１９９６） Ｊ Ｖｉｒｏｌ，第６９巻（５）：３１３４−４６（１９９５） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第２巻（３）：２８９−９９（１９９５） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１８８巻（６）：１０１７−２８（１９９８） Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，第７９巻（第１部）：８３−９０（１９９８） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，第９２巻（１３）：５８４５−９（１９９５） Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１７巻（５−６）：４１１−７（１９９７） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ，第１６巻（３）：２６１−７２（１９９７） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第１０巻（２）：２０７−１７（１９９９） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１０巻（１）：９３−１０２（１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２５６巻（５０６５）：１８１７−２０（１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５９巻（６）：２５７４−９（１９９７） Ｊ Ｖｉｒｏｌ，第７２巻（３）：２２４６−５２（１９９８）
本発明は、ポリエピトープワクチンの効力を最適化するために有用なパラメーターの開示を提供する。ポリエピトープ構築物及びこのような構築物をコードする核酸（ミニ遺伝子）もまた開示する。
１つの局面において、本発明は、複数のＨＬＡエピトープを含むかつＨＬＡクラスＩプロセシング経路に提示される、ポリエピトープ構築物を設計するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）この複数のＨＬＡエピトープをソートして連結エピトープの数を最小化する工程；（ｉｉ）このポリエピトープ構築物に含まれるＨＬＡエピトープのＣ＋１位に、以下からなる群より選択される隣接アミノ酸残基を導入する工程：Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ及びＴ；（ｉｉｉ）このポリエピトープ構築物に含まれる２つのエピトープ間に１以上のアミノ酸スペーサー残基を導入する工程であって、このスペーサーは、ＣＴＬ又はＨＴＬ連結エピトープの発生を妨げる、工程；及び（ｉｖ）最小数の連結エピトープ、最小数のアミノ酸スペーサー残基、及び各ＨＬＡエピトープに対するＣ＋１位での最大数のＫ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＴを有する、１以上のポリエピトープ構築物を選択する工程。いくつかの実施形態において、これらのスペーサー残基は、公知のＨＬＡクラスＩＩ一次アンカー残基ではない残基から独立して選択される。特定の実施形態において、このスペーサー残基の導入は、ＨＴＬエピトープの発生を妨げる。このようなスペーサーは、しばしば、Ｇ、Ｐ及びＮからなる群より独立して選択される、少なくとも５アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ＧＰＧＰＧである。
いくつかの実施形態において、このスペーサー残基の導入は、ＣＴＬエピトープの発生を妨げ、そしてさらに、このスペーサーは、Ａ及びＧからなる群より独立して選択される１、２、３、４、５、６、７又は８アミノ酸残基である。しばしば、隣接残基が、ＣＴＬエピトープのＣ＋１位で導入され、そしてこれは、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｇ及びＡからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、隣接残基は、スペーサー配列に隣接する。本発明の方法はまた、このポリエピトープ構築物によって含まれる１つのＨＬＡエピトープのＣ末端に隣接する１つのＨＬＡエピトープのＮ末端残基を、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｇ及びＡからなる群より選択される残基で置換する工程を包含する。
本発明の方法はまた、ポリエピトープ構築物の構造を予測する工程、及びさらに、最大の構造（すなわち、ＨＬＡプロセシング経路によってプロセシングされ、この構築物に含まれるエピトープの全てを生じる）を有する１以上の構築物を選択する工程を、さらに包含する。
別の局面において、本発明は、請求項１〜９のいずれかに従う方法を使用して調製された、ポリエピトープ構築物を提供する。しばしば、このポリエピトープ構築物に含まれるエピトープは、ミニ遺伝子にコードされる。好ましい実施形態において、このミニ遺伝子にコードされるポリエピトープ構築物は、図９に示されるようなＨＩＶ−ＴＴ、図９に示されるＨＩＶ−ＤＧ又は図９に示されるＨＩＶ−ＴＣである。
図１は、各々２０〜２５の異なるＣＴＬエピトープを組み込んだ３つの異なる複数エピトープ構築物のデータを示す。 図２は、２つの異なる合成ポリペプチドを示し（図２ａ）、ここで、第１の構築物は、直線的に同時合成された４つの異なるエピトープを組み込み、そして第２の構築物は、ＧＰＧＰＧスペーサーを組み込む。図２ｂは、等モル量の同じペプチドのプール（各ペプチド３マイクログラム）によって誘導される応答と比較して、２ナノモルのこれらの異なる構築物が、ＩＡb陽性マウスにおける種々のエピトープに対して、増殖性応答をプライムする能力を示す。 図３は、複数エピトープＤＮＡ構築物の構造を示す。ＨＬＡ制限が各エピトープの上に示され、Ａ*０２０１エピトープは太字である。ＨＬＡ結合親和性（ＩＣ50ｎＭ）を、各エピトープの下に示す。（ａ）コードされたエピトープの順序を示すＨＩＶ−ＦＴの概略図。（ｂ）ＨＢＶ特異的構築物の概略図。Ｃｏｒｅ１８に対するＣ＋１アミノ酸は、矢印で示される。Ｃｏｒｅ１８のＣ1位に１つのアミノ酸挿入を有するＨＢＶ特異的構築物は、ＨＢＶ．１Ｘとして示される。 図４は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウス中のＨＩＶ−ＦＴにおけるＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの免疫原性を示す。（ａ）エピトープＰｏｌ４９８（丸）、Ｖｐｒ６２（三角）、Ｇａｇ３８６（四角）に対する代表的なＣＴＬ応答。各ペプチドの存在下（塗りつぶされた記号）又は非存在下（塗りつぶされていない記号）での、Ｊｕｒｋａｔ−ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb標的細胞に対する51Ｃｒ放出アッセイにおいて、細胞傷害性をアッセイした。（ｂ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−ＦＴの免疫原性のＣＴＬ応答の要約。棒線は、陽性培養物の相乗平均ＣＴＬ応答を示す。陽性ＣＴＬ培養物の頻度もまた示した。 図５は、エピトープの免疫原性についてのＣ＋１アミノ酸の影響を示す。種々のミニ遺伝子提示９４エピトープ／Ｃ＋１アミノ酸の組合せからのＣＴＬ応答を組み込むデータベースは、目的の頻度（％）を決定するために分析され、ここで、特定の組合せが最適なＣＴＬ応答と関連する。ＣＴＬ応答は、測定された培養物のうち少なくとも３０％において、１００ＳＵ又は２０ＬＵを超える場合に、最適であるとみなされた。所定のエピトープ／Ｃ＋１アミノ酸の組合せが観察された回数もまた、提供される。 図６は、ＨＢＶ特異的構築物に対するＣＴＬ応答を示す。（ａ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスのＤＮＡ免疫化後の、Ｃｏｒｅ１８エピトープに対するＣＴＬ応答。（ｂ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスを、Ｃｏｒｅ１８のＣ＋１位で１つのアミノ酸挿入によって変更された構築物でＤＮＡ免疫化した後の、ＨＢＶ Ｃｏｒｅ１８に対するＣＴＬ応答。 図７は、ＨＢＶ．１（陰影のある棒線）及びＨＢＶ．１Ｋ（斜線した棒線）トランスフェクト細胞株における、ＨＢＶ Ｃｏｒｅ１８提示のレベルを示す。エピトープ提示を、ペプチド特異的ＣＴＬ株を使用して数量化した。ＨＢＶ Ｐｏｌ４５５の提示を、比較目的で示す。 図８は、ＨＩＶ−１ミニ遺伝子でトランスフェクトされた２２１Ａ２Ｋb標的細胞についてのデータを示す。これらのトランスフェクトされた細胞を、ＨＬＡトランスジェニックマウス由来でありそして種々のＨＩＶ誘導ＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬ株に対してエピトープを提示するその能力についてアッセイした。異なるＣＴＬ株の抗原感受性における差異を補正するために、ＡＰＣとして非トランスフェクト細胞を用いて、ペプチド用量滴定を並行して行った。 図９は、本発明の方法を使用して最適化したＨＩＶポリエピトープ構築物を示す。
本明細書中で引用された、すべての刊行物、特許及び特許出願が、すべての目的のために、それらの全体において本明細書中で参考として援用される。
（定義）
本発明は、以下の定義を参照して、より良好に理解され得る。
本開示を通して、「結合データ」結果を、しばしば、用語「ＩＣ50」で表す。ＩＣ50は、参照ペプチドの結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチドの濃度である。このアッセイを行う条件（すなわち、律速のＨＬＡタンパク質濃度及び標識ペプチド濃度）を考慮すると、これらの値は、ＫD値と近似する。結合を測定するためのアッセイは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７及びＷＯ９４／０３２０５に、詳細に記載される。アッセイ条件が変化する場合に、そして使用する特定の試薬（例えば、ＨＬＡ調製物など）に依存して、ＩＣ50値が、（しばしば、劇的に）変化し得ることに留意するべきである。例えば、過剰濃度のＨＬＡ分子は、所定のリガンドの見かけ上測定されるＩＣ50を増加させる。あるいは、結合は、参照ペプチドと関連して表される。特定のアッセイがより高感度又はより低感度になるにつれて、試験したペプチドのＩＣ50は幾分変化し得るが、参照ペプチドに対する結合は、有意には変化しない。例えば、その参照ペプチドのＩＣ50が１０倍増加するような条件下で行うアッセイにおいて、試験ペプチドのＩＣ50値もまた、約１０倍シフトする。従って、あいまい性を回避するために、ペプチドが良好な結合因子であるか、中程度の結合因子であるか、弱い結合因子であるか又はネガティブな結合因子であるかの評価は、一般に、標準ペプチドのＩＣ50に対する、そのＩＣ50に基づく。結合はまた、以下を使用するアッセイ系を含む、他のアッセイ系を使用して測定され得る：生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９２，１９８９；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７、１９９１；Ｂｕｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３、１９９９０；Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９、１９９１；ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５，１９９５）、界面活性剤溶解物を使用する無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２０６９，１９９１）、固定した精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２８９０，１９９４；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６，１９９４）、ＥＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２８２９，１９９２）、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｋｈｉｌｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５，１９９３）；高フラックス可溶相アッセイ（ｈｉｇｈ ｆｌｕｘ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｈａｓｅ ａｓｓａｙ）（Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３，１９９４）、及びクラスＩ ＭＨＣの安定化又はアセンブリの測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６、１９９０；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ ６２：５６３、１９９０；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ ６２：２８５、１９９０；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９；１８９６，１９９２）。
エピトープ中の残基位置の「カルボキシル末端」又は「カルボキシル末端位置」との表示は、ペプチドのカルボキシル末端に最も近い、そのエピトープの末端の残基位置をいい、これは、以下に定義されるような従来の命名法を使用して命名される。「Ｃ＋１」とは、そのエピトープのＣ末端残基の直後の残基又は位置をいい、すなわち、そのエピトープのＣ末端に隣接する残基をいう。そのポリエピトープ構築物のカルボキシル末端に存在するエピトープの「カルボキシル末端位置」は、そのポリペプチドのカルボキシル末端に対応してもよいし、実際には対応しなくてもよい。好ましい実施形態において、最適化されたポリエピトープ構築物において使用されるエピトープは、モチーフ保有エピトープであり、そしてこのエピトープのカルボキシル末端は、特定のモチーフに対応する一次アンカー残基について規定される。
エピトープ中の残基位置の「アミノ末端」又は「アミノ末端位置」との表示は、ペプチドのアミノ末端に最も近い、そのエピトープの末端の残基位置をいい、これは、以下に定義されるような従来の命名法を使用して命名される。「Ｎ−１」とは、エピトープのアミノ末端（位置番号１）でそのエピトープに直ぐ隣接する残基又は位置をいう。そのポリエピトープ構築物のアミノ末端に存在するエピトープの「アミノ末端位置」は、そのポリペプチドのアミノ末端に対応してもよいし、実際には対応しなくてもよい。好ましい実施形態において、最適化されたポリエピトープ構築物において使用されるエピトープは、モチーフ保有エピトープであり、そしてこのエピトープのアミノ末端は、特定のモチーフに対応する一次アンカー残基について規定される。
「コンピューター」又は「コンピューターシステム」は、一般に、以下を備える：プロセッサー；少なくとも１つの情報記憶／検索装置（例えば、ハードドライブ、ディスクドライブ又はテープドライブなど）；少なくとも１つの入力装置（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、又はマイクロホンなど）；及びディスプレイ構造。さらに、コンピューターは、ネットワークと連絡する通信チャネルを備え得る。このようなコンピューターは、多かれ少なかれ、上記に列挙したものを備え得る。
本明細書中で使用される場合、「構築物」は、一般に、天然に存在しない組成物を示す。構築物は、合成技術（例えば、組換えＤＮＡの調製及び発現又は核酸又はアミノ酸についての化学合成技術）によって、生成され得る。構築物はまた、結果としてその形態が天然において見出されないように、ある材料への別の材料の付加又は合併（ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ）によって生成され得る。「ポリエピトープ構築物」は、複数のエピトープを含む。
「交差反応結合」とは、１より多いＨＬＡ分子がペプチドに結合することを示し；同義語は、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）結合である。
「潜在（ｃｒｉｐｔｉｃ）エピトープ」は、単離されたペプチドでの免疫によって応答を誘導するが、そのエピトープを含むインタクトなタンパク質全体が抗原として使用される場合に、その応答は、インビトロで交差反応性でない。
「ドミナント（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープ」は、ネイティブ抗原全体での免疫に際して免疫応答を誘導するエピトープである（例えば、Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６，１９９３を参照のこと）。このような応答は、単離されたペプチドエピトープとは、インビトロで交差反応性である。
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセットであるか、又はＴ細胞の状況下では、Ｔ細胞レセプタータンパク質及び／又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識に必要な残基である。インビボ又はインビトロでの免疫系の設定において、エピトープは、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプター又はＨＬＡ分子によって認識される部位を共に形成する、分子の集団的特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造及び三次ペプチド構造及び電荷のような）である。本開示全体を通して、エピトープ及びペプチドは、しばしば、交換可能に使用される。しかし、本発明のエピトープより大きくかつ本発明のエピトープを含む単離又は精製されたタンパク質又はペプチド分子は、なお本発明の範囲内にあることが理解される。
「隣接残基」は、エピトープの次に位置する残基である。隣接残基は、エピトープのＮ末端又はＣ末端に隣接する位置で導入又は挿入され得る。
「免疫原性ペプチド」又は「ペプチドエピトープ」とは、そのペプチドがＨＬＡ分子を結合しそしてＣＴＬ応答及び／又はＨＴＬ応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフ又はスーパーモチーフを含むペプチドである。従って、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し得、そしてその後、この免疫原性ペプチドが由来する抗原に対して、細胞傷害性Ｔ細胞応答又はヘルパーＴ細胞応答を誘導し得る。
「ヘテロクリティックアナログ」は、所定の用量に対する応答の増加又は同じ応答を達成するために要求される量の低さによって測定されるような、特異的Ｔ細胞に対する増加された効力を有するペプチドとして、本明細書中に定義される。ヘテロクリティックアナログの利点としては、その抗原が、より強力であり得るか又はより経済的（なぜなら、より低い量が、同じ効果を達成するために必要とされるからである）であり得ることが挙げられる。さらに、改変されたエピトープは、抗原特異的Ｔ細胞非応答性（Ｔ細胞寛容性）を克服し得る。
「ヒトリンパ球抗原」又は「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩ又はクラスＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）である。
本明細書中で使用される場合、「ＨＬＡスーパータイプ又はＨＬＡファミリー」とは、共有するペプチド結合特異性に基づいてグループ化したＨＬＡ分子のセットを記載する。特定のアミノ酸モチーフを保有するペプチドに対して幾分類似した結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、このようなＨＬＡスーパータイプにグループ化される。用語ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、ＨＬＡファミリー及びＨＬＡ ｘｘ様分子（ここで、ｘｘは、特定のＨＬＡ型を示す）は、同義である。
本明細書中で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高親和性」とは、５０ｎＭ以下のＩＣ50又はＫD値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ50又はＫD値での結合である。ＨＬＡクラスＩＩ分子への結合に関する「高親和性」とは、１００ｎＭ以下のＩＣ50又はＫD値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは、約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ50又はＫD値での結合である。
「ＩＣ50」は、参照ペプチドの結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチドの濃度である。アッセイを行う条件（すなわち、律速のＨＬＡタンパク質濃度及び標識ペプチド濃度）を考慮すると、これらの値は、ＫD値と近似する。
２以上のペプチド配列の状況下で、用語「同一」又はパーセント「同一性」とは、配列比較アルゴリズムを使用してか又は手動の整列化及び目視検査によって測定されるように、比較ウインドウにわたる最大一致について比較及び整列化した場合に、同じであるか又は特定のパーセンテージの同一アミノ酸残基を有する、２以上の配列又は部分配列をいう。
ポリエピトープ構築物中の特定の位置（例えば、このエピトープのＣ末端に、そのＣ末端側で隣接して）でアミノ酸残基を「導入する」とは、所望の残基が特定の位置（例えば、そのエピトープに隣接して）にあるようにか、又は有害な残基がこのエピトープのＣ末端に隣接しないように、複数のエピトープを構成することを包含する。この用語はまた、特定の位置でアミノ酸残基（好ましくは、好ましいアミノ酸残基又は中間体アミノ酸残基）を挿入することを含む。アミノ酸残基はまた、１つのアミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置換によって、配列に導入され得る。好ましくは、このような置換は、例えば、同時係属Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２６０，７１４（１９９９年３月１日出願）及び出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４に示される、アナログ化原理に従って作製される。
句「単離された」又は「生物学的に純粋」とは、そのネイティブ状態において見い出される場合に通常その物質に付随する成分を、実質的又は本質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくは、そのインサイチュ環境下でそのペプチドに通常会合する物質を含まない。
「連結」又は「結合」とは、ペプチドを機能的に接続するための当該分野で公知の任意の方法をいい、これらには、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、及び静電結合が挙げられるが、これらに限定されない。
「主要組織適合遺伝子複合体」又は「ＭＨＣ」は、生理的免疫応答を担う細胞性相互作用の制御において役割を担う遺伝子のクラスターである。ヒトにおいて、ＭＨＣ複合体はまた、ＨＬＡ複合体として公知である。ＭＨＣ複合体及びＨＬＡ複合体の詳細な説明については、Ｐａｕｌ、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３を参照のこと。
本明細書で用いられる場合、「ペプチドの中間」とは、アミノ末端でもカルボキシル末端でもないペプチドの位置をいう。
「結合ペプチドの最小数」とは、本明細書で用いられる場合、無作為な選択基準を用いて作製されたものよりも少ない結合ペプチドの数をいう。
用語「モチーフ」は、規定された長さのペプチドにおける残基のパターンをいう。一般に、クラスＩ ＨＬＡモチーフについて約８〜約１３アミノ酸及びクラスＩＩ ＨＬＡモチーフについて約６〜約２５アミノ酸のペプチドであり、これは、特定のＨＬＡ分子によって認識される。ペプチドモチーフは、代表的には、各々のヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各々のタンパク質について異なり、そして一次アンカー残基及び二次アンカー残基のパターンにおいて異なる。
「陰性な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）結合残基」又は「有害な（ｄｅｔｅｒｉｏｕｓ）残基」は、ペプチドエピトープにおける特定の位置（代表的には一次アンカー位置ではない）に存在する場合に、ペプチドの対応するＨＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性の減少を生じさせるアミノ酸である。
「最適化された」ポリエピトープ構築物は、連結エピトープの発生を最小化するためのエピトープのソート、エピトープのＣ末端又はＮ末端に隣接する隣接残基の挿入、及び連結エピトープの発生を防止するためか又は隣接残基を提供するためのスペーサー残基のさらなる挿入による構築物の増加した免疫原性又は抗原性をいう。最適化されたポリエピトープ構築物の免疫原性又は抗原性における増加は、最適化されたパラメータに基いて構築されていないポリエピトープ構築物と比較して測定される。そして当該分野で公知のアッセイ（例えば、トランスジェニック動物における免疫原性の評価、ＥＬＩＳＰＯＴ、インターフェロンγ遊離アッセイ、テトラマー染色、クロム遊離アッセイ、及び樹状細胞に対する提示）が用いられる。
用語「ペプチド」は、本明細書中において「オリゴペプチド」と相互変換可能に使用され、（代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって）互いに連結される一連の残基（代表的にはＬ−アミノ酸）を示す。本発明の好ましいＣＴＬ誘導ペプチドは、１３以下の残基長であり、そして通常、約８残基と約１１残基との間（好ましくは９又は１０残基）からなる。好ましいＨＴＬ誘導オリゴペプチドは、約５０残基長未満であり、そして通常、約６残基と約３０残基との間からなり、より通常には、約１２残基と２５残基との間、そしてしばしば約１５残基と２０残基との間からなる。
「汎ＤＲ結合ペプチド又はＰＡＤＲＥTMペプチド」は、１つ以上のＨＬＡクラスＩＩＤＲ分子に結合する分子のファミリーのメンバーである。ＰＡＤＲＥTMファミリーの分子を定義するパターンは、ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフとして考えられ得る。ＰＡＤＲＥは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、そしてインビトロ及びインビトロでヒトヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答を刺激する。
「薬学的に受容可能な」は、一般に、非毒性の、不活性な、及び／又は薬理学的に適合性の組成物をいう。
「ＨＬＡクラスＩプロセシング経路に提示された」は、ポリエピトープ構築物が細胞に導入された結果、ＨＬＡクラスＩプロセシング経路により大部分がプロセスされることを意味する。代表的に、ポリエピトープ構築物は、ポリエピトープ構築物をコードする発現ベクターを用いて細胞に導入される。クラスＩＩプロセシング経路へのエピトープの侵入機構は定義されていないが、このようなミニジーンによりコードされるＨＬＡクラスＩＩエピトープはまた、クラスＩＩ分子に提示される。
「一次アンカー残基」又は「一次ＭＨＣアンカー」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子との間の接触点を提供することが理解されるペプチド配列に沿った特定位置におけるアミノ酸である。規定された長さのペプチド内の１〜３個（通常は２個）の一次アンカー残基は、一般に、免疫原性ペプチドについての「モチーフ」を規定する。これらの残基は、結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）自身の特定のポケットにおいて埋没するこれらの側鎖を有する、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）と密接に接触して適合することが理解される。１つの実施形態において、例えば、ＨＬＡクラスＩエピトープの一次アンカー残基は、本発明に従って９残基ペプチドエピトープの位置２（アミノ末端位から）及びカルボキシル末端位に配置される。各々のモチーフ及びスーパーモチーフについての一次アンカー位置は、ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７６６、ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４の表Ｉ及び表ＩＩＩに示される。さらに、アナログペプチドは、これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在又は非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定のモチーフ又はスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を調節する。
「乱雑な認識」は、種々のＨＬＡ分子の状況下において、別々のペプチドが同一のＴ細胞クローンによって認識されることである。乱雑な認識又は結合は、交差反応性結合と同義である。
「防御免疫応答」又は「治療的免疫応答」は、感染性因子又は腫瘍抗原由来の抗原に対するＣＴＬ応答及び／又はＨＴＬ応答をいい、いくつかの場合これは、疾患の症状、副作用、又は進行を予防するか又は少なくとも部分的に抑制する。免疫応答はまた、ヘルパーＴ細胞の刺激によって促進された抗体応答を含み得る。
用語「残基」は、アミド結合又はアミド結合模倣物によってペプチド又はタンパク質に組み込まれるアミノ酸又はアミノ酸模倣物をいう。
「二次アンカー残基」は、ペプチドにおける一次アンカー位置以外の位置での、ペプチド結合に影響し得るアミノ酸である。二次アンカー残基は、結合したペプチドの中である位置でのアミノ酸の無秩序な分布によって期待されるより有意に高い頻度で生じる。二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」で生じるといわれる。二次アンカー残基は、高い親和性もしくは中程度の親和性で結合するペプチドの中でより高頻度で存在する残基、又はさもなくば高い親和性もしくは中程度の親和性の結合と関連する残基として同定され得る。例えば、アナログペプチドは、これらの二次アンカー位置における特定の残基の存在又は非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定のモチーフ又はスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を良好に調節する。用語「固定されたペプチド」は、アナログペプチドをいうためにしばしば用いられる。
「エピトープをソーティングする」は、ポリエピトープ構築物におけるエピトープの順番を決定又は設計することをいう。
「スペーサー」は、ポリエピトープ構築物の２つのエピトープ間に挿入されて連結エピトープの発生を防ぐ配列をいう。ＨＬＡ クラスＩＩエピトープについて、スペーサーは、５アミノ酸又はそれ以上の長さであり、そしてスペーサー配列中のアミノ酸残基（例えば、Ｇ、Ｐ、又はＮ）は、代表的にはＨＬＡクラスＩＩモチーフの一次アンカー残基であることが知られていない（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４）。
「サブドミナント（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープ」は、エピトープを含む抗原全体での免疫に際して応答をほとんど引き起こさないか又は全く引き起こさないが、単離されたペプチドでの免疫によって応答が得られ得るエピトープであり、そして（潜在エピトープの場合とは異なり）この応答は、タンパク質全体を使用してインビトロ又はインビトロでの応答をリコールする場合に、検出される。
「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパーモチーフ保有ペプチドは、２つ以上のＨＬＡ抗原によって高い親和性又は中程度の親和性（本明細書中に規定される）で認識される。
「合成ペプチド」は、天然に存在しないが、化学合成又は組換えＤＮＡ技術のような方法を使用してヒトが作製したペプチドをいう。
「ＴＣＲ接触残基」又は「Ｔ細胞レセプター接触残基」は、Ｔ細胞レセプターにより結合されると考えられているエピトープ中のアミノ酸残基であり、本明細書では任意の一次ＭＨＣアンカーではないと定義される。Ｔ細胞レセプター接触残基は、ペプチドにおける位置／位置として定義され、野生型のペプチドを用いて誘導されるＩＦＮγ産生と比較して、試験されたすべてのアナログがネガティブなＩＦＮγ産生を誘導する。
ペプチド化合物を記載するのに用いられる命名法は、伝統的な慣例に従う。ここで、アミノ基は各アミノ酸残基の左側に表わし（Ｎ末端）、そしてカルボキシル基は右側に表わす（Ｃ末端）。アミノ酸残基の位置がペプチドエピトープにおいて言及される場合、アミノからカルボキシルの方向に番号付けされる（位置１は、エピトープ、もしくはその一部であり得るペプチド又はタンパク質のアミノ末端にもっとも近い位置である）。式の表現に関する本発明の選択された特定の実施形態において、（詳細には示さないが）アミノ末端基及びカルボキシル末端基は、そうではないと特定されない限り、生理的なｐＨ値でとると考えられる形態である。アミノ酸構造式において、各残基は、一般に、標準的な三文字又は一文字表示で表わされる。アミノ酸残基のＬ体は、大文字の一文字又は頭文字が大文字の三文字表示で表わされ、Ｄ体を有するこれらのアミノ酸のＤ体は、小文字の一文字又は小文字の三文字表示で表わされる。グリシンは、不斉炭素原子を有さず、単に「Ｇｌｙ」又はＧと言及される。アミノ酸表記を以下に示す。
Figure 0005628716
アミノ酸の「化学的特性」は次のように定義される：芳香族（Ｆ、Ｗ、Ｙ）；脂肪族疎水性（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ）；低極性（Ｓ、Ｔ、Ｃ）；大極性（Ｑ、Ｎ）；酸性（Ｄ、Ｅ）；塩基性（Ｒ、Ｈ、Ｋ）；プロリン；アラニン；及びグリシン。
本明細書で用いられる略語は次のようなものである：
Figure 0005628716
本出願は、１１／１０／９８に出願したＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／１８９，７０２（これは３／４／９４に出願したＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２０５，７１３（これは、１１／２９／９３に出願した０８／１５９，１８４（これは６／４／９３に出願した０８／０７３，２０５（これは、３／５／９３に出願した０８／０２７，１４６のＣＩＰであり、現在取下げられている）のＣＩＰであり、現在取下げられている）のＣＩＰであり、現在取下げられている）のＣＩＰである）に関連し得る。本出願はまた、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２２６，７７５（これは、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８１５，３９６（これは、現在取下げられているＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０１３，１１３の利益を主張している）のＣＩＰである）に関連し得る。さらに、本出願は、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／０１７，７３５（これは、取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／５８９，１０８；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／７５３，６２２、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８２２，３８２、取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０１３，９８０、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４５４，０３３、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／１１６，４２４、及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３４９，１７７のＣＩＰである）に関連し得る。本出願はまた、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／０１７，５２４、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８２１，７３９、取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０１３，８３３、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／７５８，４０９、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／５８９，１０７、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４５１，９１３、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１８６，２６６、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／１１６，０６１、及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３４７，６１０（これは、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１５９，３３９（これは、取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１０３，３９６（これは、取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／０２７，７４６（これは、取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／９２６，６６６のＣＩＰである）のＣＩＰである）のＣＩＰである）のＣＩＰである）に関連し得る。本出願はまた、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／０１７，７４３、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／７５３，６１５；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／５９０，２９８、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／１１５，４００、及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４５２，８４３（これは、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３３４，８２４（これは、取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２７８，６３４のＣＩＰである）のＣＩＰである）に関連し得る。本出願はまた、仮のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０８７，１９２、及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／００９，９５３（これは取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０３６，７１３、及び取下げられたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０３７，４３２のＣＩＰである）に関連し得る。さらに、本出願は、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／０９８，５８４及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２３９，０４３に関連し得る。本出願はまた、同時係属中の５／３０／００に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／５８３，２００、３／１／９９に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２６０，７１４、及び１０／６／００に出願されたＵ．Ｓ．仮出願「Ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ Ａｎａｌｏｇｓ Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」（代理人事件整理番号０１８６２３−０１５８１０ＵＳ）に関連し得る。上記の出願はすべて、本明細書中で参考として援用される。
（特定の実施形態の説明）
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．緒言）
本発明は、最適化された免疫原性を有する多重エピトープワクチンを設計する方法に関する。好ましい実施形態では、このワクチンは、ＣＴＬエピトープ及びＨＴＬエピトープを含む。本発明に従うワクチンは、有意に民族に偏らない集団範囲を考慮し、そして、好ましくは、異なるウイルス又は他の抗原性単離物に関して保存されたエピトープに焦点を合わせ得る。このワクチンは、応答の大きさ（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）及び広さ（ｂｒｅａｄｔｈ）に関して最適化され得、そして最も単純なエピトープ立体配置を可能にし得る。最終的に、一般的方法を提供して、ヒトにおけるポリエピトープワクチンの免疫原性を評価する。
本発明の方法は、本明細書中で特定される原理に基づいてポリエピトープ構築物を設計する工程を包含する。１つの局面では、本発明は、単一プロモーターのミニ遺伝子ワクチンを用いて、特定のＣＴＬエピトープ及びＨＴＬエピトープに対する応答の同時誘導を提供する。このようなミニ遺伝子構築物は、多くの異なるエピトープ（好ましくは１０個を越え、頻繁に、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、又は７０個以上を越える）を含み得る。
ポリエピトープ構築物を設計する際に、以下を考慮する：
（ｉ）ポリエピトープ構築物中へ取り込まれるエピトープがソートされて、形成される連結エピトープの数を最小化する順序を提供する。いくつかの実施形態では、ソートは、コンピューターにより行われる。好ましくは、エピトープの順位付けの際の第２の考慮すべきこととして、エピトープが、ＣＴＬ免疫原性を生成するエピトープのＮ末端の残基が、別のＣＴＬエピトープのＣ末端に並べられるように、配置される。
（ｉｉ）免疫原性を増強する隣接残基が、エピトープの隣接位置に挿入される。特定の実施形態では、隣接残基は、ＣＴＬエピトープのＣ＋１位に挿入される。
（ｉｉｉ）スペーサー配列をエピトープの間に挿入して、連結エピトープの発生を防ぐ。特定の実施形態では、スペーサー配列はまた、残基がＣＴＬエピトープのＣ末端に隣接するように、リンカーのＮ末端で免疫原性を生じる残基を含み得る。
ＨＴＬ連結エピトープを防ぐ特定の実施形態では、任意の公知のＨＬＡクラスＩＩアンカー残基に対応しないアミノ酸残基からなるスペーサーが用いられる（例えば、二者択一のＧ残基及びＰ残基（ＧＰスペーサー）は、２つのＨＴＬエピトープ間に含まれる）。
本発明の別の局面（上記考慮（ｉｉ））は、エピトープに隣接する位置（例えば、エピトープのＣ末端に直に隣接する位置）の特定のアミノ酸残基の導入又は置換に関与し、それにより、この部位に導入又は置換された特定の残基を含まない構築物と比較して、増加した抗原性及び免疫原性を有するポリエピトープ構築物（すなわち、最適化ミニ遺伝子）を生成する。ポリエピトープ構築物を最適化する方法は、エピトープのＣ＋１位（すなわち、エピトープのＣ末端に直に隣接する位置）に隣接残基（好ましくは、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｒ、又はＡ）を導入する工程を包含する。代替の実施形態では、免疫原性を低下させるのに寄与する残基（すなわち、負電荷の残基、例えば、Ｄ，脂肪族残基（Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ）又は芳香族非トリプトファン（ｔｒｙｔｏｐｈａｎ）残基）が、置換される。隣接残基は、適切なエピトープを配置することにより導入されて、望ましい隣接残基を提供し得るか、又は特定の残基を挿入し得る。
（最適化ポリエピトープワクチン構築物を設計する際に考慮すべきこと）
背景の節において述べたように、１０個までのエピトープをコードするミニ遺伝子が、多数の異なるエピトープに対する応答を誘導するために用いられている。実験的ミニ遺伝子であるｐＭｉｎ．１に関するデータが、公開されている［Ｉｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１６２（７）：３９１５−２５（１９９９）］。目的の無数の疾患の兆候に取り組む、最適化免疫原性を有するミニエピトープ構築物を設計及び評価するためのパラメーターが、本明細書中に開示される。
設計パラメータは、多数の研究に基づいて特定される。ポリエピトープ構築物の予備的な評価の際に、３つの異なる多重エピトープ構築物（２０〜２５個の異なるＣＴＬエピトープを各々含む）に関するデータを示す（図１）。１つの構築物は、ＨＩＶ誘導エピトープに基づき、他の２つは、ＨＣＶ誘導エピトープ（それぞれ、ＨＣＶ１及びＨＣＶ２）に組み入れる。これらの異なるミニ遺伝子の免疫原性は、Ａ２ ＨＬＡトランスジェニックマウス又はＡ１１ ＨＬＡトランスジェニックマウスのいずれかにおいて測定される（Ａ１、Ａ２４、及びＢ７制限エピトープは評価されない）。
従って、単回のｉ．ｍ．ＤＮＡワクチン注射の１１日後、８〜１４個の異なる例示的エピトープに対する応答を、ＣＴＬ活性を測定するアッセイ（本明細書中に記載される、クロム放出又はインサイチュＩＦＮ産生のいずれか）を利用して評価する前に、６日目に単回のインビトロでの再刺激をした。エピトープ特異的ＣＴＬの刺激は、ＨＩＶ−１、ＨＣＶ１及びＨＣＶ２の場合、それぞれ、試験されるエピトープの６／８（７５％）、１０／１４（７２％）、１３／１４（９３％）について実証し得る。従って、多数のエピトープに対するＣＴＬ応答を同時刺激し得る、多重エピトープミニ遺伝子が、容易に設計され得る。しかし、いくつかのエピトープのＣＴＬ刺激が検出されず、そして考慮される３６の事例のうちのいくつかでは、応答はまれであるか、少なくとも１０3（１０００倍）を越える大きさで、有意に変化する、ことが強調されるべきである。これらの結果は、ミニ遺伝子構築物のより慎重な分析及び最適化が必要とされることを強く示唆する。
特定のエピトープを刺激する最適下限の能力が、ミニ遺伝子のサイズに関与する可能性もまた試験される。実際、ほとんどの既報は、１０個までのエピトープのミニ遺伝子を記載し、そして２０個のエピトープのミニ遺伝子が報告されているいくつかの例で、２又は３個のエピトープのみに対する活性が測定される。この可能性に取り組むために、２つのより小さなミニ遺伝子（ＨＩＶ−１．１及びＨＩＶ１．２、各々１０個のエピトープを含み、そしてＨＩＶ−１ミニ遺伝子の半分に対応する）を合成し、そして試験した。４つの例示的エピトープに対する応答を測定した。
Figure 0005628716
より小さなミニ遺伝子により誘導された応答は、２０個のエピトープ構築物により誘導された応答よりに匹敵するか、むしろ低いことを見出した（表１）。従って、ミニ遺伝子のサイズに関係する因子は、特定のエピトープに対する観察された最適下限での刺激を説明できないと考えられ、従って、他のパラメータ（本明細書中に開示される）を用いて有効なポリエピトープ構築物設計する。
（連結モチーフの最小化）
ポリエピトープ構築物を設計する際の考慮すべきことの１つは、エピトープをお互いに隣接して配置する場合の連結エピトープの不慮の生成である。ミニ遺伝子におけるこのようなエピトープの存在は、ミニ遺伝子の能力に有意に影響し得る。この望まれない効果を防ぐためのストラテジーは、ポリエピトープワクチン又はミニ遺伝子ワクチンの開発への適用のために、本明細書中で開示される。連結エピトープは、初めに、エピトープをソートすることにより最小化されて、連結エピトープの数が最小化される順序を特定する。このようなソート手順は、コンピューター、又は目（必要な場合、すなわち、ポリエピトープ構築物に含まれるエピトープの数に依存して）を用いて行われ得る。
例えば、パターンを見つけ出すコンピュータプログラム（例えば、Ｐａｎｏｒａｍａ）は、多重エピトープミニ遺伝子の設計に使用され得る。多くの異なるエピトープ配列が、特定のミニ遺伝子構築物を設計する際に考慮され得れ得る。コンピュータプログラムは、入力として、考慮される特定のセットのエピトープ、及びこれらのモチーフを保有する任意の連結エピトープが存在するか否かを評価するために走査されるモチーフを受け入れる。例えば、プログラムは、ミニ遺伝子の形成をシミュレートし得、ユーリスティック（ｅｕｒｉｓｔｉｃ）コンピュータアルゴリズムにおいて、連結モチーフの存在を避けるか又は最小化するためにエピトープ対を調べる。このプログラムは、例えば、１秒当たり６×１０5（約５０万）のミニ遺伝子の構成を評価し得る。あまり好ましくない代替物（より時間を消費するので）として、非コンピュータ援助分析が実行され得る。
先のパラグラフに記載されるように、コンピュータプログラムを使用する１０−エピトープ構築物の完全な分析は、１０の階乗（約３．６×１０6）の組み合わせを調べることが必要であり、６秒間で完了し得る。１４−エピトープ構築物は、２日で完全に分析され得る。しかし、分析時間は、より大きなミニ遺伝子が考慮されるので、非常に迅速に増加する。完全な分析は、必要とされず、プログラムは、任意の所望の長さの時間で実行され得る。この場合において、最小の数の連結エピトープを提供する構成が提供される。
このタイプのアプローチの結果の例は、表２に提示される。２５のエピトープを組み込むＨＣＶ１ミニ遺伝子に含まれる同じエピトープの１０個の異なるランダムな組合せにおける連結モチーフの数（２日間のコンピュータ分析の結果であった）を、表に提示した。非最適化組合せにおいて、多数のＡ２、Ａ１１及びＫbモチーフが、２５〜３８の範囲、平均３１で見出された。比較して、２つのこのような連結モチーフのみが、ＨＣＶ１ミニ遺伝子組合せに提示される。結論として、コンピュータプログラムは、ミニ遺伝子構築物に提示される連結モチーフの数を効果的に最小化するために利用され得る。
Figure 0005628716
（クラスＩＩ連結エピトープの除去及びクラスＩＩ制限応答についてのインビボの試験）
連結エピトープを除く際のさらなるエレメントとして、スペーサー配列が、並列した場合に連結エピトープを作製する２つのエピトープ間に挿入され得る。
ＨＴＬエピトープについての連結エピトープの問題を補正するために、少なくとも５個のアミノ酸の長さのスペーサーを２つのエピトープ間に挿入する。このようなスペーサーに組み込まれるアミノ酸残基は、好ましくは、ＨＬＡクラスＩＩ結合モチーフのいずれに対しても一次アンカー残基であることが公知ではないアミノ酸残基である。このような残基には、Ｇ、Ｐ、及びＮが挙げられる。好ましい実施形態において、配列ＧＰＧＰＧを有するスペーサーが２つのエピトープ間に挿入される。以前の研究によって、ＧＰスペーサーがクラスＩＩ結合相互作用を破壊する際に特に効果的であることが示された［Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１２６８−７３（１９８９）］。全ての公知のヒトクラスＩＩ結合モチーフ及びマウスＩＡb（ＨＬＡトランスジェニックマウスによって発現されるクラスＩＩ）は、４つの残基が離れて配置される、この主要なアンカー位置におけるＧ又はＰのいずれかに寛容ではない。このアプローチは、いずれのクラスＩＩ制限エピトープも連結エピトープとして形成され得ないことを事実上保証する。
この設計の考察を確認する例において、本発明者らは、ＨＩＶ誘導ＨＴＬエピトープを組み込むポリペプチドを合成した。これらのエピトープは、広範に交差反応性のＨＬＡ ＤＲ結合エピトープである。次いで、これらのエピトープがまたマウスＩＡbクラスＩＩ分子に効果的に結合することが決定された。考慮された２つの異なる合成ポリペプチドを示す図は、図２ａに示される。
第１の構築物は、直線的に配置された４つの異なるエピトープを組込み、一方、第２の構築物は、ＧＰＧＰＧスペーサーを組み込む。三つの潜在的連結エピトープに対応する合成ペプチドをまた合成した。
２ナノモルのこれらの異なる構築物がＩＡb陽性マウス内の種々のエピトープに対する増殖性の応答についてプライムする能力を試験し、そして等モル量のプールの同じペプチド（３マイクログラムのそれぞれのペプチド）によって誘発される応答と比較した。詳細には、３匹のマウスのグループに、ＣＦＡエマルジョンを注射し、注射の１１日後、それらのリンパ節細胞をインビトロでさらに３日間培養し、そしてチミジン取り込みを、２４時間の培養において測定した。高親和性ＩＡb結合能力に基づいて予期されるように、全ての４つのエピトープが良好な増殖応答を誘導したことが見出された（図２ｂ）。４．９〜１７．９の範囲の刺激指数（ＳＩ）値は、これらのペプチドがプールに注入された場合に観測された。しかし、同じエピトープを組み込む直線状ポリペプチドが試験される場合、Ｐｏｌ３３５に対して指向される応答が失われる。これは、Ｇａｇ１７１及びＰｏｌ３３５にわたる連結エピトープに対して指向される応答の出現と関連した。ＧＰＧＰＧスペーサーの使用は、おそらく、連結エピトープを破壊することによって、この問題を除去し、そしてＰｏｌ３３５応答を回復した。観測される応答は、単離されたペプチドのプールで観測されたものと同じ大きさであった。
これらの結果は、複数ＨＩＶ誘導クラスＩＩエピトープに対する応答が同時に誘導され得ることを示し、これらはまた、ＨＴＬエピトープ候補を組み込む種々の構築物の免疫原性を調査するためにどうのようにＩＡb／ＤＲ交差反応性が利用され得るかを示す。最後に、これらは、適切なスペーサーが、クラスＩＩ連結エピトープを効果的に破壊するように使用され得、これらは、それ以外に効果的なワクチン免疫原性を干渉しないことを示す。
クラスＩ制限応答の場合において、天然に存在する連結エピトープ及びエピトープ特異的応答の結果としての阻害の１つのケースが、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ及び共同研究者によって提示された［Ｔｕｓｓｅｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第３巻（１）：６５−７７（１９９５）］。クラスＩについての連結エピトープの問題を取り組むために、類似の分析が実行され得る。例えば、特定のコンピュータプログラムを使用して、選択されたマウスモチーフについて及び最も一般的なヒトクラスＩ ＨＬＡ Ａ及びＢモチーフについてスクリーニングすることによって、潜在的なクラスＩ制限連結エピトープを同定する。
スペーサー配列もまた、同様にＣＴＬ連結エピトープを妨げるために使用され得る。しばしば、Ａ又はＧのような非常に少しの残基が好ましいスペーサー残基である。Ｇはまた、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの好ましい一次アンカー残基（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／２４８０２を参照のこと）として比較的まれに存在する。これらのスペーサーは、種々の長さであり得、例えば、スペーサー配列は、代表的には、１、２、３、４、５、６、７又は８アミノ酸残基の長さであり得、時々、それより長い。より短い長さは、しばしば、ポリエピトープ構築物を作製する際に物理的束縛のため、好ましい。
（ＣＴＬミニ遺伝子免疫原性に対する隣接領域の影響）
ミニ遺伝子を設計する際に考慮される別の因子は、ＣＴＬエピトープのＣ末端に隣接する位置に免疫原性を支持する残基を挿入することである。
このような残基の識別が本明細書中に開示される。隣接領域は、少なくともいくつかの場合において、ＣＴＬエピトープの明かな提示を調節し得る。しかし、隣接領域の効果の調節の制限された分析のみが、これまでに実行されており、全ての場合（Ｉｓｈｉｏｋａ、１９８９の研究［Ｉｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１６２巻（７）：３９１５−２５（１９９９）］）を除く）において、エピトープは、マウスＭＨＣによって制限された。これは、マウス及びヒトのＭＨＣモチーフがＣ末端において異なる傾向があり、次いで、プロテオソーム切断性能によって異なって影響し得るので、特に関連する。さらに、たとえあるにしても、マウスプロテオソーム及びヒトプロテオソームならびに／又はＥＲプロテアーゼ間の特異性を処理する際に潜在的な差を考慮した研究はほとんどない。従って、マウス対ヒトのエピトープを利用する実験は、異なる結果を生み出し得、隣接残基について「支配する」。免疫原性を増加する残基、及び従って、免疫原性を最適化するためにポリエピトープ構築物に挿入される残基を同定する研究が本明細書中に開示される。
エピトープが発現された分子の状況は、しばしば、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおけるエピトープに特異的なＣＴＬのプライミングの頻度及び／又は大きさに劇的に影響した。二つの例を表３に示す。
Figure 0005628716
ｐＭｉｎ５ミニ遺伝子において発現されるＨＢＶ Ｃｏｒｅ１８エピトープの免疫原性は、ｐＭｉｎ１ミニ遺伝子の場合に観測されるよりも、約２００倍低い大きさであった。同様に、ＨＣＶ１ミニ遺伝子の状況において発現されるＨＣＶ Ｃｏｒｅ１３２エピトープの免疫原性は、最低限であり、行われた１２の異なる独立したＣＴＬ実験／培養のうちの２つのみにおいて有意なＴ細胞が明かにプライムした。これら２つの陽性の実験は、１００ＳＵのＩＦＮ−γの応答を生成した。しかし、同じエピトープがＨＣＶ２ミニ遺伝子の状況で発現された場合、陽性の応答が、１７／１８のケースで観測され、約５倍高い平均の大きさを有する。
（ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−ＦＴの免疫原性）
ＨＩＶ多重エピトープＤＮＡワクチン（ＨＩＶ−ＦＴ（図３ａ））は、２０ＨＩＶ誘導ＣＴＬエピトープをコードする。これら２０のエピトープのうち、８つがＨＬＡ−Ａ*０２０１によって制限され、９つがＨＬＡ−Ａ*１１０１によって制限され、３つがＨＬＡ−Ｂ*０７０１１８によって制限された。全てのエピトープが、良好な親和性を有する関連の制限エレメントに結合した。ＨＬＡ−Ａ*０２０１制限されたエピトープの全てが、粗い類似性の親和性を有する精製されたＨＬＡ−Ａ*０２０１に結合し、１９〜１９２ｎＭの範囲のＩＣ50値（図３ａ）を有する。ＨＩＶ−ＦＴへの封入のために選択されたＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープは、ＨＩＶ−１感染された個体において認識され、また、ＩＦＡを用いて乳化され、そしてＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスをプライムするために利用される場合、リコールＣＴＬ応答をプライミングする際に非常に効果的であった。構築物は、それらの間にいずれの介在するスペーサー配列もなしに連続してエピトープをコードするように設計され、コンセンサスＩｇκシグナル配列を、小胞体へのコードする抗原の輸送を容易にするように、構築物の５’末端に融合した（Ｉｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１６２巻：３９１５−３９２５、１９９９）。
ＨＩＶ−ＦＴがリコールＣＴＬ応答をインビボでプライムする能力は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスの筋内免疫化によって評価された。１００μｇのＨＩＶ−ＦＴプラスミドＤＮＡで免疫化した動物由来の脾細胞を、ＨＩＶ−ＦＴにコードされるＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープのそれぞれで刺激し、そして６日間の培養後、ペプチド特異的ＣＴＬ活性についてアッセイした。ＨＩＶ−ＦＴにおけるエピトープの３つに対する代表的なＣＴＬ応答を図４ａに示す。異なる実験由来の結果をより簡便に集計するために、各脾細胞培養物についての細胞毒性のパーセントの値を、先に記載されたように溶解単位で表現した（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ９５：３４１−３４９、１９９５）。ＨＩＶ−ＦＴにコードされる８つのＨＬＡ−Ａ*０２０１制限エピトープのうち、Ｐｏｌ４９８、Ｅｎｖ１３４、Ｐｏｌ４４８、Ｖｐｒ６２、Ｎｅｆ２２１、及びＧａｇ２７１は、ＤＮＡ免疫化に続いて、ＣＴＬ応答をプライムした（図４ｂ）。ＣＴＬ応答の大きさは、Ｐｏｌ４９８に対する５０ＬＵ近くの大きさからＮｅｆ２２１及びＧａｇ２７１に対する４ＬＵの小ささまで、１０倍の範囲を越えて変化した。同様に、リコールＣＴＬ応答の頻度は、エピトープ間で変化し、Ｐｏｌ４９８エピトープは、このケースの９４％において応答を誘発し、一方、Ｇａｇ２７１に対するＣＴＬ応答は、この実験の３１％のみにおいて検出された。結論として、ＨＩＶ−ＦＴ（任意のスペーサーアミノ酸を有さないエピトープを連続してコードする）を用いるＤＮＡ免疫化は、分析されたエピトープの大部分に対してリコールＣＴＬ応答の誘発を生じた。しかし、応答の大きさ及び頻度は、エピトープ間で大きく変化した。
（トランスフェクトされた細胞株におけるエピトープ免疫原性とＨＩＶ−ＦＴエピトープ提示との間の相関）
ＨＩＶ−ＦＴにおけるＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの示差的な免疫原性を、次いで評価した。示差的なＭＨＣ結合活性は、全てのエピトープがＨＬＡ−Ａ*０２０１に高い親和性で結合する（図３ａ）ので、除外され得る。さらに、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスにおけるＴＣＲ特異性の適切なレパートリーの欠如はまた、全てのエピトープが、ＩＦＡにおいて乳化された最適に予備処理されたペプチドと比較可能な、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化に続くＣＴＬ応答を生成するので、除外され得る。Ｔ細胞認識のために提示される各エピトープの相対量の変化は、エピトープ免疫原性における差で少なくとも部分的に説明され得る。
これを試験するために、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子を発現するヒトＴ細胞株のＪｕｒｋａｔ細胞（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，１００７−１０１５，１９９１）を、エピソームベクターにおいて発現されるＨＩＶ−ＦＴでトランスフェクトした。ヒト細胞株を、ヒトとマウスとの間のプロセシング能力の差違に関連し得る任意の可能な人工産物を排除するための使用のために選択した。このトランスフェクトされた細胞株は、抗原プロセシング能力を伴うＭＨＣ提示と一致し、そしてヒトにおける使用のためのＣＴＬエピトープベースのＤＮＡワクチンの引き続く開発のための可能な支持を提供する。
ペプチド特異的ＣＴＬ株は、ＨＩＶ−ＦＴ、Ｐｏｌ ４９８、Ｅｎｖ １３４、Ｐｏｌ ４４８及びＮｅｆ ２２１においてコードされるＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの４種のトランスフェクトされた標的における存在を検出した。これらのエピトープの各々が産生されそして提示されるレベルを定量化するために、様々なエピトープに対して特異的なＣＴＬ株を、トランスフェクトしていない標的及び可変量の各エピトープと共にインキュベートした。これらのＣＴＬ用量応答曲線を標準曲線として使用して、ＨＩＶ−ＦＴをトランスフェクトした標的細胞に応答して観察される濃度と等価なレベルのＩＦＮ−γ分泌を引き起こすペプチドの濃度を決定した。この値は、「ペプチド等価用量」と称され、そしてトランスフェクトされた細胞で提示されるエピトープの量の相対測定値として理解される。
表５は、ＨＩＶ−ＦＴにおいてコードされるＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの７種についての分析の所見を要約する。ペプチド等価用量は、Ｎｅｆ ２２１の３３．３ｎｇ／ｍｌの高さから、Ｇａｇ ２７１、Ｇａｇ ３８６及びＰｏｌ ７７４の０．４ｎｇ／ｍｌ未満のペプチド等価まで変化した。累積的に、これらの結果Ｎａｈ、ＨＩＶ−ＦＴでトランスフェクトしたヒト細胞株において、異なるＨＬＡ−Ａ*０２０１制限エピトープの提示のレベルにおいて少なくとも１００倍のバリエーションが存在することを示す。抗原性アッセイにおいて検出可能なレベルで提示された全てのエピトープは又はインビボで免疫原性であった。免疫原性であるが抗原性ではないエピトープは、Ｇａｇ ２７１のみであった。この場合において、ＨＩＶ−ＦＴでのＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスの免疫化は、試験された培地の３分の１未満で、弱いＣＴＬ応答を引き起こした。抗原性分析の感度の限界より下で提示された他の２つのエピトープであるＧａｇ ３８６及びＰｏｌ ７７４は、非免疫原性であった。結論として、これらの結果は、ＨＩＶ−ＦＴ免疫化によって引き起こされるＣＴＬ応答における異質性は、最適以下のエピトープ提示に少なくとも一部起因し得ることを示唆する。
表５．ＨＩＶ−ＦＴ免疫原性及び抗原性の比較
Figure 0005628716
１ 大きさは、ＬＵ（参照）として表される；エピトープ当量に対する相関係数 Ｒ＋０．４４。
２ 陽性培養物の頻度（培養物の数＞２ＬＵ／試験した総数）；ペプチド当量に対する相関係数 Ｒ＋０．８。
３ 大きさは、ｎｇ／ｍｌで表す。
４ 独立実験の数。
（隣接アミノ酸はワクチン接種後のインビボにおけるＣＴＬエピトープ免疫原性に影響する）
本明細書中に記載されるように、個々のＣＴＬエピトープに隣接する特定のアミノ酸は、タンパク質分解に対する抗原の感受性を変えることによってエピトープがプロセシングされる効率に影響する１つの因子である。エピトープ免疫原性に対する隣接アミノ酸の影響を試験するために、免疫原性データを、配列に介在することなく最小のＣＴＬエピトープをコードする多数の無関係の実験用多重エピトープＤＮＡ構築物で免疫したＨＬＡ−Ａ*０２０１、−Ａ*１１０１、及び−Ｂ*０７０１トランスジェニックマウスから得た。９４の異なるエピトープ／隣接残基の組み合わせを示すデータベースは、エピトープ免疫原性に対する直後の隣接アミノ酸の可能な影響を決定するように編集した。所定のエピトープ及び隣接アミノ酸の組み合わせは、重複性に起因する分析の人為的なゆがみを防止するために一回のみ含まれた。ＨＬＡトランスジェニックにおけるエピトープの免疫原性は、培養物の少なくとも３０％において１００ＳＵ又は２０ＬＵより大きな値が測定された場合に、最適であるとみなした。ＣＴＬ応答を、代表的に、４個のカテゴリーの１つでスコア付けした：（＋＋＋）、顕著である−２００ＬＵ又は１０００ＳＵより大きい：（＋＋）、良好−２０〜２００ＬＵ又は１００〜１０００ＳＵ；（＋）、中程度−２〜２０ＬＵ又は１０〜１００ＳＵ；及び（＋／−）、弱い又は陰性−２ＬＬＵ又は１０ＳＵ未満。最適な応答 対 最適以下の応答の数は、隣接位置におけるアミノ酸の化学的タイプに基づいて分類され、そして有意な差はχ２統計試験を使用して決定される。
この分析は、エピトープのアミノ末端に存在するアミノ酸のタイプと免疫原性と間のいずれの関係をも見出さなかった。しかし、カルボキシル末端の隣接残基であるＣ＋１残基の有意な効果が同定された。正電荷のアミノ酸、Ｋ又はＲは、最も頻繁に、最適なＣＴＬ応答と関連し、その頻度は６８％であった（図５）。Ｃ＋１残基におけるアミノ酸Ｎ及びＱの存在はまた、試験された以下のケース：エピトープが、Ｃ＋１位でＮに隣接されている場合の５５．５％において強いＣＴＬ応答に関連し、これらは、３／４の場合で最適なＣＴＬ応答を引き起こした。一般的に、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＳのような小さな残基は、分析に利用可能な組み合わせの５４％において強い応答を引き起こす中間のＣＴＬ応答を促進した。逆に、芳香族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸により隣接されたエピトープは、それぞれ、その場合の３６％及び１７％のみで最適なインビボ応答を引き起こした。負電荷の残基Ｄは、最適以下のＣＴＬ応答を生じた。Ｃ＋１アミノ酸のエピトープ免疫原性に対する影響は、χ２統計試験（Ｐ＜０．０３）を使用して統計学的に有意であることが見出された。エピトープ免疫原性に対する有意な影響は、類似の分析をＣ＋１位より遠位のＣ末端残基について行った場合には示されなかった。
（エピトープ免疫原性に対するＣ１残基の効果の直接評価）
Ｃ＋１隣接位置におけるアミノ酸の好ましい型対欠失型のアミノ酸の効果を直接評価するために、２つの多重エピトープ構築物（ＨＢＶ．１及びＨＢＶ．２と称される（図３ｂ））もまた評価した。ＨＩＶ−ＦＴを用いた場合、これらのＨＢＶ構築物は、スペーサーに介入することなくエピトープを経時的にコードした。実際に、ＨＢＶ．１及びＨＢＶ．２は、ｐＭｉｎ１におけるＨＩＶ−１エピトープ（以前に特徴付けられた実験的多重エピトープ構築物（Ｉｓｈｉｏｋａ、前出））を類似のＨＢＶ由来エピトープで置換することによって生成された。
ＨＢＶ．１について、ＨＩＶ−１エピトープは、高度に免疫原性のＨＢＶ Ｃｏｒｅ １８エピトープに直接従うＨＩＶ−１エピトープをＨＢＶ Ｐｏｌ ５６２エピトープで置換した。これは、Ｃ＋１残基をＫからＦに変えた。さらなるエピトープのＨＢＶ Ｐｏｌ ６２９を、ＨＢＶ Ｃｏｒｅ １８とＰｏｌ ５６２エピトープとの間に挿入すること（Ｃ＋１アミノ酸をＫ残基で置換する変化）によって第２の構築物であるＨＢＶ．２を生成した。これらの異なる状況において存在するＣｏｒｅ １８エピトープの免疫原性が、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスにおいて評価された場合、Ｃｏｒｅ １８エピトープはＨＢＶ．１において実質的に非免疫原性であるが、ＨＢＶ．２において強力な免疫原性であることが決定された（図６ａ）。このエピトープのインビボ免疫原性の現象は、本発明者らの以前の分析によって示された通りであった。
Ｃ１隣接アミノ酸のＣＴＬエピトープ免疫原性に対する影響をさらに試験するために、Ｃｏｒｅ １８エピトープに対してＣ＋１位で単一のアミノ酸の挿入だけＨＢＶ．１とは異なる構築物のセット（図３ｃ）を評価した。Ｃ＋１位においてＷ、Ｙ又はＬにより隣接されている場合、Ｃｏｒｅ １８エピトープに対してＣＴＬ応答はほとんどか又は全く観察されなかった（図６ｂ）。逆に、単一のＫ残基の挿入は、Ｃｏｒｅ １８に対するＣＴＬ応答を劇的に増加した。この応答は、Ｃｏｒｅ １８エピトープがｐｏｌ ６２９により隣接されているＨＢＶ．２、エピトープのＮ末端においてＫを有するエピトープにおいて観察された応答に匹敵した。このＣｏｒｅ １８ＣＴＬ応答の増強はまた、Ｒ、Ｃ、Ｎ又はＧの挿入においても観察された。これらの挿入の効果は特異的である。なぜなら、これらの構築物内の他のエピトープの免疫原性は、ＣＴＬ応答における有意な変化を示さなかったからである（データは示さず）。結論として、これらのデータは、Ｃ＋１アミノ酸はエピトープ免疫原性に劇的に影響し得ることを示す。
（ＣＴＬエピトープ免疫原性における変化は存在する量と相関する）
異なるＣ＋１残基に関連するＣｏｒｅ １８の免疫原性の変化がタンパク質分解切断に対する差示的な感受性の結果である場合、エピトープ提示のレベルの大きな差が異なる構築物において検出可能であるべきである。これを試験するために、トランスジェニックマウス２０において発現される同じＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、ＨＢＶ．１又はＨＢＶ．１Ｋのいずれかを発現するエピトープベクターでトランスフェクトした。このＣｏｒｅ １８エピトープは、ＫがＣ＋１位にある場合、１０5より高いレベルでされ、これを同じ位置のＦの存在に匹敵した（図７）。ｐｏｌ ４５５の提示が１０倍未満だけ変化したため、Ｃｏｒｅ １８提示のこの差違は、標的細胞株の間の遺伝子発現の差違に起因する。これらのデータは、Ｃ＋１位におけるアミノ酸が、多重エピトープＤＮＡワクチンにおけるエピトープ提示の効率に影響を与え得るという著しい効果を示す。従って、これらのデータは、ＤＮＡワクチンにおけるＣＴＬエピトープの免疫原性が、エピトープ提示のレベルに影響する設計の考察により最適化され得ることを示す。このタイプの最適化は、他の形態を使用して送達されるエピトープベースのワクチン（例えば、ウイルスベクターならびに当業者に公知の他の発現ベクター）に適用可能である。なぜなら、この効果は、抗原が転写及び翻訳された後に発揮されるからである。
要約すると、隣接残基について、Ａ、Ｃ又はＧの様な非常に小さな残基、Ｑ、Ｗ、Ｋ又はＲのような大きな残基のいずれかが、一般的に良好な又は顕著な応答に関連することが見出された。ミニ遺伝子における終止コドンによるＣ＋１残基の非存在、又はＳ又はＴのような中間サイズの残基の存在は、より中間の応答パターンに関連した。最後に、負電荷の残基であるＤ、脂肪族（Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ）又は芳香族非トリプトファン残基（Ｙ、Ｆ）の場合において、比較的乏しい応答が観察された。これらの結果は、エピトープのＣ末端に隣接する特定の残基が、応答の頻度及び大きさに劇的に影響し得ることを示す。Ｃ＋１位における隣接残基はまた、スペーサー配列と組み合わせて導入され得る。従って、免疫原性を支持する残基、好ましくは、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ａ又はＧは、スペーサーの隣接残基として含まれる。
（ポリエピトープ構築物のソート及び最適化）
本発明を使用してポリエピトープ構築物を開発するために、ポリエピトープ構築物に含めるためのエピトープは、本明細書中で規定されるパラメーターを使用してソート及び最適化される。ソート及び最適化は、コンピューターを使用して、又は少数のエピトープの場合には、コンピューターを使用せずに実施され得る。
コンピューターによる最適化は、代表的に、以下のように実施され得る。以下は、エピトープの組み合わせを同定及び最適化するコンピューター化システム（すなわち、連結エピトープの最小数、及び隣接残基の最大数を提供する）の例を提供する。
エピトープのソートの１つの構成要素は、「Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ」である。例えば、このプログラムは、その操作のためのプログラムを特定するテキストファイルを使用する。５つのタイプの入力データがこのプログラムに与えられる：１）処理するペプチドのセット；２）Ｃ＋１位及びＮ−１位に現れる場合の各アミノ酸の重量のセット；３）連結の検出において使用するモチーフのセット：４）各対のペプチド環に挿入されるアミノ酸の最大数；５）プログラムの作動を制御するための他の値。このプログラムは、ペプチドの全ての可能な対を評価し、そして連結の数、Ｃ＋１及びＮ−１の重量を計算し、そしてそれらを所定の式に従って合わせる。現在、この式は、この２つの重量の積÷連結の数である。連結の数がゼロである場合、この積を０．５で割る。ペプチド部位を評価するための他の式は、いつでもこのプログラムに容易に加えられ得る。このプログラムからの出力は、最大機能結果を生じる挿入をペプチドの各対について列挙するテキストファイルである。このファイルはまた、ペプチドの元のリスト及びプロセシングの次の工程を行う２つのプログラムのいずれかの作動を制御するコマンドを含む。これら２つのプログラムは、「Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｊ Ｓｅａｒｃｈ」及び「Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｊ Ｓｅａｒｃｈ」である。
「Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｊ Ｓｅａｒｃｈ」は、ペプチドの全ての順列を調べ、機能結果の最大の和を有する１つを選択する。このプログラムは、最大の機能の和を有する順列を見出す。しかしながら、順列の因数の特徴に起因して、これは、最大１２又は１３のペプチドについてのみしか使用できない。１３ペプチドについての推定実行時間は、２．９時間であり、１４ペプチドについては約４０時間である。「Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｊ Ｓｅａｒｃｈ」は、順列配列の多くの領域を検索し、そしてこれが見出す最良の機能和を報告するように設計されている。現存の最大関数の総数を満たすか又は越える順列のみを報告することによって、順列配列のさらに広い領域を検索することが可能となる。この技術は、２０ペプチドもの多くのペプチドを用いて成功した。２０ペプチドの徹底的な検索を行うための時間は、１．３×１０５年のオーダーである。
このプログラムは以下のように作動し得る：
これらのパラメーターを、このプログラムに入力する：
１．ソートするエピトープ。
２．上記のような、アミノ酸Ｃ＋１及びＮ−１の「重量」。
３．連結エピトープを検出するためのモチーフ。
４．最大スペーシング残基。
５．プログラム選択肢を制御するパラメーター。
Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍは、次いで、以下を実行する：
１．全てのエピトープ対を生成する。
２．ペプチドの各対について、連結エピトープの最小数及びスペーシング残基のＣ＋１及びＮ−１の寄与による最大効果を生じる挿入のセットを決定する。
３．各対の最適スペーシング残基及び最適連結の値を出力する。
１４個以上のエピトープがポリエピトープ構築物に含まれる場合、推計検索が、使用される。推計検索プログラムは、モンテカルロ技術（当業者に公知である）を使用して、順列空間の多数の領域を試験し、ペプチドの最適な配列の最良の推定値を見出す。
１４個未満のエピトープが含まれる場合、網羅的プログラムが使用される。この網羅的検索プログラムは、全てのエピトープ対に関する最適化関数の和について最良の値を有するものを見出すために、ポリエピトープ構築物を構成するエピトープの全ての順列を調べる。これは、全てが試験されるので、「最良」の順列を見出すことが保証されている。
プログラムアウトプットは、エピトープの最良の配置の列挙を提供する。多くの順列が評価関数の同じ値を有するので、いくつかは、他の因子が最適な配置を選択する際に考慮され得るように、生成される。
この系のプログラム分析を用いて作製されたポリエピトープ構築物の例は、図９に提供される。
電荷分布、疎水性／親水性領域分析、又は折り畳みの推測のような他の因子がまた、ミニ遺伝子構築物をさらに最適化するために評価関数に組込まれ得る。
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）が、種々のレベルの組成に関して記載され得る。この組成の一般的な考察に関しては、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）ならびにＣａｎｔｏｒ及びＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」は、ポリペプチド内の位置的に順番に並んだ三次元構造をいう。これらの構造は、一般的にドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトな単位を形成するポリペプチドの一部である。代表的なドメインは、より小さい組成の区分（例えば、β−シート及びα−ヘリックスのストレッチ）から構成される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有結合によって形成された三次元構造をいう。
電荷分布、疎水性／親水性領域分析、又は折り畳みの推測のような構造の推定が、当業者に公知の配列分析プログラムを用いて実行され得、例えば、疎水性ドメイン及び親水性ドメインが同定され得る（例えば、Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）及びＳｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、１９８８）を参照のこと；任意の多数のインターネットベースの配列分析プログラム（例えば、ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕにおいて見出されるようなプログラム）もまた参照のこと）。
ポリエピトープ構築物の三次元構造モデルがまた、作製され得る。これは、一般的に、分析されるアミノ酸配列をコンピューターシステムに入力することによって実行される。このアミノ酸配列が、タンパク質の一次配列又はサブ配列を示し、これは、タンパク質の構造情報をコードする。次いで、タンパク質の三次元構造モデルが、当業者に公知のソフトウェアを用いて、コンピューターシステムとの対話によって作製される。
このアミノ酸配列は、目的タンパク質の二次構造、三次構造及び４次構造を形成するのに必要な情報をコードする一次構造を示す。ソフトウェアは、構造モデルを作製するために一次配列によってコードされる特定のパラメーターを調べる。このパラメーターは、「エネルギーターム」といわれ、そして主に、静電気ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒が近接可能な表面、及び水素結合を含む。二次エネルギータームとしては、ファン・デル・ヴァールスポテンシャルが挙げられる。生物学的分子は、累積的な様式でエネルギータームを最小化する構造を形成する。従って、コンピュータープログラムは、二次構造モデルを作製するために一次構造又はアミノ酸配列でコードされるこれらのタームを使用する。
次いで、二次構造でコードされるタンパク質の三次構造が、二次構造のエネルギータームに基づいて形成される。使用者は、さらなる可変、例えば、タンパク質が膜結合であるかもしくは可溶性であるか、その体内での位置、及びその細胞での位置（例えば、細胞質、表面、又は核）を入力し得る。二次構造のエネルギータームを伴ったこれらの可変は、三次構造モデルを形成するために使用される。三次構造のモデリングにおいて、コンピュータープログラムは、二次構造の疎水性表面を同種のものと一致させ、そして二次構造の親水性表面を同種のものと一致させる。
ＨＬＡプロセシング機構に最も容易に接近し得るこれらのポリエピトープ構築物が、次いで、選択される。
（ＩＩ．多重エピトープ性ワクチンの免疫原性の評価）
多重エピトープ性ミニ遺伝子の開発は、ＭＨＣへのペプチド結合の種特異性に起因して、特有のチャレンジを示す。異なる種由来の異なるＭＨＣ型は、異なるセットのペプチドに結合する傾向がある［Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．４１（４）：１７８−２２８（１９９５）］。結果として、通常の実験動物においてヒトエピトープを構成する構築物を試験することは不可能である。この限定を克服するための代替物は、一般的に利用可能である。これらとしては、以下が挙げられる：１）非ヒトＭＨＣによって制限されるエピトープを組み込んでいる類似の構築物を試験すること；２）非ヒトＭＨＣによって制限されるコントロールエピトープに対する信頼；３）ヒトＭＨＣと非ヒトＭＨＣとの間の交差反応性に対する信頼；４）ＨＬＡトランスジェニック動物の使用；及び５）インビボにおいてヒト細胞を利用する抗原性アッセイ。以下は、抗原性及び免疫原性を分析するための技術開発の簡単な概略である。
（クラスＩ ＨＬＡトランスジェニック）
エピトープを同定する目的のため［Ｓｅｔｔｅら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１５３（１２）：５５８６−９２（１９９４）；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．８（５）：６５１−９（１９９６）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１４６（４）：１２２６−３２（１９９１）；Ｍａｎら，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．７（４）：５９７−６０５（１９９５）；Ｓｈｉｒａｉら，Ｊ Ｉｍｎｔｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１５４（６）：２７３３−４２（１９９５）］、及びワクチンを開発する目的のため［Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１６２（７）：３９１５−２５（１９９９）］のＨＬＡトランスジェニックマウスの有用性は確立されている。発行されている報告のほとんどは、ＨＬＡ Ａ*０２０１／Ｋbマウスの使用を研究しているが、Ｂ*２７マウス、及びＢ*３５０１マウスもまた利用可能であることに注意すべきである。さらに、ＨＬＡ Ａ*１１／Ｋbマウス［Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１５９（１０）：４７５３−６１（１９９７）］、ならびにＨＬＡ Ｂ７／Ｋbマウス及びＨＬＡ Ａ１／Ｋbマウスもまた、作製されている。
３８個の異なる可能性のあるエピトープからのデータが、Ａ２．１／ＫbトランスジェニックマウスのＡ２．１−制限ＣＴＬレパートリーとＡ２．１＋ヒトのＡ２．１−制限ＣＴＬレパートリーとの間の重複レベルを決定するために分析された［Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．２６（１）：９７−１０１（１９９６）］。ヒト及びマウスの両方において、約５００ｎＭのＭＨＣペプチド結合親和性の閾値は、インビボにおいてＣＴＬエピトープを誘発するペプチドの能力と相関する。インビボでのヒトデータとインビボでのマウスデータとの間の高いレベルの一致が、８５％の高い結合ペプチドで、５８％の中程度の結合因子で、そして８３％の低い／陰性結合因子で観察された。同様の結果がまた、ＨＬＡ Ａ１１トランスジェニックマウス及びＨＬＡ Ｂ７トランスジェニックマウスを用いて得られた［Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１５９（１０）：４７５３−６１（１９９７）］。従って、ＨＬＡトランスジェニックマウスのＴ細胞レセプターレパートリーとヒトＣＴＬとの間に存在する広範な重複に起因して、トランスジェニックマウスは、本明細書中に記載されるポリエピトープ構築物の免疫原性を評価するのに価値がある。
ＨＬＡ Ａ１１マウスに関連するようなＴＡＰ輸送の異なる特異性は、ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスの免疫原性の評価に関する使用を妨げない。マウスＴＡＰ及びヒトＴＡＰの両方は、疎水性末端を有するペプチドを効率的に輸送するが、ヒトＴＡＰのみが、正に荷電したＣ末端を有するペプチド（例えば、Ａ３、Ａ１１、及び他のＡ３スーパータイプのメンバーによって結合されるもの）を効率的に輸送することが報告されている。この関係は、Ａ２、Ａ１、又はＢ７には適用されない。なぜなら、マウスＴＡＰもヒトＴＡＰも両方とも、Ａ２、Ｂ７、又はＡ１によって結合されるペプチドを等しく輸送し得るべきであるからである。この理解と一致して、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ［Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．１７３（４）：１００７−１５（１９９１）］及びＲｏｔｚｓｃｈｋｅ［Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ Ｏ，Ｆａｌｋ Ｋ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏ１．６（１）：４５−５１（１９９４）］は、プロセシングがマウス細胞及びヒト細胞において類似していることを示唆しているが、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ［Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ Ｏ，Ｆａｌｋ Ｋ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．６（１）：４５−５１（１９９４）］は、マウス細胞対ヒト細胞での差異を示唆し、マウス細胞及びヒト細胞の両方は、ＨＬＡ Ａ３分子を発現する。しかし、ＨＬＡ Ａ１１トランスジェニックを用いて、インビボにおいてＴ細胞及びＢ細胞上でのＨＬＡ分子の発現が、観察され、これは、報告されたマウスＴＡＰの不利な特異性が、インビボにおいてＡ１１／Ｋb分子の安定化も輸送も妨げなかったことを示唆する［Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１５９（１０）：４７５３−６１（１９９７）］。これらのデータは、荷電したＣ末端を有するペプチドがＡ１１分子でトランクフェクトされたマウス細胞から溶出され得たという以前の観察と一致する［Ｍａｉｅ（１９９４）］。複合抗原（例えば、インフルエンザ）及び最も重要には多重エピトープ性ミニ遺伝子によってコードされるＡ１１制限エピトープ［Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１６２（７）：３９１５−２５（１９９９）］に対するＨＬＡ Ａ１１マウスにおける応答がまた、検出されている。従って、ＴＡＰの問題は、トランスジェニックマウスとあまり関係がないようである。
ＨＬＡトランスジェニックマウスの使用に潜在的に関連する別の問題は、ＨＬＡ発現及び結合特異性に対するβ２ミクログロブリンの影響の可能性である。ヒトβ２が、マウスβ２ミクログロブリンよりも、より高い親和性及び安定性でヒトＭＨＣ及びマウスＭＨＣの両方を結合することが周知である［Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｖｏｌ．３５（１４−１５）：９１９−２８（１９９８）］。ＭＨＣ重鎖及びβ２のより安定な複合体が、ＭＨＣクラスＩの外因性の充填を促進することもまた周知である［Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２５０（４９８６）：１４２３−６（１９９０）］。本発明者らは、ＨＬＡ／Ｋb及びヒトβ２に対してダブルトランスジェニックであるマウスを作製することによって、この可変の潜在的な効果を試験した。ヒトβ２の発現は、ＨＬＡ Ｂ７／Ｋbマウスの場合有利であり、そしてＨＬＡ Ａ１トランスジェニックマウスの場合には、良好な発現レベルを達成するのに完全に必須であった。従って、ＨＬＡ／Ｋb及びβ２のダブルトランスジェニックマウスは、本発明者らによって、現在日常的に交配され、利用されている。従って、ＨＬＡトランスジェニックマウスは、４つの主要なＨＬＡ特異性（すなわち、Ａ２、Ａ１１、Ｂ７及びＡ１）のモデルＨＬＡ制限認識に対して使用され得、そして他のＨＬＡ特異性に対するトランスジェニックマウスは、免疫原性の評価のための適切なモデルとして作製され得る。
（クラスＩエピトープに対する抗原性試験）
数回の独立した系統の実験が、細胞表面上のクラスＩ／ペプチド複合体密度がＴ細胞プライミングのレベルと相関し得ることを示している。従って、エピトープが生成されそしてＡＰＣ表面上に提示されるレベルを測定することによって、インビトロで、ヒト細胞中のミニ遺伝子ワクチンの能力を間接的に評価する道が提供される。ＨＬＡ クラスＩトランスジェニックマウスの使用を補完するものとして、この手段は、ヒト細胞におけるプロセシングを研究するの有利である［Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１６２（７）：３９１５−２５（１９９９）］。
プロセスされたペプチドを実験的に定量するいくつかの可能な手段が、利用可能である。細胞表面上のペプチドの量は、ＡＰＣ表面から溶出されたペプチドの量を測定することによって定量され得る［Ｓｉｊｔｓら，Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１５６（２）：６８３−９２（１９９６）；Ｄｅｍｏｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２（６２５０）：６８２−４（１９８９）］。あるいは、ペプチド−ＭＨＣ複合体の数は、感染又はトランスフェクトされた標的細胞によって誘導される溶解又はリンホカイン放出の量を測定し、次いで、等レベルの溶解又はリンホカイン放出を得るのに必要なペプチドの濃度を決定することによって、概算され得る［Ｋａｇｅｙａｍａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１５４（２）：５６７−７６（１９９５）］。
類似の手段がまた使用されて、ミニ遺伝子がトランスフェクトされた細胞株中のエピトープ提示が測定される。詳細には、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて免疫原性であるミニ遺伝子構築物はまた、同じミニ遺伝子でトランスフェクトされたヒト細胞によって最適なエピトープにプロセスされ、そしてトランスジェニックマウスにおいて観察された応答の大きさは、トランスフェクトされたヒト標的細胞で観察された抗原性と相関する［Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１６２（７）：３９１５−２５（１９９９）］。
抗原性アッセイを用いて、エピトープの順番が異なるか又は隣接残基が異なる多数の関連ミニ遺伝子が、ＡＰＣにトランスフェクトされ得、そして上記可変物のエピトープ提示に対する影響が、評価され得る。これは、相対的に大多数の異なる構築物が評価される必要がある試験に対して、好ましい系であり得る。これは多数のエピトープ特異的ＣＴＬを必要するが、高度に感受性のＣＴＬ株の作製を可能にし［Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，Ｖｏｌ．９３（９）：４１０２−７（１９９６）］、そしてまたこれらを多数に増殖することを可能にする［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｐ．Ｄ．，Ｒｉｄｄｅｌｌ Ｓ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８５（５４２７）：５４６−５１（１９９９）］プロトコルが、この潜在的な問題と取り組むために開発された。
このトランスフェクションのために選択された細胞が、インビボでＡＰＣ機能を実施する細胞の反映でない場合、誤解されやすい結果が得られ得ることも気に留めておくべきである。Ｂ細胞系列の細胞（「専門的」ＡＰＣとして知られる）は、トランスフェクションのレシピエントとして代表的に使用される。このタイプのトランスフェクトされたＢ細胞の使用は、この分野では受容された手技である。さらに、本明細書中、以下により詳細に記載されるように、トランスフェクトされたヒトＢ細胞を用いるインビトロデータと、ＨＬＡトランスジェニックマウスを利用するインビボの結果との間の良好な関係がすでに注目されている。
（ＨＴＬ反応の測定）
好ましい実施形態において、クラスＩＩ拘束免疫応答を誘導するように、ワクチン構築物が至適化される。クラスＩＩエピトープを含むポリエピトープ性の構築物を評価する１つの方法は、ＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスを用いることである。いくつかの群を産出し、そしてＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスを特徴付けた［Ｔａｎｅｊａ Ｖ．，Ｄａｖｉｄ Ｃ．Ｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ，１６９巻：６７〜７９（１９９９）］。
代替方法も存在する。これは、特定のヒトＭＨＣ分子と実験動物によって発現された特定のＭＨＣ分子との間の交差反応性に拠る。Ｂｅｒｔｏｎｉ及び同僚（共同研究者）［Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１巻（８）：４４４７〜５５（１９９８）］は、かなりの交差反応性が、特定のＨＬＡクラスＩ上位タイプと特定のＰＡＴＲ分子（チンパンジーによって発現された）との間で実証され得ることに注目している。クラスＩＩ［Ｇｅｌｕｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１７７巻（４）：９７９〜８７（１９９３）］及びクラスＩ分子［Ｄｚｕｒｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９年７月］のレベルにおいて、ヒトとマカクとの間の交差反応性もまた注目されている。結局、ヒトＨＬＡ Ｂ７上位タイプによって認識されたモチーフは、マウスクラスＩ Ｌdによって認識されたモチーフと本質的に同じであることもまた注目され得る［Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，第４１巻（４）：１７８〜２２８）１９９５）］。マウスにおいてＨＬＡ ＤＲ拘束エピトープを試験することに関連して、ＤＲ１及びＩＡbのモチーフ中に類似性が存在することが、Ｗａｌｌらによって示されている［Ｗａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：４５２６〜３６（１９９４）］。本発明者らは、慣用的に、本発明者らのトランスジェニックマウスを採血して、この偶然の類似性を利用する。さらに、本発明者らはまた、本発明者らのペプチドのほとんどがＩＡbに結合することを示しており、その結果、本発明者らは、ＣＴＬ及びＨＴＬ免疫原性の研究のためにこれらのマウスを用いる。
（臨床サンプル由来の免疫応答測定又は定量）
ワクチン力価を評価するための重大な要素は、それが免疫応答を誘導する能力を評価することである。免疫原に対する、ならびに共通のリコール抗原に対する、ＣＴＬ及びＨＴＬ応答の分析を共通に用いており、それらは当該分野で公知である。使用したアッセイは、クロム遊離アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ及びリンパ球増殖アッセイを含んだ。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色、及びテトラマー（４量体）染色のような、より鋭敏な（感受性の）アッセイが、当該分野で利用可能になっている。これらの新しい方法は、一般のＣＴＬ及びＨＴＬアッセイよりも１０〜１００倍鋭敏であると見積もられる［Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第８巻（２）：１７７〜８７（１９９８）］。なぜなら、従来の方法は、インビトロで増殖し得るＴ細胞のサブセットのみを測定し、そして実際、記憶Ｔ細胞区分の画分のみを代表する［Ｏｇｇ Ｇ．Ｓ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１０巻（４）：３９３〜６（１９９８）］からである。ＨＩＶの場合特に、これらの技術を用いて、以前の技術では検出不能であった、患者からの抗原特異的ＣＴＬ応答を測定した［Ｏｇｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７９巻（５３５９）：２１０３〜６（１９９８）；Ｇｒａｙら．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６２巻（３）：１７８０〜８（１９９９）；Ｏｇｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７３巻（１１）：９１５３〜６０（１９９９）；Ｋａｌａｍｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７３巻（８）：６７２１〜８（１９９９）；Ｌａｒｓｓｏｎら．，ＡＩＤＳ、第１３巻（７）：７６７〜７７（１９９９）；Ｃｏｒｎｅら，Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ，第２０巻（５）：４４２〜７（１９９９）］。
比較的ほとんど例外なく、新鮮に単離された細胞の直接活性は、従来のアッセイ手段では実証することが困難であった［Ｏｇｇ Ｇ．Ｓ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１０巻（４）：３９３〜６（１９９８）］。しかし、より新しい技術の感度の増大により、研究者は、感染したヒト又は実験動物から新鮮に単離した細胞からの応答を検出することが可能になった［Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第８巻（２）：１７７〜８７（１９９８）；Ｏｇｇ Ｇ．Ｓ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１０巻（４）：３９３〜６（１９９８）］。インビトロ再刺激工程に依存しないこれらの敏感な（鋭敏な）アッセイの利用性により、自然の感染及び癌におけるＣＴＬ機能の研究がかなり容易になった。対照的に、実験ワクチンの有効性を判定するための終点として利用したアッセイは、通常、１つ以上のインビトロ再刺激工程と組み合わせて実施される［Ｏｇｇ Ｇ．Ｓ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１０巻（４）：３９３〜６（１９９８）］。実際、ほとんど例外なく［Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１６巻（４）：４２６〜３５（１９９８）］（Ａｌｌｅｎら、提出）、新鮮に単離したクラスＩ拘束ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＴＬ応答を惹起するように設計された実験ワクチンを用いた免疫に応答して実証することは困難であった。鋭敏なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ又はインサイチュＩＦＮ−ガンマ ＥＬＩＳＡ）の使用を、再刺激工程とを組み合わせて、最大の感度を達成した；ＭＨＣ４量体がまたこの目的に用いられる。
ＭＨＣ４量体（テトラマー）は、Ａｌｔｍａｎ及び共同研究者によって１９９６年に最初に記載された。彼らは、可溶性ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子を生成した。この分子は、蛍光マーカーでタグ化された４量体中に一緒に複合体化されたＣＴＬエピトープを含むＨＩＶ特異的ペプチドで折り畳まれた。これらを用いて、このエピトープを認識するＨＩＶ感染個体由来のＴ細胞の集団を標識する［Ｏｇｇ Ｇ．Ｓ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１０巻（４）：３９３〜６（１９９８）］。次いで、これらの細胞をフローサイトメトリーによって定量した。これにより、このエピトープに特異的なＴ細胞の頻度測定が得られる。この技術は、ＨＩＶ研究において、ならびに他の感染疾患において非常に人気となった［Ｏｇｇ Ｇ．Ｓ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１０巻（４）：３９３〜６（１９９８）；Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７９巻（５３５９）：２１０３〜６（１９９８）；Ｇｒａｙら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６２巻（３）：１７０８〜８（１９９９）；Ｏｇｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ，第７３巻（１１）：９１５３〜６０（１９９９）；Ｋａｌａｍｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，第７３巻（８）：６７２１〜８（１９９９）］。しかし、ＨＬＡ多形性は、この４量体技術が規定されたＨＬＡ／ペプチド組み合わせに依存するという点で、この技術の一般的適用性を限定し得る。しかし、種々のペプチド（ＨＩＶ由来ペプチドを含む）が、Ａ２、Ａ３及びＢ７上位タイプの異なるメンバーという状況では、ペプチド特異的ＣＴＬ株によって認識されることが示されている［Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５９巻（４）：１６４８〜５７（１９９７）；Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，第１００巻（３）：５０３〜１３（１９９７）］。まとめると、これらの観察により、所定のＭＨＣ／ペプチド組み合わせに対するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が、同じ上位タイプ由来の異なるＭＨＣ分子によって示される同じペプチドに対して検出可能な親和性を有し得ることが実証される。
防御ワクチンの有効性が、長期永続性記憶応答の誘導と主に関連する状況では、再刺激アッセイが最も適切であり、そしてワクチン誘導性免疫学的反応をモニターするための鋭敏な測定であり得る。逆に、治療ワクチンの場合、活性の主な免疫学的関連は、一次アッセイによって最も適切に測定された、エフェクターＴ細胞機能の誘導であり得る。従って、鋭敏なアッセイの使用により、ワクチンの有効性の免疫学的モニタリングのためのストラテジーを最も適切に試験することが可能になる。
（トランスフェクトされたヒトＡＰＣにおける多重エピトープミニ遺伝子の抗原性）
抗原性アッセイを実施して、ヒト細胞におけるエピトーププロセシング及び提示を評価する。エピトープベースのミニ遺伝子ワクチンを用いてヒト標的細胞を効率的にトランスフェクトするためのエピソームベクターを、このような分析を実施するために用いる。
例えば、２２１Ａ２Ｋｂ標的細胞を、ＨＩＶ−１ミニ遺伝子ワクチンでトランスフェクトした。２２１ Ａ２Ｋb標的細胞は、ＨＬＡトランスジェニックマウス中で発現されるＡ２Ｋb遺伝子を発現するが、内因性クラスＩは発現しない［Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ，ＤｅＭａｒｓ Ｒ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１４２巻（９）：３３２０〜８（１９８９）］。ＨＬＡトランスジェニックマウス由来のＣＴＬ株に対して抗原を提示する能力について、これらのトランスフェクトされた細胞をアッセイし、そして種々のＨＩＶ由来ＣＴＬエピトープに対して特異的であった。異なるＣＴＬ株の抗原感受性における差異を補正するため、ＡＰＣとしてトランスフェクトされていない細胞を用いる、ペプチド用量力価測定を、平行して行った。代表的なデータを図８に示す。ＨＩＶ Ｐｏｌ ４９８特異的ＣＴＬの場合、トランスフェクトした標的細胞は、３７８ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの放出を誘導した。ペプチド用量反応の検討によって、４８ｎｇ／ｍｌの外因的に添加されたペプチドは、同様のレベルのＩＦＮ−γ放出を達成するために必要であったことが示された。これらの結果は、外因性に添加されたペプチドの４８ｎｇ／ｍｌに等量である、比較的大量のＰｏｌ４９８エピトープが、トランスフェクトされた細胞によって示されることを実証する。
Figure 0005628716
比較すると、Ｇａｇ ２７１エピトープに特異的なＣＴＬを利用して、２５ｐｇ／ｍｌ未満のγＩＦＮを検出した。トランスフェクトしていない標的細胞を用いたコントロールペプチド力価測定は、このネガティブな結果が、利用される特定のＣＴＬ株の感受性が乏しいことに起因し得ないことを示した。なぜなら０．２ｐｇ／ｍｌ程度の少ない「ペプチド等量（ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）」（ＰＥ）が検出され得るからである。従って、Ｇａｇ２７１エピトープは、効率的にプロセシングされず、そしてＨＩＶ−１トランスフェクトされた標的細胞において提示されないようである。プロセシングの効率の適切な定量として「ペプチド等量（ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）」図を利用して、Ｐｏｌ ４９８エピトープに比べて、少なくとも２００倍少ないＧａｇ２７１が、トランスフェクトされた標的によって提示されると見積もられ得る。
ＨＩＶ−１に含まれる４つの異なるエピトープについての種々の独立した決定の結果を表４にまとめる。ＨＩＶ−１トランスフェクトされた細胞から生成された各エピトープの量は、Ｐｏｌ ４９８についての３０．５ ＰＥからＧａｇ ２７１についての０．２ ＰＥ未満の低さまでにわたった。２つのエピトープＥｎｖ １３４及びＮｅｆ ２２１は、それぞれ、６．１ ＰＥ及び２．１ ＰＥの中間値を伴った。
これらの結果は、次に、ＨＩＶ−１構築物での免疫後の各エピトープについて観察されたインビボ免疫原性値と相関した。Ｐｏｌ ４９８エピトープはまた、予測どおり、最も免疫原性であった。Ｅｎｖ １３４エピトープ及びＮｅｆ ２２１エピトープ（これについての中間値免疫原性が、インビボで観察された）はまた、トランスフェクトされたヒト細胞による中間の効率で、インビトロでプロセシングされた。結局、Ｇａｇ ２７１（これについてはインビトロプロセシングは観察され得ない）はまた、頻度及び大きさの両方において、至適以下のインビボ免疫原性を伴った。
これらのデータは、いくつかの重要な意味を有する。第一に、それは、所定のミニ遺伝子内に含まれる異なるエピトープが、プロセシングされそして異なる効率で提示され得ることを示唆する。第二に、それは、免疫原性が、生成されたプロセシングされたエピトープの量と比例していることを示唆する。最後に、これらの結果により、ヒト用途の多重エピトープワクチンの至適化の目的のためのトランスジェニックマウスの使用の重要な確証（バリデーション）が提供される。
（ＩＩＩ．ポリエピトープ構築物の調製）
ポリペプチド構築物中に封入するためのエピトープは、代表的には、例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７６６、又はＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４に記載のように、ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ結合モチーフを保有する。
ポリエピトープ構築物中に存在する複数のＨＬＡクラスＩＩ又はクラスＩエピトープは、同じ抗原、又は異なる抗原に由来し得る。例えば、ポリエピトープ性構築物は、１つ以上のＨＬＡエピトープを含み得る。このＨＬＡエピトープは、同じウイルスの２つの異なる抗原、又は異なるウイルスの２つの異なる抗原に由来し得る。ポリエピトープ性構築物への封入のためのエピトープは、例えば、ＨＬＡ対立遺伝子特異的モチーフ又はスーパーモチーフを含むエピトープを選択するためのコンピューターを用いることにより、当業者によって選択され得る。本発明のポリエピトープ性構築物はまた、１つ以上の広範に交差反応的な結合をするか、又は普遍的な、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），（例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載されている）、又はＰＡＤＲＥファミリー分子をコードし得る。
普遍的なＨＬＡクラスＩＩエピトープは、所定の抗原に応答して活性化される細胞の数を増加するために、他のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩエピトープと有利に組み合わせられ得、そしてＨＬＡ反応性対立遺伝子の広範な集団を提供する。従って、本発明のポリエピトープ性構築物は、抗原に特異的なＨＬＡエピトープ、普遍的ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、又は特定のＨＬＡエピトープ及び少なくとも１つの普遍的ＨＬＡクラスＩＩエピトープの組み合わせ、を含み得る。
ＨＬＡクラスＩエピトープは、約８〜約１３アミノ酸長、詳細には、８、９、１０、又は１１アミノ酸長である。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、一般に、約６〜約２５アミノ酸長、詳細には約１３〜２１アミノ酸長である。ＨＬＡクラスＩ又はＩＩエピトープは、目的の任意の所望の抗原に由来し得る。目的の抗原は、ウイルス抗原、表面レセプター、腫瘍抗原、癌遺伝子、酵素、又は任意の病原体、細胞もしくは分子（免疫応答が所望される）であり得る。エピトープは、１つ以上のＨＬＡ対立遺伝子に結合する能力に基づいて選択され得る。天然に存在する配列のアナログであるエピトープはまた、本明細書において記載されるポリエピトープ性構築物に含まれ得る。このようなアナログペプチドは、例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３７７８、ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４、及び同時係属のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２６０，７１４（３／１／９９出願）に記載されている。
ポリエピトープ構築物は、当該分野で周知の方法論を使用して作製され得る。例えば、そのポリエピトープ構築物を含むポリペプチドは、合成されそして連結され得る。しかし、代表的には、ポリエピトープ構築物は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ミニ遺伝子として作製され得る。
（ＩＶ．発現ベクター及びミニ遺伝子の構築）
本発明のポリエピトープ構築物は、代表的には、そのポリエピトープ構築物をコードするミニ遺伝子を含む発現ベクターとして提供される。このような発現ベクターの構築は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１０６４６に記載されている。この発現ベクターは、生物の適切な細胞中でそのミニ遺伝子をコードする転写単位を発現し得る、少なくとも１つのプロモーターエレメントを、その抗原が発現されかつ適切なＨＬＡ分子に標的化されるように含む。例えば、ヒトへの投与のために、ヒト細胞において機能するプロモーターエレメントが、その発現ベクター中に組み込まれる。
本発明は、組換え遺伝学の分野における慣用技術に依存する。本発明における使用の一般的方法を開示する基本的教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｋｕｉｊｐｅｒｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８（１７）：５１９７（１９９４）；Ｄｕｅｈｏｌｍ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９；５７６７〜５７７３（１９９４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻（Ａｇｒａｗａｌ編）；ならびにＴｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ（例えば、第１部第２章「Ｏｖｅｒｖｉｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」（１９９３））が挙げられる。
エピトープをコードする核酸は、標準技術に従って、ミニ遺伝子中にアセンブルされる。一般に、ミニ遺伝子エピトープをコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅技術を使用して単離されるか、又は化学合成される。組換えクローニング技術もまた、適切な場合に使用され得る。所望のエピトープを増幅する（そのミニ遺伝子をアセンブルするためにＰＣＲを使用する場合）か、又はその所望のエピトープをコードする（そのミニ遺伝子をアセンブルするために合成オリゴヌクレオチドを使用する場合）かのいずれかである、オリゴヌクレオチド配列が選択される。
プライマーを使用する増幅技術が、代表的には、ＤＮＡもしくはＲＮＡから選り抜きのエピトープをコードする配列を増幅及び単離するために使用される（米国特許４，６８３，１９５号及び同第４，６８，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法が、ｍＲＮＡか、ｃＤＮＡか、ゲノムライブラリーか、又はｃＤＮＡライブラリーから、エピトープ核酸配列を直接増幅するために使用され得る。制限エンドヌクレアーゼ部位が、そのプライマーに組み込まれ得る。そのＰＣＲ反応により増幅されたミニ遺伝子が、アガロースゲルから精製され得、そして適切なベクター中にクローン化され得る。
合成オリゴヌクレオチドもまた、ミニ遺伝子を構築するために使用され得る。この方法は、その遺伝子のセンス鎖及び非センス鎖の両方を示す、一連の重複するオリゴヌクレオチドを使用して実施される。次いで、これらのＤＮＡフラグメントがアニールされ、連結され、そしてクローン化される。市販されていないオリゴヌクレオチドは、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）に記載されるような自動合成機を使用して、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２（１９８１）により最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、化学合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動か、又はＰｅａｒｓｏｎ及びＲｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７〜１４９（１９８３）に記載されるようなアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによってである。
そのミニ遺伝子のエピトープは、代表的には、直接転写のための強力なプロモーター及び他の調節配列（例えば、エンハンサー及びポリアデニル化部位）を含む発現ベクター中にサブクローニングされる。適切なプロモーターは、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌらに、記載されている。哺乳動物細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そして市販されている。そのようなプロモーターエレメントとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーター及びＳＶ４０プロモーターが、挙げられる。
この発現ベクターは、代表的には、宿主細胞中でのそのミニ遺伝子の発現に必要なさらなるエレメントすべてを含む、転写単位及び発現カセットを含む。従って、代表的発現カセットは、そのミニ遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターと、その転写物の効率的ポリアデニル化に必要なシグナルとを含む。そのカセットのさらなるエレメントとしては、エンハンサー、及び機能的スプライス部位及びアクセプター部位を有するイントロンが、挙げられ得る。
プロモーター配列に加え、その発現カセットはまた、効率的終結を提供するように、その構造遺伝子の下流に転写終結領域を含む。その終結領域は、そのプロモーター配列と同じ遺伝子から得られてもよいし、又は異なる遺伝子から得られてもよい。
その遺伝情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核生物細胞中での発現のために使用される従来のベクターのいずれもが、使用され得る。真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが、代表的には、真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、ＣＭＶベクター、パピローマウイルスベクター及びエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）中で使用される。
本発明のポリエピトープ構築物は、プラスミドベクター及びウイルス性ベクターもしくは細菌性ベクターを含む、種々のベクターから発現され得る。ウイルス発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主（例えば、ワクシニアウイルスもしくは鶏痘ウイルス）が挙げられる。このアプローチの例として、ワクシニアウイルスが、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。腫瘍を保有する宿主中への導入の際に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それにより、宿主のＣＴＬ応答及び／又はＨＴＬ応答を惹起する。免疫プロトコルにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。
治療投与もしくは免疫のために有用な広範な種類の他のベクター（例えば、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）ベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなど）が、当業者に明らかである。
このポリエピトープ構築物の免疫原性及び抗原性は、本明細書中に記載されるように評価される。
（ターゲッティング配列）
本発明の発現ベクターは、ＭＨＣターゲッティング配列に作動可能に連結された、１つ以上のＭＨＣエピトープをコードする。ＭＨＣターゲッティング配列の使用は、ＭＨＣ分子アセンブリの部位へそのペプチドエピトープを指向させそして細胞表面に輸送することによって、抗原単独の送達と比較して、抗原に対する免疫応答を増強し、それにより、Ｔ細胞への結合及びＴ細胞の活性化に利用可能なＭＨＣ分子−ペプチドエピトープ複合体の数の増加を提供する。
ＭＨＣクラスＩターゲッティング配列（例えば、細胞質ゾル経路もしくは小胞体にＭＨＣクラスＩエピトープペプチドを標的化する配列）が、本発明において使用され得る（例えば、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８〜２２８（１９９５）を参照のこと）。例えば、細胞質ゾル経路は、その細胞の内側で発現される内因性抗原をプロセシングする。特定のいかなる理論によっても拘束されることは望まないが、細胞質ゾルタンパク質は、プロテアソームのエンドペプチダーゼ活性により少なくとも部分的には分解され、その後ＴＡＰ分子（プロセシングに関連するトランスポーター）により小胞体へと輸送されると考えられている。小胞体において、この抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する。小胞体シグナル配列は、この細胞質ゾルプロセシング経路を迂回し、そして内因性抗原を直接小胞体へと標的化し、小胞体において、ペプチドフラグメントへのタンパク質分解が生じる。このようなＭＨＣクラスＩターゲッティング配列は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｉｇκからのシグナル配列、組織プラスミノゲンアクチベーターからのシグナル配列、又はインスリンからのシグナル配列のような、シグナル配列が挙げられる。好ましいシグナルペプチドは、ヒトＩｇκ鎖配列である。小胞体シグナル配列はまた、ＭＨＣクラスＩ分子アセンブリの部位である、小胞体へとＭＨＣクラスＩＩエピトープを標的化するために使用され得る。
ＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列（例えば、ペプチドをエンドサイトーシス経路へと標的化する配列）もまた、本発明において使用され得る。これらのターゲッティング配列は、代表的には、細胞外抗原がエンドサイトーシス経路に入るように指向し、これにより、その抗原がリソソーム区画へと転移され、そのリソソーム区画において、その抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合のために抗原ペプチドへとタンパク質分解される。外因性抗原の通常のプロセシングと同様に、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをエンドサイトーシス経路のエンドソームへと指向し、かつ／又は続いてリソソームへと指向する配列が、ＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列であり、リソソームで、このＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し得る。例えば、本発明において有用なＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列のグループは、リソソームターゲッティング配列であり、これは、ポリペプチドをリソソームに局在化させる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は代表的には、リソソームにおけるエンドサイトーシスされた抗原のタンパク質分解性プロセシングに由来する抗原ペプチドに結合するので、リソソームターゲッティング配列は、ＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列として機能し得る。リソソームターゲッティング配列は、当該分野で周知であり、そしてＡｕｇｕｓｔら（１９９７年５月２７日発行の米国特許第５，６３３，２３４号（本明細書中に参考として援用される））により記載されるような、リソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１及びＬＡＭＰ−２中に見出される配列が挙げられる。
リソソームターゲッティング配列を含む他のリソソームタンパク質としては、ＨＬＡ−ＤＭが挙げられる。ＨＬＡ−ＤＭは、ＭＨＣクラスＩＩ分子への抗原ペプチドの結合を促進する際に機能する、エンドソーム／リソソームタンパク質である。このＨＬＡ−ＤＭはリソソーム中に位置するので、ＨＬＡ−ＤＭは、ＭＨＣクラスＩＩ分子ターゲッティング配列として機能し得るリソソームターゲッティング配列を有する（Ｃｏｐｉｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１０１７〜１０２７（１９９６）（本明細書中に参考として援用される））。
常在性リソソームタンパク質ＨＬＡ−ＤＯもまた、リソソームターゲッティング配列として機能し得る。上記の常在性リソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１及びＨＬＡ−ＤＭ（これらは、タンパク質をリソソームへと標的化する特定のＴｙｒ含有モチーフをコードする）とは対照的に、ＨＬＡ−ＤＯは、ＨＬＡ−ＤＭとの会合によってリソソームへと標的化される（Ｌｉｌｊｅｄａｈｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：４８１７〜４８２４（１９９６）（これは、本明細書中で参考として援用される））。従って、ＨＬＡ−ＤＭとの会合を生じるＨＬＡ−ＤＯの配列は、結果的には、リソソームへのＨＬＡ−ＤＯのトランスロケーションは、ＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列として使用され得る。同様に、ＨＬＡ−ＤＯのマウスホモログであるＨ２−ＤＯは、ＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列を駆動するために使用され得る。ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＨＬＡ−ＤＯもしくはＨ２−ＤＯに融合され得、そしてリソソームへと標的化され得る。
別の例において、Ｂ細胞レセプターサブユニットであるＩｇ−α及びＩｇ−βの細胞質ドメインは、抗原のインターナリゼーションを媒介し、そして抗原提示の効率を増大する（Ｂｏｎｎｅｒｏｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：３３５〜３４７（１９９５）（本明細書中で参考として援用される））。従って、このＩｇ−αタンパク質及びＩｇ−βタンパク質の細胞質ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列として機能し得、このＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを、ＭＨＣクラスＩＩ分子へのプロセシング及び結合のためのエンドサイトーシス経路へと標的化する。
ＭＨＣクラスＩＩエピトープをエンドサイトーシス経路へと指向させるＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列の別の例は、ポリペプチドが分泌されるように指向する配列であり、このポリペプチドは、エンドソーム経路に入り得る。ポリペプチドが分泌されるように指向するこれらのＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列は、内因性細胞外抗原がプロセシングされてＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドになる、通常の経路を模倣する。ポリペプチドが小胞体を通り最終的には分泌されるのを指向するように機能する任意のシグナル配列が、その分泌されたポリペプチドがエンドソーム経路／リソソーム経路に入り得、かつＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し得る分子へと切断され得る限り、ＭＨＣクラスＩＩターゲッティング配列として機能し得る。
別の例において、Ｉｉタンパク質は、小胞体中のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、この小胞体で、このタンパク質は、小胞体中に存在するペプチドがこのＭＨＣクラスＩＩ分子へ結合するのを妨げるように機能する。従って、Ｉｉタンパク質へのＭＨＣクラスＩＩエピトープの融合は、そのＭＨＣクラスＩＩエピトープを小胞体及びＭＨＣクラスＩＩ分子へと標的化する。例えば、Ｉｉタンパク質のＣＬＩＰ配列が除去され得、そしてＭＨＣクラスＩＩエピトープ配列で置換され得、そのＭＨＣクラスＩＩエピトープが小胞体を指向するようにされ得、小胞体で、そのエピトープはＭＨＣクラスＩｉ分子に結合する。
いくつかの場合において、抗原自体は、ＭＨＣクラスＩＩ又はＩ標的化配列として機能し得、そして免疫応答を刺激するために普遍的なＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合され得る。細胞質ウイルス抗原は一般に、ＭＨＣクラスＩ分子（長期生存細胞質タンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子処理経路に入り得るインフルエンザマトリックスタンパク質））との複合体として処置及び提示される（Ｇｕｅｇｕｅｎ ＆ Ｌｏｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６９２−１４６９７（１９９６）を参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される））。従って、長期生存細胞質タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ標的化配列として機能し得る。例えば、普遍的なＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合されたインフルエンザマトリックスタンパク質をコードする発現ベクターは、インフルエンザに対する免疫応答を刺激するために、インフルエンザ抗原及び普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープをＭＨＣクラスＩＩ経路に標的化するために、有利に使用され得る。
ＭＨＣクラスＩＩ標的化配列として機能する抗原の他の例としては、粒子を自発的に形成するポリペプチドが挙げられる。このポリペプチドは、それらを生成する細胞から分泌され、そして粒子を自発的に形成し、この粒子は、エンドサイトーシス（例えば、レセプター媒介エンドサイトシス）によって抗原提示細胞に取り込まれるか又は食菌作用によって飲み込まれる。この粒子は、エンドソーム／リソソーム経路に入った後、抗原ペプチドにタンパク質分解的に切断され得る。
粒子を自発的に形成する１つのこのようなポリペプチドは、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢＶ−Ｓ）である（Ｄｉｍｉｎｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ １５：６３７−６４７（１９９７）；Ｌｅ Ｂｏｒｇｎｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４０：３０４−３１５（１９９８）（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される））。粒子を自発的に形成する別のポリペプチドは、ＨＢＶコア抗原である（Ｋｕｈｒｏｂｅｒら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１２０３−１２１２（１９９７）（これは、本明細書中で参考として援用される））。粒子を自発的に形成するなお別のポリペプチドは、酵母Ｔｙタンパク質である（Ｗｅｂｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：８３１−８３４（１９９５）（これは、本明細書中で参考として援用される））。例えば、普遍的なＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合されたＨＢＶ−Ｓ抗原を含む発現ベクターは、ＨＢＶに対する免疫応答を刺激するために、ＨＢＶ−Ｓ抗原及び普遍的ＭＨＣクラスＩＩエピトープをＭＨＣクラスＩＩ経路に標的化するために、有利に使用され得る。
（インビボでの投与）
本発明はまた、本発明の発現ベクターを個体に投与することによって、免疫応答を刺激するための方法を提供する。免疫応答を刺激するために、本発明の発現ベクターの投与は、有利である。なぜなら、本発明の発現ベクターは、ＭＨＣエピトープをＭＨＣ分子に標的化し、従って、発現ベクターによってコードされる抗原によって活性化されるＣＴＬ及びＨＴＬの数を増加させるからである。
最初に、本発明の発現ベクターは、所望の免疫応答を刺激する際に最適な活性を有する発現ベクターを決定するために、マウスにおいて、スクリーニングされる。従って、初期の研究は、可能な場合、ＭＨＣ標的化配列のマウス遺伝子を用いて実施される。本発明の発現ベクターの活性を決定する方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、以下の実施例ＩＩ及びＩＩＩに記載されるように、Ｔ細胞活性化を測定するための3Ｈ−チミジンの取り込み、及びＣＴＬ活性を測定するための51Ｃｒの放出が挙げられる。実施例ＩＶに記載される実験に類似の実験が、免疫応答得を刺激する際に、活性を有する発現ベクターを決定するために実施される。活性を有する発現ベクターは、さらに、ヒトにおいて試験される。コードされたマウス配列に対する潜在的な有害な免疫学的応答を回避するために、活性を有する発現ベクターが、ＭＨＣクラスＩＩ標的化配列がヒト遺伝子から誘導されるように改変される。例えば、種々のＭＨＣクラスＩＩ標的化配列を含む遺伝子のヒトホモログの類似領域の置換は、本発明の発現ベクターに置換される。ヒトＭＨＣクラスＩＩ標的化配列（例えば、以下の実施例Ｉに記載されるなもの）が、ヒトにおける免疫応答を刺激する際に活性について試験される。
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア及び本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物に関する。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野で公知であり、そして水性又は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンが挙げられ、生理学的に緩衝化された生理食塩水、アルコール／水溶液あるいは他の溶媒又はビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、オイル（例えば、オリーブ油）又は注射可能な有機エステル）を含む。
薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、発現ベクターを安定化させるか、又は発現ベクターの吸収を増加させるように機能する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース又はデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン）、キレート化剤、低分子量ポリペプチド、抗菌剤、不活性気体あるいは他の安定化剤又は賦形剤が挙げられる。発現ベクターが、さらに、他の成分（例えば、ペプチド、ポリペプチド及び炭水化物）と複合体化され得る。発現ベクターはまた、例えば、ワクチン銃を使用して個体に投与され得る粒子又はビーズに複合体化され得る。当業者は、薬学的に受容可能なキャリア（生理学的に受容可能な化合物を含む）の選択が、例えば、発現ベクターの投与の経路に依存することを知る。
本発明はさらに、免疫応答を刺激するための本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物を投与する方法に関する。これらの発現ベクターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７））；Ｆｅｌｇｎｅｒら（米国特許第５，５８０，８５９号（１９９６年１２月３日に発行））；Ｆｅｌｇｎｅｒら（米国特許第５，７０３，０５５号（１９９７年１２月３０日に発行））；及びＣａｒｓｏｎら（米国特許第５，６７９，６４７号（１９９７年１０月２１日に発行））（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、当該分野で周知の方法によって投与される。１つの実施形態において、ミニ遺伝子が、裸の核酸として投与される。
本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物は、種々の経路（例えば、経口、膣内、直腸、又は非経口的に（例えば、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内、槽内））によってか、又は例えば皮膚パッチ又は経皮的イオン導入の各々を使用して、皮膚を介する受動的な吸収又は容易化された吸収によって、被験体における免疫応答を刺激するために投与され得る。さらに、この組成物は、注射、挿管によって、又は局所的に投与され得、これらの後者は、例えば、軟膏又は粉末の直接的な適用によって受動的であり得るか、あるいは鼻スプレー又は吸入剤を使用して積極的であり得る。発現ベクターはまた、局所スプレーとして投与され得、この場合において、この組成物の１つの成分は、適切な噴霧剤である。薬学的組成物はまた、所望ならば、リポソーム、マイクロスフィア又は他のポリマーマトリックスに組込まれ得る（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，７０３，０５５号；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻（第２版、１９９３）、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。例えば、リン脂質又は他の脂質からなるリポソームは、比較的に、作製及び投与が簡単である、非毒性で、生理学的に受容可能かつ代謝安定的なキャリアである。
本発明の発現ベクターは、動物身体の組織の間隙空間に送達され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，７０３，０５５号）。本発明の発現ベクターの筋肉への投与は、特に有効な投与方法であり、経皮注射及び皮下注射ならびに経皮投与を含む。例えば、イオン導入による、経皮投与は、本発明の発現ベクターを筋肉に送達するために有効な方法である。本発明の発現ベクターの表皮投与もまた、使用され得る。表皮投与は、刺激剤に対する免疫応答を刺激するために、表皮の最も外側の層を機械的に又は化学的に刺激する工程を包含する（Ｃａｒｓｏｎら、米国特許第５，６７９，６４７号）。
免疫応答を刺激するための、本発明の発現ベクターを投与する他の有効な方法は、粘膜投与を含む（Ｃａｒｓｏｎら、米国特許第５，６７９，６４７号）。粘膜投与について、最も有効な投与方法は、発現ベクター及び薬学的組成物を含む適切なエアロゾルの鼻腔内の投与を含む。座剤及び局所調製物はまた、生殖部位、膣部位及び眼部位の粘膜組織への発現ベクターの送達のために有効である。さらに、発現べクターは、粒子に複合体化され得、そしてワクチン銃によって投与され得る。
投与される投薬量は、投与の方法に依存し、そして一般に、約０．１μｇ〜約２００μｇの間である。例えば、この投薬量は、約０．０５μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、特に約０．００５〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。有効用量は、発現ベクターの投与の後に、免疫応答を測定することによって決定され得る。例えば、発現ベクターによってコードされるＭＨＣクラスＩＩエピトーピ又はＭＨＣクラスＩエピトープに特異的な抗体の産生が当該分野で周知の方法（ＥＬＩＳＡ又は他の免疫学的アッセイを含む）によって測定され得る。さらに、Ｔヘルパー細胞の活性化又はＣＴＬ応答が、当該分野で周知の方法（Ｔ細胞活性化を測定するための3Ｈ−チミジンの取り込み、及びＣＴＬ活性を測定するための51Ｃｒの放出を含む）によって測定され得る（以下の実施例ＩＩ及び実施例ＩＩＩを参照のこと）。
本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物は、哺乳動物、特にヒトに、予後又は治療目的のために投与され得る。本発明の発現ベクターを使用して処置又は予防され得る疾患の例としては、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ及びＣＭＶでの感染、ならびに前立腺癌、腎臓癌、頭部癌、リンパ腫、尖圭コンジローム及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が挙げられる。
治療適用において、本発明の発現ベクターは、癌、自己免疫疾患を既に被る個体、又はウイルスに感染した個体に投与される。疾患の潜伏期又は急性期にある疾患は、適切ならば、他の処置とは別に又は他の処置と組合せて、本発明の発現ベクターで処置され得、全ての普遍的なＭＨＣクラスＩＩエピトープを発現するものを含む。
治療的適用及び予後適用において、本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物は、抗原に対する有効な免疫応答を惹起するに十分な量で、及び疾患の徴侯又は症状を緩和するに十分な量で患者に投与される。投与するための、疾患の徴侯又は症状を緩和するに十分な発現ベクターの量は、治療有効用量といわれる。治療有効用量を達成するために十分な発現ベクターの量は、本発明の発現べクターを含む薬学的組成物、投薬の様式、処置される疾患の状態及び重篤度、患者の体重及び一般的な健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。
（実施例）
以下の実施例は、この特許請求された発明を例示するために提供され、この特許請求された発明を制限するために提供されていない。本明細書中に記載される実施例及び実施形態は、例示目的のみのためであり、そしてその観点における種々の改変又は変化が、当業者に示唆され、そして添付の特許請求の範囲のこの適用及び範囲の意図及び範囲内に含まれることが理解される。
実施例１〜９は、多重エピトープ構築物の免疫原性及び抗原性を評価するためのアッセイの例を提供する。
（実施例１：）
（抗原性アッセイ）
ＤＮＡ、ペプチド／ＩＦＡ又はリポペプチドで初回刺激したトランスジェニックマウスの脾細胞から高親和性ペプチド特異的ＣＴＬ株を作製した。手短に言うと、トランスジェニックマウス由来の脾細胞を、０．１μｇ／ｍｌペプチド及びＬＰＳ芽細胞で刺激した。初回刺激の１０日後、及びその後毎週、細胞を、０．１μｇ／ｍｌペプチドで１時間、ＬＰＳ芽細胞をパルスして、再刺激した。ＣＴＬ株を、上記のようにインサイチュＩＦＮ−γＥＬＩＳＡでの再刺激後に５日アッセイした。あるいは、例えば、標的化された病原菌に感染した患者、又は標的化された疾患（例えば、癌）を有する患者に由来するＣＴＬ株が使用され得る。トランスジェニックマウス又は患者のいずれかからも入手可能ではない特定のＣＴＬ株は、当該分野の専門技術に基づいて正常なドナーのＰＢＭＣから作製される。
これらのアッセイにおいて使用され得る標的細胞はトランスジェニックマウスに由来するＣＴＬ株について、Ａ２．１／Ｋb、Ａ１１／Ｋb、Ａ１／Ｋb、又はＢ７／ＫbでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞又は．２２１細胞である。すべてのこれらの細胞株が、現在我々に入手可能である（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ヒトＣＴＬ株の場合では、適切なヒトＨＬＡ対立遺伝子でトランスフェクトされた．２２１細胞が利用される。現在．２２１細胞は、Ａ２及びＡ１でトランスフェクトされ、そして、Ａ１１、Ａ２４及びＢ７トランスフェクト体を作製する。代替的な実施形態において、標的細胞に関して意外な問題生じる場合、ＬＰＳ芽細胞及びＥＢＶ形質転換株は、それぞれ、マウス及びヒトＣＴＬ株について利用される。
抗原性についてアッセイするために、連続的に希釈したＣＴＬを１０5標的細胞及び１〜１０-6μｇ／ｍｌで変化する多重ペプチド濃度でインキュベートした。さらに、ＣＴＬを、目的のミニ遺伝子を含むエピソームのベクターでトランスフェクトした標的細胞とインキュベートした。エピソーマルのベクターは、当該分野で公知である。
ミニ遺伝子でトランスフェクトされたＡＰＣ内の天然のプロセシングによって産生されたペプチドの相対量は、以下のように定量される。トランスフェクトされた標的細胞の認識の際にＣＴＬ株によって産生されたＩＦＮ−γの量が記録される。同一量のＩＦＮ−γを生成するのに必要な合成ペプチドの量は、同一のＣＴＬ株が、ペプチドの公知の濃度と平行してインキュベートされる場合に産生される標準曲線から内挿される。
（実施例２：）
（マウス、免疫化及び細胞培養）
この研究において使用されたＨＬＡ−Ａ２．１Ｋbの誘導［Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，第１７３巻（４）：１００７−１５（１９９１）］及びＡ１１／Ｋｂ［Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５９巻（１０）：４７５３−６１（１９９７）］トランスジェニックマウスが記載されている。ＨＬＡ Ｂ７ Ｋb及びＡ１／Ｋbトランスジェニックマウスは、マウスで利用可能である（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ＨＬＡ ＤＥ２、ＤＥ３及びＤＥ４トランスジェニックマウスは、Ｃ．Ｄａｖｉｄ（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ）から獲得される。非トランスジェニックＨ２bマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ又は他の販売元から購入される。免疫化は、以前に記載されたように行なわれる［Ｉｓｈｉｏｋａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．１６２（７）：３９１５−２５（１９９９）］。全ての細胞を１０％ ＦＢＳ、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μＭ ２−ＭＥ、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリンで補充したＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＲＰＭＩ １６４０培地からなる培養培地中で増殖した。
ＨＬＡトランスジェニックマウス及び抗原性アッセイを試験及びＣＴＬ応答の最適化の目的のために使用した。ＨＬＡ−ＤＲとＩＡbとの間の天然の交差反応性はまた、ＨＴＬ応答を試験するために使用され得る。この評価は、多エピトープ性構築物の抗原性及び免疫原性の評価を提供する。
（実施例３：）
（増殖アッセイ）
ＨＴＬエピトープの免疫応答を誘導する能力を評価するために、増殖アッセイのようなアッセイをしばしば行なう。例えば、マウスＤＣ４ Ｔリンパ球は、ＤｙｎａＢｅａｄｓ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）（Ｄｙｎａｌ）を使用して脾臓単一細胞懸濁液から免疫磁気的に単離した。手短に言うと、２×１０7脾細胞を４℃で４０分間５．６×１０7磁気ビーズとインキュベートし、次いで、３回洗浄した。磁気ビーズをＤｅｔａｃｈａＢｅａｄ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４（Ｄｙｎａｌ）を使用して脱着した。単離したＣＤ４ Ｔリンパ球（２×１０5細胞／ウェル）を平底の９６マイクロタイタープレートで３連で５×１０5の放射した（３５００ｒａｄ）同系の脾細胞と培養した。最終濃度２０、１、０．０５及び０μｇ／ｍｌの濃度まで精製されたペプチドをウェルに添加し、そして、細胞を全４日間培養した。収穫の約１４時間前、１μＣｉの3Ｈ−チミジン（ＩＣＮ）を各ウェルに添加した。ウェルをＦｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用してＵｎｉｆｉｌｔｅｒ ＧＦ／Ｂプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）上に収穫した。3Ｈ−チミジン取り込みをＴｏｐＣｏｕｎｔTMマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、液体シンチレーション計算によって測定した。
（実施例４：）
（51クロム放出アッセイ）
ＣＴＬ活性を測定するためのこのアッセイは、当該分野で公知である。このアッセイは、51Ｃｒ標識標的集団から放出された51Ｃｒの割合を測定することによって、Ｔ細胞集団の溶解活性を定量する［Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４（２）：１８１−９６（１９６８）］。クロム放出アッセイに由来するデータは、通常ＣＴＬ頻度／１０6細胞としてか［制限希釈分析、ＬＤＡ；［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ １９９１ 第３章；Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、１９９７ Ｒ節］、又はより厄介でない大量のＣＴＬ活性の定量的な評価［溶解単位；ＬＵアッセイ］によってのいずれかで通常発現される。ＬＵアッセイにおいて、51Ｃｒアッセイにおいて産生された標準Ｅ：Ｔ比対パーセント細胞障害性データ曲線は、１０6エフェクター細胞あたりの溶解単位に変換され、１ＬＵは、標的細胞の３０％溶解を達成するのに必要な溶解活性として定義される［Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｋ，Ｊ．，Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｇ．，及びＬｉｖｉｎｇｓｔｏｍ，Ａ．、Ｊ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｓｈｅｖａｃｈ，及びＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、「Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ；ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ，ｐ．３．１１．１８］。ＬＵ計算は、応答の定量を可能とし、従って、異なった実験値を容易に比較する。
（実施例５：）
（インサイチュＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ）
インサイチュＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイを開発し、そして、新たに単離された脾細胞及びペプチド再刺激された脾細胞の両方について最適化した（例えば、ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｋｖｏｒｅｔｘ，Ｒ．，Ｍｉｎｇｓｈｅｎｇ，Ｑ．，Ｉｓｈｉｏｋａ，Ｇ．，Ｓｅｔｔｅ，Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ Ａｓｓａｙ Ｗｈｉｃｈ ｉｓ Ａｂｌｅ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｆｒｏｍ Ｆｒｅｓｈｌｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｇｅｎｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、出版中、を参照のこと）。このアッセイは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに基づくが、可溶性の色原体（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）を利用し、ハイスループット分析に容易に適合性となる。初回刺激アッセイ及び再刺激アッセイの両方において、この技術は、これらの他のアッセイにおいて検出可能でないインサイチュＥＬＩＳＡにおいて反応が観察されるという点で、伝統的な上清ＥＬＩＳＡ又は51Ｃｒ放出アッセイのいずれかよりもより感受性である。細胞あたりの基礎に基づいて、インサイチュＥＬＩＳＡの感受性は、約１ＩＦＮ−γ分泌細胞／１０4プレート細胞である。
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩、抗ＩＦＮ−γ（ラット抗マウスＩＦＮ−α ｍＡｂ、クローンＲ４−６Ａ２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコートし、次いで、ＰＢＳ中１０％ＦＢＳで室温で２時間ブロッキングした。連続希釈した原発性脾細胞又はＣＴＬを、５％ＣＯ2で３７℃で、ペプチド及び１０5Ｊｕｒｋａｔ Ａ２．１／Ｋb細胞／ウェルと共に２０時間培養した。翌日、細胞を洗浄し、そして、ウェルに分泌されたＩＦＮ−γの量をサンドイッチＥＬＩＳＡで検出し、ビオチン化α−ＩＦＮ−γ（ラット抗マウスＩＦＮ−γ ｍＡｂ、クローンＺＭＧ１．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、分泌されたＩＦＮ−γを検出した。ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ）及びＴＭＢ（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ）を、製造業者の指示に従って、呈色発生について使用した。吸光度をＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＲＣ ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で、４５０ｎｍで読み取った。インサイチュＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡデータを、特定のペプチドに応答して１００ｐｇのＩＦＮ−γを分泌する細胞の数に基づいて、ペプチドの非存在下のＩＦＮのバックグラウンド量について修正した、分泌単位（ＳＵ）で評価した。
（実施例６：）
（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、特定のリンホカイン（通常、ＩＦＮ−γ）を産生及び放出するために誘導される個々の細胞の能力を測定することによって、所定のペプチドについてのＴ細胞特異性の頻度を定量する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの増加した感受性は、感染したヒト又は実験動物から新たに単離された細胞からの応答を研究者が検出するのを可能にした［Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第８巻（２）：１７７−８７（１９９８）；Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７９巻（５３５９：２１０３−６（１９９８）］。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、最終工程まで、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡについて上記のように行なわれ、ここで、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ，１：５００希釈）を、ＨＲＰ−ストレプトアビジンの代わりに使用する。製造業者の指示に従って、基質５−ＢＣＩＰ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して色を発生させた。位相差顕微鏡を使用して、スポットを計算した。あるいは、Ｚｅｉｓｓ ＫＳ ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを利用して、スポットを計算した。この場合、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を使用した。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを慣例的に利用して、免疫応答を定量化した。スポットを手動で計算され得るが、しかし、好ましい形態で、ＺｅｉｓｓからのＫＳ ＥＬＩＳＰＯＴリーダー、スポットを認識及び計測するように特異的に設計されたソフトウェアを用いた顕微鏡ベースの系が使用される。
（実施例７：）
（四量体染色）
四量体染色は、ペプチドエピトープ、クラスＩ抗原及びエピトープに特異的なＴ細胞レセプター間の相互作用に基づいたエピトープ特異的ヒトＣＤ８+Ｔリンパ球を検出するフローサイトメトリー技術である。このアッセイは、新たに単離された血液サンプル中のエピトープ特異的ヒトＣＤ８+Ｔリンパ球の迅速な定量を可能にする。種々のＨＩＶペプチド／ＨＬＡ組み合わせのＭＨＣ四量体が、例えば、ＮＩＨ貯蔵庫（Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔ／ｔｅｔｒａｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から獲得される。エピトープ特異的細胞を標識するために、１００μｌ用量中１×１０6ＰＢＭＣを適切な四量体ならびにヒトＣＤ３及びＣＤ８を認識するモノクローナル抗体の５μｇ／ｍｌで、４０分間暗黒下でインキュベートした（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ又はＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡを含む販売元から異なった蛍光クロム結合形態で入手可能である）。細胞を洗浄して、分析の前に、ＦＡＣｓａｎ又はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを使用して、パラホルムアルデヒド固定した（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。サンプルデータをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
（実施例８：）
（臨床サンプルからのアッセイ）
患者又は志願者からの凍結ＰＢＭＣサンプルにおける特定のＣＤ８+ＣＴＬ活性を評価するための種々のアッセイが用いられ得る。ＥＬＩＳＯＴ、クロム遊離、インサイチュＩＦＮ−γ遊離、増殖、及びテトラマーアッセイはすべて、種々の実験モデル（例えば、マウス及び／又は霊長類起源の実験モデル）からの応答を評価するのに有用である。
これらのアッセイのマウス版の実験方法は、上述されており、そしてこれらは、記載（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１５９巻（３）：１３８３−９２（１９９７）；Ｈｅａｔｈｃｏｔｅら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，第３０巻（２）：５３１−６（１９９９）；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６２巻（５）：３０８８−９５（１９９９））されるようにヒトの系について適合され、そして当業者に認識されるものにさらに適合される。このアッセイを完了させるために必要な凍結ＰＢＭＣサンプルの量についての計算については、実施例１４においてより詳細に記載される。
（実施例９：）
（トランスジェニック動物）
トランスジェニックマウス（ＨＬＡ−Ａ２．１／ＫbＨ２b；ＨＬＡ−Ａ１１／Ｋb；ＨＬＡ−Ａ１／Ｋb，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋb）は、１０〜１００μｌ容量中の１００μｇまでのＤＮＡ又はペプチドの用量を用いて前頸骨筋において筋内で免疫されるか、又は尾底（ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ）において皮下で免疫される。ＤＮＡは生理食塩水中に処方され、そしてペプチドは不完全フロイントアジュバンド中に処方される。１１〜１２日後、この動物をＣＯ2窒息させて屠殺し、脾臓を回収し、そしてインビトロでのＣＴＬ機能の決定のための細胞供給源として用いる。代表的に、実験グループあたり３〜６匹のマウスを用いる。さらに、非免疫マウス由来の脾臓を、ＣＴＬ培養物の再刺激のためのＡＰＣ供給源として用いる。８〜１２週齢の雄と雌の両方を用いる。
（実施例１０：）
（複数のＣＴＬ及びＨＴＬエピトープに対する同時応答の誘導の実証）
（ＣＴＬエピトープストリングの構築及び試験）
この実施例は、複数のＣＴＬ及びＨＴＬエピトープを試験することに関する実施例を提供する。例えば、単一のプロモーターの制御下で１０〜１２の異なるＣＴＬエピトープを含むエピトープストリングが合成され、そして標準的なプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）又はＮＧＶＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ）由来のプラスミドに組み込まれる。これらの構築物は、標準的なシグナル配列及び汎用のＨＴＬエピトープ、ＰＡＤＲＥTMを含む。エピトープの各セットは、集団範囲の均衡がとれるよう選択される。試験及び最適化を容易にするために、トランスジェニックマウスにおける免疫原性及び／又はヒトにおける抗原性であることが示されたようなエピトープの均衡のとれた提示が含まれる。
本明細書に記載されるように、これらのＣＴＬエピトープの特異的な順序は、コンピュータプログラム、ＥＰＩＳＯＲＴTMの使用により、クラスＩ結合モチーフを最小化するよう選択される。順序の最適化に関する最善の努力にも関わらず、潜在的な結合エピトープが本発明に従う構築物中になお存在する場合、対応するペプチドが合成されて、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおけるこのようなエピトープに対するＣＴＬ応答がモニターされる。一般に、結合モチーフの最小化は好都合であり、そして適している。しかし、任意の結合エピトープに対する応答が検出される場合、これらの結合エピトープは、短い１つから２つの残基のスペーサー（例えば、Ｋ、ＡＫ、ＫＡ、ＫＫ、又はＡ）の使用により分断される（これらのスペーサーは、先の節で議論した予想されるタンパク質分解性の切断の嗜好に適合する）。
最適化された構築物の究極的な使用はヒトワクチンであるので、最適化されたヒトコドンが用いられる。しかし、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおける最適化プロセスを容易にするために、可能であるならばいつでも、マウスに対しても最適であるヒトコドンを選択することに注意が払われる。ヒト及びマウスコドンの使用法は非常に類似している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎにおけるコドン使用のデータベース）。
種々のミニ遺伝子ワクチン構築物でトランスフェクトされたヒト細胞は、抗原性アッセイにおいて用いられ得る。このアッセイは、インビボでのＨＬＡトランスジェニックマウスにおける試験と平行に行なわれる。これら２つの異なるアッセイ系の有効性により、異なるコドンの使用に起因するミニ遺伝子ワクチンの効果の間のいくつかの潜在的な矛盾に取り組む。
代表的に、プラスミド構築物の抗原性及び免疫原性試験は、平行に行なわれる。トランスジェニックマウスにおけるインビボでの試験は、Ａ２、Ａ１１、Ｂ７、及びＡ１ ＨＬＡトランスジェニックマウスに対して行なわれる。本発明者らの研究室において十分に構築されたプロトコルにしたがって、心臓毒の前処理をされたマウスは、１００μｇの各プラスミドを腹腔内に注射され、そして１１日後に応答を評価される（Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６２巻（７）：３９１５−２５（１９９９））。アッセイとして、新鮮な単離された細胞からのＥＬＩＳＰＯＴ、ならびに再刺激された細胞培養物からのインターフェロンγ遊離アッセイ及び細胞障害性クロム遊離アッセイが挙げられる。上述の技術はすべて、当該分野で十分に構築されている。最初の試験は、ＨＬＡトランスジェニック動物における免疫原性がすでに十分に実証されている８ＨＬＡ Ａ２、９ＨＬＡ Ａ１１、及び６ＨＬＡ Ｂ７拘束エピトープに照準を合わせる。これらのエピトープに対する応答の同時測定は、問題にならない。というのも、トランスジェニックマウスの大きなコロニーは、すでにこれらのＨＬＡ型について「内部で」構築されているからである。複数の読み出しアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｄｏｕｔ ａｓｓａｙ）において４〜６のマウスのグループが、６〜１０の異なるエピトープに対する応答を測定するのに適している。ＨＬＡ Ａ１ トランスジェニックマウスにおけるＨＬＡ Ａ１−拘束、ＨＩＶ由来エピトープの試験が、代表的に用いられる。しかし、問題に出くわした場合、ヒトＡＰＣを用いる抗原性試験が、代替のストラテジーとして用いられ得るか、又はトランスジェニックマウスの研究を補完するために用いられ得る。
本明細書中で報告される研究の中で記載されているように、トランスジェニックマウスにおける免疫原性と抗原性との間の関連を広げる目的で、抗原性試験が用いられて、Ｐｏｌ４９８、Ｅｎｖ１３４、Ｎｅｆ２２１、Ｇａｇ２７１のようなエピトープに対する応答が評価される。これらに対して高い親和性のＣＴＬ系はすでに内部で利用可能である。本明細書中で記載されるように、そして本発明者らの研究室内で慣用的に適用されるように、さらなる適切なＣＴＬ系を生成する目的で、アジュバンド中で乳化されたペプチド、又はリポペプチドを用いたＨＬＡトランスジェニックマウスの直接の免疫が用いられて、抗原性アッセイにおいて使用するための系が生成される。
インビボでの最適化実験が適さないようなエピトープに対する主要な読み出しとして、抗原性アッセイはまた用いられる。これらのエピトープとして、Ａ２４、及びおそらくはＡ１拘束エピトープ、ならびにＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて非免疫原性である任意のエピトープが挙げられる。このような場合のいずれかにおいて、本発明者らは、ＨＩＶに曝された個体から生じたヒトＣＴＬ系を用いる。あるいは、本発明者らは、ＧＭＣＳＦ／ＩＬ４誘導性樹状細胞及び末梢血リンパ球を用いて、インビボでのＣＴＬ誘導のためにＣＴＬ系を生成する（Ｃｅｌｉｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，第９１巻（６）：２１０５−９（１９９４））。
このミニ遺伝子をコードするエピソームベクターが生成され、そして適切なヒト細胞系にトランスフェクトされて、標的細胞を生成する。例えば、ヒトＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔが用いられ得るが、リンパ芽球状細胞系もまた首尾よく用いられている。ヒト起源のＣＴＬ細胞系を用いる実験のために、十分に特徴付けられたＨＬＡ適合性の、ホモ接合型の、ＥＢＶ細胞系が、精製されたＭＨＣの供給源として、及び標的細胞として一般に用いられ、そしてミニ遺伝子トランスフェクションのレシピエントとして用いられる。ＨＬＡトランスジェニックマウス由来のＣＴＬ系を用いる実験のために、適合するＨＬＡ／Ｋbキメラ構築物でトランスフェクトされた、クラスＩネガティブの、ＥＢＶで形質転換された変異細胞系２２１（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ，ＤｅｍａｒｓＲ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１４２巻（９）：３３２０−８（１９８９））のコレクションが、このミニ遺伝子トランスフェクションのレシピエントとして用いられる。このような細胞は、ＣＴＬ系に対してペプチド抗原を効果的に提示する（Ｃｅｌｉｓら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，第９１巻（６）：２１０５−９（１９９４））。
（ＨＴＬエピトープストリングの構築及び試験）
単一のプロモーターの制御下で３〜５の異なるＨＴＬエピトープを含むエピトープストリングが合成され、そして標準的なプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）中に組み込まれる。全ての構築物は、Ｉｇ−α標的化配列を含む。試験及び最適化を容易にするために、所定のミニ遺伝子に対するエピトープの各セットは、ＩＡbマウスにおいて免疫原性であることがすでに公知であるエピトープのバランスの良い提示を提供するよう選択される。このエピトープの順序は、ＥＰＩＳＯＲＴプログラムの使用による連結エピトープの提示を最小化するよう選択される。さらに、連結に対応する全てのペプチドが合成され、そしてＩＡbに対する結合について試験される。そして、最も重要には、１４の異なるＤＲ分子のパネル（世界的に最も一般的なＤＲ対立遺伝子変異体の代表である）に対する結合について試験される（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６０巻（７）：３３６３−７３（１９９８））。したがって、目的の抗原に指向されないＨＴＬエピトープは、これらのプラスミド内で作製されない。しかし、良いＤＲ結合能を有する（したがって、インビボで潜在的なＤＲ拘束免疫原性を有する）結合領域が検出され、ＧＰＧＰＧのようなスペーサーが導入されてこれらを排除する。本明細書に記載されるように、すべての構築物において、クラスＩ結合モチーフの数はまた最小化される。
実験用ワクチンプラスミドは、ＨＬＡ ＤＲトランスジェニックマウス及び／又はＨ２ｂハプロタイプのマウスを用いて免疫原性について試験される。増殖及び／又はサイトカイン産生が測定される（ＩＬ５、ＩＦＮ−γ）。代表的なプロトコルにおいて、心臓毒処理されたマウスは、各プラスミド１００μｇを用いて筋肉内注射され、そして１１日後に応答を評価される（Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，第１６２巻（７）：３９１５−２５（１９９９））。
（ＣＴＬとＨＴＬエピトープとの間の相互作用についての試験）
上記の活性は、小さい、機能的なブロックのエピトープを産生する。これは、すべての分析可能なエピトープに対する同時応答／抗原性を実証するために用いられる。これらのブロックは、さらに最適化に供される（これについては次の実施例に記載される）。これらの同じミニ遺伝子を用いて、免疫優性が評価される。詳細には、すべてのＣＴＬプラスミドが一つに混合されるか、又はすべてのＨＴＬプラスミドが一つに混合される。次いで、ミニ遺伝子プールを用いて得られた結果が、別々に注射された同じミニ遺伝子を用いて得られた結果と比較される。
これらのミニ遺伝子プラスミドはまた、ＣＴＬエピトープへの応答についてのＨＴＬエピトープの効果を決定するためにも用いられる。詳細には、ＨＴＬ及びＣＴＬ含有プラスミドがプールされ、そしてマウスに注射され、そして選択されたエピトープへのＣＴＬ及びＨＴＬの応答が、本明細書に記載されるように測定される。しばしば、例えば、標的抗原由来のＨＴＬエピトープの存在が、ＣＴＬミニ遺伝子においてプラスミド含有汎ＤＲ結合エピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥTM、又はＰＡＤＲＥファミリー分子）を用いて得られた応答レベルを超えて、ＣＴＬ応答を増強するか否かを決定される。代表的に、ＰＡＤＲＥが抗原由来ＨＴＬエピトープを標的化する応答を阻害又は増加させる否かもまた決定される。又は逆に、目的の抗原由来のＨＴＬエピトープがＰＡＤＲＥへの応答を阻害又は増加させるか否かも決定される。
多数のエピトープへの応答は、この方法を用いて達成される。構築物のプールは、より弱いいくつかのエピトープに対する応答を阻害し得る可能性がある。この場合、プーリング実験は最適化後に繰り返される。
（実施例１１：）
（ＣＴＬ及びＨＴＬミニ遺伝子構築物の最適化）
この実施例は、実施例１０に記載されるＣＴＬ及びＨＴＬ構築物の最適化について記載する。抗原性及び免疫原性についての隣接する残基の潜在的な影響もまた、最適化したミニ遺伝子構築物において評価される。これらの研究は、隣接残基（「スペーサー」と同義語であり、効果的なプロセシングを促進するために設計される）の含有を含む。
このような分析は、次のようにして実施され得る。第１に、実施例１０に記載されるようなＣＴＬマルチエピトープ構築物の試験結果が、活性と３残基隣接エピトープのＮ及びＣ末端での特定の残基の存在との間の傾向及び関係について分析される。応答の大きさに関して準最適化（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）されているエピトープ（準最適化ＣＴＬプライミングが注目される）が隣接領域最適化についての標的である。それぞれのＣＴＬミニ遺伝子ワクチンについて、最適化された配置を有するコードされる１０〜１２の異なるＣＴＬエピトープ、「第２世代」ミニ遺伝子ワクチンが、産生される。
第一の最適化設計は、最適以下の性能に関連したすべてのエピトープについてＣ＋１位に、アラニン（Ａ）残基又はリジン（Ｋ）残基のいずれかを導入することである。第二の最適化設計は、抗原性に関連した、標的抗原（例えば、ＨＩＶ）中において天然に存在する残基を、Ｃ＋１位に導入することである。
選択されたエピトープについて、さらなる改変もまた導入される。特に、エピトープのＣ末端及びＮ末端に他の残基スペーサーを導入することの効力もまた研究される。実施例１０に記載のミニ遺伝子ワクチンの分析結果によると、研究された残基は、さらに、例えば、Ｇ、Ｑ、Ｗ、Ｓ及びＴを含み得る。連結エピトープがこれらの改変によって作製される場合、連結エピトープを排除する代替的エピトープ順序が、本明細書中に記載されるように、合理的に設計される。すべての第二世代構築物を、本明細書中に記載のように、抗原性及び免疫原性について試験する。
これらの改変の結果として、ミニ遺伝子の特定の改変に対応する、活性におけるバリエーションを同定する。普遍的で有益な効果を有する特定の改変が見出される。これを確認するために、すべてのエピトープ（また、受容可能な抗原性及び免疫原性を示したもの）が同一改変に供された、さらなるミニ遺伝子ワクチンの作製及び試験を実施する。いくつかの場合、活性の増加は、いくつかのエピトープについて注目されるが他のエピトープについては注目されないか、又は、さほど望ましくはないものの、特定の改変は、いくつかの活性を増加させるが、他のエピトープの活性を減少させる。いくつかの場合、有害であること又は効果を有さないことが証明された改変を排除しつつ、さらなるミニ遺伝子ワクチンが、有益な改変を保持するように設計され、そして試験される。
これらのミニ遺伝子ワクチンは、ａ）最少の推定連結エピトープが提示され；及びｂ）以前のミニ遺伝子ワクチンにおいて機能的ではなかったエピトープが、ここで、より有効な新規の状況下にあるように設計される。
ＨＴＬミニ遺伝子ワクチンについて、「第一世代」ミニ遺伝子ワクチンから得られるデータを、連結エピトープ、及びミニ遺伝子内のエピトープ位置、ならびにスペーサー（例えば、ＧＰＧＰＧスペーサー）に対する近接性に関しての傾向について研究する。特定の傾向が検出された場合、第二世代のミニ遺伝子ワクチンを、これらの傾向に基づいて設計する。あるいは、最適以下の活性を生ずるミニ遺伝子の場合、他の標的ストラテジー（例えば、Ｉｉ及びＬＡＭＰに基づくもの）の潜在的有効性を再評価し、そして標的なし及び単純なリーダー配列標的に対して比較する。
この節に記載されるＣＴＬ又はＨＴＬミニ遺伝子ワクチンのいずれかの活性において大きなバリエーションが検出された場合、この結果は、ミニ遺伝子活性に影響を及ぼす立体配置効果又は「長距離（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）」効果のような影響と一致する。これらの変量は、現在の分子生物学的技術及び細胞生物学的技術によって分析され得る。例えば、種々のミニ遺伝子でトランスフェクトされた細胞株を、ノーザン分析又はプライマー伸長アッセイ［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ １９９９］により、ｍＲＮＡの発現レベル及び安定性について分析し得る。
すべてのミニ遺伝子ワクチンにおいて、ＭＹＣ／ｈｉｓのような抗体タグもまた含められ得る。このタグは、タンパク質発現レベルの試験を可能にする。ＭＹＣ／ｈｉｓタグ［Ｍａｎｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ、第１６２巻（１）：１２９−３４（１９９５）］を含ませることはまた、パルス−チェイス実験によって、発現産物の安定性を決定することを可能にする。次いで、これらのアッセイの結果を、抗原性及び免疫原性の実験の結果と比較し得る。この結果を、傾向及び一般的規則の存在、ならびに試験された異なる変量間の相関について調査する。
（実施例１２）
（選択されたエピトープの効率的送達を可能にする、最も単純なプラスミド立体配置の決定）
実施例１１及び１２に記載の実験は、ミニ遺伝子ワクチン設計に関する変量に取り組むために設計される。理想的には、ヒトにおいて使用され得るベクターは、プログラム全体を通して使用されるが、ワクチンエピトープ最適化研究についてのＤＮＡワクチンプラスミドは、使用され得、次いでヒトでの使用に適切なベクターへと切り換えられ得る。実際のベクター選択は、いくつかの変量に依存する。例えば、信頼できる供給源（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ））を通した、ヒトでの使用に適切なベクターの利用能が要因である。
本実施例では、最適化されたミニ遺伝子はまた、エピトープのより多くのブロックを形成するように連結される。すべての構築物は、好ましくは、それぞれ、ＣＴＬミニ遺伝子の場合にはＰＡＤＲＥ及びリーダー配列標的、そしてＨＴＬエピトープミニ遺伝子の場合にはＩｇ−αを組み込むように設計される。詳細には、１０〜１２のＣＴＬエピトープミニ遺伝子の２対を連結して、２つの２０〜２４のＣＴＬエピトープミニ遺伝子を生成する。エピトープの連結によって、より小さなミニ遺伝子と比較して最適以下の（減少した）活性を生じる場合には、代替的な組み合わせ及び連結順序を研究する。次いで、最適の活性を生じる２０〜２４のＣＴＬエピトープミニ遺伝子の特定の対を連結し、そして結果として生じる、すべてのＣＴＬエピトープを含むミニ遺伝子を、活性について比較する。再度、２つの代替的配向を企図して研究する。この構築物の比較的大きなサイズが理由で、標的配列の特異的作用が確認される。なぜなら、リーダー配列標的は、小さなサイズのミニ遺伝子に対してより有効であるが、より大きなサイズの構築物は、ユビキチンシグナルによって最も効率的に標的化され得ることが可能であるからである。詳細には、いかなる特異的標的配列をも含まない特定の構築物を生成し、そしてユビキチン分子の添加によって分解について標的化される構築物と比較する。
同様のストラテジーを、ＨＴＬについて使用する。３〜５のＨＴＬエピトープミニ遺伝子の２つの対を連結して、２つの７〜９のＨＴＬエピトープミニ遺伝子を生成する。再度、これらのエピトープの連結が最適以下の（減少した）活性を生じる場合には、代替的な組み合わせ及び連結順序を研究する。最適の活性を生じる７〜９のＣＴＬエピトープミニ遺伝子の特定の対を連結し、そして結果として生じる、すべてのＨＴＬエピトープを含むミニ遺伝子を、活性について比較する。再度、２つの代替的配向を企図して研究する。
これらの結果に基づき、パネル（例えば、ＨＩＶエピトープ）を効率的に送達し得る最適化プラスミド立体配置を、臨床試験評価のために選択する。当然のことながら、目的（感染又は疾患関連）の任意の抗原由来のエピトープを、単独でか又は組み合わせにおいて使用し得る。この立体配置は、１以上のＨＴＬエピトープミニ遺伝子及び１以上のＣＴＬエピトープミニ遺伝子を伴う。すべてのエピトープを効率的に送達し得る、１つの長ＣＴＬミニ遺伝子及び１つの長ＨＴＬミニ遺伝子の組み合わせが最も好ましい。なぜなら、これは、ワクチンの臨床的開発をさらに単純化するからである。同時注射された場合に２つのミニ遺伝子間に所望されない相互作用が観察される場合、同一動物であるが異なる注射部位又は異なる時点での異なるプラスミドの注射を試験する。あるいは、すべての所望のエピトープをコードする単一のＣＴＬミニ遺伝子及びＨＴＬミニ遺伝子が同定されない場合、ミニ遺伝子のプールを、さらなる開発のために考慮する。
（実施例１３）
（多重エピトープワクチンでの免疫後に誘導されるＣＤ８＋リンパ球応答の評価及び特徴付け）
ＣＤ８＋リンパ球応答を、主にＥＬＩＳＰＯＴ技術により測定する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、当該分野において公知であり、そして本発明者らの研究室において通常使用されている。自動化されたＺｅｉｓｓ ＥＬＩＳＰＯＴリーダーもまた、本明細書中に示されるように使用する。ＣＤ８＋応答を測定するために利用されるアッセイは、主に、新たに単離された細胞及びインビトロでペプチドにより再刺激された細胞におけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。さらに、選択された場合には、クロム放出アッセイが利用され、これもまた再刺激された細胞を用い、そして結果を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの場合に観察された結果と関連付ける。選択されたペプチド／ＭＨＣの組み合わせにおける四量体染色もまた実施する。小見出し「臨床サンプルからの免疫応答の測定及び定量」のもとで、背景の節においてより詳細に考察されるように、ワクチンによって標的化される多数の潜在的なＨＬＡ／ペプチドの組み合わせが、一次臨床アッセイとしての四量体染色試薬の使用を非実用的にし得ることに留意すべきである。
臨床アッセイが開発され、そして確認される。この活性のタイミングは、臨床的ワクチンミニ遺伝子の選択後であり、かつ臨床試験において登録される個体由来の実際のサンプルが利用可能である前の期間と一致する。ＣＴＬ評価のためのアッセイは、当該分野での経験事項、例えば、実験ＨＢＶワクチンの第Ｉ相及び第ＩＩ相試験におけるＣＴＬ評価のためのアッセイを確立するにおける経験事項（Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１５９巻（３）：１３８３−９２（１９９７）；Ｈｅａｔｈｃｏｔｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ 第３０巻（２）：５３１−６（１９９９）；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ 第１６２巻（５）：３０８８−９５（１９９９）］）に基づいて確立し得る。詳細には、例えば、ＨＩＶ感染した、ワクチン接種されていないボランティア由来のＦｉｃｏｌｌ精製ＰＢＭＣと同様に、正常被験体由来のＦｉｃｏｌｌ精製ＰＢＭＣを使用し得る。先に記載したように、他の抗原性標的を、本発明に従って使用し得る。
利用されるエピトープは、Ａ２、Ａ３、及びＢ７インフルエンザ由来のスーパータイプエピトープ［Ｇｉａｎｆｒａｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）］、ならびにＥｎｎｉｓ及び共同研究者らによって記載されたエピトープ［Ｔａｍｕｒａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．第７２巻（１１）：９４０４−６（１９９８）］のセットである。これは、アッセイの確証を可能にし、そして処置される患者集団における基線応答レベルを規定する。
アッセイを確立した後、臨床サンプルを評価する。一般的なアッセイストラテジーは以下の通りである。凍結された材料として出荷されたＰＢＭＣアリコートを使用する。ＡＰＣについて、ペプチドでパルス（ｐｕｌｓｅ）された自己ＰＢＭＣを代表的に使用する。なぜなら、ポリエピトープ構築物において使用されるエピトープは、多様なＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の大きなコレクションによって拘束され、ＡＰＣとして分類されたＥＢＶ株及び標的の使用を非実用的にする。
非刺激及び刺激されたペプチドの両方の培養物を評価する。いくらかの応答が、刺激されていない培養物において検出され得るが、より弱い応答／エピトープは、１つ又は２つのインビトロ刺激を必要とし得る。アッセイ手順を、以下のように実施し得る。例えば、約５０個のクラスＩ拘束エピトープに対する応答がアッセイされる場合、約７個のペプチドの７個のプールが使用され得る。ペプチドのプールもまた、再刺激のために使用される。ＰＡＤＲＥエピトープに対する応答もまた測定する。ポジティブな結果を生じるペプチドプールの場合、個々のペプチドをアッセイして、観察された応答を担うエピトープを同定する。ポジティブコントロールとしては、破傷風トキソイド全体及び／又はマイトジェンＰＨＡ、ならびにインフルエンザウイルス由来エピトープのプールが挙げられる。潜在的連結エピトープもまた合成され、そして単一プールとして試験される。
次いで、少数の選択された応答物ペプチド及び個体の場合、四量体染色を、新鮮なサンプル又は再刺激されたサンプルのいずれかに対して実施し、そしてＥＬＩＳＰＯＴデータと関連付ける、共通の対立遺伝子（例えば、Ａ*０２０１、Ａ*０３０１、Ａ*１１０１、及びＡ*０７０２）に結合した選択されたペプチドについての四量体のみ生成されることに留意すべきである。これらの四量体が、同一ペプチドに対する応答についてポジティブであるが、所定のスーパータイプの他のメンバーによって拘束される細胞を染色する能力を試験する。これらの結果は、治療の診断用／代理マーカーとしてのこれらの試薬の広範な利用能を決定するにおいて興味深い。
これらの分析において必要とされる細胞の量に関して、標準的なアッセイは、例えば、７つのペプチド群、１つのネガティブコントロール及び２つのポジティブコントロール（合計１０群）を含み得る。各々２×１０5細胞／ウェルでの二連の試験について、これは、１０×２×２×１０5＝４×１０6細胞に対応する。解凍後の５０％の回収率の控えめな仮定は、約１０6個のＰＢＭＣ／ｍｌの血液の見積もりを与える。臨床被験体におけるＰＢＭＣ計数の大きなバリエーションは予期されない。なぜなら、すべての個体が健常なボランティア又はＨＩＶ感染患者の場合には、ＨＡＡＲＴ治療レシピエントのいずれかであるからである。結論として、４〜８ｍｌの血液に由来する１アリコートのＰＢＭＣが、通常、一回のアッセイに十分である。アッセイは、どのペプチドがポジティブであるかを決定することを可能にするため、及び／又は最大の感受性についてインビトロで再刺激されるのを可能にするため、あるいは両方のいずれかのために、通常、繰り返される必要がある。従って、合計３〜４アリコートが、合計約２０ｍｌの血液に対応して必要とされ得る。

Claims (12)

  1. 複数のＨＬＡエピトープを含み、ＨＬＡクラスＩプロセシング経路に提示されるポリエピトープ構築物を設計するための方法であって、
    （ｉ）前記複数のＨＬＡエピトープを、連結エピトープの数が最小になるようにソートし、ポリエピトープ構築物を作成する工程；
    （ii）Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｓ、ＣおよびＴからなる群から選択される隣接アミノ酸残基を、工程（i）で得られたポリエピトープ構築物に含まれるＨＬＡエピトープのＣ＋１位に導入する工程；
    （iii）工程（ii）で得られたポリエピトープ構築物に含まれる２つのエピトープの間に、ＣＴＬ連結エピトープまたはＨＴＬ連結エピトープの出現を妨げるように、１つ以上のスペーサーアミノ酸残基を導入する工程；および
    （iv）工程（iii）で得られたポリエピトープ構築物の中から、連結エピトープの数が最小であり、スペーサーアミノ酸残基の数が最小であり、各ＨＬＡエピトープのＣ＋１位に存在するＫ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、ＣまたはＴの数が最大である１つ以上のポリエピトープ構築物を選択する工程、を含み、
    前記スペーサーアミノ酸残基により形成されるスペーサーが、Ｇ、ＰおよびＮからなる群より独立して選択される少なくとも５アミノ酸残基を含む、方法。
  2. ＨＴＬエピトープの出現を妨げるように前記スペーサーアミノ酸残基を導入する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記スペーサーがＧＰＧＰＧである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記隣接アミノ酸残基が、ＣＴＬエピトープのＣ＋１位に導入される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記隣接アミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、ＧおよびＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記隣接アミノ酸残基が、前記スペーサーアミノ酸残基に隣接する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ポリエピトープ構築物に含まれるＨＬＡエピトープのＣ末端に隣接するＨＬＡエピトープのＮ末端残基を、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、およびＡからなる群から選択される残基で置換する工程をさらに包む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ポリエピトープ構築物の構造を予測する工程をさらに含むと共に、
    前記選択工程において１つ以上のポリエピトープ構築物を選択する際に、細胞に導入されてＨＬＡプロセシング経路によってプロセシングされた場合に、エピトープの全てがＨＬＡプロセシング経路によってプロセシングされるポリエピトープ構築物を選択する、請求項１に記載の方法。
  9. 請求項１〜８の何れか一項に記載の方法を用いて調製される、ポリエピトープ構築物。
  10. 前記ポリエピトープ構築物に含まれるエピトープが、ミニ遺伝子によってコードされる、請求項９に記載のポリエピトープ構築物。
  11. 複数のＨＬＡエピトープペプチドおよび複数のスペーサーアミノ酸残基を含む、ポリエピトープ構築物であって、ここで：
    ａ．該ＨＬＡエピトープペプチドが、８〜１３アミノ酸長のクラスＩ ＨＬＡエピトープペプチドであり；
    ｂ．該スペーサーアミノ酸残基の組み合わせが、１以上の該ＨＬＡエピトープペプチド間に配置され；
    ｃ．該スペーサーアミノ酸残基が、１〜８アミノ酸長であり；
    ｄ．１以上のスペーサーアミノ酸残基の組み合わせが、他のスペーサーアミノ酸残基の組み合わせに含まれるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み；そして
    ｅ．該スペーサーアミノ酸残基の組み合わせの各々が、エピトーププロセシングを最適化し、そして連結エピトープを最小化し、
    ｆ．前記アミノ酸スペーサー残基により形成されるスペーサーは、Ｇ、ＰおよびＮからなる群より独立して選択される、少なくとも５アミノ酸残基を含む、ポリエピトープ構築物。
  12. 前記複数のＨＬＡエピトープペプチドが、複数のＨＬＡエピトープ核酸によってコードされ、前記複数のスペーサーアミノ酸残基が、複数のスペーサー核酸によってコードされる、請求項１１に記載のポリエピトープ構築物。
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