JP2021519595A - 新規ｒｓｖ ｒｎａ分子及びワクチン接種用組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染又はそのような感染に関連する障害の治療及び／又は予防における使用に適した人工核酸、特に、人工ＲＮＡに関する。本発明は更に、障害又は疾患を治療又は予防する方法、人工ＲＮＡ、組成物、及びワクチンの第１及び第２の医学的使用に関する。更に、本発明は、人工ＲＮＡ、組成物、及びワクチンを含むキット、特に、キットオブパーツに関する。【選択図】なし

Description

序
本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染症又は係る感染症に関連する障害の治療又は予防における使用に好適な人工ＲＮＡに関する。特に、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つの異種非翻訳領域（ＵＴＲ）、好ましくは３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲと、ＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質、特に、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードするコード領域とを含む。前記人工ＲＮＡは、好ましくは、前記ＵＴＲエレメントに機能可能に連結されたコード領域の発現効率の上昇によって特徴付けられる。本発明はまた、ポリマー担体、ポリカチオン性タンパク質若しくはペプチド、又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と共に前記人工ＲＮＡを含む組成物及びワクチンに関する。更に、本発明は、前記人工ＲＮＡ又は組成物若しくはワクチンを含むキット、特に、キットオブパーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）に関する。本発明は更に、障害又は疾患を治療又は予防する方法、並びに人工ＲＮＡ、組成物、又はワクチンの第１及び第２の医学的使用に関する。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属のエンベロープ非セグメント化ネガティブ鎖ＲＮＡウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ）である。それは、生誕後、最初の年の小児における、細気管支炎と肺炎の最も一般的な原因である。ＲＳＶはまた、あらゆる年齢、特に高齢者、又は心臓、肺、又は免疫系が不全である人々の間で発生し得る重度の下気道疾患などの反復感染を引き起こす。現在、受動免疫が、特に未熟児、気管支肺異形成症、又は先天性心疾患の乳幼児において、ＲＳＶ感染によって引き起こされる重篤な病気を防ぐために用いられている。
ＲＳＶ細気管支炎の推奨される治療は、主に呼吸補助と水分補給とからなる。特定の抗ウイルス療法は推奨されていない。中和モノクローナル抗体パリビズマブは、重篤な感染のリスクが最も高い乳幼児の予防に使用されるが、非常に高価であり、広範な使用には実用的ではない。現在、認可／承認されたＲＳＶワクチンはなく、安全で効果的なＲＳＶワクチンの開発は、世界規模での公衆衛生の優先事項である。
１９６０年代のワクチン試験では、乳幼児と小児を、ホルマリンで不活化された全ビリオンＲＳＶ製剤（ＦＩＲＳＶ）又は同等のパラミクソウイルス製剤（ＦＩＰＩＶ）で免疫感作した。ＦＩ−ＰＩＶで免疫感作した後、次のＲＳＶシーズン中にＲＳＶに自然感染した被験者の５％が入院し、ＦＩ−ＲＳＶで免疫感作した後、ＲＳＶに感染した被験者の８０％が入院し、２名の小児が死亡した。ワクチン接種によるＲＳＶ感染の上昇は、ＲＳＶ感染症に対するワクチン開発の具体的な問題である。
したがって、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症は、先進国において、未充足の幼児用ワクチンのニーズが最も大きく、世界的にも重要な未充足幼児用ワクチンのニーズがある。４０年間を超える努力にもかかわらず、未だ、ヒトに対して認可されたＲＳＶワクチンは得られていない。
前記したヒト化モノクローナル抗体パリビズマブにもかかわらず、強力な免疫応答を誘発する生弱毒化ワクチンウイルスが開発されたが、特定の標的群（乳幼児、小児、高齢者、及び免疫不全患者）における使用は推奨されていない。また、Ｂ細胞エピトープを有するＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するＤＮＡベクターを使用して、中和抗体の産生を誘導した。この文脈において、特許文献１及び特許文献２は、ワクチンとしての使用のためのＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを開示している。しかし、ワクチンとしてのＤＮＡの使用は、ゲノムへの不所望の挿入により危険である場合があり、機能的な遺伝子の阻害や癌、又は抗ＤＮＡ抗体の形成に至ることがある。
特許文献３は、ＲＳＶ抗原性ペプチドと、融合タンパク質Ｆ、糖タンパク質Ｇ、短い疎水性タンパク質ＳＨ、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、ラージポリメラーゼＬ、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、リンタンパク質Ｐ、非構造タンパク質ＮＳ１、又は非構造タンパク質ＮＳ２から選択されるタンパク質とをコードするＲＮＡ配列、及び皮内投与に適したプロタミン複合体化ＲＮＡを含む抗原性組成物を開示する。
特許文献４は、ＲＳＶ抗原性ペプチドと、糖タンパク質Ｆ及び糖タンパク質Ｇから選択されるタンパク質とをコードするＲＮＡを含み、前記ＲＮＡが脂質ナノ粒子中にあるワクチンを開示する。
上に引用した幾つかのアプローチとは別に、ＲＳＶ感染症の予防又は治療のための効率的なワクチンに対する充足されていない医学的ニーズが依然として存在する。
国際公開第２００８／０７７５２７号 国際公開第９６／０４０９４５号 国際公開第２０１５／０２４６６８号 国際公開第２０１７／０７０６２２号
したがって、ＲＳＶの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする新規人工ＲＮＡ、及びＲＳＶ感染症のための予防又は治療、特に乳幼児、新生児、妊娠女性、高齢者、及び免疫不全患者における予防又は治療のためのワクチンとしての使用のための前記ＲＮＡを含む組成物／ワクチンを提供することが、根底にある発明の課題である。
更に、ＲＮＡベースの組成物又はワクチンが以下の有利な特徴の幾つかを有することが望ましい。
− 注射部位（例えば、筋肉など）でのＲＮＡ構築物の翻訳の改善
− 非常に低用量の投与計画での、コードされた抗原性ペプチド又はタンパク質に対するＲＳＶ抗原特異的免疫応答の非常に効率的な誘導
− 母体免疫感作に対する好適性
− 乳幼児及び／又は新生児のワクチン接種に対する好適性
− 筋肉内投与に対する好適性
− ＲＳＶ特異的な機能的体液性免疫応答の誘導
− ＲＳＶ特異的なＢ細胞記憶の誘導
− ＲＳＶに対する免疫防御のより速い開始
− ＲＳＶに対する誘導免疫応答の寿命
− ＲＳＶに対する広範な細胞Ｔ細胞応答の誘導
− （局所的及び一過性の）炎症誘発性環境の誘導
− ワクチン適用後の全身性サイトカイン又はケモカイン応答の誘導がない
− 十分な耐容性、副作用がない、無毒である
− ワクチン接種によるＲＳＶ感染の増強がない
− ワクチンの有利な安定性特性
− ＲＳＶワクチン製造のスピード、適応性、簡便性、スケーラビリティ
上に概説した課題は、特許請求する主題によって解決することができる。
定義
明確さ及び読み易さのために、以下の定義を提供する。これらの定義について言及された技術的特徴は、本発明の各実施形態で読むことができる。これらの実施形態の文脈において、更なる定義及び説明が具体的に提供されることがある。
数の文脈におけるパーセンテージは、各項目の総数に対するものとして理解されたい。他の場合、及び特段の断りがない限り、パーセンテージは重量パーセンテージ（ｗｔ．−％）として理解されたい。
適応免疫応答：本明細書で使用される「適応免疫応答」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、免疫系（適応免疫系）の抗原特異的応答を意味することが意図される。抗原特異性は、特定の病原体又は病原体に感染した細胞に合わせた応答の生成を可能にする。これらの調整された応答をもたらす能力は、通常、「記憶細胞」（Ｂ細胞）によって体内で維持される。本発明の文脈において、抗原は、少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする人工ＲＮＡコード配列によって提供される。
抗原：本明細書で使用される「抗原」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、免疫系、好ましくは適応免疫系によって認識され得、抗原特異的免疫応答を、例えば、適応免疫応答の一部としての抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞の生成によって誘発することができる物質を意味することが意図される。典型的には、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチド又はタンパク質であり得る又は含み得る。また、例えば、少なくとも１つのエピトープを含むＲＳＶ Ｆタンパク質に由来するペプチド又はタンパク質の断片、バリアント、及び誘導体は、本発明の文脈において抗原と理解される。本発明の文脈において、抗原は、本明細書で特定される、提供された人工ＲＮＡの翻訳産物であり得る。
抗原性ペプチド又はタンパク質：「抗原性ペプチド又はタンパク質」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、体の適応免疫系を刺激して適応免疫応答を提供し得る（抗原性）タンパク質／ポリタンパク質に由来するペプチド、タンパク質（又はポリタンパク質）を意味することが意図される。したがって、「抗原性ペプチド又はタンパク質」は、それが由来するタンパク質（例えば、本発明の文脈では、ＲＳＶペプチド又はタンパク質、好ましくはＲＳＶ Ｆタンパク質又はそのバリアント）の少なくとも１つのエピトープ（本明細書にて定義）又は抗原（本明細書にて定義）を含む。
人工核酸：本明細書で使用される「人工核酸」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、天然に存在しない人工核酸を意味することが意図される。人工核酸は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ及びＲＮＡ部分を含むハイブリッド分子であり得る。典型的には、人工核酸は、ヌクレオチドの所望の人工配列（異種配列）に対応するように遺伝子工学的方法によって設計及び／又は生成され得る。この文脈では、人工配列は、通常、天然には存在し得ない配列であり、即ち、野生型配列と少なくとも１つのヌクレオチドが異なる。本明細書で使用される「野生型」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、天然に存在する配列を意味することが意図される。更に、「人工核酸」という用語は、「１つの単一分子」を意味することに制限されず、典型的には、本質的に同一の分子の集合を含むと理解される。
人工ＲＮＡ：本明細書で使用される「人工ＲＮＡ」という用語は、天然には存在しないＲＮＡを意味することが意図される。換言すれば、人工ＲＮＡは非天然の核酸分子と理解され得る。そのようなＲＮＡ分子は、その個々の配列（これは天然には存在しない、例えば、Ｇ／Ｃ含量が改変されたコード配列、ＵＴＲ）により、及び／又は他の改変、例えば天然には存在しないヌクレオチドの構造修飾により、非天然であり得る。典型的には、人工ＲＮＡは、ヌクレオチドの所望の人工配列（異種配列）に対応するように遺伝子工学的方法によって設計及び／又は生成され得る。これに関連して、人工ＲＮＡ配列は、通常、天然には存在し得ない配列であり、即ち、野生型配列とは少なくとも１ヌクレオチド異なる。「人工ＲＮＡ」という用語は、「１つの単一分子」を意味することに制限されず、典型的には、本質的に同一の分子の集合を含むと理解される。したがって、それは、アリコート又はサンプルに含まれる複数種の本質的に同一のＲＮＡ分子に関し得る。本発明の文脈において、本発明のＲＮＡは、本明細書で定義される人工ＲＮＡである。
カチオン性：具体的な文脈から別の意味が明らかでない限り、「カチオン性」という用語は、それぞれの構造が、恒久的又は非恒久的に、ｐＨなどの特定の条件に応じて正電荷を帯びていることを意味する。したがって、「カチオン性」という用語は、「恒久的にカチオン性である」及び「カチオン化可能である」の両方を包含する。
カチオン化可能：本明細書で使用される「カチオン化可能」という用語は、化合物又は基若しくは原子が、それが置かれた環境のより低いｐＨでは正に帯電し、より高いｐＨでは帯電しないことを意味する。また、ｐＨ値を決定できない非水環境では、カチオン化可能な化合物、基、又は原子は、水素イオン濃度が高いと正に帯電し、水素イオン濃度又は水素イオン活量が低いと帯電しない。それは、カチオン化可能又はポリカチオン化可能化合物の個々の特性、特に、それぞれのカチオン化可能基又は原子のｐＫａに依存し、そのｐＨ又は水素イオン濃度で、それは帯電又は非帯電である。希釈された水性環境では、正電荷を有するカチオン化可能な化合物、基、又は原子の割合は、当業者に周知のいわゆるヘンダーソン−ハッセルバルヒ方程式を使用して推定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、化合物又は部分がカチオン化可能である場合、それは、約１〜９、好ましくは４〜９、５〜８、又は更に６〜８、より好ましくは、９未満、８未満、７未満のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ値、例えば約７．３〜７．４、即ち生理学的条件下、特にインビボでの細胞の生理学的塩条件下で正に帯電しすることが好ましい。他の実施形態では、カチオン化可能な化合物又は部分は、生理学的ｐＨ値、例えば、約７．０〜７．４で主に中性であるが、より低いｐＨ値で正に帯電することが好ましい。いくつかの実施形態では、カチオン化可能な化合物又は部分のｐＫａの好ましい範囲は、約５〜約７である。
コード配列／コード領域：本明細書で使用される「コード配列」又は「コード領域」という用語及び対応する略称「ｃｄｓ」は、当業者によって認識及び理解され、例えば、ペプチド又はタンパク質に翻訳される得るいくつかのヌクレオチドトリプレットの配列を意味することが意図される。本発明の文脈におけるコード配列は、開始コドンで始まり、好ましくは終止コドンで終結する、３で除することができるいくつかのヌクレオチドからなるＲＮＡ配列であることが好ましい。
組成物：本発明の文脈において、「組成物」は、特定の成分（例えば、ＬＮＰと会合する本発明の人工ＲＮＡ）が、任意の更なる構成成分、通常、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に含有され得る任意のタイプの組成物を意味する。したがって、組成物は、粉末又は顆粒などの乾燥組成物、又は凍結乾燥形態又は錠剤などの固体単位であってよい。或いは、組成物は液体形態であってもよく、各構成成分は、溶解又は分散した（例えば、懸濁又は乳化した）形態で独立して含有されてもよい。
化合物：本明細書で使用されるとき、「化合物」は、本質的に同一の化学構造及び性質を有する分子からなる材料である化学物質を意味する。低分子化合物の場合、分子は通常、それらの原子組成及び構造配置が同一である。高分子又は高分子化合物の場合、化合物の分子は非常に類似しているが、それらの全てが必ずしも同一ではない。例えば、５０個のモノマー単位からなると記述されたポリマーのセグメントは、例えば、４８個又は５３個のモノマー単位で個々の分子を含むこともある。
由来する：核酸に関連して本明細書全体で使用される用語「由来する」、即ち、（別の）核酸に「由来」の核酸について、（別の）核酸に由来する核酸は、それが由来する核酸と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、より好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、更により好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、特に好ましくは少なくとも９８％、９９％の配列同一性を共有する。当業者は、配列同一性が、典型的には、同一タイプの核酸について、即ち、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列について計算されることを理解している。したがって、ＤＮＡがＲＮＡに「由来する」場合、又はＲＮＡがＤＮＡに「由来する」場合、第１の工程で、ＲＮＡ配列を対応するＤＮＡ配列に変換する（特に、配列全体において、ウラシル（Ｕ）をチミジン（Ｔ）で置換する）、又は反対に、ＤＮＡ配列を対応するＲＮＡ配列に変換する（特に、配列全体において、チミジン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）で置換する）。その後、ＤＮＡ配列の配列同一性又はＲＮＡ配列の配列同一性が決定される。好ましくは、核酸に「由来する」核酸は、それが由来する核酸と比較して、例えば、ＲＮＡの安定性を更に向上させるために、及び／又はタンパク質産生を延長及び／又は増加させるために、修飾されている核酸も意味する。言うまでもなく、そのような修飾は、それが由来する核酸と比較して、ＲＮＡの安定性を損なわないことが好ましい。アミノ酸配列（例えば、抗原性ペプチド又はタンパク質）の文脈において、「由来する」という用語は、（別の）アミノ酸配列（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質）に由来するアミノ酸配列が、それが由来するアミノ酸配列と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、より好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、更により好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、特に好ましくは少なくとも９８％、９９％の配列同一性を共有することを意味する。
したがって、抗原性ペプチド又はタンパク質がＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に「由来する」場合、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質に「由来する」抗原性ペプチド又はタンパク質は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のバリアント又は断片、例えば、Ｆ０（完全長前駆体）、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３（本明細書にて記載）を表し得ることが理解される。更に、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質に「由来する」抗原性ペプチド又はタンパク質（例えば、Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３）は、上で定義されるように、アミノ酸配列が異なることがあり、特定の同一性パーセンテージを共有する。抗原性ペプチド又はタンパク質が「由来する」ことがあるＲＳＶ Ｆタンパク質の好適な更なる例を表１に示す。
エピトープ：本明細書で使用される「エピトープ」（当技術分野では「抗原決定基」とも呼ばれる）という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープを意味することが意図される。抗原性ペプチド又はタンパク質のＴ細胞エピトープ又は一部は、好ましくは約６〜約２０、更にはそれ以上のアミノ酸の長さを有する断片、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子によって処理及び提示された断片であり、好ましくは約８〜約１０、例えば、８、９、又は１０アミノ酸（更には１１又は１２アミノ酸）、又はＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理及び提示された断片であり、好ましくは約１３〜約２０、更にはそれ以上のアミノ酸の長さを有する断片（これらの断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択され得る）を含み得る。これらの断片は通常、ペプチド断片とＭＨＣ分子からなる複合体の形でＴ細胞によって認識される。即ち、断片は通常、ネイティブな形で認識されない。Ｂ細胞エピトープは、典型的には（ネイティブ）タンパク質又はペプチド抗原の外表面に位置する断片であり、好ましくは５〜１５アミノ酸、より好ましくは５〜１２アミノ酸、更により好ましくは６〜９アミノ酸を有し、抗体によって認識され得る（即ち、ネイティブな形態である）。タンパク質又はペプチドのそのようなエピトープは更に、そのようなタンパク質又はペプチドの本明細書中に言及されるバリアントのいずれかから選択することができる。この文脈において、抗原決定基は、本明細書に定義されるタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、三次元構造においては同一部分を形成する、本明細書に定義されるタンパク質又はペプチドのセグメントから構成される立体配座又は不連続エピトープであることができる、又は単一のポリペプチド鎖から構成される連続的又は線形のエピトープであることができる。本発明の文脈において、エピトープは、本明細書で特定されるように、提供される人工ＲＮＡの翻訳産物であり得る。
断片：核酸配列又はアミノ酸配列の文脈において本明細書全体で使用される「断片」という用語は、典型的には、例えば、核酸配列又はアミノ酸配列の完全長配列のより短い部分であり得る。したがって、断片は、典型的には、完全長配列内の対応する一続きと同一である配列からなる。本発明の文脈における配列の好ましい断片は、断片が由来する分子中のエンティティの連続する一続きに対応するヌクレオチド又はアミノ酸などのエンティティの連続する一続きからなり、断片が由来する全（即ち、完全長）分子（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質）の少なくとも５％、１０％、２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。タンパク質又はペプチドに関連して本明細書全体で使用される「断片」という用語は、通常、本明細書に定義されるタンパク質又はペプチドの配列を含むことができ、これは、元の（ネイティブの）タンパク質（又はそのコードされた核酸分子）のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端及び／又はＣ末端がトランケートされた、そのアミノ酸配列（又はそのコードされた核酸分子）に関するものである。したがって、そのようなトランケーションは、アミノ酸レベル又は対応する核酸レベルのいずれかで起こり得る。したがって、本明細書で定義されるそのような断片に関する配列同一性は、好ましくは、本明細書で定義されるタンパク質又はペプチド全体、又はそのようなタンパク質又はペプチドの（コード）核酸分子全体をに言及し得る。抗原との関連で、そのような断片は、約６〜約２０、又はそれ以上のアミノ酸の長さを有し得る。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子によって処理及び提示された断片であり、好ましくは約８〜約１０アミノ酸の長さ、例えば、８、９、又は１０アミノ酸（又は６、７、１１、又は１２アミノ酸）の長さを有する、又はＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理及び提示された断片であり、好ましくは約１３以上のアミノ酸の長さ、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のアミノ酸の長さを有する。これらの断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択することができる。これらの断片は、通常、ペプチド断片とＭＨＣ分子とからなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される。即ち、断片は、通常、ネイティブの形態では認識されない。タンパク質又はペプチドの断片（例えば、抗原の文脈における）は、それらのタンパク質又はペプチドの少なくとも１つのエピトープを含み得る。更にまた、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、又は膜貫通ドメインなどのタンパク質のドメイン、及びタンパク質の短縮された又はトランケートされたバージョンは、タンパク質の断片を含むと理解することができる。
異種：核酸配列又はアミノ酸配列の文脈において本明細書全体で使用される「異種」又は「異種配列」という用語は、配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸）を意味することが当業者によって認識及び理解され、別の遺伝子、別の対立遺伝子、別の種に由来する配列を意味することが意図される。２つの配列が同一遺伝子又は同一対立遺伝子に由来することができない場合、これらは、通常、「異種」であると理解される。即ち、異種配列は、同一生物から由来可能であり得るが、それらは天然に（自然界において）同一核酸分子（例えば、同一ＲＮＡ）又は同一タンパク質内には存在しない。
体液性免疫応答：「体液性免疫」又は「体液性免疫応答」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、Ｂ細胞媒介性抗体産生及び任意に抗体産生に伴う付随プロセスを意味することが意図される。体液性免疫応答は、典型的には、例えば、Ｔｈ２活性化とサイトカイン産生、胚中心形成とアイソタイプスイッチング、親和性成熟と記憶細胞生成などによって特徴付けることができる。体液性免疫はまた、典型的には、病原体及び毒素の中和、古典的な補体活性化、並びに食作用及び病原体排除のオプソニン促進を含む、抗体のエフェクター機能を意味し得る。
（配列の）同一性：核酸配列又はアミノ酸配列の文脈において本明細書全体を通して使用される「同一性」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、２つの配列が同一であるパーセンテージを意味することが意図される。２つの配列、例えば、本明細書で定義される核酸配列又はアミノ酸配列、好ましくは本明細書で定義される人工核酸配列によってコードされるアミノ酸配列又はアミノ酸配列それ自体が同一であるパーセンテージを決定するために、前記配列を、後に互いに比較するためにアラインメントさせることができる。したがって、例えば、第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と比較され得る。第１の配列のある位置が、第２の配列のある位置における場合と同一コンポーネント（残基）で占有されている場合、２つの配列はこの位置で同一である。そうではない場合、配列はこの位置で異なる。第１の配列と比較して第２の配列に挿入が生じた場合、第１の配列にギャップを挿入して、更なるアラインメントを行うことができる。第１の配列と比較して第２の配列に欠失が生じた場合、第２の配列にギャップを挿入して、更なるアラインメントを行うことができる。２つの配列が同一であるパーセンテージは、同一の位置の数を、１つの配列においてのみ占有される位置を含む位置の総数で除する関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを使用して決定できる。使用できる数学的アルゴリズムの好ましいが限定されない例は、ＢＬＡＳＴプログラムに統合されたアルゴリズムである。このプログラムにより、本発明の配列とある程度同一である配列を同定することができる。
免疫原、免疫原性：「免疫原」又は「免疫原性」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、免疫応答を刺激／誘導することができる化合物を意味することが意図される。好ましくは、免疫原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。本発明の意味における免疫原は、本明細書で定義されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド、タンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む、提供される人工核酸、好ましくはＲＮＡの翻訳産物である。通常、免疫原は、適応免疫応答を誘導する。
免疫応答：「免疫応答」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（いわゆる特異的又は適応的免疫応答）、自然免疫系の非特異的反応（いわゆる非特異的又は自然免疫応答）、又はそれらの組合せを意味することが意図される。
免疫系：「免疫系」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、生物を感染から保護し得る生物の系を意味することが意図される。病原体が生物の物理的障壁を通過することに成功し、この生物に侵入すると、自然免疫系は、即時ではあるが非特異的な応答をもたらす。病原体がこの自然応答を回避しても、脊椎動物は第２の保護層である適応免疫系を有する。ここで、免疫系は感染中にその応答に適応して、病原体の認識を改善する。次いで、この改善された応答は、病原体が排除された後も免疫学的記憶の形態で保持され、この病原体に遭遇するたびに適応免疫系がより速くより強力な攻撃を開始できるようにする。これによれば、免疫系は、自然免疫系と適応免疫系を含む。これらの２つの部分のそれぞれは、通常、いわゆる体液性成分と細胞性成分とを含む。
自然免疫系：「自然免疫系」（非特異的（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）又は非特異的（ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ）免疫系としても知られる）という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、典型的には、他の生物による感染から宿主を非特異的に防御する細胞とメカニズムを含む系を意味することが意図される。これは、自然な系の細胞が病原体を広く認識して応答することができることを意味するが、適応免疫系とは異なり、長期間続く防御免疫を宿主に付与しない。自然免疫系は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、又はリポ多糖、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０リガンド、又はサイトカイン、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、又はケモカイン、ＩＬ−１〜ＩＬ−３３、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、成長因子、及びｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体のリガンド（例えば、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０）、マウスＴｏｌｌ様受容体のリガンド（例えば、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３）、ＮＯＤ様受容体のリガンド、ＲＩＧ−Ｉ様受容体のリガンド、免疫刺激性核酸、免疫刺激性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ、抗菌剤、又は抗ウイルス剤などの他の補助物質によって活性化され得る。
リピドイド化合物：リピドイド化合物（単にリピドイドとも呼ばれる）は、脂質様化合物、即ち、脂質様物理的性質を有する両親媒性化合物である。本発明の文脈において、脂質という用語は、リピドイド化合物を包含すると考える。
一価ワクチン、一価組成物：「一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）ワクチン」、「一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）組成物」、「一価（ｕｎｉｖａｌｅｎｔ）ワクチン」、又は「一価（ｕｎｉｖａｌｅｎｔ）組成物」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、ウイルス由来の１つの抗原のみを含む組成物又はワクチンを意味することが意図される。したがって、前記ワクチン又は組成物は、単一の生物に対する単一の抗原をコードする唯一のＲＮＡ種を含む。「一価ワクチン」という用語は、一価に対する免疫化を含む。本発明の文脈において、一価のＲＳＶワクチン又は組成物は、１つの特定のＲＳＶ（例えば、ＲＳＶ Ｆ）に由来する１つの単一の抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする人工ＲＮＡを含む。
核酸：「核酸」又は「核酸分子」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子を意味することが意図される。核酸分子という用語は、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。これは、ポリヌクレオチドという用語と同義に使用されることが好ましい。好ましくは、核酸又は核酸分子は、ヌクレオチドモノマーを含む又はからなるポリマーであり、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合されている。「核酸分子」という用語は、本明細書で定義される、塩基修飾、糖修飾、又は骨格修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子などの修飾された核酸分子も包含する。
核酸配列／ＲＮＡ配列／アミノ酸配列：「核酸配列」、「ＲＮＡ配列」、又は「アミノ酸配列」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、それぞれ、そのヌクレオチド又はアミノ酸の連続する特定且つ個別の順序を意味することが意図される。
恒久的カチオン性：本明細書で使用される「恒久的カチオン性」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、それぞれの化合物又は基若しくは原子が任意のｐＨ値又はそれが置かれた環境の水素イオン活量で正に帯電していることを意味する。通常、正帯電は、４級窒素原子の存在に起因する。化合物が複数のそのような正電荷を有するとき、それを、恒久的カチオン性のサブカテゴリである恒久的ポリカチオン性と呼ぶことがある。
薬学的有効量：「薬学的有効量」又は「有効量」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、薬学的効果、本発明の文脈においては免疫応答（例えば、本明細書で定義される抗原性ペプチド、タンパク質、ポリタンパク質に対する）などを誘導するのに十分である化合物（例えば、本発明の人工ＲＮＡ）の量を意味することが意図される。
多価（Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ワクチン、多価／多価組成物：「多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）ワクチン」、「多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）組成物」、「多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ワクチン」、又は「多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）組成物」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、ウイルスの１種超の株に由来する抗原を含む組成物又はワクチン、同一ウイルスの異なる抗原を含む組成物又はワクチン、又はそれらの任意の組合せを意味することが意図される。これらの用語は、前記ワクチン又は組成物が１超の価数を有することを記述する。本発明の文脈において、多価ＲＳＶワクチンは、いくつかの異なるＲＳＶ株に由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする人工ＲＮＡを含むワクチン、同一ＲＳＶ株由来の異なる抗原をコードする人工ＲＮＡを含むワクチン、又はそれらの組合せを含む。好ましい実施形態では、多価ＲＳＶワクチン又は組成物は、ＲＳＶの少なくとも１つの異なる抗原性ペプチド又はタンパク質（例えば、ＲＳＶ Ｆ及びＲＳＶ Ｍ又はＲＳＶ Ｆ及びＲＳＶ Ｎ）をコードする１超、好ましくは２、３、４、又はそれ以上の異なる人工ＲＮＡ種を含む。多価ｍＲＮＡワクチンを製造する方法は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０８２４８７又は公開された国際公開第２０１７／１０９０１３４Ａ１号に開示されている。
「安定化された核酸分子」又は「安定化されたＲＮＡ」：「安定化された核酸分子」又は「安定化されたＲＮＡ」という用語は、環境要因又は酵素消化（例えば、エキソ又はエンドヌクレアーゼ分解など）による崩壊又は分解に対して、修飾されていない核酸分子よりも安定であるように修飾された核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子を意味する。本発明の文脈において、好ましくは安定化された核酸分子、例えば安定化されたＲＮＡは、原核細胞又は真核細胞などの細胞中で、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞中で安定化される。安定化効果は、細胞外、例えば緩衝溶液などにおいて、例えば、安定化された核酸分子を含む医薬組成物の製造プロセスにおいても発揮されることがある。
Ｔ細胞応答：本明細書で使用される「細胞性免疫」又は「細胞性免疫応答」又は「細胞性Ｔ細胞応答」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、抗原に対する、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、及び各種サイトカインの放出を意味することが意図される。より一般的に言えば、細胞性免疫は抗体ではなく、免疫系の細胞の活性化に基づく。典型的には、細胞性免疫応答は、例えば、細胞、例えば、外来抗原のエピトープをその表面に提示する、樹状細胞又は他の細胞のような特定の免疫細胞などにアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することにより、特徴付けることができる。本発明の文脈において、抗原は、ＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードし、好適にＴ細胞応答を誘導する人工ＲＮＡによって提供される。本発明の人工ＲＮＡ、組成物、ワクチンは、ＲＳＶ Ｆ抗原に対する細胞Ｔ細胞応答の誘発に有利である。
（配列の）バリアント：核酸配列の文脈において本明細書全体で使用される「バリアント」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、核酸配列の基礎を形成する核酸配列のバリアントを意味することが意図される。例えば、バリアント核酸配列は、バリアントが由来する核酸配列と比較して、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び／又は置換を伴い得る。好ましくは、核酸配列のバリアントは、バリアントが由来する核酸配列と、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、バリアントは機能的バリアントである。核酸配列の「バリアント」は、そのような核酸配列の１０、２０、３０、５０、７５、又は１００個の一続きのヌクレオチドに亘って、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のヌクレオチド同一性を有してもよい。
タンパク質又はペプチドに関して本明細書全体で使用される「バリアント」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、１以上の置換、挿入、及び／又は欠失されたアミノ酸など１以上変異において、元の配列と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドバリアントを意味することが意図される。好ましくは、これらの断片及び／又はバリアントは、完全長ネイティブタンパク質と比較して、例えば、その特異的抗原特性など、同一の生物学的機能又は特異的活性を有する。本発明の文脈で定義されるタンパク質又はペプチドの「バリアント」は、それらのネイティブの配列、即ち変異していない生理学的な配列と比較して、保存的アミノ酸置換を含み得る。それらのアミノ酸配列及びそれらをコードするヌクレオチド配列は、特に、本明細書で定義されるバリアントという用語に該当する。同一クラスに由来するアミノ酸が互いに交換される置換は、保存的置換と呼ばれる。特に、これらは、脂肪族側鎖、正又は負に帯電した側鎖、側鎖又はアミノ酸中の芳香族基を有するアミノ酸であり、その側鎖は、水素結合に入ることができる、例えば、ヒドロキシル機能を有する側鎖である。このことは、例えば極性側鎖を有するアミノ酸は、同様に極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換される、又は、例えば、疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸は、同様に疎水性側鎖を有する別のアミノ酸で置換される（例えば、セリン（スレオニン）をトレオニン（セリン）で置換する、又はロイシン（イソロイシン）をイソロイシン（ロイシン）で置換する）。挿入及び置換は、特に、三次元構造に変化を引き起こさない、又は結合領域に影響を及ぼさない配列位置で行うことができる。挿入又は欠失による３次元構造に対する変化は、例えば、ＣＤスペクトル（円偏光二色性スペクトル）を使用して容易に決定できる。タンパク質又はペプチドの「バリアント」は、そのようなタンパク質又はペプチドの１０、２０、３０、５０、７５、又は１００個のアミノ酸の一続きに亘って、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有することができる。好ましくは、タンパク質のバリアントは、タンパク質の機能的バリアントを含み、これは、バリアントが、それが由来するタンパク質と同一の効果又は機能性を発揮することを意味する。
３’−非翻訳領域、３’−ＵＴＲエレメント、３’−ＵＴＲ：「３’−非翻訳領域」又は「３’−ＵＴＲエレメント」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、コード配列の３’（即ち、「下流」）に位置し、典型的にはタンパク質に翻訳されない核酸分子の一部を意味することが意図される。通常、３’−ＵＴＲは、ｍＲＮＡのコード配列（ｃｄｓ）とポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの一部である。本発明の文脈において、３’−ＵＴＲという用語はまた、人工ＲＮＡが転写されるＤＮＡテンプレートにコードされないが、成熟中の転写後に付加されるポリ（Ａ）配列などのエレメントを含んでもよい。
５’−非翻訳領域、５’−ＵＴＲエレメント、５’−ＵＴＲ：「５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、コード配列の５’（即ち、「上流」）に位置し、タンパク質に翻訳されない核酸分子の一部を意味することが意図される。５’−ＵＴＲは、通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のコード配列の５’に位置するｍＲＮＡの特定のセクションであると理解される。通常、５’−ＵＴＲは転写開始部位で始まり、コード配列の開始コドンの１ヌクレオチド前で終わる。好ましくは、５’−ＵＴＲは、２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチドを超える長さを有する。５’−ＵＴＲは、遺伝子発現を制御するためのエレメントを含むことがあり、これは調節エレメントとも呼ばれる。そのような調節エレメントは、例えば、リボソーム結合部位であり得る。５’−ＵＴＲは、例えば、５’キャップの付加によって、転写後に修飾することができる。
５’−末端オリゴピリミジントラクト（ＴＯＰ）、ＴＯＰ−ＵＴＲ：「５’−末端オリゴピリミジントラクト（ＴＯＰ）」という用語は、核酸分子の５’−末端領域、例えば、特定のｍＲＮＡ分子の５’−末端領域又は特定の遺伝子の機能的エンティティ（例えば、転写領域）の５’−末端領域などに位置するピリミジンヌクレオチドの一続きとして理解されるべきである。この配列は、通常、転写開始部位に対応するシチジンで始まり、通常は約３〜３０個の一続きのピリミジンヌクレオチドが続く。例えば、ＴＯＰは、３〜３０個又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。一続きのピリミジン、即ち、５’−ＴＯＰは、ＴＯＰの下流にある最初のプリンヌクレオチドの５’側の１ヌクレオチドで終わる。５’−末端オリゴピリミジントラクトを含むメッセンジャーＲＮＡは、ＴＯＰ ｍＲＮＡと呼ばれることが多い。したがって、そのようなメッセンジャーＲＮＡを提供する遺伝子は、ＴＯＰ遺伝子と呼ばれる。「ＴＯＰモチーフ」又は「５’−ＴＯＰモチーフ」という用語は、上で定義した５’−ＴＯＰに対応する核酸配列として理解すべきである。したがって、本発明の文脈におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、３〜３０ヌクレオチドの長さを有する一続きのピリミジンヌクレオチドである。好ましくは、ＴＯＰモチーフは、少なくとも３個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも４個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも５個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも８個のピリミジンヌクレオチドからなり、一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、その５’−末端においてシトシンヌクレオチドで始まる。ＴＯＰ遺伝子及びＴＯＰ ｍＲＮＡでは、ＴＯＰモチーフは、好ましくは、その５’−末端において転写開始部位で始まり、前記遺伝子又はｍＲＮＡの最初のプリン残基の５’側の１ヌクレオチドで終わる。本発明の意味におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、５’−ＵＴＲを表す配列の５’−末端、又は５’−ＵＴＲをコードする配列の５’−末端に位置する。したがって、好ましくは、３個以上のピリミジンヌクレオチドの一続きは、この一続きが、人工核酸、人工核酸の５’−ＵＴＲエレメント、又は本明細書に記載のＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列などの各配列の５’−末端に位置する場合、本発明の意味において「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれる。換言すると、好ましくは、５’−ＵＴＲ又は５’−ＵＴＲエレメントの５’−末端ではなく、５’−ＵＴＲ又は５’−ＵＴＲエレメントの内部に位置する３個以上のピリミジンヌクレオチドの一続きは、「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれない。いくつかの実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲエレメントの核酸配列は、その３’−末端において、それが由来する遺伝子又はＲＮＡの開始コドン（例えば、Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の位置にあるヌクレオチドで終わる。したがって、５’−ＵＴＲエレメントは、タンパク質コード配列のいかなる部分も含まない。したがって、好ましくは、少なくとも１つの核酸配列、特にＲＮＡ配列のタンパク質コード部分は、コード配列によってのみ提供される。
発明の簡単な説明
本発明は、本発明の人工ＲＮＡによってコードされる呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つのペプチド又はタンパク質が、哺乳動物細胞において効率的に発現され得るという本発明者の驚くべき知見に基づく。更に予想外なことには、本発明者らは、本発明の人工ＲＮＡが、例えば、特異的な機能的及び防御的免疫応答をコットンラットにおいて誘導できることを示した（例えば、実施例２、３を参照）。ＲＳＶ Ｆ抗原設計の様々な最適化により、免疫応答を更に改善することができた。更に、好適な異種５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と好適な異種３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を選択することにより、人工核酸ＲＮＡによってコードされるＲＳＶ Ｆ抗原の発現を上昇させることができた（例えば、実施例４を参照）。有利なことに、有利な３’−ＵＴＲ／５’−ＵＴＲの組合せを含む本発明の前記人工ＲＮＡは、コードされたＲＳＶ Ｆに対する非常に効率的な抗原特異的免疫応答を誘導する。更に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に含有される本発明の人工ＲＮＡは、非常に低い用量の投与計画でＲＳＶ Ｆに対する抗原特異的免疫応答を非常に効率的に誘導する（例えば、実施例３を参照）。更に、例えば、実施例８及び実施例１２は、更なる抗原をコードする更なる人工ＲＮＡを含む組成物／ワクチンを提供し、更なる抗原をコードする前記人工ＲＮＡは、Ｔ細胞応答を好適に誘導又は増強し、Ｔｈ１バイアス免疫応答をもたらし、これは、潜在的なＲＳＶワクチンの重要な前提条件（Ｔｈ２バイアス応答は、動物モデルにおいて呼吸器疾患の亢進（ＥＲＤ）と関連している）であると考えられる。更に、組成物は、Ｔ細胞応答を誘導するのに適している。したがって、人工ＲＮＡ、及び本発明の前記人工ＲＮＡを含む組成物／ワクチンは、哺乳動物対象においてＲＳＶ Ｆに対する免疫応答を誘発するのに適している。したがって、人工ＲＮＡ及び前記人工ＲＮＡを含む組成物／ワクチンは、ワクチンとしての使用、例えば、ヒトのワクチンとしての使用、例えば、妊娠女性又は乳幼児のためのワクチンとしての使用に適している。
第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／又は少なくとも１つの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）と、前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結され、ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド若しくはタンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列とを含む人工核酸、好ましくは人工ＲＮＡを提供する。
好ましい実施形態においては、前記人工ＲＮＡは、ＡＬＢ７遺伝子、アルファ−グロビン遺伝子、ＰＳＭＢ３、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１、及びＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲ、又はこれらの遺伝子のいずれかのホモログ、断片、又はバリアントに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。
好ましい実施形態においては、前記人工ＲＮＡは、ＲＰＬ３２遺伝子、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４Ｂ、及びＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’−ＵＴＲ、又はこれらの遺伝子のいずれかのホモログ、断片、又はバリアントに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。
好適には、本発明の人工ＲＮＡは、ａ−１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）、ａ−２（Ｎｄｕｆａ４／ＰＳＭＢ３）、ａ−３（ＳＬＣ７Ａ３／ＰＳＭＢ３）、ａ−４（ＮＯＳＩＰ／ＰＳＭＢ３）、ａ−５（ＭＰ６８／ＰＳＭＢ３）、ｂ−１（ＵＢＱＬＮ２／ＲＰＳ９）、ｂ−２（ＡＳＡＨ１／ＲＰＳ９）、ｂ−３（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＲＰＳ９）、ｂ−４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＡＳＰ１）、ｂ−５（ＮＯＳＩＰ／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｃ−１（ＮＤＵＦＡ４／ＲＰＳ９）、ｃ−２（ＮＯＳＩＰ／ＮＤＵＦＡ１）、ｃ−３（ＮＤＵＦＡ４／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｃ−４（ＮＤＵＦＡ４／ＮＤＵＦＡ１）、ｃ−５（ＡＴＰ５Ａ１／ＰＳＭＢ３）、ｄ−１（Ｒｐｌ３１／ＰＳＭＢ３）、ｄ−２（ＡＴＰ５Ａ１／ＣＡＳＰ１）、ｄ−３（ＳＬＣ７Ａ３／ＧＮＡＳ）、ｄ−４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＮＤＵＦＡ１）、ｄ−５（Ｓｌｃ７ａ３／Ｎｄｕｆａ１）、ｅ−１（ＴＵＢＢ４Ｂ／ＲＰＳ９）、ｅ−２（ＲＰＬ３１／ＲＰＳ９）、ｅ−３（ＭＰ６８／ＲＰＳ９）、ｅ−４（ＮＯＳＩＰ／ＲＰＳ９）、ｅ−５（ＡＴＰ５Ａ１／ＲＰＳ９）、ｅ−６（ＡＴＰ５Ａ１／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｆ−１（ＡＴＰ５Ａ１／ＧＮＡＳ）、ｆ−２（ＡＴＰ５Ａ１／ＮＤＵＦＡ１）、ｆ−３（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｆ−４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＧＮＡＳ）、ｆ−５（ＭＰ６８／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｇ−１（ＭＰ６８／ＮＤＵＦＡ１）、ｇ−２（ＮＤＵＦＡ４／ＣＡＳＰ１）、ｇ−３（ＮＤＵＦＡ４／ＧＮＡＳ）、ｇ−４（ＮＯＳＩＰ／ＣＡＳＰ１）、ｇ−５（ＲＰＬ３１／ＣＡＳＰ１）、ｈ−１（ＲＰＬ３１／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｈ−２（ＲＰＬ３１／ＧＮＡＳ）、ｈ−３（ＲＰＬ３１／ＮＤＵＦＡ１）、ｈ−４（Ｓｌｃ７ａ３／ＣＡＳＰ１）、ｈ−５（ＳＬＣ７Ａ３／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｉ−１（ＳＬＣ７Ａ３／ＲＰＳ９）、ｉ−２（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）、又はｉ−３（α−グロビン遺伝子）から選択される３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲに機能可能に連結されるＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含み、ａ−１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）、ａ−４（ＮＤＵＦＡ４／ＰＳＭＢ３）、ｃ−１（ＮＤＵＦＡ４／ＲＰＳ９）、ｅ−４（ＮＯＳＩＰ／ＲＰＳ９）、ｇ−２（ＮＤＵＦＡ４／ＣＡＳＰ１）、ｉ−２（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）、又はｉ−３（アルファ−グロビン）が特に好ましい。
ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、完全長Ｆタンパク質（「Ｆ０」、ａａ １−５７４と呼ばれる）又はＣ末端を欠失させたＦタンパク質（「Ｆ−ｄｅｌ」、ａａ １−５５３）、又はその断片若しくはバリアントであることができる。
少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、コンフォメーション前状態（ｐｒｅ−ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ）／融合前コンフォメーション（ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で、抗原又はその断片若しくはバリアント又は機能的バリアント（「ＤＳＣａｖ１」、例えば、「Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１」又は「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１」と呼ばれる）を安定化させる変異、好ましくはＤＳＣａｖ１変異（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌ）を更に含むことができる。
少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、タンパク質の安定性を高めるためにリンカー（ＧＳ）を介して結合された、成熟Ｆの２個のサブユニットＦ１及びＦ２を１本の鎖に含む融合タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）；Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３））であることができる。
成熟Ｆの２個のサブユニットを１本の鎖に含むタンパク質（「Ｆ２−リンカー−Ｆ１」と呼ばれる）、例えば、（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）；Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３）は、ＤＳＣａｖ１変異（本明細書では「ｍｕｔ０」と呼ばれる）を更に含むことができる。
成熟Ｆの２個のサブユニットを１本の鎖に含むタンパク質（「Ｆ２−リンカー−Ｆ１」と呼ぶ）は、ＤＳＣａｖ１変異に加えて、プロトマー間ジスルフィド結合を促進する少なくとも１つの更なる変異を含むことができ、これらの変異は、（Ｓ４６Ｇ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ；本明細書では、「ｍｕｔ１」と呼ぶ）、（Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ；本明細書では、「ｍｕｔ２」と呼ぶ）、又は（Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ；本明細書では、「ｍｕｔ３」と呼ぶ）、（Ａ１４９Ｃ、Ｙ４５８Ｃ；本明細書では、「ｍｕｔ４」と呼ぶ）、（Ｎ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ；本明細書では、「ｍｕｔ５」と呼ぶ）、（Ｑ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ｌ９５Ｍ、Ｓ２１５Ｐ、Ｉ２１７Ｐ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ、Ｋ４６５Ｑ；本明細書では、「ｍｕｔ６」と呼ぶ）、（Ｑ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｌ９５Ｍ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ、本明細書中では、「ｍｕｔ７」と呼ぶ）、又は（Ｎ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ４６５Ｑ；本明細書では、「ｍｕｔ８」と呼ぶ）又はその断片若しくはバリアント、又は機能的バリアントから選択することができる。
本発明の人工ＲＮＡによってコードされるＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０から好ましく選択することができる。
少なくとも１つのコード配列は、配列番号６８、４８３、８９８、１２６７、１６３６、２００５、２３７４、２７４３、３１１２、３４８１、３８５０、４２１９、４５８８、４９５７、５３２６、５６９５、６０６４、６４３３、６８０２、７１７１、７５４０、７９０９、８２７９〜９６８３、１１７２６、１２０９５、１２４６４、１２８３３、１３９４０、１４３０９、１４６７８、１５０４７、１５４１６、１５７８５、１３２０２、１３５７１、１６１５４、１６５２３、１６８９２、１７２６１、１７６３０、１７９９９、１８３６８、１８７３７、１９１０６、１９４７５のいずれか又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一であるアミノ酸配列又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列の少なくとも１つをコードすることができる。
好ましくは、人工ＲＮＡは、配列番号６９〜７７、４８４〜４９２、８９９〜９０６、１２６８〜１２７５、１６３７〜１６４４、２００６〜２０１３、２３７５〜２３８２、２７４４〜２７５１、３１１３〜３１２０、３４８２〜３４８９、３８５１〜３８５８、４２２０〜４２２７、４５８９〜４５９６、４９５８〜４９６５、５３２７〜５３３４、５６９６〜５７０３、６０６５〜６０７２、６４３４〜６４４１、６８０３〜６８１０、７１７２〜７１７９、７５４１〜７５４８、７９１０〜７９１７、２１３６３〜２１３８４、１１７２７〜１１７３４、１２０９６〜１２１０３、１２４６５〜１２４７２、１２８３４〜１２８４１、１３９４１〜１３９４８、１４３１０〜１４３１７、１４６７９〜１４６８６、１５０４８〜１５０５５、１５４１７〜１５４２４、１５７８６〜１５７９３、１３２０３〜１３２１０、１３５７２〜１３５７９、１６１５５〜１６１６２、１６５２４〜１６５３１、１６８９３〜１６９００、１７２６２〜１７２６９、１７６３１〜１７６３８、１８０００〜１８００７、１８３６９〜１８３７６、１８７３８〜１８７４５、１９１０７〜１９１１４、１９４７６〜１９４８３、２１３８９〜２１４１０のいずれか又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一であるコード配列又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるコード配列を含むことができる。
人工ＲＮＡは、Ｃ最大化コード配列、ＣＡＩ最大化コード配列、ヒトコドン使用適合化コード配列、Ｇ／Ｃ含量改変コード配列、及びＧ／Ｃ最適化コード配列、又はそれらの任意の組合せから選択されるコドン改変コード配列を含むことができる。
人工ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、又はレプリコンＲＮＡであることができる。好ましい実施形態では、人工ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
人工ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、キャップ構造、ポリ（Ａ）配列、ポリ（Ｃ）配列、ヒストンステムループ、及び／又は３’−末端配列エレメントから選択される少なくとも１つを更に含むことができる。
本発明の人工ＲＮＡは、好ましくは、下記からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる：配列番号７８〜４８２、１１７３５〜１２０９４、２１４１５〜２１４１７、２１５６１〜２１５６３、２１４８９、２１４９０、２１６３５、２１６３６又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ０をコードする）、配列番号４９３〜８９７、１２１０４〜１２４６３、２１４１８〜２１４２０、２１５６４〜２１５６６、２１４９１、２１４９２、２１６３７、２１６３８又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌをコードする）、配列番号９０７〜１２６６、１２４７３〜１２８３２、２１４２１〜２１４２３、２１５６７〜２１５６９、２１４９３〜２１４９５、２１６３９〜２１６４１又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１をコードする）、配列番号１２７６〜１６３５、８２７８、１２８４２〜１３２０１、２１４２４〜２１４２６、２１５７０〜２１５７２、２１４９６〜２１４９８、２１６４２〜２１６４４又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１をコードする）、配列番号１６４５〜２００４、１３９４９〜１４３０８、２１４３３〜２１４３５、２１５７９〜２１５８１、２１５０５〜２１５０７、２１６５１〜２１６５３又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１をコードする）、配列番号２０１４〜２３７３、１４３１８〜１４６７７、２１４３６〜２１４３８、２１５８２〜２１５８４、２１５０８〜２１５１０、２１６５４〜２１６５６又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１をコードする）、配列番号２３８３〜２７４２、１４６８７〜１５０４６、２１４３９〜２１４４１、２１５８５〜２１５８７、２１５１１〜２１５１３、２１６５７〜２１６５９又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２をコードする）、配列番号２７５２〜３１１１、１５０５６〜１５４１５、２１４４２〜２１４４４、２１５８８〜２１５９０、２１５１４〜２１５１６、２１６６０〜２１６６２又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２をコードする）、配列番号３１２１〜３４８０、１５４２５〜１５７８４、２１４４５〜２１４４７、２１５９１〜２１５９３、２１５１７〜２１５１９、２１６６３〜２１６６５又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３をコードする）、配列番号３４９０〜３８４９、１５７９４〜１６１５３、２１４４８〜２１４５０、２１５９４〜２１５９６、２１５２０〜２１５２２、２１６６６〜２１６６８又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３をコードする）、配列番号３８５９〜４２１８、１３２１１〜１３５７０、２１４２７〜２１４２９、２１５７３〜２１５７５、２１４９９〜２１５０１、２１６４５〜２１６４７又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０をコードする）、配列番号４２２８〜４５８７、１３５８０〜１３９３９、２１４３０〜２１４３２、２１５７６〜２１５７８、２１５０２〜２１５０４、２１６４８〜２１６５０又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０をコードする）、配列番号４５９７〜４９５６、１６１６３〜１６５２２、２１４５１〜２１４５３、２１５９７〜２１５９９、２１５２３〜２１５２５、２１６６９〜２１６７１又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４をコードする）、配列番号４９６６〜５３２５、１６５３２〜１６８９１、２１４５４〜２１４５６、２１６００〜２１６０２、２１５２６〜２１５２８、２１６７２〜２１６７４又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４をコードする）、配列番号５３３５〜５６９４、１６９０１〜１７２６０、２１４５７〜２１４５９、２１６０３〜２１６０５、２１５２９〜２１５３１、２１６７５〜２１６７７又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５をコードする）、配列番号５７０４〜６０６３、１７２７０〜１７６２９、２１４６０〜２１４６２、２１６０６〜２１６０８、２１５３２〜２１５３４、２１６７８〜２１６８０又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５をコードする）、配列番号６０７３〜６４３２、１７６３９〜１７９９８、２１４６３〜２１４６５、２１６０９〜２１６１１、２１５３５〜２１５３７、２１６８１〜２１６８３又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６をコードする）、配列番号６４４２〜６８０１、１８００８〜１８３６７、２１４６６〜２１４６８、２１６１２〜２１６１４、２１５３８〜２１５４０、２１６８４〜２１６８６又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６をコードする）、配列番号６８１１〜７１７０、１８３７７〜１８７３６、２１４６９〜２１４７１、２１６１５〜２１６１７、２１５４１〜２１５４３、２１６８７〜２１６８９又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７をコードする）、配列番号７１８０〜７５３９、１８７４６〜１９１０５、２１４７２〜２１４７４、２１６１８〜２１６２０、２１５４４〜２１５４６、２１６９０〜２１６９２又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７をコードする）、配列番号７５４９〜７９０８、１９１１５〜１９４７４、２１４７５〜２１４７７、２１６２１〜２１６２３、２１５４７〜２１５４９、２１６９３〜２１６９５又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８をコードする）、又は配列番号７９１８〜８２７７、１９４８４〜１９８４３、２１４７８〜２１４８０、２１６２４〜２１６２６、２１５５０〜２１５５２、２１６９６〜２１６９８又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアント（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８をコードする）。
第２の態様において、本発明は、第１の態様の人工ＲＮＡを含む組成物を提供する。
好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡを含む組成物は、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１タンパク質、及び／又はリンタンパク質Ｐ、又はそれらの組合せから選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡを含む。
マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、及び／又はリンタンパク質Ｐは、好適なＴ細胞抗原であり、対象に投与したときに、組成物又はワクチンの効率的なＴ細胞応答を促進する。
更なる人工ＲＮＡは、配列番号９６８５〜９６９２、１０１３５〜１０１４２、１０６３８〜１０６４５、１１１８４〜１１１９１、２１３８５〜２１３８８、１９８４５〜１９８５２、２０２１４〜２０２２１、２０５８３〜２０５９０、２０９５２〜２０９５９、２１４１１〜２１４１４のいずれか又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントのいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるコード配列を含むことができる。
好適には、前記更なる人工ＲＮＡは、配列番号９６９３〜１００５２、１０１４３〜１０５０２、１０６４６〜１１００５、１１１９２〜１１５５１、１９８５３〜２０２１２、２０２２２〜２０５８１、２０５９１〜２０９５０、２０９６０〜２１３１９、２１４８１〜２１４８８、２１６２７〜２１６３４、２１５５３〜２１５６０、２１６９９〜２１７０６又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントから選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる。
好適には、組成物は、１以上の脂質と複合体化、カプセル化、又は会合して脂質ナノ粒子を形成する本発明の人工ＲＮＡを含むことができる。
組成物は、好ましくは、１以上の脂質と複合体化して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成する本発明の人工ＲＮＡを含み、ＬＮＰは、下記：
（ｉ）本明細書で定義される少なくとも１つのカチオン性脂質、好ましくは式（ＩＩＩ）の脂質、より好ましくは脂質ＩＩＩ−３；
（ｉｉ）本明細書で定義される中性脂質、好ましくは１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
（ｉｉｉ）本明細書で定義されるステロイド又はステロイド類似体、好ましくはコレステロール；及び
（ｉｖ）本明細書で定義されるＰＥＧ−脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−ｃＤＭＡ、好ましくは式（ＩＶａ）のＰＥＧ化脂質；
から本質的になり、
（ｉ）から（ｉｖ）は、約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％ＰＥＧ−脂質のモル比である。
本発明はまた、前記人工ＲＮＡ又は前記組成物を含むＲＳＶワクチンに関する。
本発明はまた、ＲＳＶによる感染症の治療又は予防における人工ＲＮＡ、組成物、及びワクチンの使用に関する。
特に、本発明は、ＲＳＶによる感染症又はそのような感染症に関連する障害の治療又は予防における人工ＲＮＡ、組成物、及びワクチンの使用に関する。
本発明は更に、対象における障害又は疾患を治療又は予防する方法、人工ＲＮＡ、組成物、及びワクチンの第１及び第２の医学的使用に関する。更に、本発明は、人工ＲＮＡ、組成物、及びワクチンを含むキット、特にキットオブパーツに関する。
発明の詳細な説明
本願は、本願の説明の一部である電子フォーマットの配列表と共に提出される（ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５）。この出願と共に提出された配列表の電子フォーマットに含まれる情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で「配列番号」に言及する場合、それぞれの識別子を有する配列表の対応する核酸配列又はアミノ酸（ａａ）配列が言及される。多くの配列について、配列表は、例えば、特定の構造上の特徴、配列の最適化、ＧｅｎＢａｎｋ識別子に関する追加の詳細情報、又はそのコード能力に関する追加の詳細情報も提供する。特に、そのような情報は、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５配列表の数値識別子＜２２３＞で与えられる。したがって、前記数値識別子＜２２３＞の下に提供される情報は、その全体が本明細書に明示的に含まれ、根底にある発明の説明の不可欠な部分として理解されるべきである。
人工核酸：
第１の態様では、本発明は、
ａ）少なくとも１つの異種５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び／又は少なくとも１つの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）と；
ｂ）前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結され、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド若しくはタンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列とを含む人工核酸に関する。
第１の態様の好ましい実施形態においては、本発明は、
ａ）少なくとも１つの異種５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び／又は少なくとも１つの異種３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）と；
ｂ）前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結され、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド若しくはタンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列とを含む人工ＲＮＡ、好ましくはワクチン接種に適したＲＮＡを提供する。
一般に、本発明のＲＮＡは、タンパク質コード領域、並びに５’−及び／又は３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）から構成され得る。３’−ＵＴＲは、その配列及びサイズが可変であり、終止コドンとポリ（Ａ）テールとの間に存在する。重要なこととしては、３’−ＵＴＲ配列は、ＲＮＡのターンオーバー、安定性、及び局在化を決定するいくつかの調節モチーフを有し、転写後調節の多くの側面を司っている。ＲＮＡの医学用途（例えば、免疫療法用途、ワクチン接種など）では、ＲＮＡのタンパク質への翻訳の調節は、治療の安全性と有効性にとって非常に重要である。本発明者らは、驚くべきことに、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲの特定の組合せが協調して作用して、ＲＳＶ抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする機能可能に連結された核酸配列の発現を相乗的に増強することを見出した。本発明のＵＴＲの組合せを有する人工ＲＮＡ分子は、ＲＳＶ Ｆに由来する大量のＲＳＶ抗原性ペプチド又はタンパク質の迅速且つ一過性の発現を可能にする点で有利である。したがって、本明細書に提供される人工ＲＮＡは、ＲＳＶに対するワクチン接種をはじめとする、インビボでの各種用途に特に有用且つ好適である。
好適には、人工ＲＮＡは、少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲ及び／又は少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲを含むことができる。この文脈において、本発明のＵＴＲは、任意の天然に存在する遺伝子又はその断片、ホモログ、若しくはバリアントの５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる。好ましくは、本発明の５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲは、ＲＳＶ Ｆに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列に対して異種である。好適な異種５’−ＵＴＲ又は異種３’−ＵＴＲは、（ＲＳＶには由来しない）天然に存在する遺伝子に由来する。他の実施形態においては、合成的に操作された５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲを、本発明の文脈において使用することができる。
好ましい実施形態では、少なくとも１つの人工ＲＮＡは、少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲを含む。
好ましくは、少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲは、脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又は脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’−ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含む又はからなる。
好ましくは、本発明の人工ＲＮＡは、半減期が延びたＲＮＡに関する（安定なＲＮＡを提供する）遺伝子に由来し得る３’−ＵＴＲ、例えば、以下に定義し説明する３’−ＵＴＲを含む。
好ましくは、少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲは、好ましくは安定なｍＲＮＡをコードする遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又は前記遺伝子のホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する核酸配列を含む。
第１の態様の好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲを含み、前記少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲは、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、アルファ−グロビン（「ｍｕａｇ」と呼ぶ）、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１、及びＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はこれらの遺伝子のいずれかのホモログ、断片、又はバリアントに由来する核酸配列を含む。
ＡＬＢ７由来の３’−ＵＴＲ：好ましい実施形態においては、３’−ＵＴＲは、脊椎動物アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する又はそのバリアントに由来する、好ましくは哺乳動物アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する又はそのバリアントに由来する、より好ましくはヒトアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する又はそのバリアントに由来する、更により好ましくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する又はそのホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する核酸配列を含む又はからなる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＡＬＢ７遺伝子に由来する３’−ＵＴＲを含むことができ、ＡＬＢ７遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲは、配列番号３５又は３６と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
アルファ−グロビン遺伝子由来の３’−ＵＴＲ：好ましい実施形態においては、３’−ＵＴＲは、脊椎動物アルファ−グロビン遺伝子（「ｍｕａｇ」と呼ぶ）の３’−ＵＴＲに由来する又はそのバリアントに由来する、好ましくは哺乳動物アルファ−グロビン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する又はそのバリアントに由来する、より好ましくはヒトアルファ−グロビン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する又はそのバリアントに由来する、更により好ましくはヒトアルファ−グロビン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる。したがって、本発明のＲＮＡは、アルファ−グロビン遺伝子に由来する３’−ＵＴＲを含むことができ、アルファ−グロビン遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲは、配列番号３７又は３８と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＰＳＭＢ３由来の３’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、プロテアソームサブユニットベータタイプ３（ＰＳＭＢ３）タンパク質をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲを含むことができる。そのような３’−ＵＴＲは、好ましくは、プロテアソームサブユニットベータタイプ３（ＰＳＭＢ３）遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又は好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトのプロテアソームサブユニットベータタイプ３（ＰＳＭＢ３）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒトプロテアソームサブユニットベータタイプ３（ＰＳＭＢ３）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ４９７２０、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１８３）に対応するプロテアソームサブユニットベータタイプ３（ＰＳＭＢ３）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＰＳＭＢ３遺伝子に由来する３’−ＵＴＲを含むことができ、ＰＳＭＢ３遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲは、配列番号２３又は２４と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＣＡＳＰ１由来の３’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、カスパーゼ−１（ＣＡＳＰ１）タンパク質をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲを含むことができる。そのような３’−ＵＴＲは、好ましくは、カスパーゼ−１（ＣＡＳＰ１）遺伝子の３’−ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトのカスパーゼ−１（ＣＡＳＰ１）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなる。したがって、本発明のＲＮＡは、ＣＡＳＰ１遺伝子に由来する３’−ＵＴＲを含むことができ、ＣＡＳＰ１遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲは、配列番号２５又は２６と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＣＯＸ６Ｂ１由来の３’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット６Ｂ１（ＣＯＸ６Ｂ１）タンパク質をコードするＣＯＸ６Ｂ１遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲを含むことができる。そのような３’−ＵＴＲは、好ましくは、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット６Ｂ１（ＣＯＸ６Ｂ１）遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトのシトクロムｃオキシダーゼサブユニット６Ｂ１（ＣＯＸ６Ｂ１）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒトシトクロムｃオキシダーゼサブユニット６Ｂ１（ＣＯＸ６Ｂ１）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ１４８５４、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１６６）に対応するシトクロムｃオキシダーゼサブユニット６Ｂ１（ＣＯＸ６Ｂ１）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＣＯＸ６Ｂ１遺伝子に由来する３’−ＵＴＲを含むことができ、ＣＯＸ６Ｂ１遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲは、配列番号２７又は２８と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＧＮＡＳ由来の３’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）タンパク質をコードするＧＮＡＳ遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲを含むことができる。そのような３’−ＵＴＲは、好ましくは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物のグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒトグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ６３０９２、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１５３）に対応するグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＧＮＡＳ遺伝子に由来する３’−ＵＴＲを含むことができ、ＧＮＡＳ遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲは、配列番号２９又は３０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＮＤＵＦＡ１由来の３’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１アルファサブコンプレックスサブユニット１（ＮＤＵＦＡ１）タンパク質をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲを含むことができる。そのような３’−ＵＴＲは、好ましくは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１アルファサブコンプレックスサブユニット１（ＮＤＵＦＡ１）遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１アルファサブコンプレックスサブユニット１（ＮＤＵＦＡ１）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１アルファサブコンプレックスサブユニット１（ＮＤＵＦＡ１）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｏ１５２３９、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１５２）に対応するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１アルファサブコンプレックスサブユニット１（ＮＤＵＦＡ１）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＮＤＵＦＡ１遺伝子に由来する３’−ＵＴＲを含むことができ、ＮＤＵＦＡ１遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲは、配列番号３１又は３２と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＲＰＳ９由来の３’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）タンパク質をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲを含むことができる。そのような３’−ＵＴＲは、好ましくは、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）遺伝子の３’−ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒト４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ４６７８１、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１７９）に対応する４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＲＰＳ９遺伝子に由来する３’−ＵＴＲを含むことができ、ＲＰＳ９遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲは、配列番号３３又は３４と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
更なる３’−ＵＴＲ：実施形態では、本明細書で定義される人工ＲＮＡは、国際公開第２０１６／１０７８７７号に記載される３’−ＵＴＲを含む。この文脈において、３’−ＵＴＲ配列に関する国際公開第２０１６／１０７８７７号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好適な３’−ＵＴＲは、国際公開第２０１６／１０７８７７号の配列番号１〜２４及び配列番号４９〜３１８、又はこれらの配列の断片又はバリアントである。したがって、本発明の人工ＲＮＡの３’−ＵＴＲは、国際公開第２０１６／１０７８７７号の配列番号１〜２４及び配列番号４９〜３１８に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることができる。他の実施形態においては、本明細書で定義される人工ＲＮＡは、国際公開第２０１７／０３６５８０号に記載される３’−ＵＴＲを含む。この文脈において、３’−ＵＴＲ配列に関する国際公開第２０１７／０３６５８０号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好適な３’−ＵＴＲは、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１５２〜２０４、又はこれらの配列の断片又はバリアントである。したがって、本発明の人工ＲＮＡの３’−ＵＴＲは、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１５２〜２０４に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることができる。
好ましい実施形態によれば、人工ＲＮＡは、少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲを含む。
好ましい実施形態においては、本明細書で定義される少なくとも１つの人工核酸、特に本明細書で定義されるＲＮＡは、少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲを含むことができる。
好ましくは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲは、脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳動物の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又は脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳動物の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の５’−ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含む又はからなる。
好ましくは、本発明の人工ＲＮＡは、半減期が延びたＲＮＡに関する（安定なＲＮＡを提供する）遺伝子に由来し得る５’−ＵＴＲ、例えば、以下に定義し説明する５’−ＵＴＲを含む。
好ましくは、少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲは、好ましくは安定なｍＲＮＡをコードする遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又は前記遺伝子のホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する核酸配列を含む。
第１の態様の好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲを含み、前記少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲは、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４Ｂ、及びＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はこれらの遺伝子のいずれかのホモログ、断片、又はバリアントに由来する核酸配列を含む。
ＲＰＬ３２由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、前記５’−ＵＴＲは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠いている。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくは、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなり、５’−ＵＴＲは、好ましくは、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。前記遺伝子は、好ましくは、ヒト６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ６２８９９、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１３８）に対応する６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＲＰＬ３２遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＲＰＬ３２遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号２１又は２２と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＨＳＤ１７Ｂ４由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠いている。そのような５’−ＵＴＲは、１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ペルオキシソーム多機能酵素タイプ２とも呼ばれる）遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４）遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体に由来する核酸配列を含む又はからなり、好ましくは５’−ＵＴＲは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。前記遺伝子は、好ましくは、ヒト１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｑ９ＢＰＸ１、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１３９）に対応する１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４タンパク質、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくはその誘導体をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号１又は２と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＡＳＡＨ１由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、又は誘導体の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができる。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくは酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒト酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｑ１３５１０、２０１７年６月７日のエントリーバージョン＃１７７）に対応する酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）タンパク質、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＡＳＡＨ１遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＡＳＡＨ１遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号３又は４と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＡＴＰ５Ａ１由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＴＰ５Ａ１）をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、前記５’−ＵＴＲは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠いている。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくはミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトのミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子に由来する核酸配列、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体を含む又はからなり、５’−ＵＴＲは、好ましくは、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。前記遺伝子は、好ましくは、ヒト酸性ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ２５７０５、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃２０８）に対応するミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファタンパク質、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＡＴＰ５Ａ１遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＡＴＰ５Ａ１遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号５又は６と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＭＰ６８由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、ＭＰ６８をコードする遺伝子又はそのホモログ、断片、若しくはバリアントの５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができる。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくは、６．８ｋＤａミトコンドリアプロテオリピド（ＭＰ６８）遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物の６．８ｋＤａミトコンドリアプロテオリピド（ＭＰ６８）遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体に由来する核酸配列を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒト６．８ｋＤａミトコンドリアプロテオリピド（ＭＰ６８）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ５６３７８、２０１７年２月１５日のエントリーバージョン＃１２７）に対応する６．８ｋＤａミトコンドリアプロテオリピド（ＭＰ６８）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＭＰ６８遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＭＰ６８遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号７又は８と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＮＤＵＦＡ４由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）をコードする遺伝子、又はそのホモログ、断片、若しくはバリアントの５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができる。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくは、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物のシトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体に由来する核酸配列を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒトシトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｏ００４８３、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１４９）に対応するシトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＮＤＵＦＡ４遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＮＤＵＦＡ４遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号９又は１０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＮＯＳＩＰ由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、一酸化窒素シンターゼ相互作用（ＮＯＳＩＰ）タンパク質をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができる。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくは、一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質（ＮＯＳＩＰ）遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質（ＮＯＳＩＰ）遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体に由来する核酸配列を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒト一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質（ＮＯＳＩＰ）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｑ９Ｙ３１４、２０１７年６月７日のエントリーバージョン＃１３０）に対応する一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質（ＮＯＳＩＰ）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＮＯＳＩＰ遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＮＯＳＩＰ遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号１１又は１２と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＲＰＬ３１由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、前記５’−ＵＴＲは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠いている。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくは６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物の６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体に由来する核酸配列を含む又はからなり、５’−ＵＴＲは、好ましくは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。前記遺伝子は、好ましくは、ヒト６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ６２８９９、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１３８）に対応する６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３１（ＲＰＬ３１）をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＲＰＬ３１遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＲＰＬ３１遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号１３又は１４と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＳＬＣ７Ａ３由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、カチオン性アミノ酸トランスポーター３（溶質担体ファミリー７メンバー３、ＳＬＣ７Ａ３）タンパク質、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体をコードする遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができる。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくはカチオン性アミノ酸トランスポーター３（ＳＬＣ７Ａ３）遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物のカチオン性アミノ酸トランスポーター３（ＳＬＣ７Ａ３）遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体に由来する核酸配列を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒトカチオン性アミノ酸トランスポーター３（ＳＬＣ７Ａ３）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｑ８ＷＹ０７、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１３９）に対応するカチオン性アミノ酸トランスポーター３（ＳＬＣ７Ａ３）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号１５又は１６と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＴＵＢＢ４Ｂ由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、チューブリンベータ−４Ｂ鎖（ＴＵＢＢ４Ｂ）タンパク質をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、又は誘導体の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができる。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくはチューブリンベータ−４Ｂ鎖（ＴＵＢＢ４Ｂ）遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトのチューブリンベータ−４Ｂ鎖（ＴＵＢＢ４Ｂ）遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体に由来する核酸配列を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ヒトチューブリンベータ−４Ｂ鎖（ＴＵＢＢ４Ｂ）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｑ８ＷＹ０７、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１４２）に対応するチューブリンベータ−４Ｂ鎖（ＴＵＢＢ４Ｂ）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号１７又は１８と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
ＵＢＱＬＮ２由来の５’−ＵＴＲ：本発明の人工ＲＮＡは、ユビキリン−２（ＵＢＱＬＮ２）タンパク質をコードする遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、若しくは断片の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲを含むことができる。そのような５’−ＵＴＲは、好ましくは、ユビキリン−２（ＵＢＱＬＮ２）遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物のユビキリン−２（ＵＢＱＬＮ２）遺伝子、又はそのホモログ、バリアント、断片、若しくは誘導体に由来する核酸配列を含む又はからなる。前記遺伝子は、好ましくは、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｑ９ＵＨＤ９、２０１７年８月３０日のエントリーバージョン＃１５１に対応するユビキリン−２（ＵＢＱＬＮ２）タンパク質をコードすることができる。したがって、本発明の人工ＲＮＡは、ＵＢＱＬＮ２遺伝子に由来する５’−ＵＴＲを含むことができ、ＵＢＱＬＮ２遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲは、配列番号１９又は２０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる。
更なる５’−ＵＴＲ：実施形態では、本明細書で定義される人工ＲＮＡは、国際公開第２０１３／１４３７００号に記載される５’−ＵＴＲを含む。この文脈において、５’−ＵＴＲ配列に関する国際公開第２０１３／１４３７００号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好適な５’−ＵＴＲは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２、又はこれらの配列の断片又はバリアントである。この文脈において、本発明に係る人工ＲＮＡの５’−ＵＴＲは、国際公開第２０１３／１４３７００号配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることが好ましい。他の実施形態では、本発明の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１６／１０７８７７号に記載される５’−ＵＴＲを含む。これに関して、５’−ＵＴＲ配列に関する国際公開第２０１６／１０７８７７号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好ましい５’−ＵＴＲは、国際公開第２０１６／１０７８７７号の配列番号２５〜３０及び配列番号３１９〜３８２に係る核酸配列、又はこれらの配列の断片又はバリアントである。この文脈において、人工ＲＮＡの５’−ＵＴＲが、国際公開第２０１６／１０７８７７号の配列番号２５〜３０及び配列番号３１９〜３８２に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることが特に好ましい。他の実施形態では、本発明の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１７／０３６５８０号に記載される５’−ＵＴＲを含む。この文脈において、５’−ＵＴＲ配列に関する国際公開第２０１７／０３６５８０号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好ましい５’−ＵＴＲは、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１〜１５１に係る核酸配列、又はこれらの配列の断片又はバリアントである。この文脈において、人工ＲＮＡの５’−ＵＴＲが、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１〜１５１に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることが特に好ましい。
発明者らは、少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲ及び／又は少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲの特定の組合せが、標的組織（例えば、筋肉、真皮）中のＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする、前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結された少なくとも１つのコード配列の翻訳を有利に高めていることを見出した。
したがって、本明細書で定義される少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲ及び本明細書で定義される少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲは、相乗的に作用して、本発明の人工ＲＮＡからの抗原性ペプチド又はタンパク質の産生（即ち、翻訳）を高めることが好ましい。５’−ＵＴＲと３’−ＵＴＲのこれらの有利な組合せを以下に示す。以下の記載で導入する略称、即ち、「ａ−１」、「ａ−２」、「ａ−３」、「ａ−４」、「ａ−５」、「ｂ−１」、「ｂ−２」、「ｂ−３」、「ｂ−４」、「ｂ−５」、「ｃ−１」、「ｃ−２」、「ｃ−３」、「ｃ−４」、「ｃ−５」、「ｄ−１」、「ｄ−２」、「ｄ−３」、「ｄ−４」、「ｄ−５」、「ｅ−１」、「ｅ−２」、「ｅ−３」、「ｅ−４」、「ｅ−５」、「ｅ−６」、「ｆ−１」、「ｆ−２」、「ｆ−３」、「ｆ−４」、「ｆ−５」、「ｇ−１」、「ｇ−２」、「ｇ−３」、「ｇ−４」、「ｇ−５」、「ｈ−１」、「ｈ−２」、「ｈ−３」、「ｈ−４」、「ｈ−５」、「ｉ−１」、「ｉ−２」、「ｉ−３」のそれぞれは、本発明の明細書全体を通して使用され、本発明の５’−ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの１つの有利な組合せを表す。
したがって、第１の態様の好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、
ａ−１．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ａ−２．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ａ−３．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ａ−４．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ａ−５．ＭＰ６８遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｂ−１．ＵＢＱＬＮ２遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｂ−２．ＡＳＡＨ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｂ−３．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｂ−４．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｂ−５．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｃ−１．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｃ−２．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｃ−３．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｃ−４．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｃ−５．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｄ−１．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｄ−２．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｄ−３．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｄ−４．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｄ−５．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｅ−１．ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｅ−２．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｅ−３．ＭＰ６８遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｅ−４．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｅ−５．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｅ−６．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｆ−１．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｆ−２．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｆ−３．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｆ−４．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｆ−５．ＭＰ６８遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｇ−１．ＭＰ６８遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｇ−２．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｇ−３．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｇ−４．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｇ−５．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｈ−１．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｈ−２．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｈ−３．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｈ−４．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｈ−５．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｉ−１．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｉ−２．ＲＰＬ３２遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＡＬＢ７遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
ｉ−３．アルファグロビン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ。
好適には、本発明の人工ＲＮＡは、ａ−１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）、ａ−２（Ｎｄｕｆａ４／ＰＳＭＢ３）、ａ−３（ＳＬＣ７Ａ３／ＰＳＭＢ３）、ａ−４（ＮＯＳＩＰ／ＰＳＭＢ３）、ａ−５（ＭＰ６８／ＰＳＭＢ３）、ｂ−１（ＵＢＱＬＮ２／ＲＰＳ９）、ｂ−２（ＡＳＡＨ１／ＲＰＳ９）、ｂ−３（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＲＰＳ９）、ｂ−４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＡＳＰ１）、ｂ−５（ＮＯＳＩＰ／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｃ−１（ＮＤＵＦＡ４／ＲＰＳ９）、ｃ−２（ＮＯＳＩＰ／ＮＤＵＦＡ１）、ｃ−３（ＮＤＵＦＡ４／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｃ−４（ＮＤＵＦＡ４／ＮＤＵＦＡ１）、ｃ−５（ＡＴＰ５Ａ１／ＰＳＭＢ３）、ｄ−１（Ｒｐｌ３１／ＰＳＭＢ３）、ｄ−２（ＡＴＰ５Ａ１／ＣＡＳＰ１）、ｄ−３（ＳＬＣ７Ａ３／ＧＮＡＳ）、ｄ−４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＮＤＵＦＡ１）、ｄ−５（Ｓｌｃ７ａ３／Ｎｄｕｆａ１）、ｅ−１（ＴＵＢＢ４Ｂ／ＲＰＳ９）、ｅ−２（ＲＰＬ３１／ＲＰＳ９）、ｅ−３（ＭＰ６８／ＲＰＳ９）、ｅ−４（ＮＯＳＩＰ／ＲＰＳ９）、ｅ−５（ＡＴＰ５Ａ１／ＲＰＳ９）、ｅ−６（ＡＴＰ５Ａ１／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｆ−１（ＡＴＰ５Ａ１／ＧＮＡＳ）、ｆ−２（ＡＴＰ５Ａ１／ＮＤＵＦＡ１）、ｆ−３（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｆ−４（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＧＮＡＳ）、ｆ−５（ＭＰ６８／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｇ−１（ＭＰ６８／ＮＤＵＦＡ１）、ｇ−２（ＮＤＵＦＡ４／ＣＡＳＰ１）、ｇ−３（ＮＤＵＦＡ４／ＧＮＡＳ）、ｇ−４（ＮＯＳＩＰ／ＣＡＳＰ１）、ｇ−５（ＲＰＬ３１／ＣＡＳＰ１）、ｈ−１（ＲＰＬ３１／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｈ−２（ＲＰＬ３１／ＧＮＡＳ）、ｈ−３（ＲＰＬ３１／ＮＤＵＦＡ１）、ｈ−４（Ｓｌｃ７ａ３／ＣＡＳＰ１）、ｈ−５（ＳＬＣ７Ａ３／ＣＯＸ６Ｂ１）、ｉ−１（ＳＬＣ７Ａ３／ＲＰＳ９）、ｉ−２（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）、又はｉ−３（α−グロビン遺伝子）から選択される３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲに機能可能に連結された、本明細書に記載されるＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。
第１の態様の特に好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、ａ−１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）、ａ−４（ＮＤＵＦＡ４／ＰＳＭＢ３）、ｃ−１（ＮＤＵＦＡ４／ＲＰＳ９）、ｅ−４（ＮＯＳＩＰ／ＲＰＳ９）、ｇ−２（ＮＤＵＦＡ４／ＣＡＳＰ１）、ｉ−２（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）、又はｉ−３（アルファ−グロビン（ｍｕａｇ））に係るＵＴＲエレメントを含む。
第１の態様の特に好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、ａ−１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）に係るＵＴＲエレメントを含む。
本発明は、上に定義した少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲ及び／又は上に定義した少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲと、前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結された少なくとも１つのコード配列とを含み、前記コード配列が、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質、又はその断片又はバリアントをコードする人工核酸、好ましくはワクチン接種に適したＲＮＡに関する。
本明細書で使用するとき、「呼吸器合胞体ウイルス」という用語又は対応する略称「ＲＳＶ」は、任意の起源の呼吸器合胞体ウイルスを含む、特定のウイルス株、バリアント、血清型、又は分離株などに限定されない。
様々な実施形態によれば、人工ＲＮＡ、好ましくは人工ＲＮＡのコード配列は、ウイルスに由来する核酸配列を含む又はからなり、ＮＣＢＩ分類ＩＤ（「ＮＣＢＩ−ＩＤ」）を以下のリスト１に提供する。
リスト１：ＲＳＶウイルス株：
ヒトオルトニューモウイルス、ＨＲＳＶ（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５０）；ヒト呼吸器合胞体ウイルスＡ、ＨＲＳＶ−Ａ、呼吸器合胞体ウイルスグループＡ（ＮＣＢＩ−ＩＤ ２０８８９３）；ヒト呼吸器合胞体ウイルスＡ株ロング、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（サブグループＡ／株ロング）（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２６０）；ヒト呼吸器合胞体ウイルスＡ２、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株Ａ２）、ＨＲＳＶＡ（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５９）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＢ１７３４）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５３）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＢ５８５７）（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５４）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＢ６１９０）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５５）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＢ６２５６）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５６）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＢ６４２）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５２）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＢ６６１４）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５７）；ヒト呼吸器合胞体ウイルスＢ、ＨＲＳＶ−Ｂ、呼吸器合胞体ウイルスグループＢ、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ２０８８９５）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス９３２０（ＮＣＢＩ−ＩＤ ２５３１８２）；ヒト呼吸器合胞体ウイルスＢ１（ＮＣＢＩ−ＩＤ ７９６９２）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（サブグループＢ／株１８５３７）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５１）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（サブグループＢ／株８／６０）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２５８）；ヒト呼吸器合胞体ウイルスＳ２、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１００７８）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス株ＲＳＳ−２、（ＮＣＢＩ−ＩＤ １１２６１）；未分類ヒト呼吸器合胞体ウイルス、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２３３）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１１２／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２３７）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１２０／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２３８）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１２１／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２３９）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１２２／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４７）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１３／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４１）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１４０／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４８）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１６／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４２）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１７１／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４６）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１８３／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４９）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１９１／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４０）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ１９９／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２５０）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ２１２／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２５１）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ４１／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２３４）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ４５／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２３５）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ５６／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４３）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ５８／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２３６）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ６７／スウェーデン／０２−０３）、（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４４）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株ＲＳＰ９４／スウェーデン／０２−０３）（ＮＣＢＩ−ＩＤ ４１０２４５）；呼吸器合胞体ウイルス分離株 ＲＳＶ メンフィス−３７、（株メンフィス−３７）（ＮＣＢＩ−ＩＤ １２８１４）。
本発明の好ましい実施形態においては、少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス分離株ＲＳＶメンフィス−３７（株メンフィス−３７）（ＮＣＢＩ−ＩＤ：１２８１４）に由来する。ＳＴ２５配列表に含まれる情報を含む本発明全体を通して、略称「ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）」が、前記特に好ましいＲＳＶウイルスに使用される。
本発明の好ましい実施形態においては、少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、ヒト呼吸器合胞体ウイルスＡ２、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（株Ａ２）（ＮＣＢＩ−ＩＤ：１１２５９）に由来する。ＳＴ２５配列表に含まれる情報を含む本発明全体を通して、略称「ＨＲＳＶ（Ａ２）」が、前記特に好ましいＲＳＶウイルスに使用される。
当業者はまた、本発明の教示を適合させ、本発明に係るＲＮＡ構築物、組成物、及びワクチンを得るために、リスト１に提供される任意のＲＳＶ株に由来するアミノ酸配列及び核酸配列を使用することができることを理解されたい。
様々な実施形態においては、少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆ）、糖タンパク質Ｇ、ショート疎水性タンパク質ＳＨ、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、ラージポリメラーゼＬ、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、リンタンパク質Ｐ、非構造タンパク質ＮＳ１、又は非構造タンパク質ＮＳ２、又はその断片、バリアント、若しくは誘導体から選択することができる。
第１の態様の特に好ましい実施形態においては、少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する。これに関連して、少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列は、ＲＳＶ融合タンパク質Ｆに由来する任意のペプチド又はタンパク質、又はその断片、バリアント、若しくは誘導体から選択することができる。
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、最初、（宿主細胞の感染後）完全長融合タンパク質Ｆ（本明細書では「Ｆ０」と呼ぶ）と呼ばれる単一のポリペプチド前駆体として発現される。Ｆ０は小胞体で三量体を形成し、２箇所の保存された部位で細胞／宿主のフューリン様プロテアーゼによって処理され、Ｆ１、Ｆ２、及びＰｅｐ２７ポリペプチドを生成する。Ｐｅｐ２７ポリペプチドは切除され、成熟Ｆタンパク質の一部を形成しない。Ｆ２ポリペプチドは、Ｆ０前駆体のＮ末端部分に由来し、２つのジスルフィド結合を介してＦ１ポリペプチドに結合する。Ｆ１ポリペプチドは、Ｆ０前駆体のＣ末端部分に由来し、細胞質側末端に結合されている膜貫通ドメインを介して成熟Ｆタンパク質を膜に固定する。３つのＦ２−Ｆ１ヘテロダイマーユニット（「プロトマー」）が集合して、成熟Ｆタンパク質を形成する。初期は、成熟Ｆタンパク質は準安定型である（本明細書では、「融合前コンフォメーション」と呼ぶ）。刺激に伴い、それは、ウイルスと標的細胞膜とを融合させる大きな不可逆的構造変化（本明細書では、「融合後コンフォメーション」と呼ぶ）を受ける。
したがって、第１の態様の人工ＲＮＡ、好ましくはワクチン接種に適した人工ＲＮＡは、ＲＳＶ Ｆタンパク質又はその断片若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする。
好ましい実施形態においては、ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、以下のリスト２に提供されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号）のいずれかに由来することができる。
リスト２：ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号：
アクセッション番号タンパク質、ＡＪＦ４４８０１．１、ＡＪＦ４４７５９．１、ＡＪＦ４４６６１．１、ＡＪＦ４４６０２．１、２２０７４２４Ａ、ＡＡＢ３８５２０．１、ＡＡＢ３８５１７．１、ＡＡＢ３８５１９．１、ＡＡＢ３８５１８．１、ＡＶＱ９３５８７．１、ＡＶＱ９３５９９．１、ＡＶＱ９３５７１．１、ＡＶＱ９３５６８．１、ＡＶＱ９３５８９．１、ＡＶＱ９３５９７．１、ＡＶＱ９３５６３．１、ＡＶＱ９３５９４．１、ＡＶＱ９３６０６．１、ＡＶＱ９３６０１．１、ＡＶＱ９３５６２．１、ＡＶＱ９３５６１．１、ＡＶＱ９３６０７．１、ＡＶＱ９３５８８．１、ＡＶＱ９３５７５．１、ＡＶＱ９３４６８．１、ＡＶＱ９３４６７．１、ＡＶＱ９３５９０．１、ＡＶＱ９３５５２．１、ＡＶＱ９３５５６．１、ＡＶＱ９３４７１．１、ＡＶＱ９３４５８．１、ＡＶＱ９３４９４．１、ＡＶＱ９３４７０．１、ＡＶＱ９３４８９．１、ＡＶＱ９３５４２．１、ＡＶＱ９３４７２．１、ＡＶＱ９３５１４．１、ＡＶＱ９３４８５．１、ＡＶＱ９３５３３．１、ＡＶＱ９３４８１．１、ＡＶＱ９３５４６．１、ＡＶＱ９３５１２．１、ＡＶＱ９３５５４．１、ＡＶＱ９３５５１．１、ＡＶＱ９３５４７．１、ＡＶＱ９３５５８．１、ＡＶＱ９３４６１．１、ＡＶＱ９３５００．１、ＡＶＱ９３４２６．１、ＡＶＱ９３３９８．１、ＡＶＱ９３４０１．１、ＡＶＱ９３３６１．１、ＡＶＱ９３４０８．１、ＡＶＱ９３４４３．１、ＡＶＱ９３４２９．１、ＡＶＱ９３３５９．１、ＡＶＱ９３３６５．１、ＡＶＱ９３３６６．１、ＡＶＱ９３４０２．１、ＡＶＱ９３３７７．１、ＡＶＱ９３４１２．１、ＡＶＱ９３３９１．１、ＡＶＱ９３４５７．１、ＡＶＱ９３３７２．１、ＡＶＱ９３４５５．１、ＡＶＱ９３３６４．１、ＡＶＱ９３３７８．１、ＡＶＱ９３３９３．１、ＡＶＱ９３３６２．１、ＡＶＱ９３５８５．１、ＡＲＴ２８５０４．１、ＡＶＱ９３４０４．１、ＡＯＳ４９１２３．１、ＡＯＳ４８４９６．１、ＡＭＴ７８２７１．１、ＡＨＸ５７１７４．１、ＡＨＷ８１３９０．１、ＡＨＶ８１５０６．１、ＡＦＸ６０１２８．１、ＡＦＸ６０１２９．１、ＡＥＱ６３３８９．１、ＡＲＢ６６３２８．１、ＡＮＺ８００３４．１、ＡＭＮ９１２５３．１、Ｐ０３４２０．１、ＡＩＯ０８０４６．１、ＮＰ＿０５６８６３．１、ＡＦＸ６０２３４．１、ＡＦＸ６０２３１．１、ＡＦＸ６０２３２．１、ＡＦＸ６０２２２．１、ＡＦＸ６０２１９．１、ＡＦＸ６０２１５．１、ＡＦＸ６０２１４．１、ＡＦＸ６０２１２．１、ＡＦＸ６０２０８．１、ＡＦＸ６０２０２．１、ＡＦＸ６０２２０．１、ＡＦＸ６０２１３．１、ＡＦＸ６０１９０．１、ＡＦＸ６０１８７．１、ＡＦＸ６０２０１．１、ＡＦＸ６０１７３．１、ＡＦＸ６０１６９．１、ＡＦＸ６０１６２．１、ＡＦＸ６０１５６．１、ＡＦＸ６０１５１．１、ＡＦＸ６０１５０．１、ＡＦＸ６０１４８．１、ＡＦＸ６０１４１．１、ＡＦＸ６０１２７．１、ＡＦＸ６０１３７．１、ＡＦＸ６０１３５．１、ＡＦＶ４６４２０．１、ＡＦＸ６０２００．１、ＡＦＶ４６４１９．１、ＡＦＶ４６４１７．１、ＡＦＶ４６４１３．１、ＡＦＶ４６４１４．１、ＡＦＶ４６４１０．１、ＡＦＶ４６４０３．１、ＡＦＶ４６４０９．１、ＡＦＰ９９０６１．１、ＡＦＭ９５４００．１、ＡＦＶ４６４０１．１、ＡＦＰ９９０６４．１、ＡＦＭ９５３７６．１、ＡＦＸ６０１３８．１、ＡＦＰ９９０６０．１、ＡＦＭ９５３６５．１、ＡＦＭ５５５６３．１、ＡＦＭ５５５３０．１、ＡＦＭ５５４４２．１、ＡＦＭ５５４２０．１、ＡＦＭ５５５５２．１、ＡＦＭ５５３６５．１、ＡＦＰ９９０５９．１、ＡＦＭ９５３８５．１、ＡＦＭ５５３５４．１、ＡＦＭ５５３４３．１、ＡＦＭ５５３８７．１、ＡＦＭ５５２９９．１、ＡＦＭ５５２８８．１、ＡＦＭ５５２６６．１、ＡＦＭ５５２７７．１、ＡＦＭ５５２５５．１、ＡＦＭ５５２２２．１、ＡＦＭ５５２１１．１、ＡＦＩ２５２６２．１、ＡＦＤ３４２６６．１、ＡＦＭ５５３３２．１、ＡＦＤ３４２６４．１、ＡＦＤ３４２６２．１、ＡＦＤ３４２６５．１、ＡＦＤ３４２６１．１、ＡＦＤ３４２６０．１、ＡＦＤ３４２５９．１、ＡＥＱ６３６４１．１、ＡＥＱ６３４８７．１、ＡＥＱ６３５２０．１、ＡＥＱ６３３７８．１、ＡＥＱ６３３６７．１、４ＣＣＦ＿Ａ、ＡＥＱ６３３３４．１、ＡＥＯ４５９４９．１、ＡＥＯ４５９３９．１、ＡＥＱ６３３１２．１、ＡＥＱ６３５８６．１、ＡＥＯ４５９１９．１、ＡＥＯ４５９０９．１、ＡＥＯ４５８８９．１、ＡＥＯ４５８７９．１、ＡＥＯ４５８６９．１、ＡＥＯ４５９２９．１、ＡＥＯ４５８５０．１、ＡＥＯ４５８５９．１、ＡＥＱ６３４４４．１、ＡＥＯ２３０５４．１、ＡＥＯ２３０５２．１、ＡＥＯ２３０５１．１、ＡＥＣ３２０８７．１、ＡＤＺ９５７８５．１、ＡＥＣ３２０８５．１、ＡＤＺ９５７８４．１、ＡＤＺ９５７８３．１、ＡＤＺ９５７８２．１、ＡＤＺ９５７８１．１、ＡＤＺ９５７７９．１、ＡＤＺ９５７８０．１、ＡＤＺ９５７７７．１、ＡＤＺ９５７７８．１、ＡＤＺ９５７７６．１、ＡＤＺ９５７７５．１、ＡＣＹ６８４３５．１、ＡＣＯ８３３０２．１、ＡＢＩ３５６８５．１、ＡＦＩ２５２５１．１、ＡＡＸ２３９９４．１、ＡＡＱ９７０２６．１、ＡＡＲ１４２６６．１、ＡＡＱ９７０２７．１、ＡＡＱ９７０３０．１、ＡＡＱ９７０２８．１、ＡＡＣ５７０２７．１、ＡＡＱ９７０２９．１、ＡＡＱ９７０３１．１、ＡＡＭ６８１６０．１、ＡＡＭ４４８５１．１、Ｐ１１２０９．２、Ｐ１３８４３．１、ＡＡＯ７２３２５．１、ＡＡＭ６８１５７．１、ＣＡＡ２６１４３．１、１５１２３７２Ａ、ＡＡＢ８６６６４．１、ＡＡＯ７２３２４．１、ＡＡＢ８２４４６．１、ＡＡＯ７２３２３．１、ＡＡＭ６８１５４．１、ＡＡＡ４７４１０．１、Ｐ１２５６８．１、ＡＲＢ０７８９４．１、ＡＧＧ３９５１７．１、ＢＢＣ５４６１２．１、ＢＢＣ５４６３６．１、ＢＢＣ５４６２７．１、ＢＢＣ５４６２１．１、ＢＢＣ５４５７０．１、ＢＢＣ５４５７９．１、ＢＢＣ５４５９５．１、ＢＢＣ５４５５５．１、ＢＢＣ５４５５２．１、ＢＢＣ５４５６４．１、ＢＢＣ５４５８１．１、ＢＢＣ５４５７１．１、ＢＢＣ５４５５３．１、ＢＢＣ５４５６５．１、ＢＢＣ５４２４５．１、ＢＢＣ５４２４３．１、ＢＢＣ５４２３８．１、ＢＢＣ５４２４２．１、ＢＢＣ５４２３９．１、ＢＢＣ５４２３５．１、ＢＢＣ５４２３４．１、ＢＢＣ５４２３６．１、ＢＢＣ５４２４４．１、ＢＢＣ５４１８６．１、ＢＢＣ５４１７８．１、ＢＢＣ５４２０２．１、ＢＢＣ５４１５１．１、ＢＢＣ５４１４２．１、ＢＢＣ５４１３４．１、ＢＢＣ５４１７０．１、ＢＢＣ５４２１０．１、ＢＢＣ５４１６９．１、ＢＢＣ５４２１３．１、ＢＢＣ５４２０３．１、ＢＢＣ５４１６０．１、ＢＢＣ５４１６３．１、ＢＢＣ５４２１５．１、ＢＢＣ５４１５６．１、ＢＢＣ５４１７９．１、ＢＢＣ５４１５０．１、ＢＢＣ５４２０７．１、ＢＢＣ５４１９４．１、ＢＢＣ５４１４９．１、ＢＢＣ５４１３８．１、ＢＢＣ５４１９９．１、ＢＢＣ５４２２０．１、ＢＢＣ５４１８１．１、ＢＢＣ５４１３２．１、ＢＢＣ５４１４６．１、ＢＢＣ５４１２２．１、ＢＢＣ５４１２４．１、ＢＢＢ３５２０２．１、ＢＢＢ３５２０１．１、ＢＢＢ３５１９２．１、ＢＢＢ３５１９３．１、ＢＢＢ３５１９９．１、ＢＢＢ３５１８４．１、ＢＢＢ３５１２６．１、ＢＢＢ３５１３３．１、ＢＢＢ３５１３０．１、ＢＢＢ３５１６０．１、ＢＢＢ３５１６２．１、ＢＢＢ３５１８１．１、ＢＢＢ３５１６５．１、ＢＢＢ３５１２１．１、ＢＢＢ３５１３８．１、ＢＢＢ３５１７６．１、ＢＢＢ３５１４２．１、ＢＢＢ３５１３６．１、ＢＢＢ３５１５３．１、ＢＢＢ３５１１５．１、ＢＢＢ３５１５０．１、ＢＢＢ３５０９７．１、ＢＢＢ３５１０９．１、ＢＢＢ３５０９４．１、ＢＢＢ３５１８３．１、ＢＢＢ３５１０４．１、ＢＢＢ３５０９９．１、ＢＢＢ３５１８８．１、ＡＫＡ４５８７１．１、ＡＳＶ６５８３８．１、ＡＧＧ３９３７３．１、ＡＩＩ２２１０７．１、ＡＧＧ３９４００．１、ＡＧＧ３９４５７．１、ＡＲＲ２９２４０．１、ＡＲＲ２９２５１．１、ＡＲＲ２９１８９．１、ＡＲＲ２９２０７．１、ＡＵＨ１５１６４．１、ＡＴＶ８１３４３．１、ＡＵＣ６８６５４．１、ＡＵＣ６８５７７．１、ＡＵＣ６８５６６．１、ＡＵＣ６８５５５．１、ＡＵＣ６８４７８．１、ＡＵＣ６８４４５．１、ＡＵＣ６８５００．１、ＡＵＣ６８５２２．１、ＡＵＣ６８２９１．１、ＡＵＣ６８１４９．１、ＡＵＣ６８０９４．１、ＡＭＡ６７０９７．１、ＡＭＡ６６８６６．１、ＡＭＡ６６５８０．１、ＡＩＺ９５７５０．１、ＡＩＺ９５５４１．１、ＡＩＺ９５５１９．１、ＡＨＹ２１４１９．１、ＡＨＹ２１３３１．１、ＡＨＹ２１１６５．１、ＡＨＹ２１１４３．１、ＡＨＹ２１１３２．１、ＡＧＧ３９４７８．１、ＡＴＶ９３５０６．１、ＡＴＶ９３５０９．１、ＡＩＺ９５７１７．１、ＡＴＶ８１３５４．１、ＡＲＴ２８３１７．１、ＢＢＡ５７８９０．１、ＢＢＡ５７９０１．１、ＡＳＺ７００９９．１、ＡＲＴ２８３６１．１、ＡＱＸ３６８４４．１、ＡＳＫ０５５２０．１、ＡＲＴ２８４２７．１、ＡＲＴ２８３３９．１、ＡＲＴ２８２９７．１、ＡＲＴ２８３２８．１、ＡＲＱ１５９６６．１、ＡＲＮ６１５０７．１、ＡＲＡ１５４１３．１、ＡＧＧ３９３９４．１、ＡＰＷ７８８４５．１、ＡＰＷ７８８６７．１、ＡＰＷ７８９００．１、ＡＰＷ７８８７８．１、ＡＰＷ７８７７９．１、ＡＰＷ７８７０２．１、ＡＰＷ７８７１３．１、ＡＰＷ７８６８０．１、ＡＰＷ７８６５８．１、ＡＰＷ７８６４７．１、ＡＰＷ７８６３６．１、ＡＯＳ４８８７０．１、ＡＰＷ７８６１４．１、ＡＭＴ７８９０５．１、ＡＭＴ７７４０２．１、ＡＯＺ１５４７９．１、ＡＧＮ２８４８４．１、ＡＨＸ５７２４０．１、ＡＨＸ５７０３１．１、ＡＯＳ４８９８０．１、ＡＯＳ４８８４８．１、ＡＯＳ４８８１５．１、ＡＯＳ４８７３８．１、ＡＯＳ４９０６８．１、ＡＯＳ４８７２７．１、ＡＯＳ４８７１６．１、ＡＯＳ４８６８３．１、ＡＯＳ４８５５１．１、ＡＯＳ４８４８５．１、ＡＯＳ４８５１８．１、ＡＯＳ４８４４１．１、ＡＯＳ４８３９７．１、ＡＯＳ４８３７５．１、ＡＯＳ４８３５３．１、ＡＯＳ４８２８７．１、ＡＯＳ４８３２０．１、ＡＯＳ４８２６５．１、ＡＯＳ４８２５４．１、ＡＯＳ４８２２１．１、ＡＮＺ７９６３８．１、ＡＬＣ７４０２５．１、ＡＨＶ８１２８６．１、ＡＯＤ４０８８８．１、ＡＯＤ４０５１６．１、ＡＯＤ４０２１４．１、ＡＯＤ４０１２５．１、ＡＯＤ４０１０４．１、ＡＯＤ４００８２．１、ＡＯＤ３９９０８．１、ＡＪＦ４４８２６．１、ＡＪＦ４４５０６．１、ＡＪＦ４４５３５．１、ＡＮＺ８０４６３．１、ＡＮＺ８０４０８．１、ＡＮＺ８０３９７．１、ＡＮＺ８０３８６．１、ＡＮＺ８０３３１．１、ＡＮＺ８０３２０．１、ＡＮＺ８０３６４．１、ＡＮＺ８０２７６．１、ＡＮＺ８０２２１．１、ＡＮＺ８０１８８．１、ＡＮＺ８０１４４．１、ＡＮＺ８０１３３．１、ＡＮＺ８０１１１．１、ＡＮＺ８０１２２．１、ＡＮＺ８００５６．１、ＡＮＺ８００１２．１、ＡＮＺ８００６７．１、ＡＮＺ７９９７９．１、ＡＮＺ７９９３５．１、ＡＮＺ７９９９０．１、ＡＮＺ７９９０２．１、
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本発明の文脈において、「ＲＳＶ Ｆタンパク質」、「ＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）」、「ＲＳＶ Ｆ」、又は「Ｆ」は、その最も広い意味で理解することができ、Ｆ０（Ｆポリペプチド前駆体）、Ｆ１、Ｆ２、及びＰｅｐ２７ポリペプチド、Ｆ２−Ｆ１ヘテロダイマー、又は成熟Ｆタンパク質（３つのＦ２−Ｆ１ヘテロダイマーを含む）、又はこれらのいずれかの断片及びバリアントを意味すると理解することができる。したがって、「ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来するペプチド又はタンパク質」という用語は、例えば、Ｆ０（Ｆタンパク質ポリペプチド前駆体）、Ｆ１、Ｆ２、及びＰｅｐ２７ポリペプチド、Ｆ２−Ｆ１ヘテロダイマー、又は成熟Ｆタンパク質に由来するペプチド、タンパク質、断片、又はバリアントを意味する。更に、「ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来するペプチド又はタンパク質」という用語は、上に定義した「ＲＳＶ Ｆタンパク質」又は「ＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）」に由来するペプチド、タンパク質、断片、又はバリアントを意味し、これらは、例えば、特定のタンパク質エレメント（例えば、細胞質側末端、フューリン切断部位、Ｐｅｐ２７）を欠如する、又は追加のエレメント（例えば、リンカーエレメント、異種シグナルペプチドなど）を含むように遺伝子改変することができる。例えば、「ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来するペプチド又はタンパク質」という用語は、Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０（これらの構築物の説明については、表１を参照）に由来するペプチド、タンパク質、断片、又はバリアントを意味する。第１の態様のＲＮＡによってコードされ得る特に好適なＦタンパク質バリアントを、以下に特定し、表１に示す。
ＲＳＶ Ｆタンパク質におけるアミノ酸（ａａ）残基及びそれらの位置に言及する場合、本明細書で使用される任意の番号付け（特段の断りがない限り）は、ＨＲＳＶ（Ａ２）（配列番号６８）の対応するＦ０前駆体タンパク質又はＨＲＳＶ（メンフィス−３７）の対応するＦ０前駆体タンパク質（配列番号８９３７又は１１７２６）におけるそれぞれのａａ残基の位置に関し、位置「１」は、１番目のａａ残基、即ち、ＨＲＳＶ（Ａ２）Ｆ０前駆体タンパク質又はＨＲＳＶ（メンフィス−３７）Ｆ０前駆体タンパク質のＮ末端のａａ残基に対応することに留意すべきである。
好ましい実施形態では、第１の態様のＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードし、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、完全長Ｆタンパク質（Ｆ０）又はＣ末端が欠失したＦタンパク質（Ｆ−ｄｅｌ）、又はその断片若しくはバリアントである。
この文脈では、任意のＲＳＶ Ｆ完全長タンパク質（前駆体タンパク質、「Ｆ０」と呼ばれる）を好適な抗原として使用することができ、好ましくは、リスト２に提供される任意のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号に由来する又は配列番号６８、８２７９〜８９６７、又は１１７２６のいずれかから選択することができる。本発明の好ましい実施形態では、ＨＲＳＶ（Ａ２）の完全長Ｆタンパク質（Ｆ０）（配列番号６８）が好適に使用される（表１を参照）。本発明の他の好ましい実施形態においては、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）の完全長Ｆタンパク質（Ｆ０）（配列番号８９３７又は１１７２６）が好適に使用される（表１を参照）。
これに関連して、Ｃ末端が欠失した任意のＲＳＶ Ｆ（Ｆ−ｄｅｌ）を好適な抗原として使用することができ、好ましくは、リスト２に示される任意のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号に由来することができる、又は配列番号４８３、８９６８〜９６８３、又は１２０９５いずれかから選択することができる。そのような欠失バリアントの例は、（Ｏｏｍｅｎｓら、２００６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（２１）：１０４６５〜７７）によるＲＳＶ−Ｆｄｅｌ５５４−５７４タンパク質であり、全長Ｆ０タンパク質のａａ残基５５４−５７４が除去されている。Ｆ０の細胞質側末端（ａａ５５４−５７４）の主要部分を欠失すると、インビトロでの細胞内輸送／細胞表面輸送の改善につながり、ＲＳＶ Ｆの細胞表面発現が大幅に増加する。細胞表面の提示が増加すると、Ｂ細胞の認識が向上する（これは、公開データと一致する；国際公開第２０１５０２４６６８号を参照）。本発明の好ましい実施形態においては、本明細書で「Ｆ−ｄｅｌ」（配列番号４８３、９６５３、又は１２０９５）と呼ばれる、Ｃ末端が欠失したＦタンパク質が好適に使用される（表１を参照）。異なるＲＳＶ株間でのＲＳＶ Ｆタンパク質の構造上の保存レベルが高いことに照らすと（例えば、Ｈａｕｓｅら、２０１７、ＰＬＯＳ ＯＮＥ １２（６）：ｅ０１８０６２３を参照）、ａａ５５４−５７４の欠失は、各種ＲＳＶ分離株の各種ＲＳＶ Ｆタンパク質配列に適用可能である。
特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードし、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーションで抗原を安定化するように設計される。中和抗体のためのいくつかの潜在的エピトープは、前記タンパク質コンフォメーションにおいて接近可能であるので、融合前コンフォメーションは、効率的なＲＳＶワクチンの場合において特に有利である。
いくつかの実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーションでＦタンパク質を安定化させる１以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆタンパク質の膜遠位部（Ｆ１ポリペプチドのＮ末端領域を含む）を安定化させる置換を融合前コンフォメーションに含む。例えば、アミノ酸置換は、非天然ジスルフィド結合を導入することができ、又はキャビティを満たすアミノ酸置換であることができる。
したがって、いくつかの実施形態では、好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーション（即ち、１以上の融合前仕様抗体に特異的に結合する、及び／又はＲＳＶ Ｆタンパク質の融合後構造ではなく融合前構造に存在する好適な抗原性部位を示すコンフォメーション）でタンパク質を安定化させる非天然ジスルフィド結合を形成するＳ１５５Ｃ及びＳ２９０Ｃ置換を含む。更なる実施形態において、組換えＲＳＶ Ｆタンパク質は、位置１９０、位置２０７、又は位置１９０及び２０７にＦ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、又はＭ置換を更に含むことができる。
融合前コンフォメーションで抗原を安定化させるように設計されたＲＳＶ Ｆタンパク質の例は、ＤＳＣａｖ１変異（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌ）を含むＲＳＶ Ｆタンパク質、又はその断片若しくはバリアントである。そのようなＲＳＶ Ｆ ＤＳＣａｖ１タンパク質は、当技術分野において記載されている（国際公開第２０１４１６０４６３号）。
したがって、特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードし、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＤＳＣａｖ１変異（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌ）、又はその断片若しくはバリアントを含む。
本発明の文脈では、ＲＳＶ Ｆを、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌの位置で変異させて、融合前コンフォメーションのタンパク質を安定化させることができ、本発明の文脈で好適に使用することができることが理解されるべきである。したがって、上に提供し任意のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号、又は配列番号６８、８２７９〜８９６７、４８３、８９６８〜９６８３、１２０９５、又は１１７２６から選択される任意のタンパク質、又はそれらの断片若しくはバリアントは、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌによるアミノ酸変化を導入して、各種ＲＳＶ Ｆ ＤＳＣａｖ１タンパク質を生成するために当業者によって選択することができる。
好ましい実施形態においては、ＨＲＳＶ（Ａ２）のＲＳＶ Ｆ完全長タンパク質（前駆体タンパク質、「Ｆ０」）（配列番号６８）を使用し、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌのアミノ酸変化を導入することによって、配列番号８９８に係るアミノ酸配列がもたらされる。そのようなＲＳＶ Ｆタンパク質は、本発明全体を通して、本明細書では、「ＦＯ＿ＤＳＣａｖ１」と呼ばれる（表１を参照（好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質抗原設計））。
他の好ましい実施形態においては、ＨＲＳＶ（Ａ２）（配列番号４８３）のＲＳＶ Ｆ＿ｄｅｌタンパク質（細胞質側末端（ａａ５５４−５７４）が欠失した）を使用し、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌアミノ酸変化を導入することによって、配列番号１２６７に係るアミノ酸配列がもたらされる。そのようなＲＳＶ Ｆタンパク質は、本発明全体を通して、本明細書では、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１」と呼ばれる（表１を参照（好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質抗原設計））。
好ましい実施形態においては、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）のＲＳＶ Ｆ完全長タンパク質（前駆体タンパク質、「Ｆ０」）（配列番号８９３７又は１１７２６）を使用して、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌのアミノ酸変化を導入することにより、配列番号１６４６４に係るアミノ酸配列がもたらされる。そのようなＲＳＶ Ｆタンパク質は、本発明全体を通して、本明細書では、「ＦＯ＿ＤＳＣａｖ１」と呼ばれる（表１を参照（好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質抗原設計））。
他の好ましい実施形態においては、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）のＲＳＶ Ｆ＿ｄｅｌタンパク質（細胞質側末端（ａａ５５４−５７４）が欠失）（配列番号９６５３又は１２０９５）を使用し、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌのアミノ酸変化を導入することによって、配列番号１２８３３に係るアミノ酸配列がもたらされる。このようなＲＳＶ Ｆタンパク質は、本発明全体を通して、本明細書では、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１」と呼ばれる（表１を参照（好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質抗原設計））。
好ましい実施形態においては、少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質は、成熟Ｆの２つのサブユニットＦ１及びＦ２を１本のポリペプチド鎖として含有する操作されたタンパク質であることができ、Ｆ２及びＦ１は、好ましくはリンカー（ＧＳ）を介して接続されている。前記操作されたＦ２−リンカー−Ｆ１融合タンパク質（例えば、Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３））の例は、当技術分野において記載されている（Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｇｏｒｄｏｎら、“Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｆｕｓｉｏｎ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ＲＳＶ．” Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２３．９ （２０１６）： ８１１；国際公開第２０１７１７２８９０号）。前記Ｆ２−リンカー−Ｆ１ ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ａａ１０４〜１４４（フューリン切断部位及びＰｅｐ２７を含む）を含まず、Ｆ２ポリペプチドとＦ１ポリペプチドとの間にリンカーエレメント（例えば、ＧＳリンカー）を含む。前記Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質は、安定性及び／又は抗原性の点で優れた性質を示すことができる。
したがって、好ましい実施形態においては、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、１本のポリペプチド鎖に融合された２つのサブユニットＦ２及びＦ１を含み、Ｆ２及びＦ１は、リンカーエレメント、好ましくは本明細書で特定されるＧＳリンカーを介して接続され、好ましくは安定したＦ２−リンカー−Ｆ１タンパク質を生成する。
好ましくは、前記Ｆ２−リンカー−Ｆ１融合タンパク質、例えば、Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３）は、上に概説したＤＳｃａｖ１変異（本明細書では、「ｍｕｔ０」と呼ぶ；例えば、配列番号３８５０、４２１９又は１３９４０、１４３０９）を更に含む。
特に好ましい実施形態においては、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、（Ｓ４６Ｇ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ａ１４９Ｃ、Ｙ４５８Ｃ）、（Ｎ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ）、（Ｑ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ｌ９５Ｍ、Ｓ２１５Ｐ、Ｉ２１７Ｐ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｑ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｌ９５Ｍ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ）、又は（Ｎ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ４６５Ｑ）、又はそれらの断片若しくはバリアントから選択される少なくとも１つの更なる変異を更に含むことができる。
特に好ましい実施形態においては、前記Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３））は、好ましくはＤＳＣａｖ１変異に加えて、Ｓ４６Ｇ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ（本明細書では、「ｍｕｔ１」と呼ぶ；例えば、配列番号１６３６、２００５、又は１４６７８、１５０４７）；又はＳ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ（本明細書では、「ｍｕｔ２」と呼ぶ；例えば、配列番号２３７４、２７４３又は１５４１６、１５７８５）；又はＳ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ（本明細書では、「ｍｕｔ３」と呼ぶ；例えば、配列番号３１１２、３４８１又は１３２０２、１３５７１）から選択される少なくとも１つの変異、又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアントを更に含むことができる（表１を参照（好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質抗原設計））。
他の実施形態においては、前記Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３））は、好ましくはＤＳＣａｖ１変異に加えて、Ａ１４９Ｃ、Ｙ４５８Ｃ（本明細書では、「ｍｕｔ４」と呼ぶ、例えば、配列番号４５８８、４９５７又は１６１５４、１６５２３）；又はＮ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ（本明細書では、「ｍｕｔ５」と呼ぶ、例えば、配列番号５３２６、５６９５又は１６８９２、１７２６１）；又はＱ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ｌ９５Ｍ、Ｓ２１５Ｐ、Ｉ２１７Ｐ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ、Ｋ４６５Ｑ（本明細書では、「ｍｕｔ６」と呼ぶ、例えば、配列番号６０６４、６４３３又は１７６３０、１７９９９）；又はＱ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｌ９５Ｍ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ（本明細書では、「ｍｕｔ７」と呼ぶ、例えば、配列番号６８０２、７１７１又は１８３６８、１８７３７）；又はＮ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ４６５Ｑ（本明細書では、配列番号７５４０、７９０９又は１９１０６、１９４７５）から選択される少なくとも１つの変異、又はこれら断片若しくはバリアントを更に含むことができる。
本発明の文脈において、任意のＲＳＶ Ｆは、２個のサブユニットＦ１及びＦ２が１本のポリペプチド鎖に含まれるように（Ｆ２及びＦ１は、リンカー、例えば、変異「ｍｕｔ１」、「ｍｕｔ２」、及び「ｍｕｔ３」について説明されるタンパク質の安定性を高めるための（ＧＳ）リンカーを介して連結することができる）、例えば、Ｆ０ポリペプチド鎖のａａ１０４〜１４４を欠失させることによって（上で説明）、上で説明されるＦ２とＦ１との間にリンカーエレメントを導入することによって、及び上で説明される好適なアミノ酸置換を導入することによって、適合させることができることが理解されるべきである。したがって、上に提供されるＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号（リスト２を参照）、又は配列番号６８、８２７９〜８９６７、４８３、８９６８〜９６８３、１１７２６、１２０９５から選択される任意のタンパク質、又はそれらの断片若しくはバリアントを、本明細書で概説するようにＦ２−リンカー−Ｆ１融合タンパク質を生成するように当業者であれば適合させることができ、（Ｓ４６Ｇ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ａ１４９Ｃ、Ｙ４５８Ｃ）、（Ｎ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ）、（Ｑ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ｌ９５Ｍ、Ｓ２１５Ｐ、Ｉ２１７Ｐ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｑ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｌ９５Ｍ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ）、又は（Ｎ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ４６５Ｑ）ａａ置換及び／又はＤＳＣａｖ１変異を導入することによって更に適合させることができる。更に、上で概説したＧＳリンカーの使用とは別に、当業者であれば言うまでもなく、各種の知られたリンカーエレメントから選択して、類似した同様に好適なＲＳＶ Ｆタンパク質バリアント（例えば、国内公開第２０１７／１７２８９０号の配列番号１１７〜１６２又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択される、又は国内公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１５０９〜１５６５又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択される）に到達することができる。
好ましい実施形態においては、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３））は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異を含む（本明細書では、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０と呼ぶ）。好ましい実施形態においては、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３）は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異と、上で定義したアミノ酸置換ｍｕｔ１を更に含む（本明細書では、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１と呼ぶ）。好ましい実施形態においては、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３）は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異と、上で定義したアミノ酸置換ｍｕｔ２を更に含む（本明細書では、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２と呼ぶ）。好ましい実施形態においては、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３）は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異と、上で定義したアミノ酸置換ｍｕｔ３を更に含む（本明細書では、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３と呼ぶ）。好ましい実施形態においては、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３））は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異と、上で定義したアミノ酸置換ｍｕｔ４を更に含む（本明細書では、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４と呼ぶ）。好ましい実施形態では、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３）は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異と、上で定義したアミノ酸置換ｍｕｔ５を更に含む（本明細書では、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５と呼ぶ）。好ましい実施形態では、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３）は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異と、上で定義したアミノ酸置換ｍｕｔ６を更に含む（本明細書ではＦ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６と呼ぶ）。好ましい実施形態においては、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３）は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異と、上で定義したアミノ酸置換ｍｕｔ７を更に含む（本明細書では、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７と呼ぶ）。好ましい実施形態では、Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質（Ｆ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５７４）又はＦ（１−１０３）−ＧＳ−Ｆ（１４５−５５３））は、上で概説したＤＳＣａｖ−１変異と、上で定義したアミノ酸置換ｍｕｔ８を更に含む（本明細書では、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８と呼ぶ）。
特に好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質の詳細な説明を、表１に記載する。
表１において、ＲＳＶ Ｆタンパク質におけるアミノ酸（ａａ）残基及びそれらの位置に関する言及はいずれも、ＨＲＳＶ（Ａ２）（配列番号６８）又はＨＲＳＶ（メンフィス−３７）（配列番号８９３７又は１１７２６）の対応するＦ０前駆体タンパク質における各ａａ残基の位置に関する。更に、表１における好適なＲＳＶ Ｆタンパク質抗原設計の略称は、本発明の説明全体で使用される（例えば、「Ｆ０」、「Ｆ−ｄｅｌ」、「Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８」、「Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０」、「Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０」）。表１の列Ａは、ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来するそれぞれのＲＳＶ Ｆタンパク質抗原設計のタンパク質配列番号を提供し；表１の列Ｂは、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来するそれぞれのＲＳＶ Ｆタンパク質抗原設計のタンパク質配列番号を提供する。なお、本発明の説明は、本願のＳＴ２５配列表の＜２２３＞識別子の下で提供される情報を明示的に含む。
Figure 2021519595
Figure 2021519595
特に好ましい実施形態においては、第１の態様に係る人工ＲＮＡは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードし、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質は、Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８（例えば、表１を参照）、又はこれらの断片若しくはバリアントから選択される。
本発明において、特に好ましく且つ有利なものは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８（例えば、表１を参照）、又はこれらの断片若しくはバリアントから選択されるＲＳＶ Ｆタンパク質である。
好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号６８、４８３、８９８、１２６７、１６３６、２００５、２３７４、２７４３、３１１２、３４８１、３８５０、４２１９、４５８８、４９５７、５３２６、５６９５、６０６４、６４３３、６８０２、７１７１、７５４０、７９０９、１１７２６、１２０９５、１２４６４、１２８３３、１３９４０、１４３０９、１４６７８、１５０４７、１５４１６、１５７８５、１３２０２、１３５７１、１６１５４、１６５２３、１６８９２、１７２６１、１７６３０、１７９９９、１８３６８、１８７３７、１９１０６、１９４７５（例えば、表１を参照）又は８２７９〜９６８３のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアントを含む又はからなる少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。ＲＳＶタンパク質をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、以下に説明するように、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号６８、４８３、８９８、１２６７、１６３６、２００５、２３７４、２７４３、３１１２、３４８１、３８５０、４２１９、４５８８、４９５７、５３２６、５６９５、６０６４、６４３３、６８０２、７１７１、７５４０、７９０９、１１７２６、１２０９５、１２４６４、１２８３３、１３９４０、１４３０９、１４６７８、１５０４７、１５４１６、１５７８５、１３２０２、１３５７１、１６１５４、１６５２３、１６８９２、１７２６１、１７６３０、１７９９９、１８３６８、１８７３７、１９１０６、１９４７５（例えば、表１を参照）びいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアントを含む又はからなる少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。ＲＳＶタンパク質をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、以下に説明するように、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号１２６７、２００５、２７４３、３４８１、４２１９、４９５７、５６９５、６４３３、７１７１、７９０９、１２８３３、１４３０９、１５０４７、１５７８５、１３５７１、１６５２３、１７２６１、１７９９９、１８７３７、１９４７５（例えば、表１を参照）のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアントを含む又はからなる少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。ＲＳＶタンパク質をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、以下に説明するように、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
他の実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号８２７９〜９６８３のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列の少なくとも１つ、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアントを含む又はからなる少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。ＲＳＶタンパク質をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、以下に説明するように、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
他の実施形態においては、本明細書に定義される人工ＲＮＡは、国際公開第２０１４／１６０４６３号の配列番号１〜１４２８のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアントを含む又はからなるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。この文脈において、国際公開第２０１４／１６０４６３号の配列番号１〜１４２８及びそれらに関連する開示を、参照により本明細書に援用する。
他の実施形態においては、本明細書に定義される人工ＲＮＡは、国際公開第２０１５／０２４６６８号の配列番号１〜１１のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアントを含む又はからなるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。この文脈において、国際公開第２０１５／０２４６６８号の配列番号１〜１１及びそれらに関連する開示を、参照により本明細書に援用する。
他の実施形態においては、本明細書に定義される人工ＲＮＡは、国際公開第２０１７／０７０６２２号の配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３、又は２４５のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアントを含む又はからなるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。この文脈において、国際公開第２０１７／０７０６２２号の配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３、又は２４５及びそれらに関連する開示を、参照により本明細書に援用する。
他の実施形態においては、本明細書に定義される人工ＲＮＡは、国際公開第２０１７／１７２８９０号の配列番号１〜６５、８１〜９５、１１０〜１１６のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアントを含む又はからなるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。この文脈において、国際公開第２０１７／１７２８９０号の配列番号１〜６５、８１〜９５、１１０〜１１６及びそれらに関連する開示を、参照により本明細書に援用する。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の人工ＲＮＡは、上で定義した少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードし、更に少なくとも１つの更なる異種ペプチド又はタンパク質エレメントをコードすることができる。
好適には、少なくとも１つの更なるペプチド又はタンパク質エレメントは、本発明のコード化抗原性ペプチド又はタンパク質の分泌を促進する（例えば、分泌シグナル配列を介して）、本発明のコード化抗原性ペプチド又はタンパク質の原形質膜への結合を促進する（例えば、膜貫通エレメントを介して）、抗原複合体の形成を促進する（例えば、多量体化ドメインを介して）、ウイルス様粒子の形成を促進する（ＶＬＰ形成配列）ことができる。更に、本発明に係る人工核酸配列は、ペプチドリンカーエレメント、自己切断ペプチド、免疫学的アジュバント配列、又は樹状細胞標的化配列を更にコードすることができる。好適な多量体化ドメインは、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１１１６〜１１６７に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。三量体化及び四量体化エレメントは、例えば、エンジニアードロイシンジッパー（平行三量体状態を採用するエンジニアードα−ヘリックスコイルドコイルペプチド）、腸内細菌ファージＴ４、ＧＣＮ４ｐＩＩ、ＧＣＮ４−ｐＬＩ、及びｐ５３に由来するフィブリチンフォールドンドメインから選択することができる。その文脈において、腸内細菌ファージＴ４、ＧＣＮ４ｐＩＩ、ＧＣＮ４−ｐＬＩ、及びｐ５３からのフィブリチンフォールドンドメインが好ましい。好適な膜貫通エレメントは、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１２２８〜１３４３に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。好適なＶＬＰ形成配列は、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１１６８〜１２２７に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。好適なペプチドリンカーは、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１５０９〜１５６５に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。好適な自己切断ペプチドは、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１４３４〜１５０８に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。好適な免疫学的アジュバント配列は、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１３６０〜１４２１に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。好適な樹状細胞（ＤＣ）標的化配列は、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１３４４〜１３５９に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。好適な分泌シグナルペプチドは、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１〜１１１５及び配列番号１７２８に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。核酸レベルでは、そのようなアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列（例えば、ＲＮＡ配列）を選択することができる。この文脈において、国際公開第２０１７／０８１０８２号の開示を、参照により本明細書に援用する。異種分泌シグナル配列は、コードされた抗原性ペプチド又はタンパク質の分泌を増加させることができる。
実施形態によれば、分泌シグナル配列は、配列番号２１３２９〜２１３６２のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントを含む。分泌シグナル配列をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
好ましい実施形態によれば、人工核酸、特に人工ＲＮＡは、本明細書に定義されるＲＳＶに由来する、好ましくはＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質コードする少なくとも１つのコード配列、又はその断片及びバリアントを含む。その文脈において、ＲＳＶに由来する、好ましくはＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする任意のコード配列、又はその断片及びバリアントは、好適なコード配列として理解することができ、したがって第１の態様の人工ＲＮＡに包含され得る。
好ましい実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、本明細書に定義されるＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列、好ましくは配列番号６８、４８３、８９８、１２６７、１６３６、２００５、２３７４、２７４３、３１１２、３４８１、３８５０、４２１９、４５８８、４９５７、５３２６、５６９５、６０６４、６４３３、６８０２、７１７１、７５４０、７９０９、１１７２６、１２０９５、１２４６４、１２８３３、１３９４０、１４３０９、１４６７８、１５０４７、１５４１６、１５７８５、１３２０２、１３５７１、１６１５４、１６５２３、１６８９２、１７２６１、１７６３０、１７９９９、１８３６８、１８７３７、１９１０６、１９４７５のいずれか、又はそれらのバリアントの断片をコードする少なくとも１つのコード配列を含む又はからなることができる。核酸レベルでは、任意の核酸配列、特に、配列番号６８、４８３、８９８、１２６７、１６３６、２００５、２３７４、２７４３、３１１２、３４８１、３８５０、４２１９、４５８８、４９５７、５３２６、５６９５、６０６４、６４３３、６８０２、７１７１、７５４０、７９０９、１１７２６、１２０９５、１２４６４、１２８３３、１３９４０、１４３０９、１４６７８、１５０４７、１５４１６、１５７８５、１３２０２、１３５７１、１６１５４、１６５２３、１６８９２、１７２６１、１７６３０、１７９９９、１８３６８、１８７３７、１９１０６、１９４７５と同一であるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードする任意のＲＮＡ配列である、又は配列番号６８、４８３、８９８、１２６７、１６３６、２００５、２３７４、２７４３、３１１２、３４８１、３８５０、４２１９、４５８８、４９５７、５３２６、５６９５、６０６４、６４３３、６８０２、７１７１、７５４０、７９０９、１１７２６、１２０９５、１２４６４、１２８３３、１３９４０、１４３０９、１４６７８、１５０４７、１５４１６、１５７８５、１３２０２、１３５７１、１６１５４、１６５２３、１６８９２、１７２６１、１７６３０、１７９９９、１８３６８、１８７３７、１９１０６、１９４７５のいずれかと少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列又はそれらの断片若しくはバリアントをコードする任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）を選択することができ、したがって好適なコード配列として理解することができ、したがって本発明の第１の態様の人工ＲＮＡに包含され得ることが理解されるべきである。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号８２７９〜９６８３のいずれかをコードする少なくとも１つのコード配列又はそのバリアントの断片を含む又はからなることができる。核酸レベルでは、任意の核酸配列、特に、配列番号８２７９〜９６８３と同一であるアミノ酸配列をコードする任意のＲＮＡ配列、又はその断片若しくはバリアント、又は配列番号８２７９〜９６８３のいずれかと少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列又はそれらの断片若しくはバリアントをコードする任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）を選択することができ、したがって好適なコード配列として理解することができ、したがって本発明の第１の態様の人工ＲＮＡに包含され得ることが理解されるべきである。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１４／１６０４６３号の配列番号１〜１４２８のいずれかコードする少なくとも１つのコード配列又はそのバリアントの断片を含む又はからなることができる。核酸レベルでは、任意の核酸配列、特に、国際公開第２０１４／１６０４６３号の配列番号１〜１４２８と同一であるアミノ酸配列をコードする任意のＲＮＡ配列、又はその断片若しくはバリアント、又は国際公開第２０１４／１６０４６３号の配列番号１〜１４２８のいずれかと少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列又はそれらの断片若しくはバリアントをコードする任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）を選択することができ、したがって好適なコード配列として理解することができ、したがって本発明の第１の態様の人工ＲＮＡに包含され得ることが理解されるべきである。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１５／０２４６６８号の配列番号１〜１１のいずれかコードする少なくとも１つのコード配列又はそのバリアントの断片を含む又はからなることができる。核酸レベルでは、任意の核酸配列、特に、国際公開第２０１５／０２４６６８号の配列番号１〜１１と同一であるアミノ酸配列をコードする任意のＲＮＡ配列、又はそれらの断片若しくはバリアント、又は国際公開第２０１５／０２４６６８号の配列番号１〜１１のいずれかと少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列又はそれらの断片若しくはバリアントをコードする任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）を選択することができ、したがって好適なコード配列として理解することができ、したがって本発明の第１の態様の人工ＲＮＡに包含され得ることが理解されるべきである。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１７／０７０６２２号の配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３、又は２４５のいずれかコードする少なくとも１つのコード配列又はそのバリアントの断片を含む又はからなることができる。核酸レベルでは、任意の核酸配列、特に、国際公開第２０１７／０７０６２２号の配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３、又は２４５と同一であるアミノ酸配列をコードする任意のＲＮＡ配列、又はそれらの断片若しくはバリアント、又は国際公開第２０１７／０７０６２２号の配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３、又は２４５のいずれかと少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列又はそれらの断片若しくはバリアントをコードする任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）を選択することができ、したがって好適なコード配列として理解することができ、したがって本発明の第１の態様の人工ＲＮＡに包含され得ることが理解されるべきである。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１７／１７２８９０号の配列番号１〜６５、８１〜９５、１１０〜１１６のいずれかコードする少なくとも１つのコード配列又はそのバリアントの断片を含む又はからなることができる。核酸レベルでは、任意の核酸配列、特に、国際公開第２０１７／１７２８９０号の配列番号１〜６５、８１〜９５、１１０〜１１６と同一であるアミノ酸配列をコードする任意のＲＮＡ配列、又はそれらの断片若しくはバリアント、又は国際公開第２０１７／１７２８９０号の配列番号１〜６５、８１〜９５、１１０〜１１６のいずれかと少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列又はそれらの断片若しくはバリアントをコードする任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）を選択することができ、したがって好適なコード配列として理解することができ、したがって本発明の第１の態様の人工ＲＮＡに包含され得ることが理解されるべきである。
好適には、特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、前記５’−ＵＴＲと前記３’−ＵＴＲとの間、好ましくは前記５’−ＵＴＲの下流且つ前記３’−ＵＴＲの上流に位置するコード配列を含む。
好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号６９〜４８２、４８４〜８９７、８９９〜１２６６、１２６８〜１６３５、１６３７〜２００４、２００６〜２３７３、２３７５〜２７４２、２７４４〜３１１１、３１１３〜３４８０、３４８２〜３８４９、３８５１〜４２１８、４２２０〜４５８７、４５８９〜４９５６、４９５８〜５３２５、５３２７〜５６９４、５６９６〜６０６３、６０６５〜６４３２、６４３４〜６８０１、６８０３〜７１７０、７１７２〜７５３９、７５４１〜７９０８、７９１０〜８２７７、８２７８、１１７２７〜１２０９４、１２０９６〜１２４６３、１２４６５〜１２８３２、１２８３４〜１３２０１、１３９４１〜１４３０８、１４３１０〜１４６７７、１４６７９〜１５０４６、１５０４８〜１５４１５、１５４１７〜１５７８４、１５７８６〜１６１５３、１３２０３〜１３５７０、１３５７２〜１３９３９、１６１５５〜１６５２２、１６５２４〜１６８９１、１６８９３〜１７２６０、１７２６２〜１７６２９、１７６３１〜１７９９８、１８０００〜１７９９８、１８３６９〜１８７３６、１８７３８〜１９１０５、１９１０７〜１９４７４、１９４７６〜１９８４３、２１３６３〜２１７０６、又はこれらの配列のいずれかの断片、又は断片若しくはバリアント（表３〜６も参照）と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列の少なくとも１つを含むコード配列を含む。これらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号６９〜７７、４８４〜４９２、８９９〜９０６、１２６８〜１２７５、１６３７〜１６４４、２００６〜２０１３、２３７５〜２３８２、２７４４〜２７５１、３１１３〜３１２０、３４８２〜３４８９、３８５１〜３８５８、４２２０〜４２２７、４５８９〜４５９６、４９５８〜４９６５、５３２７〜５３３４、５６９６〜５７０３、６０６５〜６０７２、６４３４〜６４４１、６８０３〜６８１０、７１７２〜７１７９、７５４１〜７５４８、７９１０〜７９１７、２１３６３〜２１３８４、１１７２７〜１１７３４、１２０９６〜１２１０３、１２４６５〜１２４７２、１２８３４〜１２８４１、１３９４１〜１３９４８、１４３１０〜１４３１７、１４６７９〜１４６８６、１５０４８〜１５０５５、１５４１７〜１５４２４、１５７８６〜１５７９３、１３２０３〜１３２１０、１３５７２〜１３５７９、１６１５５〜１６１６２、１６５２４〜１６５３１、１６８９３〜１６９００、１７２６２〜１７２６９、１７６３１〜１７６３８、１８０００〜１８００７、１８３６９〜１８３７６、１８７３８〜１８７４５、１９１０７〜１９１１４、１９４７６〜１９４８３、２１３８９〜２１４１０、又はこれらの配列のいずれかの断片、又は断片若しくはバリアント（表３及び４も参照）と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列の少なくとも１つを含むコード配列を含む。これらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１４／１６０４６３号の配列番号３８３〜３８８又はこれらの配列のいずれかの断片又は断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列の少なくとも１つを含むコード配列を含む。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１５／０２４６６８号の配列番号１２〜２２又はこれらの配列のいずれかの断片又は断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列の少なくとも１つを含むコード配列を含む。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１７／０７０６２２号の配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４４、２４６、２５７、２５８〜２８０又はこれらの配列のいずれかの断片又は断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列の少なくとも１つを含むコード配列を含む。
他の実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、国際公開第２０１７／１７２８９０号の配列番号９６〜９９又はこれらの配列のいずれかの断片又は断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列の少なくとも１つを含むコード配列を含む。
好ましい実施形態によれば、人工ＲＮＡは、修飾（改変）及び／又は安定化された人工ＲＮＡである。
したがって、好ましい実施形態によれば、本発明の人工ＲＮＡは、「安定化された人工ＲＮＡ」、即ち、インビボでの分解に対して改善された耐性を示すＲＮＡ、及び／又はインビボで改善された安定性を示す人工ＲＮＡ、及び／又はインビボで改善された翻訳能を示す人工ＲＮＡとして提供することができる。以下に、人工ＲＮＡを「安定化」させるために好適である、この文脈における具体的で好適な修飾について記載する。
このような安定化は、本明細書に明記される「乾燥ＲＮＡ」及び／又は「精製ＲＮＡ」を提供することによってもたらされ得る。それに代えて又はそれに加えて、そのような安定化は、例えば、本発明の人工ＲＮＡの修飾されたリン酸骨格によってもたらされ得る。本発明に関連する骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。これに関連して好ましく使用され得るヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオアート修飾リン酸骨格（好ましくはリン酸骨格に含まれるリン酸酸素の少なくとも１つが硫黄原子で置換されている）を含む。安定化されたＲＮＡは更に、例えば、非イオン性リン酸類似体、例えば、荷電ホスホン酸酸素がアルキル又はアリール基で置換されたアルキル及びアリールホスホン酸、又は荷電酸素残基がアルキル化された形態で存在するアルキルホスホトリエステル及びホスホジエステルなどを含み得る。このような骨格修飾は、通常、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、及びホスホロチオアート（例えば、シチジン−５’−Ｏ−（１−チオホスファート））からなる群の修飾を含むが、これらに限定されない。
以下に、本発明の人工ＲＮＡを「安定化」させることができる好適な修飾を記載する。
実施形態によれば、本発明に係る人工ＲＮＡは、修飾された人工ＲＮＡであり、修飾は、骨格修飾及び糖修飾又は塩基修飾を含む化学修飾に関する。
この文脈において、本明細書で定義される修飾人工ＲＮＡは、ヌクレオチドの類似体／修飾、例えば、骨格修飾、糖修飾、又は塩基修飾を含むことができる。本発明に関連する骨格修飾は、核酸、例えば、人工ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。本発明に関連する糖修飾は、本明細書で定義されるＲＮＡのヌクレオチドの糖の化学修飾である。更に、本発明に関連する塩基修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この文脈において、ヌクレオチド類似体又は修飾は、好ましくは、転写及び／又は翻訳に適用可能なヌクレオチド類似体から選択される。
本発明の特に好ましい実施形態では、修飾核酸又は特に本明細書に記載される修飾ＲＮＡに導入することができるヌクレオチド類似体／変異は、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスファート、２−アミノプリン−リボシド−５’−トリホスファート；２−アミノアデノシン−５’−トリホスファート、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−トリホスファート、２−チオシチジン−５’−トリホスファート、２−チオウリジン−５’−トリホスファート、２’−フルオロチミジン−５’−トリホスファート、２’−Ｏ−メチル−イノシン−５’−トリホスファート、４−チオウリジン−５’−トリホスファート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスファート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスファート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスファート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスファート、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスファート、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスファート、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、５−メチルシチジン−５’−トリホスファート、５−メチルウリジン−５’−トリホスファート、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、６−アザシチジン−５’−トリホスファート、６−アザウリジン−５’−トリホスファート、６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスファート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスファート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスファート、８−アザアデノシン−５’−トリホスファート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスファート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−トリホスファート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスファート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスファート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスファート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスファート、シュードウリジン−５’−トリホスファート、又はピューロマイシン−５’−トリホスファート、キサントシン−５’−トリホスファートから好ましく選択される。５−メチルシチジン−５’−トリホスファート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスファート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスファート、及びシュードウリジン−５’−トリホスファート、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、及び４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、及び４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ウィオシン（ｗｙｏｓｉｎｅ）、ウィブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオグアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−シチジン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−ウリジン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−シュードウリジン、６−アザ−シチジン、２−チオ−シチジン、アルファ−チオ−シチジン、シュード−イソ−シチジン、５−アミノアリル−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、アルファ−チオ−ウリジン、４−チオ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、５−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、アルファ−チオ−グアノシン、６−メチル−グアノシン、５−メチル−シチジン、８−オキソ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、２−アミノ−６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、シュード−イソ−シチジン、６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−アデノシン、アルファ−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシンからなる群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。本発明の文脈において特に好ましく且つ好適なものは、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メチルシトシン、及び５−メトキシウリジンである。したがって、本明細書に定義される人工ＲＮＡは、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メチルシトシン、及び５−メトキシウリジンから選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。
好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのコード配列を含み、少なくとも１つのコード配列は、シュードウリジン（Ψ）修飾コード配列である。
したがって、好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡ、又は少なくとも１つのコード配列は、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチドで置換された核酸配列を含む。
更に好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのコード配列を含み、少なくとも１つのコード配列は、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）修飾コード配列である。
したがって、好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡ、又は少なくとも１つのコード配列は、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換された核酸配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのコード配列を含み、少なくとも１つのコード配列は、コドン改変コード配列である。
好ましい実施形態においては、本発明の少なくとも１つのコード配列は、コドン改変コード配列であり、少なくとも１つのコドン改変コード配列によってコードされるアミノ酸配列は、対応する野生型コード配列によってコードされるアミノ酸配列と比較して変更がないことが好ましい。
「コドン改変コード配列」という用語は、対応する野生型コード配列と比較して、少なくとも１つのコドン（１つのアミノ酸をコードするヌクレオチドのトリプレット）が異なるコード配列に関する。好適には、本発明の文脈におけるコドン改変コード配列は、インビボでの分解に対して改善された耐性、及び／又はインビボでの改善された安定性、及び／又はインビボでの改善された翻訳能を示すことができる。最も広い意味でのコドン改変は、遺伝暗号の縮重を利用しており、この遺伝暗号の縮重は、複数のコドンが同一アミノ酸をコードすることができ、相互変換可能（表２を参照）に使用して、上で概説したインビボ用途のためのコード配列を最適化／改変することができる。
第１の態様の特に好ましい実施形態では、少なくとも１つの配列は、コドン改変コード配列であり、コドン改変コード配列は、Ｃ最大化コード配列、ＣＡＩ最大化コード配列、ヒトコドン使用適合化コード配列、Ｇ／Ｃ含量改変コード配列、及びＧ／Ｃ最適化コード配列、又はこれらの任意の組合せから選択される。
好ましい実施形態によれば、本発明の人工ＲＮＡを改変して、少なくとも１つのコード配列のＣ含量を、対応する野生型コード配列のＣ含量に対して増大させた、好ましくは最大化させることができる（本明細書では、「Ｃ最大化コード配列」と呼ぶ）。ＲＮＡのＣ最大化コード配列によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれの野生型核酸コード配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して変更がないことが好ましい。Ｃ最大化核酸配列の生成は、国際公開第２０１５／０６２７３８号に係る改変方法を使用して好適に行うことができる。この文脈において、国際公開第２０１５／０６２７３８号の開示を、参照により本明細書に援用する。配列表の＜２２３＞識別子を含む本発明の開示全体を通して、好適なＲＳＶ核酸配列のＣ最大化コード配列は、略称「ｏｐｔ２」で示される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の人工ＲＮＡを改変して、本発明の少なくとも１つのコード配列のＧ／Ｃ含量を、対応する野生型コード配列と比較して変更することができる（本明細書では、「Ｇ／Ｃ含量改変コード配列」と呼ぶ）。この文脈において、「Ｇ／Ｃ最適化」又は「Ｇ／Ｃ含量改変」という用語は、対応する野生型核酸配列と比較して変更された、好ましくは増加した数のグアノシン及び／又はシトシンヌクレオチドを含む、本発明の核酸、好ましくは人工核酸に関する。そのような増加した数は、アデノシン又はチミジンヌクレオチドを含むコドンを、グアノシン又はシトシンヌクレオチドを含むコドンで置換することによって生成することができる。濃縮されたＧ／Ｃ含量をＤＮＡ又はＲＮＡのコード配列で生じさせる場合、遺伝暗号の縮重を利用する。特に、ＲＮＡの場合、Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含量が増加した配列よりも安定している。核酸配列のＧ／Ｃ含量修飾コード配列によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれの野生型核酸コード配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して変わらないことが好ましい。好ましくは、本発明の人工核酸配列、例えば、ＲＮＡ配列のコード配列のＧ／Ｃ含量は、本明細書に定義されるＲＳＶ抗原又はその断片若しくはバリアントをコードする、対応する野生型核酸配列（例えば、ＲＮＡ配列）のコード配列のＧ／Ｃ含量と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％増加する。
好ましい実施形態によれば、本発明の人工ＲＮＡを改変して、本発明の少なくとも１つのコード配列のＧ／Ｃ含量を、対応する野生型コード配列のＧ／Ｃ含量と比較して変更することができる（本明細書では、「Ｇ／Ｃ含量最適化コード配列」と呼ぶ）。その文脈における「最適化された」とは、Ｇ／Ｃ含量が、好ましくは本質的に可能な限り最大のＧ／Ｃ含量にまで増加されたコード配列を意味する。核酸配列のＧ／Ｃ含量最適化コード配列によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれの野生型核酸コード配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して変わらないことが好ましい。前記したＧ／Ｃ含量最適化ＲＮＡ配列の生成は、国際公開第２００２／０９８４４３号に説明されるＧ／Ｃ含量最適化方法を使用して好適に行うことができる。この文脈において、国際公開第２００２／０９８４４３号の開示の全範囲が、本発明に含まれる。配列表の＜２２３＞識別子を含む本発明の開示全体を通して、好適なＲＳＶ核酸配列のＧ／Ｃ含量最適化コード配列は、略称「ｏｐｔ１、ｏｐｔ５、ｏｐｔ６、ｏｐｔ１１」で示される。
いくつか実施形態によれば、本発明の人工ＲＮＡを改変して、本発明の少なくとも１つのコード配列のコドンを、ヒトのコドン使用に適合させることができる（本明細書では、「ヒトコドン使用適合化コード配列」と呼ぶ）。同一アミノ酸をコードするコドンは、対象、例えば、ヒトで異なる頻度で生じる。したがって、人工ＲＮＡのコード配列は、同じアミノ酸をコードするコドンの頻度が、ヒトのコドン使用（例えば、表２を参照）に係るそのコドンの自然発生頻度に対応するように変更されることが好ましい。例えば、アミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、野生型コード配列は、コドン「ＧＣＣ」が０．４０の頻度で使用され、コドン「ＧＣＴ」が０．２８の頻度で使用され、コドン「ＧＣＡ」が０．２２の頻度で使用され、コドン「ＧＣＧ」が０．１０の頻度（表２を参照）で使用されるなどのように適合されることが好ましい。したがって、（Ａｌａで例示される）このような手順を、本発明の人工核酸のコード配列に適用することによって、ヒトコドン使用に適合された配列を得る。配列表の＜２２３＞識別子を含む本発明の開示全体を通して、好適なＲＳＶ核酸配列のヒトコドン使用適合化コード配列は、略称「ｏｐｔ３」で示される。
Figure 2021519595
いくつかの実施形態によれば、本発明の人工ＲＮＡを改変して、本発明の少なくとも１つのコード配列において、コドン適応指数（ＣＡＩ）を増加させる又は好ましくは最大化することができる（本明細書では、「ＣＡＩ最大化コード配列」と呼ぶ）。したがって、例えば、ヒト細胞において比較的稀な野生型核酸配列のコドンを全て、例えば、ヒト細胞において高頻度であるそれぞれのコドンに置き換えることが好ましく、ここで高頻度コドンは、比較的稀なコドンと同じアミノ酸をコードする。好適には、最も頻度の高いコドンが、コードされた各アミノ酸に使用される（表２を参照、最も高頻度のヒドコドンをアスタリスクで示す）。好適には、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのコード配列を含み、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）は、少なくとも０．５、少なくとも０．８、少なくとも０．９、又は少なくとも０．９５である。最も好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）は、１である。例えば、アミノ酸Ａｌａの場合、野生型コード配列は、最も高頻度のヒトコドン「ＧＣＣ」が常に前記アミノ酸に使用されるように適合される。したがって、（Ａｌａで例示される）そのような手順を、本発明の人工ＲＮＡのコード配列によってコードされる各アミノ酸に適用して、ＣＡＩ最大化コード配列を得る。配列表の＜２２３＞識別子を含む本発明の開示全体を通して、好適なＲＳＶ核酸配列のＣＡＩ最大化コード配列は、略称「ｏｐｔ４」で示される。
したがって、特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号７０〜７７、４８５〜４９２、８９９〜９０６、１２６８〜１２７５、１６３７〜１６４４、２００６〜２０１３、２３７５〜２３８２、２７４４〜２７５１、３１１３〜３１２０、３４８２〜３４８９、３８５１〜３８５８、４２２０〜４２２７、４５８９〜４５９６、４９５８〜４９６５、５３２７〜５３３４、５６９６〜５７０３、６０６５〜６０７２、６４３４〜６４４１、６８０３〜６８１０、７１７２〜７１７９、７５４１〜７５４８、７９１０〜７９１７、１１７２８〜１１７３４、１２０９７〜１２１０３、１２４６５〜１２４７２、１２８３４〜１２８４１、１３９４１〜１３９４８、１４３１０〜１４３１７、１４６７９〜１４６８６、１５０４８〜１５０５５、１５４１７〜１５４２４、１５７８６〜１５７９３、１３２０３〜１３２１０、１３５７２〜１３５７９、１６１５５〜１６１６２、１６５２４〜１６５３１、１６８９３〜１６９００、１７２６２〜１７２６９、１７６３１〜１７６３８、１８０００〜１８００７、１８３６９〜１８３７６、１８７３８〜１８７４５、１９１０７〜１９１１４、１９４７６〜１９４８３、２１３６３〜２１３８４、２１３８９〜２１４１０からなる群から選択されるコドン改変核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアント（表３及び表４も参照）と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるコドン改変核酸配列を含む少なくとも１つのコード配列を含む。これらの好適な核酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号７０〜７１、７５〜７７、４８５〜４８６、４９０〜４９２、８９９〜９００、９０４〜９０６、１２６８〜１２６９、１２７３〜１２７５、１６３７〜１６３８、１６４２〜１６４４、２００６〜２００７、２０１１〜２０１３、２３７５〜２３７６、２３８０〜２３８２、２７４４〜２７４５、２７４９〜２７５１、３１１３〜３１１４、３１１８〜３１２０、３４８２〜３４８３、３４８７〜３４８９、３８５２、４２２１、４５９０、４９５９、５３２８、５６９７、６０６６、６４３５、６８０４、７１７３、７５４２、７９１１、３８５６〜３８５８、４２２５〜４２２７、４５９４〜４５９６、４９６３〜４９６５、５３３２〜５３３４、５７０１〜５７０３、６０７０〜６０７２、６４３９〜６４４１、６８０８〜６８１０、７１７７〜７１７９、７５４６〜７５４８、７９１５〜７９１７、１１７２８、１１７３２〜１１７３４、１２０９７、１２１０１〜１２１０３、１２４６５、１２４６６、１２４７０〜１２４７２、１２８３４、１２８３５、１２８３９〜１２８４１、１３９４１、１３９４２、１３９４６〜１３９４８、１４３１０、１４３１１、１４３１５〜１４３１７、１４６７９、１４６８０、１４６８４〜１４６８６、１５０４８、１５０４９、１５０５３〜１５０５５、１５４１７、１５４１８、１５４２２〜１５４２４、１５７８６、１５７８７、１５７９１〜１５７９３、１３２０３、１３２０４、１３２０８〜１３２１０、１３５７２、１３５７３、１３５７７〜１３５７９、１６１５５、１６１５６、１６１６０〜１６１６２、１６５２４、１６５２５、１６５２９〜１６５３１、１６８９３、１６８９４、１６８９８〜１６９００、１７２６２、１７２６３、１７２６７〜１７２６９、１７６３１、１７６３２、１７６３６〜１７６３８、１８０００、１８００１、１８００５〜１８００７、１８３６９、１８３７０、１８３７４〜１８３７６、１８７３８、１８７３９、１８７４３〜１８７４５，１９１０７、１９１０８、１９１１２〜１９１１４、１９４７６、１９４７７、１９４８１〜１９４８３、２１３６３〜２１３８４、２１３８９〜２１４１０に係るＧ／Ｃ含量最適化又はＧ／Ｃ含量改変核酸配列のいずれか、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアント（表３及び表４も参照；ｏｐｔ１、５、６、１１）と同一である又は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるコドン改変核酸配列を含む少なくとも１つのコード配列を含む。これらの好適な核酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、配列番号７３、４８８、９０２、１２７１、１６４０、２００９、２３７８、２７４７、３１１６、３４８５、３８５４、４２２３、４５９２、４９６１、５３３０、５６９９、６０６８、６４３７、６８０６、７１７５、７５４４、７９１３、１１７３０、１２０９９、１２４６８、１２８３７、１３９４４、１４３１３、１４６８２、１５０５１、１５４２０、１５７８９、１３２０６、１３５７５、１６１５８、１６５２７、１６８９６、１７２６５、１７６３４、１８００３、１８３７２、１８７４１、１９１１０、１９４７９に係るヒトコドン使用適合化核酸配列のいずれか、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアント（表３及び表４も参照；ｏｐｔ３）と同一である又は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるコドン改変核酸配列を含む少なくとも１つのコード配列を含む。これらの好適な核酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、配列番号７２、４８７、９０１、１２７０、１６３９、２００８、２３７７、２７４６、３１１５、３４８４、３８５３、４２２２、４５９１、４９６０、５３２９、５６９８、６０６７、６４３６、６８０５、７１７４、７５４３、７９１２、１１７２９、１２０９８、１２４６７、１２８３６、１３９４３、１４３１２、１４６８１、１５０５０、１５４１９、１５７８８、１３２０５、１３５７４、１６１５７、１６５２６、１６８９５、１７２６４、１７６３３、１８００２、１８３７１、１８７４０、１９１０９、１９４７８に係るＣ最大化核酸配列のいずれか、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアント（表３及び表４も参照；ｏｐｔ２）と同一である又は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるコドン改変核酸配列を含む少なくとも１つのコード配列を含む。これらの好適な核酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、配列番号７４、４８９、９０３、１２７２、１６４１、２０１０、２３７９、２７４８、３１１７、３４８６、３８５５、４２２４、４５９３、４９６２、５３３１、５７００、６０６９、６４３８、６８０７、７１７６、７５４５、７９１４、１１７３１、１２１００、１２４６９、１２８３８、１３９４５、１４３１４、１４６８３、１５０５２、１５４２１、１５７９０、１３２０７、１３５７６、１６１５９、１６５２８、１６８９７、１７２６６、１７６３５、１８００４、１８３７３、１８７４２、１９１１１、１９４８０に係るＣＡＩ最大化核酸配列のいずれか、又はこれらの配列のいずれかの断片又はバリアント（表３及び表４も参照；ｏｐｔ４）と同一である又は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるコドン改変核酸配列を含む少なくとも１つのコード配列を含む。これらの好適な核酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細から得ることもできる。
いくつかの実施形態においては、人工核酸、特に本発明の人工ＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含量は、そのそれぞれの野生型核酸のリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含量と比較して増加させることができる。この改変（リボソーム結合部位の周りのＡ／Ｕ含量の増加）は、核酸、好ましくはＲＮＡへのリボソーム結合の効率を上昇させる。リボソームのリボソーム結合部位への効果的な結合は、次に、ＲＮＡの効率的な翻訳という効果を有する。したがって、特に好ましい実施形態においては、本発明の人工核酸は、配列番号４１、４２の配列のいずれか、又はそれらの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％同一である「コザック配列」とも呼ばれるリボソーム結合部位を含む。
好ましいＲＳＶポリペプチド及び核酸コード配列（「ｃｄｓ」）は、表３Ａ及び表３Ｂ並びに表４Ａ及び表４Ｂに与えられる。
表３Ａ及び表３Ｂの列Ａ〜列Ｊは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する本発明の具体的且つ好適な構築物を表し、列Ａは、Ｆ０に好適な配列を与え、列Ｂは、Ｆ−ｄｅｌに好適な配列を与え、列Ｃは、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１に好適な配列を与え、列Ｄは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１に好適な配列を与え、列Ｅは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１に好適な配列を与え、列Ｆは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１に好適な配列を与え、列Ｇは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２に好適な配列を与え、列Ｈは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２に好適な配列を与え、列Ｉは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３に好適な配列を与え、列ＪはＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３に好適な配列を与える。配列表に与えられる具体的なタンパク質の配列番号は、行２（「ＰＲＴ」）に与えられる。対応する野生型／非改変コード配列の配列番号は、行３（「ｗｔ」）に与えられる。各タンパク質構築物に対応するコドン改変コード配列の配列番号は、行４〜行１０に与えられる（「ｏｐｔ１」、「ｏｐｔ２」、「ｏｐｔ３」、「ｏｐｔ４」、「ｏｐｔ５」、「ｏｐｔ６」、「ｏｐｔ１１」）。表３Ａでは、ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来するコード配列が与えられ、表３Ｂでは、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来するコード配列が与えられる。更なる情報は、配列表の各配列番号の＜２２３＞識別子に与えられる。
Figure 2021519595
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表４Ａ及び表４Ｂの列Ｋ〜列Ｖは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する本発明の具体的且つ好適な構築物を表し、列Ｋは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０に好適な配列を与え、列Ｌは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０に好適な配列を与え、列Ｍは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４に好適な配列を与え、列Ｎは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４に好適な配列を与え、列Ｏは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５に好適な配列を与え、列Ｐは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５に好適な配列を与え、列Ｑは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６に好適な配列を与え、列Ｒは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６に好適な配列を与え、列Ｓは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７に好適な配列を与え、列Ｔは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７に好適な配列を与え、列Ｕは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８に好適な配列を与え、列Ｖは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８に好適な配列を与える。配列表に与えられる具体的なタンパク質の配列番号は、行２（「ＰＲＴ」）に与えられる。各タンパク質構築物の対応するコドン改変コード配列の配列番号は、行３〜行９に与えられる（「ｏｐｔ１」、「ｏｐｔ２」、「ｏｐｔ３」、「ｏｐｔ４」、「ｏｐｔ５」、「ｏｐｔ６」、「ｏｐｔ１１」）。表４Ａでは、ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来するコード配列が与えられ、表４Ｂでは、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来するコード配列が与えられる。更なる情報は、配列表の各配列番号の＜２２３＞識別子に与えられる。
Figure 2021519595
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いくつかの実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、モノシストロン性、バイシストロン性、又はマルチシストロン性である。
好ましい実施形態では、本発明の人工ＲＮＡは、モノシストロン性である。
「モノシストロン性核酸」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、本明細書で定義されるコード配列を１つだけ含む人工ＲＮＡを意味することが意図される。本明細書に使用される「バイシストロン性核酸、マルチシストロン性核酸」又は「モノシストロン性ＲＮＡ」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、２つ（バイシストロン性）又は更にそれ以上（マルチシストロン性）のコード配列を有し得る人工ＲＮＡを意味することが意図される。
いくつかの実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡはモノシストロン性であり、前記モノシストロン性人工ＲＮＡのコード配列は、本明細書で定義されるＲＳＶ Ｆに由来する少なくとも２つの異なる抗原性ペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくはバリアントをコードする。したがって、モノシストロン性人工ＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、アミノ酸リンカー配列と連結された又は連結されない、ＲＳＶ、好ましくは本明細書で定義されるＲＳＶ Ｆに由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８個、及びそれ以上の抗原性ペプチド又はタンパク質をコードすることができ、前記リンカー配列は、上で定義した剛性リンカー、可撓性リンカー、切断可能リンカー（例えば、自己切断ペプチド）、又はそれらの組合せ（本明細書では、「マルチ抗原構築物／核酸」と呼ぶ）を含むことができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、バイシストロン性又はマルチシストロン性であり、少なくとも２つのコード配列を含み、少なくとも２つのコード配列は、ＲＳＶ、好ましくは本明細書で定義されるＲＳＶ Ｆ、又はこれらのいずれかの断片若しくはバリアントに由来する２つ以上の異なる抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする。したがって、バイシストロン性又はマルチシストロン性人工ＲＮＡにおけるコード配列は、好適には、本明細書で定義される異なる抗原性タンパク質又はペプチド、又はそれらの断片若しくはバリアントをコードする。好ましくは、前記バイシストロン性又はマルチシストロン性人工ＲＮＡにおけるコード配列は、少なくとも１つのＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列によって分離され得る。したがって、「２つ以上の抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする」という用語は、限定されるものではないが、バイシストロン性又はマルチシストロン性人工ＲＮＡが、例えば、異なるＲＳＶの少なくとも２、３、４、５、６個、又はそれ以上の（好ましくは異なる）抗原性ペプチド又はタンパク質、又は本明細書に記載される定義の範囲内のそれらの断片若しくはバリアントをコードする。或いは、バイシストロン性又はマルチシストロン性人工ＲＮＡは、例えば、同一のＲＳＶに由来する少なくとも２、３、４、５、６個、又はそれ以上の（好ましくは異なる）抗原性ペプチド若しくはタンパク質、又は本明細書に記載される定義の範囲内の断片若しくはバリアントをコードする。その文脈において、好適なＩＲＥＳ配列は、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１５６６〜１６６２に係る核酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片若しくはバリアントから選択することができる。この文脈において、ＩＲＥＳ配列に関する国際公開第２０１７／０８１０８２号の開示を、参照により本明細書に援用する。
本発明の文脈において、コード配列の特定の組合せは、モノシストロン性、バイシストロン性、及びマルチシストロン性人工核酸及び／又はマルチ抗原構築物／核酸の任意の組合せによって生成され、本明細書に定義される複数の抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする核酸組成物を得ることができることが理解されるべきである。
好ましくは、本明細書に定義される少なくとも１つのコード配列を含む人工ＲＮＡは、典型的には、約５０〜約２００００、又は５００〜約２００００ヌクレオチド、又は約５００〜約２００００ヌクレオチド、又は約５００〜約１００００ヌクレオチド、又は約１０００〜約１００００ヌクレオチド、又は好ましくは約１０００〜約５０００ヌクレオチド、又は更により好ましくは約１０００〜約２５００ヌクレオチドの長さを含む。
好ましい実施形態によれば、第１の態様の人工ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、又はレプリコンＲＮＡであることができる。
いくつかの実施形態においては、人工ＲＮＡは環状ＲＮＡである。本明細書で使用される「環状ＲＮＡ」又は「ｃｉｒｃＲＮＡ」は、本明細書で定義される少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードすることができる環状ポリヌクレオチドとして理解されるべきである。したがって、好ましい実施形態においては、前記環状ＲＮＡは、ＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質、又は本明細書で定義されるそれらの断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含む。ｃｉｒｃＲＮＡの生成は、当技術分野で提供される様々な方法を使用して行うことができる。例えば、米国特許第６２１０９３１号明細書は、自発的切断及び自己環化の能力を有する配列を含むプラスミドにＤＮＡ断片を挿入することにより、ｃｉｒｃＲＮＡを合成する方法を教示する。米国特許第５７７３２４４号明細書は、ＲＮＡシクラーゼリボザイムをコードするＤＮＡ構築物を作製し、ＤＮＡ構築物をＲＮＡとして発現させ、次いでＲＮＡを自己スプライスさせることにより、インビトロでイントロンのないｃｉｒｃＲＮＡを生成することにより、ｃｉｒｃＲＮＡを生成することを教示する。国際公開第１９９２／００１８１３号は、線状ポリヌクレオチドを合成し、線状ヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件下で相補的連結オリゴヌクレオチドと組み合わせ、線状ポリヌクレオチドをライゲーションすることによって一本鎖環状核酸を作製するプロセスを教示する。当業者はまた、国際公開第２０１５／０３４９２５号又は国際公開第２０１６／０１１２２２号で提供される方法を使用して、環状ＲＮＡを生成することができる。したがって、米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、国際公開第１９９２／００１８１３号、国際公開第２０１５／０３４９２５号、及び国際公開第２０１６／０１１２２２号で提供される環状ＲＮＡを生成する方法を、参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態においては、人工ＲＮＡはレプリコンＲＮＡである。「レプリコンＲＮＡ」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、最適化された自己複製人工ＲＮＡ構築物であることが意図される。そのような構築物は、アルファウイルス由来の複製エレメント（レプリカーゼ）、及び目的の人工核酸による構造ウイルスタンパク質の置換（本発明の文脈では、ＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む人工核酸）を含む。或いは、レプリカーゼは、例えば、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、又はアルファウイルス科に属する他のウイルスなどに由来するレプリカーゼＲＮＡ配列を含む独立した構築物に提供することができる。レプリカーゼの下流には、本発明の人工核酸の複製を制御するサブゲノムプロモーター、即ち、ＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む人工核酸が存在する。
好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡはｍＲＮＡである。
「ＲＮＡ」及び「ｍＲＮＡ」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、リボ核酸分子、即ちヌクレオチドからなるポリマーであることが意図される。これらのヌクレオチドは通常、いわゆる骨格に沿って互いに結合されているアデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、グアノシン一リン酸、及びシチジン一リン酸モノマーである。骨格は、第１の糖、即ちリボースと、第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の連続がＲＮＡ配列と呼ばれる。ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）は通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。
本発明の人工ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製することができ、例えば、固相ＲＮＡ合成、及びＲＮＡインビトロ転写反応などのインビトロ法などの化学合成などがその方法として挙げられる。
好ましい実施形態では、人工ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、ＲＮＡのインビトロ転写によって得られる。
したがって、本発明のＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写されたＲＮＡである。
「ＲＮＡインビトロ転写」又は「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡが無細胞系（インビトロ）で合成されるプロセスに関する。ＲＮＡは、本発明にしたがう、線状化プラスミドＤＮＡテンプレート又はＰＣＲ増幅ＤＮＡテンプレートである適切なＤＮＡテンプレートのＤＮＡ依存性インビトロ転写によって得ることができる。ＲＮＡインビトロ転写を制御するためのプロモーターは、任意のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモーターであることができる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの具体例は、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、又はＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼである。本発明の好ましい実施形態においては、ＤＮＡテンプレートは、それがＲＮＡのインビトロ転写に付される前に、適切な制限酵素で線状化される。
ＲＮＡのインビトロ転写で使用される試薬は、通常、バクテリオファージがコードされたＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、又はＳｙｎ５）などのそれぞれのＲＮＡポリメラーゼに対して高い結合親和性を有するプロモーター配列を有するＤＮＡテンプレート（線状化プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）；４塩基（アデニン、シトシン、グアニン、及びウラシル）のリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）；任意に、本明細書に定義されるキャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ））；任意に、本明細書に定義される更なる修飾ヌクレオチド；ＤＮＡテンプレート内のプロモーター配列に結合できるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、又はＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼ）；任意に、汚染の可能性があるＲＮａｓｅを不活性化するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）阻害剤；任意に、ＲＮＡのインビトロ転写を阻害する可能性があるピロリン酸を分解するピロホスファターゼ；ポリメラーゼの補因子としてＭｇ２＋イオンを供給するＭｇＣｌ２；適切なｐＨ値を維持するためのバッファー（ＴＲＩＳ又はＨＥＰＥＳ）（これは、抗酸化剤（例えば、ＤＴＴ）、及び／又はスペルミジンなどのポリアミンを最適濃度で含むこともでき、例としては、国際公開第２０１７／１０９１６１号に開示されるＴＲＩＳ−クエン酸塩を含む緩衝系がある）を含む。
いくつかの実施形態においては、ＲＮＡのインビトロ転写で使用されるヌクレオチド混合物は、本明細書で定義される修飾ヌクレオチドを更に含むことができる。その文脈において、好ましい修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メチルシトシン、及び／又は５−メトキシウリジンを含む。
好ましい実施形態においては、ＲＮＡのインビトロ転写反応に使用されるヌクレオチド混合物（即ち、混合物中の各ヌクレオチドの画分）は、好ましくは国際公開第２０１５／１８８９３３号に記載されるように、所定のＲＮＡ配列に対して最適化させることができる。
本明細書で定義される１超の異なる人工ＲＮＡを生成する必要がある実施形態、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の異なる人工ＲＮＡを生成する必要がある場合（例えば、異なるＲＳＶ Ｆ抗原、又は例えばＲＳＶ ＦとＲＳＶ Ｇの組合せをコードする；第２の態様を参照）、国際公開第２０１７／１０９１３４号に記載される手順を好適に使用することができる。
ＲＮＡワクチン製造の文脈においては、ＧＭＰグレードのＲＮＡを提供する必要がある。ＧＭＰグレードのＲＮＡは、規制当局によって承認された製造プロセスを使用して製造され得る。したがって、特に好ましい実施形態においては、ＲＮＡ製造は、現行の適正製造基準（ＧＭＰ）の下で行われ、好ましくは国際公開第２０１６／１８０４３０号にしたがって、ＤＮＡ及びＲＮＡレベルでの様々な品質管理工程を行う。好ましい実施形態においては、本発明のＲＮＡは、ＧＭＰグレードのＲＮＡ、特にＧＭＰグレードのｍＲＮＡである。
得られたＲＮＡ産物は、好ましくは、ＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＣｕｒｅＶａｃ、チュービンゲン、ドイツ；国際公開第２００８／０７７５９２号にしたがうＲＰ−ＨＰＬＣ）及び／又はタンジェンシャルフローろ過（国際公開第２０１６／１９３２０６号に記載）を使用して精製される。
更に好ましい実施形態においては、ＲＮＡ、特に精製されたＲＮＡは、国際公開第２０１６／１６５８３１号又は国際公開第２０１１／０６９５８６号にしたがって凍結乾燥され、本明細書に定義される温度安定性乾燥人工ＲＮＡ（粉末）を得る。本発明のＲＮＡ、特に精製されたＲＮＡはまた、国際公開第２０１６／１８４５７５号又は国際公開第２０１６１８４５７６号にしたがって噴霧乾燥又は噴霧凍結乾燥を使用して乾燥させて、本明細書に定義される温度安定性ＲＮＡ（粉末）を得ることができる。したがって、ＲＮＡの製造及び精製に関して、国際公開第２０１７／１０９１６１号、国際公開第２０１５／１８８９３３号、国際公開第２０１６／１８０４３０号、国際公開第２００８／０７７５９２号、国際公開第２０１６／１９３２０６号、国際公開第２０１６／１６５８３１号、国際公開第２０１１／０６９５８６号、国際公開第２０１６／１８４５７５号、及び国際公開第２０１６／１８４５７６号の開示を、参照により本明細書に援用する。
したがって、好ましい実施形態においては、ＲＮＡは乾燥ＲＮＡ、特に乾燥ｍＲＮＡである。
本明細書で使用される「乾燥ＲＮＡ」という用語は、温度安定性乾燥ＲＮＡ（粉末）を得るために、上で定義した凍結乾燥、又は噴霧乾燥、又は噴霧凍結乾燥されたＲＮＡとして理解されるべきである。
好ましい実施形態では、本発明の人工ＲＮＡは、精製されたＲＮＡ、特に精製されたｍＲＮＡである。
本明細書で使用される「精製されたＲＮＡ」又は「精製されたｍＲＮＡ」という用語は、特定の精製工程（例えば、ＨＰＬＣ、ＴＦＦ、オリゴｄ（Ｔ）精製、沈殿工程）後に出発材料（例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ）よりも高い精製度を有するＲＮＡとして理解されるべきである。精製されたＲＮＡに本質的には存在しない典型的な不純物としては、ペプチド又はタンパク質（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡインビトロ転写に由来する酵素、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ、ピロホスファターゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ）、スペルミジン、ＢＳＡ、不完全ＲＮＡ配列、ＲＮＡ断片（短い二本鎖ＲＮＡ断片、不完全配列など）、遊離ヌクレオチド（修飾ヌクレオチド、従来のＮＴＰ、キャップアナログ）、テンプレートＤＮＡ断片、バッファー成分（ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＭｇＣｌ２）などがある。例えば、発酵手順に由来し得るその他の考えられ得る不純物は、細菌不純物（バイオバーデン、細菌ＤＮＡ）又は精製手順に由来する不純物（有機溶媒など）を含む。したがって、この点に関して、「ＲＮＡ純度の程度」は可能な限り１００％に近いことが望ましい。完全長のＲＮＡ転写産物の量が可能な限り１００％に近いことも、ＲＮＡ純度の程度にとって望ましい。したがって、本明細書で使用される「精製されたＲＮＡ」は、７５％、８０％、８５％、非常に特に９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは９９％以上の純度を有する。純度の程度は、例えば、分析用ＨＰＬＣによって決定することができ、前記のパーセンテージは、標的ＲＮＡのピークの面積と副生成物を表す全ピークの総面積との間の比に対応する。或いは、純度の程度は、例えば、分析用アガロースゲル電気泳動又はキャピラリーゲル電気泳動によって決定することができる。
本明細書で定義される「乾燥されたＲＮＡ」及び本明細書で定義される「精製されたＲＮＡ」又は本明細書で定義される「ＧＭＰグレードのｍＲＮＡ」は、優れた安定特性（インビトロ、インビボ）及び改善された効率（例えば、インビボでのｍＲＮＡのより優れた翻訳能）を有することができ、したがって、本発明の状況において特に好適である。更に、本明細書で定義される「乾燥されたＲＮＡ」及び本明細書で定義される「精製されたＲＮＡ」又は「ＧＭＰグレードのｍＲＮＡ」は、本明細書で定義される医学用途に特に適している場合がある。
人工ＲＮＡは、５’−キャップ構造の付加によって好適に修飾することができ、これは、本明細書に記載されるように、核酸を安定化することが好ましい。したがって、好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、５’−キャップ構造、好ましくはｍ７Ｇ、ｃａｐ０（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）、ｃａｐ１（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ））、ｃａｐ２、修飾されたｃａｐ０、又は修飾されたｃａｐ１構造（これらは、以下に定義されるキャップアナログを使用して生成される）。
本明細書で使用される「５’−キャップ構造」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、修飾されたヌクレオチド（キャップ類似体）、特にグアニンヌクレオチドを意味することが意図され、ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ分子の５’末端に付加される。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を使用して付加される（ｍ７ＧｐｐｐＮとも呼ばれる）。５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’−セコヌクレオチド、非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分、３’−３’−反転脱塩基部分、３’−２’−反転ヌクレオチド部分、３’−２’−反転脱塩基部分、１，４−ブタンジオールリン酸、３’−ホスホルアミダート、ヘキシルリン酸、リン酸アミノヘキシル、３’−リン酸、３’−ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又は架橋又は非架橋メチルホスホナート部分が挙げられる。
本発明の文脈において好適であり得る更なる５’−キャップ構造は、ｃａｐ１（ｍ７ＧｐｐｐＮの隣接ヌクレオチドのリボースの更なるメチル化）、ｃａｐ２（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の２番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ｃａｐ３（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の３番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ｃａｐ４（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の４番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）、修飾されたＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオアート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンである。
５’−キャップ（ｃａｐ０又はｃａｐ１）構造は、化学的ＲＮＡ合成又は、好ましくはキャップアナログを使用したＲＮＡインビトロ転写（共転写キャッピング）においても形成され得る。
本明細書で使用される「キャップ類似体」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、核酸分子の５’末端に組み込まれたときに、翻訳又は局在化を促進する及び／又は核酸分子、特に、ＲＮＡ分子の分解を防止するというキャップ機能性を有する非重合性ジヌクレオチドを意味することが意図される。非重合性とは、キャップアナログが５’末端にのみ組み込まれることを意味する。これは、５’三リン酸を有さず、テンプレート依存性ポリメラーゼ、特にテンプレート依存性ＲＮＡポリメラーゼによって３’方向に伸長できないからである。キャップ類似体の例としては、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、又はアンチ反転キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が挙げられるが、これらに限定されない。更なるキャップ類似体は、これまでに記載されている（国際公開第２００８／０１６４７３号、国際公開第２００８／１５７６８８号、国際公開第２００９／１４９２５３号、国際公開第２０１１／０１５３４７号、及び国際公開第２０１３／０５９４７５号）。その文脈における更なる適切なキャップ類似体は、国際公開第２０１７／０６６７９３号、国際公開第２０１７／０６６７８１号、国際公開第２０１７／０６６７９１号、国際公開第２０１７／０６６７８９号、国際公開第２０１７／０５３２９７号、国際公開第２０１７／０６６７８２号、国際公開第２０１８０７５８２７号、及び国際公開第２０１７／０６６７９７号に記載されており、これらのキャップ類似体に関する開示を、参照により本明細書に援用する。
５’−キャップ構造は、本明細書に定義されるＲＮＡインビトロ転写反応において、本明細書に定義されるキャップアナログを使用して共転写により好適に付加することができる。
好ましい実施形態では、修飾されたｃａｐ１構造は、国際公開第２０１７／０５３２９７号、国際公開第２０１７／０６６７９３号、国際公開第２０１７／０６６７８１号、国際公開第２０１７／０６６７９１号、国際公開第２０１７／０６６７８９号、国際公開第２０１７／０６６７８２号、国際公開第２０１８０７５８２７号、及び国際公開第２０１７／０６６７９７号に開示されるキャップ類似体を使用して生成される。特に、国際公開第２０１７／０５３２９７号の請求項１〜５に開示された構造から誘導可能な任意のキャップ構造は、修飾されたキャップ１構造を共転写により生成するために好適に使用することができる。更に、国際公開第２０１８０７５８２７号の請求項１又は請求項２１で定義された構造から誘導可能な任意のキャップ構造は、修飾されたｃａｐ１構造を共転写により生成するために好適に使用することができる。
好ましいキャップ類似体は、ｃａｐ０構造を共転写により生成するジヌクレオチドキャップアナログｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ）又は３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。特に好ましいキャップアナログは、ｃａｐ１構造を共転写により生成するトリヌクレオチドキャップアナログｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧである。
その文脈において、本発明のＲＮＡは、上で定義したＣａｐ１構造を含むことが好ましく、これは、好ましくは、高いキャッピング効率と翻訳効率の向上などによって、タンパク質発現の増大をもたらす。更に好適には、Ｃａｐ１構造を含む本発明のＲＮＡは、同一核酸配列のＣａｐ０構築物と比較して、自然免疫系の刺激の低下を示す。当業者であれば、翻訳効率、キャッピング度、及び免疫刺激を決定する方法を認識している。
特に好ましい実施形態においては、本発明の第１の態様の人工ＲＮＡは、ｃａｐ１構造を含み、前記ｃａｐ１構造は、酵素的又は共転写的に（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ類似体を用いて）形成することができる。
好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧキャップ構造を含む。そのような実施形態においては、コードＲＮＡは、５’末端のｍ７Ｇキャップ、及びｍ７ＧｐｐＮの隣接ヌクレオチドのリボースの更なるメチル化（その場合は、２’Ｏメチル化アデノシン）を含む。
他の好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧキャップ構造を含む。そのような実施形態においては、コードＲＮＡは、５’末端のｍ７Ｇキャップ、及び隣接ヌクレオチドのリボースの更なるメチル化（その場合は、２’Ｏメチル化グアノシン）を含む。
したがって、本発明の文脈において好適なＲＮＡ又はｍＲＮＡ配列に言及する場合は、常に、前記ＲＮＡ又はｍＲＮＡ配列の最初のヌクレオチド、即ち、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ構造の下流のヌクレオチドは、２’Ｏメチル化グアノシン又は２’Ｏメチル化アデノシンであり得る。
したがって、他の実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、配列番号４３又は２１３２１に係る５’キャップ配列エレメント、又はその断片若しくはバリアントを含むことができる。
他の実施形態においては、５’−キャップ構造は、キャッピング酵素（例えば、ワクシニアウイルスキャッピング酵素、市販のキャッピングキット）を使用する酵素的キャッピングを介して付加され、ｃａｐ０又はｃａｐ１又はｃａｐ２構造を生成する。他の実施形態においては、５’−キャップ構造（ｃａｐ０、ｃａｐ１）は、固定化キャッピング酵素を使用する、例えば、キャッピングリアクターを使用する（国際公開第２０１６／１９３２２６号）酵素的キャッピングを介して付加される。
好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、好ましくは３０〜１５０個のアデノシンヌクレオチドを含む、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列を含む。
好ましい実施形態においては、好適には３’末端に位置するポリ（Ａ）配列は、１０〜５００個のアデノシンヌクレオチド、１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、４０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、又は４０〜１５０個のアデノシンヌクレオチドを含む。特に好ましい実施形態においては、ポリ（Ａ）配列は、約６４個のアデノシンヌクレオチドを含む。更に特に好ましい実施形態においては、ポリ（Ａ）配列は、約７５個のアデノシンヌクレオチドを含む。更に特に好ましい実施形態においては、ポリ（Ａ）配列は、約１００個のアデノシンヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される「ポリ（Ａ）配列」、「ポリ（Ａ）テール」、又は「３’−ポリ（Ａ）テール」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、ＲＮＡの３’末端に位置する一連のアデノシンヌクレオチド、典型的には、最大約１０００個までのアデノシンヌクレオチドのであることが意図される。好ましくは、前記ポリ（Ａ）配列は、本質的にホモポリマーであり、例えば、本質的に１００ヌクレオチドの長さを有する１００アデノシンヌクレオチドなどのポリ（Ａ）配列である。他の実施形態においては、ポリ（Ａ）配列は、アデノシンヌクレオチドとは異なる少なくとも１つのヌクレオチドによって中断されてもよく、例えば、１００アデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）配列は、１００個を超えるヌクレオチドの長さを有し得る（１００個のアデノシンヌクレオチドと、更にアデノシンヌクレオチドとは異なる前記少なくとも１つのヌクレオチドとを含む）。
本発明の文脈において、ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡ又は他の任意の核酸分子内、例えば、ＤＮＡベクター内、例えば、前記ＤＮＡベクターの転写による、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ生成のためのテンプレートとして機能するベクター内などに位置し得る。
好ましくは、人工ＲＮＡのポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡのインビトロ転写中、ＤＮＡテンプレートから得られる。他の実施形態においては、ポリ（Ａ）配列は、必ずしもＤＮＡテンプレートからの転写ではなく、化学合成の一般的な方法によってインビトロで得られる。他の実施形態においては、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの酵素的ポリアデニル化（ＲＮＡのインビトロ転写後）に、市販のポリアデニル化キット及び当技術分野で公知の対応するプロトコルを使用して、又はこれに代えて、例えば、ポリアデニル化リアクタ（国際公開第２０１６／１７４２７１号に記載）で固定化ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用することよって生成される。
いくつかの実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、ベクターに由来するポリ（Ａ）配列を含むことができ、酵素的ポリアデニル化（例えば、国際公開第２０１６／０９１３９１号に記載）によって生成される少なくとも１つの更なるポリ（Ａ）配列を含むことができる。
好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列を含み、好ましくは１０〜４０個のシトシンヌクレオチドを含む。
好ましい実施形態においては、好適には３’末端に位置するポリ（Ｃ）配列は、１０〜２００個のシトシンヌクレオチド、１０〜１００個のシトシンヌクレオチド、２０〜７０個のシトシンヌクレオチド、２０〜６０個のシトシンヌクレオチド、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドを含む。特に好ましい実施形態においては、ポリ（Ｃ）配列は、約３０個のシトシンヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される「ポリ（Ｃ）配列」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、シトシンヌクレオチドの配列であり、典型的には、ＲＮＡの３’末端に位置する最大約２００個までのシトシンヌクレオチドのことが意図される。本発明の文脈において、ポリ（Ｃ）配列は、ｍＲＮＡ又は他の任意の核酸分子内、例えば、ＤＮＡベクター内、例えば、ベクターの転写による、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ生成のためのテンプレートとして機能するベクター内などに位置し得る。
好ましくは、本発明のＲＮＡ配列におけるポリ（Ｃ）配列は、ＲＮＡのインビトロ転写によりＤＮＡテンプレートから得られる。他の実施形態では、ポリ（Ｃ）配列は、必ずしもＤＮＡテンプレートからの転写ではなく、化学合成の一般的な方法によってインビトロで得られる。
他の実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、本明細書で定義されるポリ（Ｃ）配列を含まない。
好ましい実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのヒストンステムループを含む。
本明細書で使用される「ヒストンステムループ」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、主にヒストンｍＲＮＡに見られる核酸配列を意味することが意図される。例示的なヒストンステムループ配列は、ロペスら（Ｄａｖｉｌａ Ｌｏｐｅｚら（２００８），ＲＮＡ，１４（１））に記載されている。ヒストンプレｍＲＮＡのステムループには、通常、ヒストンダウンストリームエレメント（ＨＤＥ）として知られるプリンリッチ配列が続く。これらのプレｍＲＮＡは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡとＨＤＥとの塩基対合を介してＵ７ ｓｎＲＮＰによって触媒される、ステムループの約５ヌクレオチド下流の単一のエンドヌクレアーゼ開裂によって核内でプロセシングされる。
ヒストンステムループ配列／構造は、国際公開第２０１２／０１９７８０号に開示されるヒストンステムループ配列から好適に選択することができ、ヒストンステムループ配列／構造に関する開示を、参照により本明細書に援用する。本発明において使用することができるヒストンステムループ配列は、好ましくは、国際公開第２０１２／０１９７８０号の式（Ｉ）又は（ＩＩ）に由来する。更に好ましい実施形態によれば、本明細書で定義されるＲＮＡは、国際公開第２０１２／０１９７８０号の特定の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）の少なくともいずれかに由来する少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含み得る。
特に好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのヒストンステムループを含み、前記ヒストンステムループは、配列番号３９又は４０に係る核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む。
他の実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡは、本明細書で定義されるヒストンステムループを含まない。
更なる実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、３’末端配列エレメントを含む。前記３’末端配列エレメントは、ポリ（Ａ）配列及びヒストンステムループ配列を含む配列エレメントとして理解されるべきであり、前記配列エレメントは、本発明の人工ＲＮＡの３’末端に位置する。
他の実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、配列番号４４〜６３又は２１３２２〜２１３２８に係る３’末端配列エレメント又はその断片若しくはバリアントを含むことができる。
好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのシュードウリジン（Ψ）修飾コード配列を含む。
したがって、好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡ、又は少なくとも１つのコード配列は、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチドで置換された核酸配列を含む。
更に好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡは、少なくとも１つのＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）修飾コード配列を含む。
したがって、好ましい実施形態においては、本発明の人工ＲＮＡ、又は少なくとも１つのコード配列は、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換された核酸配列を含む。
第１の態様の好ましい実施形態においては、人工ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメントａ）〜ｉ）：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくは本明細書に記載される５’−キャップ構造；
ｂ）任意に、本明細書に記載される５’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号１〜２２から選択される少なくとも１つ；
ｃ）リボソーム結合部位、好ましくは本明細書に記載されるリボソーム結合部位；
ｄ）本明細書に記載される少なくとも１つのコード配列、好ましくは表３及び表４に記載される少なくとも１つのコード配列；
ｅ）本明細書に記載される３’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号２３〜３８から選択される少なくとも１つ；
ｆ）任意に、ポリ（Ａ）配列、好ましくは本明細書に記載されるポリ（Ａ）配列；
ｇ）任意に、ポリ（Ｃ）配列、好ましくは本明細書に記載されるポリ（Ｃ）配列；
ｈ）任意に、ヒストンステムループ、好ましくは本明細書に記載されるヒストンステムループ；
ｉ）任意に、本明細書に記載される３’末端配列エレメント、好ましくは配列番号４４〜６３、又は２１３２２〜２１３２８に係る３’末端配列エレメント、
を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
第１の態様の更に好ましい実施形態においては、人工ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメント：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくは本明細書に記載される５’−キャップ構造、最も好ましくはＣａｐ１構造；
ｂ）本明細書に記載されるａ−１、ａ−４、ｃ−１、ｅ−４、ｇ−２、ｉ−２、又はｉ−３に係る３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）リボソーム結合部位、好ましくは本明細書に記載されるリボソーム結合部位；
ｄ）本明細書に記載される少なくとも１つのコード配列であって、前記５’−ＵＴＲと前記３’−ＵＴＲとの間、好ましくは前記５’−ＵＴＲの下流且つ前記３’−ＵＴＲの上流に位置し、好ましくは表３及び表４に記載されるいずれかから選択される少なくとも１つのコード配列；
ｅ）任意に、ポリ（Ａ）配列、好ましくは本明細書に記載されるポリ（Ａ）配列；
ｆ）任意に、ポリ（Ｃ）配列、好ましくは本明細書に記載されるポリ（Ｃ）配列；
ｇ）任意に、ヒストンステムループ、好ましくは本明細書に記載されるヒストンステムループ；
ｈ）任意に、本明細書に記載される３’末端配列エレメント、好ましくは配列番号４４〜６３、２１３２２〜２１３２８に係る３’末端配列エレメント、
を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
第１の態様の更に好ましい実施形態においては、人工ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメント：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくは本明細書に記載される５’−キャップ構造、最も好ましくはＣａｐ１構造；
ｂ）本明細書に記載されるａ−１又はｉ−３に係る３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）リボソーム結合部位、好ましくは本明細書に記載されるリボソーム結合部位；
ｄ）本明細書に記載される少なくとも１つのコード配列であって、前記５’−ＵＴＲと前記３’−ＵＴＲとの間、好ましくは前記５’−ＵＴＲの下流且つ前記３’−ＵＴＲの上流に位置し、好ましくは表３及び表４に記載されるいずれかから選択される少なくとも１つのコード配列；
ｅ）任意に、ヒストンステムループ、好ましくは本明細書に記載されるヒストンステムループ；
ｆ）ポリ（Ａ）配列、好ましくは約１００個のアデノシンヌクレオチドを含むポリ（Ａ）配列；
ｇ）任意に、本明細書に記載される３’末端配列エレメント、好ましくは配列番号２１３２２〜２１３２８に係る３’末端配列エレメント、
を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
第１の態様の更に好ましい実施形態においては、人工ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、５’から３’方向に、以下のエレメント：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくは本明細書に記載される５’−キャップ構造、最も好ましくはＣａｐ１構造；
ｂ）本明細書に記載されるａ−１、ａ−４、ｃ−１、ｅ−４、ｇ−２、ｉ−２、又はｉ−３に係る３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）リボソーム結合部位、好ましくは本明細書に記載されるリボソーム結合部位；
ｄ）本明細書に記載される少なくとも１つのコード配列であって、前記５’−ＵＴＲと前記３’−ＵＴＲとの間、好ましくは前記５’−ＵＴＲの下流且つ前記３’−ＵＴＲの上流に位置し、好ましくは配列番号６９〜７７、４８４〜４９２、８９９〜９０６、１２６８〜１２７５、１６３７〜１６４４、２００６〜２０１３、２３７５〜２３８２、２７４４〜２７５１、３１１３〜３１２０、３４８２〜３４８９、３８５１〜３８５８、４２２０〜４２２７、４５８９〜４５９６、４９５８〜４９６５、５３２７〜５３３４、５６９６〜５７０３、６０６５〜６０７２、６４３４〜６４４１、６８０３〜６８１０、７１７２〜７１７９、７５４１〜７５４８、７９１０〜７９１７、１１７２７〜１１７３４、１２０９６〜１２１０３、１２４６５〜１２４７２、１２８３４〜１２８４１、１３９４１〜１３９４８、１４３１０〜１４３１７、１４６７９〜１４６８６、１５０４８〜１５０５５、１５４１７〜１５４２４、１５７８６〜１５７９３、１３２０３〜１３２１０、１３５７２〜１３５７９、１６１５５〜１６１６２、１６５２４〜１６５３１、１６８９３〜１６９００、１７２６２〜１７２６９、１７６３１〜１７６３８、１８０００〜１８００７、１８３６９〜１８３７６、１８７３８〜１８７４５、１９１０７〜１９１１４、１９４７６〜１９４８３、２１３６３〜２１３８４、２１３８９〜２１４１０（又はこれらの断片若しくはバリアント）のいずれかから選択される少なくとも１つのコード配列；
ｅ）約６４個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列；
ｆ）約３０個のシステインを含むポリ（Ｃ）配列；
ｇ）配列番号３９又は４０に係るヒストンステムループ、
を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
第１の態様の更に好ましい実施形態においては、人工ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、５’から３’方向に、以下のエレメント：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくは本明細書に記載される５’−キャップ構造、最も好ましくはＣａｐ１構造；
ｂ）本明細書に記載されるａ−１、ａ−４、ｃ−１、ｅ−４、ｇ−２、ｉ−２、又はｉ−３に係る３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）リボソーム結合部位、好ましくは本明細書に記載されるリボソーム結合部位；
ｄ）本明細書に記載される少なくとも１つのコード配列であって、前記５’−ＵＴＲと前記３’−ＵＴＲとの間、好ましくは前記５’−ＵＴＲの下流且つ前記３’−ＵＴＲの上流に位置し、好ましくは配列番号６９〜７７、４８４〜４９２、８９９〜９０６、１２６８〜１２７５、１６３７〜１６４４、２００６〜２０１３、２３７５〜２３８２、２７４４〜２７５１、３１１３〜３１２０、３４８２〜３４８９、３８５１〜３８５８、４２２０〜４２２７、４５８９〜４５９６、４９５８〜４９６５、５３２７〜５３３４、５６９６〜５７０３、６０６５〜６０７２、６４３４〜６４４１、６８０３〜６８１０、７１７２〜７１７９、７５４１〜７５４８、７９１０〜７９１７、１１７２７〜１１７３４、１２０９６〜１２１０３、１２４６５〜１２４７２、１２８３４〜１２８４１、１３９４１〜１３９４８、１４３１０〜１４３１７、１４６７９〜１４６８６、１５０４８〜１５０５５、１５４１７〜１５４２４、１５７８６〜１５７９３、１３２０３〜１３２１０、１３５７２〜１３５７９、１６１５５〜１６１６２、１６５２４〜１６５３１、１６８９３〜１６９００、１７２６２〜１７２６９、１７６３１〜１７６３８、１８０００〜１８００７、１８３６９〜１８３７６、１８７３８〜１８７４５、１９１０７〜１９１１４、１９４７６〜１９４８３、２１３６３〜２１３８４、２１３８９〜２１４１０（又はこれらの断片若しくはバリアント）のいずれかから選択される少なくとも１つのコード配列；
ｅ）約６４個のアデノシンを含むポリ（Ａ）配列；
ｆ）配列番号３９又は４０に係るヒストンステムループ、
を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
好ましいＲＳＶポリペプチド、核酸、及びｍＲＮＡ配列を、表５Ａ、５Ｂ及び表６Ａ、６Ｂに示す。
表５Ａ及び表５Ｂでは、タンパク質設計を行１に示す。表中、列Ａ〜Ｊは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する本発明の具体的な適切な構築物を表し、列Ａは、Ｆ０に好適な配列を示し、列Ｂは、Ｆ−ｄｅｌに好適な配列を示し、列Ｃは、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１に好適な配列を示し、列Ｄは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１に好適な配列を示し、列Ｅは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１に好適な配列を示し、列Ｆは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１に好適な配列を示し、列Ｇは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２に好適な配列を示し、列Ｈは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２に好適な配列を示し、列Ｉは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３に好適な配列を示し、列Ｊは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３に好適な配列を示す。
タンパク質設計を行１（列Ａ〜Ｊ）に示し、配列表に示す具体的なタンパク質配列番号を行２（「タンパク質」）に示す。各タンパク質構築物の対応するコード配列の配列番号を行３に示す（「ｃｄｓ」、各種ｃｄｓ最適化については表３と比較されたい）。コドン改変コード配列のタイプ（例えば、ｏｐｔ１、ｏｐｔ２、ｏｐｔ３、ｏｐｔ４、ｏｐｔ５、ｏｐｔ６、ｏｐｔ１１）などに関する更なる情報は、配列表の各配列番号の＜２２３＞識別子と表３に記載される。前記コード配列を含む対応するｍＲＮＡ構築物の配列番号及び本発明に係る好適な３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲは、行４〜４７に示す（本明細書に記載ｍＲＮＡ設計ａ−１〜ｉ−３）。表５Ａでは、ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来するｍＲＮＡ配列が示され、表５Ｂでは、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来するｍＲＮＡ配列が示される。ｍＲＮＡ構築物に含まれるコード配列のタイプ（例えば、ｗｔ、ｏｐｔ１、ｏｐｔ２、ｏｐｔ３、ｏｐｔ４、ｏｐｔ５、ｏｐｔ６、ｏｐｔ１１）などに関する更なる情報は、配列表の各配列番号の＜２２３＞識別子に記載される。
Figure 2021519595
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表６Ａ及び表６Ｂでは、タンパク質設計を行１に示す。表中、列Ｋ〜Ｖは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する本発明の具体的な適切な構築物を表し、列Ｋは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０に好適な配列を示し、列Ｌは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０に好適な配列を示し、列Ｍは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４に好適な配列を示し、列Ｎは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４に好適な配列を示し、列Ｏは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５に好適な配列を示し、列Ｐは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５に好適な配列を示し、列Ｑは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６に好適な配列を示し、列Ｒは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６に好適な配列を示し、列Ｓは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７に好適な配列を示し、列Ｔは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７に好適な配列を示し、列Ｕは、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８に好適な配列を示し、列Ｖは、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８に好適な配列を示す。
タンパク質設計は、最初の行（列Ｋ〜Ｖ）に示される。配列表に示す具体的なタンパク質配列番号は、行２の「ＰＲＴ」に記載する。各タンパク質構築物の対応するコード配列の配列番号を、行３の「ｃｄｓ」に示す（各種ｃｄｓ最適化については表４と比較されたい）。コドン改変コード配列のタイプ（例えば、ｏｐｔ１、ｏｐｔ２、ｏｐｔ３、ｏｐｔ４、ｏｐｔ５、ｏｐｔ６、ｏｐｔ１１）などに関する更なる情報は、配列表の各配列番号の＜２２３＞識別子と表４に記載される。前記コード配列を含む対応するｍＲＮＡ構築物の配列番号及び本発明に係る好適な３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲは、以下の各行に記載する（本明細書に記載するｍＲＮＡ設計「ａ−１」〜「ｉ−３」）。表６Ａでは、ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来するｍＲＮＡ配列が示され、表６Ｂでは、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来するｍＲＮＡ配列が示される。
ｍＲＮＡ構築物に含まれるコード配列のタイプ（例えば、ｗｔ、ｏｐｔ１、ｏｐｔ２、ｏｐｔ３、ｏｐｔ４、ｏｐｔ５、ｏｐｔ６、ｏｐｔ１１）などに関する更なる情報は、配列表の各配列番号の＜２２３＞識別子に記載される。
表６Ａ：ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来するＲＳＶ Ｆをコードする好ましいｍＲＮＡ構築物（列Ｋ〜Ｖ）
Figure 2021519595
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表６Ｂ：ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来するＲＳＶ Ｆをコードする好ましいｍＲＮＡ構築物（列Ｋ〜Ｖ）
Figure 2021519595
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好ましい実施形態においては、人工ＲＮＡは、配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８からなる群から選択される核酸配列、これらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなり、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
好ましい実施形態においては、人工ＲＮＡは、（ａ）少なくとも１つの異種５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び／又は少なくとも１つの異種３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）及び（ｂ）前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結された、ＲＳＶ Ｆに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含み、
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号７８〜４８２、１１７３５〜１２０９４、２１４１５〜２１４１７、２１５６１〜２１５６３、２１４８９、２１４９０、２１６３５、２１６３６（Ｆ０をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号４９３〜８９７、１２１０４〜１２４６３、２１４１８〜２１４２０、２１５６４〜２１５６６、２１４９１、２１４９２、２１６３７、２１６３８（Ｆ−ｄｅｌをコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号９０７〜１２６６、１２４７３〜１２８３２、２１４２１〜２１４２３、２１５６７〜２１５６９、２１４９３〜２１４９５、２１６３９〜２１６４１（Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号１２７６〜１６３５、８２７８、１２８４２〜１３２０１、２１４２４〜２１４２６、２１５７０〜２１５７２、２１４９６〜２１４９８、２１６４２〜２１６４４（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号１６４５〜２００４、１３９４９〜１４３０８、２１４３３〜２１４３５、２１５７９〜２１５８１、２１５０５〜２１５０７、２１６５１〜２１６５３（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号２０１４〜２３７３、１４３１８〜１４６７７、２１４３６〜２１４３８、２１５８２〜２１５８４、２１５０８〜２１５１０、２１６５４〜２１６５６（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号２３８３〜２７４２、１４６８７〜１５０４６、２１４３９〜２１４４１、２１５８５〜２１５８７、２１５１１〜２１５１３、２１６５７〜２１６５９（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号２７５２〜３１１１、１５０５６〜１５４１５、２１４４２〜２１４４４、２１５８８〜２１５９０、２１５１４〜２１５１６、２１６６０〜２１６６２（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号３１２１〜３４８０、１５４２５〜１５７８４、２１４４５〜２１４４７、２１５９１〜２１５９３、２１５１７〜２１５１９、２１６６３〜２１６６５（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号３４９０〜３８４９、１５７９４〜１６１５３、２１４４８〜２１４５０、２１５９４〜２１５９６、２１５２０〜２１５２２、２１６６６〜２１６６８（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号３８５９〜４２１８、１３２１１〜１３５７０、２１４２７〜２１４２９、２１５７３〜２１５７５、２１４９９〜２１５０１、２１６４５〜２１６４７（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号４２２８〜４５８７、１３５８０〜１３９３９、２１４３０〜２１４３２、２１５７６〜２１５７８、２１５０２〜２１５０４、２１６４８〜２１６５０（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号４５９７〜４９５６、１６１６３〜１６５２２、２１４５１〜２１４５３、２１５９７〜２１５９９、２１５２３〜２１５２５、２１６６９〜２１６７１（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号４９６６〜５３２５、１６５３２〜１６８９１、２１４５４〜２１４５６、２１６００〜２１６０２、２１５２６〜２１５２８、２１６７２〜２１６７４（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号５３３５〜５６９４、１６９０１〜１７２６０、２１４５７〜２１４５９、２１６０３〜２１６０５、２１５２９〜２１５３１、２１６７５〜２１６７７（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号５７０４〜６０６３、１７２７０〜１７６２９、２１４６０〜２１４６２、２１６０６〜２１６０８、２１５３２〜２１５３４、２１６７８〜２１６８０（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号６０７３〜６４３２、１７６３９〜１７９９８、２１４６３〜２１４６５、２１６０９〜２１６１１、２１５３５〜２１５３７、２１６８１〜２１６８３（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号６４４２〜６８０１、１８００８〜１８３６７、２１４６６〜２１４６８、２１６１２〜２１６１４、２１５３８〜２１５４０、２１６８４〜２１６８６（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号６８１１〜７１７０、１８３７７〜１８７３６、２１４６９〜２１４７１、２１６１５〜２１６１７、２１５４１〜２１５４３、２１６８７〜２１６８９（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号７１８０〜７５３９、１８７４６〜１９１０５、２１４７２〜２１４７４、２１６１８〜２１６２０、２１５４４〜２１５４６、２１６９０〜２１６９２（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号７５４９〜７９０８、１９１１５〜１９４７４、２１４７５〜２１４７７、２１６２１〜２１６２３、２１５４７〜２１５４９、２１６９３〜２１６９５（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
− 前記人工ＲＮＡは、配列番号７９１８〜８２７７、１９４８４〜１９８４３、２１４７８〜２１４８０、２１６２４〜２１６２６、２１５５０〜２１５５２、２１６９６〜２１６９８（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなり、
任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
特に好ましい実施形態においては、人工ＲＮＡは、（ａ）少なくとも１つの異種５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び／又は少なくとも１つの異種３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）及び（ｂ）前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結された、ＲＳＶ Ｆに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含み、前記人工ＲＮＡが、配列番号５７０４〜６０６３、１７２７０〜１７６２９、２１４６０〜２１４６２、２１６０６〜２１６０８、２１５３２〜２１５３４、２１６７８〜２１６８０（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５をコードする）からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる。
明細書全体を通して説明されるように、好適なアミノ酸配列又は核酸配列（コード配列、ｍＲＮＡ配列）に関する更なる情報を、配列表、特に、以下に説明するように、識別子＜２２３＞の下に与えられる詳細からも得られる。
例えば、配列表の配列番号６８の数値識別子＜２２３＞は、以下の通りである： 「ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｄ／ｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ） ｆｒｏｍ ＨＲＳＶ（Ａ２）＿Ｆ０」。配列表全体を通して、数値識別子＜２２３＞の下に与えられる情報は、同一の構造：「＜ＣＯＮＳＴＲＵＣＴ＿ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ＞から＜ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＤＥＳＣＲＩＰＴＯＲ＞」に当てはまると考えるべきである。＜ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＤＥＳＣＲＩＰＴＯＲ＞は、配列のタイプ（例えば、「誘導及び／又は修飾されたタンパク質配列」、「誘導及び／又は修飾されたＣＤＳ」、「誘導及び／又は修飾された配列を含むｍＲＮＡ生成物設計ａ−１」、又は「誘導及び／又は修飾された配列を含むｍＲＮＡ生成物設計ｂ−４」、又は「誘導及び／又は修飾された配列を含むｍＲＮＡ生成物設計ｃ−５」、又は「誘導及び／又は修飾された配列を含むｍＲＮＡ生成物設計ｇ−４」など）及び野生型配列（「ｗｔ」）を含む又はからなるかどうか、又は配列が配列最適化配列（例えば、「ｏｐｔ１」、「ｏｐｔ２」、「ｏｐｔ３」、「ｏｐｔ４」、「ｏｐｔ５」、「ｏｐｔ６」、「ｏｐｔ１１」；配列最適化については、以下に更に詳細に記載する）を含む又はからなるかどうかに関する。例えば、配列番号６８の数値識別子＜２２３＞の下に与えられる＜ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＤＥＳＣＲＩＰＴＯＲ＞は、以下の通りである：「ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｄ／ｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）」。数値識別子＜２２３＞の下に与えられる＜ＣＯＮＳＴＲＵＣＴ＿ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ＞は、以下の構造：（「生物＿構築物名」、又は「生物＿アクセッション番号＿構築物名」）を有し、当業者が、本発明に係る同一ＲＳＶタンパク質をコードする好適な核酸配列（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を明確に誘導する助けとなることが意図される。例えば、配列番号６８の数値識別子＜２２３＞の下に与えられる＜ＣＯＮＳＴＲＵＣＴ＿ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ＞は、「ＨＲＳＶ（Ａ２）＿Ｆ０」である。この例において、各タンパク質配列は、「ＨＲＳＶ（Ａ２）」（生物）に由来し、タンパク質は、構造エレメント「Ｆ０」（構築物名、完全長Ｆ）を含む。当業者が配列番号６８の構築物識別子、即ち「ＨＲＳＶ（Ａ２）＿Ｆ０」を使用する場合、前記当業者は、本発明の配列表から容易に取得できるＲＮＡコード配列及びｍＲＮＡ配列などの好適な核酸コード配列のリストに容易に到達する。
組成物：
第２の態様は、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡを含む組成物に関する。
第２の態様の好ましい実施形態においては、組成物は、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、任意に、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、好ましくは組成物の液体又は非液体ベースを含むことが好ましい。組成物が液体形態で提供される場合、担体は、好ましくは水、典型的にはパイロジェンフリー水；等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸、クエン酸などの緩衝溶液である。水又は好ましくは緩衝液、より好ましくは水性緩衝液を用いることができ、これらは、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩、任意にカリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩を含有する。好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び任意に、カリウム塩は、それらのハロゲン化物（例えば、塩化物、ヨウ化物、又は臭化物）、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、又は硫酸塩などの形態で存在してもよい。限定されるものではないが、ナトリウム塩の例としては、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が挙げられ、任意のカリウム塩の例としては、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が挙げられ、カルシウム塩の例としては、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が挙げられる。更に、前記カチオンの有機アニオンが緩衝液に含有されていてもよい。
いくつかの実施形態においては、本明細書に定義される組成物は、本発明の第１の態様又は第２の態様の文脈で定義される複数又は少なくとも１超の人工ＲＮＡを含むことができる。
いくつかの実施形態においては、組成物に含まれる少なくとも１つのＲＮＡは、バイ又はマルチシストロン性核酸、特に、本明細書に定義されるバイ又はマルチシストロン性核酸であり、これは、同一のＲＳＶ及び／又は異なるＲＳＶに由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個の異なる抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする。
実施形態においては、組成物は、遺伝的に同一のＲＳＶ又はその断片若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をそれぞれがコードする、本発明の第１の態様の文脈で定義される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の異なる人工ＲＮＡを含むことができる。ウイルス、例えば、「同一のウイルス」の文脈で使用される「同一」又は「同一のＲＳＶ」という用語は、遺伝的に同一であると理解されるべきである。特に、前記（遺伝的に）同一のウイルスは同一のタンパク質又はペプチドを発現し、全てのタンパク質又はペプチドが同一のアミノ酸配列を有する。特に、前記（遺伝的に）同一のＲＳＶは、本質的に同一のタンパク質、ペプチド、又はポリタンパク質を発現し、これらのタンパク質、ペプチド、又はポリタンパク質は、それらのアミノ酸配列において好ましくは相違がない。例示的なＲＳＶウイルスの非限定的なリストをリスト１に示す。
いくつかの実施形態においては、組成物は、遺伝的に異なるＲＳＶ又はその断片若しくはバリアントに由来する少なくとも１つのペプチド又はタンパク質をそれぞれがコードする、本発明の第１の態様の文脈で定義される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の異なるＲＮＡを含むことができる。ウイルス、例えば、「異なるウイルス」の文脈で使用される「異なる」又は「異なるＲＳＶ」という用語は、少なくとも２つのそれぞれのウイルス間の違いとして理解されるべきであり、この違いは、それぞれの異なるウイルスのＲＮＡゲノム上に現れる。特に、前記（遺伝的に）異なるＲＳＶは、少なくとも１つの異なるタンパク質、ペプチド、又はポリタンパク質を発現し、少なくとも１つの異なるタンパク質、ペプチド、又はポリタンパク質は、好ましくは少なくとも１つのアミノ酸が異なる。
他の実施形態においては、組成物は、糖タンパク質Ｇ、ショート疎水性タンパク質ＳＨ、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、ラージポリメラーゼＬ、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、リンタンパク質Ｐ、非構造タンパク質ＮＳ１、又は非構造タンパク質ＮＳ２、又はそれらの任意の組合せから選択されるＲＳＶ抗原をコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の更なるＲＮＡ構築物を含む。
ＲＳＶをコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の更なるＲＮＡ構築物を含む組成物の製造のために、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０８２４８７又は公開特許出願国際公開第２０１７／１０９０１３４Ａ１号に開示される方法を使用し、適宜、適合させることが好ましい。
好ましい態様においては、第２の態様の組成物は、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１タンパク質、及び／又はリンタンパク質Ｐ、又はそれらの任意の組合せから選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを含む。ＲＳＶ Ｍ、Ｎ、Ｍ２−１、及び／又はリンタンパク質Ｐ（又はそれらの組合せ）に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む更なる人工ＲＮＡの追加は、例えば、Ｔ細胞免疫応答を促進する。
なお、第１の態様の人工ＲＮＡに関連する実施形態は、第２の態様の少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡにも同様に当てはまり、好適な実施形態として理解され得る（例えば、ＵＴＲの組合せ、ＣＤＳ最適化、ヒストンステムループ、ポリＡ、ポリＣ、キャップ構造、ｍＲＮＡ構造、ｍＲＮＡ生成、ｍＲＮＡ精製などに関する実施形態）。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、及びＲＳＶマトリックスタンパク質Ｍに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
或いは、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｎに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
或いは、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
或いは、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
好ましい実施形態においては、第２の態様の組成物は、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１、及びリンタンパク質Ｐから選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列をそれぞれが含む２つの更なる人工ＲＮＡ種を含む。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｎに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｎに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｎに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
好ましい実施形態においては、第２の態様の組成物は、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１、及びリンタンパク質Ｐから選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列をそれぞれが含む３つの更なる人工ＲＮＡ種を含む。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｎに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｎに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｎに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
好ましい態様においては、第２の態様の組成物は、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１、及びリンタンパク質Ｐから選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列をそれぞれが含む４つの更なる人工ＲＮＡ種を含む。
したがって、第２の態様の組成物は、ＲＳＦ Ｆをコードする第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｎに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡと、ＲＳＶ Ｍ２−１に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを好適に含み得る。
第２の態様の好ましい実施形態においては、更なる人工ＲＮＡのコード配列は、配列番号９６８４、１００５３〜１０１３３、１０１３４、１０５０３〜１０６３６、１０６３７、１１００６〜１１１８２、１１１８３、１１５５２〜１１７２５、１９８４４、２０２１３、２０５８２、２０９５１のいずれか又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列の少なくとも１つをコードする。ＲＳＶタンパク質をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に以下に記載するように、識別子＜２２３＞の下に記載される詳細からも得られる。
第２の態様の更なる実施形態においては、更なる人工ＲＮＡのコード配列は、本明細書に定義される少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質と、更に異種分泌シグナル配列又は異種分泌シグナルペプチドをコードする。異種分泌シグナル配列は、コードされた抗原性ペプチド又はタンパク質の分泌を増大させることができる。
好適な分泌シグナルペプチドは、国際公開第２０１７／０８１０８２号の配列番号１〜１１１５及び配列番号１７２８に係るアミノ酸配列のリスト、又はこれらの配列の断片又はバリアントから選択することができる。核酸レベルでは、そのようなアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列（例えば、ＲＮＡ配列）を選択することができる。この文脈において、国際公開第２０１７／０８１０８２号の開示を、参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態によれば、分泌シグナル配列は、配列番号２１３２９〜２１３６２のいずれか又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。分泌シグナル配列をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に、識別子＜２２３＞の下に記載される詳細からも得られる。
好ましい実施形態においては、組成物の更なる人工ＲＮＡは、
（ａ）少なくとも１つの異種５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び／又は少なくとも１つの異種３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）；及び
（ｂ）前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結された、ＲＳＶ Ｍ、Ｎ、Ｍ２−１、及び／又はリンタンパク質Ｐに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくはバリアントをコードする、好ましくは配列番号９６８４、１００５３〜１０１３３、１０１３４、１０５０３〜１０６３６、１０６３７、１１００６〜１１１８２、１１１８３、１１５５２〜１１７２５、１９８４４、２０２１３、２０５８２、２０９５１のいずれかから選択されるアミノ酸配列又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含む。
好ましい実施形態においては、組成物の更なる人工ＲＮＡは、
（ａ）少なくとも１つの異種５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び／又は少なくとも１つの異種３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）；及び
（ｂ）前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結された、ＲＳＶ Ｍ２−に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくはバリアントをコードする、好ましくは配列番号１１１８３、２０９５３、２１４１４のいずれかから選択されるアミノ酸配列又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列を含む。
好適には、組成物の更なる人工ＲＮＡは、ａ−１、ａ−２、ａ−３、ａ−４、ａ−５、ｂ−１、ｂ−２、ｂ−３、ｂ−４、ｂ−５、ｃ−１、ｃ−２、ｃ−３、ｃ−４、ｃ−５、ｄ−１、ｄ−２、ｄ−３、ｄ−４、ｄ−５、ｅ−１、ｅ−２、ｅ−３、ｅ−４、ｅ−５、ｅ−６、ｆ−１、ｆ−２、ｆ−３、ｆ−４、ｆ−５、ｇ−１、ｇ−２、ｇ−３、ｇ−４、ｇ−５、ｈ−１、ｈ−２、ｈ−３、ｈ−４、ｈ−５、ｉ−１、ｉ−２、又はｉ−３（第１の態様の文脈にて定義されている）から選択される３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲに機能可能に連結されたコード配列を含む。
好適には、組成物の更なる人工ＲＮＡは、少なくとも１つの又は１より多くのウラシルヌクレオチド又は好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
したがって、他の実施形態においては、組成物の更なる人工ＲＮＡは、配列番号４３又は２１３２１に係る５’キャップ配列エレメント、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
第２の態様の好ましい実施形態においては、更なるＲＮＡのコード配列は、配列番号９６８５〜９６９２、１０１３５〜１０１４２、１０６３８〜１０６４５、１１１８４〜１１１１９、１９８４５〜１９８５２、２０２１４〜２０２２１、２０５８３〜２０５９０、２０９５２〜２０９５９、２１３８５〜２１３８８、２１４１１〜２１４１４又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアント（第１の態様の文脈にて定義したｃｄｓ最適化）と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列の少なくとも１つを含む。ＲＳＶタンパク質をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に以下に記載するように、識別子＜２２３＞の下に記載される詳細からも得られる。
第２の態様の好ましい実施形態においては、組成物の更なる人工ＲＮＡ、好ましくは更なるｍＲＮＡは、好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメントａ）〜ｉ）：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくは第１の態様の文脈において記載される５’−キャップ構造、最も好ましくはＣａｐ１構造；
ｂ）任意に、第１の態様の文脈において記載される５’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号１〜２２から選択される少なくとも１つ；
ｃ）リボソーム結合部位、好ましくは本明細書に記載されるリボソーム結合部位；
ｄ）配列番号９６８５〜９６９２、１０１３５〜１０１４２、１０６３８〜１０６４５、１１１８４〜１１１１９、１９８４５〜１９８５２、２０２１４〜２０２２１、２０５８３〜２０５９０、２０９５２〜２０９５９、２１３８５〜２１３８８、２１４１１〜２１４１４から選択される少なくとも１つのコード配列；
ｅ）第１の態様の文脈において記載される３’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号２３〜３８から選択される少なくとも１つ；
ｆ）任意に、ポリ（Ａ）配列、好ましくは第１の態様の文脈において記載されるポリ（Ａ）配列；
ｇ）任意に、ポリ（Ｃ）配列、好ましくは第１の態様の文脈において記載されるポリ（Ｃ）配列；
ｈ）任意に、ヒストンステムループ、好ましくは第１の態様の文脈において記載されるヒストンステムループ；
ｉ）任意に、第１の態様の文脈において記載される３’末端配列エレメント、好ましくは配列番号４４〜６３、２１３２２〜２１３２８に係る３’末端配列エレメント、
を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
第２の態様の特に好ましい実施形態においては、組成物の更なる人工ＲＮＡ、好ましくは更なるｍＲＮＡは、好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメントａ）〜ｉ）：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくは第１の態様の文脈において記載される５’−キャップ構造、最も好ましくはＣａｐ１構造；
ｂ）任意に、第１の態様の文脈において記載される５’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号１〜２２から選択される少なくとも１つ；
ｃ）リボソーム結合部位、好ましくは本明細書に記載されるリボソーム結合部位；
ｄ）配列番号１１１８５〜１１１９１、２１３８８、２０９５２〜２０９５９、２１４１４から選択される少なくとも１つのコード配列；
ｅ）第１の態様の文脈において記載される３’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号２３〜３８から選択される少なくとも１つ；
ｆ）任意に、ポリ（Ａ）配列、好ましくは第１の態様の文脈において記載されるポリ（Ａ）配列；
ｇ）任意に、ポリ（Ｃ）配列、好ましくは第１の態様の文脈において記載されるポリ（Ｃ）配列；
ｈ）任意に、ヒストンステムループ、好ましくは第１の態様の文脈において記載されるヒストンステムループ；
ｉ）任意に、第１の態様の文脈において記載される３’末端配列エレメント、好ましくは配列番号４４〜６３、２１３２２〜２１３２８に係る３’末端配列エレメント、
を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
その文脈において、第２の態様の好ましいＲＳＶポリペプチド、核酸、及びｍＲＮＡ配列を表７Ａに示す。
表７Ａでは、列Ａ〜列Ｄは、ＲＳＶタンパク質に由来する第２の態様の具体的な好適な構築物を示す。列Ａは、Ｍに好適な配列を示し、列Ｂは、Ｎに好適な配列を示し、列Ｃは、Ｐに好適な配列を示し、列Ｄは、Ｍ２−１に好適な配列を示す。
タンパク質名／設計は、行１（列Ａ〜列Ｄ）に示し、配列表に示されるタンパク質配列番号は、行２（「ＰＲＴ」）に示す。ＨＲＳＶ（Ａ２）の好ましいタンパク質配列番号は、行３に示す（「ＨＲＳＶ（Ａ２）ＰＲＴ」）。示された各ＨＲＳＶ（Ａ２）タンパク質の対応するコード配列の配列番号は、行４〜１１に示す（それぞれ、「ｃｄｓ ｗｔ」、「ｃｄｓ ｏｐｔ１」、「ｃｄｓ ｏｐｔ２」、「ｃｄｓ ｏｐｔ３」、「ｃｄｓ ｏｐｔ４」、「ｃｄｓ ｏｐｔ５」、「ｃｄｓ ｏｐｔ６」、「ｃｄｓ ｏｐｔ１１」）。本発明に係る前記コード配列と好適な３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲとを含む対応するｍＲＮＡ構築物の配列番号は、行１２〜５５に示す（本明細書に記載される「ｍＲＮＡ設計ａ−１」〜「ｍＲＮＡ設計ｉ−３」）。
ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）の好ましいタンパク質配列番号は、列５６に示す（「メンフィス−３７ ＰＲＴ」）。示された各ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）タンパク質の対応するコード配列の配列番号は、行５７〜６４に示す（それぞれ、「ｃｄｓ ｗｔ」、「ｃｄｓ ｏｐｔ１」、「ｃｄｓ ｏｐｔ２」、「ｃｄｓ ｏｐｔ３」、「ｃｄｓ ｏｐｔ４」、「ｃｄｓ ｏｐｔ５」、「ｃｄｓ ｏｐｔ６」、「ｃｄｓ ｏｐｔ１１」）。本発明に係る前記コード配列と好適な３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲとを含む対応するｍＲＮＡ構築物の配列番号は、行６５〜１０８に示す（本明細書に記載される「ｍＲＮＡ設計ａ−１」〜「ｍＲＮＡ設計ｉ−３」））。
示されたｍＲＮＡ構築物に含まれるコード配列のタイプなどに関する更なる情報は、配列表のそれぞれの配列番号の＜２２３＞識別子に示す。
Figure 2021519595
Figure 2021519595
Figure 2021519595
したがって、好ましい実施形態においては、第２の態様の組成物は、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１タンパク質、リンタンパク質Ｐから選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡを含み、更なる人工ＲＮＡは、配列番号９６９３〜１００５２、１０１４３〜１０５０２、１０６４６〜１１００５、１１１９２〜１１５５１、１９８５３〜２０２１２、２０２２２〜２０５８１、２０５９１〜２０９５０、２０９６０〜２１３１９、２１４８１〜２１４８８、２１６２７〜２１６３４、２１５５３〜２１５６０、２１６９９〜２１７０６から選択される核酸配列又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなり、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの又は全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。ＲＳＶタンパク質をコードするこれらの好適なアミノ酸配列のそれぞれに関する更なる情報は、配列表、特に以下に記載するように、識別子＜２２３＞の下に記載される詳細からも得られる。
第２の態様の特に好ましい実施形態においては、第２の態様の組成物は、
− 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８（第１の態様において定義したＲＳＶ Ｆをコードする）から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号９６９３〜１００５２、１９８５３〜２０２１２、２１４８１、２１４８２、２１６２７、２１６２８、２１５５３、２１５５４、２１６９９、２１７００（ＲＳＶ Ｍをコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；又は
− 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８（第１の態様において定義したＲＳＶ Ｆをコードする）から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号１０１４３〜１０５０２、２０２２２〜２０５８１、２１４８３、２１４８４、２１６２９、２１６３０、２１５５５、２１５５６、２１７０１、２１７０２（ＲＳＶ Ｎをコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；又は
− 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８（第１の態様において定義したＲＳＶ Ｆをコードする）から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号１０６４６〜１１００５、２０５９１〜２０９５０、２１４８５、２１４８６、２１６３１、２１６３２、２１５５７、２１５５８、２１７０３、２１７０４（ＲＳＶ Ｐをコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ；又は
− 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８（第１の態様において定義したＲＳＶ Ｆをコードする）から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号１１１９２〜１１５５１、２０９６０〜２１３１９、２１４８７、２１４８８、２１６３３、２１６３４、２１５５９、２１５６０、２１７０５、２１７０６（ＲＳＶ Ｍ２−１をコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ；又は
− 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８（第１の態様において定義したＲＳＶ Ｆをコードする）から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号９６９３〜１００５２、１９８５３〜２０２１２、２１４８１、２１４８２、２１６２７、２１６２８、２１５５３、２１５５４、２１６９９、２１７００（ＲＳＶ Ｍをコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号１０６４６〜１１００５、２０５９１〜２０９５０、２１４８５、２１４８６、２１６３１、２１６３２、２１５５７、２１５５８、２１７０３、２１７０４（ＲＳＶ Ｐをコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；
− 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８（第１の態様において定義したＲＳＶ Ｆをコードする）から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号９６９３〜１００５２、１９８５３〜２０２１２、２１４８１、２１４８２、２１６２７、２１６２８、２１５５３、２１５５４、２１６９９、２１７００（ＲＳＶ Ｍをコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号１０６４６〜１１００５、２０５９１〜２０９５０、２１４８５、２１４８６、２１６３１、２１６３２、２１５５７、２１５５８、２１７０３、２１７０４（ＲＳＶ Ｐをコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ及び配列番号１０１４３〜１０５０２、２０２２２〜２０５８１、２１４８３、２１４８４、２１６２９、２１６３０、２１５５５、２１５５６、２１７０１、２１７０２（ＲＳＶ Ｎをコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；又は
− 配列番号７８〜８６、２１４１５〜２１４１７、２１５６１〜２１５６３、４７４〜４８２、１１７３５〜１１７４２、２１４８９、２１４９０、２１６３５、２１６３６、１２０８７〜１２０９４、４９３〜５０１、２１４１８〜２１４２０、２１５６４〜２１５６６、８８９〜８９７、１２１０４〜１２１１１、２１４９１、２１４９２、２１６３７、２１６３８、１２４５６〜１２４６３、９０７〜９１４、２１４２１〜２１４２３、２１５６７〜２１５６９、１２５９〜１２６６、１２４７３〜１２４８０、２１４９３〜２１４９５、２１６３９〜２１６４１、１２８２５〜１２８３２、１２７６〜１２８３、２１４２４〜２１４２６、２１５７０〜２１５７２、１６２８〜１６３５、１２８４２〜１２８４９、２１４９６〜２１４９８、２１６４２〜２１６４４、１３１９４〜１３２０１、１６４５〜１６５２、２１４３３〜２１４３５、２１５７９〜２１５８１、１９９７〜２００４、１３９４９〜１３９５６、２１５０５〜２１５０７、２１６５１〜２１６５３、１４３０１〜１４３０８、２０１４〜２０２１、２１４３６〜２１４３８、２１５８２〜２１５８４、２３６６〜２３７３、１４３１８〜１４３２５、２１５０８〜２１５１０、２１６５４〜２１６５６、１４６７０〜１４６７７、２３８３〜２３９０、２１４３９〜２１４４１、２１５８５〜２１５８７、２７３５〜２７４２、１４６８７〜１４６９４、２１５１１〜２１５１３、２１６５７〜２１６５９、１５０３９〜１５０４６、２７５２〜２７５９、２１４４２〜２１４４４、２１５８８〜２１５９０、３１０４〜３１１１、１５０５６〜１５０６３、２１５１４〜２１５１６、２１６６０〜２１６６２、１５４０８〜１５４１５、３１２１〜３１２８、２１４４５〜２１４４７、２１５９１〜２１５９３、３４７３〜３４８０、１５４２５〜１５４３２、２１５１７〜２１５１９、２１６６３〜２１６６５、１５７７７〜１５７８４、３４９０〜３４９７、２１４４８〜２１４５０、２１５９４〜２１５９６、３８４２〜３８４９、１５７９４〜１５８０１、２１５２０〜２１５２２、２１６６６〜２１６６８、１６１４６〜１６１５３、３８５９〜３８６６、２１４２７〜２１４２９、２１５７３〜２１５７５、４２１１〜４２１８、１３２１１〜１３２１８、２１４９９〜２１５０１、２１６４５〜２１６４７、１３５６３〜１３５７０、４２２８〜４２３５、２１４３０〜２１４３２、２１５７６〜２１５７８、４５８０〜４５８７、１３５８０〜１３５８７、２１５０２〜２１５０４、２１６４８〜２１６５０、１３９３２〜１３９３９、４５９７〜４６０４、２１４５１〜２１４５３、２１５９７〜２１５９９、４９４９〜４９５６、１６１６３〜１６１７０、２１５２３〜２１５２５、２１６６９〜２１６７１、１６５１５〜１６５２２、４９６６〜４９７３、２１４５４〜２１４５６、２１６００〜２１６０２、５３１８〜５３２５、１６５３２〜１６５３９、２１５２６〜２１５２８、２１６７２〜２１６７４、１６８８４〜１６８９１、５３３５〜５３４２、２１４５７〜２１４５９、２１６０３〜２１６０５、５６８７〜５６９４、１６９０１〜１６９０８、２１５２９〜２１５３１、２１６７５〜２１６７７、１７２５３〜１７２６０、５７０４〜５７１１、２１４６０〜２１４６２、２１６０６〜２１６０８、６０５６〜６０６３、１７２７０〜１７２７７、２１５３２〜２１５３４、２１６７８〜２１６８０、１７６２２〜１７６２９（第１の態様において定義したＲＳＶ Ｆをコードする）から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び配列番号１１１９２〜１１５５１、２０９６０〜２１３１９、２１４８７、２１４８８、２１６３３、２１６３４、２１５５９、２１５６０、２１７０５、２１７０６（ＲＳＶ Ｍ２−１をコードする）からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ、
を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの又は全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている。
各種実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８）ＲＮＡ構築物と、ＲＳＶ Ｔ−細胞抗原ＲＮＡ構築物（ＲＳＶ Ｍ、Ｎ、Ｍ２−１、又はＰ）との各種組合せが好適に組成物に含まれる（表７Ｂに開示する；組合せ１〜６４）。組合せ４９〜６４が好ましく、組合せ６４が特に好ましい。
Figure 2021519595
Figure 2021519595
表７Ｂは、第１の態様において定義した株Ａ２に由来するＲＳＶ Ｆをコードする少なくとも１つのＲＮＡと、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１タンパク質、リンタンパク質Ｐから選択される株Ａ２に由来するＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡとを含む第２の態様の組成物を開示する。本発明の更なる実施形態においては、表７Ｂにおける開示組成物はいずれも、ＲＳＶ分離株メンフィス−３７（株メンフィス−３７）に由来する抗原性ペプチド又はタンパク質にも適用可能である。
特に好ましい実施形態においては、組成物は、１つのＲＳＶ Ｆ ＲＮＡ構築物（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８）と、更に１つのＲＳＶ Ｍ２−１ ＲＮＡ構築物、好ましくはＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５及びＭ２−１とを含む。
特に好ましい実施形態においては、配列番号５７０４〜５７１１、２１４６０〜２１４６２、２１６０６〜２１６０８、１７２７０〜１７２７７、２１５３２〜２１５３４、２１６７８〜２１６８０から選択されるＲＳＶ Ｆをコードする１つのＲＮＡ構築物及び配列番号１１１９２〜１１１９９、２１４８７、２１４８８、２１６３３、２１６３４、２０９６０〜２０９６７、２１５５９、２１５６０、２１７０５、２１７０６から選択されるＭ２−１をコードする１つのＲＮＡ構築物が、本発明の組成物に含まれる。
各種実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び本明細書に記載される少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡは、同一のＲＳＶウイルス（例えば、リスト１から選択される任意のウイルス）に由来する。
好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡは、ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来し、本明細書に記載される少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡは、ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来する。
好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡは、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来し、本明細書に記載される少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡは、ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来する。
本発明の文脈において、コード配列の特定の組合せは、モノシストロン性、バイシストロン性、及びマルチシストロン性の人工核酸及び／又はマルチ抗原構築物／核酸の任意の組合せによって生成され、本明細書に定義される複数の抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする核酸組成物を得ることができることが理解されるべきである。
更に、人への投与に適した、１以上の相溶性の固体又は液体の充填剤又は希釈剤又は封入化合物も使用することができる。本明細書で使用される「相溶性」という用語は、組成物の構成成分が、通常の使用条件下で組成物の生物活性又は薬効を実質的に低下させ得る相互作用が生じないように、組成物の少なくとも１つのＲＮＡ及び任意に更なる人工ＲＮＡと混合されることができることを意味する。薬学的に許容される担体、充填剤、及び希釈剤は、それらが治療対象者への投与に適するようにするために、十分に高い純度及び十分に低い毒性でなければならない。薬学的に許容される担体、充填剤、又はそれらの構成成分として使用され得る化合物としては、例えば、ラクトース、グルコース、トレハロース、及びスクロースなどの糖；コーンスターチ又はポテトスターチなどのスターチ；デキストロース；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど；粉末状トラガカント；麦芽；ゼラチン；獣脂；固体流動促進剤、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及びカカオ油；ポリオール、例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；アルギン酸などである。
組成物に含まれ得る更なる添加剤は、乳化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ；湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；味感付与剤、医薬担体；錠剤形成剤；安定化剤；抗酸化剤；保存料である。
複合体化
第２の態様の好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１つ以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性又はポリカチオン性ポリマー、カチオン性又はポリカチオン性多糖、カチオン性又はポリカチオン性脂質、カチオン性又はポリカチオン性タンパク質、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド、又はそれらの任意の組合せと複合体化若しくは会合される又は少なくとも部分的に複合体化若しくは会合される。
本明細書で使用される「カチオン性又はポリカチオン性化合物」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、約１〜９のｐＨ値、約３〜８のｐＨ値、約４〜８のｐＨ値、約５〜８のｐＨ値、より好ましくは約６〜８のｐＨ値、より好ましくは約７〜８のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ、例えば、約７．２〜約７．５の範囲で正に帯電された帯電分子を意味することが意図される。したがって、カチオン性成分、例えば、カチオン性ペプチド、カチオン性タンパク質、カチオン性ポリマー、カチオン性多糖、カチオン性脂質は、生理学的条件下で正に帯電する任意の正に荷電した化合物又はポリマーであり得る。「カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質」は、少なくとも１つの正に帯電したアミノ酸、又は１超の正に帯電したアミノ酸、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択されるアミノ酸を含み得る。したがって、「ポリカチオン性」成分も、所定条件下で１超の正電荷を示す範囲内にある。
この文脈において特に好ましいカチオン性又はポリカチオン性化合物は、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はその断片のタンパク質の以下のリストから選択することができる：プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン、若しくはスペルミジン、又は他のカチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えば、ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来又はアナログペプチド、ＨＳＶ ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、又はヒストンを含む。より好ましくは、本明細書で定義される核酸、好ましくは本明細書で定義されるｍＲＮＡは、１以上のポリカチオン、好ましくはプロタミン又はオリゴフェクタミン、最も好ましくはプロタミンと複合体化される。
第２の態様の好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡと、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、プロタミンと複合体化される。
トランスフェクション又は錯化剤として使用することができる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性化合物は、カチオン性多糖、例えば、キトサン、ポリブレンなど；カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ、ＤＩＭＲＩ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−６−１４、ＣＬＩＰ１、ＣＬＩＰ６、ＣＬＩＰ９、オリゴフェクタミンなど；又はカチオン性又はポリカチオン性ポリマー、例えば、ベータ−アミノ酸ポリマー又は逆ポリアミドなどの修飾ポリアミノ酸、ＰＶＰなどの修飾ポリエチレン、ｐＤＭＡＥＭＡなどの修飾アクリレート、ｐＡＭＡＭなどの修飾アミドアミン、ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリレート−コ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなどの修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピレンアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭベースのデンドリマーなどのデンドリマー、ＰＥＩ、ポリ（プロピレンイミン）などのポリイミン、ポリアリルアミン、シクロデキストリンベースのポリマー、デキストランベースのポリマーなどの糖骨格ベースのポリマー、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなどのシラン骨格ベースのポリマー、１以上のカチオンブロックの組合せからなるブロックポリマー（例えば、前記カチオン性ポリマーから選択される）及び１以上の親水性又は疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコールなど）の組合せからなるブロックポリマー；などを含む。
この文脈においては、本明細書で定義される少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡが、カチオン性又はポリカチオン性化合物及び／又はポリマー担体、好ましくはカチオン性タンパク質又はペプチドと複合体化又は少なくとも部分的に複合体化されることが特に好ましい。この文脈において、国際公開第２０１０／０３７５３９号及び国際公開第２０１２／１１３５１３号の開示を、参照により本明細書に援用する。部分的には、人工核酸の一部のみがカチオン性化合物と複合体化し、人工核酸の残りの部分が（本発明（医薬）組成物に含まれ）非複合型（「遊離」）であることを意味する。
第２の態様の好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１つ以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはプロタミンと、第１の態様の少なくとも１つの遊離人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なるＲＮＡと複合体化される。
この文脈において、本明細書に定義される少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、プロタミンと複合体化される又は少なくとも部分的に複合体化されることが特に好ましい。好ましくは、核酸、特にプロタミン複合体化ＲＮＡのＲＮＡと遊離ＲＮＡのモル比は、約１：１の比を含む約０．００１：１〜約１：０．００１のモル比から選択することができる。好適には、複合化されたＲＮＡは、プロタミン−トレハロース溶液を２：１のＲＮＡ：プロタミン重量対重量比（ｗ／ｗ）でＲＮＡサンプルに添加することによってプロタミンと複合化される。
複合体化に使用できる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質又はペプチドは、国際公開第２００９／０３０４８１号又は国際公開第２０１１／０２６６４１号の式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘから誘導することができる。これに関連する国際公開第２００９／０３０４８１号又は国際公開第２０１１／０２６６４１号の開示を、参照により本明細書に援用する。
第２の態様の好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、好ましくは、配列番号６４〜６７、２１３２０又はそれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つのカチオン性又はポリカチオン性タンパク質又はペプチドと複合体化又は少なくとも部分的に複合体化される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、本明細書で定義されるＲＮＡ及びポリマー担体を含む。
本明細書で使用される「ポリマー担体」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、別の化合物（カーゴ）の輸送及び／又は錯化を促進する化合物を意味することが意図される。ポリマー担体は、典型的には、ポリマーから形成される担体である。ポリマー担体は、共有的又は非共有的相互作用によって、そのカーゴ（核酸、ＲＮＡ）と会合し得る。
好適なポリマー担体は、ジスルフィド架橋されたカチオン性化合物によって形成されるポリマー担体であり得る。ジスルフィド架橋されたカチオン性化合物は、互いに同一であっても異なっていてもよい。ポリマー担体はまた、更なる成分も含み得る。本発明にしたがって使用されるポリマー担体が、ジスルフィド結合によって（−ＳＨ基を介して）架橋される、本明細書に定義のカチオン性ペプチド、タンパク質、又はポリマー、及び任意に更なる成分の混合物を含むことができる。
この文脈において、国際公開第２０１２／０１３３２６号の式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ’）ｘ（Ｃｙｓ）ｙ｝及び式Ｃｙｓ，｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝Ｃｙｓ２に係るポリマー担体が好ましく、それに関する国際公開第２０１２／０１３３２６号の開示を、参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態においては、本明細書で定義されるＲＮＡを複合体化するために使用できるポリマー担体は、国際公開第２０１１／０２６６４１号の式（Ｌ−Ｐ１−Ｓ−［Ｓ−Ｐ２−Ｓ］ｎ−Ｓ−Ｐ３−Ｌ）に係るポリマー担体に由来することができ、それに関する国際公開第２０１１／０２６６４１号の開示を、参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態においては、ポリマー担体化合物は、ペプチドエレメントＣｙｓＡｒｇ１２Ｃｙｓ（配列番号６４）又はＣｙｓＡｒｇ１２（配列番号６５）又はＴｒｐＡｒｇ１２Ｃｙｓ（配列番号６６）によって形成される又は含む又はからなる。特に好ましい実施形態では、ポリマー担体化合物は、（Ｒ１２Ｃ）−（Ｒ１２Ｃ）二量体、（ＷＲ１２Ｃ）−（ＷＲ１２Ｃ）二量体、又は（ＣＲ１２）−（ＣＲ１２Ｃ）−（ＣＲ１２）三量体からなり、二量体（例えば、（ＷＲ１２Ｃ））又は三量体（例えば、（ＣＲ１２））中の個々のペプチドエレメントは、−ＳＨ基を介して結合される。
第２の態様の好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、ＨＯ−ＰＥＧ５０００−Ｓ−（Ｓ−ＣＨＨＨＨＨＨＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨＣ−Ｓ−）７−Ｓ−ＰＥＧ５０００−ＯＨ（ペプチドモノマーとしての配列番号６７）を含むポリエチレングリコール／ペプチドポリマーと複合体化又は会合される。
第２の態様の更に好ましい実施形態においては、、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、ＨＯ−ＰＥＧ５０００−Ｓ−（Ｓ−ＣＨＨＨＨＨＨＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨＣ−Ｓ−）４−Ｓ−ＰＥＧ５０００−ＯＨ（ペプチドモノマーとしての配列番号６７）を含むポリエチレングリコール／ペプチドポリマーと複合体化又は会合される。
第２の態様の更に好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、ＨＯ−ＰＥＧ５０００−Ｓ−（Ｓ−ＣＧＨＨＨＨＨＲＲＲＲＨＨＨＨＨＧＣ−Ｓ−）７−Ｓ−ＰＥＧ５０００−ＯＨ（ペプチドモノマーとしての配列番号２１３２０）を含むポリエチレングリコール／ペプチドポリマーと複合体化又は会合される。
第２の態様の更に好ましい実施形態では、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、ＨＯ−ＰＥＧ５０００−Ｓ−（Ｓ−ＣＧＨＨＨＨＨＲＲＲＲＨＨＨＨＨＧＣ−Ｓ−）４−Ｓ−ＰＥＧ５０００−ＯＨ（ペプチドモノマーとしての配列番号２１３２０）を含むポリエチレングリコール／ペプチドポリマーと複合体化又は会合される。
他の実施形態においては、組成物は、本明細書に記載される少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡを含み、少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、ポリマー担体と、任意に、公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１７／２１２００８Ａ１号、同２０１７／２１２００６Ａ１号、同２０１７／２１２００７Ａ１号、及び同２０１７／２１２００９Ａ１号に記載される少なくとも１つの脂質成分と複合体化又は会合される。この文脈において、国際公開第２０１７／２１２００８Ａ１号、同２０１７／２１２００６Ａ１号、同２０１７／２１２００７Ａ１号、及び同２０１７／２１２００９Ａ１号の開示を、参照により本明細書に援用する。
特に好ましい実施形態においては、ポリマー担体は、ペプチドポリマー、好ましくは上に定義したポリエチレングリコール／ペプチドポリマー、及び脂質成分、好ましくはリピドイド成分、より好ましくはリピドイド成分である。
第２の態様の好ましい実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、ポリマー担体、好ましくは上に定義したポリエチレングリコール／ペプチドポリマー、及びリピドイド成分と複合体化又は会合され、リピドイド成分は式Ａに係る化合物又はその薬学的に許容される塩である。
Figure 2021519595
 式中、
− ＲＡは、それぞれ独立して、非置換、環状又は非環状、分岐又は非分岐のＣ１−２０の脂肪族基；置換又は非置換、環状又は非環状、分岐又は非分岐のＣ１−２０のヘテロ脂肪族基；置換又は非置換のアリール；置換又は非置換のヘテロアリールから選択され；
Figure 2021519595
 式中、少なくとも１つのＲＡは、
Figure 2021519595
 − Ｒ５は、それぞれ独立して、非置換、環状又は非環状、分岐又は非分岐のＣ８−１６の脂肪族；置換又は非置換のアリール；又は置換又は非置換のヘテロアリールから選択され；
− ｘは、それぞれ１〜１０の整数であり；
− ｙは、それぞれ１〜１０の整数である。
好ましい実施形態では、リピドイド成分は、式Ｂに係る３−Ｃ１２−ＯＨである。
Figure 2021519595
好ましい実施形態においては、上に記載したリピドイド３−Ｃ１２−ＯＨを含むペプチドポリマーを使用して、第１の態様のＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡを複合体化して、約０．１〜約２０、又は約０．２〜約１５、又は約２〜約１５、又は約２〜約１２のＮ／Ｐ比を有する複合体を形成する。Ｎ／Ｐ比は、カチオン性ペプチド又はポリマーの塩基性基の窒素原子の、人工核酸のリン酸基も対するモル比として定義される。その文脈において、国際公開第２０１７／２１２００９Ａ１号の開示、特に、国際公開第２０１７／２１２００９Ａ１号の請求項１〜１０、及びそれに関する具体的な開示を、参照により本明細書に援用する。
ＬＮＰにおける封入化／複合体化：
第２の態様の好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１以上の脂質（例えば、カチオン性脂質及び／又は中性脂質）と複合体化又は会合されて、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックス、及び／又はナノリポソームを形成する。
本明細書で定義される１超の人工ＲＮＡ構築物（例えば、Ｆ−ｄｅｌ及びＭ２−１）を含む組成物の場合、前記構築物を、例えば、ＬＮＰ中に共存させて、各組成物を形成することができる。
或いは、前記１超の人工ＲＮＡ構築物は、別々に調製した後、組み合わせて、各組成物を形成してもよい。
この文脈において、「複合体化された」又は「会合された」という用語は、第１の態様の人工ＲＮＡと、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡと、共有結合なしでより大きな複合体又はアセンブリをなす１以上の脂質との本質的に安定な組合せを意味する。
本発明の文脈において、「脂質ナノ粒子」という用語（「ＬＮＰ」とも呼ぶ）は、特定の形態に限定されず、例えば、水性環境及び／又はＲＮＡの存在下で、カチオン性脂質と任意に１以上の更なる脂質とが組み合わされたときに生成される形態を含む。例えば、リポソーム、脂質複合体、リポプレックスなどは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の範囲内である。
したがって、第２の態様の好ましい実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１以上の脂質と複合体化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成する。
ＬＮＰは通常、カチオン性脂質と、中性脂質、荷電脂質、ステロイド、及びポリマーコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ化脂質）から選択される１以上の賦形剤とを含む。ＲＮＡは、ＬＮＰの脂質部分内、又はＬＮＰの一部又は全体の脂質部分によって包囲される水性空間に封入され得る。ＲＮＡ又はその一部はまた、ＬＮＰと会合及び複合体化され得る。ＬＮＰは、核酸が結合する粒子、又は１以上の核酸が封入される粒子を形成することができる任意の脂質を含むことができる。好ましくは、ＬＮＰを含む核酸は、１以上のカチオン性脂質、及び１以上の安定化脂質を含む。安定化脂質には、中性脂質及びＰＥＧ化脂質が含まれる。
ＬＮＰのカチオン性脂質はカチオン化可能であることがある。即ち、ｐＨが、脂質のイオン化可能基のｐＫ未満に低下するとプロトン化するが、ｐＨ値がより高くなると次第に中性になる。ｐＫ未満のｐＨ値では、脂質は、負に帯電した核酸と会合することができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ｐＨ低下時に正電荷を帯びる両性イオン性脂質を含む。
ＬＮＰは、任意の更なるカチオン性又はカチオン化可能な脂質、即ち、生理学的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の正電荷を有する多くの脂質種のいずれかを含み得る。
そのような脂質としては、限定されるものではないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）（Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド及び１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩としても知られる）、Ｎ−（１−（２，３−）ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−ｙ−ノレニルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチル−アミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）又は３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭ Ａ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）又はその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｃ１２〜２００）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル ４−（ジ−メチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ）、３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（ＭＣ３エーテル）、４−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ブタン−１−アミン（ＭＣ４エーテル）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの市販されている、ＤＯＴＭＡ及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されている、Ｎ−（１−（２，３ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム）；及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から市販されている、エタノール中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販のカチオン性脂質）又はこれらの任意の組合せが挙げられる。
いくつかの実施形態においては、脂質は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、及びｃｋｋ−Ｅ１２からなる群から選択される。
一実施形態においては、更なるカチオン性脂質はアミノ脂質である。
代表的なアミノ脂質としては、限定されるものではないが、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、及び２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［ｌ，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）；ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）；ＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書）が挙げられる。
一実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、アミノアルコールリピドイド中に含有させることができる。本発明で使用することができるアミノアルコールリピドイドは、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第８，４５０，２９８号明細書に記載される方法によって調製することができる。好適な（イオン化可能な）脂質はまた、表１、表２、及び表３に開示され、参照により本明細書に援用する国際公開第２０１７／０７５５３１Ａ１号の請求項１〜２４に定義される化合物であってもよい。
別の実施形態においては、イオン化可能な脂質はまた、国際公開第２０１５／０７４０８５Ａ１号に開示される化合物（即ち、ＡＴＸ−００１〜ＡＴＸ−０３２又は請求項１〜２６で特定される化合物）、米国特許出願第６１／９０５，７２４号明細書及び同第１５／６１４，４９９号明細書、又は米国特許第９，５９３，０７７号明細書及び同第９，５６７，２９６号明細書に開示される化合物であってもよく、これらの全体を参照により本明細書に援用する。
その文脈においては、一般式（Ｘ１）に由来する脂質、又はその薬学的に許容される塩を好適に使用することができる。
Figure 2021519595
 式中、ＲｉとＲ２は同一又は異なっており、それぞれ１〜９個の炭素からなる直鎖又は分岐したアルキル、２〜１１個の炭素からなるアルケニル又はアルキニル、ＬｉとＬ２は同一又は異なっており、それぞれ５〜１８個の炭素からなる直鎖のアルキレン又はアルケニレンである、又はＮと複素環を形成している、Ｘｉは結合、又は−ＣＯ−Ｏ−であり、それによって−Ｌ２−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２が形成され、Ｘ２はＳ又はＯ、Ｌ３は結合又は直鎖又は分岐した１〜６個の炭素からなるアルキレン、又はＮと複素環を形成している、Ｒ３は１〜６個の炭素からなる直鎖又は分岐したアルキレン、Ｒ４とＲ５は同一又は異なっており、各水素又は直鎖又は分岐した１〜６個の炭素からなるアルキルである。
他の実施形態においては、好適なカチオン性脂質は、その全体を参照により援用する国際公開第２０１７／１１７５３０Ａ１号に開示される化合物（即ち、脂質１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は特許請求の範囲で特定されている化合物）であってもよい。
この文脈においては、一般式（Ｘ２）に由来する脂質、又はその薬学的に許容される塩である。
Figure 2021519595
 式中、
Ｘは、直鎖又は分岐したアルキレン又はアルケニレン、単環式、二環式、又は三環式のアレーン又はヘテロアレーンであり；
Ｙは、結合、エテン、又は非置換又は置換芳香族又はヘテロ芳香族環であり；
Ｚは、Ｓ又は０であり；
Ｌは、炭素数１〜６の直鎖又は分岐したアルキレンであり；
Ｒ−３及びＲ４は、独立して、炭素数１〜６の直鎖又は分岐したアルキルであり；
Ｒｉ及びＲ２は、独立して、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニルであり；
ｒは、０〜６であり；
ｍ、ｎ、ｐ、及びｑは、独立して、１〜１８であり；
ｎ＝ｑ、ｍ＝ｐ、Ｒｉ＝Ｒ２のとき、ＸとＹは異なり；
Ｘ＝Ｙ、ｎ＝ｑ、ｍ＝ｐのとき、Ｒ１とＲ２は異なり；
Ｘ＝Ｙ、ｎ＝ｑ、Ｒｉ＝Ｒ２のとき、ｍとｐは異なり；
Ｘ＝Ｙ、ｍ＝ｐ、Ｒｉ＝Ｒ２のとき、ｎとｑは異なる。
好ましい実施形態においては、式（Ｘ２）に由来する脂質を使用することができ、式中、Ｘは、結合、直鎖又は分岐したアルキレン、アルケニレン、又は単環式、二環式、又は三環式アレーン又はヘテロアレーンであり；Ｙは、単環式、二環式、又は三環式のアレーン又はヘテロアレーンであり；Ｚは、Ｓ又はＯであり；Ｌは、炭素数１〜６の直鎖又は分岐したアルキレンであり；Ｒ３とＲ４は、独立して、炭素数１〜６の直鎖又は分岐したアルキルであり；ＲｉとＲ２は、独立して、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニルであり；ｒは、０〜６であり；ｍ、ｎ、ｐ、及びｑは、独立して、１〜１８であり；又はその薬学的に許容される塩を好適に使用することができる。
好ましい実施形態においては、イオン化可能な脂質は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７７５１７に開示される脂質化合物（即ち、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７７５１７の式Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩに由来する脂質化合物、又はＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７７５１７の請求項１〜１２に特定されている脂質化合物）から選択することもでき、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７７５１７の開示は、参照によりその全体を本明細書に援用する。この文脈では、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７７５１７の表７に開示される脂質化合物（例えば、式Ｉ−１〜Ｉ−４１に由来する脂質化合物）及びＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７７５１７の表８に開示される脂質化合物（例えば、式ＩＩ−１〜ＩＩ−３６）が、本発明の文脈において好適に使用することができる。したがって、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７７５１７の式Ｉ−１〜式Ｉ−４１及び式ＩＩ−１〜式ＩＩ−３６、及びそれらに関する具体的な開示を、参照により本明細書に援用する。
第２の態様の特に好ましい実施形態においては、好適な脂質は、式（ＩＩＩ）に係るカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ、若しくは立体異性体であり得る。
Figure 2021519595
 式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ１、Ｇ２、及びＧ３は、以下の通りである。
式（ＩＩＩ）は、更に、以下のように定義される：
Ｌ１又はＬ２は、その一方が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、又は−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり、Ｌ１又はＬ２の他方が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、若しくは−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−、又は直接結合であり；
Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、非置換のＣ１−Ｃ１２アルキレン又はＣ１−Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１−Ｃ２４アルキレン、Ｃ１−Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルケニレンであり；
Ｒａは、Ｈ又はＣ１−Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ６−Ｃ２４アルキル又はＣ６−Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、又は−ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ｘは、０、１、又は２である。
前記した式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態においては、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）又は（ＩＩＩＢ）のいずれかを有する。
Figure 2021519595
 式中、
Ａは、３〜８員のシクロアルキル又はシクロアルキレン環であり；Ｒ６は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、又はＣ１−Ｃ２４アルキルであり；ｎは、１〜１５の整数である。
前記した式（ＩＩＩ）の実施形態のいくつかにおいては、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態においては、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩＩ）の他の実施形態においては、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）又は（ＩＩＩＤ）のいずれかを有する。
Figure 2021519595
 式中、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、１〜１２の整数である。
式（ＩＩＩ）の前記したの実施形態のいずれかにおいては、Ｌ１又はＬ２のいずれかは、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。例えば、いくつかの実施形態においては、Ｌ１又はＬ２は、それぞれ、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。前記のいずれかのいくつかの異なる実施形態においては、Ｌ１又はＬ２は、それぞれ独立して、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又は−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。例えば、いくつかの実施形態においては、Ｌ１又はＬ２は、それぞれ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−である。
第２の態様の好ましい実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質は、式ＩＩＩの化合物であり、
式中、
Ｌ１又はＬ２は、それぞれ独立して、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−又は（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−であり；
Ｇ３は、Ｃ１−Ｃ２４アルキレン又はＣ１−Ｃ２４アルケニレンであり；
Ｒ３は、Ｈ又はＯＲ５である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態においては、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）又は（ＩＩＩＦ）のいずれかを有する。
Figure 2021519595
式（ＩＩＩ）の前記した実施形態のいくつかにおいては、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）、又は（ＩＩＩＪ）のいずれかを有する。
Figure 2021519595
式（ＩＩＩ）の前記した実施形態のいくつかにおいては、ｎは、２〜１２であり、例えば、２〜８又は２〜４の整数である。いくつかの実施形態においては、ｎは、３、４、５、又は６である。いくつかの実施形態においては、ｎは、４である。いくつかの実施形態においては、ｎは、５である。いくつかの実施形態においては、ｎは、６である。式（ＩＩＩ）の前記したいくつかの他の実施形態においては、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、２〜１０の整数である。例えば、いくつかの実施形態においては、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、４〜９又は４〜６の整数である。式（ＩＩＩ）の前記した実施形態のいくつかにおいては、Ｒ６は、Ｈである。前記した実施形態の他の実施形態においては、Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ２４アルキルである。他の実施形態においては、Ｒ６は、ＯＨである。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態においては、Ｇ３は、非置換である。他の実施形態においては、Ｇ３は、置換されている。様々な異なる実施形態においては、Ｇ３は、直鎖Ｃ１−Ｃ２４アルキレン又は直鎖Ｃ１−Ｃ２４アルケニレンである。式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前記した実施形態においては、Ｒ１又はＲ２、若しくはその両方は、Ｃ６−Ｃ２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態においては、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して以下の構造を有する。
Figure 2021519595
 式中、
Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、各場合に独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ１２アルキルであり；ａは、２〜１２の整数であり；Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、及びａはそれぞれ、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して６〜２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態においては、ａは、５〜９又は８〜１２の整数である。式（ＩＩＩ）の前記した実施形態のいくつかにおいては、Ｒ７ａの少なくとも１つは、Ｈである。例えば、いくつかの実施形態においては、Ｒ７ａはいずれもＨである。前記した他の異なる実施形態においては、Ｒ７ｂの少なくとも１つは、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態においては、Ｃ１−Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、又はｎ−オクチルである。
式（ＩＩＩ）の異なる実施形態においては、Ｒ１又はＲ２、若しくはその両方は、以下の構造のうちの１つを有する。
Figure 2021519595
第２の態様の好ましい実施形態においては、ＬＮＰのカチオン性脂質は、式ＩＩＩの化合物であり、式中、
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−又は（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、以下の構造のうちの１つを有する。
Figure 2021519595
式（ＩＩＩ）の前記した実施形態のいくつかにおいては、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、又は−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。いくつかの実施形態においては、Ｒ４は、メチル又はエチルである。
第２の態様の好ましい実施形態においては、ＬＮＰのカチオン性脂質は、式ＩＩＩの化合物であり、Ｒ３がＯＨである。
第２の態様の特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１以上の脂質と複合体化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成し、ＬＮＰは、構造ＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−３６（表８を参照）から選択される。
表８：式（ＩＩＩ）に由来する代表的な脂質化合物
Figure 2021519595
Figure 2021519595
Figure 2021519595
Figure 2021519595
Figure 2021519595
いくつかの実施形態においては、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質、第１の態様の人工ＲＮＡ、及び任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡ、並びに中性脂質、ステロイド、及びＰＥＧ化脂質から選択される１以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態においては、式（ＩＩＩ）の脂質は、化合物ＩＩＩ−３である。いくつかの実施形態においては、式（ＩＩＩ）の脂質は、化合物ＩＩＩ−７である。
好ましい実施形態においては、ＬＮＰは、以下から選択されるカチオン性脂質を含む。
Figure 2021519595
Figure 2021519595
第２の態様の特に好ましい実施形態においては、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１以上の脂質と複合体化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成し、ＬＮＰは、以下のカチオン性脂質（表８の式ＩＩＩ−３に係る脂質）を含む。
Figure 2021519595
特定の実施形態においては、本明細書に定義されるカチオン性脂質、好ましくは表８に開示されるカチオン性脂質、より好ましくはカチオン性脂質化合物ＩＩＩ−３は、ＬＮＰの総脂質含量に対して約３０〜約９５モルパーセントの量でＬＮＰに存在する。１超のカチオン性脂質がＬＮＰに含有される場合、そのパーセンテージは、組み合わされたカチオン性脂質に適用される。
一実施形態においては、カチオン性脂質は、約３０〜約７０モルパーセントの量でＬＮＰに存在する。一実施形態においては、カチオン性脂質は、それぞれ約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０モルパーセントなど、約４０〜約６０モルパーセントの量でＬＮＰに存在する。いくつかの実施形態においては、カチオン性脂質は、それぞれ約４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、５０．０モルパーセントなど、約４７〜約４８モルパーセントの量でＬＮＰに存在し、４７．７モルパーセントが特に好ましい。
いくつかの実施形態においては、カチオン性脂質は、ＬＮＰに存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％〜約７０又は７５ｍｏｌ％、又は約４５〜約６５ｍｏｌ％、又は約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は約７０ｍｏｌ％の比率で存在する。更なる実施形態においては、ＬＮＰは、カチオン性脂質のモル基準で約２５％〜約７５％、例えば、（脂質ナノ粒子中の脂質の総モル１００％に基づく）モル基準で約２０〜約７０％、約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５７．１％、約５０％、又は約４０％を含む。いくつかの実施形態においては、カチオン性脂質と核酸、好ましくは第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に第２の態様の更なる人工ＲＮＡの割合は、約３〜約１５であり、例えば、約５〜約１３又は約７〜約１１である。
本発明のいくつかの実施形態においては、ＬＮＰは、前記した任意の脂質の組合せ又は混合物を含む。
他の好適な（カチオン性）脂質は、国際公開第２００９／０８６５５８号、国際公開第２００９／１２７０６０号、国際公開第２０１０／０４８５３６号、国際公開第２０１０／０５４４０６号、国際公開第２０１０／０８８５３７号、国際公開第２０１０／１２９７０９号、国際公開第２０１１／１５３４９３号、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号、米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６０号、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号、米国特許第８１５８６０１号、国際公開第２０１６／１１８７２４号、国際公開第２０１６／１１８７２５号、国際公開第２０１７／０７０６１３号、国際公開第２０１７／０７０６２０号、国際公開第２０１７／０９９８２３号、及び国際公開第２０１７／１１２８６５号に開示される。この文脈において、ＬＮＰに好適な（カチオン性）脂質に具体的に関連する国際公開第２００９／０８６５５８号、国際公開第２００９／１２７０６０号、国際公開第２０１０／０４８５３６号、国際公開第２０１０／０５４４０６号、国際公開第２０１０／０８８５３７号、国際公開第２０１０／１２９７０９号、国際公開第２０１１／１５３４９３号、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６０号明細書、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書、米国特許出願公開第８１５８６０１号明細書、国際公開第２０１６／１１８７２４号、国際公開第２０１６／１１８７２５号、国際公開第２０１７／０７０６１３号、国際公開第２０１７／０７０６２０号、国際公開第２０１７／０９９８２３号、及び国際公開第２０１７／１１２８６５号を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態においては、脂質は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、及びｃｋｋ−Ｅ１２からなる群から選択される。
いくつかの実施形態においては、本明細書に定義されるアミノ脂質又はカチオン性脂質は、少なくとも１つのプロトン化可能基又は脱プロトン化可能基を有し、脂質は、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のｐＨで正に帯電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨで中性である。言うまでもなく、ｐＨの関数としてのプロトンの追加又は除去は平衡プロセスであり、荷電脂質又は中性脂質への言及は主として存在する種の性質を意味し、全て脂質が荷電又は中性の形態で存在しなければならないということではない。１超のプロトン化可能基又は脱プロトン化可能基（即ち、両性イオン性である）を有する脂質は除外せず、本発明の文脈において同様に好適であり得る。
いくつかの実施形態においては、プロトン化可能な脂質は、約４〜約１１の範囲のプロトン化可能基のｐＫａ、例えば、約５〜約７のｐＫａを有する。
ＬＮＰは、２つ以上の（異なる）カチオン性脂質を含むことができる。カチオン性脂質は、異なる有利な特性に寄与するように選択することができる。例えば、アミンｐＫａ、化学的安定性、循環中の半減期、組織での半減期、組織での正味の蓄積、又は毒性などの性質が異なるカチオン性脂質をＬＮＰに使用することができる。特に、カチオン性脂質は、混合ＬＮＰの性質が個々の脂質の単一ＬＮＰの性質よりも望ましいように選択することができる。
恒久的にカチオン性の脂質又はリピドイドの量は、核酸カーゴの量を考慮して選択することができる。一実施形態では、これらの量は、ナノ粒子又は組成物のＮ／Ｐ比が約０．１〜約２０の範囲となるように選択される。この文脈において、Ｎ／Ｐ比は、脂質又はリピドイドの塩基性窒素含有基の窒素原子（「Ｎ」）の、カーゴとして使用されるＲＮＡのリン酸基（「Ｐ」）に対するモル比として定義される。Ｎ／Ｐ比は、ＲＮＡが塩基の統計的分布を示すという条件で、例えば、１μｇのＲＮＡが典型的に約３ｎｍｏｌのリン酸残基を含有することに基づいて計算することができる。脂質又はリピドイドの「Ｎ」値は、その分子量と、恒久的にカチオン性の及び存在する場合にはカチオン化可能な基の相対含量に基づいて計算できる。
ＬＮＰのインビボ特性と挙動は、親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をＬＮＰ表面に添加して、立体的安定性を付与することにより変更することができる。更に、ＬＮＰは、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）をその表面又はＰＥＧ鎖の末端（例えば、ＰＥＧ化脂質を介して）に結合させることにより、特異的なターゲティングに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ポリマーコンジュゲート脂質を含む。「ポリマーコンジュゲート脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む分子を意味する。ポリマーコンジュゲート脂質の例は、ＰＥＧ化脂質である。「ＰＥＧ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を意味する。ＰＥＧ化脂質は、当技術分野で知られており、１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧ）などが挙げられる。
特定の実施形態では、ＬＮＰは、ポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ化脂質）である更なる安定化脂質を含む。好適なポリエチレングリコール脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。代表的なポリエチレングリコール脂質としては、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、及びＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧが挙げられる。一実施形態では、ポリエチレングリコール脂質は、Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。好ましい実施形態では、ポリエチレングリコール脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＭＧである。一実施形態では、ポリエチレングリコール脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧである。他の実施形態では、ＬＮＰは、ＰＥＧ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、例えば、１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧスクシナートジアシルグリセロール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＧ）、例えば、４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−１−Ｏ−（ω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオアート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ化セラミド（ＰＥＧ−ｃｅｒ）、又はＰＥＧジアルコキシプロピルカルバマート、例えば、ω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル−Ｎ−（２，３ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバマート又は２，３−ジ（テトラデカノキシ）プロピル−Ｎ−（ω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバマートを含む。
第２の態様の好ましい実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１以上の脂質と複合体化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成し、ＬＮＰは更に、式（ＩＶ）を有するＰＥＧ化脂質、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、若しくは立体異性体を含む。
Figure 2021519595
 式中、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、１０〜３０個の炭素原子を含む、直鎖又は分岐した飽和又は不飽和のアルキル鎖であり、アルキル鎖は、１以上のエステル結合を途中に有していてもよく；ｗの平均値は、３０〜６０である。
式（ＩＶ）に係るＰＥＧ化脂質の前記した実施形態のいくつかでは、ｗが４２であるとき、Ｒ８及びＲ９の両方は、ｎ−オクタデシルではない。いくつかの他の実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、１０〜１８個の炭素原子を含む直鎖又は分岐の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、１２〜１６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、１２個の炭素原子を含む直鎖又は分枝の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、１４個の炭素原子を含む直鎖又は分枝の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。他の実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、１６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。更に他の実施形態では、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、１８個の炭素原子を含む直鎖又は分枝の飽和又は不飽和のアルキル鎖である。更に他の実施形態では、Ｒ８は、１２個の炭素原子を含む直鎖又は分岐の飽和又は不飽和アルキル鎖であり、Ｒ９は、１４個の炭素原子を含む直鎖又は分岐の飽和又は不飽和アルキル鎖である。
様々な実施形態では、ｗは、式（ＩＶ）に係るＰＥＧ化脂質のＰＥＧ部分が約４００〜約６０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するように選択される範囲を有する。いくつかの実施形態では、平均ｗは、約５０である。
第２の態様の好ましい実施形態では、式（ＩＶ）に係るＰＥＧ化脂質のＲ８及びＲ９は、飽和アルキル鎖である。
第２の態様の特に好ましい実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１以上の脂質と複合体化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成し、ＬＮＰは、ＰＥＧ化脂質を更に含み、ＰＥＧ脂質は、式（ＩＶａ）のものである。
Figure 2021519595
 式中、ｎは、３０〜６０の範囲の平均値を有し、例えば、約２８〜約３２、約３０〜約３４、３２〜約３６、約３４〜約３８、３６〜約４０、約３８〜約４２、４０〜約４４、約４２〜約４６、４４〜約４８、約４６〜約５０、４８〜約５２、約５０〜約５４、５２〜約５６、約５４〜約５８、５６〜約６０、約５８〜約６２である。好ましい実施形態では、ｎは、約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４である。最も好ましい実施形態では、ｎは、４９の平均値を有する。
他の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、以下の構造のうちの１つを有する。
Figure 2021519595
 式中、ｎは、ＰＥＧ化脂質の平均分子量が約２５００ｇ／ｍｏｌになるように選択される整数であり、最も好ましくは、ｎは、約４９である。
その文脈において好適なＰＥＧ脂質の更なる例は、米国特許出願公開第２０１５／０３７６１１５Ａ１号明細書及び国際公開第２０１５／１９９９５２号に記載されており、これらのそれぞれの全体を参照により援用する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰ中の脂質の総モルに基づいて、約３、２、又は１モルパーセント未満のＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質を含む。更なる実施形態では、ＬＮＰは、モル基準で、約０．１％〜約２０％のＰＥＧ修飾脂質、例えば、（ＬＮＰ中の脂質の総モル１００％に基づく）モル基準で、約０．５〜約１０％、約０．５〜約５％、約１０％、約５％、約５％、約３．５％、約３％、約２，５％、約２％、約１．５％、約１％、約０．５％、又は約０．３％を含む。好ましい実施形態では、ＬＮＰは、モル基準で、約１．０％〜約２．０％のＰＥＧ修飾脂質、例えば、約１．２〜約１．９％、約１．２〜約１．８％、約１．３〜約１．８％、約１．４〜約１．８％、約１．５〜約１．８％、約１．６〜約１．８％、特に、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、最も好ましくは１．７％（ＬＮＰ中の脂質の総モル数１００％に基づく）を含む。各種実施形態では、カチオン性脂質のＰＥＧ化脂質に対するモル比は、約１００：１〜約２５：１の範囲である。
好ましい実施形態では、ＬＮＰは、それらの形成中に粒子の形成を安定化させる１以上の更なる脂質（例えば、中性脂質及び／又は１以上のステロイド又はステロイド類似体）を更に含む。
第２の態様の好ましい実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１以上の脂質と複合体化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成し、ＬＮＰは、更に、１以上の中性脂質及び／又は１以上のステロイド又はステロイド類似体を含む。
好適な安定化脂質としては、中性脂質及びアニオン性脂質が挙げられる。「中性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで非荷電又は中性な両性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを意味する。代表的な中性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが挙げられる。
第２の態様の実施形態では、ＬＮＰは、１以上の中性脂質を更に含み、中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアリオイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、及び１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）を含む群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質を含む。各種実施形態では、カチオン性脂質の中性脂質に対するモル比は、約２：１〜約８：１の範囲である。
第２の態様の好ましい実施形態では、中性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。カチオン性脂質のＤＳＰＣに対するモル比は、約２：１〜８：１の範囲であることができる。
第２の態様の好ましい実施形態では、ステロイドは、コレステロールである。カチオン性脂質のコレステロールに対するモル比は、約２：１〜１：１の範囲であることができる。
ステロールは、脂質粒子の約１０モル％〜約６０モル％又は約２５モル％〜約４０モル％であることができる。一実施形態では、ステロールは、脂質粒子中に存在する総脂質の約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は約６０モル％である。別の実施形態では、ＬＮＰは、ステロールのモル基準で、約５％〜約５０％、例えば、（脂質ナノ粒子中の脂質の総モル１００％に基づく）モル基準で、約１５％〜約４５％、約２０％〜約４０％、約４８％、約４０％、約３８．５％、約３５％、約３４．４％、約３１．５％、又は約３１％を含む。
好ましくは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、（ａ）第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡ、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）凝集抑制剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質又はＰＥＧ修飾脂質など）、（ｄ）任意に、非カチオン性脂質（例えば、中性脂質など）、及び（ｅ）任意に、ステロールを含む。
他の好ましい実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、（ａ）第１の態様のＦをコードする少なくとも１つの人工ＲＮＡ又はその誘導体若しくは断片及び第２の態様のＮ、Ｍ、Ｐ、又はＭ２−１をコードする少なくとも１つの人工ＲＮＡ又はその誘導体若しくは断片、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）凝集抑制剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質又はＰＥＧ修飾脂質など）、（ｄ）任意に、非カチオン性脂質（例えば、中性脂質など）、及び（ｅ）任意に、ステロールを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質、本明細書に定義される人工ＲＮＡ、中性脂質、ステロイド、及びＰＥＧ化脂質を含む。好ましい実施形態では、式（ＩＩＩ）の脂質は脂質化合物ＩＩＩ−３であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロイドはコレステロールであり、ＰＥＧ化脂質は式（ＩＶａ）の化合物である。
第２の態様の好ましい実施形態では、ＬＮＰは、（ｉ）少なくとも１つのカチオン性脂質；（ｉｉ）中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えば、コレステロール；及び（ｉｖ）ＰＥＧ−脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−ｃＤＭＡから本質的になり、モル比で、約２０〜６０％カチオン性脂質：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％ステロール；０．５〜１５％ＰＥＧ−脂質である。
第２の態様の特に好ましい実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡは、１以上の脂質と複合体化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成し、ＬＮＰは、
（ｉ）本明細書に定義される少なくとも１つのカチオン性脂質、好ましくは式（ＩＩＩ）の脂質、より好ましくは脂質ＩＩＩ−３；
（ｉｉ）本明細書に定義される中性脂質、好ましくは１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；
（ｉｉｉ）本明細書に定義されるステロイド又はステロイド類似体、好ましくはコレステロール；及び
（ｉｖ）本明細書に定義されるＰＥＧ−脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−ｃＤＭＡ、好ましくは式（ＩＶａ）のＰＥＧ化脂質から本質的になり、
（ｉ）〜（ｉｖ）は、モル比で、約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ−脂質である。
好ましい一実施形態では、脂質ナノ粒子は、式（ＩＩＩ）を有するカチオン性脂質及び／又は式（ＩＶ）を有するＰＥＧ脂質、任意に、中性脂質、好ましくは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及び任意に、ステロイド、好ましくはコレステロールを含み、カチオン性脂質のＤＳＰＣに対するモル比は、任意に、約２：１〜８：１であり、カチオン性脂質のコレステロールに対するモル比は、任意に、約２：１〜１：１である。
特に好ましい実施形態では、第１の態様の人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡを含む第２の態様の組成物は、約５０：１０：３８．５：１．５、好ましくは４７．５：１０：４０．８：１．７、又はより好ましくは４７．４：１０：４０．９：１．７（即ち、カチオン性脂質（好ましくは脂質ＩＩＩ−３）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質の比率（ｍｏｌ％）（（好ましくは、ｎ＝４９の式（ＩＶａ）のＰＥＧ−脂質）；エタノールに可溶）のモル比を有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。
特に好ましい実施形態では、第２の態様の組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含み、約５０：１０：３８．５：１．５、好ましくは４７．５：１０：４０．８：１．７、又はより好ましくは４７．４：１０：４０．９：１．７（即ち、カチオン性脂質（好ましくは脂質ＩＩＩ−３）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質の比率（ｍｏｌ％）（（好ましくはｎ＝４９の式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質）；エタノールに可溶）のモル比を有し、脂質ナノ粒子は、Ｆ（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８）をコードする少なくとも１つのＲＮＡと、更に、脂質−ナノ粒子（ＬＮＰ）を含み、約５０：１０：３８．５：１．５、好ましくは４７．５：１０：４０．８：１．７、又はより好ましくは４７．４：１０：４０．９：１．７（即ち、カチオン性脂質（好ましくは脂質ＩＩＩ−３）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質の比率（ｍｏｌ％）（（好ましくはｎ＝４９の式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質）；エタノールに可溶）のモル比を有し、脂質ナノ粒子は、Ｍ、Ｎ、Ｍ２−１、又はＰをコードする少なくとも１つのＲＮＡを含む。
特に好ましい実施形態では、第２の態様の組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含み、約５０：１０：３８．５：１．５、好ましくは４７．５：１０：４０．８：１．７、又はより好ましくは４７．４：１０：４０．９：１．７（即ち、カチオン性脂質（好ましくは脂質ＩＩＩ−３）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質の比率（ｍｏｌ％）（（好ましくはｎ＝４９の式（ＩＶａ）のＰＥＧ脂質）；エタノールに可溶）のモル比を有し、脂質ナノ粒子は、Ｆ（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８）をコードする少なくとも１つのＲＮＡと、Ｍ、Ｎ、Ｍ２−１、又はＰをコードする少なくとも１つのＲＮＡを含む。
脂質ナノ粒子中のＲＮＡの総量は変動することがあり、例えば、ＲＮＡの総脂質に対するｗ／ｗ比などによって定義される。本発明の一実施形態では、人工ＲＮＡの総脂質に対する比は、０．０６ｗ／ｗ未満、好ましくは０．０３ｗ／ｗ〜０．０４ｗ／ｗである。
各種実施形態では、本明細書で定義されるＬＮＰは、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１９０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１７０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、又は約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、又は２００ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。本明細書で使用するとき、平均直径は、当技術分野で一般に知られている動的光散乱によって決定されるｚ平均で表すことができる。
本発明の別の好ましい実施形態では、脂質ナノ粒子は、それぞれ約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、又は約６０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、又は約６０ｎｍ〜約１２０ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する。
更なる実施形態によれば、第２の態様の組成物は、少なくとも１つのアジュバントを含むことができる。好適には、アジュバントは、好ましくは、組成物の免疫刺激性を増強するために添加される。
本明細書に使用される「アジュバント」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、他の剤の効果（本明細書では、本発明の人工核酸の効果）を変える、例えば、増強する又は組成物の投与及び送達を支援するのに好適であり得る薬理学的及び／又は免疫学的な剤を意味することが意図される。「アジュバント」という用語は、広範囲の物質を意味する。通常、これらの物質は、抗原の免疫原性を高めることができる。例えば、アジュバントは、自然免疫系によって認識され得、そして例えば、自然免疫応答（即ち、非特異的免疫応答）を誘発することができる。「アジュバント」は、通常、適応免疫応答を誘導しない。本発明の文脈においては、アジュバントは、本明細書に定義される人工核酸又は本明細書に定義されるポリタンパク質によってもたらされる抗原性ペプチド又はタンパク質の効果を増強することができる。
この文脈において、少なくとも１つのアジュバントは、当業者に知られ且つ本件に適した、即ち、対象、例えば、ヒト対象における免疫応答の誘導を支援するアジュバントから選択することができる。
したがって、第２の態様の組成物は、少なくとも１つのアジュバントを含み得、少なくとも１つのアジュバントは、公開されたＰＣＴ出願国際公開第２０１６／２０３０２５号に記載される任意のアジュバントから好適に選択することができる。国際公開第２０１６／２０３０２５号の請求項２〜１７のいずれかに開示されたアジュバント、好ましくは国際公開第２０１６／２０３０２５号の請求項１７に開示されたアジュバントが特に好適であり、それらに関する具体的内容を、参照により本明細書に援用する。
第２の態様の組成物は、本明細書に特定される成分に加えて、更なる抗原（例えば、ペプチド又はタンパク質の形態で）又は更なる抗原コード核酸からなる群から選択することができる少なくとも１つの更なる成分；更なる免疫療法剤；１以上の補助物質（サイトカイン、例えば、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、又はケモカインなど）；又は、ヒトＴｏｌｌ様受容体に対する（リガンドとしての）その結合親和性のために免疫刺激性であることが知られている任意の更なる化合物；及び／又はアジュバント核酸、好ましくは免疫刺激性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、例えば、ＣｐＧ−ＲＮＡなどを含むことができる。
ポリペプチド及びポリペプチドを含む組成物
第３の態様において、本発明は、ポリペプチド、好ましくは抗原ポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、第１の態様の人工ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列又はその断片を含む。
いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドは、配列番号６８、４８３、８９８、１２６７、１６３６、２００５、２３７４、２７４３、３１１２、３４８１、３８５０、４２１９、４５８８、４９５７、５３２６、５６９５、６０６４、６４３３、６８０２、７１７１、７５４０、７９０９、１１７２６、１２０９５、１２４６４、１２８３３、１３９４０、１４３０９、１４６７８、１５０４７、１５４１６、１５７８５、１３２０２、１３５７１、１６１５４、１６５２３、１６８９２、１７２６１、１７６３０、１７９９９、１８３６８、１８７３７、１９１０６、１９４７５と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、又はこれらのポリペプチドのいずれかのバリアントを有する。
好ましい実施形態においては、前記ポリペプチドは、配列番号１２６７、２００５、２７４３、３４８１、４２１９、４９５７、５６９５、６４３３、７１７１、７９０９、１２８３３、１４３０９、１５０４７、１５７８５、１３５７１、１６５２３、１７２６１、１７９９９、１８７３７、１９４７５と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、又はこれらのポリペプチドのいずれかのバリアントを有する。
第４の態様では、本発明は、第３の態様のポリペプチドを含む免疫原性組成物に関する。好ましい実施形態では、第４の態様の組成物は、本明細書で定義される少なくとも１つの薬学的に許容される担体を更に含むことができる。好ましい実施形態では、第４の態様の組成物は、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ、又は第２の態様のＲＮＡ組成物を更に含むことができる。
なお、第２の態様の組成物又は第５の態様のワクチンに関する実施形態は、第４の態様の組成物の好適な実施形態として同様に理解することができる。
ワクチン：
第５の態様において、本発明は、第１の態様のＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、又は第４の態様の組成物を含むワクチンを提供する。
なお、第２の態様の組成物又は第４の態様の組成物に関する実施形態は、第５の態様のワクチンの好適な実施形態として同様に理解することができる。また、第５の態様のワクチンに関する実施形態も、第２の態様の組成物（第１の態様のＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡを含む）又は第４の態様の組成物（第３の態様のポリペプチドを含む）の好適な実施形態として同様に理解することができる。
「ワクチン」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、少なくとも１つのエピトープ又は抗原、好ましくは免疫原を提供する予防又は治療物質であることが意図される。本発明の文脈において、抗原又は抗原機能は、第１の態様の本発明ＲＮＡ（ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をコードするコード配列を含むＲＮＡ）、第２の態様の組成物（第１の態様のＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡ）、第３の態様のポリペプチド、又は第４の態様の組成物（前記ポリペプチドを含む）によってもたらされる。
第５の態様の好ましい実施形態では、ワクチンは、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物（第１の態様のＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なる人工ＲＮＡを含む）、第３の態様のポリペプチド、又は第４の態様の組成物を含み、前記ＲＮＡ、第２の態様の前記組成物、前記ポリペプチド、又は第４の態様の前記組成物（前記ポリペプチドを含む）が、適応免疫応答を誘導する。
特に好ましい実施形態では、ワクチンは、第１の態様のＲＮＡ又は第２の態様の組成物を含み、前記ＲＮＡ又は前記組成物は、適応免疫応答、好ましくはＲＳＶに対する適応免疫応答を誘導する。
特に好ましい実施形態では、ワクチンは、第１の態様のＲＮＡ又は第２の態様の組成物を含み、前記ＲＮＡ又は前記組成物は、Ｔ細胞免疫応答を誘導する。
第５の態様の好ましい実施形態によれば、本明細書に定義されるワクチンは、第２の態様の文脈で特定された薬学的に許容される担体及び任意の少なくとも１つのアジュバントを更に含むことができる。
この文脈において好適なアジュバントは、国際公開第２０１６／２０３０２５号の請求項１７に開示されるアジュバントから選択することができる。
好ましい実施形態では、ワクチンは、一価のワクチンである。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、文脈で定義される複数の又は少なくとも１より多い人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の文脈で定義される少なくとも１より多い更なる人工ＲＮＡを含む多価ワクチンである。第２の態様の文脈で開示される多価組成物に関する実施形態は、第５の態様の多価ワクチンの好適な実施形態として同様に理解することができる。
第５の態様のワクチンは、典型的には、第１の態様のＲＮＡの安全且つ有効な量及び、任意に、第２の態様の更なるＲＮＡを含む。本明細書に使用されるとき、「安全且つ有効な量」とは、ＲＳＶの感染に関連する疾患又は障害のポジティブな変化を有意に誘導するのに十分なＲＮＡの量を意味する。同時に、「安全且つ有効な量」は、重篤な副作用を回避するのに十分少ない量である。本発明のワクチン又は組成物に関し、「安全且つ有効な量」という表現は、好ましくは、過剰又は損傷免疫反応が生じず、好ましくは測定可能レベルを下回るそのような免疫反応もないように適応免疫系を刺激するのに適したＲＮＡの量を意味する。
上で定義した組成物又はワクチンのＲＮＡの「安全且つ有効な量」は、治療対象となる特定の状態、及び治療対象患者の年齢及び身体状態、状態の重篤度、治療期間、付随する治療の性質、使用される具体的な薬学的に許容される担体、及び同様の要因に関連して、主治医の知識と経験の範囲内で更に変化しよう。更に、ＲＮＡ、組成物、ワクチンの「安全且つ有効な量」は、投与経路（皮内、筋肉内）、投与装置（ジェット注射、針注射、マイクロニードルパッチ）、及び／又は複合体形成（プロタミン複合体形成又はＬＮＰ封入）に依存し得る。更に、人工ＲＮＡ、組成物、ワクチンの「安全且つ有効な量」は、治療対象（乳児、妊娠女性、免疫不全のヒト対象など）の状態に依存し得る。したがって、好適な「安全且つ有効な量」は、それに応じて適合させる必要があり、当業者によって選択及び決定される。
ワクチンは、本発明にしたがって、ヒトの医療目的及び獣医学的目的（哺乳動物、脊椎動物、鳥類）のために、医薬組成物として、又はワクチンとして使用することができる。
好ましい実施形態では、ＲＮＡ、組成物（前記ＲＮＡ及び、任意に、更なるＲＮＡを含む）、ポリペプチド、組成物（前記ポリペプチドを含む）、又はワクチンは、凍結乾燥形態で提供される（例えば、国際公開第２０１６／１６５８３１号、国際公開第２０１１／０６９５８６号、国際公開第２０１６／１８４５７５号、又は国際公開第２０１６／１８４５７６号に記載される凍結乾燥法を使用する）。好ましくは、凍結乾燥されたＲＮＡ、凍結乾燥された組成物、凍結乾燥されたポリペプチド、ポリペプチドを含む凍結乾燥された組成物、又は凍結乾燥されたワクチンは、投与前に、有利には水性担体に基づく好適な緩衝液（例えば、Ｒｉｎｇｅｒラクタート溶液又はリン酸緩衝液など）中で再構成される。
したがって、本明細書に使用される薬学的に許容される担体は、好ましくは、本発明ワクチンの液体又は非液体ベースを含む。本発明ワクチンが液体形態で提供される場合、担体は、水、典型的には、パイロジェンフリー水；等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸、クエン酸などの緩衝液である。好ましくは、Ｒｉｎｇｅｒラクタート溶液が、国際公開第２００６／１２２８２８号に記載されるように、本発明に係るワクチン又は組成物の液体ベースとして使用され、好適な緩衝液に関する開示を、参照により本明細書に援用する。
本明細書に定義される薬学的に許容される担体の選択は、原則として、本発明に係る医薬組成物又はワクチンが投与される方法によって決定される。ワクチンは、例えば、全身的又は局所的に投与することができる。全身投与の経路には、一般に、例えば、経皮、経口、非経口経路を含み、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、及び腹腔内注射、及び／又は鼻腔内投与経路を含む。一般的な局所投与経路は、例えば、局所投与経路だけでなく、皮内、経皮、皮下、又は筋肉内注射、又は病変内、頭蓋内、肺内、心臓内、関節内、及び舌下注射も含む。より好ましくは、本発明に係る組成物又はワクチンは、皮内、皮下、又は筋肉内経路によって、好ましくは注射によって投与でき、これは無針及び／又は針注射であり得る。したがって、組成物／ワクチンは、好ましくは液体又は固体の形態に処方される。投与される本発明に係るワクチン又は組成物の好適な量は、動物モデルなどを用いる通常の実験によって決定することができる。そのようなモデルとしては、限定することを意図するものではないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、及び非ヒト霊長類モデルが挙げられる。注射用の好ましい単位剤形は、水、生理食塩水、又はそれらの混合物の滅菌溶液を含む。そのような溶液のｐＨは、約７．４に調整する必要がある。注射に適した担体は、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸、及びコラーゲンマトリックスを含む。局所適用に適した薬学的に許容される担体には、ローション、クリーム、ゲルなどでの使用に適したものが含まれる。本発明組成物又はワクチンが経口投与される場合、錠剤、カプセルなどが好ましい単位剤形である。経口投与に使用することができる単位剤形を調製するための薬学的に許容される担体は、先行技術でよく知られている。それらの選択は、本発明の目的にとって重要ではないが、味、コスト、及び保存性などの副次的な事項に依存し、当業者であれば何ら困難性なく選択することができる。
本明細書に定義される本発明ワクチン又は組成物は、免疫原性を更に増加させるために、上に定義した１以上の補助物質を更に含むことができる。本発明組成物に含まれる核酸と補助物質とは、前記したように本発明ワクチン又は組成物と共に製剤化されてもよい（又は別々に製剤化されてもよい）が、相乗作用がそれらによってもたらされることが好ましい。そのような免疫原性増加剤又は化合物は、別々に提供され（本発明のワクチン又は組成物と共に製剤化されるのではなく）、個別に投与してもよい。
本発明ワクチン又は組成物に含まれ得る更なる添加剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎなどの乳化剤；例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；味感付与剤、医薬担体；錠剤形成剤；安定化剤；抗酸化剤；保存料である。
キット又はキットオブパーツ、用途、医学用途、治療方法：
第６の態様において、本発明は、キット又はキットオブパーツを提供し、キット又はキットオブパーツは、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物（前記ＲＮＡを含む）、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物（前記ポリペプチドを含む）、及び／又は第５の態様のワクチン、任意に、可溶化のための液体ビヒクル、及び任意に、成分の用法用量に関する情報を提供する技術的説明書を含む。
好ましい実施形態では、第６の態様のキットは、少なくとも以下の成分を含む。
ａ）第１の態様の少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡ（好ましくは表５又は表６から選択されるＲＮＡ配列）であって、前記人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している；及び
ｂ）Ｍ、Ｎ、Ｍ２−１、又はＰから選択されるＲＳＶに由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、又は３つの更なる人工ＲＮＡ（好ましくは表７Ａから選択されるＲＮＡ配列）であって、前記更なる人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している、
ここで、成分ａ）及びｂ）は、別々の実体又は単一の実体として提供される。
好ましい実施形態では、第６の態様のキットは、少なくとも以下の成分を含む。
ａ）第１の態様の少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡ（好ましくは表５又は表６から選択されるＲＮＡ配列）であって、前記人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している；及び
ｂ）Ｍから選択されるＲＳＶに由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ（好ましくは表７Ａ、列Ａから選択されるＲＮＡ配列）であって、前記更なる人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している；及び
ｃ）Ｐから選択されるＲＳＶに由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ（好ましくは表７Ａ、列Ｃから選択されるＲＮＡ配列）であって、前記更なる人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している、
ここで、成分ａ）、ｂ）、及びｃ）は、別々の実体又は単一の実体として提供される。
好ましい実施形態では、第６の態様のキットは、少なくとも以下の成分を含む。
ａ）第１の態様の少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡ（好ましくは表５又は表６から選択されるＲＮＡ配列）であって、前記人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している；及び
ｂ）Ｍから選択されるＲＳＶに由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ（好ましくは表７Ａ、列Ａから選択されるＲＮＡ配列）であって、前記更なる人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している；及び
ｃ）Ｐから選択されるＲＳＶに由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ（好ましくは表７Ａ、列Ｃから選択されるＲＮＡ配列）であって、前記更なる人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している；及び
ｄ）Ｐから選択されるＲＳＶに由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡ（好ましくは表７Ａ、列Ｂから選択されるＲＮＡ配列）であって、前記更なる人工ＲＮＡは、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している、
ここで、成分ａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）は、別々の実体又は単一の実体として提供される。
キットは、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、及び／又は第５の態様のワクチンに関して記載される更なる成分を更に含むことができる。
前記キットの技術的説明書は、用法用量及び患者群に関する情報を含み得る。そのようなキット、好ましくはキットオブパーツは、例えば、本明細書で言及される用途又は使用のいずれか、好ましくは第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、又は第５の態様のワクチンの、ＲＳＶ又はそれに関連する障害によって引き起こされる感染又は疾患の治療又は予防のための使用に適用することができる。好ましくは、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、又は第５の態様のワクチンは、キットの別々のパーツで提供され、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、又は第５の態様のワクチンは、好ましくは凍結乾燥される。キットは、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、又は第５の態様のワクチンを可溶化するためのビヒクル（例えば、緩衝液など）を一部として更に含むことができる。
好ましい実施形態では、本明細書に定義されるキット又はパーツオブパーツは、Ｒｉｎｇｅｒラクタート溶液を含む。
前記キットはいずれも、本明細書に定義される治療又は予防に使用することができる。より好ましくは、前記キットのいずれかは、ワクチン、好ましくは、本明細書に定義されるＲＳＶによって引き起こされる感染に対するワクチンとして使用することができる。
医学的使用：
更なる態様においては、本発明は、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット又はキットオブパーツの第１の医学的使用に関する。
したがって、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット又はキットオブパーツは、医薬として使用のためのものである。
本発明は更に、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツのいくつかの用途及び使用を提供する。
特に、前記ＲＮＡ、組成物（前記ＲＮＡを含む）、ポリペプチド、組成物（前記ポリペプチドを含む）、ワクチン、又はキット若しくはキットオブパーツは、ヒトの医療目的及び獣医学的目的、好ましくはヒトの医療目的に使用することができる。
特に、前記ＲＮＡ、組成物（前記ＲＮＡを含む）、ポリペプチド、組成物（前記ポリペプチドを含む）、ワクチン、又はキット若しくはキットオブパーツは、ヒトの医療目的の医薬として使用するためのものであることができ、前記ＲＮＡ、組成物（前記ＲＮＡを含む）、ポリペプチド、組成物（前記ポリペプチドを含む）、ワクチン、又はキット若しくはキットオブパーツは、乳幼児、新生児、免疫不全のレシピエント、妊娠中及び授乳中の女性、並びに高齢者に特に好適であり得る。
更に別の態様において、本発明は、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツの第２の医学的使用に関する。
したがって、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツは、病原体（例えば、ウイルスなど）による感染、特に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染症、又はそのような感染症に関連する障害の治療又は予防における使用のためのものである。
特に、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツは、ヒト及び獣医学的目的、好ましくはヒトの医学的目的で、ウイルスによる感染症、特にＲＳＶによる感染症、又はそのような感染症に関連する障害の治療又は予防に使用される。
特に、前記ＲＮＡ、組成物（前記ＲＮＡを含む）、ポリペプチド、組成物（前記ポリペプチドを含む）、ワクチン、又はキット若しくはキットオブパーツは、ＲＳＶ感染症の治療又は予防における使用のために、乳幼児及び新生児、免疫不全のレシピエント、妊娠中及び授乳中の女性、並びに高齢者に特に好適であり得る。
本明細書に使用されるとき、「ＲＳＶ感染に関連する障害」は、好ましくは、ＲＳＶ感染の典型的な症状又は合併症を含み得る。
特に、第１の態様の人工ＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット又はキットオブパーツは、ＲＳＶによって引き起こされる感染症の予防的方法（曝露前予防又は曝露後予防）及び／又は治療的処置に使用することができる。
本明細書に定義される組成物又はワクチンは、好ましくは局所的に投与され得る。特に、組成物又はワクチンは、皮内、皮下、鼻腔内、又は筋肉内経路によって投与することができる。したがって、本発明の本発明組成物又はワクチンは、好ましくは液体（又は、場合により固体）の形態で調製される。いくつかの実施形態においては、本発明ワクチンは、従来の針注射又は無針ジェット注射によって投与することができる。この文脈においては、ＲＮＡ、組成物、ワクチンを、筋肉内針注射によって投与することが好ましい。
本明細書に使用するとき、「ジェット注射」という用語は、無針注射法を意味し、例えば、第１の態様の少なくとも１つのＲＮＡなどを含む流体（本発明のワクチン、組成物）を強制的にオリフィスに通して、哺乳動物の皮膚、及び注射のセッティングに応じて、皮下組織又は筋肉組織に透過することができる高圧の超微細液体流を生成させる。原理上は、液体流が皮膚を貫通し、そこを通って液体流が標的組織に押し込まれる。好ましくは、ジェット注射は、本明細書に開示されるＲＮＡ、組成物、ワクチンの皮内、皮下、又は筋肉内注射に使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に定義される組成物又はワクチンに含まれるＲＮＡは、約１００ｎｇ〜約５００μｇの量、約１μｇ〜約２００μｇの量、約１μｇ〜約１００μｇの量、約５μｇ〜約１００μｇの量、好ましくは約１０μｇ〜約５０μｇの量、具体的には、約５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、又は１００μｇの量で提供される。
投与経路（皮内、筋肉内、鼻腔内）、投与装置（ジェット注射、針注射、マイクロニードルパッチ）、及び／又は複合体形成（好ましくはＬＮＰカプセル化）に応じて、好適な量に適宜調整する必要があるが、これは当業者によって選択及び決定されよう。
本明細書に定義される感染症の治療又は予防のための免疫感作プロトコル、即ち、ＲＳＶに対する対象の免疫感作は、典型的には、組成物又はワクチンの一連の単回用量又は複数回用量を含む。本明細書に使用される単回用量とは、初回／１回目用量、（免疫反応を「ブースト」するために好ましくは投与される）２回目用量、又は任意の更なる用量をそれぞれ意味する。
一実施形態では、本明細書に定義される感染症の治療又は予防のための免疫感作プロトコル、即ち、ＲＳＶに対する対象の免疫化は、組成物又はワクチンの単回用量を含む。
好ましい実施形態では、ＲＳＶによる感染の予防のための免疫感作プロトコルは、本明細書に定義される組成物又はワクチンの少なくとも１回の単回用量を含み、前記少なくとも１回の単回用量は、母体免疫のために妊娠女性に投与され、それにより、胎児の免疫化及び／又は前記少なくとも１回の単回用量が授乳中の女性に投与され、それにより授乳中の小児の受動免疫を達成する。
上に定義した治療又は予防は、更なる活性医薬成分の投与を含むことができる。第１の態様の人工ＲＮＡに基づく本発明ワクチン又は組成物の場合、好ましくは、第３の態様のポリペプチドを、更なる活性医薬成分として共投与してもよい。
例えば、本明細書に記載される少なくとも１つのＲＳＶタンパク質又はペプチド、又はその断片若しくはバリアントは、免疫応答を誘導又は増強するために共投与してもよい。更に、第１の態様の２つの異なる人工ＲＮＡ及び、任意に、第２の態様の更なるＲＮＡは、異なる時点で、好ましくはプライムブーストシナリオで投与することができる。これは、例えば、初回ワクチン接種として少なくとも１つのＲＳＶポリペプチドを含む組成物、及び追加ワクチン接種として第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡを含む組成物／ワクチンを使用する。
好適には、上に定義される治療又は予防は、更なる活性医薬成分の投与を含み、更なる活性医薬成分は、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、モノクローナル又はポリクローナル抗体、ポリクローナル血清又は複数の血清などから選択できる免疫療法剤であり得る。最も好ましくは、本明細書に定義されるＲＳＶタンパク質又はペプチドに対する免疫グロブリンである。好ましくは、そのような更なる免疫療法剤は、ペプチド／タンパク質として提供されてもよく、又は核酸、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡによってコードされてもよい。このような免疫療法剤は、本発明人工ＲＮＡ又は本発明ポリペプチドによって引き起こされる能動的ワクチン接種に加えて、受動的ワクチン接種を提供することを可能にする。
治療及び使用の方法、診断方法、並びに使用：
別の態様において、本発明は、障害を治療又は予防する方法に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、障害を治療又は予防する方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツを適用又は投与することを含む。
好ましい実施形態では、障害は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染、又はそのような感染症に関連する障害である。
好ましい実施形態においては、本発明は、障害を治療又は予防する方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチドを、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツを適用又は投与することを含み、前記必要とする対象が、好ましくは哺乳動物対象である。特に好ましい実施形態では、哺乳動物対象は、ヒト対象、特に、乳幼児、新生児、妊娠女性、授乳中の女性、高齢者、又は免疫不全のヒト対象である。
特に、そのような方法は、好ましくは以下の工程を含むことができる：
ａ）第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツを準備する工程；
ｂ）第１の態様の前記ＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツを組織又は生物に適用又は投与する工程；
ｃ）任意に、ＲＳＶに対する免疫グロブリン（ＩｇＧ）を投与する工程；
ｄ）任意に、更なる物質（アジュバント、補助物質、更なる抗原）を投与する工程。
更なる態様によれば、本発明はまた、ＲＳＶに由来する少なくとも１つのペプチド若しくはタンパク質、又はその断片若しくはバリアントを含む少なくとも１つのポリペプチドの発現のための方法を提供し、前記方法は、好ましくは以下の工程を含む：
ａ）第１の態様のＲＮＡ又は第２の態様の組成物を準備する工程；及び
ｂ）前記ＲＮＡ又は組成物を発現系（細胞）、組織、生物に適用又は投与する工程。
前記方法は、実験室、研究、診断、ペプチド又はタンパク質の商業的生産、及び／又は治療目的に適用することができる。前記方法は更に、特定の疾患の治療、特に感染症疾患、特にＲＳＶ感染症の治療において行うことができる。
同様に、別の態様によれば、本発明はまた、第１の態様の人工ＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット若しくはキットオブパーツの、好ましくは診断又は治療目的、例えば、コードされたＲＳＶ抗原性ペプチド又はタンパク質の発現のため、例えば、前記ＲＮＡ、前記ＲＮＡを含む組成物、前記ＲＮＡを含むワクチンを、例えば、無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞又は体細胞）、組織、又は生物に適用又は投与することによる使用を提供する。具体的な実施形態では、前記ＲＮＡ、前記ＲＮＡを含む組成物、前記ＲＮＡを含むワクチンを組織又は生物に適用又は投与した後に、例えば、誘導されたＲＳＶ Ｆ抗体、例えば、ＲＳＶ Ｆ特異的（モノクローナル）抗体を取得する工程が行われる。
前記使用は、（診断用）実験室、研究、診断、ペプチド、タンパク質、又はＲＳＶ抗体の商業的生産、及び／又は治療目的に適用することができる。前記使用は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで行うことができる。更に、前記使用は、特定の疾患の治療、特にＲＳＶ感染症又は関連障害の治療において行うことができる。
特に好ましい実施形態においては、本発明は、医薬として使用、治療又は予防における使用、好ましくはＲＳＶ感染又は関連障害の治療又は予防、又はワクチンとして使用のための第１の態様のＲＮＡ、第２の態様の組成物、第３の態様のポリペプチド、第４の態様の組成物、第５の態様のワクチン、又は第６の態様のキット又はキットオブパーツを提供する。
リスト及び表の簡単な説明
リスト１：好適なＲＳＶウイルス株
リスト２：好適なＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質のＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号
表１：好ましいＲＳＶ Ｆタンパク質抗原デザイン
表２：各アミノ酸の使用頻度が示されたヒトコドン使用表
表３Ａ：ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来する、ＲＳＶ Ｆをコードする好ましいコード配列（列Ａ〜Ｊ）
表３Ｂ：ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来する、ＲＳＶ Ｆをコードする好ましいコード配列（列Ａ〜Ｊ）
表４Ａ：ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来する、ＲＳＶ Ｆをコードする好ましいコード配列（列Ｋ〜Ｖ）
表４Ｂ：ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来する、ＲＳＶ Ｆをコードする好ましいコード配列（列Ｋ〜Ｖ）
表５Ａ：ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来する、ＲＳＶ Ｆをコードする好ましいｍＲＮＡ構築物（列Ａ〜Ｊ）
表５Ｂ：ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来する、ＲＳＶ Ｆをコードする好ましいｍＲＮＡ構築物（列Ａ〜Ｊ）
表６Ａ：ＨＲＳＶ（Ａ２）に由来する、ＲＳＶ Ｆをコードする好ましいｍＲＮＡ構築物（列Ｋ〜Ｖ）
表６Ｂ：ＨＲＳＶ（メンフィス−３７）に由来する、ＲＳＶ Ｆをコードする好ましいｍＲＮＡ構築物（列Ｋ〜Ｖ）
表７Ａ：組成物又はワクチンの好ましい更なるコード配列及びｍＲＮＡ構築物
表７Ｂ：ＲＮＡ構築物の好適な組合せ
表８：式（ＩＩＩ）に由来する代表的な脂質化合物
表９：本実施例で使用されるｍＲＮＡ構築物（実施例セクションを参照）
表１０：実施例２の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
表１１：実施例３の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
表１２：実施例４のＵＴＲの各種組合せのｍＲＮＡ構造（実施例セクションを参照）
表１３：実施例５の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
表１４：実施例６の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
表１５：実施例７の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
表１５：実施例７の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
表１６：実施例８に使用されるｍＲＮＡ構築物の概要（実施例セクションを参照）
表１７：実施例９の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
表１８：実施例１０の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
表１９：実施例１１に使用されるｍＲＮＡ構築物の概要（実施例セクションを参照）
表２０：実施例１２の動物群とワクチン接種スケジュール（実施例セクションを参照）
図１は、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、ｉ．ｍ．及びｉ．ｄ．ワクチン接種後のコットンラットの血清中に高いウイルス中和力価（ＶＮＴ）を誘導することを示す。プロタミン配合ｍＲＮＡによるワクチン接種は、弱い応答しか誘導しない。ワクチン接種スケジュールは、表１０を参照されたい。更なる詳細は、実施例２に示す。 図２は、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、ｉ．ｍ．及びｉ．ｄ．ワクチン接種後のコットンラットの肺のＲＳＶ感染を低減することを示す。ワクチン接種スケジュールは、表１０を参照されたい。更なる詳細は、実施例２に示す。 図３は、実施例２で説明したＲＳＶコットンラット接種試験の肺組織病理学的分析の結果を示す。ＬＮＰ配合ｍＲＮＡでワクチン接種された動物は、ホルマリン不活化ＲＳＶウイルスによるワクチン接種とは異なり、ウイルス接種後に肺組織病理／炎症の亢進を示さない。ワクチン接種スケジュールは、表１０を参照されたい。更なる詳細は、実施例２に示す。 図４は、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、及びＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、２回のｉ．ｍ．ワクチン接種後のコットンラットの血清中に高い（ウイルス中和力価）ＶＮＴを誘導することを示す。ＶＮＴの決定は、４８日目に行った。ワクチン接種スケジュールは、表１１を参照されたい。更なる詳細は、実施例３に記載する。 図５は、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、及びＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードするＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡが、コットンラットにおいてＲＳＶ−Ｆタンパク質に対する特異的な体液性免疫応答を誘導することを示す。実験は、実施例３に記載されるように行い、抗体の総ＩｇＧ力価は、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＲＳＶ−Ｆ（ＬＮＰに配合）及びＲＳＶ−Ｆ−ｄｅｌ（ＬＮＰに配合）ワクチンは、初回ウイルス接種後（２８日目）に、生ウイルスよりも高い力価のＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧを誘導する。図５ａ：４９日目に決定された抗体価；図５ｂ及び５ｃ：ＲＳＶ Ｆ−タンパク質（Ｆ、Ｆ−ｄｅｌ、及びＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードする１０μｇのｍＲＮＡ（図５ｂ）又は１００μｇのｍＲＮＡ（図５ｃ）を含む血清中の時間依存性ＩｇＧ力価。ワクチン接種スケジュールは、表１１を参照されたい。更なる詳細は、実施例３に示す。 図６は、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、及びＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、ｉ．ｍ．ワクチン接種後のコットンラットの肺のＲＳＶ感染を低減させることを示す。実験は、実施例３に記載されるように行った。ｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した動物群はいずれも、肺のウイルス力価に関し、ワクチン接種されたコットンラットの防御を示す検出レベルよりも低いウイルス力価を示した。ｍＲＮＡワクチンと比較して、ホルマリン不活化ウイルスに基づくワクチンは、肺のウイルス力価を防ぐことができなかった。ワクチン接種スケジュールは、表１１を参照されたい。更なる詳細は、実施例３に示す。 図７は、ＲＳＶ Ｆタンパク質（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、及びＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、ｉ．ｍ．ワクチン接種後のコットンラットの鼻のＲＳＶ力価を低下させることを示す。実験は、実施例３に記載されるように行った。ｍＲＮＡワクチンでワクチン接種された動物群はいずれも、ウイルス接種感染実験で鼻組織のウイルス力価を大きく低下させたことを示す。ｍＲＮＡワクチンと比較して、ホルマリン不活化ウイルスに基づくワクチンは、鼻のウイルス力価を低下させることはできなかった。ワクチン接種スケジュールは、表１１を参照されたい。更なる詳細は、実施例３に示す。 図８は、実施例３に記載されたＲＳＶコットンラット接種試験の肺組織病理学分析の結果を示す。ＬＮＰ配合ｍＲＮＡでワクチン接種された動物は、ホルマリン不活化ＲＳＶウイルスワクチンによるワクチン接種とは異なり、ウイルス接種後に肺組織病理／炎症の亢進を示さない。ワクチン接種スケジュールは、表１１を参照されたい。更なる詳細は、実施例３に示す。 図９は、本発明に係るＵＴＲの組合せが、インビトロでＲＳＶ Ｆ−タンパク質の発現を増大させることを示す。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、リポフェクタミン配合した各種ｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトした。これらはいずれも、融合前の安定化されたトランケートされたＲＳＶ−Ｆ（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードする同一コード配列を含むが、５’及び３’−ＵＴＲの異なる組合せを用いている（表１２を参照）。ＲＳＶ−Ｆ発現をフローサイトメトリーで分析した。値は、検出されたＲＳＶ−Ｆシグナルの％を示す。参照ｍＲＮＡ構築物（ＵＴＲの組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）の発現を１００％にして規格化した。注射用水（ＷＦＩ）を対照とした。Ｎ＝２。更なる詳細は、実施例４に示す。 図１０は、使用したｍＲＮＡが、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質をコードする構築物（図１０ａ：Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、図１０ｂ：Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５）は、細胞内ＲＳＶ Ｆタンパク質発現及び細胞表面の検出可能なタンパク質発現をもたらしたことを示す。更なる詳細は、表１６と実施例８に示す。 図１１は、各種ＲＳＶ Ｆタンパク質（Ｆ０、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）をコードするＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする試験したＬＮＰ配合ｍＲＮＡがいずれも、ＲＳＶ−Ｆタンパク質に対するコットンラットの体液性免疫応答を誘導する。抗体の総ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡで決定した。ワクチン接種スケジュールは、表１７を参照されたい。更なる詳細は、実施例９に示す。 図１２は、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ０、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）ｍＲＮＡワクチンがいずれも、高いウイルス中和抗体力価により示されるように、コットンラットにおけるＲＳＶ特異的機能性抗体の形成を誘導した。ワクチン接種スケジュールは、表１７を参照されたい。更なる詳細は、実施例９に示す。 図１３は、ＲＳＶコットンラット接種試験からの肺組織病理学的分析を示す。ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンを使用してワクチン接種した群の場合と同様に、ｍＲＮＡワクチン接種群はいずれも、肺病変の亢進を示さなかった。ワクチン接種スケジュールは、表１７を参照されたい。更なる詳細は、実施例９に示す。 図１４は、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットにおける肺のウイルス力価（図１４ａ）及び鼻のウイルス力価（図１４ｂ）の分析結果を示す。ワクチン接種スケジュールは、表１７を参照されたい。更なる詳細は、実施例９に示す。 図１５は、各種ＲＳＶ Ｆタンパク質（Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４）をコードする試験したＬＮＰ配合ｍＲＮＡ構築物がいずれも、コットンラットにおいてＲＳＶ−Ｆタンパク質に対する体液性免疫応答を誘導することを示す。抗体の総ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡで決定した。ワクチン接種スケジュールは、表１８を参照されたい。更なる詳細は、実施例１０に示す。 図１６は、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４）ｍＲＮＡワクチンがいずれも、高いウイルス中和抗体価によって示されるように、コットンラットにおいてＲＳＶ特異的機能性抗体の形成を誘導したことを示す。融合前安定化のためのＬＮＰ配合構築物は、Ｆ−ｄｅｌよりも高い又は同等の応答を誘導する。ワクチン接種スケジュールは、表１８を参照されたい。更なる詳細は、実施例１０に示す。 図１７は、ＲＳＶコットンラット接種試験の肺組織病理学的分析を示す。ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンを使用してワクチン接種した群の場合と同様に、ｍＲＮＡワクチン接種群はいずれも、肺病変の亢進を示さなかった。ワクチン接種スケジュールは、表１８を参照されたい。更なる詳細は、実施例１０に示す。 図１８は、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットにおける肺のウイルス力価（図１８ａ）及び鼻のウイルス力価（図１８ｂ）の分析結果を示す。ワクチン接種スケジュールは、表１８を参照されたい。更なる詳細は、実施例１０に示す。 図１９は、ＲＳＶマトリックスタンパク質Ｍ、リンタンパク質Ｐ、核タンパク質Ｎ、及びマトリックスタンパク質Ｍ２−１タンパク質をコードする使用したｍＲＮＡ構築物が、ウサギ網状赤血球溶解物システムを使用して検出可能なタンパク質発現をもたらしたことを示す。更なる詳細は、表１９と実施例１１に示す。 図２０は、マウスにおける免疫原性試験（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。体液性免疫応答は、図２０ａ：抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ及び図２０ｂ：抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ２ａに見ることができる。全ての群が体液性免疫応答を誘導した。一般に、ＩｇＧ２ａの力価は、ＩｇＧ１の力価よりも１０倍高く、Ｔｈ１応答が主であることを示す。ワクチン接種スケジュールは、表２０を参照されたい。更なる詳細は、実施例１２に示す。 図２１は、特定の抗原ＩｇＧが免疫化マウスの血清で検出されたことを示し、適用されたｍＲＮＡ構築物が特異的な体液性免疫応答を誘導するのに適していることを示す。ワクチン接種スケジュールは、表２０を参照されたい。更なる詳細は、実施例１２に示す。 図２２は、ＬＮＰ配合ｍＲＮＡワクチン（Ｆ、Ｍ＋Ｆ、Ｐ＋Ｆ、Ｎ＋Ｆ、Ｍ２−１＋Ｆ）がいずれも、高いウイルス中和抗体力価により示されるように、ＲＳＶ特異的機能性抗体の生成を誘導したことを示す。ワクチン接種スケジュールは、表２０を参照されたい。更なる詳細は、実施例１２に示す。 図２３は、ＲＳＶ Ｆ、ＲＳＶ Ｍ２−１、又はその両方を含むワクチンがいずれも、驚くべきことに、筋肉内免疫感作時に肺に組織常駐記憶Ｔ細胞（ＴＲＭ）応答を誘導したことを示す（図２３ａ）。脾細胞分析により、ＲＳＶ Ｆ、特にＲＳＶ Ｍ２−１による免疫感作により、ＩＦＮ−γとＴＮＦを分泌する抗原特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞が増加をもたらし、部位特異的応答に加えて全身Ｔ細胞応答の誘導を示すことが分かった（図２３ｂ及び図２３ｃ）。
以下において、本発明の様々な実施形態及び態様を示す特定の実施例例が示される。しかしながら、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。以下の調製物及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することを可能にするために与えられる。しかしながら、本発明は、本発明の一態様の例示のみが意図された例示的な実施形態によって範囲が限定されることはなく、機能的に同等である方法は本発明の範囲内である。実際に、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更は、前述の説明、添付の図面、及び以下の実施例から当業者に容易に明らかになろう。このような変更はいずれも、添付の特許請求の範囲に含まれる。
実施例１：インビトロ及びインビボ実験のためのＤＮＡ及びｍＲＮＡ構築物及び組成物の調製
本実施例は、本発明の人工ＲＮＡを得る方法、及び本発明の組成物又はワクチンを生成する方法を提供する。
１．１．ＤＮＡ及びｍＲＮＡ構築物の調製：
本実施例では、異なるＲＳＶ Ｆタンパク質（例えば、Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５など）をコードするＤＮＡ配列を調製し、その後のＲＮＡインビトロ転写反応に使用した。前記ＤＮＡ配列は、安定化のためにＧ／Ｃ最適化コード配列（例えば、「ｃｄｓ ｏｐｔ１」）を導入することにより野生型コードＤＮＡ配列を改変することによって調製した。ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、α−グロビン、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１、及びＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する３’−ＵＴＲ配列及びＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４Ｂ、及びＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’−ＵＴＲ配列を安定化させることと、更に、一続きのアデノシン（例えば、６４Ａ又はＡ１００）及びヒストンステムループ（ｈＳＬ）構造、並びに任意に、表９に記載される３０個の一続きのシトシン（例えば、Ｃ３０）を含むように、ｐＵＣ１９由来ベクターに配列を導入した。
得られたプラスミドＤＮＡ構築物は、当技術分野で知られる一般的プロトコルを使用して、細菌内で形質転換及び増殖させた。最終的に、プラスミドＤＮＡ構築物を抽出、精製し、後続のＲＮＡインビトロ転写に使用した（セクション１．２を参照）。
或いは、パラグラフ１にしたがって調製したＤＮＡプラスミドを、ＰＣＲベースの増幅用のＤＮＡテンプレートとして使用する。最終的に、生成されたＰＣＲ産物を精製し、後続のＲＮＡインビトロ転写に使用する（セクション１．３を参照）。
１．２．プラスミドＤＮＡテンプレートからのＲＮＡインビトロ転写：
パラグラフ１．１にしたがって調製したＤＮＡプラスミドを、ＥｃｏＲＩ又はＳａｐＩを使用して酵素的に線状化し、好適なバッファー条件下にて、ヌクレオチド混合物（ＡＴＰ／ＧＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ）とキャップアナログ（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ））の存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ依存性ＲＮＡインビトロ転写に使用した。得られたｍＲＮＡ構築物をＲＰ−ＨＰＬＣ（ＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）、ＣｕｒｅＶａｃ ＡＧ、チュービンゲン、独国；国際公開第２００８／０７７５９２号）を使用して精製し、インビトロ及びインビボ実験に使用した。臨床開発用のＲＮＡ（実施例６を参照）は、ＤＮＡ及びＲＮＡレベルで様々な品質管理手順を実行する、例えば、国際公開第２０１６／１８０４３０号にしたがう現行の適正製造基準の下で製造する。生成したＲＮＡ配列／構築物を表９に示し、コード化されたＦタンパク質及びそこに示される各ＵＴＲエレメントと共に示す。表９に示す情報に加えて、特定のｍＲＮＡ構築物の配列番号に関する更なる情報が、ＳＴ．２５配列表に与えられる＜２２３＞識別子の下に記載される情報からも得られる。
或いは、好適なバッファー条件下にて、修飾ヌクレオチド混合物（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、Ｎ（１）−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）又はシュードウリジン（Ψ））とキャップアナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ）の存在下でＲＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ依存性ＲＮＡインビトロ転写に、ＥｃｏＲＩ又はＳａｐＩで線状化したＤＮＡを使用する。得られたｍ１Ψ又はΨ修飾ｍＲＮＡは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）、ＣｕｒｅＶａｃ、チュービンゲン、独国；国際公開第２００８／０７７５９２号）を使用して精製し、更なる実験に用いる。
一部のｍＲＮＡ構築物は、キャップアナログの非存在下でインビトロ転写する。キャップ構造（ｃａｐ１）は、当技術分野で一般に知られているキャッピング酵素を使用して酵素的に付加される。即ち、インビトロ転写されたｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを含むｍ７Ｇキャッピングキットを使用してキャッピングし、ｃａｐ１でキャッピングされたｍＲＮＡを得る。Ｃａｐ１−キャッピングｍＲＮＡは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）、ＣｕｒｅＶａｃ、チュービンゲン、独国；国際公開第２００８／０７７５９２号）を使用して精製し、更なる実験に用いる。
１．３．ＰＣＲ増幅ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡインビトロ転写：
パラグラフ１．１にしたがって調製した精製済みＰＣＲ増幅ＤＮＡテンプレートを、好適なバッファー条件下にて、ヌクレオチド混合物（ＡＴＰ／ＧＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ）とキャップアナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）の存在下でＤＮＡ依存性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写する。或いは、ＰＣＲ増幅したＤＮＡは、好適なバッファー条件下にて、修飾ヌクレオチド混合物（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、Ｎ（１）−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ））とキャップアナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）の存在下でＤＮＡ依存性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写する。一部のｍＲＮＡ構築物は、キャップ類似体の非存在下でインビトロ転写し、キャップ構造（ｃａｐ１）は、当技術分野で一般に知られているキャッピング酵素、例えば、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを含むｍ７Ｇキャッピングキットを使用して酵素的に付加される。得られたｍＲＮＡは、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）、ＣｕｒｅＶａｃ、チュービンゲン、独国；国際公開第２００８／０７７５９２号）を使用して精製し、インビトロ及びインビボ実験に用いる。
表９：本実施例で用いられるｍＲＮＡ構築物
Figure 2021519595
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１．４．ＬＮＰ配合ｍＲＮＡ組成物の調製：
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、カチオン性脂質、及びポリマーコンジュゲート脂質（ＰＥＧ−脂質）は、国際公開第２０１５／１９９９５２号、国際公開第２０１７／００４１４３号、及び国際公開第２０１７／０７５５３１号（これらの開示内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載される一般的な手順に本質的にしたがって調製及び試験した。ＬＮＰ配合ｍＲＮＡは、イオン化可能なアミノ脂質（カチオン性脂質）、リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を使用して調製した。簡単に説明すれば、式ＩＩＩ−３のカチオン性脂質化合物、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び式ＩＶａのＰＥＧ脂質を、約５０：１０：３８．５：１．５又は４７．４：１０：４０．９：１．７のモル比（％）でエタノールに可溶化した。式ＩＩＩ−３のカチオン性脂質化合物及び式ＩＶａのＰＥＧ−脂質化合物を含むＬＮＰは、ｍＲＮＡの全脂質に対する比が０．０３〜０．０４ｗ／ｗで調製した。ｍＲＮＡは、ｐＨ４の１０ｍＭ〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液中に、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。シリンジポンプを使用して、エタノール脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液と約１：５〜１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で混合し、総流量は１５ｍｌ／ｍｉｎ超とした。次いで、エタノールを除去し、透析により外部緩衝液を、スクロースを含むＰＢＳ緩衝液で置換した。最後に、脂質ナノ粒子を０．２ｕｍポアの滅菌フィルタで濾過し、ＬＮＰ配合ｍＲＮＡ組成物を約１ｍｇ／ｍｌの総ｍＲＮＡに調整した。脂質ナノ粒子の粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用した準弾性光散乱によって測定すると、６０〜９０ｎｍであった。本明細書に言及される他のカチオン性脂質化合物について、製剤化プロセスは本質的に同様である。得られたＬＮＰ配合ｍＲＮＡ組成物（１ｍｇ／ｍｌ（全ｍＲＮＡ））を、生理食塩水を使用して所望の目的濃度に希釈してから、インビボで適用した。
１．５．プロタミン複合体化ｍＲＮＡ組成物の調製：
ｍＲＮＡ構築物は、インビボ免疫感作実験での使用に先立ち、プロタミンと複合体を形成させた。ｍＲＮＡ製剤は、５０％遊離ｍＲＮＡと、２：１の重量比でプロタミンと複合化した５０％ｍＲＮＡとの混合物からなった。まず、ｍＲＮＡを、プロタミン−Ｒｉｎｇｅｒ乳酸溶液をｍＲＮＡに添加することによりプロタミンと複合体化させた。１０分間のインキュベーションの後、安定な複合体が生成されたら、遊離ｍＲＮＡを添加し、最終濃度をＲｉｎｇｅｒラクタート溶液で調整した。
実施例２：ＲＳＶ−ＦをコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡを用いたコットンラットのワクチン接種及びＲＳＶコットンラット接種試験
本実施例は、ＲＳＶ−ＦをコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、コットンラットにおいて強力且つ機能的な免疫応答を誘導することを示す。
ＲＳＶワクチンの開発において、コットンラットは、特に接種感染において、認められている動物モデルである。ホルマリン不活化ＲＳＶウイルスワクチン製剤を投与したコットンラットは、ＲＳＶ感染に対する応答として、肺の病理亢進を示す。これは、亢進した疾患現象の点で、ワクチン接種の安全性評価を可能にする。
ＲＳＶ特異的免疫応答を最適化するために、融合前安定化ＲＳＶ Ｆタンパク質Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖをコードするｍＲＮＡワクチンを、実施例１にしたがって調製し、ＬＮＰ（実施例１．４を参照）又はプロタミン（実施例１．５を参照）のいずれかと配合して、表１０に示すように、０日目と２８日目に異なる用量のＲＮＡを筋肉内（ｉ．ｍ．）又は皮内（ｉ．ｄ．）に適用した。対照動物は、１０５ｐｆｕ生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内に０日目に１回ワクチン接種する、又はホルマリン不活化ＲＳＶウイルス（ＦＩ−ＲＳＶ）を筋肉内に、０日目と２８日目の２回ワクチン接種した。別の対照動物には緩衝液のみを投与した。本実施例では、ＵＴＲの組合せＨＳＤ１７Ｂ４／ＡＬＢ７を使用し、本明細書では、これを「ｉ−４」と呼ぶ。
表１０：実施例２の動物群及びワクチン接種スケジュール
Figure 2021519595
ウイルス中和力価の決定：
４９日目に血清を採取し、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用してＲＳＶウイルス中和力価（ＶＮＴ）を測定した。希釈した血清サンプルをＲＳＶ／Ａ２と共に室温で１時間インキュベートし、２４ウェルプレートのコンフルーエントなＨＥｐ−２の単層上に２連で接種しました。５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに０．７５％メチルセルロース培地をオーバーレイした。４日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞を固定、染色した。対応する相互中和抗体力価（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒｓ）は、ウイルス対照の６０％減少エンドポイントで決定した。
コットンラット接種試験：
ワクチン接種した動物に、６３日目に、１００μＬ中の１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内接種した。１つの対照群は、未処理且つ未感染の状態とした（群１０）。６８日目に全動物を屠殺し、鼻組織及び肺を採取した。
接種したコットンラットの肺におけるＲＳＶ力価：
動物の肺を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、ＲＳＶ／Ａ２力価をプラークアッセイによって１つの肺葉で定量した。肺ホモジネートを遠心分離により清澄化し、ＥＭＥＭで希釈した。コンフルーエントなＨＥｐ−２単層を、２４ウェルプレート中、希釈ホモジネートで２連で感染させた。５％ＣＯインキュベータ中、３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに、０．７５％メチルセルロース培地をオーバーレイした。４日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットで１時間染色した後、リンスして風乾した。プラークをカウントし、ウイルス力価を組織１グラム当たりのプラーク形成単位として表した。ウイルス力価は、所定時点における群内の全動物の幾何平均±標準誤差として計算した。
接種したコットンラットの肺組織病理：
動物の肺を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、１つの肺葉を組織病理学的に分析した。肺を解剖し、１０％中性緩衝ホルマリンで通常の容量まで膨潤させた後、同一の固定溶液に浸漬した。固定後、肺をパラフィンに包埋し、切片状にし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。肺の炎症の４つのパラメーターを評価した。即ち、細気管支周囲炎（細気管支周囲の炎症性細胞浸潤）、血管周囲炎（小血管周囲の炎症性細胞浸潤）、間質性肺炎（炎症性細胞浸潤と肺胞壁の肥厚）、及び肺胞炎（肺胞空間内の細胞）。スライドは、０〜４の重篤度スケールで盲目的にスコア化した。その後、スコアを０〜１００％の組織病理学的スケールに変換した。
結果：
図１から分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）ｍＲＮＡワクチンは、高いウイルス中和抗体価（群１〜４）により示されるように、コットンラットにおいてＲＳＶ特異的機能抗体の形成を誘導する。プロタミン配合ｍＲＮＡによるワクチン接種は、弱い応答しか誘導しない。
図２から分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）ｍＲＮＡワクチンは、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの肺ウイルス力価を低下させ、肺のＲＳＶ感染を制限する（群１〜４）。ＬＮＰワクチンに配合したｍＲＮＡでワクチン接種し動物群はいずれも、実施したウイルス滴定の検出レベルを下回るウイルス力価を示し、このことは、ウイルス肺力価に関し、ワクチン接種されたコットンラットの防御を示している。対照的に、プロタミン配合ｍＲＮＡワクチン（ｉ．ｍ．投与）とホルマリン不活化ウイルスワクチンは、緩衝液対照群と比較して、肺ウイルス力価を最小限に低下させるに留まった。
図３から分かるように、ＲＳＶコットンラット接種試験の肺組織病理学的分析は、各種動物群の様々な病理学スコアを示す。組織病理学から、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンを使用してワクチン接種した群の場合と同様に、ｍＲＮＡワクチン接種群はいずれも肺病変の亢進を示さなかったと結論付けることができる。細気管支周囲炎、血管周囲炎、間質性肺炎、及び肺胞炎の平均病理学スコアは、ホルマリン不活化ＲＳＶ接種群（群８）と比較して、ｍＲＮＡによるワクチン接種をした全て群（群１〜６）の場合に、遥かに低くなっている。
実施例３：ＲＳＶ−ＦをコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡを用いたコットンラットのワクチン接種及びＲＳＶコットンラット接種試験
本実施例は、各種ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、ＵＴＲ組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７を有するｍＲＮＡ構築物（ｉ−２）の場合に、コットンラットにおいて強力且つ機能的な免疫応答を誘導することを示す。
この実験では、３種の異なるＲＳＶ−Ｆバリアント、即ち、完全長ＲＳＶ Ｆ０、トランケートされたＲＳＶ Ｆ−ｄｅｌ、及び融合前の安定化されトランケートされたＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１をコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰを比較した。ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは実施例１にしたがって調製した。コットンラットは、０日目と２８日目にｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンによる２回の筋肉内ワクチンを投与した。各用量は、１０μｇ又は１００μｇのｍＲＮＡ−ＬＮＰを含んだ。対照動物には、０日目に１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内に１回、又は０日目と２８日目にホルマリン不活化ＲＳＶウイルス（ＦＩ ＲＳＶ）を筋肉内に２回投与した。別の対照動物には緩衝液のみを投与した（表１１を参照）。
表１１：実施例３の動物群及びワクチン接種スケジュール
Figure 2021519595
ＥＬＩＳＡによる抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体の決定：
抗ＲＳＶ Ｆ抗体力価を決定するために、２８日目、４９日目、６３日目に血液サンプルを採取した。ＥＬＩＳＡプレートは、組換えヒトＲＳＶ融合糖タンパク質（Ｃ末端のポリヒスチジンタグと融合したヒトＲＳＶ融合糖タンパク質（５２９）の細胞外ドメイン、凍結乾燥粉末として提供されるバキュロウイルス昆虫細胞で発現）でコーティングする。コーティングしたプレートは、所定の血清希釈液を使用してインキュベートする。Ｆタンパク質への特異的抗体の結合は、ＡＢＴＳ基質とストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を組み合わせたビオチン化アイソタイプ特異的抗マウス抗体を使用して検出する。
ウイルス中和力価の決定：
４９日目に血清を採取し、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用してＲＳＶウイルス中和力価（ＶＮＴ）を測定した。希釈した血清サンプルをＲＳＶ／Ａ２と室温で１時間インキュベートし、２４ウェルプレート中のコンフルーエントなＨＥｐ−２単層に２連で接種した。５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに、０．７５％メチルセルロース培地をオーバーレイした。４日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞を固定、染色した。対応する相互中和抗体力価は、ウイルス対照の６０％減少エンドポイントで決定した。
コットンラット接種試験：
ワクチン接種した動物に、６３日目に、１００μＬ中の１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内接種した。１つの対照群は、未処理且つ未感染の状態とした。６８日目に全動物を屠殺し、鼻組織及び肺を採取した。
接種したコットンラットの肺におけるＲＳＶ力価：
動物の肺を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、ＲＳＶ／Ａ２力価を、前記したようにプラークアッセイによって１つの肺葉で定量した。
接種したコットンラットの鼻組織におけるＲＳＶ力価：
動物の鼻組織を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取した。鼻ホモジネートを肺ホモジネートと同様に遠心分離により清澄化し、ＥＭＥＭで希釈した。コンフルーエントなＨＥｐ−２単層に、２４ウェルプレート中、希釈ホモジネートで２連で感染させた。５％ＣＯインキュベータ中、３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに、０．７５％メチルセルロース培地をオーバーレイした。４日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットで１時間染色した後、リンスして風乾した。プラークをカウントし、ウイルス力価を組織１グラム当たりのプラーク形成単位として表した。ウイルス力価は、所定時点における群内の全動物の幾何平均±標準誤差として計算した。
接種したコットンラットの肺組織病理：
動物の肺を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、１つの肺葉を、前記したように組織病理学的に分析した。
結果：
図４から分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）ｍＲＮＡワクチンはいずれも、高いウイルス中和抗体価によって示されるように、コットンラットにおいてＲＳＶ特異的機能抗体の生成を誘導した。
図５ａ、図５ｂ、及び図５ｃは、ＲＳＶ Ｆ−タンパク質（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、及びＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、コットンラットにおいて、ＲＳＶ−Ｆタンパク質に対する体液性免疫応答を誘導することを示す。抗体の総ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡで決定した。図５ａ：４９日目に決定された抗体価。図５ｂ及び図５ｃ：ＲＳＶ Ｆ−タンパク質（Ｆ、Ｆ−ｄｅｌ、及びＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードする１０μｇのｍＲＮＡ（図５ｂ）又は１００μｇのｍＲＮＡ（図５ｃ）を含む血清中の時間依存性ＩｇＧ力価。いずれの用量、即ち、１０μｇ及び１００μｇの場合にも、Ｆ０及びＦ−ｄｅｌワクチンは、生ウイルスによるワクチン接種と比較して、初回ワクチン接種後（２８日目）既に、ＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧをより高い力価で誘導する。追加ワクチン接種後、試験したＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）ｍＲＮＡワクチンはいずれも、ＥＬＩＳＡで測定される液性免疫応答を誘導し、これは、対照ワクチン接種の応答よりも顕著である。
図６から分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）ｍＲＮＡワクチンは、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの肺ウイルス力価を低下させ、肺のＲＳＶ感染を制限した。ＬＮＰワクチンに配合されたｍＲＮＡでワクチン接種された動物群はいずれも、実施したウイルス滴定の検出レベルを下回るウイルス力価を示した。これらの結果は、肺のウイルス力価の点で、ワクチン接種されたコットンラットの防御を示す。対照的に、ホルマリン不活化ウイルスワクチン（ＦＩ ＲＳＶ）は、緩衝液対照群と比較して、肺ウイルス力価を最小限に抑えるに留まった。
図７から分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）ｍＲＮＡワクチンは、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの鼻組織のウイルス力価を大きく低下させ、鼻のＲＳＶ感染を低減した。ｍＲＮＡワクチンと比較して、ホルマリン不活化ウイルス（ＦＩ ＲＳＶ）に基づくワクチンは、鼻のウイルス力価を低下させることはできなかった。
図８から分かるように、ＲＳＶコットンラット接種試験の肺組織病理学的分析は、各種動物群の様々な病理学スコアを明らかにする。組織病理から、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンを使用してワクチン接種した群の場合と同様に、ｍＲＮＡワクチン接種群のいずれも肺病変の亢進を示さなかったと結論付けることができる。細気管支周囲炎、血管周囲炎、間質性肺炎、及び肺胞炎の平均病理スコアは、ホルマリン不活化ＲＳＶの群と比較して、ｍＲＮＡを接種した全ての群で遥かに低くなっている。
ｍＲＮＡベースのワクチンの効率を更に改善するために、ｍＲＮＡの翻訳効率を向上させ得るＵＴＲの異なる組合せを有するいくつかの代替ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ構築物を設計した。これらのｍＲＮＡ構築物は、以下の実施例において理解できるように試験した。
実施例４：ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ構築物のインビトロ発現スクリーニング
本実施例は、本発明に係るＵＴＲの組合せが、例えば、実施例３（ＵＴＲの組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７（ｉ−２））で用いた参照ｍＲＮＡ構築物（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７ＵＴＲを有する）と比較して、前記ｍＲＮＡ構築物の発現性能を強力に改善することを示す。
ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡの発現性能を更に改善するために、スクリーニング実験を行って、本発明に係る有利なＵＴＲの組合せを同定した。様々なＵＴＲの組合せを含むＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ構築物のタンパク質発現性能を決定するために、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミンを配合した各種ｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。これらの構築物はいずれも、融合前の安定化されトランケートされたＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１をコードする同一コード配列を含むが、使用する５’−及び３’−ＵＴＲは異なる（表１２を参照）。ＲＳＶ−Ｆ発現をトランスフェクションの２４時間後にフローサイトメトリーで分析した。
表１２：実施例４で用いられる各種ＵＴＲ組合せを有するｍＲＮＡ構築物の概要
Figure 2021519595
トランスフェクションとフローサイトメトリー分析の詳細：
２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに、２０００００細胞／ウェル（２０００００細胞／２ｍｌ）の密度で播種しました。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で、各ＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と１／１．５（ｗ／ｖ）の比で２０分間複合体化した。次いで、リポ複合体化したｍＲＮＡを細胞に添加して、合計容量５００ｕＬで１ウェル当たり２μｇのＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション開始後の４時間で、トランスフェクション溶液を２０００ｕＬ／ウェルで完全培地と交換した。ＦＡＣＳ分析を行う前に、細胞を更に３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
トランスフェクションの２４時間後、目的抗原の発現を、標準的な手順を使用してＦＡＣＳ分析によって定量した。簡単に説明すれば、細胞を剥離し（４０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５ １５０ｍＭのＮａＣｌ、Ｈ２０中１ｍＭのＥＤＴＡ；ＲＴで５分間）、ＰＢＳで洗浄し、ＲＳＶ−Ｆに対するマウス抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ：ＭＡＢ８２６２）と蛍光標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ：Ｆ５２６２）で表面を染色した。細胞を、１００ｕＬのＰＦＥＡ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０１％ＮａＮ３）に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを用いて分析した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色を、Ａｑｕａ蛍光反応性染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。
結果を、１００％のレベルに設定したＲＰＬ３２／ＡＬＢ７のＵＴＲの組合せ（配列番号１６１２）を含む実施例３の参照構築物からの発現と比較した。分析結果を、図９に示す。
結果
図９から分かるように、本発明に係るＵＴＲの組合せを含むｍＲＮＡ構築物の発現性能は、参照ＵＴＲ組合せ（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７；ｉ−２）を含む構築物と比較して、大幅に向上した。
実施例５：ＲＳＶ−ＦをコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡによるコットンラットのワクチン接種及びコットンラット接種試験
実施例４のＵＴＲスクリーニングの結果に基づき、ｍＲＮＡ発現を最適化するためのＵＴＲ組合せを有するｍＲＮＡ構築物を、ワクチン接種実験で使用する。
この実験では、本発明に係るＵＴＲの各種組合せを有するＲＳＶ−Ｆ（Ｆ、Ｆ−ｄｅｌ、又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）をコードするｍＲＮＡワクチンを比較する。ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは実施例１にしたがって調製する。コットンラットには、０日目と２８日目に、ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンによる２回の筋肉内ワクチン接種を施す。各用量は、２μｇ又は１０μｇのｍＲＮＡ−ＬＮＰを含む。対照動物には、０日目に、鼻腔内に１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルス又は筋肉内にホルマリン不活化ＲＳＶウイルスを１回ワクチン接種する。別の対照動物には、緩衝液のみを投与する（表１３を参照）。
表１３：実施例５の動物群及びワクチン接種スケジュール
Figure 2021519595
ＥＬＩＳＡ又はＰＲＮＴを使用した抗ＲＳＶ免疫応答の決定
抗ＲＳＶ免疫応答の誘導は、前記したように決定される。
コットンラット接種試験
ワクチン接種した動物に、６３日目に、１００μＬ中の１０ｅｘｐ５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内接種する。１つの対照群は、未処理且つ未感染の状態にする。６８日目に全動物を屠殺し、鼻組織及び肺を採取する。
接種したコットンラットの肺におけるＲＳＶ力価
動物の肺を６８日目（即ち、１０ｅｘｐ５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、ＲＳＶ／Ａ２力価を、前記したようにプラークアッセイによって１つの肺葉で定量した。更に、ＲＳＶウイルスゲノムのコピー数と（ＲＳＶ ＮＳ−１遺伝子のコピー数を測定することによって）サイトカインｍＲＮＡレベルを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。
接種したコットンラットの鼻組織におけるＲＳＶ力価
動物の鼻組織を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取する。ウイルス力価を、前記したように定量する。更に、ＲＳＶウイルスゲノムのコピー数（ＲＳＶ ＮＳ−１遺伝子のコピー数を測定することによって）とサイトカインｍＲＮＡレベルを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。
接種したコットンラットの肺組織病理
動物の肺を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、１つの肺葉を、前記したように組織病理学的に分析する。
実施例６：ＲＳＶ−ＦをコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡを用いたコットンラットのワクチン接種及びコットンラット接種試験
この実験では、ＲＳＶ−ＦをコードするｍＲＮＡワクチン（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３（及び／又は更には、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、＿ｍｕｔ４、＿ｍｕｔ５、＿ｍｕｔ６、＿ｍｕｔ７、＿ｍｕｔ８及び／又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、＿ｍｕｔ４、＿ｍｕｔ５、＿ｍｕｔ６、＿ｍｕｔ７、＿ｍｕｔ８）を比較する。ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは、実施例１にしたがって調製する。コットンラットは、０日目と２８日目に、ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンによる２回の筋肉内ワクチン接種を施す。各用量は、２μｇ又は１０μｇのｍＲＮＡを含む。対照動物には、０日目に、鼻腔内に１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルス又はホルマリン不活化ＲＳＶウイルスを筋肉内に１回ワクチン接種する。別の対照動物には、緩衝液のみを投与する（表１４を参照）。
表１４：実施例６の動物群
Figure 2021519595
ＥＬＩＳＡ又はＰＲＮＴを使用した抗ＲＳＶ免疫応答の決定
抗ＲＳＶ免疫応答の誘導は、前記したように決定する。
コットンラット接種試験
ワクチン接種した動物に、６３日目に、１００ｕＬ中の１０ｅｘｐ５の生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内接種する。１つの対照群は、未処理且つ未感染の状態にする。６８日目に全動物を屠殺し、鼻組織及び肺を採取する。
接種したコットンラットの肺におけるＲＳＶ力価
動物の肺を６８日目（即ち、１０ｅｘｐ５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、ＲＳＶ／Ａ２力価を、前記したようにプラークアッセイによって１つの肺葉で定量する。更に、ＲＳＶウイルスゲノムのコピー数（ＲＳＶ ＮＳ−１遺伝子のコピー数を測定することによって）とサイトカインｍＲＮＡレベルを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。
接種したコットンラットの鼻組織におけるＲＳＶ力価
動物の鼻組織を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取する。ウイルス力価を、前記したように定量する。更に、ＲＳＶウイルスゲノムのコピー数（ＲＳＶ ＮＳ−１遺伝子のコピー数を測定することによって）とサイトカインｍＲＮＡレベルを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。
接種したコットンラットの肺組織病理
動物の肺を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、１つの肺葉を、前記したように組織病理学的に分析する。
実施例７：ＲＳＶ−Ｆ及び更なるＲＳＶ抗原をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡによるコットンラットのワクチン接種、並びにコットンラット接種試験
ＲＳＶ特異的免疫応答の幅を広げ最適化するために、特にＴ細胞依存性免疫応答を増大させるために、各種ＲＳＶタンパク質（ＲＳＶ Ｆ（Ｆ０、Ｆ、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１ Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、又はＦ＿ＤＳＣａｖ１ｍｕｔ０〜ｍｕｔ８、又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１ｍｕｔ０〜ｍｕｔ８）をコードするｍＲＮＡワクチンを、実施例１にしたがって調製する。単一又は混合ワクチンの効果を評価するために、これらのワクチンを、表９に示すように、単独又は組み合わせて投与する。コットンラットに、０日目と２８日目に、各抗原において、２μｇ又は１０μｇのｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンで２回筋肉内（ｉ．ｍ．）ワクチン接種を施す。別の群には、ホルマリン不活化ＲＳＶ及び／又は生ＲＳＶ／Ａ２で筋肉内（ｉ．ｍ．）に免疫感作して、それらの免疫原性をｍＲＮＡワクチンと比較する。更なる対照動物には、緩衝液のみを投与する（表１５を参照）。ＲＳＶ特異的免疫応答は、Ｅｌｉｓａ又は細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって決定する。
表１５：実施例７の動物群
Figure 2021519595
実施例７のワクチン接種実験では、少なくとも２つの異なる配列最適化ＤＮＡテンプレート（そのそれぞれは、実施例１に記載されるように生成される）を使用するＰＣＴ出願国際公開第２０１７／１０９１３４号に開示される手順にしたがって、多価ｍＲＮＡ組成物／ワクチンを生成する（例えば、群６〜１０）。簡単に説明すると、ＤＮＡ構築物混合物（それぞれが各種コード配列及びＴ７プロモーターを含む）を、ｍＲＮＡ構築物の混合物を生成するための同時ＲＮＡインビトロ転写用テンプレートとして使用する。続いて、得られたＲＮＡ混合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用する共精製に使用する。その後、得られた精製ＲＮＡ混合物をＬＮＰに配合し（セクション１．４で説明）、多価のＬＮＰ配合ＲＮＡ組成物／ワクチンを生成する。
ＥＬＩＳＡ ＰＲＮＴを使用した抗ＲＳＶ免疫応答の決定：
抗ＲＳＶ免疫応答の誘導は、その検出に適した組換えタンパク質又はペプチドを用いて、前記したように決定する。
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）：
ワクチン接種したマウスと対照マウスの脾細胞を、標準的なプロトコルにしたがって単離する。簡単に説明すれば、単離した脾臓をセルストレーナーで粉砕し、ＰＢＳ／１％ＦＢＳで洗浄した後、赤血球を溶解する。十分な洗浄工程の後、ＰＢＳ／１％ＦＢＳ脾細胞を９６ウェルプレートに播種する（２×１０６細胞／ウェル）。翌日、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇＴＭ／ＧｏｌｇｉＳｔｏｐＴＭ（それぞれ、ブレフェルジンＡとモネンシンを含むタンパク質輸送阻害剤；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の混合物の存在下で、好適なＲＳＶペプチド又は無関係の対照ペプチドと２．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３７℃にて６時間、細胞を刺激する。刺激後、細胞を洗浄し、製造元の指示書にしたがってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞内サイトカインを染色する。以下の抗体：ＣＤ８−ＰＥＣｙ７（１：２００）、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（１：２００）、ＩＬ２−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（１：１００）、ＴＮＦα−ＰＥ（１：１００）、ＩＦＮγ−ＡＰＣ（１：１００）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４−ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖ４５０（１：２００）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を染色に使用し、１：１００に希釈したＦｃγ−ブロックと共にインキュベートする。Ａｑｕａ Ｄｙｅを用いて、生細胞と死細胞を区別する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、細胞を回収する。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて分析する。
コットンラット接種試験
ワクチン接種した動物に、６３日目に、１００ｕＬ中の１０ｅｘｐ５の生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内接種する。１つの対照群は、未処理且つ未感染の状態にする。６８日目に全動物を屠殺し、鼻組織及び肺を採取する。
コットンラット接種試験：
ワクチン接種した動物に、６３日目に、１００ｕＬ中の１０ｅｘｐ５の生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内接種する。１つの対照群は、未処理且つ未感染の状態にする。６８日目に全動物を屠殺し、鼻組織及び肺を採取する。血清を４９日目に採取し、ＲＳＶウイルス中和力価（ＶＮＴ）を、実施例２に記載されているプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を用いて測定する。
接種したコットンラットの肺におけるＲＳＶ力価：
動物の肺を６８日目（即ち、１０ｅｘｐ５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、ＲＳＶ／Ａ２力価を、前記したようにプラークアッセイによって１つの肺葉で定量する。更に、ＲＳＶウイルスゲノムのコピー数（ＲＳＶ ＮＳ−１遺伝子のコピー数を測定することによって）とサイトカインｍＲＮＡレベルを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。
接種したコットンラットの鼻組織におけるＲＳＶ力価：
動物の鼻組織を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取する。ウイルス力価を、前記したように定量する。更に、ＲＳＶウイルスゲノムのコピー数（ＲＳＶ ＮＳ−１遺伝子のコピー数を測定することによって）とサイトカインｍＲＮＡレベルを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。
接種したコットンラットの肺組織病理
動物の肺を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取し、１つの肺葉を、前記したように組織病理学的に分析する。
実施例８：ＨｅＬａ細胞における各種ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現及びＦＡＣＳによる分析
ｍＲＮＡ構築物のインビトロでのタンパク質発現を決定するために、ＨｅＬａ細胞を、ＲＳＶ Ｆ抗原をコードするｍＲＮＡで一過性にトランスフェクトし、好適な抗Ｆタンパク質抗体（マウスにて生成）をＲＳＶ融合するために染色し、ＦＩＴＣ結合抗マウス二次抗体で対比染色した（ＳｉｇｍａのＦ５２６２）。ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、細胞培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で、４００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。ＨｅＬａ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇの未配合ｍＲＮＡをトランスフェクトした。実施例１にしたがって調製され、表１６に列挙されるｍＲＮＡ構築物は、陰性対照（注射用水）を含む実験（表９も参照されたい）で使用した。トランスフェクションの２４時間後、ＨｅＬａ細胞を好適な抗ＲＳＶ−Ｆ抗体（マウスにて生成、１：５００）及び抗マウスＦＩＴＣ標識二次抗体（１：５００）で染色し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用するＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩにおけるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して、蛍光ＦＩＴＣシグナルの定量分析を行った。細胞を、細胞内又は細胞表面で染色した。結果を、図１０ａ及び図１０ｂに示す。これらは、２つの異なる独立した実験を表す。
表１６：実施例８で用いられるｍＲＮＡ構築物の概要
Figure 2021519595
結果：
結果は、使用したｍＲＮＡ構築物が検出可能な細胞内ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現、及び細胞表面での検出可能なタンパク質の発現をもたらしたことを示す。Ｃ末端（Ｆ−ｄｅｌ）を欠失させたＲＳＶ Ｆ構築物（例えば、Ｒ６９４０、Ｒ５４５３、Ｒ６７７５、Ｒ６７７４、Ｒ６７７３、Ｒ７４５５、Ｒ７４５７、Ｒ７４５９など）は、Ｆ完全長構築物と比較して、細胞表面タンパク質発現の増加を示す。Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０（Ｒ７４５５）をコードする構築物は、最も高い発現を示す。この結果は、Ｆタンパク質をコードする本発明ｍＲＮＡ（Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５）は細胞内で翻訳され、細胞表面に存在する。これは、ｍＲＮＡベースのＲＳＶワクチンの前提条件である。
実施例９：ＲＳＶ−ＦをコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡを用いたコットンラットのワクチン接種及びＲＳＶコットンラット接種試験
本実施例は、各種融合前の安定化ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする本発明に係るＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、コットンラットにおいて強力で機能的且つ防御的な免疫応答を誘導することを示す。
この実験は、融合前の安定化された各種ＲＳＶ−Ｆバリアント（ｍｕｔ１、ｍｕｔ２、ｍｕｔ３）をコードするｍＲＮＡ−ＬＮＰを、完全長Ｆ又はトランケートされたＦ（Ｆ−ｄｅｌ）と比較した。ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは、実施例１にしたがって調製した。コットンラットには、０日目及び２８日目に、ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンによる２回の筋肉内ワクチン接種を施した。各用量は、１００μｇのｍＲＮＡ−ＬＮＰを含有した。対照動物には、０日目に、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルス又はＵＶ不活化ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを１回、又は０日目及び２８日目に、ホルマリン不活化ＲＳＶウイルス（ＦＩ ＲＳＶ）を筋肉内に２回接種した。別の対照動物には、緩衝液のみを投与した（表１７を参照）。
表１７：実施例９の動物群及びワクチン接種スケジュール
Figure 2021519595
ＥＬＩＳＡによる抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体の決定：
抗ＲＳＶ Ｆ抗体力価を決定するために、０日目、２８日目、４９日目、及び６３日目に血液サンプルを回収した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＲＳＶ／Ａ２感染ＨＥｐ−２細胞又はメタノール／アセトン固定ＲＳＶ／Ｂ感染ＨＥｐ−２細胞から抽出した精製Ｆタンパク質でコーティングした。コーティングしたプレートを、所定の血清希釈液を使用してインキュベートした。Ｆタンパク質への特異的抗体の結合は、ＴＭＢ基質を用いたストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と組み合わせたアイソタイプ特異的抗コットンラット抗体を使用して検出した。
ウイルス中和力価の決定：
０日目、２８日目、４９日目、６３日目に血清を採取し、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用してＲＳＶウイルス中和力価（ＶＮＴ）を測定した。希釈した血清サンプルをＲＳＶ／Ａ２又はＲＳＶ／Ｂ（２５〜５０ＰＦＵ）と室温で１時間インキュベートし、２４ウェルプレートのコンフルーエントなＨＥｐ−２単層に２連で接種した。５％ＣＯ２インキュベータにて３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに、０．７５％メチルセルロース培地をオーバーレイした。４日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞を固定、染色した。対応する相互中和抗体力価は、ウイルス対照の６０％減少エンドポイントで決定した。
コットンラット接種試験：
ワクチン接種した動物に、６３日目に、１００ｕＬ中の１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内接種する。１つの対照群は、未処理且つ未感染の状態にする。６８日目に全動物を屠殺し、鼻組織及び肺を採取する。
接種したコットンラットの鼻組織におけるＲＳＶ力価：
動物の肺及び鼻組織を６８日目（即ち、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスによる鼻腔内接種の５日後）に採取した。鼻ホモジネートを肺ホモジネートと同様に遠心分離により清澄化し、ＥＭＥＭで希釈した。コンフルーエントなＨＥｐ−２単層に、２４ウェルプレート中、希釈ホモジネートで２連で感染させた。５％ＣＯインキュベータ中、３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに、０．７５％メチルセルロース培地をオーバーレイした。４日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットで１時間染色した後、リンスして風乾した。プラークをカウントし、ウイルス力価を組織１グラム当たりのプラーク形成単位として表した。
肺組織病理：
肺を解剖し、１０％中性緩衝ホルマリンで通常の容量まで膨潤させた後、同一の固定溶液に浸漬した。固定後、肺をパラフィンに包埋し、切片状にし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。肺の炎症の４つのパラメーターを評価した。即ち、細気管支周囲炎（細気管支周囲の炎症性細胞浸潤）、血管周囲炎（小血管周囲の炎症性細胞浸潤）、間質性肺炎（炎症性細胞浸潤と肺胞壁の肥厚）、及び肺胞炎（肺胞空間内の細胞）。スライドは、０〜４の重篤度スケールで盲目的にスコア化した。その後、スコアを０〜１００％の組織病理学的スケールに変換した。
結果：
図１１は、本発明に係る各種ＲＳＶ Ｆタンパク質（Ｆ０、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）をコードする試験したＬＮＰ配合ｍＲＮＡ構築物はいずれも、ＲＳＶ−Ｆタンパク質に対するコットンラットの体液性免疫応答を誘導する。抗体の総ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡで決定した。
トランケートしたＦ（Ｆ−ｄｅｌ）（Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）をコードするｍＲＮＡ構築物は、ｄ２８の時点で、完全長Ｆ配列を有する構築物よりも高く且つ速い応答を誘導し、それ以降の時点では、有意差は検出できない。安定化された構築物（Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）は、野生型構築物（Ｆ０及びＦ−ｄｅｌ）よりも低いＥＬＩＳＡ力価を示す。レベルは、それ以降の時点では、有意差を示さない。
１００μｇの用量では、安定化されトランケートしたＦタンパク質（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）をコードする構築物は、初回ワクチン接種後（２８日目）に既に、生ウイルスによるワクチン接種と比較して、より高いＲＳＶ−Ｆ特異的ＩｇＧ力価を誘導する。追加ワクチン接種後、試験したＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡワクチンはいずれも、ＥＬＩＳＡで測定される液性免疫応答を誘導し、これは、対照ワクチン接種の応答よりも顕著である。
図１２から分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ０、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）ｍＲＮＡワクチンがいずれも、高いウイルス中和抗体価によって示されるように、コットンラットにおいてＲＳＶ特異的機能的抗体の生成を誘導したことを示した。ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆのトランケートされた構築物（Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）は、Ｆ完全長構築物よりも高く且つ速い応答を誘導した。本発明に係る融合前安定化のための構築物（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）は、Ｆ０、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１よりも高い応答を誘導する。
図１３から分かるように、ＲＳＶコットンラット接種試験の肺組織病理学的分析は、各種動物群の様々な病理学スコアを明らかにする。組織病理から、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンを使用してワクチン接種した群の場合と同様に、ｍＲＮＡワクチン接種群のいずれも肺病変の亢進を示さなかったと結論付けることができる。細気管支周囲炎の平均病理スコアは、ホルマリン不活化ＲＳＶの群と比較して、ｍＲＮＡを接種した全ての群で遥かに低くなっている。ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆのトランケートされた構築物（Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）は、一般に、Ｆ完全長構築物よりも低い病理スコアを示した。本発明に係る融合前安定化のための構築物（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）は、Ｆ０、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１よりも良好な応答（低い病理学スコア）をもたらした。
図１４ａから分かるように、この実験においては、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−ＦｍＲＮＡワクチンがいずれも、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの肺ウイルス力価を低下させ、肺のＲＳＶ感染を制限した。ＬＮＰワクチンに配合されたｍＲＮＡでワクチン接種された動物群はいずれも、実施したウイルス滴定の検出レベルを下回るウイルス力価を示した。これらの結果は、肺のウイルス力価の点で、ワクチン接種されたコットンラットの防御を示す。対照的に、ホルマリン不活化ウイルスワクチン（ＦＩ ＲＳＶ）とＵＶ不活化ＲＳＶ／Ａ２ウイルス対照は、緩衝液対照群と比較して、肺ウイルス力価を最小限に抑えるに留まった。
図１４ｂから分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−ＦｍＲＮＡワクチンは、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの鼻組織のウイルス力価を大きく低下させ、鼻のＲＳＶ感染を低減した。ｍＲＮＡワクチンと比較して、ホルマリン不活化ウイルス（ＦＩ ＲＳＶ）に基づくワクチンとＵＶ不活化ＲＳＶ／Ａ２ウイルス対照は、鼻のウイルス力価を低下させることはできなかった。鼻の完全な防御は、本発明に係る融合前安定化によってのみ達成された（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）。
結論として、結果は、ＲＳＶ−Ｆトランケートタンパク質（Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２）をコードするＬＮＰ配合ＲＮＡ構築物が、一般に、完全長Ｆタンパク質をコードするＲＮＡ構築物よりも免疫原性が高いことを示す。Ｄｓ−Ｃａｖ１変異のみを特徴とする構築物（Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１及びＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１）は、本発明に係る更に安定化されたＦタンパク質をコードする構築物（Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２
）と比較してｍＲＮＡベースのワクチンとして最適ではない。
ｍＲＮＡベースのワクチンの効率を更に向上させるために、いくつかの代替ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ構築物を、有益なトランケートされたＦ−ｄｅｌタンパク質と組み合わせて、融合前コンフォメーションを安定化させる更なる変異を有するように設計した。これらのｍＲＮＡ構築物は、以下の実施例に記載するように試験した。
実施例１０：ＲＳＶ−ＦをコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡを用いたコットンラットのワクチン接種及びＲＳＶコットンラット接種試験
本実施例は、各種融合前の安定化ＲＳＶ−Ｆ抗原をコードする本発明に係るＬＮＰ配合ｍＲＮＡが、コットンラットにおいて強力で機能的且つ防御的な免疫応答を誘導することを示す。
ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは、実施例１にしたがって調製した。コットンラットには、０日目又は０日目及び２８日目に、ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンによる１回又は２回の筋肉内ワクチン接種を施した。各用量は、１００μｇのｍＲＮＡ−ＬＮＰを含有した。対照動物には、２８日目に、１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルス又はホルマリン不活化ＲＳＶウイルス（ＦＩ ＲＳＶ）を筋肉内に１回接種した。別の対照動物には、緩衝液のみを投与した（表１８を参照）。
表１８：実施例１０の動物群及びワクチン接種スケジュール
Figure 2021519595
ＥＬＩＳＡ及びウイルス中和力価による抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体の決定
０日目、２８日目、４９日目、及び６３日目に血液サンプルを採取し、前記したように（実施例９を参照）、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用して測定される抗ＲＳＶ Ｆ抗体及びＲＳＶウイルス中和力価（ＶＮＴ）を決定した。
コットンラット接種試験：
ワクチン接種した動物に、６３日目に、１００ｕＬ中の１０５ｐｆｕの生ＲＳＶ／Ａ２ウイルスを鼻腔内接種した。１つの対照群は、未処理且つ未感染の状態にした。６８日目に全動物を屠殺し、鼻組織及び肺を採取した。接種したコットンラットの鼻組織におけるＲＳＶ力価及び肺組織病理を、上に記載したように分析する（実施例９を参照）。
結果：
図１５は、本発明に係る各種ＲＳＶ Ｆタンパク質（Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４）をコードする試験したＬＮＰ配合ｍＲＮＡ構築物がいずれも、コットンラットにおいてＲＳＶ−Ｆタンパク質に対する体液性免疫応答を誘導することを示す。抗体の総ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡで決定した。安定化されたＦタンパク質（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４）をコードするＲＮＡ構築物は、初期においては、トランケートされた野生型Ｆタンパク質Ｆ−ｄｅｌをコードする構築物よりも低いＥＬＩＳＡ力価を示した。この傾向は、ＥＬＩＳＡ用により高い血清希釈液を使用することにより、それ以降の時点でも検出可能である（データは示さず）。ＩｇＧ応答は、２回目の免疫感作によって著しくブーストすることができる。
図１６から分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ（Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４）ｍＲＮＡワクチンがいずれも、高いウイルス中和抗体力価によって示されるように、コットンラットにおいてＲＳＶ特異的機能性抗体の生成を誘導した。本発明に係る融合前安定化のためのＬＮＰ配合構築物（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４）は、Ｆ−ｄｅｌよりも高い又は同等の応答を誘導する。融合前安定化タンパク質Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５をコードするＲＮＡ構築物Ｒ７４５７は、最も高いＶＮＴを誘導する（前の実験（実施例９、Ｒ６７７３）において、最も良好な融合前安定化構築物によって誘導された最も良好な結果と同等）。
肺組織病理学分析は、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンを使用してワクチン接種された群の場合（図１７ａ（細気管支炎及び血管周囲炎の場合）及び図１７ｂ（間質性肺炎及び肺胞炎の場合）を参照）と同様に、ｍＲＮＡワクチン接種群はいずれも、肺病変の亢進を示さなかった。本発明に係る融合前安定化のための構築物（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４）は、Ｆ−ｄｅｌよりも良好な応答（より低い病理学スコア）をもたらした。２回のワクチン接種を施された動物は、１回のワクチン接種のみを施した動物と比較して、より低い病理スコアを示した。
図１８ａから分かるように、この実験において、試験したＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡワクチンはいずれも、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの肺ウイルス力価を低下させ、肺のＲＳＶ感染を制限した。これは、ワクチン接種を１回のみ施した群にも当てはまる。結果は、ウイルス性肺力価の点で、ワクチン接種されたコットンラットの防御を示す。対照的に、ホルマリン不活化ウイルスワクチン（ＦＩ ＲＳＶ）は、緩衝液対照群と比較して、肺ウイルス力価を最小限に抑えるに留まった。
図１８ｂから分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡワクチンは、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの鼻組織のウイルス力価を大きく低下させ、鼻のＲＳＶ感染を低減させた。ｍＲＮＡワクチンと比較して、ホルマリン不活化ウイルス（ＦＩ ＲＳＶ）に基づくワクチンは、鼻のウイルス力価を低下させることができなかった。鼻の完全な防御は、２回のワクチン接種を受けたいくつかの群でのみ達成された（例えば、Ｒ７４５７（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ＿ｍｕｔ４）及びＲ７４５９（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ＿ｍｕｔ５））。
結論として、結果は、融合前に安定化されたＲＳＶ−Ｆトランケートタンパク質（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４）をコードするＬＮＰ配合ＲＮＡ構築物が、一般に、より高い機能性力価をもたらし、野生型トランケートＦタンパク質Ｆ＿ｄｅｌをコードするＲＮＡ構築物と比較して、感染に対するより顕著な防御を達成したことを示す。最も良い結果が、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５（Ｒ６７７３、Ｒ７４５７）をコードするＲＮＡ構築物によって達成された。
実施例１１：ウサギ網状赤血球溶解物システムを使用した各種ＲＳＶ Ｔ細胞抗原の発現
本発明の第２の態様に係るｍＲＮＡ構築物（ＲＳＶマトリックスタンパク質Ｍ、リンタンパク質Ｐ、核タンパク質Ｎ、及びマトリックスタンパク質Ｍ２−１タンパク質をコードするｍＲＮＡ構築物）のインビトロタンパク質発現を決定するために、未配合ＲＮＡ（実施例１にしたがって調製）を、製造元のプロトコルにしたがって、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍの成分と混合した。溶解物は、タンパク質合成に必要な細胞成分（ｔＲＮＡ、リボソーム、アミノ酸、開始、伸長、終止因子）を含有する。ポジティブコントロールとして、Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＫｉｔのルシフェラーゼＲＮＡを使用した。翻訳結果は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅとウエスタンブロット分析（ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン抗体（１：２０００））で分析した。
表１９：実施例１１で用いられるｍＲＮＡ構築物の概要
Figure 2021519595
結果：
結果（図１９を参照）は、使用したｍＲＮＡ構築物が検出可能なタンパク質発現をもたらしたことを示す。これは、ｍＲＮＡベースのＲＳＶワクチンの前提条件である（ゲル上のＲＳＶ Ｐ及びＭ２−１のサイズシフトは、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄら、２０１８又はＨａｒｄｙ及びＷｅｒｔｚ、２０００ ＰＭＩＤｓ：２９４８９８９３及び１０８４６０６８に記載されるようにリン酸化によるものと考えられる）。
実施例１２：各種ＲＳＶ Ｔ細胞抗原を単独及びＲＳＶ Ｆ（Ｆ−ｄｅｌ）と共にコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡによるマウスのワクチン接種
本実施例は、本発明の第２の態様に係る各種ＲＳＶ Ｔ細胞抗原（ＲＳＶ Ｍ、Ｐ、Ｎ、及びＭ２−１）をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡを、単独で、又はトランケートＲＳＶ ＦをコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡ（Ｆ−ｄｅｌ）と組み合わせて分析する。ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは実施例１にしたがって調製した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目と２８日目に、ｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンによる２回の筋肉内ワクチン接種を施した。各用量は、５μｇ、２．５μｇ、又は２．５μｇ＋２．５μｇのｍＲＮＡ−ＬＮＰを含有した（各種抗原をコードするｍＲＮＡを投与する群では、ＬＮＰを別に配合し、投与前に混合した）。対照動物には緩衝液のみを投与した（表２０を参照）。体液性並びに細胞性免疫応答及び中和抗体を、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＲＮＴ、及びＩＣＳにより分析した。
表２０：実施例１２の動物群及びワクチン接種スケジュール
Figure 2021519595
ＥＬＩＳＡによる抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体の決定：
抗ＲＳＶ Ｆ抗体力価を決定するために、０日目、１４日目、２８日目、４９日目に血液サンプルを採取した。ＥＬＩＳＡプレートを、組換えヒトＲＳＶ融合糖タンパク質（ｈＲＳＶ Ｆタンパク質（Ａ２；Ｈｉｓ−ｔａｇ；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；Ｃａｔ：１１０４９−Ｖ０８Ｂ））でコーティングした。コーティングしたプレートを、所定の血清希釈液を使用してインキュベートした。Ｆタンパク質への特異的抗体の結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）及びＡｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（参照番号Ａ３６００６））と組み合わせたアイソタイプ特異的抗マウスラット抗体を用いて検出した。
ＦＡＣＳで測定された抗原特異的な体液性抗体応答の検出
Ｈｅｌａ細胞を、リポフェクタミンを使用して２μｇのＲＳＶ ｍＲＮＡ構築物（Ｒ７５９５、Ｒ７５９６、Ｒ７５９７、Ｒ７５９８）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後に細胞を回収し、１ウェルあたり１×１０５で９６ウェルプレートに播種した。細胞を、ワクチン接種したマウスの対応する血清（２８日目及び４９日目の血清、１：５０に希釈）とインキュベートし、続いて、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体染色を行った。細胞は、ＤＩＶＡソフトウェアを使用してＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで取得し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。結果を、図２１ａ（２８日目）及び図２１ｂ（４９日目）に示す。読み取りには、（生細胞中の）ＦＩＴＣ陽性細胞のパーセンテージを使用した。
ウイルス中和力価の決定：
４９日目に血清を採取し、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用して、ＲＳＶウイルス中和力価（ＶＮＴ）を測定した。希釈した血清サンプルを、ＲＳＶ／Ａ２（２５〜５０ＰＦＵ）と共に室温で１時間インキュベートし、２４ウェルプレートのコンフルーエントなＨＥｐ−２単層に２連で接種した。５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに、０．７５％メチルセルロース培地をオーバーレイした。４日間のインキュベーション後、オーバーレイを除去し、細胞を固定、染色した。対応する相互中和抗体力価は、ウイルス対照の６０％減少エンドポイントで決定した。
ＦＡＣＳを使用したＩＣＳによるマウスの細胞性免疫応答の決定
ワクチン接種したマウス及び対照マウスからの脾細胞及び肺細胞は、標準的なプロトコルにしたがって単離した。簡単に説明すれば、単離された脾臓をセルストレーナーで粉砕し、ＰＢＳ（１％ＦＣＳ）で洗浄した。遠心分離後、細胞ペレットを残りの上清で再懸濁し、赤血球溶解バッファーで処理し、ＰＢＳ（１％ＦＣＳ）で繰り返し洗浄した。最後に、脾細胞をＦＣＳ／１０％ＤＭＳＯに再懸濁し、クライオバイアルに移し、−８０℃で保存した。ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ；２ｍＭグルタミン；１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を使用して肺を灌流し、採取した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ；２ｍＭグルタミン；１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に４℃で保存し、製造元の指示にしたがって、肺細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＬｕｎｇ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔマウスを用いて単離した。ＩＣＳの場合、丸底プレートに２×１０６細胞（脾細胞又は肺細胞）を２連で播種し、ＲＳＶ Ｍ２−１特異的（ＶＹＮＴＶＩＳＹＩ、ＳＹＩＧＳＩＮＮＩ、ＳＹＩＥＳＮＲＫＮ、ＫＳＩＤＴＬＳＥＩ）、ＲＳＶ Ｆ特異的（ＦＹＱＳＴＣＳＡＶ、ＴＹＭＬＴＮＳＥＬ、ＫＹＫＮＡＶＴＥＬ、ＫＩＭＴＳＫＴＤＶ）、ＲＳＦ Ｍ特異的（ＫＨＴＡＴＲＦＡＩ、ＡＱＭＰＳＫＦＴＩ、ＫＹＩＫＰＱＳＱＦ、ＴＹＬＲＳＩＳＶＲ）、ＲＳＶ Ｐ特異的（ＳＰＩＴＳＮＳＴＩ、ＳＹＥＥＩＮＤＱＴ）、又はＲＳＶ Ｎ特異的（ＳＹＫＫＭＬＫＥＭ、ＦＹＨＩＬＮＮＰＫ、ＫＹＴＩＱＲＳＴＧ、ＧＹＨＶＫＡＮＧＶ）ペプチドで刺激した。Ｇｏｌｇｉブロック（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ １／１０００）及び細胞内サイトカイン蓄積のためのインキュベーションの後、細胞を、Ａｑｕａ染料を使用して生死染色に付した。次いで、細胞を、脾細胞用の抗体α−ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｈ７（１／１００）、α−ＣＤ４−ＢＤ−Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖ４５０（１／２００）、α−Ｔｈｙ１．２−ＦＩＴＣ（１／３００）、及びα−ＣＤ１０７ａＰＥ−Ｃｙ７（１／１００）及び肺細胞用のα−ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｈ７（１／１００）、α−ＣＤ４−ＢＤ−Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖ４５０（１／２００）、α−Ｔｈｙ１．２−ＦＩＴＣ（１／３００）、α−ＣＤ６９−ＰＥ（１／１００）、及びα−ＣＤ１０３−ＰＥ−Ｃｙ７（１／６０）を用いて表面染色した。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで処理した後、肺細胞を、細胞内でα−ＩＦＮｇ−ＡＰＣ（１／１００）で染色し、脾細胞を更にα−ＴＮＦα−ＰＥ（１／１００）で染色した。最後に、ＤＩＶＡソフトウェアを使用してＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。
結果：
マウスにおける免疫原性試験の結果、例えば、体液性免疫応答について、図２０に見ることができる（図２０ａ：抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ、図２０ｂ：抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ２ａ）。一般に、いずれの群も、Ｆ−ｄｅｌ単独群とＦ−ｄｅｌ＋Ｔ細胞抗原群との間に有意差なしに体液性免疫応答を誘導した。ＲＳＶ Ｆ−ｄｅｌをコードするｍＲＮＡワクチンへのＴ細胞抗原Ｍ、Ｐ、Ｎ、及びＭ２−１の追加は、ＲＳＶ Ｆに対する免疫応答に影響も妨害もしなかった。これらの知見は、Ｔ細胞抗原の共発現が、ＲＳＶ Ｆによって誘導された抗体反応に影響しないことを示す。免疫応答は、２回目の免疫感作によってブーストすることができた（４９日目の応答を参照）。一般に、ＩｇＧ２ａの力価は、ＩｇＧ１の力価よりも１０倍高く、Ｔｈ１が主であることを示している。Ｔｈ２バイアス応答が動物モデルで呼吸器疾患（ＥＲＤ）の亢進に関連付けられているので、Ｔｈ１バイアス免疫応答は、潜在的なＲＳＶワクチンの重要な前提条件であると考えられる。
図２１ａ及び図２１ｂに示すように、免疫感作したマウスの血清中に特異的抗原ＩｇＧが検出され、このことは、適用されたｍＲＮＡ構築物が特異的な体液性免疫応答を誘導するのに適することを示している。更に、結果は、Ｎ及びＭ２−１の抗原特異的抗体応答の誘導が、２８日目に既に検出できることを示すが、一方で、Ｍ及びＰ免疫感作の場合には、追加のワクチン接種が必要である。ＲＳＶ Ｆ共免疫感作後の抗原特異的抗体応答の低下は、免疫量の違いによる可能性がある（５μｇ対２．５μｇ）。
図２２から分かるように、ＬＮＰ配合ｍＲＮＡワクチン（Ｆ、Ｍ＋Ｆ、Ｐ＋Ｆ、Ｎ＋Ｆ、Ｍ２−１＋Ｆ）はいずれも、高いウイルス中和抗体価によって示されるように、ＲＳＶ特異的機能性抗体の生成をマウスに誘導した。ＲＳＶ／Ａ２に対する血清中和抗体力価アッセイでは、免疫感作群間に有意差は認められなかった。
図２３（図２３ａ 肺ＩＣＳ ＣＤ８、図２３ｂ 脾臓ＩＣＳ ＣＤ８、図２３ｃ 脾臓ＩＣＳ ＣＤ４）から分わかるように、ＲＳＶ Ｆ、ＲＳＶ Ｍ２−１、又はその両方を含むワクチンはいずれも、驚くべきことに、Ｆ又は特にＭ２−１に特異的なＣＤ８＋ＴＲＭ細胞の増加が観察できたことから、筋肉内免疫時に、肺における組織常在性記憶Ｔ細胞（ＴＲＭ）応答を誘導した。肺のＴＲＭ細胞（ＣＤ６９＋及びＣＤ１０３＋）は、ＲＳＶ感染を防ぐために提案されているので、肺でのＴＲＭ細胞応答の誘導は、潜在的なＲＳＶワクチンにとって好ましい可能性がある。脾細胞分析により、ＲＳＶ Ｆ、特にＲＳＶ Ｍ２−１による免疫感作が、ＩＦＮγ及びＴＮＦを分泌する抗原特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増加をもたらすことが明らかとなり、このことは、部位特異的応答に加えて、全身性Ｔ細胞応答の誘導を示す。
結論として、結果は、ＲＳＶ Ｍ２−１が、ＲＳＶ Ｆによって誘導される抗体応答に影響を与えることなく、最も有望なＴ細胞免疫応答を誘導することを示している。したがって、ＲＳＶ Ｍ２−１と共にＲＳＶ ＦをコードするｍＲＮＡを含むワクチンは、ＲＳＶ感染に対する防御効果を高める可能性がある。
実施例１３：ＲＳＶ ｍＲＮＡワクチン組成物の臨床開発：
ＲＳＶ ｍＲＮＡワクチン組成物の安全性と有効性を実証するために、臨床試験（フェーズＩ）が開始される。臨床開発では、ＧＭＰ条件下（例えば、国際公開第２０１６／１８０４３０号に記載される手順を使用して）生成したＲＮＡが使用される。
臨床試験では、健康なヒトボランティアのコホートに、好ましいＵＴＲの組合せを含むそれぞれのＬＮＰ配合ワクチン組成物を筋肉内注射する。本発明に係るワクチン組成物の安全性プロファイルを評価するために、投与後に対象をモニターする（バイタルシグナル、ワクチン接種部位の耐容性評価、血液学的分析）。
免疫感作の有効性は、ワクチン接種した対象からの血清中のウイルス中和力価（ＶＮＴ）の測定によって分析される。血液サンプルは、ベースラインとして０日目と、ワクチン接種が完了後に採取する。血清を、ウイルス中和抗体について分析する。
各種実施形態においては、第１の態様の少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び本明細書に記載される少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡは、同一のＲＳＶ（例えば、リスト１から選択される任意のウイルス）に由来する。
その文脈においては、一般式（Ｘ１）に由来する脂質、又はその薬学的に許容される塩を好適に使用することができる。
Figure 2021519595
 式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なっており、それぞれ１〜９個の炭素からなる直鎖又は分岐したアルキル、２〜１１個の炭素からなるアルケニル又はアルキニル、Ｌ１とＬ２は同一又は異なっており、それぞれ５〜１８個の炭素からなる直鎖のアルキレン又はアルケニレンである、又はＮと複素環を形成している、Ｘ１は結合、又は−ＣＯ−Ｏ−であり、それによって−Ｌ２−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２が形成され、Ｘ２はＳ又はＯ、Ｌ３は結合又は直鎖又は分岐した１〜６個の炭素からなるアルキレン、又はＮと複素環を形成している、Ｒ３は１〜６個の炭素からなる直鎖又は分岐したアルキレン、Ｒ４とＲ５は同一又は異なっており、各水素又は直鎖又は分岐した１〜６個の炭素からなるアルキルである。
この文脈においては、一般式（Ｘ２）に由来する脂質、又はその薬学的に許容される塩である。
Figure 2021519595
 式中、
Ｘは、直鎖又は分岐したアルキレン又はアルケニレン、単環式、二環式、又は三環式のアレーン又はヘテロアレーンであり；
Ｙは、結合、エテン、又は非置換又は置換芳香族又はヘテロ芳香族環であり；
Ｚは、Ｓ又は０であり；
Ｌは、炭素数１〜６の直鎖又は分岐したアルキレンであり；
Ｒ３及びＲ４は、独立して、炭素数１〜６の直鎖又は分岐したアルキルであり；
Ｒ１及びＲ２は、独立して、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニルであり；
ｒは、０〜６であり；
ｍ、ｎ、ｐ、及びｑは、独立して、１〜１８であり；
ｎ＝ｑ、ｍ＝ｐ、Ｒ１＝Ｒ２のとき、ＸとＹは異なり；
Ｘ＝Ｙ、ｎ＝ｑ、ｍ＝ｐのとき、Ｒ１とＲ２は異なり；
Ｘ＝Ｙ、ｎ＝ｑ、Ｒ１＝Ｒ２のとき、ｍとｐは異なり；
Ｘ＝Ｙ、ｍ＝ｐ、Ｒ１＝Ｒ２のとき、ｎとｑは異なる。
好ましい実施形態においては、式（Ｘ２）に由来する脂質を使用することができ、式中、Ｘは、結合、直鎖又は分岐したアルキレン、アルケニレン、又は単環式、二環式、又は三環式アレーン又はヘテロアレーンであり；Ｙは、単環式、二環式、又は三環式のアレーン又はヘテロアレーンであり；Ｚは、Ｓ又はＯであり；Ｌは、炭素数１〜６の直鎖又は分岐したアルキレンであり；Ｒ３とＲ４は、独立して、炭素数１〜６の直鎖又は分岐したアルキルであり；Ｒ１とＲ２は、独立して、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐したアルキル又はアルケニルであり；ｒは、０〜６であり；ｍ、ｎ、ｐ、及びｑは、独立して、１〜１８であり；又はその薬学的に許容される塩を好適に使用することができる。
第２の態様の特に好ましい実施形態においては、好適な脂質は、式（ＩＩＩ）に係るカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ、若しくは立体異性体であり得る。
Figure 2021519595
 式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｌ １ 、Ｌ ２ 、Ｇ １ 、Ｇ ２ 、及びＧ ３ は、以下の通りである。
実施例７：ＲＳＶ−Ｆ及び更なるＲＳＶ抗原をコードするＬＮＰ配合ｍＲＮＡによるコットンラットのワクチン接種、並びにコットンラット接種試験
ＲＳＶ特異的免疫応答の幅を広げ最適化するために、特にＴ細胞依存性免疫応答を増大させるために、各種ＲＳＶタンパク質（ＲＳＶ Ｆ（Ｆ０、Ｆ、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１ Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、又はＦ＿ＤＳＣａｖ１ｍｕｔ０〜ｍｕｔ８、又はＦ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１ｍｕｔ０〜ｍｕｔ８）をコードするｍＲＮＡワクチンを、実施例１にしたがって調製する。単一又は混合ワクチンの効果を評価するために、これらのワクチンを、表９に示すように、単独又は組み合わせて投与する。コットンラットに、０日目と２８日目に、各抗原において、２μｇ又は１０μｇのｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンで２回筋肉内（ｉ．ｍ．）ワクチン接種を施す。別の群には、ホルマリン不活化ＲＳＶ及び／又は生ＲＳＶ／Ａ２で筋肉内（ｉ．ｍ．）に免疫感作して、それらの免疫原性をｍＲＮＡワクチンと比較する。更なる対照動物には、緩衝液のみを投与する（表１５を参照）。ＲＳＶ特異的免疫応答は、ＥＬＩＳＡ又は細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって決定する。
図１８から分かるように、この実験において、試験したＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡワクチンはいずれも、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの肺ウイルス力価を低下させ、肺のＲＳＶ感染を制限した。これは、ワクチン接種を１回のみ施した群にも当てはまる。結果は、ウイルス性肺力価の点で、ワクチン接種されたコットンラットの防御を示す。対照的に、ホルマリン不活化ウイルスワクチン（ＦＩ ＲＳＶ）は、緩衝液対照群と比較して、肺ウイルス力価を最小限に抑えるに留まった。
図１８から分かるように、ＬＮＰ配合ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡワクチンは、ＲＳＶウイルスを接種したコットンラットの鼻組織のウイルス力価を大きく低下させ、鼻のＲＳＶ感染を低減させた。ｍＲＮＡワクチンと比較して、ホルマリン不活化ウイルス（ＦＩ ＲＳＶ）に基づくワクチンは、鼻のウイルス力価を低下させることができなかった。鼻の完全な防御は、２回のワクチン接種を受けたいくつかの群でのみ達成された（例えば、Ｒ７４５７（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ＿ｍｕｔ４）及びＲ７４５９（Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ＿ｍｕｔ５））。

Claims (68)

  1. ａ）少なくとも１つの異種５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び／又は少なくとも１つの異種３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）と；
    ｂ）前記３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲに機能可能に連結され、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド若しくはタンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードする少なくとも１つのコード配列とを含むことを特徴とする人工ＲＮＡ。
  2. 前記少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲが、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、アルファ−グロビン、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１、及びＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲ、又はこれらの遺伝子のいずれかのホモログ、断片、又はバリアントに由来する核酸配列を含む請求項１に記載の人工ＲＮＡ。
  3. 前記少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲが、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４Ｂ、及びＵＢＱＬＮ２から選択される遺伝子の５’−ＵＴＲ、又はこれらの遺伝子のいずれかのホモログ、断片、又はバリアントに由来する核酸配列を含む請求項１から２のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  4. ａ−１．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ａ−２．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ａ−３．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ａ−４．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ａ−５．ＭＰ６８遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｂ−１．ＵＢＱＬＮ２遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｂ−２．ＡＳＡＨ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｂ−３．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｂ−４．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｂ−５．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｃ−１．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｃ−２．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｃ−３．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｃ−４．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｃ−５．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｄ−１．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｄ−２．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｄ−３．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｄ−４．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｄ−５．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｅ−１．ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｅ−２．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｅ−３．ＭＰ６８遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｅ−４．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｅ−５．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｅ−６．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｆ−１．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｆ−２．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｆ−３．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｆ−４．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｆ−５．ＭＰ６８遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｇ−１．ＭＰ６８遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｇ−２．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｇ−３．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｇ−４．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｇ−５．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｈ−１．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｈ−２．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｈ−３．ＲＰＬ３１遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｈ−４．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｈ−５．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｉ−１．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＲＰＳ９遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｉ−２．ＲＰＬ３２遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの５’−ＵＴＲ、及びＡＬＢ７遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ；又は
    ｉ−３．アルファグロビン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくはバリアントに由来する少なくとも１つの３’−ＵＴＲ、
    を含む請求項１から３のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  5. ａ−１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）、ａ−４（ＮＤＵＦＡ４／ＰＳＭＢ３）、ｃ−１（ＮＤＵＦＡ４／ＲＰＳ９）、ｅ−４（ＮＯＳＩＰ／ＲＰＳ９）、ｇ−２（ＮＤＵＦＡ４／ＣＡＳＰ１）、ｉ−２（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）、又はｉ−３（アルファ−グロビン）、好ましくはａ−１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３）に係るＵＴＲエレメントを含む請求項４に記載の人工ＲＮＡ。
  6. − ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号１又は２と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＡＳＡＨ１遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号３又は４と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＡＴＰ５Ａ１遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号５又は６と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＭＰ６８遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号７又は８と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＮＤＵＦＡ４遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号９又は１０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＮＯＳＩＰ遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号１１又は１２と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＲＰＬ３１遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号１３又は１４と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＲＰＬ３２遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号２１又は２２と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号１５又は１６と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号１７又は１８と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＵＢＱＬＮ２遺伝子に由来する前記５’−ＵＴＲが、配列番号１９又は２０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＰＳＭＢ３遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲが、配列番号２３又は２４と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＣＡＳＰ１遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲが、配列番号２５又は２６と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＣＯＸ６Ｂ１遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲが、配列番号２７又は２８と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＧＮＡＳ遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲが、配列番号２９又は３０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＮＤＵＦＡ１遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲが、配列番号３１又は３２と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＲＰＳ９遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲが、配列番号３３又は３４と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − ＡＬＢ７遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲが、配列番号３５又は３６と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる；
    − アルファ−グロビン遺伝子に由来する前記３’−ＵＴＲが、配列番号３７又は３８と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む又はからなる、
    請求項１から５のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  7. ＲＳＶ Ｆタンパク質に由来する前記少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質が、完全長Ｆタンパク質（Ｆ０）又はＣ末端が欠失したＦタンパク質（Ｆ−ｄｅｌ）、又はその断片若しくはバリアントである請求項１から６のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  8. 前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、融合前コンフォメーションで抗原を安定化するように設計される請求項１から７のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  9. 前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、ＤＳＣａｖ１変異（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、及びＶ２０７Ｌ）又はその断片若しくはバリアントを含む請求項１から８のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  10. 前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、１本のポリペプチド鎖に２つのサブユニットＦ２及びＦ１を含み、Ｆ２及びＦ１が、リンカーエレメント、好ましくはＧＳリンカーを介して接続され、安定したＦ２−リンカー−Ｆ１タンパク質を生成し、前記Ｆ２−リンカー−Ｆ１タンパク質が、好ましくはａａ１０４〜ａａ１４４を欠いている請求項１から９のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  11. 前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、（Ｓ４６Ｇ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ａ１４９Ｃ、Ｓ２１５Ｐ、Ｙ４５８Ｃ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ａ１４９Ｃ、Ｙ４５８Ｃ）、（Ｎ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ）、（Ｑ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｅ９２Ｄ、Ｌ９５Ｍ、Ｓ２１５Ｐ、Ｉ２１７Ｐ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ、Ｋ４６５Ｑ）、（Ｑ９８Ｃ、Ｑ３６１Ｃ、Ｌ９５Ｍ、Ｉ２２１Ｍ、Ｒ４２９Ｋ）、又は（Ｎ１８３ＧＣ、Ｎ４２８Ｃ、Ｓ４６Ｇ、Ｎ６７Ｉ、Ｅ９２Ｄ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ４６５Ｑ）、又はそれらの断片若しくはバリアントから選択される少なくとも１つの更なる変異を更に含む請求項１から１０のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  12. 前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、Ｆ０、Ｆ−ｄｅｌ、Ｆ０＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ０、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ１、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ２、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ３、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ４、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ５、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ６、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ７、Ｆ−ｄｅｌ＿ＤＳＣａｖ１＿ｍｕｔ８、又はこれらの断片若しくはバリアントから選択される請求項１から１１のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  13. 前記少なくとも１つのコード配列が、配列番号６８、４８３、８９８、１２６７、１６３６、２００５、２３７４、２７４３、３１１２、３４８１、３８５０、４２１９、４５８８、４９５７、５３２６、５６９５、６０６４、６４３３、６８０２、７１７１、７５４０、７９０９、８２７９〜９６８３、１１７２６、１２０９５、１２４６４、１２８３３、１３９４０、１４３０９、１４６７８、１５０４７、１５４１６、１５７８５、１３２０２、１３５７１、１６１５４、１６５２３、１６８９２、１７２６１、１７６３０、１７９９９、１８３６８、１８７３７、１９１０６、１９４７５のいずれかと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントをコードする請求項１から１２のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  14. 前記少なくとも１つのコード配列が、配列番号６９〜７７、４８４〜４９２、８９９〜９０６、１２６８〜１２７５、１６３７〜１６４４、２００６〜２０１３、２３７５〜２３８２、２７４４〜２７５１、３１１３〜３１２０、３４８２〜３４８９、３８５１〜３８５８、４２２０〜４２２７、４５８９〜４５９６、４９５８〜４９６５、５３２７〜５３３４、５６９６〜５７０３、６０６５〜６０７２、６４３４〜６４４１、６８０３〜６８１０、７１７２〜７１７９、７５４１〜７５４８、７９１０〜７９１７、１１７２７〜１１７３４、１２０９６〜１２１０３、１２４６５〜１２４７２、１２８３４〜１２８４１、１３９４１〜１３９４８、１４３１０〜１４３１７、１４６７９〜１４６８６、１５０４８〜１５０５５、１５４１７〜１５４２４、１５７８６〜１５７９３、１３２０３〜１３２１０、１３５７２〜１３５７９、１６１５５〜１６１６２、１６５２４〜１６５３１、１６８９３〜１６９００、１７２６２〜１７２６９、１７６３１〜１７６３８、１８０００〜１８００７、１８３６９〜１８３７６、１８７３８〜１８７４５、１９１０７〜１９１１４、１９４７６〜１９４８３、２１３６３〜２１３８４、２１３８９〜２１４１０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントをコードする請求項１から１３のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  15. 前記少なくとも１つのコード配列が、コドン改変コード配列であり、前記少なくとも１つのコドン改変コード配列によってコードされるアミノ酸配列が、対応する野生型コード配列によってコードされるアミノ酸配列と比較して変更がないことが好ましい請求項１から１４のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  16. 前記少なくとも１つのコドン改変コード配列が、Ｃ最大化コード配列、ＣＡＩ最大化コード配列、ヒトコドン使用適合化コード配列、Ｇ／Ｃ含量改変コード配列、及びＧ／Ｃ最適化コード配列、又はこれらの任意の組合せから選択される請求項１５に記載の人工ＲＮＡ。
  17. 前記少なくとも１つのコード配列が、配列番号７０〜７７、４８５〜４９２、８９９〜９０６、１２６８〜１２７５、１６３７〜１６４４、２００６〜２０１３、２３７５〜２３８２、２７４４〜２７５１、３１１３〜３１２０、３４８２〜３４８９、３８５１〜３８５８、４２２０〜４２２７、４５８９〜４５９６、４９５８〜４９６５、５３２７〜５３３４、５６９６〜５７０３、６０６５〜６０７２、６４３４〜６４４１、６８０３〜６８１０、７１７２〜７１７９、７５４１〜７５４８、７９１０〜７９１７、１１７２８〜１１７３４、１２０９７〜１２１０３、１２４６５〜１２４７２、１２８３４〜１２８４１、１３９４１〜１３９４８、１４３１０〜１４３１７、１４６７９〜１４６８６、１５０４８〜１５０５５、１５４１７〜１５４２４、１５７８６〜１５７９３、１３２０３〜１３２１０、１３５７２〜１３５７９、１６１５５〜１６１６２、１６５２４〜１６５３１、１６８９３〜１６９００、１７２６２〜１７２６９、１７６３１〜１７６３８、１８０００〜１８００７、１８３６９〜１８３７６、１８７３８〜１８７４５、１９１０７〜１９１１４、１９４７６〜１９４８３、２１３６３〜２１３８４、２１３８９〜２１４１０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントを含むコドン改変コード配列を含む請求項１５から１６のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  18. 前記少なくとも１つのコード配列が、配列番号７０〜７１、７５〜７７、４８５〜４８６、４９０〜４９２、８９９〜９００、９０４〜９０６、１２６８〜１２６９、１２７３〜１２７５、１６３７〜１６３８、１６４２〜１６４４、２００６〜２００７、２０１１〜２０１３、２３７５〜２３７６、２３８０〜２３８２、２７４４〜２７４５、２７４９〜２７５１、３１１３〜３１１４、３１１８〜３１２０、３４８２〜３４８３、３４８７〜３４８９、３８５２、４２２１、４５９０、４９５９、５３２８、５６９７、６０６６、６４３５、６８０４、７１７３、７５４２、７９１１、３８５６〜３８５８、４２２５〜４２２７、４５９４〜４５９６、４９６３〜４９６５、５３３２〜５３３４、５７０１〜５７０３、６０７０〜６０７２、６４３９〜６４４１、６８０８〜６８１０、７１７７〜７１７９、７５４６〜７５４８、７９１５〜７９１７、１１７２８、１１７３２〜１１７３４、１２０９７、１２１０１〜１２１０３、１２４６５、１２４６６、１２４７０〜１２４７２、１２８３４、１２８３５、１２８３９〜１２８４１、１３９４１、１３９４２、１３９４６〜１３９４８、１４３１０、１４３１１、１４３１５〜１４３１７、１４６７９、１４６８０、１４６８４〜１４６８６、１５０４８、１５０４９、１５０５３〜１５０５５、１５４１７、１５４１８、１５４２２〜１５４２４、１５７８６、１５７８７、１５７９１〜１５７９３、１３２０３、１３２０４、１３２０８〜１３２１０、１３５７２、１３５７３、１３５７７〜１３５７９、１６１５５、１６１５６、１６１６０〜１６１６２、１６５２４、１６５２５、１６５２９〜１６５３１、１６８９３、１６８９４、１６８９８〜１６９００、１７２６２、１７２６３、１７２６７〜１７２６９、１７６３１、１７６３２、１７６３６〜１７６３８、１８０００、１８００１、１８００５〜１８００７、１８３６９、１８３７０、１８３７４〜１８３７６、１８７３８、１８７３９、１８７４３〜１８７４５，１９１０７、１９１０８、１９１１２〜１９１１４、１９４７６、１９４７７、１９４８１〜１９４８３、２１３６３〜２１３８４、２１３８９〜２１４１０と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントを含むコドン改変コード配列を含む請求項１５から１７のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  19. 前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、又はレプリコンＲＮＡである請求項１から１８のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  20. 前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである請求項１９に記載の人工ＲＮＡ。
  21. 前記ＲＮＡが、５’−キャップ構造、好ましくはｍ７Ｇ、ｃａｐ０、ｃａｐ１、ｃａｐ２、修飾されたｃａｐ０、又は修飾されたｃａｐ１構造を含む請求項１から２０のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  22. 前記ＲＮＡが、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列、好ましくは３０〜１５０個のアデノシンヌクレオチドを含む少なくとも１つのポリ（Ａ）配列、より好ましくは１００個のアデノシンヌクレオチドを含む少なくとも１つのポリ（Ａ）配列、及び／又は少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列、好ましくは１０〜４０個のシトシンヌクレオチドを含む少なくとも１つのポリ（Ｃ）配列を含む請求項１から２１のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  23. 前記ＲＮＡが、少なくとも１つのヒストンステムループを含み、前記ヒストンステムループが、好ましくは配列番号３９又は４０に係る核酸配列又はその断片若しくはバリアントを含む請求項１から２２のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  24. 好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメントａ）〜ｉ）：
    ａ）５’−キャップ構造、好ましくは本明細書に記載される５’−キャップ構造；
    ｂ）任意に、本明細書に記載される５’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号１〜２２から選択される少なくとも１つ；
    ｃ）リボソーム結合部位、好ましくは本明細書に記載されるリボソーム結合部位；
    ｄ）本明細書に記載される少なくとも１つのコード配列、好ましくは表３及び表４に記載される少なくとも１つのコード配列；
    ｄ）本明細書に記載される３’−ＵＴＲ、好ましくは配列番号２３〜３８から選択される少なくとも１つ；
    ｅ）任意に、ポリ（Ａ）配列、好ましくは本明細書に記載されるポリ（Ａ）配列；
    ｆ）任意に、ポリ（Ｃ）配列、好ましくは本明細書に記載されるポリ（Ｃ）配列；
    ｇ）任意に、ヒストンステムループ、好ましくは本明細書に記載されるヒストンステムループ；
    ｈ）任意に、本明細書に記載される３’末端配列エレメント、好ましくは配列番号４４〜６３、又は２１３２２〜２１３２８に係る３’末端配列エレメント、
    を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている請求項１から２３のいずれかに記載の人工ＲＮＡ。
  25. 好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメント：
    ａ）５’−キャップ構造、好ましくは請求項２１に記載の５’−キャップ構造、最も好ましくはＣａｐ１構造；
    ｂ）ａ−１、ａ−４、ｃ−１、ｅ−４、ｇ−２、ｉ−２、又はｉ−３に係る５’−ＵＴＲ及び／又は３’−ＵＴＲ；
    ｃ）請求項１３から１８のいずれかに記載の少なくとも１つのコード配列又は請求項７から１２のいずれかに記載のタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列；
    ｄ）任意に、ポリ（Ａ）配列、好ましくは請求項２２に記載のポリ（Ａ）配列；
    ｅ）任意に、ポリ（Ｃ）配列、好ましくは請求項２２に記載のポリ（Ｃ）配列；
    ｆ）任意に、ヒストンステムループ、好ましくは請求項２３に記載のヒストンステムループ；
    ｇ）任意に、配列番号４４〜６３、２１３２２〜２１３２８に係る３’−末端配列、
    を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている請求項１から２４に記載の人工ＲＮＡ。
  26. ５’から３’方向に、以下のエレメント：
    ａ）５’−キャップ構造、好ましくは請求項２１に記載の５’−キャップ構造、最も好ましくはＣａｐ１構造；
    ｂ）ａ−１、ａ−４、ｃ−１、ｅ−４、ｇ−２、ｉ−２、又はｉ−３、好ましくはａ−１に係る５’−ＵＴＲ及び／又は３’−ＵＴＲ；
    ｃ）請求項１３から１８のいずれかに記載の少なくとも１つのコード配列又は請求項７から１２のいずれかに記載のタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列であって、前記５’−ＵＴＲと前記３’−ＵＴＲとの間、好ましくは前記５’−ＵＴＲの下流且つ前記３’−ＵＴＲの上流に位置する少なくとも１つのコード配列；
    ｄ）ヒストンステムループ、好ましくは請求項２３に記載のヒストンステムループ；
    ｅ）ポリ（Ａ）配列、好ましくは請求項２２に記載のポリ（Ａ）配列；
    ｆ）配列番号２１３２２〜２１３２８に係る３’−末端配列、
    を含み、任意に、少なくとも１つの又は１より多くの、好ましくは全てのウラシルヌクレオチドがシュードウリジン（Ψ）ヌクレオチド又はＮ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）ヌクレオチドで置換されている請求項１から２５に記載の人工ＲＮＡ。
  27. 前記人工ＲＮＡが、配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントを含む又はからなる請求項１から２６に記載の人工ＲＮＡ。
  28. − 前記人工ＲＮＡが、配列番号７８〜４８２、１１７３５〜１２０９４、２１４１５〜２１４１７、２１５６１〜２１５６３、２１４８９、２１４９０、２１６３５、２１６３６からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号４９３〜８９７、１２１０４〜１２４６３、２１４１８〜２１４２０、２１５６４〜２１５６６、２１４９１、２１４９２、２１６３７、２１６３８からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号９０７〜１２６６、１２４７３〜１２８３２、２１４２１〜２１４２３、２１５６７〜２１５６９、２１４９３〜２１４９５、２１６３９〜２１６４１からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号１２７６〜１６３５、８２７８、１２８４２〜１３２０１、２１４２４〜２１４２６、２１５７０〜２１５７２、２１４９６〜２１４９８、２１６４２〜２１６４４からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号１６４５〜２００４、１３９４９〜１４３０８、２１４３３〜２１４３５、２１５７９〜２１５８１、２１５０５〜２１５０７、２１６５１〜２１６５３からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号２０１４〜２３７３、１４３１８〜１４６７７、２１４３６〜２１４３８、２１５８２〜２１５８４、２１５０８〜２１５１０、２１６５４〜２１６５６からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号２３８３〜２７４２、１４６８７〜１５０４６、２１４３９〜２１４４１、２１５８５〜２１５８７、２１５１１〜２１５１３、２１６５７〜２１６５９からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号２７５２〜３１１１、１５０５６〜１５４１５、２１４４２〜２１４４４、２１５８８〜２１５９０、２１５１４〜２１５１６、２１６６０〜２１６６２からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号３１２１〜３４８０、１５４２５〜１５７８４、２１４４５〜２１４４７、２１５９１〜２１５９３、２１５１７〜２１５１９、２１６６３〜２１６６５からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号３４９０〜３８４９、１５７９４〜１６１５３、１４４８〜２１４５０、２１５９４〜２１５９６、２１５２０〜２１５２２、２１６６６〜２１６６８からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号３８５９〜４２１８、１３２１１〜１３５７０、２１４２７〜２１４２９、２１５７３〜２１５７５、２１４９９〜２１５０１、２１６４５〜２１６４７からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号４２２８〜４５８７、１３５８０〜１３９３９、２１４３０〜２１４３２、２１５７６〜２１５７８、２１５０２〜２１５０４、２１６４８〜２１６５０からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号４５９７〜４９５６、１６１６３〜１６５２２、２１４５１〜２１４５３、２１５９７〜２１５９９、２１５２３〜２１５２５、２１６６９〜２１６７１からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号４９６６〜５３２５、１６５３２〜１６８９１、２１４５４〜２１４５６、２１６００〜２１６０２、２１５２６〜２１５２８、２１６７２〜２１６７４からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号５３３５〜５６９４、１６９０１〜１７２６０、２１４５７〜２１４５９、２１６０３〜２１６０５、２１５２９〜２１５３１、２１６７５〜２１６７７からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号５７０４〜６０６３、１７２７０〜１７６２９、２１４６０〜２１４６２、２１６０６〜２１６０８、２１５３２〜２１５３４、２１６７８〜２１６８０からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号６０７３〜６４３２、１７６３９〜１７９９８、２１４６３〜２１４６５、２１６０９〜２１６１１、２１５３５〜２１５３７、２１６８１〜２１６８３からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号６４４２〜６８０１、１８００８〜１８３６７、２１４６６〜２１４６８、２１６１２〜２１６１４、２１５３８〜２１５４０、２１６８４〜２１６８６からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号６８１１〜７１７０、１８３７７〜１８７３６、２１４６９〜２１４７１、２１６１５〜２１６１７、２１５４１〜２１５４３、２１６８７〜２１６８９からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号７１８０〜７５３９、１８７４６〜１９１０５、２１４７２〜２１４７４、２１６１８〜２１６２０、２１５４４〜２１５４６、２１６９０〜２１６９２からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号７５４９〜７９０８、１９１１５〜１９４７４、２１４７５〜２１４７７、２１６２１〜２１６２３、２１５４７〜２１５４９、２１６９３〜２１６９５からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる；
    − 前記人工ＲＮＡが、配列番号７９１８〜８２７７、１９４８４〜１９８４３、２１４７８〜２１４８０、２１６２４〜２１６２６、２１５５０〜２１５５２、２１６９６〜２１６９８からなる群から選択される核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる請求項２７に記載の人工ＲＮＡ。
  29. 請求項１から２８のいずれかに記載の少なくとも１つの人工ＲＮＡを含む組成物であって、任意に、少なくとも１つの薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする組成物。
  30. マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１タンパク質、及び／又はリンタンパク質Ｐ、又はそれらの組合せから選択される、好ましくはＭ２−１から選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む少なくとも１つの更なる人工ＲＮＡを含む請求項２９に記載の組成物。
  31. マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１、及びリンタンパク質Ｐから選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列をそれぞれが含む２つの更なる人工ＲＮＡ種を含む請求項２９から３０のいずれかに記載の組成物。
  32. マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、Ｍ２−１、及びリンタンパク質Ｐから選択されるＲＳＶに由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列をそれぞれが含む３つの更なる人工ＲＮＡ種を含む請求項２９から３０のいずれかに記載の組成物。
  33. 前記更なる人工ＲＮＡのコード配列が、配列番号９６８４、１００５３〜１０１３３、１０１３４、１０５０３〜１０６３６、１０６３７、１１００６〜１１１８２、１１１８３、１１５５２〜１１７２５、１９８４４、２０２１３、２０５８２、２０９５１のいずれか又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列の少なくとも１つをコードする請求項３０から３２のいずれかに記載の組成物。
  34. 前記コード配列が、ａ−１、ａ−２、ａ−３、ａ−４、ａ−５、ｂ−１、ｂ−２、ｂ−３、ｂ−４、ｂ−５、ｃ−１、ｃ−２、ｃ−３、ｃ−４、ｃ−５、ｄ−１、ｄ−２、ｄ−３、ｄ−４、ｄ−５、ｅ−１、ｅ−２、ｅ−３、ｅ−４、ｅ−５、ｅ−６、ｆ−１、ｆ−２、ｆ−３、ｆ−４、ｆ−５、ｇ−１、ｇ−２、ｇ−３、ｇ−４、ｇ−５、ｈ−１、ｈ−２、ｈ−３、ｈ−４、ｈ−５、ｉ−１、ｉ−２、又はｉ−３から選択される３’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲに機能可能に連結されている請求項３０から３３のいずれかに記載の組成物。
  35. 前記コード配列が、配列番号９６８５〜９６９２、１０１３５〜１０１４２、１０６３８〜１０６４５、１１１８４〜１１１１９、１９８４５〜１９８５２、２０２１４〜２０２２１、２０５８３〜２０５９０、２０９５２〜２０９５９、２１３８５〜２１３８８、２１４１１〜２１４１４又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントと同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸配列の少なくとも１つを含む請求項３０から３４のいずれかに記載の組成物。
  36. 前記更なる人工ＲＮＡが、配列番号９６９３〜１００５２、１０１４３〜１０５０２、１０６４６〜１１００５、１１１９２〜１１５５１、１９８５３〜２０２１２、２０２２２〜２０５８１、２０５９１〜２０９５０、２０９６０〜２１３１９、２１４８１〜２１６３４、２１５５３〜２１７０６又はこれらの配列のいずれかの断片若しくはバリアントから選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＲＮＡ配列を含む又はからなる請求項３０から３５のいずれかに記載の組成物。
  37. − 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である人工ＲＮＡ及び配列番号９６９３〜１００５２、１９８５３〜２０２１２、２１４８１、２１４８２、２１６２７、２１６２８、２１５５３、２１５５４、２１６９９、２１７００からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；又は
    − 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である人工ＲＮＡ及び配列番号１０１４３〜１０５０２、２０２２２〜２０５８１、２１４８３、２１４８４、２１６２９、２１６３０、２１５５５、２１５５６、２１７０１、２１７０２からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；又は
    − 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である人工ＲＮＡ及び配列番号１０６４６〜１１００５、２０５９１〜２０９５０、２１４８５、２１４８６、２１６３１、２１６３２、２１５５７、２１５５８、２１７０３、２１７０４からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；又は
    − 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である人工ＲＮＡ及び配列番号１１１９２〜１１５５１、２０９６０〜２１３１９；２１４８７、２１４８８、２１６３３、２１６３４、２１５５９、２１５６０、２１７０５、２１７０６からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；又は
    − 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である人工ＲＮＡ及び配列番号９６９３〜１００５２、１９８５３〜２０２１２、２１４８１、２１４８２、２１６２７、２１６２８、２１５５３、２１５５４、２１６９９、２１７００からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ及び配列番号１０６４６〜１１００５、２０５９１〜２０９５０、２１４８５、２１４８６、２１６３１、２１６３２、２１５５７、２１５５８、２１７０３、２１７０４からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ；
    − 配列番号７８〜４８２、４９３〜８９７、９０７〜１２６６、１２７６〜１６３５、１６４５〜２００４、２０１４〜２３７３、２３８３〜２７４２、２７５２〜３１１１、３１２１〜３４８０、３４９０〜３８４９、３８５９〜４２１８、４２２８〜４５８７、４５９７〜４９５６、４９６６〜５３２５、５３３５〜５６９４、５７０４〜６０６３、６０７３〜６４３２、６４４２〜６８０１、６８１１〜７１７０、７１８０〜７５３９、７５４９〜７９０８、７９１８〜８２７７、８２７８、１１７３５〜１２０９４、１２１０４〜１２４６３、１２４７３〜１２８３２、１２８４２〜１３２０１、１３９４９〜１４３０８、１４３１８〜１４６７７、１４６８７〜１５０４６、１５０５６〜１５４１５、１５４２５〜１５７８４、１５７９４〜１６１５３、１３２１１〜１３５７０、１３５８０〜１３９３９、１６１６３〜１６５２２、１６５３２〜１６８９１、１６９０１〜１７２６０、１７２７０〜１７６２９、１７６３９〜１７９９８、１８００８〜１８３６７、１８３７７〜１８７３６、１８７４６〜１９１０５、１９１１５〜１９４７４、１９４８４〜１９８４３、２１４１５〜２１４８０、２１５６１〜２１６２６、２１４８９〜２１５５２、２１６３５〜２１６９８から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である人工ＲＮＡ及び配列番号９６９３〜１００５２、１９８５３〜２０２１２、２１４８１、２１４８２、２１６２７、２１６２８、２１５５３、２１５５４、２１６９９、２１７００からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ及び配列番号１０６４６〜１１００５、２０５９１〜２０９５０、２１４８５、２１４８６、２１６３１、２１６３２、２１５５７、２１５５８、２１７０３、２１７０４からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡ及び配列番号１０１４３〜１０５０２、２０２２２〜２０５８１、２１４８３、２１４８４、２１６２９、２１６３０、２１５５５、２１５５６、２１７０１、２１７０２からなる群から選択される核酸配列と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である更なる人工ＲＮＡを含む請求項２９から３６に記載の組成物。
  38. 前記少なくとも１つの人工ＲＮＡ及び、任意に、前記更なる人工ＲＮＡが、１以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性又はポリカチオン性ポリマー、カチオン性又はポリカチオン性多糖、カチオン性又はポリカチオン性脂質、カチオン性又はポリカチオン性タンパク質、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド、又はそれらの任意の組合せと複合体化若しくは会合される又は少なくとも部分的に複合体化若しくは会合される請求項２９から３７に記載の組成物。
  39. 前記人工ＲＮＡ及び、任意に、前記更なる人工ＲＮＡが、１以上の脂質と複合体化又は会合されて、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、及び／又はナノリポソームを形成する請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記人工ＲＮＡ及び、任意に、前記更なる人工ＲＮＡが、１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成する請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記ＬＮＰが、式ＩＩＩを有するカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグ、若しくは立体異性体を含む請求項４０に記載の組成物。
    Figure 2021519595
     （式中、Ｌ１又はＬ２は、それぞれ独立して、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、ＳＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ−、又は−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ−であり、好ましくはＬ１又はＬ２が、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり；
    Ｇ１及びＧ２は、それぞれ独立して、非置換のＣ１−Ｃ１２アルキレン又はＣ１−Ｃ１２アルケニレンであり；
    Ｇ３は、Ｃ１−Ｃ２４アルキレン、Ｃ１−Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキレン、又はＣ３−Ｃ８シクロアルケニレンであり；
    Ｒａは、Ｈ又はＣ１−Ｃ１２アルキルであり；
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ６−Ｃ２４アルキル又はＣ６−Ｃ２４アルケニルであり；
    Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、又は−ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
    Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルであり；
    Ｒ５は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；
    ｘは、０、１、又は２である。）
  42. 前記カチオン性脂質が、式ＩＩＩの化合物であり、式中、
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−又は（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−であり；
    Ｇ３は、Ｃ１−Ｃ２４アルキレン又はＣ１−Ｃ２４アルケニレンであり；
    Ｒ３は、Ｈ又はＯＲ５である請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記カチオン性脂質が、式ＩＩＩの化合物であり、式中、
    Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−又は（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−であり；
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、以下の構造のうちの１つを有する請求項４１から４２のいずれかに記載の組成物。
    Figure 2021519595
  44. 前記カチオン性脂質が、式ＩＩＩの化合物であり、式中、Ｒ３がＯＨである請求項４１から４３のいずれかに記載の組成物。
  45. 前記カチオン性脂質が、構造ＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−３６から選択される請求項４１から４４のいずれかに記載の組成物。
    Figure 2021519595
    Figure 2021519595
    Figure 2021519595
    Figure 2021519595
    Figure 2021519595
  46. 前記カチオン性脂質が、下記である請求項４１から４５のいずれかに記載の組成物。
    Figure 2021519595
  47. 前記ＬＮＰが、式（ＩＶ）を有するＰＥＧ脂質を含む請求項４０から４６のいずれかに記載の組成物。
    Figure 2021519595
     （式中、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、１０〜３０個の炭素原子を含む、直鎖又は分岐した飽和又は不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は、１以上のエステル結合を途中に有していてもよく；
    ｗの平均値は、３０〜６０である。）
  48. 前記ＰＥＧ脂質において、Ｒ８及びＲ９が飽和アルキル鎖である請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記ＰＥＧ脂質が、下記である請求項４７から４８のいずれかに記載の組成物。
    Figure 2021519595
     （式中、ｎは、３０〜６０の範囲の平均値を有し、好ましくはｎは、約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４の平均値を有し、最も好ましくは、ｎは、４９の平均値を有する。
  50. 前記ＬＮＰが、１以上の中性脂質及び／又はステロイド又はステロイド類似体を含む請求項４０から４９のいずれかに記載の組成物。
  51. 前記中性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアリオイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、及び１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）を含む群から選択される請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記中性脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、前記カチオン性脂質のＤＳＰＣに対するモル比が、任意に、約２：１〜８：１の範囲である請求項５０から５１のいずれかに記載の組成物。
  53. 前記ステロイドが、コレステロールであり、前記カチオン性脂質のコレステロールに対するモル比が、任意に、約２：１〜１：１の範囲である請求項５０に記載の組成物。
  54. 前記ＬＮＰが、
    （ｉ）少なくとも１つのカチオン性脂質、好ましくは請求項４１から４６のいずれかに記載の少なくとも１つのカチオン性脂質；
    （ｉｉ）中性脂質、好ましくは請求項５０から５２のいずれかに記載の中性脂質；
    （ｉｉｉ）ステロイド又はステロイド類似体、好ましくは請求項５３に記載のステロイド又はステロイド類似体；及び
    （ｉｖ）ＰＥＧ−脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−ｃＤＭＡ、好ましくは請求項４７から４９のいずれかに記載のＰＥＧ−脂質から本質的になり、
    （ｉ）〜（ｉｖ）は、モル比で、約２０〜６０％のカチオン性脂質、５〜２５％の中性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ−脂質である請求項４０から５３のいずれかに記載の組成物。
  55. 好ましくは配列番号１２６７、２００５、２７４３、３４８１、４２１９、４９５７、５６９５、６４３３、７１７１、７９０９、１２８３３、１４３０９、１５０４７、１５７８５、１３５７１、１６５２３、１７２６１、１７９９９、１８７３７、１９４７５と同一である又は少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から２８のいずれかに記載の人工ＲＮＡによってコードされることを特徴とするポリペプチド又はこれらのポリペプチドのいずれかのバリアント。
  56. 請求項５５に記載のポリペプチドを含む組成物であって、任意に、少なくとも１つの薬学的に許容される担体若しくは請求項１から２８のいずれかに記載の少なくとも１つの人工ＲＮＡ、又は請求項２９から５４に記載の組成物を含むことを特徴とする組成物。
  57. 請求項１から２８のいずれかに記載の人工ＲＮＡ、請求項２９から５４のいずれかに記載の組成物、請求項５５に記載のポリペプチド、又は請求項５６に記載の組成物を含むことを特徴とするワクチン。
  58. 請求項１から２８のいずれかに記載の前記人工ＲＮＡ、請求項２９から５４のいずれかに記載の前記組成物、請求項５５に記載の前記ポリペプチド、又は請求項５６に記載の前記組成物が、適応免疫応答を誘導する請求項４９に記載のワクチン。
  59. 前記ワクチンが、薬学的に許容される担体と、任意に、少なくとも１つのアジュバントを更に含む請求項５７から５８のいずれかに記載のワクチン。
  60. 請求項１から２８のいずれかに記載の人工ＲＮＡ、請求項２９から５４のいずれかに記載の組成物、請求項５５に記載のポリペプチド、請求項５６に記載の組成物、及び／又は請求項５７から５９のいずれかに記載のワクチンと、任意に、可溶化のための液体ビヒクルと、任意に、成分の用法用量に関する情報を提供する技術的説明書とを含むことを特徴とするキット又はキットオブパーツ。
  61. 少なくとも以下の成分を含む請求項６０に記載のキット又はキットオブパーツ：
    ａ）ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質に由来する少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードする請求項１から２８のいずれかに記載の少なくとも１つの人工ＲＮＡであって、前記人工ＲＮＡが、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している；及び
    ｂ）Ｍ、Ｎ、Ｍ２−１、又はＰから選択されるＲＳＶに由来する抗原性ペプチド又はタンパク質をそれぞれがコードする少なくとも１つ、２つ、又は３つの更なる人工ＲＮＡであって、前記更なる人工ＲＮＡ種のそれぞれが、好ましくは１以上の脂質と複合体化されて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成している、
    ここで、成分ａ）及びｂ）は、別々の実体又は単一の実体として提供される。
  62. Ｒｉｎｇｅｒラクタート溶液を更に含む請求項６０から６１のいずれかに記載のキット又はキットオブパーツ。
  63. 医薬としての使用のための、請求項１から２８のいずれかに記載の人工ＲＮＡ、請求項２９から５４のいずれかに記載の組成物、請求項５５に記載のポリペプチド、請求項５６に記載の組成物、請求項５７から５９のいずれかに記載のワクチン、又は請求項６０から６２のいずれかに記載のキット又はキットオブパーツ。
  64. ウイルスによる感染症、好ましくはＲＳＶによる感染症、又はそのような感染症に関連する障害の治療又は予防における使用のための、請求項１から２８のいずれかに記載の人工ＲＮＡ、請求項２９から５４のいずれかに記載の組成物、請求項５５に記載のポリペプチド、請求項５６に記載の組成物、請求項５７から５９のいずれかに記載のワクチン、又は請求項６０から６２のいずれかに記載のキット又はキットオブパーツ。
  65. 障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１から２８のいずれかに記載の人工ＲＮＡ、請求項２９から５４のいずれかに記載の組成物、請求項５５に記載のポリペプチド、請求項５６に記載の組成物、請求項５７から５９のいずれかに記載のワクチン、又は請求項６０から６２のいずれかに記載のキット又はキットオブパーツを適用又は投与することを含むことを特徴とする方法。
  66. 前記障害が、ＲＳＶによる感染症、又はそのような感染症に関連する障害である請求項６５に記載の方法。
  67. 前記必要とする対象が、哺乳動物対象である請求項６５から６６のいずれかに記載の方法。
  68. 前記哺乳動物対象が、ヒト対象、好ましくは、新生児、妊娠女性、授乳中の女性、高齢者、及び／又は免疫不全のヒト対象である請求項６７に記載の方法。

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