CN112135908A - 选择性cd8阳性t细胞诱导疫苗抗原 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于选择性地诱导靶抗原特异性CD8阳性T细胞反应的多肽。通过疫苗进行的人免疫缺陷病毒(HIV)特异性CD4阳性T细胞反应的诱导存在促进HIV感染的可能性，因此，如果能够取得选择性地诱导HIV特异性CD8阳性T细胞反应的HIV疫苗抗原，则是有用的。因此，在本发明中，通过将靶抗原蛋白的氨基酸序列分割为8～12残基的氨基酸序列，并设计了将它们以变得与原始氨基酸序列不同的方式连接而成的多肽抗原。就使用了表达本抗原的DNA和病毒载体的疫苗而言，进行基于猴的接种试验的结果，表现出能够效率良好地选择性地诱导抗原特异性CD8阳性T细胞反应。可认为本抗原可用作具有极高选择性的CD8阳性T细胞诱导疫苗抗原。

Description

选择性CD8阳性T细胞诱导疫苗抗原
技术领域
本发明涉及：将抗原特异性CD4阳性T细胞反应抑制为低水平，同时选择性地诱导抗原特异性CD8阳性T细胞反应的多肽和其制备法；以及表达该多肽的疫苗等。本发明的疫苗特别是可用作抗HIV疫苗。
背景技术
推测世界上人免疫缺陷病毒(HIV)感染者数量超过3600万人，每年新增感染者数量约为180万人，HIV感染扩大是严重的问题。为了抑制HIV感染扩大，HIV疫苗开发是国际上的重要问题，但是仍未实现有效的疫苗的实用化。HIV感染，是通常无法自然治愈、表现出慢性持续感染并且导致AIDS(后天性免疫缺陷症候群)发作的致死性感染。虽然通过抗HIV药物治疗能够阻止AIDS发作，但是难以从体内清除病毒而无法治愈，因此感染者大致需要一生进行抗HIV药物治疗(非专利文献12)。近年，除了长期给药治疗下的副作用·出现耐药性病毒的问题之外，高额医疗费、慢性炎症所伴随的骨质疏松症·心血管疾病·脑认知疾病·肾脏疾病等的发展成为了大问题(非专利文献13-15)。然而，包括非洲在内的世界范围内，HIV感染者数量持续增大，为了抑制感染扩大，除了促进早期诊断·早期治疗之外，开发出有效的HIV疫苗是国际上最重要的问题之一。然而，仍未开发出有效性得到了确认的HIV疫苗。
认为在HIV复制抑制中起着重要作用的CD8阳性T细胞反应的诱导，是HIV疫苗开发中的重要战略之一(非专利文献1-4)。CD8阳性T细胞诱导HIV疫苗开发中，可认为抗原递送法的优化和抗原的优化是重要的。就递送法而言，已经开发出了：腺病毒载体(非专利文献7)、巨细胞病毒载体(非专利文献8)、腺病毒/痘病毒载体(非专利文献9)等多种具有效率良好的CD8阳性T细胞诱导能力的载体。
另一方面，就用于有效的CD8阳性T细胞诱导的抗原而言，可认为需要进一步进行优化。病毒抗原特异性CD8阳性T细胞，对在病毒感染细胞表面与主要组织相容性基因复合体(MHC)I类分子结合而呈递的病毒抗原来源的8～11mer肽片段(抗原决定簇)进行特异性识别，并伤害感染细胞(非专利文献16)。CD8阳性T细胞反应，已知其靶标依赖于宿主的MHCI类基因型，同时基于CD8阳性T细胞的病毒复制抑制能力(有效性)根据作为靶标的病毒抗原而有所不同(非专利文献17)。此外，有效性较低的CD8阳性T细胞反应占优势时，会抑制有效性高的CD8阳性T细胞反应的诱导(免疫优势)(非专利文献18)，因此需求用于选择性地诱导有效性高的CD8阳性T细胞反应的抗原设计。近年，通过HIV感染者和猴AIDS模型的解析，发现以Gag和Vif抗原作为靶标的CD8阳性T细胞反应具有强病毒复制抑制能力(非专利文献17-20)。此外，Gag capsid(CA)抗原在结构保守性高的方面也是有力的CD8阳性T细胞靶区域候选者(非专利文献21)。
以往的HIV疫苗方法中，不仅是HIV抗原特异性CD8阳性T细胞，也会同时诱导HIV抗原特异性CD4阳性T细胞。病毒抗原特异性CD4阳性T细胞，对在抗原呈递细胞表面与MHC II类分子结合而呈递的病毒抗原来源的肽片段(抗原决定簇)进行特异性地识别，发生抗原特异性反应。然而，HIV以HIV抗原特异性CD4阳性T细胞作为更优先性的靶标而增殖(非专利文献10)，因此，基于疫苗的HIV抗原特异性CD4阳性T细胞诱导存在导致促进HIV增殖的风险。实际，在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猴AIDS模型中的解析中，报告了基于疫苗的SIV抗原特异性CD4阳性T细胞诱导导致SIV曝露后急性期的SIV增殖促进的情况(非专利文献11)。因此，对于抗原优化，不仅是设计有效的CD8阳性T细胞的靶标，还需要开发出尽可能抑制HIV抗原特异性CD4阳性T细胞诱导，并且选择性地诱导有效的HIV抗原特异性CD8阳性T细胞的方法，但是基于这样的观点的抗原设计迄今仍未实现。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Koup RA.et al.,J Virol.68:4650-4655.1994.
非专利文献2：Matano T.et al.,J Virol.72:164-169.1998.
非专利文献3：Schmitz JE.et al.,Science.283:857-860.1999.
非专利文献4：Goulder PJ.et al.,Nat Rev Immunol.4:630-640.2004.
非专利文献5：Matano T.et al.,J Exp Med.199:1709-1718.2004.
非专利文献6：Nyombayire J.et al.,J Infect Dis.215:95-104.2017.
非专利文献7：Wilson NA.et al.,J Virol.80:5875-5885.2006.
非专利文献8：Hansen SG.et al.,Nature.473:523-527.2011.
非专利文献9：Barouch DH.et al.,Nature.482:89-93.2012.
非专利文献10：Douek DC.et al.,Nature.417:95-98.2002.
非专利文献11：Terahara K.et al.,J Virol.88:14232-14240.2014.
非专利文献12：Fischer M.et al.,AIDS.17:195-199.2003.
非专利文献13：Kirk GD.et al.,Clin Infect Dis.45:103-110.2007.
非专利文献14：Hsue PY.et al.Curr Opin HIV AIDS.12:534-539.2017.
非专利文献15：Khoury G.et al.,J Infect Dis.215:911-919.2017.
非专利文献16：Hewitt EW.et al.,Immunology.110:163-169.2003.
非专利文献17：Kiepiela P.et al.,Nat Med.13:46-53.2007.
非专利文献18：Akram A.et al.,Clin Immunol.143:99-115.2012.
非专利文献19：Mudd PA.et al.,Nature.491:129-133.2012.
非专利文献20：Iwamoto N.et al.,J Virol.88:425-433.2014.
非专利文献21：Goulder PJ.et al.Nat Rev Immunol.8:619-630.2008.
非专利文献22：Tsukamoto T.et al.,J Virol.83:9339-9346.2009.
非专利文献23：Ishii H.et al.,J Virol.86:738-745.2012.
非专利文献24：Letourneau S.et al.,PLoS One.2:e984.2007.
非专利文献25：Mothe B.et al.,J Transl Med.9:208.2011.
发明内容
发明所解决的技术问题
本发明的问题在于，提供抑制抗原特异性CD4阳性T细胞的诱导，同时选择性地诱导抗原特异性CD8阳性T细胞的多肽和搭载有该多肽的疫苗等。
解决问题的技术手段
如上所述，认为在HIV复制抑制中起着重要作用的CD8阳性T细胞反应的诱导，是HIV疫苗开发中的重要战略之一，CD8阳性T细胞诱导HIV疫苗开发中抗原的设计是重要的。
因此，本发明人为了抑制抗原特异性CD4阳性T细胞的诱导，并且选择性地诱导抗原特异性CD8阳性T细胞，而基于新的方法进行抗原设计。具体而言，首先将作为靶标的抗原蛋白的氨基酸序列分割多个部分氨基酸序列，并且使其成为至少具有MHC I类抗原决定簇的典型长度，并且不具有MHCII类抗原决定簇的典型长度的长度。并且将分割得到的部分氨基酸序列，以使得具有MHC II类抗原决定簇的典型长度的靶抗原蛋白的连续的部分氨基酸序列不再大量形成的方式进行顺序改变，设置重叠(Overlap)、间隔物等而进行连接，而形成包含靶抗原的MHC I类抗原决定簇并且不含靶抗原的MHC II类抗原决定簇的氨基酸序列。
具体而言，在实施例中，着眼于CD4阳性T细胞的最佳抗原决定簇为13-18mer肽而CD8阳性T细胞的最佳抗原决定簇为8-11mer肽这一点，为了选择性地诱导有效的HIV抗原特异性CD8阳性T细胞而设计了将HIV靶抗原来源11mer肽串联连接而成的新抗原。设计了将作为有效的CD8阳性T细胞的靶区域的病毒Gag CA和Vif的氨基酸序列片段化为11mer肽，改变这些肽群的顺序，将丙氨酸设为间隔物进行串联连接而成的抗原(TCT11)(图1)。以同样的步骤，设计了8种使靶抗原区域的肽起始氨基酸位置以1mer发生了偏移的串联连接抗原(A～H)。通过共8种抗原，涵盖了理论上可存在于靶区域的全部CD8阳性T细胞抗原决定簇。另一方面，这些抗原中，不含病毒来源的12mer以上的肽序列，因此理论上不存在病毒抗原特异性CD4阳性T细胞的最佳抗原决定簇，认为不会发生效率良好的CD4阳性T细胞诱导。
这样设计得到的串联连接抗原，在11mer这样的短范围中与靶抗原的氨基酸序列一致，但是整体的氨基酸序列与靶抗原的氨基酸序列完全不同。为了调查这样的连接抗原能否有效诱导针对靶抗原蛋白的特异性CD8阳性T细胞，而构建表达连接抗原的病毒载体并且对个体进行接种。其结果，确认了：在进行了接种的个体中，靶抗原特异性CD8阳性T细胞频率明显上升，另一方面，靶抗原特异性CD4阳性T细胞频率未变化(图2)。由此表明，通过将根据本发明而将抗原蛋白的氨基酸序列重排得到的多肽用作抗原，能够选择性地介由靶抗原的MHC I类抗原决定簇来诱导免疫反应。
使用本发明的方法时，不需要预先确定靶抗原的MHC I类抗原决定簇，通过将根据本发明的方法而将氨基酸序列重排而构建的多肽用作抗原并进行接种，能够避免介由靶抗原的MHC II类抗原决定簇的免疫反应的诱导，同时选择性地诱导介由靶抗原的MHC I类抗原决定簇的免疫反应。该方法具有极高的通用性，不限于HIV等感染性病毒，对于广泛的通常性靶标蛋白质，能够用于选择性地诱导靶抗原特异性CD8阳性T细胞的反应。
即，本发明涉及抑制抗原特异性CD4阳性T细胞的诱导，同时选择性地诱导抗原特异性CD8阳性T细胞的抗原和搭载有该抗原的疫苗等，更具体而言，涉及权利要求的各项所述的发明。需要说明的是，引用相同的权利要求的权利要求所述的发明的两个以上的任意组合而构成的发明，也是本说明书中意指的发明。即本发明涉及以下的发明。
[1]、一种多肽，其包含相互连接的多种肽，所述多种肽具有抗原蛋白的氨基酸序列中包含的8～12残基的氨基酸序列。
[2]、根据[1]所述的多肽，其中，所述8～12残基肽以与所述抗原蛋白中的顺序不同的顺序进行连接。
[3]、根据[1]或[2]所述的多肽，其实际上不包含所述抗原蛋白的13残基以上的连续的部分氨基酸序列。
[4]、根据[1]～[3]中任一项所述的多肽，其中，所述多种肽的氨基酸序列可以重叠。
[5]、根据[4]所述的多肽，其中，所述重叠为1～4残基。
[6]、根据[1]～[5]中任一项所述的多肽，其中，所述连接部可以分别具有间隔物。
[7]、根据[6]所述的多肽，其中，所述间隔物为1～4残基的氨基酸。
[8]、根据[1]～[7]中任一项所述的多肽，其至少包含20种相互连接的所述8～12残基肽。
[9]、一种核酸，其编码[1]～[8]中任一项所述的多肽。
[10]、一种载体，其包含[9]所述的核酸。
[11]、根据[10]所述的载体，其为仙台病毒载体。
[12]、一种疫苗，其包含：[1]～[8]中任一项所述的多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[13]、根据[12]所述的疫苗，其中，抗原蛋白源自人免疫缺陷病毒的抗原蛋白。
[14]、一种方法，其中，通过接种[12]或[13]所述的疫苗的工序来选择性地诱导靶抗原特异性CD8阳性T细胞。
[15]、一种方法，其为[1]所述的多肽或编码该多肽的核酸的制造方法，所述方法包含：
(i)将编码抗原蛋白的氨基酸序列分割为8～12残基的氨基酸序列的工序，其中，该分割氨基酸序列可以相互重叠或不重叠；
(ii)将该分割氨基酸序列以使其与该抗原蛋白的该氨基酸序列不同的方式进行连接的工序，其中，该分割氨基酸序列的各连接部中可以夹持或不夹持间隔物；
(iii)分别取得包含由工序(ii)得到的氨基酸序列的多肽或编码该多肽的核酸的工序。
此外，本发明也包含以下的发明。
[16]、根据[1]～[8]中任一项所述的多肽，其中，所述多种肽介由间隔物而进行了连接。
[17]、根据[1]～[8]和[16]中任一项所述的多肽，其中，连接有10种以上所述8～12残基的氨基酸序列。
[18]、根据[17]所述的多肽，其中，连接有20种以上所述8～12残基的氨基酸序列。
[19]、根据[17]所述的多肽，其中，连接有30种以上所述8～12残基的氨基酸序列。
[20]、根据[1]～[8]和[16]～[19]中任一项所述的多肽，其中，所述8～12残基以下的氨基酸序列为8～11残基的氨基酸序列。
[21]、根据[1]～[8]和[16]～[20]中任一项所述的多肽，其中，所述抗原蛋白的13残基以上的连续的部分氨基酸序列的总残基数为所述连接得到的氨基酸序列的总残基数的20％以下。
[22]、根据[21]所述的多肽，其中，所述抗原蛋白的13残基以上的连续的部分氨基酸序列的总残基数为所述连接得到的氨基酸序列的总残基数的10％以下或5％以下。
此外，本发明也包含以下的发明。
[23]、根据[1]～[8]中任一项所述的多肽，其包含从抗原蛋白的氨基酸序列中选择多种12残基以下的氨基酸序列并将它们连接而得到的氨基酸序列。
[24]、根据[23]所述的多肽，其中，以与所述抗原蛋白的该氨基酸序列不同的方式进行了连接。
[25]、根据[23]或[24]所述的多肽，其中，以实际上不产生13残基以上的该抗原蛋白的连续氨基酸序列的方式进行了连接。
[26]、根据[23]或[24]所述的多肽，其中，以使得产生13残基以上的该抗原蛋白的连续氨基酸序列的连接为连接总数的20％以下、10％以下或5％以下的方式进行了连接。
[27]、根据[26]所述的多肽，其中，从抗原蛋白的氨基酸序列中选择多种11残基以下的氨基酸序列并进行了连接，以使得产生12残基以上的该抗原蛋白的连续氨基酸序列的连接实际上不发生、或者使其为连接总数的20％以下、10％以下或5％以下。
[28]、根据[23]～[27]中任一项所述的多肽，其中，介由间隔物而进行了连接。
[29]、根据[28]所述的多肽，其中，间隔物为1～4残基的氨基酸。
[30]、根据[20]～[29]中任一项所述的多肽，其中，所述分割氨基酸序列相互重叠。
[31]、根据[30]所述的多肽，其中，重叠了1～4残基。
[32]、根据[23]～[31]中任一项所述的多肽，其中，连接有10种以上的分割氨基酸序列。
[33]、根据[32]所述的多肽，其中，连接有20种以上的分割氨基酸序列。
[34]、根据[32]所述的多肽，其中，连接有30种以上的分割氨基酸序列。
[35]、根据[23]～[34]中任一项所述的多肽，其中，将抗原蛋白的氨基酸序列分割为5～12残基的氨基酸序列。
[36]、根据[23]～[34]中任一项所述的多肽，其中，将抗原蛋白的氨基酸序列分割为8～12残基的氨基酸序列。
[37]、根据[23]～[34]中任一项所述的多肽，其中，将抗原蛋白的氨基酸序列分割为8～11残基的氨基酸序列。
此外，本发明也包含以下的发明。
[38]、一种核酸，其编码[16]～[37]中任一项所述的多肽。
[39]、一种载体，其包含[38]所述的核酸。
[40]、根据[39]所述的载体，其为仙台病毒载体。
[41]、一种疫苗，其包含：[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[42]、根据[41]所述的疫苗，其中，抗原蛋白源自人免疫缺陷病毒的抗原蛋白。
[43]、一种方法，其通过接种[41]或[42]所述的疫苗的工序，选择性地诱导靶抗原特异性CD8阳性T细胞。
此外，本发明也包含以下的发明。
[44]、一种使用，其为[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体用于选择性地诱导靶抗原特异性CD8阳性T细胞的使用。
[45]、一种使用，其为[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的用于制造用于选择性地诱导靶抗原特异性CD8阳性T细胞的药物或药剂的使用。
此外，本发明也包含以下的发明。
[46]、一种疫苗接种方法，其包含：接种[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的工序。
[47]、根据[46]所述的方法，其中，分别将作为[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的多种多肽、核酸或载体进行给药。
[48]、根据[46]或[47]所述的方法，其包含：进一步接种不是[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽的其他多肽、编码所述其他多肽的核酸或包含该核酸的载体的工序。
[49]、根据[48]所述的方法，其中，预先接种不是[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽的其他多肽、编码所述其他多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[50]、根据[48]或[49]所述的方法，其中，所述其他多肽为所述抗原蛋白或其部分肽。
[51]、根据[48]～[50]中任一项所述的方法，其中，包含编码所述其他多肽的核酸的载体为DNA载体。
[52]、一种使用，其为[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的用于疫苗接种的使用。
[53]、根据[52]所述的使用，其用于分别将作为[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的多种多肽、核酸或载体进行给药。
[54]、根据[52]或[53]所述的使用，其中，进一步接种不是[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽的其他多肽、编码所述其他多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[55]、根据[54]所述的使用，其中，预先接种不是[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽的其他多肽、编码所述其他多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[56]、根据[54]或[55]所述的使用，其中，所述其他多肽为所述抗原蛋白或其部分肽。
[57]、根据[54]～[56]中任一项所述的使用，其中，包含编码所述其他多肽的核酸的载体为DNA载体。
[58]、一种使用，其为[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的用于制造疫苗接种的药物或药剂的使用。
[59]、根据[58]所述的使用，其用于分别将作为[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的多种多肽、核酸或载体进行给药。
[60]、根据[58]或[59]所述的使用，其中，进一步接种不是[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽的其他多肽、编码所述其他多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[61]、根据[60]所述的使用，其中，预先接种不是[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽的其他多肽、编码所述其他多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[62]、根据[60]或[61]所述的使用，其中，所述其他多肽为所述抗原蛋白或其部分肽。
[63]、根据[60]～[62]中任一项所述的使用，其中，包含编码所述其他多肽的核酸的载体为DNA载体。
[64]、一种使用，其为用于疫苗接种的[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的使用。
[65]、根据[64]所述的使用，其用于分别将作为[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽、编码所述多肽的核酸或包含该核酸的载体的多种多肽、核酸或载体进行给药。
[66]、根据[64]或[65]所述的使用，其中，进一步接种不是[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽的其他多肽、编码所述其他多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[67]、根据[66]所述的使用，其中，预先接种不是[1]～[8]和[16]～[37]中任一项所述的多肽的其他多肽、编码所述其他多肽的核酸或包含该核酸的载体。
[68]、根据[66]或[67]所述的使用，其中，所述其他多肽为所述抗原蛋白或其部分肽。
[69]、根据[66]～[68]中任一项所述的使用，其中，包含编码所述其他多肽的核酸的载体为DNA载体。
需要说明的是，本说明书记载的任意技术事项和其任意组合均包含在本说明书主旨中。此外，这些发明中，在本说明书所述的任意事项或其任意组合之外的发明也包含在本说明书主旨中。此外，就本发明而言，说明书中记载的特定实施方式，不仅公开了该方式，也公开了包含该方式的更上位概念的本说明书中公开的发明中除该方式之外的发明。
发明效果
如上所述，本发明可用于针对期望的抗原而选择性地诱导CD8阳性T细胞。例如在AIDS疫苗中，能够尽可能地抑制HIV抗原特异性CD4阳性T细胞诱导，并且选择性地诱导有效的HIV抗原特异性CD8阳性T细胞。
附图说明
[图1]表示靶标11mer连接抗原TCT11的概要的图。
[图2]表示SIV复制控制猴慢性期中的SCaV11抗原表达疫苗接种试验的图。
[图3]表示SCaV11抗原表达疫苗对非感染猴的接种试验的图。
[图4]与图3同样，表示疫苗接种后的抗原特异性T细胞反应的图。
[图5]表示疫苗接种后的淋巴结中的抗原特异性T细胞反应的图。
具体实施方式
以下，对于本发明的实施方式详细地进行说明。
本发明中“疫苗”是指，用于引发针对抗原的免疫反应的组合物，例如是指用于予防或治疗传染病、感染等的组合物。疫苗包含抗原或可表达抗原，由此能够诱导针对抗原的免疫应答。为了予防或治疗病原微生物的感染、传播和流行，本发明的多肽、表达所述多肽的核酸和载体可用作疫苗。该疫苗可用于期望的方式中。
“抗原”通常是指，作为包含1种以上的抗原决定簇(抗体或免疫细胞识别的抗原的一部分)的分子并且可刺激宿主的免疫系统而诱导抗原特异性的免疫应答的物质。免疫应答可以为体液性免疫应答和/或细胞性免疫应答。需要说明的是，本发明中抗原决定簇不限于一次结构形成的抗原决定簇，也包含依赖于蛋白质的立体结构的抗原决定簇。此外，抗原也称为免疫原。
本发明中“病毒载体”是具有源自所述病毒的基因组核酸，通过将导入基因组入所述核酸中，在导入细胞后，能够表达所述基因的载体。例如副粘病毒载体是染色体非导入型病毒载体，载体在细胞质中表达，因此不存在导入基因组入宿主的染色体(源自核的染色体)的风险。因此，安全性高，并且可从感染细胞除去载体。本发明中副粘病毒载体，除了感染性病毒粒子之外，还包括：作为包含病毒核心、病毒基因组和病毒蛋白质的复合体或非感染性病毒粒子等的复合体的、具有通过导入细胞而表达搭载的基因的能力的复合体。例如副粘病毒中，包含副粘病毒基因组和与其结合的副粘病毒蛋白质(NP、P和L蛋白质)的核糖核蛋白(病毒的芯部分)能够通过导入细胞而在细胞内表达导入基因(WO00/70055)。对于细胞的导入，可使用适宜转染试剂等。这样的核糖核蛋白(RNP)也包含在本发明的副粘病毒载体中。本发明中副粘病毒载体优选为所述的RNP被细胞膜来源的生物膜包裹而成的粒子。
本发明提供：抑制针对作为靶标的抗原蛋白的特异性CD4阳性T细胞的诱导，并且可用于选择性地诱导特异性CD8阳性T细胞的多肽。该多肽是包含下述序列的多肽：至少具有MHC I类抗原决定簇的典型长度并且不具有MHC II类抗原决定簇的典型长度的、从抗原蛋白的氨基酸序列切得的多个部分氨基酸序列以与抗原蛋白的原始氨基酸序列(即抗原蛋白的氨基酸序列)不同的方式连接而成的氨基酸序列。此处，MHC I类或II类抗原决定簇的典型长度是指，各个抗原决定簇必要长度的典型。MHC I类抗原决定簇通常为5～12残基左右。用于CD8阳性T细胞诱导的最佳MHC I类抗原决定簇为8～11残基肽。另一方面，可认为用于CD4阳性T细胞诱导的最佳MHC II类抗原决定簇为13～18残基肽。本发明中，MHC I类抗原决定簇的典型长度，例如为5～12氨基酸，优选为6～12氨基酸，更优选为7～12氨基酸，更优选为8～11氨基酸，例如为7、8、9、10或11氨基酸。本发明中MHC II类抗原决定簇的典型长度，例如为15氨基酸以上，优选为14～25氨基酸以上，更优选为13～18氨基酸，例如为22、20，18、15或13氨基酸。
本发明的多肽，例如可通过以下的顺序进行制造。
(i)将编码期望的靶抗原蛋白的氨基酸序列以至少具有MHC I类抗原决定簇的典型长度并且不具有MHC II类抗原决定簇的典型长度的方式进行分割的工序，其中，所述分割氨基酸序列可以相互重叠或不重叠；
(ii)将该分割氨基酸序列以与所述抗原蛋白的该氨基酸序列(即原始氨基酸序列)不同的方式进行连接的工序，其中，所述分割氨基酸序列的各连接部中可以夹持或不夹持间隔物；
(iii)取得包含由工序(ii)得到的氨基酸序列的多肽的工序。
此外，编码本发明的多肽的核酸，例如可通过以下的顺序进行制造。
(i)将编码期望的靶抗原蛋白的氨基酸序列以至少具有MHC I类抗原决定簇的典型长度并且不具有MHC II类抗原决定簇的典型长度的方式进行分割的工序，其中，所述分割氨基酸序列可以相互重叠或不重叠。
(ii)将该分割氨基酸序列以与所述抗原蛋白的该氨基酸序列(即原始氨基酸序列)不同的方式进行连接的工序，其中，所述分割氨基酸序列的各连接部中可以夹持或不夹持间隔物；
(iii)取得编码多肽的核酸的工序，其中，所述多肽包含由工序(ii)得到的氨基酸序列。
此处，“至少具有MHC I类抗原决定簇的典型长度并且不具有MHC II类抗原决定簇的典型长度”，例如为5～14氨基酸，优选为5～13氨基酸，更优选为5～12氨基酸，更优选为8～12氨基酸，更优选为8～11氨基酸。
作为靶标的抗原蛋白没有特别限定，可使用期望的蛋白质。抗原蛋白可以是天然的蛋白质或人工的蛋白质，但是优选为天然的蛋白质。此外，可以将全长蛋白质用作抗原蛋白，也可以将其部分蛋白质用作抗原蛋白。此外，也可以将多个蛋白质结合而成的融合蛋白质用作抗原蛋白。作为本发明中使用的抗原蛋白，优选为与疾病关连的蛋白质。特别是，针对所述抗原蛋白的细胞性免疫性诱导优选与疾病的予防和/或治疗相关。典型地，作为靶标的抗原蛋白，可举出：期望的病原体、病原性微生物或寄生生物等的蛋白质或其片段、癌抗原(肿瘤特异性蛋白质)、癌症干细胞抗原或它们的片段等。作为肿瘤抗原的实例，例如可举出：WT1、存活蛋白、存活蛋白-B2、MAGE-A3、MEGE-A4、酪氨酸酶、gp100、Melan-A、TRP-2、SNRPD1、CDK4、NY-ESO-1、HER2、MUC-1、CD20、p53等。作为癌症干细胞抗原，可举出：CD44、CD133、LGR5、Dclk1等。作为病毒抗原，可举出：肝炎病毒(HBV、HCV等)、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒、成人T细胞白血病病毒等病毒的组成蛋白。作为寄生虫抗原，可举出疟疾原虫蛋白质等。
作为抗原蛋白，特别是可举出源自感染性微生物的蛋白质，其中可举出病原性病毒、特别是CD4阳性T细胞感染性病毒。作为这样的病毒，可举出：作为后天性免疫缺陷症候群(AIDS)的病原性病毒的人免疫缺陷病毒(HIV)和作为成人T细胞白血病(ATL)的病原性病毒的人T细胞白血病病毒(HTLV-1)。作为本发明的抗原蛋白，可适宜使用所述病毒的蛋白质、其片段。
此外，本发明涉及连接有具有期望的抗原蛋白的氨基酸序列中包含的12残基以下的氨基酸序列的多种肽的多肽。此处“12残基以下”，只要具有可成为MHC I类抗原决定簇的长度，下限值就没有特别限定，例如为5～12氨基酸，优选为6～12氨基酸，更优选为7～12氨基酸，更优选为8～12氨基酸、9～12氨基酸、10～12氨基酸或10～11氨基酸。此外，就“多种”而言，只要预期包含实际成为MHC I类抗原决定簇的肽，就可以为任意的复数，例如为10种以上，优选为15种以上，更优选为20种以上，例如30种以上、40种以上或50种以上。
具体而言，本发明的多肽可以为，包含以成为具有期望的抗原蛋白的氨基酸序列的连续的至少5氨基酸(优选为6、7、8、9、10或11氨基酸)并且不具有15氨基酸(优选为14、13或12氨基酸)的长度的方式切得的多个部分氨基酸序列(也称为分割氨基酸序列)以与所述抗原蛋白的原始氨基酸序列不同的方式连接而成的氨基酸序列的多肽。更具体而言，本发明的多肽可以为，包含以成为具有期望的抗原蛋白的氨基酸序列的至少8氨基酸(更优选为至少9、10或11氨基酸)并且不具有13氨基酸(更优选为12氨基酸)的长度的方式切得的多个部分氨基酸序列以与所述抗原蛋白的原始氨基酸序列不同的方式连接而成的氨基酸序列的多肽。
此处，与所述抗原蛋白的原始氨基酸序列相同是指，连接并最终生成得到的氨基酸序列与抗原蛋白的氨基酸序列(分割前的抗原蛋白的氨基酸序列)相同。为了避免与原始氨基酸序列相同，例如可以改变连接的顺序，例如可以跳跃地、随机地或顺序不同地进行结合。或，结合时夹入包含1个或多个氨基酸的间隔物时，即使按照顺序进行连接而能够避免与原始氨基酸序列相同。或，分割抗原蛋白的氨基酸时，以重复数残基的方式进行分割时，其连接而成的氨基酸序列与原始抗原蛋白的氨基酸序列不同。
从抗原蛋白的氨基酸序列切出部分氨基酸序列的方法没有特别限定，可以使得全部的片段具有相同长度(例如统一为8、9、10、11、12氨基酸中任一者的长度)的方式进行剪切，也可以根据片段而以不同长度(例如根据片段而为8、9、10、11、12氨基酸中任一者)的方式进行剪切，典型地以前者的方式进行剪切。
例如，将举例说明如下分割抗原蛋白的氨基酸序列的情况。
YPVQQIGGNYVHLPLSPRTLNAWVKLIEEKKFGAEVVPGFQALSEGCTPYDINQMLNCVG...(SEQID NO.1)
将所述序列例如分割为11残基的氨基酸序列的情况下，例如可以下述方式进行分割。
[例1]
YPVQQIGGNYV(SEQ ID NO.2)
HLPLSPRTLNA(SEQ ID NO.3)
WVKLIEEKKFG(SEQ ID NO.4)
AEVVPGFQALS(SEQ ID NO.5)
EGCTPYDINQM(SEQ ID NO.6)
.....
与上述方式进行分割时，除去最后剩余的不足11残基的余部(如果发生这种情况)，能够将抗原蛋白的氨基酸序列的全部序列(即100％)依次分割为11残基的氨基酸序列。本发明中，将其称为抗原蛋白的氨基酸序列的覆盖率，所述的实例中大致为100％。本发明的多肽中包含的连接氨基酸序列中，抗原蛋白的氨基酸序列的覆盖率例如为50％以上，优选为55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或100％。
将这些分割氨基酸序列(上述实例的情况下为SEQ ID NO.2～6)进行连接的情况下，按照顺序进行连接时会恢复为原始抗原蛋白的氨基酸序列(即与原始氨基酸序列相同)。为了避免这样的情况，可以适宜变更连接顺序，例如以SEQ ID NO.2、4、3、5，···的方式进行连接时，能够避免与原始氨基酸序列相同。这样的连接方式没有特别限定，可以规律地跳跃式进行连接，也可以随机地进行连接。在随机地进行连接的情况下，概率上，原本相邻的片段可能以相同的方式相邻连接。虽然在一定程度上允许这样的连接发生，但是优选以尽可能不发生这样的情况的方式进行连接。例如本发明的多肽中包含的连接氨基酸序列中，原本相邻的片段以相同的方式相邻连接而使得连接得到的部分的氨基酸序列与原始抗原蛋白的氨基酸序列相同的连接，在连接氨基酸序列中包含的总连接数中例如为10％以下，优选为8％以下，更优选为5％以下，更优选为3％以下，更优选为1％以下。不用说，最优选不含这样的连接。
例如，连接并生成得到的连接氨基酸序列，优选实际上不含原始抗原蛋白的氨基酸序列的长于15氨基酸(优选至少长于14、13、12或11氨基酸)连续的部分氨基酸序列。“实际不含”是指，不含所述长度的连续的部分氨基酸序列、或该长度的连续的部分氨基酸序列的总残基数相比于所述连接氨基酸序列的总残基数而充分小。充分小是指，例如，所述长度的连续的部分氨基酸序列的总残基数优选为所述连接氨基酸序列的总残基数的30％以下，更优选为25％以下，更优选为20％以下，更优选为15％以下，更优选为10％以下，更优选为5％以下。例如连接氨基酸序列不含长于原始抗原蛋白的12氨基酸(优选长于11氨基酸)连续的部分氨基酸序列、或者这样的部分氨基酸序列的总残基数为所述连接氨基酸序列的总残基数的10％以下(更优选为5％以下)。
此外，连接分割氨基酸序列时可以夹入间隔物。间隔物可以为1个或多个氨基酸残基，优选为1～数个，例如可以为1、2、3或4残基的期望的氨基酸。作为间隔物的氨基酸没有特别限定，可使用例如丙氨酸(A)。例如，通过将上述分割氨基酸序列(SEQ ID NO.2～6)介由间隔物而连接，即使按照顺序进行连接时，也能够避免恢复为原始抗原蛋白的氨基酸序列(即与原始氨基酸序列相同)。不用说，跳跃或随机地连接时也可以适宜插入间隔物。
需要说明的是，抗原蛋白的氨基酸序列的分割方式不限于上述例举的方式，例如也可以将8～12残基的氨基酸序列从抗原蛋白的氨基酸序列中的任意的位置切出。例如将上述抗原蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)在保留3残基的间隙的同时分割为11残基的氨基酸序列的情况下，可以下述方式进行分割。
[例2]
YPVQQIGGNYV(SEQ ID NO.2)
LSPRTLNAWVK(SEQ ID NO.7)
EKKFGAEVVPG(SEQ ID NO.8)
LSEGCTPYDIN(SEQ ID NO.9)
.....
所述情况下的抗原蛋白的氨基酸序列的覆盖率，除去最后剩余的不足11残基的余部之外，为11/14、即78.6％。这些分割氨基酸序列可以以期望的顺序连接。例如也可以与原始顺序相同顺序，跳跃或随机地连接。连接部分中可以夹入或不夹入适宜间隔物。
此外，将抗原蛋白的氨基酸序列分割得到的序列也可以相互重叠。例如将上述抗原蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)分割为11残基的氨基酸序列时，以相互重叠3残基的方式分割时为如下所述。
[例3]
YPVQQIGGNYV(SEQ ID NO.2)
NYVHLPLSPRT(SEQ ID NO.10)
PRTLNAWVKLI(SEQ ID NO.11)
KLIEEKKFGAE(SEQ ID NO.12)
GAEVVPGFQAL(SEQ ID NO.13)
QALSEGCTPYD(SEQ ID NO.14)
PYDINQMLNCV(SEQ ID NO.15)
.....
以上述方式进行重叠时，更多种具有可成为MHC I类抗原决定簇的长度的分割氨基酸序列组入连接氨基酸序列中，故为有利的。例如将抗原蛋白的氨基酸序列如“例1”那样，在不设置间隙、重叠的情况下依次分割为11氨基酸，并制备它们连接而成的多肽的情况下，分割的方式中存在11种构架。具体而言，上述“例1”所示的是将抗原蛋白的氨基酸序列从第1个氨基酸依次分割为11氨基酸的情况，除此之外，构架的方式中还包括：从第2个氨基酸依次分割为11氨基酸的情况、从第3个氨基酸依次分割为11氨基酸的情况、···、从第11个氨基酸依次分割为11氨基酸的情况。因此，为了使分割为11氨基酸而得到的分割氨基酸序列包含全部的构架，11种连接氨基酸序列是必要的。然而，在如“例3”所示制备以重叠3残基的方式分割得到的分割氨基酸连接而成的连接氨基酸序列的情况下，为了使分割为11氨基酸而成的分割氨基酸序列包含全部的构架，8种连接氨基酸序列就足够了(参照实施例)。因此，通过在分割氨基酸序列中设置重叠，能够以更少种类的连接氨基酸序列，包含抗原蛋白的氨基酸序列中理论上存在的全部种类的分割氨基酸配(即可成为MHC I类抗原决定簇的序列)。
在设置重叠的情况下，该重叠的长度没有特别限定。但是，将连接多肽表达为重组蛋白质时等，为了避免同源重组导致的不希望的序列的缺失、重复等，优选重复的区域不要过长。分割氨基酸彼此重复的长度，例如为1～数残基，具体而言，例如为1～6氨基酸，更优选为1～5氨基酸，更优选为1～4氨基酸，更优选为1～3氨基酸，更优选为1～2氨基酸。
需要说明的是，所述示例中，将抗原蛋白的氨基酸序列依次分割为固定数目的氨基酸(上述实例中为11氨基酸)，但是不必为固定数目。例如下述的实例中，将SEQ ID NO.1表示的抗原蛋白的氨基酸序列按照顺序以成为11氨基酸、8氨基酸、10氨基酸、9氨基酸、11氨基酸的方式进行分割，表示了各分割氨基酸序列可以具有或不具有间隙并且可以具有或不具有重叠的情况。连接这些分割氨基酸序列的情况也包含在本发明中。
[例4]
YPVQQIGGNYV(SEQ ID NO.2)
NYVHLPLS(SEQ ID NO.16)
SPRTLNAWVK(SEQ ID NO.17)
EEKKFGAEV(SEQ ID NO.18)
EVVPGFQALSE(SEQ ID NO.19)
.....
典型性地，抗原蛋白的氨基酸序列以选自8～12氨基酸中的任一固定数目进行分割(例如选择11氨基酸时，全部的分割以11氨基酸进行分割)。此外，对于分割时的氨基酸序列的重叠，也以固定数目设置重叠(例如，选择3氨基酸的重叠时，全部的分割氨基酸序列中以使两端分别重叠3氨基酸的方式进行分割。此外，不设置重叠时，全部的分割中不设置重叠)。
连接的分割氨基酸序列的数量也可能取决于抗原蛋白的长度。连接的分割氨基酸序列的数量没有特别限定，通过将尽可能多种类的分割氨基酸序列进行连接，可期待提高包含抗原蛋白的特异性MHC I类抗原决定簇的序列的概率、其种类数。连接的分割氨基酸序列的数量，例如为10种以上，优选为15种以上、20种以上、25种以上、30种以上、35种以上、40种以上、45种以上、50种以上或55种以上。这样连接得到的氨基酸序列中的抗原蛋白的氨基酸序列的覆盖率如上所述，优选较高，优选在分割时尽可能不设置间隙。例如，将抗原蛋白的氨基酸序列依次分割为11氨基酸，并且设为相互分别重叠3残基的情况下，为了确保10种分割氨基酸序列所必要的抗原蛋白的长度为83氨基酸，为了确保20种所必要的抗原蛋白的长度为163氨基酸。因此，原本的抗原蛋白的长度，例如为80氨基酸以上，优选为85氨基酸以上，优选为100氨基酸以上，更优选为150氨基酸以上、200氨基酸以上、250氨基酸以上、300氨基酸以上或350氨基酸以上，更优选为400氨基酸以上。此外，连接多肽(连接而成的氨基酸序列)的长度，例如为100氨基酸以上，优选为120氨基酸以上，优选为150氨基酸以上，更优选为200氨基酸以上、250氨基酸以上、300氨基酸以上、350氨基酸以上或400氨基酸以上，更优选为500氨基酸以上。
包含连接氨基酸序列的多肽，包含作为靶标的抗原蛋白的潜在性MHC I类抗原决定簇，可期待不包含抗原蛋白的潜在性MHC II类抗原决定簇。通过将该多肽作为抗原进行接种，可期待几乎不诱导介由MHC II类的针对靶抗原蛋白的免疫应答。实际上，如图3和4的图表所示，在仅将HIV的Gag蛋白质、Vif/Nef蛋白质作为抗原进行接种的情况下，靶抗原特异性CD4阳性T细胞的频率显著上升，与之相对，在将本发明的多肽作为抗原进行接种的情况下，靶抗原特异性CD4阳性T细胞的频率几乎没有上升。并且表明，通过将本发明的多肽作为抗原进行接种，使靶抗原特异性CD8阳性T细胞的频率显著上升。因此，本发明的多肽可用于选择性地诱导针对靶抗原蛋白的介由MHC I类的免疫反应。
针对靶抗原蛋白的MHC I类和MHC II类的免疫应答，可通过公知的方法进行测定。例如将本发明的多肽或编码其的核酸或载体进行接种，从血液回收外周血单个核细胞(PBMC)。对得到的细胞施加抗原刺激，检测IFN-γ产生细胞，来测定靶抗原特异性T细胞频率。
在将本发明的多肽用作抗原的情况下，选择性地提高靶抗原蛋白特异性CD8阳性T细胞频率。选择性是指，相比于靶抗原蛋白特异性CD4阳性T细胞频率的上升，靶抗原蛋白特异性CD8阳性T细胞频率的上升显著较高。基于本发明的多肽的“靶抗原蛋白特异性CD8阳性T细胞频率的上升倍率/靶抗原蛋白特异性CD4阳性T细胞频率的上升倍率”(CD8 T频率上升倍率/CD4T频率上升倍率)，例如为1.1以上，优选为1.2以上、1.3以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上、10以上、15以上、20以上或30以上。此外，基于本发明的多肽的“CD8 T频率上升倍率/CD4 T频率上升倍率”的值，与将原始靶抗原蛋白用作抗原的情况相比，例如为1.1以上，优选为1.2以上、1.3以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上、10以上、15以上、20以上或30以上。
所述的细胞频率的测定，可在接种起5日后的适当时机进行，例如在接种起1周、2周、3周或4周后进行。在多次进行接种的情况下，可以适当时机进行测定，例如可在最终接种起1周后采取血液并测定。
此外，在接种本发明的多肽的情况下，在接种起5日后的任一时机，“靶抗原蛋白特异性CD8阳性T细胞频率/靶抗原蛋白特异性CD4阳性T细胞频率”(CD8 T频率/CD4 T频率)的值，例如为1.1以上，优选为1.2以上、1.3以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上、10以上、15以上、20以上或30以上。此外，基于本发明的多肽的“CD8 T频率/CD4 T频率”的值，与将原始靶抗原蛋白用作抗原的情况相比，例如为1.1以上，优选为1.2以上、1.3以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上、10以上、15以上、20以上或30以上。
包含连接氨基酸序列的多肽中，可适宜包含其他氨基酸序列。例如可在多肽的前端添加甲硫氨酸(M)，在甲硫氨酸和连接氨基酸序列之间可包含间隔物氨基酸。在使用丙氨酸(A)作为间隔物氨基酸的情况下，所述多肽的前端(N末端)可设为MA(Met-Ala)。此外，在该多肽的C末端可添加适宜标签、间隔物等。例如在实验用途中，C末端可添加H-2K d RT2抗原决定簇(VYYDPSKDLI/SEQ ID NO.20)等期望的序列。进行添加时，可适宜夹入间隔物氨基酸，此外，在C末端可进一步添加间隔物氨基酸(例如Ala)。
此外，本发明的多肽可包含由多个抗原蛋白的氨基酸序列制成的连接氨基酸序列。例如，可将对于某病原体的两个蛋白质分别制成的连接氨基酸序列连接而制成一个多肽。例如，在实施例中，将由HIV的Gag蛋白质的氨基酸序列制成的连接氨基酸序列与由Vif蛋白质的氨基酸序列制成的连接氨基酸序列相连而制备一个多肽。这样，本发明的多肽可包含由多个抗原蛋白制成的连接氨基酸序列。
此外，在将本发明的多肽作为抗原进行接种的情况下，可组合使用多个本发明的多肽。此处“组合使用”不限于同时使用，可用于一系列的使用中、连续的使用或顺序的使用中。如上所述，在将抗原蛋白的氨基酸序列例如依次分割为11氨基酸的情况下，分割构架的方式存在11种。因此，包含全部可成为作为靶标的抗原蛋白的氨基酸序列中可存在的MHC I类抗原决定簇(CD8阳性T细胞抗原决定簇)的序列时，例如在分割氨基酸序列中未设置重叠的情况下，需要11种连接氨基酸序列，在设置3残基的重叠的情况，需要8种连接氨基酸序列。这些连接氨基酸序列可由1个表达载体表达为多个多肽或使多个连接氨基酸序列彼此连接而表达为1个多肽，连接氨基酸序列彼此共享多个数十碱基程度的相同核酸序列，存在发生同源重组的风险。为了避免该风险，将以不同的构架制成的多个连接氨基酸序列表达为重组多肽的情况下，优选分别制成分开的多肽并由分开的载体表达。可认为将包含这些构架不同的连接氨基酸序列的多肽、编码它们的核酸或载体适宜组合进行接种，可广泛包含可成为理论上可存在的MHC I类抗原决定簇的序列，能够效率良好地诱导靶标特异性CD8阳性T细胞。
例如上述“例3”，通过将包含构架不同的连接氨基酸序列的8种多肽进行组合，可包含全部可成为理论上可存在的MHC I类抗原决定簇的序列(可从抗原蛋白的氨基酸序列中选择的11氨基酸的组合)(即100％)。本发明中，将其称为抗原蛋白的分割序列的覆盖率。该覆盖率对应于抗原蛋白中存在的潜在性MHC I类抗原决定簇的覆盖率。上述“例1”的情况下，1个连接氨基酸序列的分割序列的覆盖率(以11残基进行分割的情况下，将其称为11氨基酸的窗口宽度中的分割序列覆盖率)为1/11，即为9.1％，在将构架不同的n个连接氨基酸序列进行组合的情况下为(1/11)*n％。上述“例3”的情况下，1个连接氨基酸序列的分割序列的覆盖率(以11残基进行分割的情况)为1/8，即为12.5％，将构架不同的n个连接氨基酸序列进行组合的情况下为(1/8)*n％。在组合多个本发明的多肽的情况下，作为其组合，抗原蛋白的分割序列的覆盖率例如为20％以上，优选为25％以上，更优选为30％以上，更优选为35％以上，更优选为40％以上，更优选为45％以上，更优选为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或100％。该覆盖率可根据分割的氨基酸的长度来计算。氨基酸的长度(即窗口宽度)，例如为8氨基酸，优选为9氨基酸，更优选为10氨基酸，更优选为11氨基酸。例如上述“例3”(分别以11氨基酸进行分割，并且存在3残基的重叠)的情况下，为了使抗原蛋白的分割序列的覆盖率为60％以上，组合构架不同的6种连接氨基酸序列即可。
例如包含本发明的连接氨基酸序列的多肽，可将分割构架不同的多肽组合至少2种，优选为2种，更优选为4种，更优选为5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种。这些多肽可以作为分开的疫苗组合物进行制备，也可以混合在1个组合物中进行制备。
此外，本发明涉及编码包含本发明的连接氨基酸序列的多肽的核酸。此处，核酸没有特别限定，可以为DNA或RNA。此外，后述的负链RNA病毒载体是在基因组具有反义单链RNA的病毒，蛋白质被编码为反义。这样，本发明的核酸中，不仅包含编码作为有义链的多肽的核酸，还包含编码作为反义链的多肽的核酸。此外，核酸可以为单链或双链。核酸的碱基序列的设计中，可根据表达多肽的宿主而对密码子进行适宜优化。
本发明的核酸不限于编码本发明的多肽，也可以编码其他多肽，可包含其它的序列，例如复制起始点、启动子、增强子、终止子等的序列、间隔物等。
此外，本发明提供包含所述核酸的载体。本发明的载体只要保持本发明的核酸就没有特别限定。例如可以为质粒载体、噬菌体载体、粘粒、病毒载体或人工染色体等。特别是，作为本发明的载体可举出表达载体，通过使用可对动物进行体内给药的表达载体，而能够使本发明的多肽在动物体内表达并作为疫苗发挥功能。
作为这样的载体，包含非病毒载体和病毒载体，例如可举出：质粒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体(包含慢病毒载体)、腺相关病毒载体、痘苗病毒病毒载体、巨细胞病毒载体、痘病毒载体(Wilson NA.et al.,J Virol.80:5875-5885,2006；Hansen SG.et al.,Nature.473:523-527,2011；Barouch DH.et al.,Nature.482:89-93,2012)等，但不限于此。
特别是作为本发明的载体，可举出负链RNA病毒载体。发明人进行的猴AIDS模型的研究中，在使用了作为负链RNA病毒载体之一的仙台病毒(SeV)载体的研究中，通过单独CD8阳性T细胞SIV抗原决定簇表达SeV载体疫苗，未发现SIV特异性CD4阳性T细胞诱导，表现出有效的SIV抗原决定簇特异性CD8阳性T细胞得到诱导(Tsukamoto T.et al.,J Virol.83:9339-9346，2009；Ishii H.et al.,J Virol.86:738-745,2012)。因此，通过使用负链RNA病毒载体来表达本发明的多肽，可期待进一步提高下述效果：尽可能抑制抗原特异性CD4阳性T细胞诱导，并且选择性地诱导有效的抗原特异性CD8阳性T细胞的效果。
如上所述，负链RNA病毒载体是非染色体整合型病毒载体并且载体在细胞质中表达，因此不存在搭载基因导入宿主的染色体(源自核的染色体)的风险。因此，安全性较高，并且载体易于从感染细胞中除去。仙台病毒(SeV)载体(Matano T.et al.,J Exp Med.199:1709-1718,2004；Nyombayire J.et al.,J Infect Dis.215:95-104,2017)等负链RNA病毒，可用作具有效率良好的CD8阳性T细胞诱导能力的载体。
本发明中负链RNA病毒载体，除了感染性病毒粒子之外，包含：作为包含病毒核心、病毒基因组和病毒蛋白质的复合体或非感染性病毒粒子等的复合体并且具有通过导入细胞而表达搭载的基因的能力的复合体。例如，负链RNA病毒中，包含病毒基因组和与其结合的负链RNA病毒蛋白质(例如NP、P和L蛋白质)的核糖核蛋白(病毒的芯部分)，可通过导入细胞而在细胞内表达导入基因(WO00/70055)。向细胞的导入，使用适宜转染试剂等进行即可。这样的核糖核蛋白(RNP)也包含在本发明的负链RNA病毒载体中。本发明中负链RNA病毒载体优选为所述的RNP被源自细胞膜的生物膜包裹而成的粒子。
作为本发明中使用的负链RNA病毒载体，特别是可举出副粘病毒载体，副粘病毒是指属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒或其衍生物。副粘病毒科包含：副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)(包含呼吸道病毒属(也称为副粘病毒属)、Rubravirus属和麻疹病毒属)和肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)(包含肺炎病毒属和变性肺病毒属)。作为副粘病毒科病毒中包含的病毒，具体而言，可举出：仙台病毒(Sendai virus)、新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病毒(Measles virus)、RS病毒(Respiratory syncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1、2、3型等。更具体而言，例如包含：仙台病毒(SeV)、人副流感病毒1(HPIV-1)、人副流感病毒3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒海豚(DMV)、小反刍兽疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒2(HPIV-2)、猴副流感病毒5(SV5)、人副流感病毒4a(HPIV-4a)、人副流感病毒4b(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(Mumps)和新城疫病毒(NDV)等。作为弹状病毒，包含弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口炎病毒(Vesicular stoma titis virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)等。
需要说明的是，如上所述负链RNA病毒的基因组RNA为负链，蛋白质的氨基酸序列被具有基因组RNA的互补序列的反基因组所编码。本发明中为了方便起见，基因组和反基因组都可称为基因组。
本发明的病毒载体，优选为属于副粘病毒亚科(包含呼吸道病毒属、Rubr avirus属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，更优选为属于呼吸道病毒属(genus Respirovirus)(也称为副粘病毒属(Paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物中，包含以不损害病毒的基因导入能力的方式对病毒基因进行了修饰的病毒和经过了化学修饰的病毒等。作为可适用本发明的呼吸道病毒属病毒，例如包含：人副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙台病毒(Sendai virus；也称为小鼠副流感病毒1型)、麻疹病毒、猴副流感病毒(SV5)和猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本发明中副粘病毒最优选为仙台病毒。
副粘病毒，通常包含在包膜的内部包含RNA和蛋白质的复合体(核糖核蛋白；RNP)。RNP中包含的RNA为作为负链RNA病毒的基因组的(-)链(负链)的单链RNA，所述单链RNA与NP蛋白质、P蛋白质和L蛋白质结合而形成RNP。该RNP中包含的RNA为用于病毒基因组的转印和复制的模板(Lamb,R.A.,and D.Kolakofsky,1996,Paramyxoviridae:The viruses andtheir replication.pp.1177-1204.In Fields Virology,3rd edn.Fields,B.N.,D.M.Knipe,and P.M.Howley et al.(ed.),Raven Press,New York,N.Y.)。
此外，病毒载体可源自天然株、野生株、变异株、实验室传代株和人工构建株等病毒。例如为仙台病毒时，可举出Z株，但不限于此(Medical Journal of Osaka UniversityVol.6,No.1,March 1955p1-15)。例如，可以为所具有的任一基因存在变异、缺失的野生型病毒。例如，可适宜使用编码病毒的包膜蛋白或外壳蛋白质的至少1个基因发生缺失或具有抑制其表达的终止密码子变异等变异的病毒。这样的不表达包膜蛋白的病毒，例如为虽然能够在感染细胞中复制基因组，但是无法形成感染性病毒粒子的病毒。这样的传播能力缺陷型的病毒，特别是适用作安全性高的载体。例如，可使用在基因组中不编码F或HN中任一者的包膜蛋白(刺突蛋白)的基因或F和HN的基因的病毒(WO00/70055和WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。基因组RNA中至少编码基因组复制所必要的蛋白质(例如N、P和L蛋白质)时，病毒能够在感染细胞中扩增基因组。为了制造包膜蛋白缺陷型并且具有感染性的病毒粒子，例如，将缺失的基因产物或能够补充该缺失的基因产物的蛋白质在病毒产生细胞中外来性地进行供给(WO00/70055和WO00/70070；Li,H.-O.etal.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。另一方面，通过完全不补充缺失的病毒蛋白质，能够对非感染性病毒粒子进行回收(WO00/70070)。
此外，本发明的病毒的生产中，优选使用搭载有变异型的病毒蛋白质基因的病毒。例如，已知有包含病毒的结构蛋白质(NP、M)、RNA合成酶(P、L)中弱毒化变异、温度感受性变异的多种变异。具有这些变异蛋白质基因的副粘病毒载体等可根据目的而适用于本发明中。
就包含编码本发明的多肽的核酸的病毒载体的构建而言，可使用公知的方法进行(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70070；WO01/18223；WO2005/071092；Hasan,MK et al.JGen Virol 78:2813-2820,1997；Kato A et al.EMBO J 16:578-587,1997；Yu D etal.Genes Cells 2:457-466,1997；Ka to A et al.,Genes Cells 1；569-579,1996；Tokusumi T et al.Virus Res 86:33-38,2002；Li HO et al.,J Virol 74:6564-6569,2000)。
此外，本发明提供包含本发明的多肽或编码该多肽的核酸或载体的组合物。该组合物可包含期望的载体和/或介质。作为载体、介质，可举出药学上可允许的期望载体、介质，例如可举出灭菌水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、缓冲液、培养液等。此外，可添加二醇、甘油、橄榄油等油、有机酯等，可适宜混合悬浮液、乳化剂、稀释剂、赋形剂等的添加剂并制剂化。制剂化的方法和可使用的添加剂为药物制剂领域中周知的。制剂的方式没有特别限定，例如可作为注射剂、吸入剂、胶囊剂等进行制剂化。此外，本发明涉及包含本发明的多肽或编码该多肽的核酸或载体的疫苗制剂。本发明的组合物或疫苗制剂，可用于抑制作为靶标的抗原蛋白特异性CD4阳性T细胞的诱导，同时选择性地诱导抗原蛋白特异性CD8阳性T细胞。本发明的组合物或疫苗制剂，例如可作为包含本发明的多肽或编码该多肽的核酸或载体、和期望的载体的组合物进行制备。本发明的组合物或疫苗制剂，例如可设为HVJ脂质体等脂质体。此外，本发明的组合物或疫苗制剂可进一步包含期望的佐剂。作为佐剂，例如可举出油佐剂、铝佐剂，具体而言，可举出：Alum(铝盐)、MF59(油乳剂)、Montanide(Montanide ISA 51VG等、油乳剂)。
本发明的组合物或疫苗制剂可包含一种或多种本发明的多肽。如上所述，通过将作为由相同抗原蛋白的氨基酸序列制成的本发明的多肽并且分割构架不同的多肽进行组合，能够进一步高效地诱导靶抗原特异性CD8阳性T细胞。例如，就本发明的组合物或疫苗制剂而言，可以将以相同抗原蛋白为靶标但是分割构架不同的本发明的多肽组合使用例如2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上或11种以上，此外，也可以包含它们。在组合多个分割构架不同的本发明的多肽的情况下，作为其组合，可以使得抗原蛋白的分割序列的覆盖率例如为20％以上、优选为25％以上、更优选为30％以上、更优选为35％以上、更优选为40％以上、更优选为45％以上、更优选为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或100％的方式进行设定。此外，就本发明的组合物或疫苗制剂而言，可组合使用以不同的抗原蛋白为靶标的本发明的多肽，此外，也可以包含它们。
在使用本发明的疫苗制剂的情况下，其接种方式没有特别限定，例如可用于单次接种、多次接种。多次接种中，可以将本发明的疫苗多次接种，也可以与别的类型的疫苗组合使用。例如在进行多次接种的情况下，不是重复相同多肽或相同组合的接种，而变更接种的多肽或其组合可能是有用的。此外，变更给药途径或以多个给药途径进行接种可能是有用的。具体而言，在能够以8种多肽包含理论上可存在的全部种类的分割氨基酸配(即可成为MHC I类抗原决定簇的序列)的情况下，可在一次接种中接种例如4种的多肽，并且每次接种变更4种的组合(参照实施例4、图3)。此外，可在初次接种或前几次接种中使用非病毒载体(例如使用多肽、DNA载体)进行接种，然后使用包覆本发明的多肽的病毒载体进行接种。所使用的病毒载体没有特别限定，例如可优选使用仙台病毒载体等副粘病毒载体。
此外，本发明的多肽、核酸和载体可与其他抗原、编码该抗原的核酸、载体组合使用。例如，在初次接种或前几次接种中，可使用未如本发明的多肽那样进行分割的靶抗原、编码该抗原的核酸或载体进行接种，在追加接种中接种本发明的多肽、核酸或载体(参照实施例4和5)。初次接种中，可使用编码例如未如本发明的多肽那样进行分割的靶抗原的DNA载体，但不限于此。
在将本发明的组合物或疫苗制剂对动物进行接种的情况下，其给药量可根据疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的形态、给药方法等而适宜决定。给药途径可适宜选择，例如可举出鼻腔给药、腹腔内给药、肌肉内给药、对于感染、肿瘤等病变部位的局部给药等，但不限于此。此外，给药量可根据对象动物、给药部位、给药次数等而适宜调整。例如，可举出：1ng/kg～1000mg/kg、5ng/kg～800mg/kg、10ng/kg～500mg/kg、0.1mg/kg～400mg/kg、0.2mg/kg～300mg/kg、0.5mg/kg～200mg/kg或1mg/kg～100mg/kg，但不限于此。此外，例如为病毒载体时，以1x104～1x1015CIU/kg、1x105～1x1014CIU/kg、1x106～1x1013CIU/kg、1x107～1x1012CIU/kg、1x108～5x1011CIU/kg、1x109～5x1011CIU/kg或1x1010～1x1011CIU/kg进行给药，以及以1x106～1x1017微粒/kg、1x107～1x1016微粒/kg、1x108～1x1015微粒/kg、1x109～1x1014微粒/kg、1x1010～1x1013微粒/kg、1x1011～5x1012微粒/kg或5x1011～5x1012微粒/kg进行给药，但不限于此。
本发明的组合物或疫苗制剂的给药对象没有特别限定，优选为哺乳动物(包含人和非人哺乳类)。具体而言，包含：人、猴等的非人灵长类、小鼠、大鼠等啮齿类、兔子、山羊、绵羊、猪、牛、狗、猫等其它的全部哺乳动物。
此外，本发明的组合物或疫苗制剂，可与其他药物品组合使用。例如，在使用针对肿瘤抗原而设计的本发明的多肽的情况下，可与其他抗癌剂组合使用。此外，在使用针对感染而设计的本发明的多肽的情况下，可与针对所述感染的其他药物组合使用。
实施例
以下，通过实施例对本发明进一步详细地进行说明，但是本发明不限于这些实施例。需要说明的是，本说明书中引用的文献和其它的参照都导入为本说明书的一部分。
[实施例1]搭载SCaV11抗原基因的质粒的构建
基于SIVmac239感染猴AIDS模型的评价中，将SIVmac239(GenBank AccessionNo.M33262)的Gag CA和Vif蛋白作为靶抗原而设计TCT11(也称为SCaV11)抗原。基于SIVmac239的Gag CA(氨基酸序列Accession：AAA4 7632.1(SEQ ID NO.21))和Vif(氨基酸序列Accession：AAA47634.1(SEQ ID NO.22))蛋白的氨基酸序列，将这些抗原蛋白的氨基酸序列片段化为相互重复3氨基酸的11mer的肽，将这些肽群的顺序重新排列后，将丙氨酸作为间隔物进行串联连接(SCaV11)(图1)。3氨基酸的重复用于防止同源重组。以同样的步骤，设计靶抗原区域的肽起始氨基酸位置分别偏移1氨基酸的串联连接抗原共8种(SCaV11A～H)(依次为SEQ ID NO.：23～30)。接下来，将这些抗原的碱基序列的密码子进行优化以用于人，进一步导入用于防止同源重组的变异后化学合成基因整体(Eurofins Genomics公司)，搭载于质粒。将这些质粒命名为pSCaV11A～H(依次为SEQ ID NO.：31～38)。
[实施例2]搭载SCaV11抗原基因的仙台病毒(SeV)载体的构建
(1)搭载SCaV11抗原基因的F缺陷型仙台病毒制备用质粒的构建
以搭载SCaV11A抗原基因的质粒为模板，以Not1_SCaV11A_N(5’-ATATgcggccgcgacgccaccATGGCCTACCCTGTGCAGCAG-3’(SEQ ID NO.：39))和SCaV11A_EIS_Not1_C(5’-ATATGCGGCCGCgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggTCAGGCTTTGCCTCCCCTCTGC-3’(SEQ IDNO.：40))为引物，使用KOD-Plus-Ver.2kit，将94℃2分钟、(98℃10秒、55℃30秒、68℃2.5分钟)的循环进行30个循环，然后以68℃7分钟进行反应后，在保持为4℃的条件下进行PCR，将扩增得到的SCaV11A片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离后，通过NucleoSpin Gel and PCRClean-up kit(TAKARABIO)进行纯化。需要说明的是，所述引物的序列中的大写字母表示SCaV11抗原基因的序列，小写字母表示SeV载体的序列(以下同样)。
接下来，在编码F基因缺陷型的仙台病毒载体的pSeV18+/ΔF质粒(WO00/070070)的NotI剪切部位连接经过NotI处理的所述SCaV11A片段(两端具有NotI位点)，并转化至大肠菌后进行克隆，通过测序选择碱基序列的正确克隆，得到pSeV18+SCaV11A/ΔF质粒。
同样，以SCaV11B抗原基因搭载质粒为模板，以Not1_SCaV11B_N(5’-ATATgcggccgcgacgccaccATGGCCCCTGTGCAGCAGATCG-3’(SEQ ID NO.：41))和SCaV11B_EIS_Not1_C(5’-ATATGCGGCCGCgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggTCAGGCGGGCTTCCCTCCCCTC-3’(SEQ IDNO.：42))为引物，通过PCR进行扩增，将得到的片段插入pSeV18+/ΔF质粒的NotI位点以得到pSeV18+SCaV11B/ΔF质粒。
同样，以SCaV11C抗原基因搭载质粒为模板，以Not1_SCaV11C_N(5’-ATATgcggccgcgacgccaccATGGCCGTGCAGCAGATCGGAG-3’(SEQ ID NO.：43))和SCaV11C_EIS_Not1_C(5’-ATATGCGGCCGCgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggTCAAGCAGGAGGTTTCCCTCCCC-3’(SEQID NO.：44))为引物，通过PCR进行扩增，将得到的片段插入pSeV18+/ΔF质粒的NotI位点以得到pSeV18+SCaV11C/ΔF质粒。
同样，以SCaV11D抗原基因搭载质粒为模板，以Not1_SCaV11D_N(5’-ATATgcggccgcgacgccaccATGGCCCAGCAGATCGGAGGC-3’(SEQ ID NO.：45))和SCaV11D_EIS_Not1_C(5’-ATATGCGGCCGCgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggTCAGGCTGTTGGGGGTTTCCCTC-3’(SEQ IDNO.：46))为引物，通过PCR进行扩增，将得到的片段插入pSeV18+/ΔF质粒的NotI位点以得到pSeV18+SCaV11D/ΔF质粒。
同样，以SCaV11E抗原基因搭载质粒为模板，以Not1_SCaV11E_N(5’-ATATgcggccgcgacgccaccATGGCCCAGATCGGAGGCAATTATG-3’(SEQ ID NO.：47))和SCaV11E_EIS_Not1_C(5’-ATATGCGGCCGCgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggTCAGGCCTTGGTAGGGGGTTTCC-3’(SEQ ID NO.：48))为引物，通过PCR进行扩增，将得到的片段插入pSeV18+/ΔF质粒的NotI位点以得到pSeV18+SCaV11E/ΔF质粒。
同样，以SCaV11F抗原基因搭载质粒为模板，以Not1_SCaV11F_N(5’-ATATgcggccgcgacgccaccATGGCCATCGGAGGCAATTATG-3’(SEQ ID NO.：49))和SCaV11F_EIS_Not1_C(5’-ATATGCGGCCGCgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggTCAGGCGCCTTTTGTAGGGGG-3’(SEQ IDNO.：50))为引物，通过PCR进行扩增，将得到的片段插入pSeV18+/ΔF质粒的NotI位点以得到pSeV18+SCaV11F/ΔF质粒。
同样，以SCaV11G抗原基因搭载质粒为模板，以Not1_SCaV11G_N(5’-ATATgcggccgcgacgccaccATGGCCGGAGGCAATTATGTG-3’(SEQ ID NO.：51))和SCaV11G_EIS_Not1_C(5’-ATATGCGGCCGCgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggTCAGGCGGCGCCCTTTGTAGGGG-3’(SEQ IDNO.：52))为引物，通过PCR进行扩增，将得到的片段插入pSeV18+/ΔF质粒的NotI位点以得到pSeV18+SCaV11G/ΔF质粒。
同样，以SCaV11H抗原基因搭载质粒为模板，以Not1_SCaV11H_N(5’-ATATgcggccgcgacgccaccATGGCCGGAGGCAATTATGTG-3’(SEQ ID NO.：53))和SCaV11H_EIS_Not1_C(5’-ATATGCGGCCGCgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggTCAGGCGGCGCCCTTTGTAGGGG-3’(SEQ IDNO.：54))为引物，通过PCR进行扩增，将得到的片段插入pSeV18+/ΔF质粒的NotI位点以得到pSeV18+SCaV11H/ΔF质粒。
(2)搭载SCaV11抗原基因的F缺陷型仙台病毒的制备(重建)和扩增
由以上述方式制备的搭载SCaV11抗原基因的F缺陷型仙台病毒制备用质粒pSeV18+SCaV11A/ΔF～pSeV18+SCaV11H/ΔF出发的、搭载SCaV11抗原基因的F缺陷型仙台病毒的制备(重建)和扩增，使用公知的方法(例如WO2005/071092)进行，将得到的病毒的名称分别设为SeV18+SCaV11A/ΔF、SeV18+SCaV11B/ΔF、SeV18+SCaV11C/ΔF、SeV18+SCaV11D/ΔF、SeV18+SCaV11E/ΔF、SeV18+SCaV11F/ΔF、SeV18+SCaV11G/ΔF、SeV18+SCaV11H/ΔF。
[实施例3]SIV CA-Vif TCT11抗原表达疫苗对SIV Controller(SIV复制控制猴)的接种试验
在表达单独抗原决定簇(Gag CA)的疫苗接种后，通过SIVmac239经静脉接种，在SIV复制得到控制的恒河猴(SIV controller)的慢性期中，接种本SCaV11表达仙台病毒(SeV)载体，检查诱导的SIV Gag·Vif抗原特异性T细胞反应。
将表达SCaV11A、SCaV11B、SCaV11F和SCaV11H的F缺陷型仙台病毒载体(SeV18+SCaV11A/ΔF、SeV18+SCaV11B/ΔF、SeV18+SCaV11F/ΔF、SeV18+SCaV11H/ΔF、各6x109CIU)进行鼻腔接种和肌肉注射。从疫苗接种前和接种后1周的血液中分离外周血单个核细胞(PBMC)，对SIV Gag·Vif抗原特异性T细胞反应进行解析。具体而言，在使用了包含SIVmac239 Gag·Vif区域的重叠肽库的抗原刺激后，通过细胞内细胞因子染色并使用流式细胞仪(Flowcytometer)对IFN-γ产生细胞进行检测，而测定SIV Gag·Vif抗原特异性T细胞频率。其结果，疫苗接种后的Gag·Vif抗原特异性CD8阳性T细胞频率与疫苗接种前相比增加了10倍以上，但Gag·Vif抗原特异性CD4阳性T细胞频率在疫苗接种前后没有变化(图2)。因此，SCaV11抗原表达SeV载体疫苗表现出选择性地诱导SIV Gag·Vif抗原特异性CD8阳性T细胞反应。
[实施例4]SCaV11疫苗对非感染猴的接种试验
对6只非感染恒河猴接种SCaV11抗原表达疫苗，检查诱导的SIV抗原特异性T细胞反应。
对于6只猴，将分别表达SCaV11A～H抗原(8种)的质粒DNA(pcDNA-SCaV11A～H，各5mg)疫苗各分2次进行肌肉注射后，将分别表达SCaV11A～H抗原(8种)的F缺陷型SeV载体(SeV18+SCaV11A/ΔF～SeV18+SCaV11H/ΔF，各6x109CIU)疫苗各以1次进行鼻腔接种和肌肉注射(图3)。从最后的疫苗接种后1周的血液中分离PBMC，以与实施例3同样的方法对SIVGag·Vif抗原特异性T细胞反应进行解析。
以前的报告中，通过表达SIV Gag抗原或Vif·Nef抗原的DNA/SeV载体疫苗接种，不仅是Gag·Vif抗原特异性CD8阳性T细胞反应，还会效率良好地诱导Gag·Vif特异性CD4阳性T细胞反应(Iwamoto N.et al.,J Virol.88:425-433,2014)。另一方面，在本SCaV11抗原表达DNA/SeV载体疫苗接种中，虽然非常高效地诱导了Gag·Vif抗原特异性CD8阳性T细胞反应，但是未发现Gag·Vif特异性CD4阳性T细胞反应或为非常低的水平(图3)。以上的结果表明，SCaV11抗原表达DNA prime·SeV载体疫苗，几乎不诱导SIV Gag·Vif抗原特异性CD4阳性T细胞反应，而是效率良好地选择性诱导Gag·Vif抗原特异性CD8阳性T细胞。
[实施例5]SCaV11疫苗对非感染猴的接种试验2
对8只非感染恒河猴，接种SCaV11抗原表达疫苗，检查诱导的SIV抗原特异性T细胞反应。
对于8只猴，将分别表达SCaV11A～H抗原(8种)的质粒DNA(pcDNA-SCaV11A～H，各5mg)疫苗各分2次进行肌肉注射后，将分别表达SCaV11A～H抗原(8种)的F缺陷型SeV载体(SeV18+SCaV11A/ΔF～SeV18+SCaV11H/ΔF，各1x109CIU)疫苗各以1次进行鼻腔接种和肌肉注射(图4)。从最后的疫苗接种后1周的血液中分离PBMC，以与实施例3同样的方法对SIVGag·Vif抗原特异性T细胞反应进行解析。此外，为了对淋巴结中的免疫诱导能力进行评价，在第3次SeV载体疫苗接种后2周实施淋巴结活检，同样对SIV Gag·Vif抗原特异性T细胞反应进行解析。
在SCaV11抗原表达DNA/SeV载体疫苗接种中，非常高效地诱导Gag·Vif抗原特异性CD8阳性T细胞反应，并且未观察到Gag·Vif特异性CD4阳性T细胞反应或处于非常低的水平(图4)。在抗原特异性CD4阳性T细胞反应和CD8阳性T细胞反应的比较中，与Gag·Vif特异性T细胞同样，抗原特异性CD8阳性T细胞频率也表现出明显高于抗原特异性CD4阳性T细胞频率的值(Gag；p＝0.0078,Vif；p＝0.0156by Wilcoxon matched-pairs signed ranktest(威氏配对符号秩次检验))。根据以上的结果，确认了基于SCaV11抗原表达疫苗的Gag·Vif特异性CD8阳性T细胞反应的选择性诱导的再现性，并且检证·确认了靶标11mer连接抗原TCT11疫苗的选择性抗原特异性CD8阳性T细胞反应诱导能力。
对疫苗接种后的淋巴结中的抗原特异性T细胞反应进行解析结果，在淋巴结中也选择性地诱导了Gag·Vif特异性CD8阳性T细胞反应，而Gag·Vif特异性CD4阳性T细胞反应除一只个体之外都处于检测极限以下(图5)。淋巴结为HIV·SIV增殖的主要组织之一，可认为淋巴结中的选择性抗原特异性CD8阳性T细胞反应可助于控制HIV·SIV复制。
工业实用性
在用于有效的CD8阳性T细胞诱导的抗原优化研究中，HIV感染者和猴AIDS模型的解析表明，以Gag和Vif抗原为靶标的CD8阳性T细胞反应具有较强的病毒复制抑制能力。此外，多种HIV株中相对保守的抗原区域，被认为是不易发生转义变异选择的CD8阳性T细胞靶标，而设计了这些保守区域连接而成的抗原(Letourneau S.et al.,PLoS One.2:e984,2007)。此外，也设计了包含与较低的病毒量相关的(HIV复制抑制能力高的)CD8阳性T细胞靶标的区域连接而成的抗原(Mothe B.et al.,J Transl Med.9:208,2011)。这些均以GagCA和Vif区域为主区域，但是从尽可能抑制HIV抗原特异性CD4阳性T细胞诱导，并且选择性地诱导有效的HIV抗原特异性CD8阳性T细胞这样的观点出发，迄今为止仍未完成抗原设计，故本发明的新颖性·创造性·优越性极高。此外，也可将本抗原的设计理论应用于所述的保守区域连接抗原、HIV复制抑制能力高的CD8阳性T细胞靶标连接抗原设计。根据本发明，可期待为针对AIDS的更有效的疫苗疗法的开创道路。
序列表
<110> 国立传染病研究所长代表日本国
株式会社爱迪药业
<120> 选择性CD8阳性T细胞诱导疫苗抗原
<130> D4-A1703P
<150> JP 2018-008255
<151> 2018-01-22
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 1
Tyr Pro Val Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr Val His Leu Pro Leu Ser
1 5 10 15
Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys Phe
20 25 30
Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys Thr
35 40 45
Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Val Gly
50 55 60
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 2
Tyr Pro Val Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr Val
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 3
His Leu Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 4
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1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 5
Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 6
Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 7
Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 8
Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 9
Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 11
Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Ile
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 13
Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 14
Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 15
Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Val
1 5 10
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 16
Asn Tyr Val His Leu Pro Leu Ser
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 17
Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys
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<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 18
Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu Val
1 5
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 19
Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 20
Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile
1 5 10
<210> 21
<211> 510
<212> PRT
<213> 猴免疫缺陷病毒
<400> 21
Met Gly Val Arg Asn Ser Val Leu Ser Gly Lys Lys Ala Asp Glu Leu
1 5 10 15
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Asn Gly Lys Lys Lys Tyr Met Leu Lys
20 25 30
His Val Val Trp Ala Ala Asn Glu Leu Asp Arg Phe Gly Leu Ala Glu
35 40 45
Ser Leu Leu Glu Asn Lys Glu Gly Cys Gln Lys Ile Leu Ser Val Leu
50 55 60
Ala Pro Leu Val Pro Thr Gly Ser Glu Asn Leu Lys Ser Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Thr Val Cys Val Ile Trp Cys Ile His Ala Glu Glu Lys Val Lys His
85 90 95
Thr Glu Glu Ala Lys Gln Ile Val Gln Arg His Leu Val Val Glu Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Thr Met Pro Lys Thr Ser Arg Pro Thr Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Gly Arg Gly Gly Asn Tyr Pro Val Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Val His Leu Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu
145 150 155 160
Ile Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala
165 170 175
Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys
180 185 190
Val Gly Asp His Gln Ala Ala Met Gln Ile Ile Arg Asp Ile Ile Asn
195 200 205
Glu Glu Ala Ala Asp Trp Asp Leu Gln His Pro Gln Pro Ala Pro Gln
210 215 220
Gln Gly Gln Leu Arg Glu Pro Ser Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Ser Ser Val Asp Glu Gln Ile Gln Trp Met Tyr Arg Gln Gln Asn Pro
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260 265 270
Lys Cys Val Arg Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln
275 280 285
Gly Pro Lys Glu Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ser
290 295 300
Leu Arg Ala Glu Gln Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gln
305 310 315 320
Thr Leu Leu Ile Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Lys
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Gly Leu Gly Val Asn Pro Thr Leu Glu Glu Met Leu Thr Ala Cys Gln
340 345 350
Gly Val Gly Gly Pro Gly Gln Lys Ala Arg Leu Met Ala Glu Ala Leu
355 360 365
Lys Glu Ala Leu Ala Pro Val Pro Ile Pro Phe Ala Ala Ala Gln Gln
370 375 380
Arg Gly Pro Arg Lys Pro Ile Lys Cys Trp Asn Cys Gly Lys Glu Gly
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Pro Ala Val Asp Leu Leu Lys Asn Tyr Met Gln Leu Gly Lys Gln Gln
465 470 475 480
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<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 猴免疫缺陷病毒
<400> 22
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Glu Arg Leu Glu Arg Trp His Ser Leu Ile Lys Tyr Leu Lys Tyr Lys
20 25 30
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35 40 45
Trp Ala Trp Trp Thr Cys Ser Arg Val Ile Phe Pro Leu Gln Glu Gly
50 55 60
Ser His Leu Glu Val Gln Gly Tyr Trp His Leu Thr Pro Glu Lys Gly
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Arg Gly Leu Arg Met Ala Lys Gln Asn Ser Arg Gly Asp Lys Gln Arg
180 185 190
Gly Gly Lys Pro Pro Thr Lys Gly Ala Asn Phe Pro Gly Leu Ala Lys
195 200 205
Val Leu Gly Ile Leu Ala
210
<210> 23
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 23
Met Ala Tyr Pro Val Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ala Ala Met Gln Ile Ile Arg
20 25 30
Asp Ile Ile Asn Glu Ala Pro Ser Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
35 40 45
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Asp Trp Asp Leu Gln Ala Thr Thr Ser Ser Val Asp Glu Gln Ile Gln
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Arg Ala Glu Gln Thr Asp Ala Ala Ala Leu Lys Gly Leu Gly Val
165 170 175
Asn Pro Thr Leu Glu Ala Ala Leu Lys Glu Ala Leu Ala Pro Val Pro
180 185 190
Ile Ala Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Ile Ala Pro Tyr
195 200 205
Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Val Ala Asp Leu Gln His Pro Gln
210 215 220
Pro Ala Pro Gln Gln Ala Ile Gln Trp Met Tyr Arg Gln Gln Asn Pro
225 230 235 240
Ile Ala Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Ala Asp Ala
245 250 255
Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Ala Thr Leu Glu Glu Met Leu
260 265 270
Thr Ala Cys Gln Gly Ala Val Pro Ile Pro Phe Ala Ala Ala Gln Gln
275 280 285
Arg Ala Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu Ala Asn Cys
290 295 300
Val Gly Asp His Gln Ala Ala Met Gln Ala Pro Gln Gln Gly Gln Leu
305 310 315 320
Arg Glu Pro Ser Gly Ala Asn Pro Ile Pro Val Gly Asn Ile Tyr Arg
325 330 335
Arg Ala Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Gln Ser Tyr Ala Thr Gln
340 345 350
Thr Leu Leu Ile Gln Asn Ala Asn Pro Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly
355 360 365
Pro Gly Gln Lys Ala Ala Gln Gln Arg Gly Pro Arg Lys Pro Ile Lys
370 375 380
Cys Ala Met Glu Glu Glu Lys Arg Trp Ile Ala Val Pro Ala Thr Lys
385 390 395 400
Asp Leu Gln Lys Val Cys Tyr Val Pro Ala Ser His Leu Glu Val Gln
405 410 415
Gly Tyr Trp His Leu Ala Trp Thr Asp Val Thr Pro Asn Tyr Ala Asp
420 425 430
Ile Ala Glu Gln Leu Leu Ser Cys Cys Arg Phe Pro Arg Ala Ser Gln
435 440 445
Gly Glu Asn Pro Thr Trp Lys Gln Trp Ala Ala Val Pro Thr Trp Arg
450 455 460
Ile Pro Glu Arg Leu Ala Tyr Val Pro His Phe Lys Val Gly Trp Ala
465 470 475 480
Trp Ala Trp His Leu Thr Pro Glu Lys Gly Trp Leu Ser Ala Ala Asp
485 490 495
Ile Leu Leu His Ser Thr Tyr Phe Pro Ala Phe Pro Arg Ala His Lys
500 505 510
Tyr Gln Val Pro Ser Ala Lys Gln Trp Arg Arg Asp Asn Arg Arg Gly
515 520 525
Leu Ala Glu Arg Leu Glu Arg Trp His Ser Leu Ile Lys Ala Trp Ala
530 535 540
Trp Trp Thr Cys Ser Arg Val Ile Phe Ala Trp Leu Ser Thr Tyr Ala
545 550 555 560
Val Arg Ile Thr Trp Ala Tyr Phe Pro Cys Phe Thr Ala Gly Glu Val
565 570 575
Arg Ala Val Pro Ser Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Lys Val Ala Arg Gly
580 585 590
Leu Arg Met Ala Lys Gln Asn Ser Arg Ala Leu Ile Lys Tyr Leu Lys
595 600 605
Tyr Lys Thr Lys Asp Ala Val Ile Phe Pro Leu Gln Glu Gly Ser His
610 615 620
Leu Ala Ile Thr Trp Tyr Ser Lys Asn Phe Trp Thr Asp Ala Glu Val
625 630 635 640
Arg Arg Ala Ile Arg Gly Glu Gln Leu Ala Leu Lys Val Val Ser Asp
645 650 655
Val Arg Ser Gln Gly Ala Asn Ser Arg Gly Asp Lys Gln Arg Gly Gly
660 665 670
Lys Ala
<210> 24
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 24
Met Ala Pro Val Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr Val His Ala Ala Glu
1 5 10 15
Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Ala Met Gln Ile Ile Arg Asp
20 25 30
Ile Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser
35 40 45
Ser Ala Arg Arg Trp Ile Gln Leu Gly Leu Gln Lys Cys Ala Ser Tyr
50 55 60
Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Arg Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu
65 70 75 80
Val Leu Lys Gly Leu Ala Lys Ala Arg Leu Met Ala Glu Ala Leu Lys
85 90 95
Glu Ala Tyr Val His Leu Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Ala Ala Leu
100 105 110
Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Ala Asn Glu Glu Ala Ala Asp
115 120 125
Trp Asp Leu Gln His Ala Thr Ser Ser Val Asp Glu Gln Ile Gln Trp
130 135 140
Met Ala Gln Lys Cys Val Arg Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ala Ser Leu
145 150 155 160
Arg Ala Glu Gln Thr Asp Ala Ala Val Ala Lys Gly Leu Gly Val Asn
165 170 175
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180 185 190
Pro Ala Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Asp
195 200 205
Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Val Gly Ala Leu Gln His Pro Gln Pro
210 215 220
Ala Pro Gln Gln Gly Ala Gln Trp Met Tyr Arg Gln Gln Asn Pro Ile
225 230 235 240
Pro Ala Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Ala Ala Ala
245 250 255
Val Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Ala Leu Glu Glu Met Leu Thr
260 265 270
Ala Cys Gln Gly Val Ala Pro Ile Pro Phe Ala Ala Ala Gln Gln Arg
275 280 285
Gly Ala Leu Ile Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu Val Ala Cys Val
290 295 300
Gly Asp His Gln Ala Ala Met Gln Ile Ala Gln Gln Gly Gln Leu Arg
305 310 315 320
Glu Pro Ser Gly Ser Ala Pro Ile Pro Val Gly Asn Ile Tyr Arg Arg
325 330 335
Trp Ala Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Gln Ser Tyr Val Ala Gln Thr
340 345 350
Leu Leu Ile Gln Asn Ala Asn Pro Asp Ala Gln Gly Val Gly Gly Pro
355 360 365
Gly Gln Lys Ala Arg Ala Gln Arg Gly Pro Arg Lys Pro Ile Lys Cys
370 375 380
Trp Ala Glu Glu Glu Lys Arg Trp Ile Ala Val Pro Thr Ala Lys Asp
385 390 395 400
Leu Gln Lys Val Cys Tyr Val Pro His Ala His Leu Glu Val Gln Gly
405 410 415
Tyr Trp His Leu Thr Ala Thr Asp Val Thr Pro Asn Tyr Ala Asp Ile
420 425 430
Leu Ala Gln Leu Leu Ser Cys Cys Arg Phe Pro Arg Ala Ala Gln Gly
435 440 445
Glu Asn Pro Thr Trp Lys Gln Trp Arg Ala Val Pro Thr Trp Arg Ile
450 455 460
Pro Glu Arg Leu Glu Ala Val Pro His Phe Lys Val Gly Trp Ala Trp
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Gln Val Pro Ser Leu Ala Gln Trp Arg Arg Asp Asn Arg Arg Gly Leu
515 520 525
Arg Ala Arg Leu Glu Arg Trp His Ser Leu Ile Lys Tyr Ala Ala Trp
530 535 540
Trp Thr Cys Ser Arg Val Ile Phe Pro Ala Leu Ser Thr Tyr Ala Val
545 550 555 560
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565 570 575
Arg Ala Pro Ser Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Lys Val Val Ala Gly Leu
580 585 590
Arg Met Ala Lys Gln Asn Ser Arg Gly Ala Ile Lys Tyr Leu Lys Tyr
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Arg Ala Ile Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Lys Val Val Ser Asp Val
645 650 655
Arg Ser Gln Gly Glu Ala Ser Arg Gly Asp Lys Gln Arg Gly Gly Lys
660 665 670
Pro Ala
<210> 25
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 25
Met Ala Val Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr Val His Leu Ala Glu Val
1 5 10 15
Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu Ala Gln Ile Ile Arg Asp Ile
20 25 30
Ile Asn Glu Glu Ala Ala Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ser
35 40 45
Val Ala Arg Trp Ile Gln Leu Gly Leu Gln Lys Cys Val Ala Tyr Val
50 55 60
Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Arg Ala Ala Pro Asp Cys Lys Leu Val
65 70 75 80
Leu Lys Gly Leu Gly Ala Ala Arg Leu Met Ala Glu Ala Leu Lys Glu
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Thr Leu Glu Glu Met Ala Lys Glu Ala Leu Ala Pro Val Pro Ile Pro
180 185 190
Phe Ala Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Ile Glu Glu Ala Asp Ile
195 200 205
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210 215 220
Pro Gln Gln Gly Gln Ala Trp Met Tyr Arg Gln Gln Asn Pro Ile Pro
225 230 235 240
Val Ala Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys Ala Ala Val
245 250 255
Lys Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu Ala Glu Glu Met Leu Thr Ala
260 265 270
Cys Gln Gly Val Gly Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Gln Gln Arg Gly
275 280 285
Pro Ala Ile Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu Val Val Ala Val Gly
290 295 300
Asp His Gln Ala Ala Met Gln Ile Ile Ala Gln Gly Gln Leu Arg Glu
305 310 315 320
Pro Ser Gly Ser Asp Ala Ile Pro Val Gly Asn Ile Tyr Arg Arg Trp
325 330 335
Ile Ala Gly Pro Lys Glu Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Ala Thr Leu
340 345 350
Leu Ile Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Ala Gly Val Gly Gly Pro Gly
355 360 365
Gln Lys Ala Arg Leu Ala Arg Gly Pro Arg Lys Pro Ile Lys Cys Trp
370 375 380
Asn Ala Glu Glu Lys Arg Trp Ile Ala Val Pro Thr Trp Ala Asp Leu
385 390 395 400
Gln Lys Val Cys Tyr Val Pro His Phe Ala Leu Glu Val Gln Gly Tyr
405 410 415
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420 425 430
Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Arg Phe Pro Arg Ala His Ala Gly Glu
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Thr Ala Leu Thr Pro Glu Lys Gly Trp Leu Ser Thr Tyr Ala Ile Leu
485 490 495
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500 505 510
Val Pro Ser Leu Gln Ala Trp Arg Arg Asp Asn Arg Arg Gly Leu Arg
515 520 525
Met Ala Leu Glu Arg Trp His Ser Leu Ile Lys Tyr Leu Ala Trp Trp
530 535 540
Thr Cys Ser Arg Val Ile Phe Pro Leu Ala Ser Thr Tyr Ala Val Arg
545 550 555 560
Ile Thr Trp Tyr Ser Ala Pro Cys Phe Thr Ala Gly Glu Val Arg Arg
565 570 575
Ala Ala Ser Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Lys Val Val Ser Ala Leu Arg
580 585 590
Met Ala Lys Gln Asn Ser Arg Gly Asp Ala Lys Tyr Leu Lys Tyr Lys
595 600 605
Thr Lys Asp Leu Gln Ala Phe Pro Leu Gln Glu Gly Ser His Leu Glu
610 615 620
Val Ala Trp Tyr Ser Lys Asn Phe Trp Thr Asp Val Thr Ala Arg Arg
625 630 635 640
Ala Ile Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ser Ala Val Val Ser Asp Val Arg
645 650 655
Ser Gln Gly Glu Asn Ala Arg Gly Asp Lys Gln Arg Gly Gly Lys Pro
660 665 670
Pro Ala
<210> 26
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 26
Met Ala Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr Val His Leu Pro Ala Val Val
1 5 10 15
Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly Ala Ile Ile Arg Asp Ile Ile
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Gly Leu Gly Val Ala Arg Leu Met Ala Glu Ala Leu Lys Glu Ala
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100 105 110
Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Ala Glu Ala Ala Asp Trp Asp
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Arg Ala Cys Val Arg Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Ala Arg Ala
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Glu Gln Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Ala Leu Gly Val Asn Pro Thr
165 170 175
Leu Glu Glu Met Leu Ala Glu Ala Leu Ala Pro Val Pro Ile Pro Phe
180 185 190
Ala Ala Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Ile Glu Glu Lys Ala Ile Asn
195 200 205
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210 215 220
Gln Gln Gly Gln Leu Ala Met Tyr Arg Gln Gln Asn Pro Ile Pro Val
225 230 235 240
Gly Ala Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys Glu Ala Val Lys
245 250 255
Asn Trp Met Thr Gln Thr Leu Leu Ile Ala Glu Met Leu Thr Ala Cys
260 265 270
Gln Gly Val Gly Gly Ala Pro Phe Ala Ala Ala Gln Gln Arg Gly Pro
275 280 285
Arg Ala Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Ala Gly Asp
290 295 300
His Gln Ala Ala Met Gln Ile Ile Arg Ala Gly Gln Leu Arg Glu Pro
305 310 315 320
Ser Gly Ser Asp Ile Ala Pro Val Gly Asn Ile Tyr Arg Arg Trp Ile
325 330 335
Gln Ala Pro Lys Glu Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg Ala Leu Leu
340 345 350
Ile Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Ala Val Gly Gly Pro Gly Gln
355 360 365
Lys Ala Arg Leu Met Ala Gly Pro Arg Lys Pro Ile Lys Cys Trp Asn
370 375 380
Cys Ala Glu Lys Arg Trp Ile Ala Val Pro Thr Trp Arg Ala Leu Gln
385 390 395 400
Lys Val Cys Tyr Val Pro His Phe Lys Ala Glu Val Gln Gly Tyr Trp
405 410 415
His Leu Thr Pro Glu Ala Val Thr Pro Asn Tyr Ala Asp Ile Leu Leu
420 425 430
His Ala Leu Ser Cys Cys Arg Phe Pro Arg Ala His Lys Ala Glu Asn
435 440 445
Pro Thr Trp Lys Gln Trp Arg Arg Asp Ala Thr Trp Arg Ile Pro Glu
450 455 460
Arg Leu Glu Arg Trp Ala His Phe Lys Val Gly Trp Ala Trp Trp Thr
465 470 475 480
Cys Ala Thr Pro Glu Lys Gly Trp Leu Ser Thr Tyr Ala Ala Leu Leu
485 490 495
His Ser Thr Tyr Phe Pro Cys Phe Thr Ala Ala His Lys Tyr Gln Val
500 505 510
Pro Ser Leu Gln Tyr Ala Arg Arg Asp Asn Arg Arg Gly Leu Arg Met
515 520 525
Ala Ala Glu Arg Trp His Ser Leu Ile Lys Tyr Leu Lys Ala Trp Thr
530 535 540
Cys Ser Arg Val Ile Phe Pro Leu Gln Ala Thr Tyr Ala Val Arg Ile
545 550 555 560
Thr Trp Tyr Ser Lys Ala Cys Phe Thr Ala Gly Glu Val Arg Arg Ala
565 570 575
Ile Ala Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Lys Val Val Ser Asp Ala Arg Met
580 585 590
Ala Lys Gln Asn Ser Arg Gly Asp Lys Ala Tyr Leu Lys Tyr Lys Thr
595 600 605
Lys Asp Leu Gln Lys Ala Pro Leu Gln Glu Gly Ser His Leu Glu Val
610 615 620
Gln Ala Tyr Ser Lys Asn Phe Trp Thr Asp Val Thr Pro Ala Arg Ala
625 630 635 640
Ile Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ser Cys Ala Val Ser Asp Val Arg Ser
645 650 655
Gln Gly Glu Asn Pro Ala Gly Asp Lys Gln Arg Gly Gly Lys Pro Pro
660 665 670
Thr Ala
<210> 27
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 27
Met Ala Gln Ile Gly Gly Asn Tyr Val His Leu Pro Leu Ala Val Pro
1 5 10 15
Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys Ala Ile Arg Asp Ile Ile Asn
20 25 30
Glu Glu Ala Ala Asp Ala Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ser Val Asp
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Glu Ala Ile Gln Leu Gly Leu Gln Lys Cys Val Arg Met Ala Asp Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Leu Gly Val Asn Ala Leu Met Ala Glu Ala Leu Lys Glu Ala Leu
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Ala Ala Leu Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Ala Glu Gly
100 105 110
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Ala Ala Ala Asp Trp Asp Leu
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Gln His Pro Gln Pro Ala Val Asp Glu Gln Ile Gln Trp Met Tyr Arg
130 135 140
Gln Ala Val Arg Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Ala Ala Glu
145 150 155 160
Gln Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Trp Ala Gly Val Asn Pro Thr Leu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Thr Ala Ala Leu Ala Pro Val Pro Ile Pro Phe Ala
180 185 190
Ala Ala Asn Ala Trp Val Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys Ala Asn Gln
195 200 205
Met Leu Asn Cys Val Gly Asp His Gln Ala Pro Gln Pro Ala Pro Gln
210 215 220
Gln Gly Gln Leu Arg Ala Tyr Arg Gln Gln Asn Pro Ile Pro Val Gly
225 230 235 240
Asn Ala Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Ala Lys Asn
245 250 255
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260 265 270
Gly Val Gly Gly Pro Ala Phe Ala Ala Ala Gln Gln Arg Gly Pro Arg
275 280 285
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290 295 300
Gln Ala Ala Met Gln Ile Ile Arg Asp Ala Gln Leu Arg Glu Pro Ser
305 310 315 320
Gly Ser Asp Ile Ala Ala Val Gly Asn Ile Tyr Arg Arg Trp Ile Gln
325 330 335
Leu Ala Lys Glu Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg Phe Ala Leu Ile
340 345 350
Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Ala Gly Gly Pro Gly Gln Lys
355 360 365
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370 375 380
Gly Ala Lys Arg Trp Ile Ala Val Pro Thr Trp Arg Ile Ala Gln Lys
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
Leu Glu Arg Trp His Ala Phe Lys Val Gly Trp Ala Trp Trp Thr Cys
465 470 475 480
Ser Ala Pro Glu Lys Gly Trp Leu Ser Thr Tyr Ala Val Ala Leu His
485 490 495
Ser Thr Tyr Phe Pro Cys Phe Thr Ala Ala His Lys Tyr Gln Val Pro
500 505 510
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515 520 525
Lys Ala Arg Trp His Ser Leu Ile Lys Tyr Leu Lys Tyr Ala Thr Cys
530 535 540
Ser Arg Val Ile Phe Pro Leu Gln Glu Ala Tyr Ala Val Arg Ile Thr
545 550 555 560
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565 570 575
Arg Ala Gln Tyr Leu Ala Leu Lys Val Val Ser Asp Val Ala Met Ala
580 585 590
Lys Gln Asn Ser Arg Gly Asp Lys Gln Ala Leu Lys Tyr Lys Thr Lys
595 600 605
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625 630 635 640
Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ser Cys Cys Ala Ser Asp Val Arg Ser Gln
645 650 655
Gly Glu Asn Pro Thr Ala Asp Lys Gln Arg Gly Gly Lys Pro Pro Thr
660 665 670
Lys Ala
<210> 28
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 28
Met Ala Ile Gly Gly Asn Tyr Val His Leu Pro Leu Ser Ala Pro Gly
1 5 10 15
Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys Thr Ala Arg Asp Ile Ile Asn Glu
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Glu Ala Ala Asp Trp Ala Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ser Val Asp Glu
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Gln Ala Gln Leu Gly Leu Gln Lys Cys Val Arg Met Tyr Ala Arg Phe
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65 70 75 80
Leu Gly Val Asn Pro Ala Met Ala Glu Ala Leu Lys Glu Ala Leu Ala
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gln Ala Arg Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Ala Glu Gln
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Gly Gln Leu Arg Glu Ala Arg Gln Gln Asn Pro Ile Pro Val Gly Asn
225 230 235 240
Ile Ala Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Ala Asn Trp
245 250 255
Met Thr Gln Thr Leu Leu Ile Gln Asn Ala Leu Thr Ala Cys Gln Gly
260 265 270
Val Gly Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Gln Gln Arg Gly Pro Arg Lys
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Asp Ile Ala Gly Ala Gly Asn Ile Tyr Arg Arg Trp Ile Gln Leu
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340 345 350
Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Ala Gly Pro Gly Gln Lys Ala
355 360 365
Arg Leu Met Ala Glu Ala Arg Lys Pro Ile Lys Cys Trp Asn Cys Gly
370 375 380
Lys Ala Arg Trp Ile Ala Val Pro Thr Trp Arg Ile Pro Ala Lys Val
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Trp Lys Gln Trp Arg Arg Asp Asn Arg Ala Arg Ile Pro Glu Arg Leu
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Thr Tyr Phe Pro Cys Phe Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gln Val Pro Ser
500 505 510
Leu Gln Tyr Leu Ala Ala Asp Asn Arg Arg Gly Leu Arg Met Ala Lys
515 520 525
Gln Ala Trp His Ser Leu Ile Lys Tyr Leu Lys Tyr Lys Ala Cys Ser
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Arg Val Ile Phe Pro Leu Gln Glu Gly Ala Ala Val Arg Ile Thr Trp
545 550 555 560
Tyr Ser Lys Asn Phe Ala Thr Ala Gly Glu Val Arg Arg Ala Ile Arg
565 570 575
Gly Ala Tyr Leu Ala Leu Lys Val Val Ser Asp Val Arg Ala Ala Lys
580 585 590
Gln Asn Ser Arg Gly Asp Lys Gln Arg Ala Lys Tyr Lys Thr Lys Asp
595 600 605
Leu Gln Lys Val Cys Ala Gln Glu Gly Ser His Leu Glu Val Gln Gly
610 615 620
Tyr Ala Lys Asn Phe Trp Thr Asp Val Thr Pro Asn Tyr Ala Ile Arg
625 630 635 640
Gly Glu Gln Leu Leu Ser Cys Cys Arg Ala Asp Val Arg Ser Gln Gly
645 650 655
Glu Asn Pro Thr Trp Ala Lys Gln Arg Gly Gly Lys Pro Pro Thr Lys
660 665 670
Gly Ala
<210> 29
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 29
Met Ala Gly Gly Asn Tyr Val His Leu Pro Leu Ser Pro Ala Gly Phe
1 5 10 15
Gln Ala Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Ala Asp Ile Ile Asn Glu Glu
20 25 30
Ala Ala Asp Trp Asp Ala Ala Gly Thr Thr Ser Ser Val Asp Glu Gln
35 40 45
Ile Ala Leu Gly Leu Gln Lys Cys Val Arg Met Tyr Asn Ala Phe Tyr
50 55 60
Lys Ser Leu Arg Ala Glu Gln Thr Asp Ala Leu Val Leu Lys Gly Leu
65 70 75 80
Gly Val Asn Pro Thr Ala Ala Glu Ala Leu Lys Glu Ala Leu Ala Pro
85 90 95
Val Ala Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Ala Cys Thr
100 105 110
Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Ala Asp Trp Asp Leu Gln His
115 120 125
Pro Gln Pro Ala Pro Ala Glu Gln Ile Gln Trp Met Tyr Arg Gln Gln
130 135 140
Asn Ala Met Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Ala Gln Thr
145 150 155 160
Asp Ala Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Ala Asn Pro Thr Leu Glu Glu
165 170 175
Met Leu Thr Ala Cys Ala Ala Pro Val Pro Ile Pro Phe Ala Ala Ala
180 185 190
Gln Ala Trp Val Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Met Leu
195 200 205
Asn Cys Val Gly Asp His Gln Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gln Gln Gly
210 215 220
Gln Leu Arg Glu Pro Ala Gln Gln Asn Pro Ile Pro Val Gly Asn Ile
225 230 235 240
Tyr Ala Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Gln Ala Trp Met
245 250 255
Thr Gln Thr Leu Leu Ile Gln Asn Ala Ala Thr Ala Cys Gln Gly Val
260 265 270
Gly Gly Pro Gly Gln Ala Ala Ala Gln Gln Arg Gly Pro Arg Lys Pro
275 280 285
Ile Ala Lys Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Gln Ala
290 295 300
Ala Met Gln Ile Ile Arg Asp Ile Ile Ala Arg Glu Pro Ser Gly Ser
305 310 315 320
Asp Ile Ala Gly Thr Ala Asn Ile Tyr Arg Arg Trp Ile Gln Leu Gly
325 330 335
Leu Ala Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Gln Asn
340 345 350
Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Ala Pro Gly Gln Lys Ala Arg
355 360 365
Leu Met Ala Glu Ala Ala Lys Pro Ile Lys Cys Trp Asn Cys Gly Lys
370 375 380
Glu Ala Trp Ile Ala Val Pro Thr Trp Arg Ile Pro Glu Ala Val Cys
385 390 395 400
Tyr Val Pro His Phe Lys Val Gly Trp Ala Gly Tyr Trp His Leu Thr
405 410 415
Pro Glu Lys Gly Trp Ala Asn Tyr Ala Asp Ile Leu Leu His Ser Thr
420 425 430
Tyr Ala Cys Arg Phe Pro Arg Ala His Lys Tyr Gln Val Ala Thr Trp
435 440 445
Lys Gln Trp Arg Arg Asp Asn Arg Arg Ala Ile Pro Glu Arg Leu Glu
450 455 460
Arg Trp His Ser Leu Ala Val Gly Trp Ala Trp Trp Thr Cys Ser Arg
465 470 475 480
Val Ala Lys Gly Trp Leu Ser Thr Tyr Ala Val Arg Ile Ala Ser Thr
485 490 495
Tyr Phe Pro Cys Phe Thr Ala Gly Glu Ala Tyr Gln Val Pro Ser Leu
500 505 510
Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Asn Arg Arg Gly Leu Arg Met Ala Lys Gln
515 520 525
Asn Ala His Ser Leu Ile Lys Tyr Leu Lys Tyr Lys Thr Ala Ser Arg
530 535 540
Val Ile Phe Pro Leu Gln Glu Gly Ser Ala Val Arg Ile Thr Trp Tyr
545 550 555 560
Ser Lys Asn Phe Trp Ala Ala Gly Glu Val Arg Arg Ala Ile Arg Gly
565 570 575
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580 585 590
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Asn Pro Thr Trp Lys Ala Gln Arg Gly Gly Lys Pro Pro Thr Lys Gly
660 665 670
Ala Ala
<210> 30
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 30
Met Ala Gly Asn Tyr Val His Leu Pro Leu Ser Pro Arg Ala Phe Gln
1 5 10 15
Ala Leu Ser Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Ala Ile Ile Asn Glu Glu Ala
20 25 30
Ala Asp Trp Asp Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ser Val Asp Glu Gln Ile
35 40 45
Gln Ala Gly Leu Gln Lys Cys Val Arg Met Tyr Asn Pro Ala Tyr Lys
50 55 60
Ser Leu Arg Ala Glu Gln Thr Asp Ala Ala Val Leu Lys Gly Leu Gly
65 70 75 80
Val Asn Pro Thr Leu Ala Glu Ala Leu Lys Glu Ala Leu Ala Pro Val
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Pro Ala Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu Ala Thr Pro
100 105 110
Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Asn Cys Ala Trp Asp Leu Gln His Pro
115 120 125
Gln Pro Ala Pro Gln Ala Gln Ile Gln Trp Met Tyr Arg Gln Gln Asn
130 135 140
Pro Ala Tyr Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Ala Thr Asp
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Ala Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gln Ala Pro Thr Leu Glu Glu Met
165 170 175
Leu Thr Ala Cys Gln Ala Pro Val Pro Ile Pro Phe Ala Ala Ala Gln
180 185 190
Gln Ala Val Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys Phe Gly Ala Ala Leu Asn
195 200 205
Cys Val Gly Asp His Gln Ala Ala Met Ala Ala Pro Gln Gln Gly Gln
210 215 220
Leu Arg Glu Pro Ser Ala Gln Asn Pro Ile Pro Val Gly Asn Ile Tyr
225 230 235 240
Arg Ala Val Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Gln Ser Ala Met Thr
245 250 255
Gln Thr Leu Leu Ile Gln Asn Ala Asn Ala Ala Cys Gln Gly Val Gly
260 265 270
Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ala Gln Gln Arg Gly Pro Arg Lys Pro Ile
275 280 285
Lys Ala Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Ala Ala Ala
290 295 300
Met Gln Ile Ile Arg Asp Ile Ile Asn Ala Glu Pro Ser Gly Ser Asp
305 310 315 320
Ile Ala Gly Thr Thr Ala Ile Tyr Arg Arg Trp Ile Gln Leu Gly Leu
325 330 335
Gln Ala Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Ala Asn Ala
340 345 350
Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Lys Ala Gly Gln Lys Ala Arg Leu
355 360 365
Met Ala Glu Ala Leu Ala Pro Ile Lys Cys Trp Asn Cys Gly Lys Glu
370 375 380
Gly Ala Ile Ala Val Pro Thr Trp Arg Ile Pro Glu Arg Ala Cys Tyr
385 390 395 400
Val Pro His Phe Lys Val Gly Trp Ala Ala Tyr Trp His Leu Thr Pro
405 410 415
Glu Lys Gly Trp Leu Ala Tyr Ala Asp Ile Leu Leu His Ser Thr Tyr
420 425 430
Phe Ala Arg Phe Pro Arg Ala His Lys Tyr Gln Val Pro Ala Trp Lys
435 440 445
Gln Trp Arg Arg Asp Asn Arg Arg Gly Ala Pro Glu Arg Leu Glu Arg
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465 470 475 480
Ile Ala Gly Trp Leu Ser Thr Tyr Ala Val Arg Ile Thr Ala Thr Tyr
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595 600 605
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Asn Ala
<210> 31
<211> 2025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 31
atggcctacc ctgtgcagca gatcggaggc aattacgtgg ccggagctga ggtggtgcca 60
ggatttcagg ctctggccgc tatgcagatc atcagggaca tcatcaatga ggccccaagc 120
ggatctgaca tcgccggcac cacctctgcc tataggagat ggatccagct gggcctgcaa 180
aaggcccaga gctacgtgga taggttttat aaatccctgg ctgccaatcc tgactgcaaa 240
ctggtgctga aaggagctca gaaagctcgg ctgatggctg aggccctcaa ggctaattat 300
gtgcatctgc cactgtctcc caggacagcc caggccctgt ccgagggatg caccccttat 360
gacgccatca acgaggaggc cgctgactgg gatctccagg ctaccacatc ttccgtggat 420
gagcagatcc aatgggccct gcagaagtgc gtgagaatgt acaaccctac agctaaatct 480
ctgagagctg agcagaccga cgctgctgcc ctgaagggac tgggcgtgaa tccaacactc 540
gaagctgccc tgaaggaggc tctggctcct gtgcccatcg ctccccgcac actgaacgcc 600
tgggtgaagc tcatcgcccc ttacgacatc aaccagatgc tgaattgtgt ggctgatctg 660
cagcatccac agccagctcc tcaacaggcc atccagtgga tgtaccgcca gcagaaccct 720
atcgccaacc ccacaaatat cctggacgtg aaacaaggcg ccgacgccgc tgtgaagaac 780
tggatgaccc aaacagccac actggaggag atgctgaccg cttgtcaagg agccgtgcca 840
atccccttcg ccgctgccca gcaaagggcc aagctgatcg aggagaaaaa gttcggagcc 900
gaggccaatt gcgtggggga tcaccaggcc gccatgcaag cccctcagca gggacagctg 960
agggagccat ccggagctaa cccaatcccc gtgggaaata tctatagaag agccaaacag 1020
ggccctaagg agccattcca gtcctacgcc acccagacac tgctgatcca gaacgccaac 1080
cctgcctgtc agggagtggg aggacctgga cagaaggctg ctcagcagag gggaccaagg 1140
aaacctatca aatgcgccat ggaggaggag aaaaggtgga tcgccgtccc agccaccaag 1200
gacctgcaga aagtgtgcta tgtgcccgcc tcccacctgg aggtgcaggg atactggcac 1260
ctggcctgga ccgacgtgac acccaattac gctgacatcg ctgagcagct gctgtcctgc 1320
tgtaggtttc ccagagccag ccagggcgag aacccaacct ggaagcaatg ggcagccgtg 1380
ccaacctgga gaatccccga gaggctggcc tacgtgccac atttcaaagt ggggtgggca 1440
tgggcctggc atctgacccc tgagaaagga tggctcagcg ccgctgatat cctgctgcac 1500
tctacctact tccccgcctt tcctagagcc cataaatacc aggtgcccag cgccaagcag 1560
tggcggcgcg acaataggag aggcctggcc gagcggctgg agaggtggca ctccctgatt 1620
aaggcctggg cttggtggac atgttctaga gtcatcttcg cctggctgag cacctacgcc 1680
gtgagaatca cctgggccta tttcccttgc tttacagccg gcgaggtcag ggccgtgcca 1740
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agggctctga tcaagtacct gaagtataaa accaaagacg ccgtgatctt tccactgcag 1860
gagggatctc acctcgccat cacatggtat tctaagaact tctggacaga cgctgaggtg 1920
aggagagcta tcagggggga gcaactggcc ctgaaggtgg tgtccgatgt gcggagccaa 1980
ggcgctaact ccaggggcga taagcagagg ggaggcaaag cctga 2025
<210> 32
<211> 2025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 32
atggcccctg tgcagcagat cggaggcaat tatgtccatg ccgctgaggt ggtgccagga 60
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aggtttccta gggccgctca gggcgagaac ccaacctgga agcaatggag ggccgtgcca 1380
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gaggcttcca ggggcgataa gcagagggga gggaagcccg cctga 2025
<210> 33
<211> 2025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 33
atggccgtgc agcagatcgg aggcaattat gtgcacctgg ccgaggtggt gccaggattt 60
caggccctgt ctgaggccca gatcatcagg gacatcatca acgaggaagc cgccggatct 120
gacatcgccg gcaccacatc tagcgtggcc agatggatcc agctgggcct gcagaagtgt 180
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aacgccaggg gcgataagca gaggggaggg aaacctcctg cttga 2025
<210> 34
<211> 2025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 34
atggcccagc agatcggagg caattatgtg catctcccag ccgtggtgcc aggatttcag 60
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cagccagctc ctcagcaggg acaactggca atgtaccgcc agcagaaccc aatccccgtc 720
ggggccaata tcctggacgt gaaacagggc cctaaagagg ctgtgaagaa ctggatgacc 780
cagacactgc tcatcgccga gatgctgacc gcttgtcagg gagtgggcgg agctcccttc 840
gccgctgccc agcagagggg acccagggct gaggagaaaa agttcggagc tgaggtggtc 900
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gagccattcc agagctacgt ggacagggcc ctgctgatcc agaacgccaa tcctgactgt 1080
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cctagagccc acaaggccga gaacccaacc tggaagcagt ggcggcggga cgccacctgg 1380
agaatccccg agcggctgga gagatgggcc catttcaaag tggggtgggc ttggtggacc 1440
tgtgccaccc ctgagaaagg atggctgagc acctatgctg ctctgctgca ctctacctat 1500
ttcccttgct tcacagccgc ccataaatac caggtgccaa gcctgcaata tgcccggcgc 1560
gacaatagga gaggactgcg gatggcagcc gagaggtggc actccctgat caagtacctc 1620
aaggcttgga catgttctag agtgatcttt cctctgcaag ccacctacgc cgtgagaatc 1680
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tatctggctc tgaaggtggt gtctgatgcc cgcatggcca aacagaactc caggggcgac 1800
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cacctggagg tccaggccta ttctaagaac ttctggaccg acgtgactcc cgccagagct 1920
atcagggggg agcagctgct gtcttgcgcc gtgtccgatg tgcggagcca gggcgagaat 1980
ccagccggcg ataagcagag gggagggaaa cccccaacag cctga 2025
<210> 35
<211> 2025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 35
atggcccaga tcggaggcaa ttatgtgcat ctgcctctgg ccgtgccagg atttcaggcc 60
ctgtccgagg ggtgcgccat cagggacatc atcaacgagg aggccgccga cgccgacatc 120
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tggatgtacc ggcaggctgt gagaatgtac aaccccacaa atatcctcga cgctgctgag 480
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atcgaggaga agaaagccaa ccagatgctg aattgcgtgg gggatcatca agccccacag 660
ccagctcctc agcagggaca gctcagggcc taccgccagc agaacccaat ccccgtgggc 720
aatgctatcc tggacgtgaa acagggccct aaggaaccag ccaagaactg gatgacccag 780
acactgctga ttcaggccat gctgaccgct tgtcagggag tgggaggccc tgccttcgcc 840
gctgcccagc agaggggacc acggaaggcc gagaaaaagt tcggagctga ggtggtgcct 900
ggagccgatc accaggccgc tatgcagatc atcagagacg cccagctgag ggagccaagc 960
ggatctgaca ttgccgccgt gggaaatatc tataggagat ggatccaact ggctaaggag 1020
ccattccaga gctacgtgga tagatttgcc ctgatccaga acgccaatcc tgactgcaag 1080
ctggcaggag gacctggaca gaaagctcgg ctcatggccg ctccaaggaa acctatcaag 1140
tgctggaact gcggcgccaa aaggtggatc gccgtgccaa cctggaggat cgcccagaaa 1200
gtgtgctacg tgccacattt caaggtggcc gtgcagggat actggcatct gacccctgaa 1260
aaagctacac ccaattacgc tgatatcctg ctgcattctg cctcctgctg taggtttcct 1320
agagcccata agtacgccaa cccaacctgg aagcagtggc ggcgcgataa tgcatggaga 1380
atccccgagc ggctggagag atggcatgcc ttcaaagtgg ggtgggcttg gtggacatgc 1440
tctgctcctg agaaaggatg gctgagcacc tacgctgtgg ctctgcactc tacctatttc 1500
ccttgcttta ccgccgccca taaataccag gtgccaagcc tgcagtacct ggcccgcgac 1560
aataggagag gactgcgcat ggctaaagca aggtggcact ccctgatcaa gtacctgaaa 1620
tatgccacat gttctagagt gatctttcca ctccaggaag cctacgccgt gagaatcaca 1680
tggtattcta aaaacgcctt tacagccggc gaggtgagga gagctattag ggcccagtat 1740
ctggctctga aggtggtgtc cgacgtggcc atggccaaac agaactccag gggcgataaa 1800
caggctctga agtataaaac caaggacctg cagaaggtgg ctctgcagga gggatcccac 1860
ctggaggtgc aaggagcttc taagaacttc tggaccgacg tgacacctaa tgccgctatc 1920
aggggggagc agctgctgtc ctgttgtgcc tccgatgtgc ggagccaggg cgagaaccct 1980
accgctgata agcagagggg agggaaaccc cctaccaagg cctga 2025
<210> 36
<211> 2025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 36
atggccatcg gaggcaatta tgtgcatctg ccactctctg ccccaggatt tcaggccctg 60
tccgagggat gtacagccag ggacatcatc aacgaggagg ccgctgattg ggccatcgcc 120
ggcaccacat cttccgtgga tgaacaggcc cagctgggcc tgcagaagtg cgtgaggatg 180
tatgccaggt tttataaatc tctgagagct gagcaaaccg ctaaactggt gctgaaggga 240
ctgggcgtga acccagccat ggctgaggcc ctgaaggagg ctctggcacc tgccccactg 300
tctccccgca cactgaacgc ttgggtcgcc ggatgcaccc cttacgacat caaccaaatg 360
ctcgccgctg actgggatct gcagcatcca cagcctgctg ccgatgagca gatccagtgg 420
atgtaccgcc aacaggctag aatgtacaac cccacaaata tcctggatgt ggccgagcag 480
accgacgccg ctgtgaagaa ttggatggct gtgaatccaa cactggagga gatgctgaca 540
gctgctctgg ctcctgtgcc aatccccttc gccgcagccg ccgcctgggt gaagctgatc 600
gaggagaaaa aattcgccca gatgctgaat tgcgtggggg atcaccaagc cgctcagcca 660
gctcctcagc agggacagct gagagaggcc cgccagcaga acccaatccc cgtgggaaac 720
atcgccctgg acgtgaaaca gggccctaag gagcccttcg ctaactggat gacccagaca 780
ctgctgattc agaatgccct gaccgcttgt cagggagtgg gaggaccagg agccgccgct 840
gcccagcaga ggggaccaag gaagcctgct aaaaagttcg gagctgaggt ggtgccaggc 900
tttgcccacc aggccgctat gcagatcatc agggatatcg ctctgaggga gccaagcgga 960
tctgacatcg ctggcgccgg aaatatctat aggagatgga tccagctcgg cgctgagcca 1020
ttccagagct acgtggatag gttctatgcc atccagaacg ccaatcctga ctgcaaactc 1080
gtggctggac ctggacagaa agctcggctg atggccgagg ctaggaaacc tatcaagtgc 1140
tggaactgtg gaaaggccag gtggatcgcc gtgccaacct ggaggattcc cgccaaagtg 1200
tgctacgtgc cacatttcaa agtcggggcc cagggatact ggcatctgac ccctgagaag 1260
ggagctccca attacgctga tatcctgctg cactccaccg cttgctgtag gtttcctaga 1320
gcccataaat atcaggcacc aacctggaag cagtggcggc gcgacaacag ggccagaatc 1380
cccgagcggc tggagaggtg gcattccgcc aaagtggggt gggcttggtg gacatgttcc 1440
agagccgaga aaggatggct gagcacctac gccgtcagag ctcactctac ctatttccct 1500
tgctttacag ctggcgctaa ataccaggtg ccaagcctgc agtatctcgc tgctgacaat 1560
aggagaggac tgcgcatggc caagcaggct tggcactccc tgatcaagta cctgaagtac 1620
aaagcctgtt ctagagtgat ctttccactg caggaaggag ctgccgtgag aatcacatgg 1680
tattctaaga atttcgccac agccggcgag gtgaggagag ctatcagagg ggcctatctg 1740
gctctgaagg tggtgtccga tgtccgggcc gccaaacaga actccagggg cgataagcaa 1800
agggctaagt ataaaaccaa ggacctgcag aaagtctgcg cccaggaggg atcccacctg 1860
gaggtgcagg ggtacgccaa gaacttctgg accgacgtga cacccaacta cgctatcagg 1920
ggggagcagc tgctgtcctg ctgcagggct gatgtgcgga gccagggcga gaacccaaca 1980
tgggccaagc agaggggagg gaaaccccct acaaaaggcg cctga 2025
<210> 37
<211> 2025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 37
atggccggag gcaattatgt gcatctgcca ctgtcccccg ccggatttca ggccctgtcc 60
gagggatgca cacctgccga catcatcaac gaggaggccg ctgattggga cgccgccggc 120
accacatctt ccgtggatga gcaaatcgcc ctgggcctgc agaagtgcgt gagaatgtat 180
aacgcctttt ataaatctct gagagctgag cagactgacg ctctggtgct gaagggactg 240
ggcgtgaatc ccacagccgc tgaggccctg aaggaggctc tggctccagt ggccctgtct 300
ccccgcacac tgaacgcctg ggtcaaggcc tgcacccctt acgacatcaa ccagatgctc 360
aatgccgact gggatctgca gcatccacag ccagcccctg ctgagcagat ccagtggatg 420
taccgccagc aaaacgctat gtacaacccc acaaatatcc tggacgtcaa agcccagacc 480
gacgccgctg tgaagaactg gatgactgcc aatccaacac tggaggagat gctgaccgcc 540
tgtgccgctc ctgtgccaat ccccttcgcc gctgctcagg cctgggtgaa gctgatcgag 600
gagaaaaagt ttggagccat gctgaattgc gtgggggatc accaggcagc tgccccagct 660
cctcagcagg gacagctgag ggaaccagcc cagcagaacc caatccccgt gggaaatatt 720
tatgccgacg tgaaacaggg ccctaaggag ccatttcagg cttggatgac ccagacactg 780
ctgatccaga atgccgccac cgcttgtcag ggagtgggag gacctggcca ggccgctgcc 840
cagcagaggg gaccaaggaa acccattgcc aagttcggag ctgaggtggt gccaggattc 900
caggctcagg ccgctatgca gatcatcagg gacattatcg ctagggagcc aagcggatct 960
gacatcgccg ggaccgccaa tatctatagg agatggatcc agctgggact ggccccattc 1020
cagagctacg tggataggtt ttacaaagct cagaacgcca atcctgactg caaactggtc 1080
ctggctcctg gacagaaagc tcggctgatg gctgaagccg ctaaacctat caagtgctgg 1140
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tacgtgccac atttcaaagt gggatgggcc ggatactggc atctgacccc tgagaaaggg 1260
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cataaatatc aggtcgccac ctggaagcag tggcggcgcg acaatagaag agccatcccc 1380
gagcggctgg agaggtggca cagcctggca gtggggtggg cttggtggac atgttctagg 1440
gtggccaaag gatggctgag cacctacgcc gtgcggatcg cctctaccta tttcccttgc 1500
tttacagccg gggaggctta ccaggtgcca agcctgcagt atctggccct cgccaatagg 1560
agaggactgc gcatggccaa gcagaatgcc cactccctga tcaagtacct gaagtataag 1620
accgcttcta gagtgatctt tccactgcag gagggctccg ccgtgagaat cacatggtat 1680
tctaagaact tttgggctgc cggcgaggtg aggagagcta tcaggggaga ggcactggct 1740
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gagcagctgc tgtcctgctg tagatttgcc gtgcggagcc agggcgagaa cccaacatgg 1980
aaagctcaga ggggagggaa accccctaca aagggcgccg cctga 2025
<210> 38
<211> 2025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 38
atggccggca attatgtgca tctgccactg tctcctcgcg cctttcaggc cctgtccgag 60
ggatgcaccc catacgccat catcaacgag gaggccgctg actgggacct ggccggcacc 120
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gccgctgtga agaactggat gacacaggct ccaacactgg aggagatgct gaccgcttgc 540
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cagcagggac agctgaggga gcccagcgct cagaacccaa tccccgtggg aaatatctac 720
agggctgtga aacagggccc taaggagcca tttcagtccg ccatgaccca gacactgctg 780
atccagaacg ctaatgccgc ttgtcaggga gtgggaggac ctggccagaa ggccgcccag 840
cagaggggac caaggaaacc tattaaagcc ttcggagctg aggtggtgcc aggatttcaa 900
gccgctgccg ctatgcagat catcagggac atcattaacg ccgagccaag cggatctgac 960
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tgtggcaagg aaggggccat cgccgtgcca acctggagaa tccctgagag ggcctgctac 1200
gtgccacatt tcaaagtggg atgggccgcc tactggcatc tgacccctga gaaagggtgg 1260
ctcgcctacg ctgatatcct gctgcactct acctacttcg ccaggtttcc tagagcccat 1320
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cggctggaga ggtggcacag cctgattgcc gggtgggctt ggtggacatg ttctagagtc 1440
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acagccggcg aagtggccca ggtgccaagc ctgcagtatc tggctctcaa ggcaaggaga 1560
ggactgcgca tggccaaaca gaatagcgcc tccctgatca agtacctgaa gtataaaaca 1620
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ggggctaaaa ccaaggacct gcagaaagtg tgctatgtgg ctggatccca cctggaggtg 1860
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cagctgctgt cctgctgtag gttccctgcc cggagccagg gcgagaaccc aacctggaaa 1980
caggccaggg gagggaaacc ccctacaaag ggagctaacg cttga 2025
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 39
atatgcggcc gcgacgccac catggcctac cctgtgcagc ag 42
<210> 40
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 40
atatgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag gctttgcctc 60
ccctctgc 68
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 41
atatgcggcc gcgacgccac catggcccct gtgcagcaga tcg 43
<210> 42
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 42
atatgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag gcgggcttcc 60
ctcccctc 68
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 43
atatgcggcc gcgacgccac catggccgtg cagcagatcg gag 43
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 44
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tccctcccc 69
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工合成序列
<400> 45
atatgcggcc gcgacgccac catggcccag cagatcggag gc 42
<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 46
atatgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag gctgttgggg 60
gtttccctc 69
<210> 47
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 47
atatgcggcc gcgacgccac catggcccag atcggaggca attatg 46
<210> 48
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 48
atatgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag gccttggtag 60
ggggtttcc 69
<210> 49
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 49
atatgcggcc gcgacgccac catggccatc ggaggcaatt atg 43
<210> 50
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 50
atatgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag gcgccttttg 60
taggggg 67
<210> 51
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 51
atatgcggcc gcgacgccac catggccgga ggcaattatg tg 42
<210> 52
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 52
atatgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag gcggcgccct 60
ttgtagggg 69
<210> 53
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 53
atatgcggcc gcgacgccac catggccgga ggcaattatg tg 42
<210> 54
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 54
atatgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag gcggcgccct 60
ttgtagggg 69

Claims (15)

1.一种多肽，其包含相互连接的多种肽，所述多种肽具有抗原蛋白的氨基酸序列中包含的8～12残基的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，
所述8～12残基肽以与所述抗原蛋白中的顺序不同的顺序进行连接。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其实际上不包含所述抗原蛋白的13残基以上的连续的部分氨基酸序列。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽，其中，
所述多种肽的氨基酸序列可以重叠。
5.根据权利要求4所述的多肽，其中，
所述重叠为1～4残基。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的多肽，其中，
所述连接部可以分别具有间隔物。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中，
所述间隔物为1～4残基的氨基酸。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的多肽，其至少包含20种相互连接的所述8～12残基肽。
9.一种核酸，其编码权利要求1～8中任一项所述的多肽。
10.一种载体，其包含权利要求9所述的核酸。
11.根据权利要求10所述的载体，其是仙台病毒载体。
12.一种疫苗，其包含：权利要求1～8中任一项所述的多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸的载体。
13.根据权利要求12所述的疫苗，其中，
抗原蛋白源自人免疫缺陷病毒的抗原蛋白。
14.一种方法，其通过接种权利要求12或13所述的疫苗的工序来选择性地诱导靶抗原特异性CD8阳性T细胞。
15.一种方法，其是制造权利要求1所述的多肽或编码该多肽的核酸的方法，其中，
所述方法包含：
(i)将编码抗原蛋白的氨基酸序列分割为8～12残基的氨基酸序列的工序，其中，该分割氨基酸序列可以相互重叠或不重叠；
(ii)将该分割氨基酸序列以使其与该抗原蛋白的该氨基酸序列不同的方式进行连接的工序，其中，该分割氨基酸序列的各连接部中可以夹持或不夹持间隔物；
(iii)分别取得包含由工序(ii)得到的氨基酸序列的多肽或编码该多肽的核酸的工序。
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