ES2922760T3 - Vacunas de virus respiratorios - Google Patents

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Abstract

La descripción se refiere a vacunas de ácido ribonucleico (ARN) de virus respiratorios y vacunas combinadas, así como métodos de uso de las vacunas y composiciones que comprenden las vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas de virus respiratorios
ANTECEDENTES
Enfermedad respiratoria es un término médico que abarca las condiciones patológicas que afectan a los órganos y tejidos que hacen posible el intercambio gaseoso en los organismos superiores, e incluye las condiciones del tracto respiratorio superior, la tráquea, los bronquios, los bronquiolos, los alvéolos, la pleura y la cavidad pleural, y los nervios y músculos de la respiración. Las enfermedades respiratorias se encuentran dentro del intervalo de leves y autolimitadas, tales como el resfriado común, hasta entidades potencialmente letales como neumonía bacteriana, embolismo pulmonar, asma agudo y cáncer de pulmón. La enfermedad respiratoria es una causa común y significativa de enfermedad y muerte alrededor del mundo. En Estados Unidos, se producen aproximadamente 1 mil millones de “resfriados comunes” por año. Las afecciones respiratorias se encuentran entre las razones más frecuentes de internaciones en niños.
El metapneumovirus humano (hMPV) es un virus de ARN de cadena simple de sentido negativo del género Pneumovirinae y de la familia Paramyxo viridae y está estrechamente relacionado con el subgrupo C del metapneumovirus aviar (AMPV). Fue aislado por primera vez en 2001 en los Países Bajos utilizando la técnica RAP-PCR (identificación de ARN usando PCR [Polinuclease Chain Reaction - Reacción en Cadena de Polimerasa] cebada arbitrariamente) para la identificación de virus desconocidos que crecen en células cultivadas. hPMV ocupa el segundo lugar después de RSV (Respiratory Syncytial Virus - Virus Sincitial Respiratorio) como una causa importante de enfermedad viral del tracto respiratorio inferior (LRI, de Lower Respiratory Tract) en niños pequeños. La epidemiología estacional del hMPV aparenta ser similar a la del RSV, pero la aparición de la infección y enfermedad aparenta ser sustancialmente menor.
El virus de la parainfluenza de tipo 3 (PIV3), tal como el hMPV, también es un virus de ARN de cadena simple y sentido negativo del género Pneumovirinae y de la familia Paramyxoviridae y es una causa principal de las infecciones respiratorias agudas ubicuas de la infancia y la niñez temprana. Su aparición alcanza un pico aproximadamente a los 4-12 meses de vida, y el virus es responsable del 3-10 % de las hospitalizaciones, principalmente por bronquiolitis y neumonía. El PIV3 puede ser fatal y, en algunos aspectos, está asociado con enfermedades neurológicas, como convulsiones febriles. También puede provocar la remodelación de las vías respiratorias, una causa importante de morbilidad. En las regiones en desarrollo del mundo, los bebés y los niños pequeños corren el mayor riesgo. de mortalidad, ya sea por infección viral primaria por PIV3 o por consecuencias secundarias, como infecciones bacterianas. Los virus de la parainfluenza humana (hPIV) de tipos 1, 2 y 3 (hPIV1, hPIV2 y hPIV3, respectivamente), así como el hMPV, se encuentran en segundo lugar solamente con respecto al RSV como causas importantes de LRI viral en niños menores.
El RSV también es un virus de ARN de cadena simple de sentido negativo del género Pneumovirinae y de la familia Paramyxoviridae. Los síntomas en adultos suelen parecerse a una infección de los senos paranasales o al resfriado común, aunque la infección puede ser asintomática. En adultos mayores, (por ejemplo, >60 años), la infección de RSV puede evolucionar a bronquiolitis o neumonía. Los síntomas en niños son a menudo más graves, inclusive bronquiolitis y neumonía. Se estima que en Estados Unidos la mayoría de los niños se ven afectados con el RSV al llegar a los tres años. El virión del RSV consiste en una nucleocápside interna comprendida por el ARN viral unido a una nucleoproteína (N), fosfoproteína (P) y proteína larga de polimerasa (L). La nucleocápside está rodeada por una proteína de matriz (M) y está encapsulada por una bicapa lipídica en la cual se incorporan las proteínas de acoplamiento (G) y fusión viral (F), así como proteínas hidrofóbicas pequeñas (SH). El genoma viral también codifica dos proteínas no estructurales (NS1 y NS2), que inhiben la actividad del interferón de tipo I, así como la proteína M-2.
Los problemas de salud crónicos asociados con el hMPV, PIV3 y RSV son de preocupación en el plano internacional, lo cual refuerza la importancia del desarrollo de candidatos de vacunas seguras y eficaces contra estos virus.
A pesar de décadas de investigación, no existe en la actualidad ninguna vacuna (Sato y Wright, Pediatr. Infect. Dis, J.
2008;27(10 Suppl):S123-5). No obstante, la tecnología recombinante se ha utilizado para dirigirse a la formación de vacunas para los serotipos de hPIV-1, 2 y 3, por ejemplo, y ha adoptado la forma de vacunas intranasales con organismos vivos atenuados. Se encontró que dos vacunas en particular eran inmunogénicas y bien toleradas contra hPIV-3 en ensayos de fase I. Los candidatos a vacunas hPIV1 y hPIV2 siguen siendo menos avanzados (Durbin y Karron, Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2003;37(12):1668-77).
El virus del sarampión (MeV), al igual que el hMPV, PIV3 y RSV es un virus de ARN de cadena simple y sentido negativo que es la causa del sarampión, una infección del sistema respiratorio. El MeV pertenece al género Morbillivirus dentro de la familia Paramyxo viridae. Los humanos son los hospedadores naturales del virus; no se conoce de la existencia de reservorios animales. Los síntomas de sarampión incluyen fiebre, catarro, rinorrea, ojos rojos y una erupción eritematosa maculopapular generalizada. El virus es altamente contagioso y se esparce mediante la tos.
Además del hMPV, PIV, RSV y MeV, se conoce que los betacoronavirus provocan enfermedades respiratorias. Los betacoronavirus (BetaCoV) son uno de cuatro géneros de coronavirus de la subfamilia Coronavirinae en la familia Coronaviridae, del orden Nidovirales. Son virus de ARN de cadena simple, de sentido positivo y envueltos de origen zoonótico. Cada uno de los géneros de coronavirus se compone de diferentes linajes virales, y el género betacoronavirus contiene cuatro de esos linajes. Los BetaCoV con la mayor importancia clínica con respecto a humanos son OC43 y HKU1 del linaje A, SARS-CoV del linaje B, y MERS-CoV del linaje C. MERS-CoV es el primer betacoronavirus que pertenece al linaje C que se conoce que infecta a humanos.
El síndrome respiratorio por coronavirus de Oriente Medio (MERS-CoV) o EMC/2012 (HCoV-EMC/2012), inicialmente denominado coronavirus 2012 novedoso o simplemente coronavirus novedoso, se informó por primera vez en 2012 luego de la secuenciación del genoma de un virus aislado de muestras de esputo de una persona que se enfermó durante un brote de 2012 de una nueva gripe. A partir de julio de 2015, se han informado casos de MERS-CoV en más de 21 países. Los brotes de MERS-CoV han suscitado grave preocupación a nivel mundial, lo que fortalece la importancia del desarrollo de candidatos a vacunas seguras y efectivas contra el MERS-CoV.
El síndrome respiratorio agudo grave (SARS) surgió en China en 2002 y se extendió a otros países antes de controlarse. Debido a una preocupación por la reaparición de una liberación deliberada del coronavirus de SARS, se ha iniciado el desarrollo de una vacuna.
La vacuna de ácido desoxirribonucleico (ADN) es una técnica utilizada para estimular las respuestas inmunitarias celulares a antígenos externos, tales como antígenos de hMPV, antígenos de PIV y/o antígenos de RSV. La inyección directa de ADN modificado genéticamente (por ejemplo, ADN de plásmido desnudo) en un hospedador vivo causa que una pequeña cantidad de sus células produzcan directamente un antígeno, lo que resulta en una respuesta inmunológica protectora. Sin embargo, esta técnica acarrea posibles problemas que incluyen la posibilidad de mutagénesis insercional, lo que podría llevar a la activación de oncogenes o la inhibición de genes de supresión tumoral.
Shim y col., BMC Immunol, 11:65 (2010) describen que la inmunización intranasal con ADN plasmídico que codifica la proteína espicular de SARS-CoV/nanopartículas de polietilenimina provoca respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas de antígeno en ratones BALB/c.
Du y col., Virology, 353(1), 6-16 (2006) describe que el virus adenoasociado recombinante que expresa el dominio de unión al receptor de la proteína S del SARS-CoV es capaz de provocar anticuerpos neutralizantes en ratones BALB/c.
RESUMEN
En base a la descripción contenida en esta invención, la presente invención proporciona una vacuna de ARN mensajero (ARNm) de betacoronavirus (BetaCoV) que comprende al menos un polinucleótido de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico BetaCoV; donde el al menos un polipéptido antigénico BetaCoV es (a) una proteína espicular (S) o un fragmento inmunogénico de la misma, o (b) un subconjunto S1 o un subconjunto S2 de la proteína S o un fragmento inmunogénico de la misma; donde la vacuna BetaCoV se formula en una nanopartícula lipídica, donde la nanopartícula lipídica comprende 40-60 % de lípido catiónico, 5-15 % de lípido no catiónico, 1-2 % de lípido PEG y 30-50 % de colesterol.
En otro aspecto, la presente invención proporciona la vacuna de ARNm de BetaCoV de la invención para su uso en un procedimiento para impedir y/o tratar una enfermedad BetaCoV en un sujeto.
La presente invención algunas realizaciones preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La información técnica expuesta a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
Además, las referencias incidentales a procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y procedimientos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no deben interpretarse como una reivindicación de protección para dichos procedimientos como tales, sino que deben interpretarse como refiriéndose a productos, en particular sustancias o composiciones, para uso en cualquiera de estos procedimientos.
En esta invención se proporcionan vacunas de ácido ribonucleico (ARN) que se basan en el conocimiento de que el ARN mensajero (ARNm) puede dirigir de manera segura la maquinaria celular del cuerpo para producir casi cualquier proteína de interés, desde proteínas nativas hasta anticuerpos y otras construcciones de proteínas completamente nuevas que pueden tener efectos terapéuticos. actividad dentro y fuera de las células. Las vacunas de ARNm de la presente divulgación pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria equilibrada contra BetaCoV (p.ej., MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1), que comprende tanto inmunidad celular como humoral, sin correr el riesgo de la posibilidad de mutagénesis por inserción, por ejemplo. hMPV, PIV, RSV, MeV, BetaCoV (p.ej., MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1) y combinaciones de los mismos se refieren a en esta invención como "virus respiratorios". Por lo tanto, el término "vacunas de ARN de virus respiratorios" abarca vacunas de ARN de hMPV, vacunas de ARN de PIV, vacunas de ARN de RSV, vacunas de ARN de MeV, vacunas de ARN de BetaCoV y cualquier combinación de dos o más vacunas de ARN de hMPV, vacunas de ARN de PIV, vacunas de ARN de r Sv , vacunas de ARN de MeV y vacunas de ARN de BetaCoV.
Es posible utilizar las vacunas de ARN (es decir, ARNm) en diversos casos de acuerdo con la prevalencia de la infección o el grado o nivel de la necesidad médica no satisfecha. Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) tienen propiedades superiores porque producen títulos de anticuerpos mucho mayores y producen respuestas antes que los tratamientos terapéuticos antivirales disponibles en el mercado. Sin limitarse a la teoría, se cree que el diseño de las vacunas de ARN (es decir, ARNm), como polinucleótidos de ARNm, se adapta mejor a la producción de la conformación de proteínas adecuadas con la traducción debido a que las vacunas de ARN (es decir, ARNm) seleccionan maquinaria celular natural. A diferencia de las vacunas tradicionales que se producen ex vivo y que pueden desencadenar respuestas celulares no deseadas, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) se presentan al sistema celular en una forma más natural.
De manera sorprendente, se ha demostrado que la efectividad de las vacunas de ARNm puede mejorarse de forma significativa cuando se combinan con un adyuvante de flagelina, en particular, cuando uno o más ARNm de codificación de antígenos se combina con un ARNm que codifica la flagelina.
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) combinadas con el adyuvante de flagelina (es decir, adyuvante de flagelina codificado por ARNm) tienen propiedades superiores, en el sentido de que pueden producir títulos de anticuerpo mucho mayores y producir respuestas en forma más temprana que las formulaciones de vacunas disponibles en el mercado. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, se cree que las vacunas de ARN (es decir, ARNm), como polinucleótidos de ARNm, están mejor diseñadas para producir la conformación proteica adecuada tras la traducción, tanto para el antígeno como para el adyuvante, ya que las vacunas de ARN (es decir, ARNm) cooptan la maquinaria celular natural. A diferencia de las vacunas tradicionales que se producen ex vivo y que pueden desencadenar respuestas celulares no deseadas, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) se presentan al sistema celular en una forma más natural.
Algunas realizaciones de la presente descripción proporcionan vacunas de ARN (es decir, ARNm) que incluyen al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico o un fragmento inmunógeno del mismo (por ejemplo, un fragmento inmunógeno capaz de inducir una respuesta inmunitaria al polipéptido antigénico) y al menos un ARN (es decir, polinucleótido de ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica un adyuvante de flagelina.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de flagelina (por ejemplo, polipéptido de flagelina codificado) es una proteína de flagelina. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de flagelina (por ejemplo, polipéptido de flagelina codificado) es un fragmento inmunógeno de flagelina. En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de flagelina y al menos un polipéptido antigénico se codifican mediante un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) individual. En otras realizaciones, cada uno de al menos un polipéptido de flagelina y al menos un polipéptido antigénico se codifican mediante un polinucleótido de ARN distinto.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido de flagelina tiene una identidad de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con respecto a un polipéptido de flagelina que tiene una secuencia identificada mediante cualquiera de las SEQ ID NO: 54-56.
En algunas realizaciones, se proporciona en esta invención una vacuna de ácido ribonucleico (ARN) (es decir, ARNm), que comprende al menos un (por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5) polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un (por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5) hMPV, PIV, RSV, MeV, o un BetaCoV (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH, HCoV-HKU1) polipéptido antigénico En esta invención, el uso de la expresión “polipéptido antigénico” abarca fragmentos inmunógenos del polipéptido antigénico (un fragmento inmunógeno que induce (o es capaz de inducir) una respuesta inmunitaria a BetaCoV), a menos que se exprese lo contrario.
En algunas realizaciones, se proporciona en esta invención también una vacuna de ARN (es decir, ARNm) que comprende al menos un (por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5) polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un (por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5) hMPV, PIV, RSV, MeV, o un BetaCoV (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH, HCoV-HKU1) polipéptido antigénico o un fragmento inmunógeno del mismo, unido a un péptido señal.
En esta invención también se divulga, en algunos aspectos, un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica al menos uno (por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5) BetaCoV (por ejemplo, MERS-CoV, Sa Rs -CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH, HCoV-HKU1) polinucleótido de ARN (por ejemplo, ARNm).
Aún más, en esta invención se describe, en algunos aspectos, una vacuna para usaren un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una vacuna que comprende al menos uno (por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5) polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos uno (por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5) BetaCoV (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV -229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH, HCoV-HKU1) polipéptido antigénico.
BetaCoV
En la invención, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) comprende al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico BetaCoV. En algunas realizaciones, el BetaCoV es MERS-CoV. En algunas realizaciones, el BetaCoV es SARS-CoV. En algunas realizaciones, el BetaCoV es HCoV-OC43. En algunas realizaciones, el BetaCoV es HCoV-229E. En algunas realizaciones, el BetaCoV es HCoV-NL63. En algunas realizaciones, el BetaCoV es HCoV-HKU1. En la invención, al menos un polipéptido antigénico es una proteína estructural del betacoronavirus. En algunas realizaciones, una proteína estructural de betacoronavirus es una proteína espicular (S). En algunas realizaciones, una proteína estructural de betacoronavirus es un subconjunto S1 o un subconjunto S2 de la proteína espicular (S) o un fragmento inmunógeno de la misma.
Debido a sus propiedades de expresión superficial, se considera que las vacunas que poseen polinucleótidos de ARN que codifican proteínas estructurales tienen una actividad inmunogénica preferida y, por lo tanto, pueden ser más adecuadas para su uso en las vacunas de la presente divulgación.
La invención proporciona vacunas contra el betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH, HCoV-HKU1 o una combinación de los mismos) que incluyen al menos un ARN (es decir, ARNm) polinucleótido que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH, HCoV-HKU1) polipéptido antigénico. También se proporcionan en esta invención vacunas de pan-betacoronavirus. Por lo tanto, una vacuna de betacoronavirus que comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que posee un marco de lectura abierto que codifica cualesquiera uno, dos, tres o cuatro de MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63 y HCoV-HKU1, por ejemplo, puede ser efectiva contra cualquiera, una combinación o la totalidad, de MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1. La presente descripción abarca otros betacoronavirus.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una proteína estructural de MERS-CoV. En algunas realizaciones, la proteína estructural de MERS-CoV es una proteína espicular (S) (véase, por ejemplo, Coleman CM y col. Vaccine 2014;32:3169-74 ). En algunas realizaciones, la proteína estructural de MERS-CoV es un subconjunto S1 o un subconjunto S2 de la proteína espicular (S) o un fragmento inmunógeno de la misma (Li J y col. Viral Immunol 2013;26(2):126-32; He Y col. Biochem Biophys Res Commun 2004;324(2):773-81).
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico de MERS-CoV comprende una secuencia de aminoácidos que se identifica mediante cualquiera de las SEQ ID NO: 24-28 or 33 (Tabla 11). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido antigénico de MERS-CoV es, o es un fragmento o variante que tiene una identidad de al menos 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %) con respecto a la secuencia de aminoácidos identificada mediante cualquiera de las SEQ ID NO: 24-28 o 33 (Tabla 11).
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico de MERS-CoV está codificado con una secuencia de ácido nucleico identificada mediante cualquiera de las SEQ ID NO: 20-23 (Tabla 10).
En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN de MERS-CoV (por ejemplo, ARNm) está codificado por una secuencia de ácido nucleico, o un fragmento de una secuencia de nucleótidos, identificado por cualquiera de las SEQ ID NO: 20-23 (Tabla 10). En algunas realizaciones, al menos un polinucleótido de ARN (por ejemplo, ARNm) de MERS-CoV comprende una secuencia de ácido nucleico, o un fragmento de una secuencia de nucleótidos, identificado por cualquiera de las SEQ ID NO: 65-68 (Tabla 10).
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico se obtiene de la cepa de MERS-CoV Riyadh_14_2013, 2cEMC/2012 o Hasa_1_2013.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una proteína estructural de SARS-CoV. En algunas realizaciones, la proteína estructural de Sa Rs -CoV es una proteína espicular (S). En algunas realizaciones, la proteína estructural de sARS-CoV es un subconjunto S1 o un subconjunto S2 de la proteína espicular (S) o un fragmento inmunógeno de la misma.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico de SARS-CoV comprende una secuencia de aminoácidos que se identifica mediante cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 32 o 34 (Tabla 11). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido antigénico del SARS-CoV es, o es un fragmento de, o es un homólogo o variante que tiene al menos el 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % % de identidad con la secuencia de aminoácidos identificada por cualquiera de SEQ ID NO: 29, 32 o 34 (Tabla 11).
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico es una proteína estructural de HCoV-OC43. En algunas realizaciones, la proteína estructural de HCoV-OC43 es una proteína espicular (S). En algunas realizaciones, la proteína estructural de HCoV-OC43 es un subconjunto S1 o un subconjunto S2 de la proteína espicular (S) o un fragmento inmunógeno de la misma.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico de HCoV-OC43 comprende una secuencia de aminoácidos que se identifica mediante cualquiera de las SEQ ID NO: 30 (Tabla 11). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido antigénico HCoV-OC43 es, o es un fragmento de, o es un homólogo o variante que tiene al menos el 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % % de identidad con la secuencia de aminoácidos identificada por cualquiera de SEQ ID NO: 30 (Tabla 11).
En algunas realizaciones, un polipéptido antigénico es una proteína estructural de HCoV-HKU1. En algunas realizaciones, la proteína estructural de HCoV-HKU1 es una proteína espicular (S). En algunas realizaciones, la proteína estructural HCoV-HKU1 es un subconjunto S1 o un subconjunto S2 de la proteína espicular (S) o un fragmento inmunogénico de la misma.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico de HCoV-HKU1 comprende una secuencia de aminoácidos identificada por cualquiera de SEQ ID NO: 31 (Tabla 11). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido antigénico HCoV-HKU1 es, o es un fragmento de, o es un homólogo o variante que tiene al menos el 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % % de identidad con la secuencia de aminoácidos identificada por cualquiera de SEQ ID NO: 31 (Tabla 11).
En algunas realizaciones, un marco de lectura abierto de una vacuna de ARN (es decir, ARNm) se optimiza por codones.
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) comprende además un adyuvante.
Las Tablas 4, 7, 12 y 15 proporcionan los números de acceso de interés del Centro nacional de información de biotecnología (NCBI). Debe entenderse que la frase “una secuencia de aminoácidos de las Tablas 4, 7, 12 y 15” hace referencia a una secuencia de aminoácidos identificada mediante uno o más números de acceso de NCBI enumerados en las Tablas 4, 7, 12 y 15.
Algunas realizaciones de la presente descripción proporcionan una vacuna que incluye al menos un polinucleótido de ácido ribonucleico (ARN) (por ejemplo, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico (es decir, al menos un polipéptido antigénico BetaCoV, por ejemplo, seleccionado de entre MERS -CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1), al menos una caperuza de extremo 5' y al menos una modificación química, formulada dentro de una nanopartícula de lípido,
En algunas realizaciones, una caperuza del extremo 5' es 7mG(5')ppp(5')NlmpNp.
En algunas realizaciones, al menos una modificación química se selecciona de entre.
pseudouridina, N1-metilpseudouridina, N1-etilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 5-metiluridina, 2-tio-1-metil-1-desaza- pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina ridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1 -metilpseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina y 2'-O-metil uridina. En algunas realizaciones, la modificación química está en la posición 5 del uracilo. En algunas realizaciones, la modificación química es una N1-metilpseudouridina. En algunas realizaciones, la modificación química es una N1-etilpseudouridina.
En la invención, una nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, un lípido modificado por PEG, un esterol y un lípido no catiónico. En algunas realizaciones, un lípido catiónico en un lípido catiónico ionizable y el lípido no catiónico es un lípido neutro. En algunas realizaciones, un lípido catiónico se selecciona de entre el grupo que consiste en 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-no-2-en-1-ilo) (L319), (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenicosa-12,15-dien-1-amina (L608) y N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptadecan-8-amina (L530).
En algunas realizaciones, el lípido es
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En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica comprende compuestos de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II), mencionados más adelante.
En algunas realizaciones, se formula una vacuna de ARN (es decir., ARNm) de virus respiratorios en una nanopartícula lipídica que comprende un compuesto que se selecciona de entre los Compuestos 3, 18, 20, 25, 26, 29, 30, 60, 108­ 112 y 122, mencionados más adelante.
Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una vacuna que incluye al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico (es decir, al menos un polipéptido antigénico BetaCoV, por ejemplo, seleccionado de entre MERS- CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1), donde al menos el 80 % (por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %) del uracilo en el marco de lectura abierto tiene una modificación química, en la que la vacuna se formula en una nanopartícula lipídica (es decir, una nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, un lípido modificado con PEG, un colesterol y un lípido no catiónico).
En algunas realizaciones, 100 % del uracilo en el marco de lectura abierto tiene una modificación química. En algunas realizaciones, una modificación química se encuentra en la posición 5 del uracilo. En algunas realizaciones, una modificación química es una N1-metil pseudouridina. En algunas realizaciones, 100 % del uracilo del marco de lectura abierto tiene una N1-metil pseudouridina en la posición 5 del uracilo.
En algunas realizaciones, un marco de lectura abierto de un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) codifica al menos dos polipéptidos antigénicos (es decir, al menos dos polipéptidos antigénicos BetaCoV, por ejemplo, seleccionados de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV -229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1). En algunas realizaciones, el marco de lectura abierto codifica al menos cinco o al menos diez polipéptidos antigénicos. En algunas realizaciones, el marco de lectura abierto codifica al menos 100 polipéptidos antigénicos. En algunas realizaciones, el marco de lectura abierto codifica 2-100 polipéptidos antigénicos.
En algunas realizaciones, una vacuna comprende al menos dos polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm), cada uno con un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico (es decir, al menos un polipéptido antigénico BetaCoV, por ejemplo, seleccionado de entre m Er S-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1). En algunas realizaciones, la vacuna comprende al menos cinco o al menos diez polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm), cada uno de los cuales tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico o un fragmento inmunogénico del mismo. En algunas realizaciones, la vacuna comprende al menos al menos 100 polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm), cada uno de los cuales tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico. En algunas realizaciones, la vacuna comprende 2-100 polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm), donde cada uno tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico (es decir, al menos un polipéptido antigénico BetaCoV, por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1,) se fusiona con un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal se selecciona de entre: un péptido señal HulgGk (METPAQLLFLLLLWLPDTTG; SEQ ID NO: 15); péptido señal epsilon-1 de cadena pesada de IgE (MDWTWILFLVa Aa TRVHS; SEQ ID NO: 16); Secuencia de señal PRM de encefalitis japonesa (MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS; SEQ ID NO: 17), secuencia de señal de proteína VSVg (MKCLLYLAFLFIGVNCA; SEQ ID NO: 18) y secuencia de señal JEV de encefalitis japonesa (MWLVs La IVTACAGA; SeQ ID NO: 19).
En algunas realizaciones, el péptido señal se fusiona al extremo N de al menos un polipéptido antigénico. En algunas realizaciones, un péptido señal se fusiona al extremo C de al menos un polipéptido antigénico.
En algunas realizaciones, al menos un polipéptido antigénico (es decir, al menos un polipéptido antigénico BetaCoV, por ejemplo, seleccionado de MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1,) comprende un sitio de glicosilato unido a N mutado.
La invención proporciona una vacuna de ARNm como se establece en las reivindicaciones, formulada en una nanopartícula lipídica.
En algunas realizaciones, la nanopartícula tiene un diámetro medio de 50-200 nm. En algunas realizaciones, el lípido catiónico en un lípido catiónico ionizable y el lípido no catiónico es un lípido neutro. En algunas realizaciones, el lípido catiónico se selecciona de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-(('t-(dimetiliamino)butanoil)o)(y)heptadecanodioato (L319).
En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica comprende compuestos de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II), tal como se menciona más adelante.
En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica comprende los Compuestos 3, 18, 20, 25, 26, 29, 30, 60, 108­ 112 o 122, tal como se menciona más adelante.
En algunas realizaciones, la nanopartícula tiene un valor de polidispersidad menor que 0,4 (por ejemplo, menor que 0,3, 0,2 o 0,1).
En algunas realizaciones, la nanopartícula tiene una carga neutra neta a un valor de pH neutro.
En algunas realizaciones, la vacuna de virus respiratorios es multivalente.
Algunos aspectos de la presente descripción proporcionan procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto cualquiera de las vacunas de ARN (p. ej., ARNm) que se proporcionan en esta invención en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune específica de antígeno,
En algunos aspectos, una respuesta inmune específica de antígeno comprende una respuesta de células T o una respuesta de células B,
En algunos aspectos, un procedimiento para producir una respuesta inmune específica de antígeno comprende administrar a un sujeto una dosis única (sin dosis de refuerzo) de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de la presente divulgación.
En algunos aspectos, un procedimiento comprende además administrar al sujeto una segunda dosis (refuerzo) de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm). Pueden administrarse dosis adicionales de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm).
En algunos aspectos, los sujetos presentan una tasa de seroconversión de al menos el 80 % (p. ej., al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %) después de la primera dosis o la segunda dosis (refuerzo) de la vacuna. La seroconversión es el período de tiempo durante el cual se desarrolla un anticuerpo específico y se torna pasible de detección en la sangre. Después de producirse la seroconversión, un virus puede detectarse en análisis de sangre en búsqueda del anticuerpo. Durante una infección o inmunización, los antígenos ingresan en la sangre y el sistema inmune comienza a producir anticuerpos como respuesta. Antes de la seroconversión, el antígeno en sí puede ser detectable o no, pero los anticuerpos se consideran ausentes. Durante la seroconversión, los anticuerpos están presentes, pero aún no pueden detectarse. En cualquier momento luego de la seroconversión, los anticuerpos pueden detectarse en la sangre, lo que indica una infección anterior o actual.
En algunos aspectos, la vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) se administra a un sujeto mediante inyección intradérmica o intramuscular.
Algunos aspectos de la presente descripción proporcionan procedimientos para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto, incluida la administración a un sujeto de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto. Las respuestas inmunes específicas de antígeno en un sujeto pueden determinarse, en algunos aspectos, analizando el título de anticuerpos (para el t'tulo de un anticuerpo que se une a un polipéptido antigénico hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV) después de la administración al sujeto de cualquiera de las vacunas de ARN (p. ej., ARNm) de la presente divulgación. En algunos aspectos, el nivel de anticuerpos anti-polipéptido antigénico producido en el sujeto aumenta al menos 1 log en relación con un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en el sujeto aumenta 1-3 log con respecto a un control.
En algunos aspectos, el título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en un sujeto aumenta al menos 2 veces con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en el sujeto aumenta al menos 5 veces con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en el sujeto aumenta al menos 10 veces con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en el sujeto aumenta 2-10 veces con respecto a un control.
En algunos aspectos, el control es un título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en un sujeto al que no se administró una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción. En algunos aspectos, el control es un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto al que se le ha administrado la vacuna viva atenuada o inactivada hMPV, PiV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (ver, por ejemplo, Ren J. y col. J of Gen. Virol 2015; 96: 1515-1520), o donde el control es un nivel de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto al que se le ha administrado una vacuna de proteína hMPV, PiV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada. En algunos aspectos, el control es un nivel de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto al que se le administró una vacuna de partículas similares a virus (VLP) hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (ver, Cox RG ol, J \1rol 2014 Jun; 88(11): 6368-6379).
En algunos aspectos de la divulgación, una vacuna de ARN (p. ej., ARNm) de la presente divulgación se administra a un sujeto en una cantidad efectiva (una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune). En algunos aspectos, la cantidad efectiva es una dosis equivalente a una reducción de al menos 2 veces, al menos 4 veces, al menos 10 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces en la dosis de atención estándar de un hMPV recombinante, PIV3, RSV, MeV y/ o vacuna de proteína BetaCoV, donde el nivel de anticuerpos anti-polipéptido antigénico producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpos anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto de control al que se le administró la dosis de atención estándar de un hMPV recombinante, PIV3, RSV, MeV y/o o vacuna proteica BetaCoV, una vacuna proteica purificada hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV, una vacuna viva atenuada hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV, una vacuna inactivada hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV o una vacuna hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV VLP. En algunos aspectos, la cantidad efectiva es una dosis equivalente a una reducción de 2-1000 veces de la dosis de estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante, donde el título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en un sujeto de control al que se administró la dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante, una vacuna de proteína hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV purificada, una vacuna de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV atenuado vivo, una vacuna de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV inactivado o una vacuna VLP de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV.
En algunos aspectos, el control es un título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en un sujeto al que se administró una vacuna con partículas similares a virus (VLP) que comprende proteínas estructurales de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV.
En algunas realizaciones, la vacuna ARNm de la invención se formula en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune específica del antígeno en un sujeto.
En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis total de 25 |jg a 1000 |jg o de 50 |jg a 1000 |jg. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis total de 100 jig. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis de 25 |jg administrada al sujeto un total de dos veces. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis de 100 jg administrada al sujeto un total de dos veces. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis de 400 jg administrada al sujeto un total de dos veces. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis de 500 jg administrada al sujeto un total de dos veces.
En algunas realizaciones, la efectividad (o eficacia) de una vacuna de ARNm es mayor que 60 %.
La efectividad de la vacuna se puede evaluar mediante el uso de análisis estándar (véase, por ejemplo., Weinberg y col., J Infect Di5, 2010 Jun 1;201(11):1607-10). Por ejemplo, la efectividad de la vacuna se puede medir mediante ensayos clínicos controlados, aleatorios y de doble ciego. La efectividad de la vacuna puede expresarse como una reducción proporcional en la tasa de ataque (AR) entre las cohortes de estudio sin vacunar (ARU) y vacunadas (ARV) y puede calcularse a partir del riesgo relativo (RR) de enfermedad entre el grupo vacunado con el uso de las siguientes fórmulas:
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Asimismo, la efectividad de la vacuna puede evaluarse utilizando análisis estándar (ver, por ejemplo, Weinberg y coi, J Infect Di5, 2010 Jun 1;201(11):1607-10), la efectividad de la vacuna es una evaluación de cómo una vacuna (que ya puede haber demostrado tener una alta efectividad) reduce la enfermedad en una población. Esta medida puede evaluar el balance neto de beneficios y efectos adversos de un programa de vacunación, no solo la vacuna en sí, en condiciones de campo naturales en lugar de en un ensayo clínico controlado. La efectividad de la vacuna es proporcional a la efectividad (potencia) de la vacuna, pero también se ve afectada por qué tan bien están inmunizados los grupos diana de la población, así como por otros factores no relacionados con la vacuna que influyen en los resultados 'reales' de hospitalizaciones, visitas ambulatorias, o costos. Por ejemplo, se puede utilizar un análisis retrospectivo de casos y controles, en el que se comparan las tasas de vacunación entre un conjunto de casos infectados y controles apropiados. La efectividad de la vacuna se puede expresar como una diferencia de tasas, con el uso de la razón de probabilidades (OR) para desarrollar infección a pesar de la vacunación:
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En algunas realizaciones, la efectividad (o efectividad) de una vacuna de ARN (es decir, ARNm) es de al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 % o al menos 90 %.
En algunas realizaciones, la vacuna inmuniza al sujeto contra BetaCoV (p. ej., seleccionados de entre MERS-Co V, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1), por hasta 2 años. En algunas realizaciones, la vacuna inmuniza al sujeto contra BetaCoV (p. ej., seleccionados de entre MERS-Co V, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1), durante más de 2 años, más de 3 años, más de 4 años o durante 5-10 años.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene aproximadamente 5 años de edad o menos. Por ejemplo, el sujeto puede tener una edad de aproximadamente 1 año a aproximadamente 5 años (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 5 o 5 años), o una edad de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 1 año (por ejemplo, aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses). En algunas realizaciones, el sujeto tiene aproximadamente 12 meses o menos (por ejemplo, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 meses o 1 mes). En algunas realizaciones, el sujeto tiene aproximadamente 6 meses de edad o menos.
En algunas realizaciones, el sujeto nació a término (por ejemplo, aproximadamente 37-42 semanas). En algunas realizaciones, el sujeto nació de forma prematura, por ejemplo, a aproximadamente 36 semanas de gestación o menos (por ejemplo, aproximadamente 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26 o 25 semanas). Por ejemplo, el sujeto puede haber nacido a aproximadamente 32 semanas de gestación o antes. En algunas realizaciones, el sujeto nació de forma prematura de aproximadamente 32 semanas a aproximadamente 36 semanas de gestación. En dichos sujetos, puede administrarse una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) en una etapa posterior de la vida, por ejemplo, a la edad de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 5 años, o mayor.
En algunas realizaciones, el sujeto está embarazado (por ejemplo, en el primer, segundo o tercer trimestre) cuando se le administra una vacuna de ARN (es decir, ARNm). Por lo tanto, la presente descripción proporciona vacunas de ARN (es decir, ARNm) para la inmunización materna, para mejorar la transmisión de la madre al hijo de la protección contra el virus.
En algunas realizaciones, el sujeto es un adulto joven entre las edades de aproximadamente 20 años y aproximadamente 50 años (por ejemplo, aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 años de edad).
En algunas realizaciones, el sujeto es sujeto anciano de aproximadamente 60 años de edad, aproximadamente 70 años de edad de edad, o mayor (por ejemplo, aproximadamente 60, 65, 70, 75, 80, 85 o 90 años de edad).
En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad pulmonar crónica (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o asma). Las dos formas de EPOC incluyen bronquitis crónica, que implica tos con mucosidad durante períodos prolongados, y enfisema, que implica daño a los pulmones con el tiempo. Por lo tanto, un sujeto al que se le administra una vacuna de ARN (es decir, ARNm) puede tener bronquitis crónica o enfisema.
En algunas realizaciones, el sujeto ha estado expuesto a BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1); el sujeto está infectado con BetaCoV (p. ej., seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1); o el sujeto está en riesgo de infección por BetaCoV (p. ej., seleccionado de entre MERS-Co V, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, el sujeto está inmunocomprometido (tiene un sistema inmune deficiente, por ejemplo, tiene un trastorno inmune o un trastorno autoinmune).
En algunas realizaciones, las vacunas de ácido nucleico descritas en esta invención están modificadas químicamente. En otras realizaciones, las vacunas de ácido nucleico no están modificadas.
La descripción se refiere además a una composición o procedimiento para vacunar a un sujeto que comprende administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico donde una dosis de entre 10 pg/kg y 400 pg/kg de la vacuna de ácido nucleico se administra al sujeto. En algunos aspectos, la dosis del polinucleótido de ARN es de 1-5 ug, 5-10 ug, 10-15 ug, 15-20 ug, 10-25 ug, 20-25 pg, 20-50 pg, 30-50 pg, 40-50 pg, 40-60 pg, 60-80 pg, 60-100 pg, 50-100 pg, 80-120 pg, 40-120 pg, 40-150 pg, 50-150 pg, 50-200 pg, 80-200 pg, 100-200 pg, 120-250 pg, 150-250 pg, 180-280 pg, 200-300 pg, 50-300 pg, 80-300 pg, 100-300 pg, 40-300 pg, 50-350 pg, 100-350 pg, 200-350 pg, 300­ 350 pg, 320-400 pg, 40-380 pg, 40-100 pg, 100-400 pg, 200-400 pg o 300-400 pg por dosis. En algunos aspectos, la vacuna de ácido nucleico se administra al sujeto mediante inyección intradérmica o intramuscular. En algunos aspectos, la vacuna de ácido nucleico se administra al sujeto el día cero. En algunos aspectos, se administra una segunda dosis de la vacuna de ácido nucleico al sujeto el día veintiuno.
En algunos aspectos, se incluye una dosis de 25 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, se incluye una dosis de 100 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, se incluye una dosis de 50 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, se incluye una dosis de 75 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, se incluye una dosis de 150 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, se incluye una dosis de 400 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, se incluye una dosis de 200 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, el polinucleótido de ARN se acumula aun nivel 100 veces mayor en el ganglio linfático local en comparación con el ganglio linfático distal. En otros aspectos, la vacuna de ácido nucleico se modifica químicamente y en otros aspectos, la vacuna de ácido nucleico no se modifica químicamente.
La descripción se relaciona además con la vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico, en donde el polinucleótido de ARN no incluye un elemento de estabilización, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde un adyuvante no está incluido en la vacuna. En algunos aspectos, el elemento de estabilización es una horquilla de histona. En algunos aspectos, el elemento de estabilización es una secuencia de ácido nucleico que tiene un mayor contenido de GC en relación con la secuencia de tipo salvaje.
La descripción se relaciona además con vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico, donde el polinucleótido de ARN está presente en la formulación para la administración in vivo a un huésped, lo que confiere un nivel superior de anticuerpos al criterio de seroprotección para el primer antígeno para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. En algunos aspectos, el título de anticuerpos producido por las vacunas de ARNm de la divulgación es un nivel de anticuerpos neutralizantes. En algunos aspectos, el título de anticuerpos neutralizantes es mayor que el de una vacuna proteica. En otros aspectos, el título de anticuerpos neutralizantes producido por las vacunas de ARNm de la invención es mayor que el de una vacuna de proteínas con adyuvante. En otros aspectos, el título de anticuerpos neutralizantes producido por las vacunas de ARNm de la divulgación es 1.000-10.000, 1.200-10.000, 1.400-10.000, 1.500-10.000, 1.000-5.000, 1.000-4.000, 1.800-10.000, 2.000-10.000, 2.000-5.000, 2.000-3.000, 2.000-4.000, 3.000-5.000, 3.000­ 4.000, o 2.000-2.500. Un título de neutralización generalmente se expresa como la dilución de suero más alta requerida para lograr una reducción del 50 % en el número de placas.
También se describen vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico, donde el polinucleótido de ARN está presente en una formulación para la administración in vivo a un huésped para provocar un t'tulo de anticuerpos alto más duradero que un título de anticuerpos provocado por una vacuna de ARNm que tiene un elemento estabilizador o formulada con un adyuvante y que codifica el primer polipéptido antigénico. En algunos aspectos, el polinucleótido de ARN se formula para producir anticuerpos neutralizantes dentro de una semana de una única administración. En algunos aspectos, el adyuvante se selecciona de entre un péptido catiónico y un ácido nucleico inmunoestimulador. En algunos aspectos, el péptido catiónico es protamina.
La descripción se refiere además a vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que comprende al menos una modificación química u opcionalmente ninguna modificación de nucleótidos, codificando el marco de lectura abierto un primer polipéptido antigénico, donde el polinucleótido de ARN está presente en la formulación. para la administración in vivo a un huésped de manera que el nivel de expresión del antígeno en el huésped exceda significativamente el nivel de expresión del antígeno producido por una vacuna de ARNm que tiene un elemento estabilizador o formulada con un adyuvante y que codifica el primer polipéptido antigénico.
La descripción se refiere además a vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que comprende al menos una modificación química u opcionalmente ninguna modificación de nucleótidos, el marco de lectura abierto codifica un primer polipéptido antigénico, donde la vacuna tiene al menos 10 veces menos polinucleótido de ARN de lo que se requiere para que una vacuna de ARNm sin modificar produzca un nivel de anticuerpos equivalente. En algunos aspectos, el polinucleótido de ARN está presente en una dosis de 25 a 100 microgramos.
La divulgación incluye además procedimientos para crear, mantener o restaurar la memoria antigénica a una cepa de virus respiratorio en un individuo o población de individuos que comprende administrar a dicho individuo o población una vacuna de ácido nucleico de refuerzo de la memoria antigénica que comprende (a) al menos un polinucleótido de ARN, dicho polinucleótido que comprende al menos una modificación química u opcionalmente ninguna modificación de nucleótidos y dos o más marcos de lectura abiertos optimizados por codones, codificando dichos marcos de lectura abiertos un conjunto de polipéptidos antigénicos de referencia, y (b) opcionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la vacuna se administra al individuo a través de una ruta seleccionada de entre el grupo que consiste en administración intramuscular, administración intradérmica y administración subcutánea. En algunos aspectos, el paso de administración comprende poner en contacto un tejido muscular del sujeto con un dispositivo adecuado para la inyección de la composición. en algunos ins En ocasiones, la etapa de administración comprende poner en contacto un tejido muscular del sujeto con un dispositivo adecuado para la inyección de la composición en combinación con la electroporación.
La divulgación incluye además procedimientos para vacunar a un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis única de entre 25 ug/kg y 400 ug/kg de una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico en una cantidad efectiva para vacunar al sujeto.
La descripción se refiere además a vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que comprende al menos una modificación química, codificando el marco de lectura abierto un primer polipéptido antigénico, donde la vacuna tiene al menos 10 veces menos polinucleótido de ARN que el requerido. para que una vacuna de ARNm sin modificar produzca un nivel de anticuerpos equivalente. En algunos aspectos, el polinucleótido de ARN está presente en una dosis de 25 a 100 microgramos.
La descripción se relaciona además con vacunas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido de ARN formulado con LNP (Lipid Nano Particles - Nano Partículas Lipídicas) que tiene un marco de lectura abierto que no comprende modificaciones de nucleótidos (sin modificar), el marco de lectura abierto codifica un primer polipéptido antigénico, donde la vacuna tiene al menos 10 veces menos ARN polinucleótido que el requerido para una vacuna de ARNm no modificada no formulada en un LNP para producir un título de anticuerpo equivalente. En algunos aspectos, el polinucleótido de ARN está presente en una dosis de 25 a 100 microgramos.
Los datos presentados en los Ejemplos demuestran respuestas inmunes mejoradas significativas usando las formulaciones de la invención. Tanto las vacunas de ARN químicamente modificadas como las no modificadas son útiles según la invención. Sorprendentemente, en contraste con los informes de la técnica anterior de que era preferible usar ARNm no modificado químicamente formulado en un vehículo para la producción de vacunas, en esta invención se describe que las vacunas de ARNm-LNP modificadas químicamente requerían una dosis de ARNm efectiva mucho más baja que el ARNm no modificado, es decir, diez veces menos que el ARNm no modificado cuando se formula en vehículos distintos de LNP. Tanto las vacunas de ARN químicamente modificadas como las no modificadas de la invención producen mejores respuestas inmunes que las vacunas de ARNm formuladas en un vehículo lipídico diferente.
La descripción incluye además un procedimiento para tratar a un sujeto anciano de 60 años o más que comprende administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico en una cantidad efectiva para vacunar al sujeto.
La descripción incluye un procedimiento para tratar aun sujeto joven de 17 años o menos que comprende administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico de virus respiratorio en una cantidad efectiva para vacunar al sujeto.
La descripción abarca un procedimiento para tratar a un sujeto adulto que comprende administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico de virus respiratorio en una cantidad efectiva para vacunar al sujeto.
La divulgación incluye un procedimiento para vacunar a un sujeto con una vacuna combinada que incluye al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos respiratorios donde la dosis de la vacuna es una dosis terapéutica combinada donde la dosis de cada ácido nucleico individual que codifica un antígeno es una sub dosificación terapéutica. En algunos aspectos, la dosis combinada es de 25 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, la dosis combinada es de 100 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, la dosis combinada es de 50 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, la dosis combinada es de 75 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, la dosis la dosis combinada es de 150 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, la dosis combinada es de 400 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunos aspectos, la dosis subterapéutica la dosis de cada ácido nucleico individual que codifica un antígeno es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 microgramos. En otros aspectos, la vacuna de ácido nucleico se modifica químicamente y en otras realizaciones, la vacuna de ácido nucleico no se modifica químicamente.
En aspectos preferidos, las vacunas de la invención (es decir, vacunas de ARNm encapsuladas con LNP) producen profilácticamente- y/o niveles terapéuticamente eficaces, concentraciones y/o niveles de anticuerpos específicos de antígeno en la sangre o el suero de un sujeto vacunado. Tal como se define en esta invención, el término título de anticuerpos se refiere a la cantidad de anticuerpo específico de antígeno que se produce en un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano. En realizaciones ejemplares, el título de anticuerpos se expresa como el inverso de la mayor dilución (en una dilución en serie) que todavía da un resultado positivo. En realizaciones ejemplares, el nivel de anticuerpos se determina o mide mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En realizaciones ejemplares, el nivel de anticuerpos se determina o mide mediante un ensayo de neutralización, por ejemplo, mediante un ensayo de microneutralización. En ciertos aspectos, la medición del nivel de anticuerpos se expresa como una relación, como 1:40,1:100, etc.
En realizaciones ejemplares de la invención, una vacuna efectiva produce un título de anticuerpos mayor que 1:40, mayor que 1:100, más grande que 1:400, más grande que 1:1000, más grande que 1:2000, más grande que 1:3000, más grande que 1:4000, más grande que 1:500, más grande que 1:6000, más grande que 1:7500, más grande que 1:10000. En realizaciones ejemplares, el nivel de anticuerpos se produce o se alcanza 10 días después de la vacunación, 20 días después de la vacunación, 30 días después de la vacunación, 40 días después de la vacunación o 50 o más días después de la vacunación. En realizaciones ejemplares, el nivel se produce o se alcanza después de una dosis única de vacuna administrada al sujeto. En otras realizaciones, el título se produce o se alcanza después de múltiples dosis, por ejemplo, después de una primera y una segunda dosis (por ejemplo, una dosis de refuerzo).
En aspectos ejemplares de la invención, los anticuerpos específicos de antígeno se miden en unidades de pg/ml o se miden en unidades de IUIL (Unidades Internacionales por litro) o mlU/ml (mili Unidades Internacionales por ml). En realizaciones ejemplares de la invención, una vacuna efectiva produce >0,5 pg/ml, >0,1 pg/ml, >0,2 pglml, >0,35 pg/ml, >0,5 pg/ml, >1 pg/ml, >2 pg/ml, >5 pg/ml o >10 pg/ml. En realizaciones ejemplares de la invención, una vacuna efectiva produce >10 mlU/ml, >20 mlU/ml, >50 mlU/ml, >100 mlU/ml, >200 mlU/ml, >500 mlU/ml o > 1000 mlU/ml. En realizaciones ejemplares, el nivel de anticuerpos se produce o se alcanza 10 días después de la vacunación, 20 días después de la vacunación, 30 días después de la vacunación, 40 días después de la vacunación o 50 o más días después de la vacunación. En realizaciones ejemplares, el nivel o la concentración se produce o se alcanza después de una sola dosis de vacuna administrada al sujeto. En otras realizaciones, el nivel o la concentración se produce o se alcanza después de múltiples dosis, por ejemplo, después de una primera y una segunda dosis (por ejemplo, una dosis de refuerzo). En realizaciones ejemplares, el nivel o la concentración de anticuerpos se determina o mide mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En realizaciones ejemplares, el nivel o la concentración de anticuerpos se determina o mide mediante un ensayo de neutralización, por ejemplo, mediante un ensayo de microneutralización.
Los detalles de varias realizaciones de la descripción se establecen en la descripción a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y a partir de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los objetivos, características y ventajas anteriores y otros serán evidentes a partir de la siguiente descripción de realizaciones particulares de la descripción, como se ilustra en los dibujos adjuntos en los que los mismos caracteres de referencia se refieren a las mismas partes en las diferentes vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala y, en cambio, se coloca un énfasis en la ilustración de los principios de diversas realizaciones de la divulgación.
La Figura 1 muestra un esquema de un ejemplo de una construcción de vacuna de ARN (p.ej., ARNm) de la presente descripción. La construcción representa una proteína de fusión de longitud completa de un virus sincitial respiratorio humano y metapneumovirus humano obtenida de cepas de tipo salvaje (The Journal of General Virology. 2008;89(Pt 12):3113-3118).
Las Figuras 2A-2C son gráficas que muestran los niveles de anticuerpos específicos de la proteína de fusión antihMPV en el suero de ratones inmunizados con vacunas de ARNm de hMPV al día 0 (Figura 2A), día 14 (Figura 2B) y día 35 (Figura 2C) luego de la inmunización. Los ratones se inmunizaron con una dosis única (2 pg o 10 pg) el día 0 y se les administró una dosis de refuerzo (2 pg o 10 pg) el día 21. Se detectaron anticuerpos específicos de la proteína de fusión hMPV en hasta 1:10000 dilución de suero el día 35 para ambas dosis.
Las Figuras 3A-3C son gráficas que muestran el resultado del isotipo de IgG en el suero de ratones inmunizados con vacunas de ARNm de hMPV. Los niveles de los anticuerpos de IgG2a (Figura 3A) e IgG1 (Figura 3B) específicos de la proteína de fusión de hMPV en el suero se midieron mediante ELISA. La Figura 3C muestra que la vacuna de ARNm de proteína de fusión de hMPV indujo una respuesta de citocina Th1/Th2 mixta con una predisposición a Th1.
La Figura 4 es una gráfica que muestra la neutralización in vitro de una cepa B2 de hMPV (TN/91-316) mediante el uso de los sueros de ratones inmunizados con una vacuna de ARNm que codifica la proteína de fusión de hMPV. El suero de ratón obtenido de ratones que recibieron una dosis de 10 |jg o 2 |jg contenía anticuerpos que neutralizaban el hMPV.
Las Figuras 5A-5C son gráficas que muestran una respuesta de citocina Th1 inducida por grupos de péptidos de fusión de hMPV (15-mers-5O (superposición)) en esplenocitos aislados de ratones inmunizados con las vacunas de ARNm de hMPV. Se utilizó medio sin virus como control negativo y se incluyó Concanavalina A (ConA, control positivo para la estimulación de esplenocitos). Las citocinas evaluadas incluyeron IFN-y (Figura 5A), IL-2 (Figura 5B) e IL12 (Figura 5C).
Las Figuras 6A-6E son gráficas que muestran la respuesta de citocina Th2 inducida por grupos de péptidos de fusión de hMPV (15-mers-50 (superposición)) en esplenocitos aislados de ratones inmunizados con las vacunas de ARNm de hMPV. Se utilizó medio sin virus como control negativo y se incluyó también Concanavalina A. Las citocinas evaluadas incluyeron IL-10 (Figura 6A), TNF-a (Figura 6B), IL4 (Figura 6C), IL-5 (Figura 6D) e IL-6 (Figura 6E).
Las Figuras 7A-7C son gráficas que muestran la respuesta de Th1 inducida por el virus de hMPV inactivado en esplenocitos aislados de ratones inmunizados con vacunas de ARNm de hMPV. Se utilizó medio sin virus como control negativo y se incluyó Concanavalina A. Las citocinas evaluadas incluyeron IFN-y (Figura 7A), IL-2 (Figura 7B) e IL12 (Figura 7C).
Las Figuras 8A-8E son gráficas que muestran la respuesta de Th2 inducida por el virus de hMPV inactivado en esplenocitos aislados de ratones inmunizados con las vacunas de ARNm de hMPV. Se utilizó medio sin virus como control negativo y se incluyó Concanavalina A. Las citocinas evaluadas incluyeron IL-10 (Figura 8A), TNF-a (Figura 8B), IL4 (Figura 8C), IL-5 (Figura 8D) e IL-6 (Figura 8E).
Las Figuras 9A-9B son gráficas que muestran los resultados de experimentos de exposición de ratas algodoneras. Se utilizaron dos dosis distintas de las vacunas de ARNm de hMPV (dosis de 2 jg o 10 jg ) para inmunizar a las ratas algodoneras antes de la exposición. Las vacunas de ARNm de hMPV redujeron el título viral en el pulmón y nariz de la rata algodonera, donde la dosis de 10 jg fue más efectiva en la reducción del título viral. El uso de una dosis de 10 jg produjo una protección del 100 % en el pulmón y una reducción de ~2 log en el título viral de la nariz. El uso de una dosis de 2 jg produjo una reducción de 1 log en el título viral del pulmón y ninguna reducción en el título viral de la nariz. Se administró la vacuna al Día 0 y se administró el refuerzo al Día 21.
La Figura 10 es una gráfica que muestra la histopatología del pulmón de las ratas algodoneras que recibieron vacunas de ARNm de hMPV. No se observó en grupos inmunizados una patología asociada con la enfermedad mejorada por la vacuna.
La Figura 11 es una gráfica que muestra títulos de anticuerpo de neutralización de hMPV en ratas algodoneras que recibieron vacunas de ARNm de hMPV (dosis de 2 jg o 10 jg ) los días 35 y 42 luego de la inmunización. La Figura 12 es una gráfica que muestra la carga viral en el pulmón y la nariz de ratas algodoneras expuestas a una cepa de hMPV/A2 luego de la inmunización con las vacunas de ARNm indicadas (vacuna de ARNm de hMPV o vacuna de combinación de ARNm de hMPV/PIV). Las ratas algodoneras vacunadas mostraron una reducción de las cargas virales del pulmón y la nariz luego de la exposición, en comparación con el control.
La Figura 13 es una gráfica que muestra la carga viral en el pulmón y la nariz de ratas algodoneras expuestas a una cepa de PIV3 luego de la inmunización con las vacunas de ARNm indicadas (vacuna de ARNm de PIV o vacuna de combinación de hMPV/PIV). Las ratas algodoneras vacunadas mostraron una reducción de las cargas virales del pulmón y la nariz luego de la exposición, en comparación con el control.
La Figura 14 es una gráfica que muestra títulos de anticuerpo de neutralización de hMPV en ratas algodoneras que recibieron dosificaciones distintas de vacunas de ARNm de hMPV o vacunas de ARNm de combinación de hMPV/PIV al día 42 después de la inmunización. Las dosis de la vacuna se indican en la Tabla 9.
La Figura 15 es una gráfica que muestra títulos de anticuerpo de neutralización de PIV3 en ratas algodoneras que recibieron dosificaciones distintas de vacunas de ARNm de PIV o vacunas de ARNm de combinación de hMPV/PIV al día 42 después de la inmunización. Las dosis de la vacuna se indican en la Tabla 9.
La Figura 16 es un gráfico que muestra la puntuación de histopatología pulmonar de ratas algodoneras inmunizadas con vacunas de ARNm de hMPV, vacunas de ARNm de PIV o vacunas de ARNm combinadas de hMPV/PIV como se indica en la Tabla 9. Se observó una baja incidencia de alevolitis y neumonía intersticial, lo que indica que no hay mejoría dependiente de anticuerpos (ADE) de enfermedades asociadas con hMPV.
La Figura 17 es una gráfica que muestra los títulos de anticuerpo de neutralización de MERS-CoV recíprocos en ratones inmunizados con la vacuna de ARNm de betacoronavirus que codifica la proteína espicular de longitud completa de MERS-CoV, a los días 0, 21, 42 y 56 después de la inmunización.
La Figura 18 es una gráfica que muestra los títulos de anticuerpo de neutralización de MERS-CoV recíprocos en ratones inmunizados con la vacuna de ARNm de betacoronavirus que codifica la proteína espicular de longitud completa de MERS-CoV o el subconjunto S2 de la proteína espicular. La proteína espicular de longitud completa indujo una respuesta inmunitaria más potente en comparación con el subconjunto de S2 por sí sola.
Las Figuras 19A-19C son gráficas que muestran la carga viral en la nariz y la garganta, el lavado broncoalveolar (BAL) o los pulmones de conejos blancos Nueva Zelanda 4 días después de la exposición a MERS-CoV. Los conejos blancos Nueva Zelanda se inmunizaron con una dosis de 20 jg (al día 0) o dos dosis de 20 jg (los días 0 y 21) de la vacuna de ARNm de MERS-CoV que codifica la proteína espicular de longitud completa antes de la exposición. La Figura 19A muestra que dos dosis de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjeron una reducción de 3 log de la carga viral en la nariz y llevaron a una protección completa en la garganta de los conejos blancos Nueva Zelanda. La Figura 19B muestra que dos dosis de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjeron una reducción de 4 log de la carga viral en el BAL de los conejos blancos Nueva Zelanda. La Figura 19C muestra que una dosis de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjo una reducción de 2 log de la carga viral, mientras que dos dosis de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjeron una reducción de la carga viral superior a 4 log en los pulmones de conejos blancos Nueva Zelanda.
Las Figuras 20A-20B son imágenes y gráficas que muestran la carga viral o virus replicantes detectados mediante PCR en los pulmones de conejos blancos Nueva Zelanda 4 días después de la exposición a MERS-CoV. Los conejos blancos Nueva Zelanda se inmunizaron con una única dosis de 20 |jg (al día 0, Grupo 1a) de la vacuna de ARNm de MERS-CoV que codifica la proteína espicular de longitud completa, dos dosis de 20 jg (a los días 0 y 21, Grupo 1b) de la vacuna de ARNm de MERS-CoV que codifica la proteína espicular de longitud completa, o placebo (Grupo 2) antes de la exposición. La Figura 20A muestra que dos dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjeron una reducción superior al 99 % (2 log) de los virus en los ratones de los conejos blancos Nueva Zelanda. La Figura 20B muestra que el grupo de conejos blancos Nueva Zelanda que recibió 2 dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV no tuvo ningún virus replicante de MERS-CoV detectable en sus pulmones.
La Figura 21 es una gráfica que muestra los títulos de anticuerpo de neutralización de MERS-CoV en conejos blancos Nueva Zelanda inmunizados con la vacuna de ARNm de MERS-CoV que codifica la proteína espicular de longitud completa. La inmunización de los conejos blancos Nueva Zelanda se llevó a cabo tal como se describe en las Figuras 21A-21C. Los resultados muestran que dos dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV indujeron una cantidad significativa de anticuerpos de neutralización contra MERS-CoV (EC50 entre 500-1000). El título de anticuerpo inducido por la vacuna de ARNm de MERS-CoV es 3-5 veces mejor que cualquier otra vacuna evaluada en el mismo modelo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente divulgación proporciona, en algunas realizaciones, vacunas que comprenden polinucleótidos de ARN (es.decir, ARNm) que codifican un polipéptido antigénico de betacoronavirus (p.ej., coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), SARS-CoV, coronavirus humano (HCoV)-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH (New Haven) y HCoV-HKU1) (ver, p.ej., Esper F. y col. Emerging Infectious Diseases, 12(5), 2006; y Pyrc K. y col. Journal of Virology, 81(7):3051-57, 2007). En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) comprende un adyuvante, tal como un adyuvante de flagelina, tal como se proporciona en esta invención.
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) (es decir, vacuna de ARN de BetaCoV), en algunas realizaciones, pueden usarse para inducir una respuesta inmune equilibrada, que comprende tanto inmunidad celular como humoral, sin muchos de los riesgos asociados con la vacunación de a Dn .
Metapneumovirus humano (hMPV)
hMPV comparte una homología sustancial con el virus respiratorio sincitial (RSV) en sus glicoproteínas de superficie. La proteína de fusión hMPV (F) está relacionada con otras proteínas de fusión de paramixovirus y parece tener regiones homólogas que pueden tener funciones similares. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de hMPV contiene elementos característicos de otras proteínas F de paramixovirus, inclusive un sitio de escisión putativo y posibles sitios de glicosilación unidos a N. Las proteínas de fusión de paramixovirus se sintetizan como precursores inactivos (F0) que las proteasas de la célula huésped escinden en los dominios F1 y F2 biológicamente activos para la fusión (ver, p.ej., Cseke G. y col. Journal of Virology 2007;81(2):698-707), hMPV tiene un sitio de escisión putativo, en contraste con los dos sitios establecidos para RSV F, y solo comparte una identidad de secuencia de aminoácidos del 34 % con RSV F. F2 es extracelular y está unido por disulfuro a F1. Las proteínas de fusión son glicoproteínas de tipo I que existen como trímeros, con dos dominios de repetición de héptada 4-3 en las regiones de extremo N y C de la proteína (HR1 y HR2), que forman hélices alfa superenrrolladas. Estas superhélices se unen de forma antiparalela cuando la proteína se somete a un cambio conformacional en el estado fusogénico. Hay un péptido de fusión hidrofóbico N proximal a la repetición de la heptada del extremo N, que se cree que se inserta en la membrana de la célula diana, mientras que la asociación de las repeticiones de la heptada acerca el dominio transmembrana, induciendo la fusión de la membrana (ver, p.ej., Baker, KA y col. Mol. Cell 1999;3:309-319).
Este mecanismo se ha propuesto para una cantidad de virus distintos, inclusive RSV, el virus de la influenza y el virus de la inmunodeficiencia humana. Las proteínas de fusión son determinantes antigénicas principales para todos los paramixovirus conocidos y para otros virus que poseen proteínas de fusión similares, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la influenza y el virus del Ébola.
Virus de parainfluenza humana de tipo 3 (PIV3)
Los virus de parainfluenza pertenecen a la familia Paramyxoviridae. Estos son virus envueltos con un genoma de ARN de cadena simple y sentido negativo. Los virus de la parainfluenza pertenecen a la subfamilia Paramyxoviridae, que se subdivide en tres géneros: Respirovirus (PIV-1, PIV-3 y virus Sendai (SeV)), Rubulavirus (PIV-2, PIV-4 y virus de las paperas) y Morbillivirus (virus del sarampión). virus de la peste bovina y virus del moquillo canino (CDV)). Su genoma, una molécula de ARN de sentido negativo con una longitud de ~15 500 nucleótidos, codifica dos glicoproteínas de envoltura, la hemaglutinina-neuraminidasa (HN), la proteína de fusión (F o F0), que se escinde en las subconjuntoes F1 y F2, una proteína de matriz (M), una proteína de nucleocápside (N) y varias proteínas no estructurales, inclusive la replicasa viral (L). Todos los virus de la parainfluenza, excepto el PIV-1, expresan una proteína V no estructural que bloquea la señalización de IFN en la célula infectada y, por lo tanto, actúa como un factor de virulencia (ver, p.ej., Nishio M y col. J Virol. 2008;82(13):6130-38).
PIV3 hemaglutinina-neuraminidasa (HN), una proteína estructural, se halla en la envoltura viral, donde es necesaria para el acoplamiento y la entrada a la célula. Reconoce a los receptores que contienen ácido siálico y se une a ellos en la superficie de la célula hospedadora. Como una neuroaminidasa, HN elimina el ácido siálico de partículas de virus, impidiendo la autoagregación del virus y promueve una expansión efectiva de este. Además, HN promueve la actividad de la proteína de fusión (F o F0), lo que contribuye a la penetración de la superficie de la célula hospedadora.
La proteína de fusión PIV3 (PIV3 F) se ubica en la envoltura viral, donde facilita la fusión viral y la entrada celular. La proteína F se encuentra inicialmente inactiva, pero la escisión proteolítica lleva a sus formas activas, F1 y F2, que se unen mediante enlaces disulfuro. Esto se produce cuando la proteína HN une su receptor sobre la superficie de la célula hospedadora. Durante fases tempranas de la infección, la glicoproteína F media la penetración de la célula hospedadora mediante la fusión de la envoltura viral a la membrana plasmática. En etapas posteriores de la infección, la proteína F facilita la fusión de las células infectadas con células no infectadas cercanas, lo que lleva a la formación de un sincitio y expansión de la infección.
La proteína de matriz (M) de PIV3 se halla dentro de la envoltura viral y contribuye al ensamblaje viral. Interactúa con la las glicoproteínas de envoltura y nucleocápside, donde facilita la gemación de virus de progenie mediante sus interacciones con sitios específicos sobre la cola citoplasmática de las glicoproteínas virales y nucleocápside. También desempeña un papel en el transporte de componentes virales hacia el sitio de gemación.
La fosfoproteína (P) de PIV3 y la proteína grande de polimerasa (L) de PIV3 se hallan en la nucleocápside, donde forman una parte del complejo de polimerasa de ARN. La proteína L, una polimerasa de ARN dependiente de ARN viral, facilita la transcripción genómica, mientras que los ribosomas de la célula hospedadora traducen el ARNm viral en proteínas virales.
PIV3 V es una proteína no estructural que bloquea la señalización de IFN en la célula infectada, y por lo tanto actúa como un factor de virulencia.
La nucleoproteína (N) de PIV3 encapsida el genoma en una relación de 1 N por 6 ribonucleótidos, lo que lo protege de las nucleasas. La nucleocápside (NC) tiene una estructura helicoidal. El ARN genómico encapsidado se denomina NC y funciona como plantilla para la transcripción y replicación. Durante la replicación, la encapsidación mediante PIV3 N se acopla a la síntesis de ARN y todos los productos de replicación son resistentes a las nucleasas. El PIV3 N se homomultimeriza para formar la nucleocápside y se une a ARN genómico viral. El PIV3 N se une a la proteína P y, de esta forma, coloca la polimerasa en la plantilla.
Virus sincitial respiratorio (RSV)
El RSV es un virus de ARN de cadena simple y sentido negativo del género Pneumovirinae. El virus está presente en al menos dos subgrupos antigénicos, conocidos como Grupo A y Grupo B, que se producen primordialmente a partir de diferencias en la superficie de las glicoproteínas G. Dos glicoproteínas superficiales de RSV (G y F) median el acoplamiento con y hacia las células del epitelio respiratorio. Las glicoproteínas superficiales F median la coalescencia de las células cercanas. Esto da como resultado la formación de células sincitiales. El RSV es la causa más común de bronquiolitis. La mayoría de los adultos infectados desarrolla síntomas similares a los de un resfrío leve, tales como congestión, fiebre baja y sibilancia. Los infantes y niños pequeños pueden padecer síntomas más graves, tales como bronquiolitis y neumonía. La enfermedad puede transmitirse entre seres humanos mediante el contacto con secreciones respiratorias.
El genoma del RSV codifica al menos tres glicoproteínas de superficie, incluidas F, G y SH, cuatro proteínas de la nucleocápside, incluidas L, P, N y M2, y una proteína de matriz, M. La glicoproteína F dirige la penetración viral mediante la fusión entre el virión y la membrana del huésped. La glicoproteína G es una glicoproteína transmembrana de tipo II y es la proteína principal de acoplamiento. SH es una proteína de membrana integral corta. La proteína de matriz M se halla en la capa interior de la bicapa lipídica y contribuye a la formación de viriones. Las proteínas de nucleocápside L, P, N y m 2 modulan la replicación y transcripción del genoma de RSV. Se cree que la glicoproteína G ata y estabiliza la partícula del virus en la superficie de las células epiteliales bronquiales, mientras que la glicoproteína F interactúa con los glicosaminoglicanos celulares para mediar la fusión y el suministro del contenido del virión del RSV a la célula huésped (Krzyzaniak MA y col. PLoS Pathog 2013;9(4)).
Virus del sarampión (MeV)
Las investigaciones epidemiológicas moleculares y la supervisión virológica contribuyen en particular al control y prevención del sarampión. Prácticamente la mitad de las muertes relacionadas con el sarampión a nivel mundial se produce en la India, pero los datos de supervisión virológica no están completos para muchas regiones del país. Estudios anteriores documentaron la presencia de los genotipos del virus del sarampión D4, D7 y D8 en India, y se detectaron los genotipos D5, D9, D11, H1 y G3 en países colindantes. Recientemente, se detectó el genotipo B3 del MeV en la India (Kuttiatt VS y col. Emerg Infect Dis. 2014;20(10): 1764-66).
El complejo de glicoproteína de los paramixovirus media la unión al receptor y la fusión de la membrana. En particular, la proteína de fusión (F) del MeV lleva a cabo la fusión de la membrana, luego de la unión al receptor mediante la proteína hemaglutinina (HA) (Muhlebach MD y col. Journal of Virology 2008; 82(22):11437-45). El gen MeV P codifica tres proteínas: P, un cofactor esencial de la polimerasa, y V y C, que tienen múltiples funciones, pero no son estrictamente necesarias para la propagación viral en células cultivadas. V comparte el dominio del extremo amino con P, pero tiene un dominio del extremo carboxilo de unión a cinc, mientras que C se traduce a partir de un marco de lectura superpuesto. La proteína C de MeV es un factor de infectividad. Durante la replicación, la proteína P une a las proteínas de nucleocápside (N) monoméricas que ingresan con su dominio del extremo amino y las coloca para su ensamblaje en la ribonucleocápside naciente. El dominio amino-terminal de la proteína P se despliega de forma nativa (Deveaux P y col. Journal of Virology 2004;78(21):11632-40).
Betacoronavirus (BetaCoVJ
MERS-CoV. MERS-CoV es un virus de ARN de cadena simple y sentido positivo del género Betacoronavirus. Los genomas se clasifican filogenéticamente en dos clados, clado A y clado B. Tiene un fuerte tropismo por las células epiteliales bronquiales no ciliadas, evade la respuesta inmunitaria innata y antagoniza la producción de interferón (IFN) en las células infectadas. La dipeptil peptidasa 4 (DDP4, también denominada CD26) se identificó como un receptor celular funcional para MERS-CoV. Su actividad enzimática no es necesaria para la infección, aunque su secuencia de aminoácidos se conserva en gran medida entre especies y se expresa en los riñones y epitelio bronquial humano. La mayoría de las personas infectadas desarrollan enfermedades respiratorias agudas graves, como fiebre, tos y dificultad para respirar, y el virus puede ser mortal. La enfermedad puede transmitirse entre humanos, generalmente entre aquellos en estrecho contacto.
El genoma de MERS-CoV codifica al menos cuatro proteínas accesorias únicas, tales como 3, 4a, 4b y 5, dos proteínas de replicasa (marco de lectura abierto 1a y 1b), y cuatro proteínas estructurales principales, inclusive las proteínas espicular (S), de envoltura (E), de nucleocápside (N) y de membrana (M) (Almazan F y col. MBio 2013;4(5):e00650-13). Las proteínas accesorias desempeñan funciones no esenciales en la replicación del MERS-CoV, pero probablemente sean proteínas estructurales o antagonistas del interferón, que modulan la patogenia y/o la efectividad de la replicación in vivo, como en el caso del SARS-CoV (Almazan F y col. MBio 2013;4(5):e00650-13; Totura AL y col. Curr Opin Virol 2012;2(3):264-75; Scobey T y col. Proc Natl Acad Sci USA 2013;110(40):16157-62). Las otras proteínas de MERS-CoV mantienen funciones distintas en la replicación del virus. La proteína E, por ejemplo, implica virulencia, y la eliminación del gen que codifica la E da como resultado virus con capacidad de replicación y defectos de propagación o virus atenuados (Almazan F y col. MBio 2013;4(5):e00650-13). La proteína S es particularmente esencial para mediar la unión del virus a las células que expresan el receptor dipeptidil peptidasa-4 (DPP4) a través del dominio de unión al receptor (RBD) en el subconjunto S1, mientras que el subconjunto S2 posteriormente media la entrada del virus a través de la fusión del virus y las membranas de las células diana (Li F. J Virol 2015;89(4):1954-64; Raj VS y col. Nature 2013;495(7440):251-4).
En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S. En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica el subconjunto S1 de la proteína S. En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica el subconjunto S2 de la proteína S.
En algunas realizaciones, una vacuna MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es.decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2), la proteína E, la proteína N y la proteína M.
En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2) y la proteína E. En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2) y la proteína N. En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2) y la proteína M.
En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2), la proteína E y la proteína M. En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2), la proteína E y la proteína N. En algunas realizaciones, una vacuna de MERS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2), la proteína M y la proteína N.
Una vacuna MERS-Co V puede comprender, por ejemplo, al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico MERS-Co V identificado por cualquiera de SEQ ID NO: 24-38 o 33 (Tabla 11; véanse también las secuencias de aminoácidos de la Tabla 12).
Una vacuna MERS-Co V puede comprender, por ejemplo, al menos un polinucleótido de ARN (es.decir, ARNm) codificado por un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) identificado por cualquiera de las SEQ ID NO: 20-23 (Tabla 10).
La presente divulgación no está limitada por una cepa particular de MERS-Co V. La cepa de MERS-Co V utilizada en una vacuna puede ser cualquier cepa de MERS-Co V. Ejemplos no limitantes de cepas de MERS-CoV para uso como proporcionaren esta invención incluir Riyadh_14_2013, y 2cEMC/2012, Hasa_1_2013.
SARS-CoV. El genoma de SARS-CoV incluye un ARN de cadena simple y positiva que tiene una longitud de aproximadamente 29.700 nucleótidos. La organización genómica general de SARS-CoV es similar a la de otros coronavirus. El genoma de referencia incluye 13 genes, que codifican al menos 14 proteínas. Dos marcos de lectura abiertos (ORF) grandes abarcan el 71 % del genoma. El resto tiene 12 posibles ORF, que incluyen genes para las proteínas estructurales S (espicular), E (envoltura pequeña), M (membrana) y N (nucleocápside). Otros posibles ORF codifican polipéptidos específicos de SARS-CoV putativos únicos que carecen de una similitud de secuencia obvia con respecto a proteínas conocidas. Se publicó un análisis detallado del genoma de SARS-CoV en J Mol Biol 2003; 331: 991-1004.
En algunas realizaciones, una vacuna de SARS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2), la proteína E, la proteína N y la proteína M.
En algunas realizaciones, una vacuna de SARS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es.decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2) y la proteína E. En algunas realizaciones, una vacuna contra el SARS-CoV de la presente divulgación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2) y la proteína N. En algunas realizaciones, una vacuna contra el SARS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2) y proteína M.
En algunas realizaciones, una vacuna contra el SARS-CoV de la presente divulgación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2), la proteína E y la proteína M. En algunas realizaciones, una vacuna contra el SARS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2), la proteína E y la proteína N. En algunas realizaciones, una vacuna de SARS-CoV de la presente descripción comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica la proteína S (S, S1 y/o S2), la proteína M y la proteína N.
Una vacuna contra el SARS-CoV puede comprender, por ejemplo, al menos un polinucleótido de ARN (es.decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico del SARS-CoV identificado por cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 32 o 34 ( Tabla 11; véanse también las secuencias de aminoácidos de la Tabla 12).
La presente divulgación no está limitada por una cepa particular de SARS-CoV. La cepa de SARS-CoV utilizada en una vacuna puede ser cualquier cepa de SARS-CoV.
HCoV-OC43. El coronavirus humano OC43 es un virus de ARN de cadena simple y sentido positivo envuelto de la especie Betacoronavirus-1 (género Betacoronavirus, subfamilia Coronavirinae, familia Coronaviridae, orden Nidovirales). Se han identificado cuatro genotipos de HCoV-OC43 (A a D), donde el genotipo D muy probablemente surge de la recombinación. La secuenciación completa del genoma de dos cepas de genotipo C y D y el análisis bootscan muestran eventos de recombinación entre los genotipos B y C en la generación del genotipo D. De las 29 cepas identificadas, ninguna pertenece al genotipo A más antiguo. Junto con HCoV-229E, un Las especies del género Alphacoronavirus, HCoV-OC43 se encuentran entre los virus conocidos que causan el resfriado común. Ambos virus pueden provocar infecciones graves del tracto respiratorio inferior, inclusive neumonía en infantes, adultos mayores e individuos inmunocomprometidos tales como aquellos que se someten a quimioterapia y aquellos con VIH-SIDa .
HCoV-HKU1. El coronavirus humano HKU1 (HCoV-HKU1) es un virus de ARN de cadena simple y sentido positivo con el gen HE, que lo distingue como un grupo 2, o betacoronavirus. Se descubrió en enero de 2005 en dos pacientes en Hong Kong. El genoma de HCoV-HKU1 es un ARN poliadenilado de 29.926 nucleótidos. El contenido de GC es de 32 %, el menor entre todos los coronavirus conocidos. La organización del genoma es la misma que la de otros coronavirus del grupo II, con el orden genético característico 1a, 1b, HE, S, E, M y N. Además, los genes de proteínas accesorias están presentes entre los genes S y E (ORF4) y en la posición del gen N (ORF8). El TRS presumiblemente está ubicado dentro de la secuencia MUCUAAAC, que precede a cada ORF excepto E. Como en el virus de la sialodacrioadenitis y el virus de la hepatitis del ratón (MHV), la traducción de la proteína E posiblemente ocurre a través de un sitio de entrada ribosómico interno. La región 3' no traducida contiene una estructura de horquilla prevista de forma inmediatamente posterior al ORF de N (posición de nucleótidos 29647 a 29711). Más hacia la parte posterior, se encuentra presente una estructura de pseudonudo en la posición de nucleótidos 29708 a 29760. Ambas estructuras de ARN se conservan en los coronavirus de grupo II y son esenciales para la replicación del virus.
HCoV-NL63. El genoma de ARN del coronavirus humano NL63 (HCoV-NL63) tiene 27.553 nucleótidos, con una cola poli(A) (Figura 1). Con un contenido de GC de 34 %, HCoV-NL63 tiene uno de los contenidos de GC menores de los coronavirus, para los cuales el contenido de GC se encuentra en el intervalo de 32 a 42 %. Las regiones no traducidas de los nucleótidos 286 y 287 se encuentran presentes en los extremos 5' y 3', respectivamente. Los genes que se prevé que codifican las proteínas S, E, M y N se hallan en la parte 3' del genoma de HCoV-NL63. El gen de h E, que se encuentra presente en algunos coronavirus del grupo II, se encuentra ausente, y hay solamente un ORF de proteína accesoria monocistriónica individual (ORF3) ubicado entre los genes de S y E. Se generan ARNm subgenómicos para todos los ORF (S, ORF3, E, M y N) y la secuencia nuclear del TRS de h CoV-NL63 se define como AACUAAA. Esta secuencia se ubica de forma anterior a cada ORF salvo en el caso del ORF de E, que contiene la secuencia nuclear subóptima AACUAUA. De manera interesante, una secuencia de 13 nucleótidos con una homología perfecta con respecto a la secuencia líder se encuentra en una posición anterior con respecto a la TRS subóptima de E. La hibridación de esta secuencia de 13 nucleótidos a la secuencia líder puede actuar como un mecanismo de compensación para la interacción alterada de líder-TRS/cuerpo-TRS.
HCoV-229E. El coronavirus humano 229E (HCoV-229E) es una especie de virus de ARN de sentido positivo y cadena simple del género Alfacoronavirus de la subfamilia Coronavirinae, de la familia Coronaviridae, del order Nidovirales. Junto con el coronavirus humano OC43, es responsable por la gripe común. HCoV-NL63 y HCoV-229E son dos de los cuatro coronavirus humanos que circulan en todo el mundo. Estos dos virus son únicos en su relación entre sí. De forma filogenética, los virus se relacionan más estrechamente entre sí que con cualquier otro coronavirus humano, pero comparten únicamente un 65 % de identidad de secuencia. Además, los virus utilizan receptores distintos para ingresar a su célula diana. HCoV-NL63 se asocia con la laringitis en niños, mientras que todos los signos sugieren que el virus probablemente causa la gripe común en adultos saludables. HCoV-229E es un virus probado de la gripe común en adultos saludables, de modo que es probable que ambos virus induzcan síntomas comparables en adultos, aunque difiera su modo de infección (HCoV-NL63 y HCoV-229E son dos de los cuatro coronavirus humanos que circulan a nivel mundial. De forma filogenética, los virus se relacionan más estrechamente entre sí que con cualquier otro coronavirus humano, pero comparten únicamente un 65 % de identidad de secuencia. Además, los virus utilizan receptores distintos para ingresar a su célula diana. HCoV-NL63 se asocia con la laringitis en niños, mientras que todos los signos sugieren que el virus probablemente causa la gripe común en adultos saludables. HCoV-229E es un virus probado de la gripe común en adultos saludables, de modo que es probable que ambos virus induzcan síntomas comparables en adultos, aunque difiera su modo de infección (Dijkman R. y col. J Formos Med Assoc. 2009 Apr;108(4):270-9),
Vacunas de combinación
Las realizaciones de la presente descripción también proporcionan vacunas de ARN (es.decir, ARNm) de combinación. Una “vacuna de ARN (es.decir, ARNm) de combinación” de la presente descripción hace referencia a una vacuna que comprende al menos un (es.decir, al menos 2, 3, 4 o 5) polinucleótido de ARN (es.decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica una combinación de cualesquiera dos o más (o todos) polipéptidos antigénicos seleccionados de entre polipéptidos antigénicos de hMPV, polipéptidos antigénicos de PIV3, polipéptidos antigénicos de RSV, polipéptidos antigénicos de MeV y polipéptidos antigénicos de BetaCoV (por ejemplo, seleccionados de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1). En la invención, al menos un polinucleótido de ARNm codifica al menos un polipéptido antigénico BetaCoV.
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es.decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es.decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de hMPV, un polipéptido antigénico de PIV3, un polipéptido antigénico de RSV, un polipéptido antigénico de MeV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de hMPV y un polipéptido antigénico de BetaCoV.
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es.decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de PIV3 y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de RSV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de MeV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoVHKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de hMPV, un polipéptido antigénico de PIV3, un polipéptido antigénico de RSV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (p.ej., seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de hMPV, un polipéptido antigénico de PIV3, un polipéptido antigénico de MeV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es.decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de hMPV, un polipéptido antigénico de RSV, un polipéptido antigénico de MeV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de PIV3, un polipéptido antigénico de RSV, un polipéptido antigénico de MeV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de hMPV, un polipéptido antigénico de PIV3 y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de hMPV, un polipéptido antigénico de RSV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de hMPV, un polipéptido antigénico de MeV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es.decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de PIV3, un polipéptido antigénico de RSV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es.decir, ARNm) de combinación comprende un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica un polipéptido antigénico de RSV, un polipéptido antigénico de MeV y un polipéptido antigénico de BetaCoV (por ejemplo, seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
Se encuentran comprendidas en esta descripción otras vacunas de combinación de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios.
Se ha descubierto que las vacunas de ARNm descritas en esta invención son superiores a las vacunas actuales en varios aspectos. En primer lugar, la administración de nanopartículas lipídicas (LNP) es superior a otras formulaciones que incluyen una estrategia de base de protamina descrita en la bibliografía y no se necesitan adyuvantes adicionales. El uso de LNP permite la administración efectiva de vacunas de ARNm químicamente modificadas o no modificadas. Además, se ha demostrado en esta invención que tanto las vacunas de ARNm formuladas con LNP modificadas como las no modificadas fueron superiores a las vacunas convencionales en un grado significativo. En algunas realizaciones, las vacunas de ARNm de la invención son superiores a las vacunas convencionales en un factor de al menos 10 veces, 20 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces.
Aunque se han hecho intentos para producir vacunas de ARN funcionales, incluidas vacunas de ARNm y vacunas de ARN autorreplicante, la efectividad terapéutica de estas vacunas de ARN aún no se ha establecido completamente. Sorprendentemente, los inventores han descubierto, según aspectos de la invención, una clase de formulaciones para administrar vacunas de ARNm in vivo que da como resultado respuestas inmunes significativamente mejoradas y, en muchos aspectos, sinérgicas, incluida la generación mejorada de antígenos y la producción de anticuerpos funcionales con capacidad de neutralización. Estos resultados se logran incluso cuando se administran dosis significativamente más bajas de ARNm en comparación con las dosis de ARNm utilizadas en otras clases de formulaciones basadas en lípidos. Las formulaciones de la invención han demostrado respuestas inmunes in vivo significativas e inesperadas suficientes para establecer la efectividad de las vacunas de ARNm funcional como agentes profilácticos y terapéuticos. Además, las vacunas de ARN autorreplicantes se basan en vías de replicación viral para entregar suficiente ARN a una célula para producir una respuesta inmunogénica. Las formulaciones de la invención no requieren replicación viral para producir suficiente proteína para dar como resultado una fuerte respuesta inmune. Por lo tanto, los ARNm de la invención no son ARN autorreplicantes y no incluyen componentes necesarios para la replicación viral.
La invención implica, en algunos aspectos, el sorprendente hallazgo de que las formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) mejoran significativamente la efectividad de las vacunas de ARNm, incluidas las vacunas de ARNm químicamente modificado. La efectividad de las vacunas de ARNm formuladas en LNP se examinó in vivo utilizando varios antígenos virales distintos y en una variedad de modelos animales diferentes. Los resultados presentados en esta invención demuestran la efectividad superior inesperada de las vacunas de ARNm formuladas en LNP sobre otras vacunas disponibles comercialmente.
Además de proporcionar una respuesta inmune mejorada, las formulaciones de la invención generan una respuesta inmune más rápida con menores dosis de antígeno que otras vacunas probadas. Las formulaciones de ARNm-LNP de la invención también producen respuestas inmunitarias cuantitativa y cualitativamente mejores que las vacunas formuladas en diferentes vehículos.
Los datos descritos en esta invención demuestran que las formulaciones de la invención produjeron mejoras inesperadas significativas sobre las vacunas antigénicas existentes. Además, las formulaciones de ARNm-LNP de la invención son superiores a otras vacunas incluso cuando la dosis de ARNm es más baja que otras vacunas.
Dos dosis de 20 |jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV LNP indujeron una cantidad significativa de anticuerpos de neutralización contra MERS-CoV (EC50 entre 500-1000). El título de anticuerpos inducidos por la vacuna de ARNm de MERS-CoV fue de 3 a 5 veces mejor que cualquier otra vacuna probada en el mismo modelo.
Las LNP usadas en los estudios descritos en esta invención se han utilizado anteriormente para administrar siRNA en varios modelos animales, así como en seres humanos. En vista de las observaciones realizadas en asociación con la administración de siRNA de formulaciones de LNP, el hecho de que LNP sean útiles en vacunas es bastante sorprendente. Se ha observado que la administración terapéutica de siRNA formulado en LNP provoca una respuesta inflamatoria indeseable asociada con una respuesta transitoria de IgM, lo que generalmente conduce a una reducción en la producción de antígenos y una respuesta inmunitaria comprometida. En contraste con los hallazgos observados con siRNA, el LNP- Se demuestra en esta invención que las formulaciones de ARNm de la invención generan niveles mejorados de IgG, suficientes para procedimientos profilácticos y terapéuticos en lugar de respuestas transitorias de IgM.
Ácidos nucleicos/Polinucleótidos
Las vacunas de virus respiratorios, tal como se proporciona en esta invención, comprenden al menos uno (uno o más) polinucleótidos de ácido ribonucleico (ARN) (es.decir, ARNm) que tienen un marco de lectura abierto que codifica al menos un BetaCoV (p. ej., seleccionado de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1). La expresión “ácido nucleico” incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprenda un polímero de nucleótidos (monómero de nucleótidos). Estos polímeros se denominan polinucleótidos. Por lo tanto, las expresiones “ácido nucleico” y “polinucleótido” se utilizan de forma intercambiable.
Los ácidos nucleicos pueden ser o pueden incluir, por ejemplo, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de treosa (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA, incluyendo LNA que tiene una configuración p-D-ribo, a-LNA que tiene una configuración a-L-ribo (un diastereoisómero de LNA), 2'-amino-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino y 2'-amino-a -LNA que tiene una funcionalización 2'-amino), ácidos nucleicos de etileno (ENA), ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA) o quimeras o combinaciones de los mismos.
Los polinucleótidos de la presente invención funcionan como ARN mensajero (ARNm). "ARN mensajero" (ARNm) se refiere a cualquier polinucleótido que codifica un (al menos un) polipéptido (un polímero de aminoácidos natural, no natural o modificado) y puede traducirse para producir el polipéptido codificado in vitro, in vivo, in situ o ex vivo. El experto en la técnica entenderá que, salvo que se indique lo contrario, las secuencias de polinucleótidos establecidas en la presente solicitud indicarán “T” en una secuencia de ADN representativa, pero cuando la secuencia representa ARN (es decir, ARNm), se debería sustituir las “T” con “U”. Por lo tanto, cualquier polinucleótido de ARN codificado por un ADN identificado por un número de identificación de secuencia particular también puede comprender la secuencia de ARN correspondiente (p.ej., ARNm) codificada por el ADN, donde cada “T” de la secuencia de ADN se sustituye con “U”.
Los componentes básicos de una molécula de ARNm suelen incluir al menos una región codificante, una región no traducida (UTR) en 5', una UTR en 3', una caperuza en 5' y una cola poli-A. Los polinucleótidos de la presente descripción pueden funcionar como ARNm, pero pueden distinguirse del ARNm de tipo salvaje en sus características de diseño funcional y/o estructural, que sirven para superar los problemas existentes de expresión polipeptídica efectiva utilizando agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos.
En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN de una vacuna de ARN (es decir, ARNm) codifica 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-10, 7-9, 7-8, 8-10, 8-9 o 9-10 polipéptidos antigénicos. En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) de una vacuna de virus respiratorio codifica al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 polipéptidos antigénicos. En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) de una vacuna de virus respiratorio codifica al menos 100 o al menos 200 polipéptidos antigénicos. En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN de una vacuna de virus respiratorio codifica 1-10, 5-15, 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40, 35-45, 40-50, 1­ 50, 1-100, 2-50 o 2-100 polipéptidos antigénicos.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos de la presente descripción se optimizan por codones. Los procedimientos de optimización de codones son conocidos en la técnica y pueden usarse como se proporciona en esta invención. La optimización de codones, en algunas realizaciones, se puede usar para hacer coincidir las frecuencias de codones en los organismos diana y huésped para garantizar un plegamiento adecuado; sesgar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm o reducir las estructuras secundarias; minimizar los codones repetidos en tándem o las corridas de bases que pueden afectar la construcción o expresión de genes; personalizar las regiones de control transcripcional y traduccional;insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas; eliminar/añadir sitios de modificación posteriores a la traducción en la proteína codificada (por ejemplo, sitios de glicosilato); añadir, eliminar o barajar dominios de proteínas; insertar o eliminar sitios de restricción; modificar los sitios de unión al ribosoma y los sitios de degradación del ARNm; ajustar las tasas de traducción para permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen correctamente; o para reducir o eliminar estructuras secundarias problemáticas dentro del polinucleótido. Las herramientas, algoritmos y servicios de optimización de codones son conocidos en la técnica; los ejemplos no taxativos incluyen los servicios de GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park, CA) y/o procedimientos de propietario. En algunas realizaciones, la secuencia del marco de lectura abierto (ORF) se optimiza utilizando algoritmos de optimización.
En algunas realizaciones, una secuencia con codones optimizados comparte menos del 95 % de identidad de secuencia, menos del 90 % de identidad de secuencia, menos del 85 % de identidad de secuencia, menos del 80 % de identidad de secuencia o menos del 75 % de identidad de secuencia con una identidad de secuencia natural o secuencia de tipo salvaje (p. ej., una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (p. ej., una proteína antigénica o un polipéptido antigénico)).
En algunas realizaciones, una secuencia con codones optimizados comparte entre un 65 % y un 85 % (p. ej., entre aproximadamente un 67 % y aproximadamente un 85 %, o entre aproximadamente un 67 % y aproximadamente un 80 %) de identidad de secuencia con una secuencia natural o una secuencia salvaje. secuencia de tipo (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, una proteína o polipéptido antigénico)). En algunas realizaciones, una secuencia optimizada por codones comparte entre 65 % y 75 % o aproximadamente 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de origen natural o de tipo salvaje (por ejemplo, una secuencia de ARNm de origen natural o de tipo salvaje que codifica un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido o proteína antigénicos)).
En algunas realizaciones, un ARN (es decir, ARNm) optimizado por codones puede ser, por ejemplo, uno en el que se mejoren los niveles de G/C. El contenido de G/C de las moléculas de ácido nucleico puede influir en la estabilidad del a Rn . El ARN con una cantidad mayor de residuos guanina (G) y/o citosina (C) puede ser funcionalmente más estable que los ácidos nucleicos que contienen una gran cantidad de nucleótidos de adenina (A) y timina (T) o uracilo (U). WO02/098443 describe una composición farmacéutica que contiene un ARNm estabilizado mediante modificaciones de secuencia en la región traducida. Debido a la degeneración del código genético, las modificaciones funcionan sustituyendo los codones existentes por aquellos que promueven una mayor estabilidad del ARN sin cambiar el aminoácido resultante. La estrategia se limita a las regiones codificantes del ARN.
Antígenos/Polipéptidos antigénicos
En algunas realizaciones, un polipéptido antigénico (es decir, un polipéptido antigénico BetaCoV) tiene más de 25 aminoácidos y menos de 50 aminoácidos. Los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser una sola molécula o puede ser un complejo multimoleculartal como un dímero, trímero o tetrámero. Los polipéptidos también pueden comprender polipéptidos monocatenarios o polipéptidos multicatenarios, como anticuerpos o insulina, y pueden estar asociados o enlazados entre sí. Los enlaces disulfuro más comunes se encuentran en los polipéptidos de cadena múltiple. El término "polipéptido" también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos en los que al menos un residuo de aminoácido es un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente.
Una “variante de polipéptido” es una molécula que difiere en su secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia natural o una secuencia de referencia. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden tener sustituciones, deleciones, inserciones o una combinación de cualquiera de dos o tres de los anteriores, en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o una secuencia de referencia. Comúnmente, las variantes poseen una identidad de al menos 50 % con respecto a una secuencia de origen natural o de referencia. En algunas realizaciones, las variantes poseen una identidad de al menos 80 % o al menos 90 % con respecto a una secuencia de origen natural o de referencia.
En algunas realizaciones, se proporcionan “miméticos variantes”. Un “mimético variante” contiene al menos un aminoácido que imitaría una secuencia activada. Por ejemplo, el glutamato puede servir como un imitador de fosforotreonina y/o fosforo-serina. De manera alternativa, los miméticos variantes pueden dar como resultado la desactivación o un producto inactivado que contiene el mimético. Por ejemplo, la fenilalanina puede actuar como una sustitución de inactivación para la tirosina, o la alanina puede actuar como una sustitución de inactivación para la serina.
"Ortólogos" hace referencia a genes en distintas especies que evolucionaron a partir de un gen ancestral común mediante especiación. Normalmente, los ortólogos conservan la misma función en el transcurso de la evolución. La identificación de ortólogos es importante para la predicción confiable de la función génica en genomas recientemente secuenciados.
Se pretende que "análogos" incluya variantes polipeptídicas que difieran en una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o deleciones de residuos aminoácidos que aún conservan una o más de las propiedades del polipéptido original o inicial.
La presente descripción proporciona varios tipos de composiciones basadas en polinucleótidos o polipéptidos, incluidas variantes y derivados. Estos incluyen, por ejemplo, variantes y derivados de sustitución, inserción, deleción y covalentes. El término "derivado" se usa como sinónimo del término "variante", pero generalmente se refiere a una molécula que ha sido modificada y/o cambiada de cualquier manera en comparación con una molécula de referencia o molécula inicial.
Como tales, los polinucleótidos que codifican péptidos o polipéptidos que contienen sustituciones, inserciones y/o adiciones, deleciones y modificaciones covalentes con respecto a las secuencias de referencia, en particular las secuencias polipeptídicas descritas en esta invención, se incluyen dentro del alcance de esta divulgación. Por ejemplo, los marcadores de secuencia o aminoácidos, tales como una o más lisinas, pueden agregarse a las secuencias de péptidos (por ejemplo, en los extremos N o C). Pueden usarse marcadores de secuencia para la detección, purificación o localización de péptidos. Pueden usarse lisinas para aumentar la solubilidad de péptidos o para permitir la biotinilación. De manera alternativa, los residuos de aminoácidos ubicados en las regiones de los extremos amino y carboxi de la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína pueden eliminarse de manera opcional para proporcionar secuencias truncadas. Ciertos aminoácidos (p. ej., residuos de extremo C o residuos de extremo N) alternativamente pueden eliminarse según el uso de la secuencia, como por ejemplo, la expresión de la secuencia como parte de una secuencia más grande que es soluble o unida a un soporte sólido.
"Variantes de sustitución", cuando se refieren a polipéptidos, son las que han eliminado al menos un residuo de aminoácidos en una secuencia natural o inicial y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, donde solo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, donde se han sustituido dos o más (por ejemplo, 3, 4 ó 5) aminoácidos en la misma molécula.
Tal como se usa en esta invención, la expresión “sustitución de aminoácido conservadora” se refiere a la sustitución de un aminoácido que está presente normalmente en la secuencia con un aminoácido diferente de tamaño, carga o polaridad similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina y leucina, por otro residuo no polar. De manera similar, ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. De manera adicional, la sustitución de un residuo básico, tal como lisina, arginina o histidina, por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido, son ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras. Ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina, por un residuo polar (hidrofílico), tal como, cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina, y/o un residuo polar por un residuo no polar.
"Características" cuando se refiere a polipéptido o polinucleótido se definen como componentes distintos basados en secuencias de aminoácidos o basados en nucleótidos de una molécula, respectivamente. Las características de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos incluyen manifestaciones superficiales, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos y cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "dominio" se refiere a un motivo de un polipéptido que tenga una o más características o propiedades funcionales o estructurales identificables (por ejemplo, capacidad de unión, servir como sitio para interacciones entre proteínas).
Tal como se usa en esta invención en referencia a polipéptidos, el término “sitio”, en lo referente a realizaciones basadas en aminoácidos, se usa como sinónimo de “residuo de aminoácidos” y “cadena lateral de aminoácidos”. Tal como se usa en esta invención en referencia a polinucleótidos, el término “sitio”, en lo que respecta a realizaciones a base de nucleótidos, se utiliza como sinónimo de “nucleótido”. Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido o polinucleótido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivatizarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptidos o polinucleótidos.
Tal como se usa en esta invención los términos "extremos" o "extremo", en referencia a polipéptidos, se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido, respectivamente. Dicha extremidad no se limita únicamente al sitio inicial o final del polipéptido o polinucleótido, sino que puede incluir aminoácidos o polinucleótidos adicionales en las regiones de los extremos. Las moléculas basadas en polipéptidos se pueden caracterizar por tener un extremo N (terminado por un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) y un extremo C (terminado por un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). En algunos casos, las proteínas están formadas por múltiples cadenas polipeptídicas unidas por enlaces disulfuro o por fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estas proteínas tienen múltiples extremos N y C. De manera alternativa, los extremos de los polipéptidos pueden modificarse de manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos, tal como un conjugado orgánico.
Como reconocerán los expertos en la técnica, los fragmentos de proteína, dominios de proteína funcional y proteínas homólogas, también se consideran dentro del alcance de los polipéptidos de interés. Por ejemplo, en esta invención se proporciona cualquier fragmento de proteína (es decir, una secuencia polipeptídica al menos un residuo de aminoácido más corta que una secuencia polipeptídica de referencia, pero por lo demás idéntica) de una proteína de referencia que tiene una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100 o más de 100 aminoácidos. En otro ejemplo, cualquier proteína que incluya un tramo de 20, 30, 40, 50 o 100 (contiguos) aminoácidos que son 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o Se puede utilizar un 100% idéntico a cualquiera de las secuencias descritas en esta invención de acuerdo con la divulgación. En algunas realizaciones, un polipéptido incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones, como se muestra en cualquiera de las secuencias proporcionadas o referenciadas en esta invención. En otro ejemplo, cualquier proteína que incluya una extensión de 20, 30, 40, 50 o 100 aminoácidos que sean más que 80 %, 90 %, 95 % o 100 % idénticos a cualquiera de las secuencias descritas en esta invención, donde la proteína tenga una extensión de 5, 10, 15, 20, 25 o 30 aminoácidos que sean menos que 80 %, 75 %, 70 %, 65 % a 60 % idénticos a cualquiera de las secuencias descritas en esta invención puede utilizarse de acuerdo con la descripción.
Las moléculas de polipéptidos o polinucleótidos de la presente descripción pueden compartir un cierto grado de similitud o identidad de secuencia con las moléculas de referencia (por ejemplo, polipéptidos de referencia o polinucleótidos de referencia), por ejemplo, con moléculas descritas en la técnica (por ejemplo, moléculas diseñadas o modificadas genéticamente, o moléculas de tipo salvaje). El término "identidad", como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos o polinucleótidos, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de relación de secuencia entre dos secuencias según lo determinado por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos o residuos de ácidos nucleicos. La identidad mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de espacios (si los hubiera) conforme a un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de los péptidos relacionados se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos. "% de identidad", tal como se aplica a las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, se define como el porcentaje de residuos (residuos de aminoácidos o residuos de ácido nucleico) en la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico candidata que son idénticos con los residuos en la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico de una segunda secuencia luego de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el mayor porcentaje de identidad. Los Procedimientos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica. La identidad depende de un cálculo del porcentaje de identidad, pero puede diferir en valor debido a los espacios y penalizaciones introducidas en el cálculo. En general, las variantes de un polinucleótido o polipéptido particular tienen al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, pero menos de 100% de identidad de secuencia con dicho polinucleótido o polipéptido de referencia particular, según se determina mediante parámetros y programas de alineación de secuencia descritos en esta invención y conocidos por los expertos en la técnica. Dichas herramientas para la alineación incluyen las de la suite BLAST (Stephen F. Altschul, y col. (1997)." Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Otra técnica popular de alineación local se basa en el algoritmo de Smith-Waterman (Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Identification of common molecular subsequences." J. Mol. Biol. 147:195-197). Una técnica general de alineación global basada en la programación dinámica es el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins." J. Mol. Biol. 48: 443-453. Más recientemente, se desarrolló un algoritmo de alineación de secuencia global óptima rápida (FOGSAA) que supuestamente produce una alineación global de secuencias de nucleótidos y proteínas más rápido que otros procedimientos de alineación global óptima, incluido el algoritmo de Needleman-Wunsch. Otras herramientas se describen en esta invención, específicamente en la definición de "identidad" a continuación.
Como se usa en esta invención, el término "homología" se refiere a la relación global entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. Moléculas poliméricas (p.ej., moléculas de ácido nucleico (p.ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o moléculas de polipéptidos) que comparten un nivel umbral de similitud o identidad determinado por la alineación de los residuos coincidentes se denominan homólogas. La homología es un término cualitativo que describe una relación entre moléculas y puede basarse en la identidad o similitud cuantitativa. Similitud o identidad es un término cuantitativo que define el grado de coincidencia de secuencias entre dos secuencias comparadas. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran «homólogas» entre sí si sus secuencias son al menos 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % idénticas o similares. El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos). Se considera que dos secuencias de polinucleótidos son homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos alrededor de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso 99 % para al menos un tramo de al menos unos 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4--5 aminoácidos especificados de forma única. Para secuencias de polinucleótidos de menos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4--5 aminoácidos especificados de forma única. Dos secuencias de proteínas se consideran homólogas si las proteínas son idénticas al menos en un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en al menos un tramo de al menos 20 aminoácidos.
La homología implica que las secuencias comparadas divergieron en la evolución a partir de un origen común. El término "homólogo" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o secuencia de ácidos nucleicos (p. ej., gen (ADN o ARN) o secuencia de proteínas) que está relacionada con una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de ácidos nucleicos por descendencia de una secuencia ancestral común. El término "homólogo" puede aplicarse a la relación entre genes y/o proteínas separados por el evento de especiación o a la relación entre genes y/o proteínas separados por el evento de duplicación genética. “Ortólogos” son genes (o proteínas) de distintas especies que evolucionaron a partir de un gen (o proteína) ancestral en común mediante especiación. Típicamente, los ortólogos conservan la misma función en el transcurso de la evolución. "Parálogos" son genes (o proteínas) relacionadas por duplicación dentro de un genoma. Los ortólogos retienen la misma función durante la evolución, mientras que los parálogos desarrollan nuevas funciones, incluso si estas se relacionan con la original.
El término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótidos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido de polinucleótidos se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico para una alineación óptima, y se pueden ignorar las secuencias no idénticas a los efectos de la comparación). En determinadas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con fines comparativos es de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95% o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, a continuación, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede obtener usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando procedimientos tales como los que se describen en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991. Por ejemplo, es posible determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, de manera alternativa, usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los procedimientos comúnmente empleados para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, entre otros, aquellos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Las técnicas para determinar la identidad están codificadas en programas informáticos disponibles públicamente. Software informático ejemplar para determinar la homología entre dos secuencias incluye, entre otros, el paquete de programas GCG., Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research, 12(1), 387(1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215, 403(1990)).
Vacunas Multiproteicas y Multicomponentes
La presente divulgación abarca vacunas de virus respiratorios que comprenden múltiples polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm), cada uno de los cuales codifica un solo polipéptido antigénico, así como vacunas de virus respiratorios que comprenden un solo polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica más de un polipéptido antigénico (por ejemplo, como un polipéptido de fusión). Por lo tanto, una composición de vacuna que comprende un polinucleótido de ARN (es dcir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico y un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica un segundo polipéptido antigénico abarca (a) vacunas que comprenden un primer polinucleótido de ARN que codifica un primer polipéptido antigénico y un segundo polinucleótido de ARN que codifica un segundo polipéptido antigénico, y (b) vacunas que comprenden un solo polinucleótido de ARN que codifica un primer y segundo polipéptido antigénico (por ejemplo, como un polipéptido de fusión). Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de la presente divulgación, en algunas realizaciones, comprenden de 2 a 10 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10), o más, polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto, cada uno de los cuales codifica un polipéptido antigénico diferente (o un único polinucleótido de ARN que codifica de 2 a 10, o más, polipéptidos antigénicos diferentes). Los polipéptidos antigénicos pueden seleccionarse de entre polipéptidos antigénicos hMPV, PIV3, RSV, MEV y BetaCoV (por ejemplo, seleccionados de entre MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV -HKU1). En la invención, al menos un polinucleótido de ARNm codifica al menos un polipéptido antigénico BetaCoV.
En algunas realizaciones, una vacuna multicomponente comprende al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que codifica al menos un polipéptido antigénico fusionado con un péptido señal (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO: 15-19). El péptido señal puede fusionarse en el extremo N o el extremo C de un polipéptido antigénico. Un polipéptido antigénico fusionado a un péptido señal puede seleccionarse de entre los polipéptidos antigénicos hMPV, PIV3, RSV, MEV y BetaCoV (por ejemplo, seleccionados de entre MERS-CoV, sA r S-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y HCoV-HKU1).
Péptidos señal
En algunas realizaciones, los polipéptidos antigénicos codificados por polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios comprenden un péptido señal. Los péptidos señal que comprenden los 15-60 aminoácidos de extremo N de proteínas suelen ser necesarios para la translocación a través de la membrana en la vía de secreción y, por lo tanto, para controlar universalmente la entrada de la mayoría de las proteínas tanto en eucariotas y procariotas a la vía de secreción. En general, los péptidos señal incluyen tres regiones: una región de extremo N de longitud diferente que usualmente comprende aminoácidos con carga positiva, una región hidrofóbica y una región peptídica de extremo carboxi corta. En eucariotas, el péptido señal de una proteína precursora naciente (preproteína) dirige el ribosoma a la membrana del retículo endoplasmático (RE) rugoso e inicia el transporte de la cadena peptídica creciente a través de esta para su procesamiento. El procesamiento del RE produce proteínas maduras, donde el péptido señal se escinde a partir de proteínas precursoras, típicamente a través de una peptidasa señal que reside en el RE de la célula hospedadora, o permanece sin escindir y funciona como una ligadura de membrana. Además, un péptido señal puede facilitar la selección de la proteína como diana para la membrana celular. No obstante, el péptido señal no es responsable del destino final de la proteína madura. Por defecto, las proteínas de secreción carentes de etiquetas de dirección adicionales en su secuencia se secretan al entorno exterior. Durante los últimos años, ha evolucionado una visión más avanzada de los péptidos señal, lo que demuestra que las funciones y la inmunodominancia de ciertos péptidos señal son mucho más versátiles de lo previsto anteriormente.
Las vacunas de virus respiratorios de la presente descripción pueden comprender, por ejemplo, polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm) que codifican un péptido señal artificial, donde la secuencia codificante del péptido señal está unida operativamente y está en marco con la secuencia codificante del polipéptido antigénico. Por lo tanto, las vacunas de virus respiratorios de la presente divulgación, en algunas realizaciones, producen un polipéptido antigénico que comprende un polipéptido antigénico (es decir, BetaCoV) fusionado con un péptido señal. En algunas realizaciones, un péptido señal se fusiona con el extremo N del polipéptido antigénico. En algunas realizaciones, un péptido señal se fusiona con el extremo C del polipéptido antigénico.
En algunas realizaciones, el péptido señal fusionado al polipéptido antigénico es un péptido señal artificial. En algunas realizaciones, se obtiene un péptido señal artificial fusionado con el polipéptido antigénico codificado por la vacuna de ARN (es.decir, ARNm) a partir de una proteína de inmunoglobulina, por ejemplo, un péptido señal IgE o un péptido señal IgG. En algunas realizaciones, un péptido señal fusionado con el polipéptido antigénico codificado por una vacuna de ARN (es decir, ARNm) es un péptido señal epsilon-1 de cadena pesada de Ig (IgE HC SP) que tiene la secuencia de: m Dw TWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 16). En algunas realizaciones, un péptido señal fusionado con el polipéptido antigénico codificado por la vacuna de ARN (es decir, ARNm) es un péptido señal HAH de la región V­ III de la cadena IgGk (IgGk SP) que tiene la secuencia de MeTPAQLLFLLl Lw LPd Tt G (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el péptido señal se selecciona de entre: secuencia señal PRM de encefalitis japonesa (MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS; SEQ ID NO: 17), secuencia señal de proteína VSVg (MKCLLYLAFLFIGVNCA; SEQ ID NO: 18) y secuencia señal JEV de encefalitis japonesa (MWLVSLAIVTACAGA; SeQ ID NO: 19).
En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico codificado por una vacuna de ARN (es decir, ARNm) comprende una secuencia de aminoácidos identificada por cualquiera de las SEQ ID NO: 5-8, 12-13, 24-34, 47-50 o 54-56 (Tablas 3, 6, 11, 14 ó 17; véanse también las secuencias de aminoácidos de las Tablas 4, 7, 12 ó 15) fusionadas con un péptido señal identificado por cualquiera de las SEQ ID NO: 15-19 (Tabla 8). Los ejemplos divulgados en esta invención no pretenden ser limitantes y cualquier péptido señal que sea conocido en la técnica para facilitar la orientación de una proteína al ER para el procesamiento y/o la orientación de una proteína a la membrana celular puede usarse de acuerdo con la presente divulgación.
Un péptido señal puede tener una longitud de 15 a 60 aminoácidos. Por ejemplo, un péptido señal puede tener una longitud de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 aminoácidos. En algunas realizaciones, un péptido señal tiene una extensión de 20-60, 25-60, 30-60, 35- 60, 40-60, 45- 60, 50-60, 55-60, 15-55, 20-55, 25-55, 30-55, 35­ 55, 40-55, 45-55, 50-55, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50, 15-45, 20-45, 25-45, 30-45, 35-45, 40-45, 15-40, 20-40, 25-40, 30-40, 35-40, 15-35, 20-35, 25-35, 30-35, 15-30, 20-30, 25-30, 15-25, 20-25 o 15-20 aminoácidos.
Un péptido señal normalmente se escinde del polipéptido naciente en la unión de escisión durante el procesamiento del ER. El polipéptido antigénico maduro producido por una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorio de la presente descripción normalmente no comprende un péptido señal.
Modificaciones químicas
Las vacunas de virus respiratorios de la presente divulgación, en algunas realizaciones, comprenden al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico que comprende al menos una modificación química.
Los términos "modificación química" y "modificado químicamente" se refieren a la modificación con respecto a los ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos de adenosina (A), guanosina (G), uridina (U), timidina (T) o citidina (C) en al menos uno de sus posición, patrón, porcentaje o población. En general, estos términos no se refieren a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de caperuza de ARNm extremo 5' de origen natural. Respecto a un polipéptido, el término "modificación" hace referencia a una modificación respecto al conjunto canónico de 20 aminoácidos. Tal como se proveen en esta invención, los polipéptidos también se consideran “modificados” si contienen sustituciones, inserciones o una combinación de sustituciones e inserciones de aminoácidos.
Los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm), en algunas realizaciones, comprenden varias (más de una) modificaciones diferentes. En algunas realizaciones, una región particular de un polinucleótido contiene una, dos o más modificaciones (opcionalmente diferentes) de nucleósidos o nucleótidos. En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN modificado (es decir, un polinucleótido de ARNm modificado), introducido en una célula u organismo, muestra una degradación reducida en la célula u organismo, respectivamente, en relación con un polinucleótido no modificado. En algunas realizaciones, un polinucleótido de ARN modificado (es decir, un polinucleótido de ARNm modificado), introducido en una célula u organismo, puede exhibir inmunogenicidad reducida en la célula u organismo, respectivamente (por ejemplo, una respuesta innata reducida).
Las modificaciones de los polinucleótidos incluyen, sin imitación, las descritas en esta invención. Los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) pueden comprender modificaciones que ocurren de forma natural, que no ocurren de forma natural o el polinucleótido puede comprender una combinación de modificaciones que ocurren de forma natural y que no ocurren de forma natural. Los polinucleótidos pueden incluir cualquier modificación útil, por ejemplo, de un enlace internucleósido, un azúcar o una nucleobase (por ejemplo, a un fosfato enlazador, a un enlace fosfodiéster o a la estructura principal de fosfodiéster).
Los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm), en algunas realizaciones, comprenden nucleótidos modificados no naturales que se introducen durante la síntesis o possíntesis de los polinucleótidos para lograr las funciones o propiedades deseadas. Las modificaciones pueden estar en un enlace internucleótido, bases de purina o pirimidina o azúcares. La modificación se puede introducir con síntesis química o con una enzima polimerasa en el extremo de una cadena o en cualquier otro lugar de la cadena. Cualquiera de las regiones de un polinucleótido puede modificarse químicamente.
La presente descripción proporciona nucleósidos y nucleótidos modificados de un polinucleótido (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm). Un "nucleósido" se refiere a un compuesto que contiene una molécula de azúcar (p. ej., una pentosa o una ribosa) o un derivado del mismo en combinación con una base orgánica (p. ej., una purina o pirimidina) o un derivado del mismo (también denominado en esta invención "nucleobase"). Un “nucleótido” hace referencia a un nucleósido, inclusive un grupo fosfato. Los nucleótidos modificados pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento útil, como, por ejemplo, química, enzimática o recombinantemente, para incluir uno o más nucleósidos modificados o no naturales. Los polinucleótidos pueden comprender una región o regiones de nucleósidos enlazados. Dichas regiones pueden tener enlaces de estructura principal variable. Los enlaces pueden ser enlaces fosfodiéster estándar, en cuyo caso los polinucleótidos comprenderían regiones de nucleótidos.
El apareamiento de bases de nucleótidos modificado abarca no solo los pares de bases estándar de adenosina-timina, adenosina-uracilo o guanosina-citosina, sino también pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos modificados que comprenden bases no estándar o modificadas, en donde la disposición del enlace de hidrógeno Los donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno permiten la formación de enlaces de hidrógeno entre una base no estándar y una base estándar o entre dos estructuras de base no estándar complementarias. Un ejemplo de dicho apareamiento de bases no estándar es el apareamiento de bases entre el nucleótido modificado inosina y adenina, citosina o uracilo. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador puede incorporarse a los polinucleótidos de la presente descripción.
Las modificaciones de polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) que son útiles en las vacunas de la presente descripción incluyen, entre otras, las siguientes: 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina; 2-metiltio-N6-metiladenosina; 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina; N6-glicinilcarbamoiladenosina; N6-isopenteniladenosina; N6-metiladenosina; N6-treonilcarbamoiladenosina: 1,2'-O-dimetiladenosina; 1-metiladenosina; 2'-O. metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6 isopenteniladenosina; 2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); isopenteniladenosina; N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,2'O-dimetiladenosina; N6,N6,2'-O-trimetiladenosina; N6,N6-dimetiladenosina; N6-acetiladenosina; N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina; N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina; 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; 7-desaza-adenosina; N1-metil-adenosina; N6, N6(dimetil)adenina; N6-cis-hidroxi-isopenteniladenosina; a-tio-adenosina; 2(amino)adenina; 2 (aminopropil) adenina; 2(metiltio) N6 (isopentenil)adenina; 2-(alquil)adenina; 2-(aminoalquil)adenina; 2-(aminopropil)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(propil)adenina; 2'-amino-2'-desoxi-ATP; 2'-azido-2'-desoxi-ATP; 2'-desoxi-2'-a-a minoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-a-azidoadenosina TP; 6 (alquil) adenina; 6 (metil) adenina; 6-(alquil)adenina; 6-(metil)adenina; 7(deaza)adenina; 8 (alquenil) adenina; 8(alquinil)adenina; 8(amino)adenina; 8(tioalquil)adenina; 8-(alquenil)adenina; 8-(alquil)adenina; 8-(alquinil)adenina; 8-(amino)adenina; 8-(halo)adenina; 8-(hidroxil)adenina; 8-(tioalquil)adenina; 8-(tiol)adenina; 8-azido-adenosina; aza adenina; deaza adenina; N6(metil)adenina; N6-(isopentil)adenina; 7-desaza-8-aza-adenosina; 7-metiladenina; 1-desazaadenosina TP; 2'Fluoro-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2'-OMe-2-Amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2'-a-etiniadenosina TP; 2-aminoadenina; 2-aminoadenosina TP; 2-Amino-ATP; 2'-a-trifluorometiladenosina TP; 2-azidoadenosina TP; 2'-b-etiniladenosina TP; 2-bromoadenosina TP; 2'-b-trifluorometiladenosina TP; 2-cloroadenosina TP; 2'-desoxi-2',2'-difluoroadenosina TP; 2'-desoxi-2'-a-me rcaptoa deno sine TP; 2'-desoxi-2'-a-tiometoxiadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-aminoa denosina TP; 2'-desoxi-2'-b-azidoadeno seno TP; 2'-desoxi-2'-b-bromoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-cloroadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-fluoroadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-yodoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-bmercaptoadenosina TP; 2'-desoxi-2'-b-tiometoxiadenosina TP; 2-fluoroadenosina TP; 2-yodoadenosina TP; 2-mercaptoadenosina TP; 2-metoxi-adenina; 2-metiltio-adenina; 2-trifluorometiladenosina TP; 3-Deaza-3-bromoadenosina TP; 3-Desaza-3-cloroadenosina TP; 3-Desaza-3-fluoroadenosina TP; 3-Desaza-3-yodoadenosina TP; 3-desazaadenosina TP; 4'azidoadenosina TP; TP de adenosina 4'-carbocíclica; 4'-etiniladenosina TP; 5'Homoadenosina TP; 8-Aza-ATP; 8-bromo-adenosina TP; 8-trifluorometiladenosina TP; 9-desazaadenosina TP; 2-aminopurina; 7-desaza-2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-2-aminopurina; 2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina; 2-tiocitidina; 3-metilcitidina; 5-formilcitidina; 5-hidroximetilcitidina; 5-metilcitidina; N4-acetilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 5,2'-O-dimetilcitidina; 5-formil-2'-O-metilcitidina; lisidina; N4,2'-O-dimetilcitidina; N4-acetil-2'-O-metilcitidina; N4-metilcitidina; N4,N4-dimetil-2'-OMecitidina TP; 4-metilcitidina; 5-aza-citidina; pseudo-iso-citidina; pirrolo-citidina; a-tio-citidina; 2-(tio)citosina; 2'-amino-2'-desoxi-CTP; 2'-azido-2'-desoxi-CTP; 2'-desoxi-2'-a-aminocitidina TP; 2'-desoxi-2'-a-azidocitidina TP; 3 (deaza) 5 (aza)citosina; 3(metil)citosina; 3-(alquil)citosina; 3-(deaza) 5 (aza)citosina; 3-(metil)citidina; 4,2'-O-dimetilcitidina; 5(halo)citosina; 5(metil)citosina; 5(propinil)citosina; 5 (trifluorometil) citosina; 5-(alquil)citosina; 5-(alquinil)citosina; 5-(halo)citosina; 5-(propinil)citosina; 5-(trifluorometil)citosina; 5-bromo-citidina; 5-yodo-citidina; 5-propinil citosina; 6-(azo)citosina; 6-aza-citidina; aza citosina; deaza citosina; N4 (acetil)citosina; 1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina; 1-metil-pseudoisocitidina; 2-metoxi-5-metil-citidina; 2-metoxi-citidina; 2-tio-5-metil-citidina; 4-metoxi-1-metilpseudoisocitidina; 4-metoxi-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metilpseudoisocitidina; 4-tio-pseudoisocitidina; 5-aza-zebularina; 5-metil-zebularina; pirrolo-pseudoisocitidina; cebularina; (E)-5-(2-Bromo-vinil)citidina TP; hidrocloruro de 2,2'-anhidro-citidina TP; 2'Fluor-N4-Bz-citidina TP; 2'Fluoro-N4-Acetilcitidina TP; 2'-O-Metil-N4-Acetil-citidina TP; 2'O-metil-N4-Bz-citidina TP; 2'-a-Etinilcitidina TP; 2'-a-trifluorometilcitidina TP; 2'-b-etinilcitidina TP; 2'-b-trifluorometilcitidina TP; 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina TP; 2'-desoxi-2'-a-mercaptocitidina TP; 2'-desoxi-2'-a-tiometoxicitidina TP; TP de 2'-desoxi-2'-b-aminocitidina; 2'-desoxi-2'-b-azidocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-bromocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-clorocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-fluorocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-yodocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-mercaptocitidina TP; 2'-desoxi-2'-b-tiometoxicitidina TP; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)citidina TP; 3'-Etinilcitidina TP; 4'-azidocitidina TP; citidina 4'-carbocíclica TP; 4'-Etinilcitidina TP; 5-(1-Propinil)ara-citidina TP; 5-(2-cloro-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-(4-aminofenil)-2-tiocitidina TP; 5-aminoalil-CTP; 5-cianocitidina TP; 5-etinilara-citidina TP; 5-Etinilcitidina TP; TP de 5'-homocitidina; 5-metoxicitidina TP; 5-trifluorometil-citidina TP; N4-Amino-citidina TP; N4-benzoil-citidina TP; pseudoisocitidina; 7-metilguanosina; N2,2'-O-dimetilguanosina; N2-metilguanosina; Wyosine; 1,2-O-dimetilguanosina; 1-metilguanosina; 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 2'-O-metilguanosina; 2'O-ribosilguanosina (fosfato); 7-aminometil-7-desazaguanosina; 7-ciano-7-desazaguanosina; arqueosina; metilwyosina; N2,7-dimetilguanosina; N2,N2,2'-O-trimetilguanosina; N2,N2,7-trimetilguanosina; N2,N2-dimetilguanosina; N2,7,2'-O-trimetilguanosina; 6-tio-guanosina; 7-deaza-guanosina; 8-oxo-guanosina; N1-metil-guanosina; a-tio-guanosina; 2(propil)guanina; 2-(alquil)guanina; 2'-amino-2'-desoxi-GTP; 2'-azido-2'-desoxi-GTP; 2'-desoxi-2'-a-aminoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-a-azidoguanosina TP; 6(metil)guanina; 6-(alquil)guanina; 6-(metil)guanina; 6-metil-guanosina; 7(alquil)guanina; 7 (deaza)guanina; 7(metil)guanina; 7-(alquil)guanina; 7-(deaza)guanina; 7-(metil)guanina; 8 (alquil)guanina; 8(alquinil)guanina; 8 (halo)guanina; 8(tioalquil)guanina; 8-(alquenil)guanina; 8-(alquil)guanina; 8-(alquinil)guanina; 8-(amino)guanina; 8-(halo)guanina; 8-(hidroxil)guanina; 8-(tioalquil)guanina; 8-(tiol)guanina; aza guanina; deaza guanina; N (metil) guanina; N-(metil)guanina; 1-metil-6-tio-guanosina; 6-metoxi-guanosina; 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina; 6-tio-7-deaza-guanosina; 6-tio-7-metil-guanosina; 7-deaza-8-aza-guanosina; 7-metil-8-oxoguanosina; N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina; N2-metil-6-tio-guanosina; 1-Me-GTP; 2'Fluoro-N2-isobutil-guanosina TP; 2'O-metil-N2-isobutil-guanosina; TP; 2'-a-Etinilguanosina TP; 2'-a-Tnfluorometilguanosina TP; 2'-b-Etinilguanosina TP; 2'-b-trifluorometilguanosina TP; 2'-desoxi-2',2'-difluoroguanosina TP; 2'-desoxi-2'-a-mercaptoguanosina TP; 2'-desoxi 2'-a-tiometoxiguanosina TP; 2'-desoxi-2'-b-aminoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-b-azidoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-bbromoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-b-cloroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluoroguano seno TP; 2'-desoxi-2'-b-yodoguano seno TP; 2'-desoxi-2'-b-mercaptoguanosina TP; 2'-desoxi-2'-b-tiometoxiguanosina TP; 4'-azidoguanosina TP; guanosina 4'-carbocíclica TP; 4'-Etinilguanosina TP; 5'-Homo-guanosina TP; 8-bromo-guanosina TP; 9-desazaguanosina TP; N2-isobutil-guanosina TP; 1-metilinosina; inosina; 1,2'-O-dimetilinosina; 2'-O-metilinosina; 7-metilinosina; 2'-O-metilinosina; epoxiqueuosina; galactosil-queuosina; manosilqueuosina; queuosina; alilaminotimidina; aza timidina; deaza timidina; desoxitimidina; 2'-O-metiluridina; 2-tiouridina; 3-metiluridina; 5-catoximetiluridina; 5-hidroxiuridina; 5-metiluridina; 5-taufinometil-2-tiouridina; 5-taurinometiluridina; dihidrouridina; pseudouridina; (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 1-metil-3-(3-amino-5-carboxipropil)pseudouridina; 1-metilpsduouridina; 1-metil-pseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2'-O-metilpseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2-tio-2'-O-metiluridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 3,2'-O-dimetiluridina; 3-metil-pseudo-uridina TP; 4-tiouridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina; éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)uridina; 5,2'-O-dimetiluridina; 5,6-dihidro-uridina; 5- aminometil-2-tiouridina; 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina; 5-carbamoilmetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina; éster metílico de 5-carboxihidroximetiluridina; 5-carboximetilaminometil-2'-O-metiluridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carbamoilmetiluridina TP; 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metoxiuridina; 5-metil-2-tiouridina; 5-metilaminometil-2-selenouridina; 5-metilaminometil-2- tiouridina; 5-metilaminometiluridina; 5-metildihidrouridina; ácido 5-oxiacético-uridina TP; Ácido 5-oxiacético-éster metílico-uridina TP; N1-metil-pseudouridina; ácido uridina 5-oxiacético; éster metílico del ácido 5-oxiacético de uridina; 3- (3-Amio-3-carboxipropil)-Uridina TP; 5-(iso-pentenilaminometil)-2-tiouridina TP; 5-(iso-pentenilaminometil)-2'O-metiluridina TP; 5-(iso-pentenilaminometil)uridina TP; 5-propinil uracilo; a-tio-uridina; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-4 (tio) pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-4 (tio) pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 12(tio)-pseudouracilo sustituido; 1 2,4-(ditio)pseudouracilo sustituido; 1 sustituyó 4 (tio)pseudouracilo; 1 pseudouracilo sustituido; 1-(aminoalquilaminocarboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracilo; 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina TP; 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-metil-pseudo-UTP; 2 (tio) pseudouracilo; 2' desoxiuridina; 2' fluorouridina; 2-(tio(uracilo; 2,4-(dtio)pseudouracilo; 2'metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluoro-guanosina; 2'-Amino-2'-desoxi-UTP; 2'-Azido -2'-desoxi-UTP; 2'-azido-desoxiuridina TP; 2'-O-metilpseudouridina; 2'desoxiuridina; 2'fluorouridina; 2'-desoxi-2'-a-amifiouridina TP; 2'-desoxi- 2'-a-azidouridina TP; 2-metilpseudouridina; 3(3amino-3 carboxipropil)uracilo; 4(tio)pseudouracilo; 4-(tio)pseudouracilo; 4-(tio)uracilo; 4-tiouracilo; 5 (1,3 -diazol-1 -alquil)uracilo, 5(2-aminopropil)uracilo, 5(aminoalquil)uracilo, 5(dimetilaminoalquil)uracilo; 5 (guanidinioalquil)uracilo; 5(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5 (metoxicarbonil-metil)uracilo; 5 (metil) 2 (tio) uracilo; 5 (metil) 2,4 (ditio) uracilo; 5 (metil) 4 (tio) uracilo; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio(uracilo; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracilo; 5 (propinil)uracilo; 5 (trifluorometil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5-(alquilo) -2-(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(alquil)-4(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)pseudouracilo; 5-(alquil)uracilo; 5- (alquinil)uracilo; 5-(alilamino)uracilo; 5-(cianoalquil)uracilo; 5-(dialquilaminoalquil)uracilo; 5-(dimetilaminoalquil)uracilo; 5-(guanidinioalquil)uracilo; 5-(halo)uracilo; 5-( 1,3-diazol-1-alquil)uracilo, 5-(metoxi)uracilo, 5-(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonil-metil)uracilo; 5-(metil) 2(tio)uracilo; 5-(metil) 2,4(ditio)uracilo; 5-(metil) 4(tio)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(metil)-4(tio)pseudouracilo; 5-(metil)pseudouracilo; 5-(metilaminometil)-2(tio)uracilo; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracilo; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracilo; 5-(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-aminoalil-uridina; 5-bromo-uridina; 5-yodo-uridina; 5-uracilo; 6(azo)uracilo; 6- (azo)uracilo; 6-aza-uridina; alilamino-uracilo; aza uracilo; deaza uracilo; N3 (metil)uracilo; ácido pseudo-UTP-1-2-etanoico; pseudouracilo; 4-tio-pseudo-UTP; 1-carboximetil-pseudouridina; 1-metil-1-desaza-pseudouridina; 1-propiniluridina; 1-taurinometil-1-metil-uridina; 1-taurinometil-4-tio-uridina; 1-taurinometil-pseudouridina; 2-metoxi-4-tiopseudouridina; 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina; 2-tio-1-metil-pseudouridina; 2-tio-5-aza-uridina; 2-tiodihidropseudouridina; 2-tio-dihidrouridina; 2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-pseudouridina; 4- tio-1-metil-pseudouridina; 4-tio-pseudouridina; 5-aza-uridina; dihidropseudouridina; (±)1-(2-hidroxipropil)pseudouridina TP; (2R)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2S)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; 1-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)pseudouridina TP; 1-(2,2-Dietoxietil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-trimetilbencil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-trimetil-bencil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-trimetil-fenil)pseudo-UTP; 1-(2-Amino-2-carboxietil)pseudo-UTP; 1-(2-aminoetil)pseudo-UTP; 1-(2-hidroxietil)pseudouridina TP; 1-(2-Metoxietil)pseudouridina TP; 1-(3,4-bis-trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Dimetoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3-Amino-3-carboxipropil)pseudo-UT P; 1-(3-Amino-propil)pseudo-UTP; 1-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)pseuduridina TP; 1-(4-amino-4-carboxibutil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-butil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-azidobencil)pseudouridina TP; 1-(4-bromobencil)pseudouridina TP; 1-(4-clorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-fluorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-yodobencil)pseudouridina TP; 1-(4-metanosulfonilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-metoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-metoxi-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-metoxi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-metilbencil)pseudouridina TP; 1 -(4-Metilbencil)pseudo-UTP; 1-(4-nitrobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Nitro-bencil)pseudo-UTP; 1(4-nitro-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-tiometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-trifluorometilbencil)pseudouridina TP; 1-(5-Amino-pentil)pseudo-UTP; 1-(6-Amino-hexil)pseudo-UTP; 1,6-Dimetilpseudo-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionil]pseudouridina TP; 1-{3-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-propionil}pseudouridina TP; 1-acetilpseudouridina TP; 1-alquil-6-(1-propinil)-pseudo-UTP; 1-alquil-6-(2-propinil)pseudo-UTP; 1-alquilo-6-alilo-pseudo-UTP; 1-alquil-6-etinil-pseudo-UTP; 1-alquil-6-homoalil-pseudo-UTP; 1 -alquil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-alilpseudouridina TP; 1-aminometil-pseudo-UTP; 1-benzoilpseudouridina TP; 1-benciloximetilpseudouridina TP; 1-bencil-pseudo-UTP; 1-biotinil-PEG2-pseudouridina TP; 1-biotinilpseudouridina TP; 1-butil-pseudo-UTP; 1-cianometilpseudouridina TP; 1-ciclobutilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclobutil-pseudo-UTP; 1-cicloheptilmetil-pseudo-UTP; 1-cicloheptil-pseudo-UTP; 1-ciclohexilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclohexil-pseudo-UTP; 1-ciclooctilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclooctilo-pseudo-UTP; 1-ciclopentilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclopentil-pseudo-UTP; 1-ciclopropilmetil-pseudo-UTP; 1-ciclopropil-pseudo-UTP; 1-etil-pseudo-UTP; 1-hexil-pseudo-UTP; 1-Homoalilpseudouridina TP; 1-hidroximetilpseudouridina TP; 1-iso-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4- tio-pseudo-UTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-UTP; 1-metanosulfonilmetilpseudouridina TP; 1-metoximetilpseudouridina TP; 1-metil-6-(2,2,2-trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(fenil sustituido)pseudo-UTP; 1-metil-6-amino-pseudo-UTP; 1-metil-6-azido-pseudo-UTP; 1-metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-cloro-pseudo-UTP; 1-metil-6-ciano-pseudo-UTP; 1-metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-etoxi-pseudo-UTP; pseudo-UTP de 1-metil-6-etilcarboxilato; 1 -metil-6-etilpseudo-UTP; 1-metil-6-fluoro-pseudo-UTP; 1-metil-6-formil-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroxiamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroxi-pseudo-UTP; 1-metil-6-yodo-pseudo-UTP; 1-metil-6-iso-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-metoxi-pseudo-UTP; 1-metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-fenil-pseudo-UTP; 1-metil-6-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-teft-butilpseudo-UTP; 1-metil-6-tritluorometoxi-pseudo-UTP; 1-metil-6-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-morfolinometilpseudouridina TP; 1-Pentil-pseudo-UTP; 1-fenil-pseudo-UTP; 1-pivaloilpseudouridina TP; 1-propargilpseudouridina TP; 1-propil-pseudo-UTP; 1-propinil-pseudouridina; 1-p-tolil-pseudo-UTP; 1-terc-butil-pseudo-UTP; 1-tiometoximetilpseudouridina TP; 1-tiomorfolinometilpseudouridina TP; 1-trifluoroacetilpseudouridina TP; 1-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-vinilpseudouridina TP; 2,2'-anhidro-uridina TP; 2'-bromo-desoxiuridina TP; 2'-F-5-Metil-2'-desoxi-UTP; 2'-OMe-5-Me-uTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-Etiniluridina TP; 2'a-triluorometiluridina TP; 2'b-Etiniluridina TP; 2'b-triluorometiluridina TP; 2'-desoxi-2',2'-difluorouridina TP; 2'-desoxi-2'-a-mercaptouridina TP; 2'-desoxi-2'-a-tiometoxiuridina TP; 2'-desoxi-2'-b-aminouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-azidouridina TP; 2'-desoxi-2'-bbromouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-clorouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-fluorouridinaTP; 2'-desoxi-2'-b-yodoruridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptouridina TP; 2'-desoxi-2'-b-tiometoxiuridina TP; 2-metoxi-4-tio-uridina; 2-metoxiuridina; 2'-O-Metil-5- (1-propinil)uridina TP; 3-alquilo-pseudo-UTP; 4'Azidouridina TP; TP de uridina 4'-catocíclica; 4'Etiniluridina TP; 5-(1-Propinil)ara-uridina TP; 5-(2-furanil)uridina TP; 5-cianouridina TP; 5-dimetilaminouridina TP; 5'-Homo-uridina TP; 5-yodo-2'-fluoro-desoxiuridina TP; 5-feniletiniluridina TP; 5-trideuterometil-6-deuterouridina TP; 5-trifluorometil-uridina TP; 5-vinilarauridina TP; 6-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 6-(fenilo sustituido)-pseudo-UTP; 6-amino-pseu do-UTP; 6-azido-pseudo-UTP; 6-bromo-pseudo-UTP; 6-butilpseudo-UTP; 6-cloro-pseudo-UTP; 6-ciano-pseudo-UTP; 6-dimetilamino-pseudo-UTP; 6-etoxi-pseudo-UTP; 6-etilcarboxilato-pseudo-UTP; 6-etil-pseudo-UTP; 6-fluoro-pseudo-UTP; 6-formil-pseudo-UTP; 6-hidroxiamino-pseudo-UTP; 6-Hidroxi-pseudo-UTP; 6-lodo-pseudo-UT P; 6-iso-propil-pseudo-UTP; 6-metoxi-pseudo-UTP; 6-metilaminopseudo-UTP; 6-metil-pseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-propil-pseudo-UTP; 6-terc-butilpseudo-UTP; 6-trifluorometoxi-pseudo-UTP; 6-trifluorometil-pseudo-UTP; alfa-tio-pseudo-UTP; Pseudouridina 1-(ácido 4-metilbencenosulfónico) TP; pseudouridina 1 -(ácido 4-metilbenzoico) TP; pseudouridina TP 1-[3-(2-etoxi)]ácido propiónico; pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-[2-{2-etoxi)-etoxi]-etoxi)-etoxi}]ácido propiónico; pseudouridina TP 1- [3-{2-(2-[2-{2(2-etoxi)-etoxi}-etoxi]-etoxi)-etoxi}]ácido propiónico; pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-[2-etoxi]-etoxi)-etoxi)]ácido propiónico; pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-etoxi)-etoxi}] ácido propiónico; ácido pseudouridina TP 1-metilfosfónico; éster dietílico del ácido 1-metilfosfónico de pseudouridina TP; ácido pseudo-UTP-N1-3-propiónico; ácido pseudo-UTP-N1-4-butanoico; ácido pseudo-UTP-N 1-pentanoico; ácido pseudo-UTP-N1-6-hexanoico; ácido pseudo-UTP-N1-7-heptanoico; ácido pseudo-UTP-N1-metil-p-benzoico; ácido pseudo-UTP-N1-p-benzoico; Wybutosina; hidroxiwybutosina; isoyosina; peroxiwybutosina; hidroxiwybutosina submodificada; 4-desmetilwyosina; 2,6(diamino)purina;1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-il: 1,3-( diaza)-2-( oxo )-fentiazina-1- yil;1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-il;1,3,5-(triaza)-2,6-(dioxa)-naftaleno;2 (amino)purina;2, 4,5-(trimetil)fenilo; 2'metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluorocitidina;2' metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluoroadenina;2'metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluorouridina;2'-amino-2'-desoxirribosa; 2-amino-6-cloro-purina; 2-aza-inosinilo; 2'-azido-2'-desoxirribosa; 2'fluoro-2'-desoxirribosa; bases modificadas con 2'-fluoro; 2'-O-metil-ribosa; 2-oxo-7-aminopiridopirimidin-3-ilo; 2-oxo-piridopirimidin-3-ilo; 2-piridinona; 3 nitropirrol; 3-(metil)-7-(propinil)isocarboestirililo; 3-(metil)isocarboestirililo; 4-(fluoro)-6-(metil)bencimidazol; 4-(metil)bencimidazol; 4-(metil)indolilo; 4,6-(dimetil)indolilo; 5 nitroindol; 5 pirimidinas sustituidas; 5-(metil)isocarboestirililo; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidina; 6-(azo)timina; 6-(metil)-7-(aza)indolilo; 6-cloro-purina; 6-fenilpirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-l-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2- (tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-l,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-l-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-l,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-l-ilo; 7-(aza)indolilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazinl-ilo; 7-(guanidinioaikyihidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-l-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquil-hidroxi)-l,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-l-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-l,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-l-ilo; 7-(propinil)isocarboestirililo; 7-(propinil)isocarboestirilo, propinil-7-(aza)indolilo; 7-desaza-inosinilo; 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo 7-sustituido; 1,3-(diaza)-2-(0xo)-fenoxazin-1-ilo 7-sustituido; 9-(metil)-imidizopiridinilo; aminoindolilo; antracenilo; bis-orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo bis-orto-sustituido; difluorotolilo; hipoxantina; imidizopiridinilo; inosinilo; isocarboestirilo; isoguanisina; purinas sustituidas en N2; N6-metil-2-amino-purina; purinas sustituidas en N6; derivado N-alquilado; naftalenilo; nitrobencimidazolilo; nitroimidazolilo; nitroindazolilo; nitropirazolilo; nubularina; purinas sustituidas en O6; derivado O-alquilado; orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo orto-sustituido; Oxoformicina TP; para-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin2-on-3-ilo para-sustituido; pentacenilo; fenantracenilo; Fenilo; propinil-7-(aza)indolilo; pirenilo; piridopirimidin-3-ilo; piridopirimidin-3-ilo, 2-oxo-7-amino-piridopirimidin-3-ilo; pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; pirrolopirimidinilo; pirrolopirizinilo; estilbencilo; 1,2,4-triazoles sustituidos; tetracenilo; tubercidina; xantina; xantosina-5'-TP; 2-tio-zebularina; 5-aza-2-tiozebularina; 7-deaza-2-amino-purina; ribonucleósido de piridin-4-ona; 2-Amino-ribosido-TP; formicina A TP; Formicina B TP; pirrolosina TP; 2'OH-ara-adenosina TP; 2'-OH-afa-citidifie TP; 2'OH-ara-uridina TP; 2'OH-ara-guanosina TP; 5-(2-carbometoxivinil)uridina TP; y N6-(19-Amino-pentaoxanonadecil)adenosina TP.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) incluyen una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente,
En algunas realizaciones, las bases nitrogenadas modificadas en polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) se seleccionan de entre el grupo que consiste en pseudouridina (y ), N1-metilpseudouridina (m1^ ), Nl-etilpseudouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tiopseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tiopseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina y 2'-O-metil uridina. En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) incluyen una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, las bases nitrogenadas modificadas en polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) son seleccionados de entre el grupo que consiste en 1-metil-pseudouridina (m1^ ), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (y ), a-tio-guanosina y a-tio-adenosina. En algunas realizaciones, los polinucleótidos incluyen una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden pseudouridina (y ) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden 1- metil-pseudouridina (m1Y). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden 1-metil-pseudouridina (m1Y) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden 2-tiouridina (s2U). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, esw decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden metoxiuridina (mo5U). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, ews decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden 2'-O-metiluridina. En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden 2'-O-metiluridina y 5-metilcitidina (m5C). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden N6-metiladenosina (m6A). En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) comprenden N6-metil-adenosina (m6A) y 5-metil-citidina (m5C),
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, polinucleótidos de ARN, es decir, polinucleótidos de ARNm) se modifican uniformemente (por ejemplo, se modifican completamente, se modifican en toda la secuencia) para una modificación particular. Por ejemplo, un polinucleótido se puede modificar uniformemente con 5-metil-citidina (m5C), lo que significa que todos los residuos de citosina en la secuencia de ARNm se reemplazan con 5-metil-citidina (m5C). De manera similar, un polinucleótido se puede modificado uniformemente para cualquier tipo de resto de nucleósido presente en la secuencia por sustitución con un resto modificado como los expuestos anteriormente.
Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (ac4C), 5-metilcitidina (m5C), 5-halo-citidina (p. ej., 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2-tiocitidina (s2C) y 2-tio-5-metil-citidina.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una uridina modificada. Bases nitrogenadas ejemplares y En algunas realizaciones, una base nitrogenada modificada es una citosina modificada. los nucleósidos que tienen una uridina modificada incluyen 5-cianouridina y 4'-tiouridina.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una adenina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una adenina modificada incluyen 7-desaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A) y N6-metil-adenosina (m6A).
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1l), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-desaza-guanosina, 7-ciano-7-desaza-guanosina (preQO), 7-aminometil-7-desaza-guanosina (preQ1), 7-metilguanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina.
Los polinucleótidos de la presente descripción pueden modificarse de forma parcial o total en toda la longitud de la molécula. Por ejemplo, uno o más o todos los tipos de nucleótidos (por ejemplo, purina o pirimidina, o cualquiera o más o todos los A, G, U, C) pueden modificarse uniformemente en un polinucleótido de la descripción, o en un región de secuencia predeterminada dada del mismo (por ejemplo, en el ARNm que incluye o excluye la cola poliA). En algunas realizaciones, todos los nucleótidos X de un polinucleótido de la presente descripción (o de una región de secuencia dada del mismo) son nucleótidos modificados, donde X puede ser cualquiera de los nucleótidos A, G, U, C, o cualquiera de las combinaciones A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C o A+G+C.
El polinucleótido puede contener de alrededor de 1 % a alrededor de 100 % de nucleótidos modificados (ya sea con relación al contenido de nucleótidos total, o en relación con uno o más tipos de nucleótidos, es decir, uno o más de A, G, U o C) o cualquier porcentaje intermedio (es decir, del 1 % al 20 %, del 1 % al 25 %, del 1 % al 50 %, del 1 % al 60 %, del 1 % al 70 %, del 1 % al 80 %, del 1 % al 90 %, del 1 % al 95 %, del 10 % al 20 %, del 10 % al 25 %, del 10 % al 50 %, del 10 % al 60 %, del 10 % al 70 %, del 10 % al 80 %, del 10 % al 90 %, del 10 % al 95 %, del 10 % al 100 %, del 20 % al 25 %, del 20 % al 50 %, del 20 % al 60 %, del 20 % al 70 %, del 20 % al 80 %, del 20 % al 90 %, del 20 % al 95 %, del 20 % al 100 %, del 50 % al 60 %, del 50 % al 70 %, del 50 % al 80 %, del 50 % al 90 %, del 50 % al 95 %, del 50 % al 100 %, del 70 % al 80 %, del 70 % al 90 %, del 70 % al 95 %, del 70 % al 100 %, del 80 % al 90 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 100 %, del 90 % al 95 %, del 90 % al 100 % y del 95 % al 100 %). Se entenderá que cualquier porcentaje restante está representado por la presencia de A, G, U o C no modificados.
Los polinucleótidos pueden contener un mínimo del 1 % y un máximo del 100 % de nucleótidos modificados, o cualquier porcentaje intermedio, tal como al menos el 5 % de nucleótidos modificados, al menos el 10 % de nucleótidos modificados, al menos el 25 % de nucleótidos modificados, al menos el 50 % de nucleótidos modificados, al menos el 80 % de nucleótidos modificados o al menos el 90 % de nucleótidos modificados. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden contener una pirimidina modificada, tal como un uracilo o citosina modificados. En algunas realizaciones, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 25 %, al menos el 50 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 % del uracilo del polinucleótido se reemplaza con un uracilo modificado (por ejemplo,un uracilo sustituido en la posición 5). El uracilo modificado se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única, o se puede reemplazar por una pluralidad de compuestos que tienen estructuras diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas). n algunas realizaciones, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 80%, al menos el 90% o el 100% de la citosina en el polinucleótido se reemplaza con una citosina modificada (p.ej., una citosina 5-sustituida). La citosina modificada se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única, o se puede reemplazar por una pluralidad de compuestos que tienen estructuras diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas),
Por lo tanto, en algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) comprenden un elemento 5'UTR, un marco de lectura abierto opcionalmente optimizado por codón y un elemento 3'UTR, una secuencia poli(A) y/o una señal de poliadenilación donde el ARN no se modifica químicamente.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es un uracilo modificado. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con un uracilo modificado incluyen pseudouridina (y ), ribonucleósido de piridin-4-ona, 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (s2U), 4-tio-uridina (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxi-uridina (ho5U), 5-aminoallil-uridina, 5-halo-uridina (or ejemplo. 5-yodo-uridina o 5-bromo-uridina), 3-metiluridina (m3U), 5-metoxi-uridina (mo5U), uridina ácido 5-oxiacético (cmo5U), uridina ácido 5-oxiacético metil éster (mcmo5U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), 5-carboxihidroximetil-uridinametil éster (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2 -tiouridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio- uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tiouridina (mnm5s2U), 5-methilaminomethil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-[carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propynil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometil-uridina (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 5-metil-uridina (m5U, es decir, teniendo la deoxitimina como nucleobase), 1-metil-pseudouridina (m1^ ), 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metilpseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1 -metil-1- deaza-pseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tiodihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxi-uridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudosulfidina, 4-metoxi-2- tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-ca(boxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3^ ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenila minometil)-2-tio-uridina (inm5S2U), a-tio-uridina, 2'-O-metil-uridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (^m), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um), y 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1 -tio-uridina, desoxitimidina, 2'-F-ara-uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil) uridina, y 5-[3-(1-E-propenila mino)]uridina,
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una citosina modificada incluyen 5-aza-citidina, 6-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina (m3C), N4-acetil-citidina (ac4C), 5-formil-citidina (f®C), N4-metil-citidina (m4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p.ej., 5-yodocitidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio citidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deazapseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tiozebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metilpseudoisocitidina, lisidina (k2C), a-tio-citidina, 2'-O-metil-citidina (Cm), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidina (f5Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1-tio-citidina, 2'-F-ara-citidina, 2'-F-citidina, y 2'-OH-ara-citidina.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una adenina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una adenina modificada incluyen 2-amino-purina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-halo-purina (por ejemplo, 2-amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (por ejemplo, 6-cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azidoadenosina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-amino-purina, 7-deaza-8-aza-2-amino-purina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenosina (ms2m6A), N6-isopentenil-adenosina (i6A), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenosina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (io6A), 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoil-adenosina (g6A), N6-treonilcarbamoil-adenosina (t6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenosina (m®t6A), 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenosina (ms2g6A), N6,N6-dimetiladenosina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (ms2hn6A), N6-acetil-adenosina (ac6A), 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, a-tio-adenosina, 2'-O-metil-adenosina (Am), N6,2-O-dimetil-adenosina (m6Am), N6,N6,2-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2-O-dimetiladenosina (m1Am), 2-O-ribosiladenosina (fosfato) (Ar(p)), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenosina, 8-azidoadenosina, 2'-F-aa-adenosina, 2'-F-adenosina, 2'- OH-ara-adenosina y N6-(19-amino-pentaoxanonadecil)-adenosina.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4-demetil-wiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (02yW), hidroxiwibutosina (OhyW), hidroxiwibutosina insuficientemente modificada (OhyW*), 7-deaza-guanosina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosil-queuosina (galQ), mannosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQo), 7-aminometil-7-deaza-guanosina (preQI), arcaeosina (G+), 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deazaguanosina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina (m7G), 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metil-inosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metil-guanosina (m1G), N2-metil-guanosina (m2G), N2,N2-dimetil-guanosina (m22G), N2,7-dimetil-guanosina (m2'7G), N2, N2,7-dimetil-guanosina (m2'2'7G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina, a-tio-guanosina, 2-O-metil-guanosina (Gm), N2-metil-2-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m22Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2-O-metil-guanosina (m2'7Gm), 2'-O-metil-inosina (Im), 1,2-O-dimetil-inosina (m1Im), 2'-O-ribosilguanosina (fosfato) (Gr(p)), 1-tio-guanosina, 06-metil-guanosina, 2'-F-ara-guanosina y 2'-F-guanosina.
Mutantes de sitios de glicosilación unidos a N
Los glicanos unidos a N de proteínas virales desempeñan papeles importantes en la modulación de la respuesta inmune. Los glicanos pueden ser importantes para mantener las conformaciones antigénicas adecuadas, proteger los posibles epítopos de neutralización, y pueden alterar la susceptibilidad proteolítica de las proteínas. Algunos virus tienen sitios de glicosilación putativos unidos a N. La eliminación o modificación de un sitio de glicosilación unido a N puede mejorar la respuesta inmunitaria. Por tanto, la presente divulgación proporciona, en algunas realizaciones, vacunas de ARN (es decir, ARNm) que comprenden ácidos nucleicos (es decir, ARNm) que codifican polipéptidos antigénicos que comprenden una deleción o modificación en uno o más sitios de glicosilación unidos a N.
Transcripción in vitro de ARN (es decir, ARNm)
Las vacunas de virus respiratorios de la presente descripción comprenden al menos un polinucleótido de ARN, como un ARNm (es decir, ARNm modificado). El ARNm, por ejemplo, se transcribe in vitro a partir de una plantilla de ADN, denominada "plantilla de transcripciónin v itro " En algunas realizaciones, una plantilla de transcripción in vitro codifica una región 5' no traducida (UTR), contiene un marco de lectura abierto y codifica una UTR 3' y una cola poliA. La composición particular de la secuencia de ácido nucleico y la longitud de una plantilla de transcripción in vitro dependerán del ARNm codificado por la plantilla.
Una "región no traducida 5" (5'UTR)hace referencia a una región de un ARNm que se encuentra directamente aguas arriba (es decir, 5') respecto al codón de inicio (es decir, el primer codón de un transcrito de ARNm traducido por un ribosoma) que no codifica una proteína o un péptido.
Una "región no traducida 3'" (3'UTR) hace referencia a una región de un ARNm que se encuentra directamente aguas abajo (es decir, 3') respecto al codón de terminación (es decir, el codón de un transcrito de ARNm que indica la terminación de la traducción) que no codifica una proteína o un péptido.
Un "marco de lectura abierto" es un tramo continuo de ADN que comienza con un codón de inicio (p. ej., metionina (ATG)) y termina con un codón de parada (p. ej., TAA, TAG o TGA) y codifica un polipéptido.
Una "cola poliA" es una región del ARNm que se encuentra aguas abajo, por ejemplo, directamente aguas abajo (es decir, 3'), respecto a la UTR 3' que contiene monofosfatos de adenosina consecutivos múltiples. Una cola poliA puede contener de 1o a 300 monofosfatos de adenosina. Por ejemplo, una cola poliA puede contener 10, 20, 30, 40, 5o, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 monofosfatos de adenosina. En algunas realizaciones, una cola poliA contiene de 50 a 250 monofosfatos de adenosina. En un entorno biológico relevante (por ejemplo, en células, in vivo) la cola de poli(A) protege al ARNm de la degradación enzimática, por ejemplo, en el citoplasma y ayuda con la finalización de la transcripción, la exportación del ARNm del núcleo y la traducción.
En algunas realizaciones, un polinucleótido incluye de 200 a 3.000 nucleótidos. Por ejemplo, un polinucleótido puede incluir de 200 a 500, de 200 a 1000, de 200 a 1500, de 200 a 3000, de 500 a 1000, de 500 a 1500, de 500 a 2000, de 500 a 3000, de 1000 a 1500, de 1000 a 2000, de 1000 a 3000, de 1500 a 3000 o de 2000 a 3000 nucleótidos.
Adyuvantes de flagelina
La flagelina es una proteína monomérica de aproximadamente 500 aminoácidos que se polimeriza para formar los flagelos asociados con el movimiento bacteriano. La flagelina se expresa mediante una variedad de bacterias flageladas (Salmonella typhimurium por ejemplo), así como bacterias no flageladas (tales como Escherichia coli). La detección de la flagelina por parte de las células del sistema inmune innato (células dendríticas, macrófagos, etc.) está mediada por el receptor similar a Toll 5 (TLR5), así como por los receptores similares a Nod (NLR) Ipaf y Naip5. Se identificó que los TLR y NLR desempeñan un papel en la activación de la respuesta inmunitaria innata y la respuesta inmunitaria adaptiva. Como tal, la flagelina proporciona un efecto adyuvante en una vacuna.
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos que codifican polipéptidos de flagelina conocidos se encuentran disponibles al público en la base de datos de GenBank NCBI. Las secuencias de flagelina de S. Typhimurium, H. Pylori, V. Cholera, S. marcesens, S. flexneri, T. Pallidum, L. pneumophila, B. burgdorferi, C. difficile, R. melloti, A. tumefaciens, R. lupini, B. clarridgeiae, P. Mirabilis, B, subtilus, L. monocytogenes, P. aeruginosa, y E. coli, son conocidas entre otras.
Un polipéptido de flagelina, como se usa en esta invención, se refiere a una proteína de flagelina de longitud completa, fragmentos inmunogénicos de la misma y péptidos que tienen al menos un 50 % de identificación de secuencia con una proteína de flagelina o fragmentos inmunogénicos de la misma. Proteínas de flagelina ejemplares incluyen flagelina de Sahonella typhi (Número de entrada UniPro: Q56086), Sahonella typhimurium (A0A0C9DG09), Salmonella enteritidis (A0A0C9BAB7), y Sahonella choleraesuis (Q6V2X8), y SEQ iD NO: 54-56 (Tabla 17). En algunas realizaciones, el polipéptido de flagelina tiene una identidad de secuencia de al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % con respecto a una proteína flagelina o fragmentos inmunógenos de esta.
En algunas realizaciones, el polipéptido de flagelina es un fragmento inmunogénico. Un fragmento inmunógeno es una parte de una proteína flagelina que provoca una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria de TLR5. Un ejemplo de un fragmento inmunógeno es una proteína flagelina en la cual la totalidad o una parte de una región bisagra se eliminó o reemplazó con otros aminoácidos. Por ejemplo, puede insertarse un polipéptido antigénico en la región bisagra. Las regiones bisagra son las regiones hipervariables de una flagelina. Las regiones bisagra de una flagelina también se denominan “región o dominio D3”, “región o dominio de hélice”, “región o dominio hipervariable” y “región o dominio variable”. "Al menos una porción de una región bisagra", como se usa en esta invención, se refiere a cualquier parte de la región bisagra de la flagelina, o la totalidad de la región bisagra. En otras realizaciones, un fragmento inmunogénico de flagelina es un fragmento de extremo C de 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos.
El monómero de flagelina se forma mediante los dominios D0 a D3. D0 y D1, que forman el tallo, están compuestos por hélices alfa largas en tándem y están conservados en gran medida entre bacterias distintas. El dominio D1 incluye varios tramos de aminoácidos que son útiles para la activación de TLR5. El dominio D1 completo o una o más de las regiones activas dentro del dominio son fragmentos inmunógenos de flagelina. Los ejemplos de regiones inmunógenas dentro del dominio D1 incluyen los residuos 88-114 y los residuos 411-431 de la flagelina de Salmonella typhimurium FliC. Dentro de los 13 aminoácidos en la región 88-100, se permiten al menos 6 sustituciones entre flagelina de Salmonella y otras flagelinas que todavía preservan la activación de TLR5. Por lo tanto, los fragmentos inmunogénicos de flagelina incluyen secuencias similares a flagelina que activan TLR5 y contienen un motivo de 13 aminoácidos que es 53% o más idéntico a la secuencia de Samonella en 88-100 de FliC (LQRVRELAVQSAN; SEQ ID NO: 84).
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) incluye un ARN que codifica una proteína de fusión de flagelina y uno o más polipéptidos antigénicos. Una “proteína de fusión”, tal como se usa en esta invención, se refiere a la unión de dos o más componentes de la construcción. En algunas realizaciones, un extremo carboxi del polipéptido antigénico se fusiona o une a un extremo amino del polipéptido de flagelina. En otras realizaciones, un extremo amino del polipéptido antigénico se fusiona o une a un extremo carboxi del polipéptido de flagelina. La proteína de fusión puede incluir, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más polipéptidos de flagelina unidos a uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más polipéptidos antigénicos. Cuando se unen dos o más polipéptidos de flagelina y/o dos o más polipéptidos antigénicos, dicha construcción puede mencionarse como un “multímero”.
Cada uno de los componentes de una proteína de fusión pueden unirse directamente entre sí o pueden estar conectados a través de un enlazador. Por ejemplo, el enlazador puede ser un enlazador de aminoácido. El enlazador de aminoácidos codificado por la vacuna de ARN (es decir, ARNm) para unir los componentes de la proteína de fusión puede incluir, por ejemplo, al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un residuo de lisina, un residuo de ácido glutámico, una serina residuo y un residuo de arginina. En algunas realizaciones, el enlazador tiene una longitud de 1-30, 1-25, 1-25, 5-10, 5, 15 o 5-20 aminoácidos.
En otras realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) incluye al menos dos polinucleótidos de ARN separados, uno que codifica uno o más polipéptidos antigénicos y el otro que codifica el polipéptido de flagelina, donde los al menos dos polinucleótidos de ARN están coformulados en un vehículo tal como una nanopartícula lipídica.
Vacunas de ARN (es decir, ARNm) de amplio espectro
Puede haber situaciones en las que las personas se encuentren en riesgo de padecer una infección con más de una cepa de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1). Las vacunas terapéuticas de ARN (es decir, ARNm) son particularmente adecuadas para estrategias de vacunación combinada debido a una serie de factores que incluyen, entre otros, la velocidad de fabricación, la capacidad de adaptar rápidamente las vacunas para adaptarse a las amenazas geográficas percibidas y similares. Asimismo, debido a que las vacunas utilizan el cuerpo humano para producir la proteína antigénica, son responsables por la producción de proteínas antigénicas más complejas y más largas, lo que hace posible el pliegue adecuado, expresión superficial, presentación de antígenos, etc., en el sujeto humano. Para la protección contra más de una cepa de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1), puede administrarse una vacuna de combinación que incluye ARN (es decir, ARNm) que codifica al menos una proteína de polipéptido antigénico (o parte antigénica de esta) de un primer virus respiratorio e incluye además ARN que codifica al menos una proteína de polipéptido antigénico (o parte antigénica de esta) de un segundo virus respiratorio. El ARN (es decir, el ARNm) se puede coformular, por ejemplo, en una sola nanopartícula lipídica (LNP) o se puede formular en LNP separados para la coadministración.
Vacunas para uso en procedimientos de tratamiento
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios pueden utilizarse como agentes terapéuticos o profilácticos, por sí solas o de forma combinada con otra u otras vacunas. Se pueden utilizar en la medicina para impedir y/o tratar infecciones/enfermedades respiratorias. La presente invención proporciona la vacuna de ARNm definida en las reivindicaciones para su uso en un procedimiento para impedir y/o tratar una enfermedad BetaCoV en un sujeto. En aspectos ejemplares, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de la presente descripción se usan para proporcionar protección profiláctica contra BetaCoV (incluidos MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1). La protección profiláctica contra BetaCoV (incluidos MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1) se puede lograr después de la administración de un ARN (es decir, ARNm) vacuna de la presente divulgación. Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la presente descripción pueden utilizarse para tratar o impedir “co-infecciones” virales que contienen dos o más infecciones respiratorias. Las vacunas pueden administrarse una, dos, tres, cuatro o más veces, pero es probable que sea suficiente administrar la vacuna una vez (opcionalmente seguida de un solo refuerzo). Es posible, aunque menos deseable, administrar la vacuna a un infectado individuo para lograr una respuesta terapéutica. Es posible que sea necesario ajustar la dosificación en consecuencia.
En esta invención se describe un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (incluidos MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1). El procedimiento implica administrar al sujeto una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorio que comprende al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que posee un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1) de este, mediante lo cual se induce en el sujeto una respuesta inmunitaria específica para un polipéptido antigénico de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1) o un fragmento inmunógeno de este, donde el título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en el sujeto aumenta luego de la vacunación con respecto al título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en un sujeto al que se vacunó con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1). Un "anticuerpo de polipéptido anti-antigénico" es un anticuerpo en suero que se une específicamente al polipéptido antigénico. En algunos aspectos, una vacuna de ARN (p. ej., ARNm) (p.ej., hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (incluidos MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o vacuna de ARN HCoV-HKU1) capaz de provocar una respuesta inmunitaria se administra por vía intramuscular a través de una composición que incluye un compuesto según la Fórmula (I), (IA), (II), (IIa), ( IIb), (IIc), (IId) o (IIe) (por ejemplo, Compuesto 3, 18, 20, 25, 26, 29, 30, 60, 108-112 o 122).
Una dosis profilácticamente efectiva es una dosis terapéuticamente efectiva que impide la infección por el virus a un nivel clínicamente aceptable. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente efectiva es una dosis indicada en un prospecto para la vacuna. Tal como se usa en esta invención, una vacuna tradicional hace referencia a una vacuna diferente a las vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción. Por ejemplo, una vacuna tradicional incluye, de modo no taxativo, vacunas de microorganismos vivos/atenuados, vacunas de microorganismos muertos/inactivados, vacunas de subconjuntoes, vacunas de antígenos proteicos, vacunas de ADN, vacunas de VLP, etc. En ejemplos de realizaciones, una vacuna tradicional es una vacuna que logró una aprobación para la regulación y/o fue registrada por un organismo nacional de regulación de fármacos, por ejemplo, la Administración de alimentos y fármacos (FDA) de Estados Unidos o la Agencia europea de medicamentos (EMA).
En algunos aspectos, el título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en el sujeto aumenta de 1 log a 10 log luego de la vacunación con respecto a un título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1).
En algunos aspectos, el título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en el sujeto aumenta 1 log, 2 log, 3 log, 5 log o 10 log luego de la vacunación con respecto a un título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1).
En esta invención se describe un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (incluidos MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1). El procedimiento implica administrar al sujeto una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorio que comprende al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que posee un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1) o un fragmento inmunógeno de este, mediante lo cual se induce en el sujeto una respuesta inmunitaria específica para un polipéptido antigénico de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1) o un fragmento inmunógeno de este, donde la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria de un sujeto vacunado con una vacuna tradicional contra hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1) de 2 veces a 100 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN (es decir, ARNm).
En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100 veces el nivel de dosificación en relación con hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (incluidos MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1) vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm).
En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 10-100 veces o 100-1000 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN (es decir, ARNm) de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1).
En algunos aspectos, se evalúa la respuesta inmunitaria mediante la determinación del título de anticuerpo [proteína] en el sujeto.
En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100 el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN (es decir, ARNm) de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1) al administrar al sujeto una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorio que comprende al menos un polinucleótido de ARN (es decir, ARNm) que posee un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1), mediante lo cual se induce en el sujeto una respuesta inmunitaria específica al polipéptido antigénico o un fragmento inmunógeno de este, donde la respuesta inmunitaria en el sujeto se induce de 2 días a 10 semanas antes con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional contra hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1). En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional a una dosis que es de 2 veces a 100 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN (es decir, (es decir, ARNm).
En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 2 días antes, o 3 días antes, con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional.
En algunos aspectos, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 5 semanas o 10 semanas antes, con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente efectiva de una vacuna tradicional.
También se proporciona en esta invención un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HcoV-HKU1) al administrar al sujeto una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorio que tiene un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico, donde el polinucleótido de ARN no incluye un elemento de estabilización, y donde no se coformula ni coadministra un adyuvante con la vacuna.
Composiciones terapéuticas y profilácticas
La presente invención proporciona la vacuna de ARNm definida en las reivindicaciones para su uso en un procedimiento para impedir y/o tratar una enfermedad BetaCoV en un sujeto.
En algunas realizaciones, la vacuna de virus respiratorios que contiene polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm) como se describe en esta invención se puede administrar a un sujeto (por ejemplo, un sujeto mamífero, como un sujeto humano), y los polinucleótidos de ARN (es decir, ARNm) se traducen in vivo para producir un polipéptido antigénico.
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios pueden ser inducidas para la traducción de un polipéptido (por ejemplo, antígeno o inmunógeno) en una célula, tejido u organismo. En algunas realizaciones, dicha traducción se produce in vivo, aunque dicha traducción puede producirse ex vivo, en cultivo o in vitro. En algunas realizaciones, se pone la célula, tejido u organismo en contacto con una cantidad efectiva de una composición que contiene una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios que contiene un polinucleótido que tiene al menos una región traducible que codifica un polipéptido antigénico.
Se proporciona una "cantidad efectiva" de una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios en función, al menos en parte, del tejido diana, el tipo celular diana, los medios de administración, las características físicas del polinucleótido (por ejemplo, tamaño y extensión de nucleósidos modificados) y otros componentes de la vacuna, y otros determinantes. En general, una cantidad efectiva de la composición de vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios proporciona una respuesta inmunitaria inducida o reforzada en función de una producción de antígenos en la célula, preferentemente más efectiva que una composición que contiene un polinucleótido no modificado correspondiente que codifica el mismo antígeno o un antígeno de péptido. El aumento de la producción de antígenos puede demostrarse mediante el aumento de la transfección celular (el porcentaje de células transfectadas con el ARN, por ejemplo, vacuna de ARNm), el aumento de la traducción de proteínas del polinucleótido, la disminución de la degradación del ácido nucleico (como se demuestra, por ejemplo, mediante el aumento de la duración de la traducción de proteínas de un polinucleótido modificado), o la respuesta inmunitaria innata alterada de la célula huésped.
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, (es decir, ARNm) (que incluyen polinucleótidos y sus polipéptidos codificados) de acuerdo con la presente descripción pueden utilizarse para el tratamiento de BetaCoV (inclusive MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH y/o HCoV-HKU1).
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) respiratorios se pueden administrar en forma profiláctica o terapéutica como parte de un programa de inmunización activo a individuos sanos o que se encuentran en etapas tempranas de infección durante la fase de incubación o durante la infección activa, luego de la aparición de síntomas. En algunas realizaciones, la cantidad de vacuna de ARN (es decir, ARNm) de la presente descripción proporcionada a una célula, un tejido o un sujeto puede ser una cantidad efectiva para profilaxis inmunitaria.
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios pueden administrarse con otros compuestos profilácticos o terapéuticos. Como ejemplo no limitante, el compuesto profiláctico o terapéutico puede ser un adyuvante o un refuerzo. Tal como se usa en esta invención, cuando se hace referencia a una composición profiláctica, tal como una vacuna, el término “refuerzo” se refiere a una administración extra de la composición profiláctica (vacuna). Puede administrarse un refuerzo (o vacuna de refuerzo) después de una administración anterior de la composición profiláctica. El plazo de administración entre la administración inicial de la composición profiláctica y el refuerzo puede ser, de modo no taxativo, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 35 minutos, 40 minutos, 45 minutos, 50 minutos, 55 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 día, 36 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 10 días, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 18 meses, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años, 11 años, 12 años, 13 años, 14 años, 15 años, 16 años, 17 años, 18 años, 19 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años, 40 años, 45 años, 50 años, 55 años, 60 años, 65 años, 70 años, 75 años, 80 años, 85 años, 90 años, 95 años o más de 99 años. En algunas realizaciones, el período de administración entre la administración inicial de la composición profiláctica y el refuerzo puede ser, de modo no taxativo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses o 1 año.
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios pueden administrarse por vía intramuscular o intradérmica, de manera similar a la administración de vacunas inactivadas conocidas en la técnica.
Las vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios pueden utilizarse en diversos casos, dependiendo de la prevalencia de la infección o el grado o nivel de la necesidad médica no satisfecha. Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) tienen propiedades superiores debido a que producen títulos de anticuerpo mucho mayores y producen respuestas en forma más temprana que los agentes/composiciones antivirales disponibles en el mercado.
En esta invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios y complejos y/o composiciones de vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) opcionalmente de forma combinada con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios pueden formularse o administrarse por sí solas o junto con uno o más componentes distintos.
En algunas realizaciones, las vacunas de virus respiratorios (es decir, ARNm) no incluyen un adyuvante (carecen de adyuvante).
Las vacunas de ARN (es decir. ARNm) de virus respiratorios pueden formularse o administrarse de forma combinada con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones de vacuna comprenden al menos una sustancia activa adicional, tal como, por ejemplo, una sustancia terapéuticamente activa, una sustancia profilácticamente activa o una combinación de ambas. Las composiciones de vacuna pueden ser estériles, libres de pirógenos o estériles y libres de pirógenos. Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
En algunos aspectos, las vacunas de ARN de virus respiratorios (por ejemplo, ARNm) se administran a seres humanos, pacientes o sujetos humanos. Para los fines de la presente divulgación, la frase "ingrediente activo" generalmente se refiere a las vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) o los polinucleótidos que contienen, por ejemplo, polinucleótidos de ARN (por ejemplo, polinucleótidos de ARNm) que codifican polipéptidos antigénicos.
Las formulaciones de las composiciones de vacunas de virus respiratorios descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo (es decir, el polinucleótido de ARNm) con un excipiente y/o uno o más ingredientes accesorios y luego, si es necesario y/o deseable, dividir, moldear y/o o envasar el producto en un conjunto monodosis o multidosis deseado.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la invención variarán conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía de administración de la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 % y 100 %, por ejemplo, entre 0,5 y 50 %, entre 1-30 %, entre 5-80 %, al menos 80 % (p/p) de ingrediente activo.
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios se pueden formular utilizando uno o más excipientes para (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la transfección celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (por ejemplo, a partir de una formulación de depósito); (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, dirigirse a tejidos o tipos celulares específicos); (5) aumentar la traducción de la proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de la proteína codificada (antígeno) in vivo.
Elementos estabilizadores
Se ha encontrado que las moléculas de ARNm eucariotas de origen natural contienen elementos estabilizadores, que incluyen, entre otros, regiones no traducidas (UTR) en su extremo 5' (5'UTR) y/o en su extremo 3' (3'UTR), además de otras características estructurales, como una estructura 5'-cap o una cola 3'-poli(A). Normalmente se transcriben tanto la 5'UTR como la 3'UTR del ADN genómico y son elementos del ARNm prematuro. Se suelen agregar las características estructurales que caracterizan el ARNm maduro, tales como casquete 5' y la cola 3'-poli(A), al ARNm (prematuro) transcrito durante el procesamiento de ARNm. La cola 3'-poli(A) usualmente es una extensión de nucleótidos de adenina que se agrega al extremo 3' del ARNm transcripto. Puede comprender hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenina. En algunas realizaciones, la extensión de la cola 3'-poli(A) puede ser un elemento esencial respecto a la estabilidad del ARNm individual.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) puede incluir uno o más elementos estabilizantes. Los elementos estabilizadores pueden incluir, por ejemplo, una horquilla de histona. Se ha identificado una proteína de unión a horquilla (SLBP - Stem-Loop Binding Protein) de 32 kDa. Se asocia a la horquilla de histona en el extremo 3' de los mensajes de histona tanto en el núcleo como en el citoplasma. El ciclo celular regula su nivel de expresión, con picos durante la fase S, cuando los niveles de ARNm de histona también se encuentran elevados. Se ha demostrado que la proteína es esencial para el procesamiento eficiente del extremo 3' del pre-ARNm de histona por parte de U7 snRNP. Aún se asocia la SLBP con la horquilla luego del procesamiento y luego se estimula la traducción de ARNm de histona maduro en proteínas de histona en el citoplasma. El dominio de unión de ARN de SLBP se conserva mediante metazoarios y protozoarios, y su unión a la horquilla de histona depende de la estructura del bucle. El sitio de unión mínimo incluye al menos tres nucleótidos 5' y dos nucleótidos 3' respecto a la horquilla.
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) incluyen una región codificante, al menos una horquilla de histona y, opcionalmente, una secuencia poli(A) o señal de poliadenilación. La secuencia poli(A) o la señal de poliadenilación generalmente debería mejorar el nivel de expresión de la proteína codificada. La proteína codificada, en algunas realizaciones, no es una proteína histona, una proteína reportera (por ejemplo, Luciferasa, GFP, EGFP, pgalactosidasa, EGFP), o una proteína marcadora o de selección (por ejemplo, alfa-globina, galactoquinasa y xantina:guanina fosforribosil transferasa (GPT)).
En algunas realizaciones, la combinación de una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación y al menos una horquilla de histona, aunque ambas representan mecanismos alternativos en la naturaleza, actúan en forma sinérgica para aumentar la expresión proteica más allá del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. Se ha observado que el efecto sinérgico de la combinación de poli(A) y al menos una horquilla de histona no depende del orden de los elementos o de la extensión de la secuencia de poli(A).
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, (es decir, ARNm) no comprende un elemento aguas abajo abajo de histona (HDE - Histone Downstream Element). El "elemento aguas abajo de histona" (HDE, por sus siglas en inglés) incluye una extensión de polinucleótidos rica en purina de aproximadamente 15 a 20 nucleótidos en dirección 3' respecto a una horquilla de origen natural, lo que representa el sitio de unión para el ARNpn U7 involucrado en el procesamiento de pre-ARNm de histona en ARNm de histona maduro. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la invención no incluye un intrón.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) puede o no contener una secuencia mejoradora y/o promotora que se puede encontrar modificada o no modificada o que puede estar activada o inactivada. En algunas realizaciones, la horquilla de histona se deriva en general de genes de histona e incluye un apareamiento de bases intramolecular de dos secuencias complementarias parcial o totalmente inversas separadas por un espaciador, que incluye (por ejemplo, que consiste en) una secuencia breve, que forma el bucle de la estructura. Usualmente, la región de bucle no apareada no es capaz de aparear bases con ninguno de los elementos de tallo-bucle. Se produce con mayor frecuencia en el ARN, ya que es un componente clave de muchas estructuras secundarias del ARN, pero también puede estar presente en el ADN de cadena simple. En general, la estabilidad de la estructura de horquilla depende de la extensión, cantidad de apareamientos incorrectos o protuberancias, y la composición de bases de la región apareada. En algunas realizaciones, puede producirse un apareamiento de bases que oscila (apareamiento de bases que no responde a Watson y Crick). En algunas realizaciones, la al menos una secuencia de horquilla de histona comprende una extensión de 15 a 45 nucleótidos.
En otras realizaciones, es posible eliminar una o más secuencias ricas en AU de la vacuna de ARN (es decir, ARNm). Estas secuencias, a veces denominadas AURES, son secuencias desestabilizadoras que se encuentran en la 3'UTR. Las AURES pueden eliminarse de las vacunas de ARN (es decir, ARNm). De manera alternativa, las AURES pueden permanecer en la vacuna de ARN (es decir, ARNm).
Formulación de Nanopartículas
En la invención, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios se formulan en una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios se formulan en una nanopartícula lipídica que incluye un lípido no catiónico como, entre otros, colesterol o dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE).
Una formulación de nanopartículas lipídicas puede verse afectada, de modo no taxativo, por la selección del componente lipídico catiónico, el grado de saturación lipídica catiónica, la naturaleza de la PEGilación, la relación de todos los componentes y parámetros biofísicos tales como el tamaño. En un ejemplo de Semple y col. (Nature Biotech.
2010 28:172-176), la formulación de nanopartículas lipídicas se compone de 57,1 % de lípido catiónico, 7,1 % de dipalmioilfosfatidilcolina, 34,3 % de colesterol y 1,4 % de PEG-c-DMA. Como otro ejemplo, cambiar la composición del lípido catiónico podría suministrar siRNA de manera más efectiva a varias células presentadoras de antígenos (Basha y col. Mol Ther. 201119:2186-2200).
En algunas realizaciones, la proporción de lípido a ARN (es decir, ARNm) en nanopartículas lipídicas puede ser de 5:1 a 20:1, de 10:1 a 25:1, de 15:1 a 30:1 y/o al menos de 30:1.
En algunas realizaciones, la relación de PEG en las formulaciones de nanopartículas lipídicas se puede aumentar o disminuir y/o la longitud de la cadena de carbono del lípido PEG se puede modificar de C14 a C18 para alterar la farmacocinética y/o la biodistribución de las formulaciones de nanopartículas lipídicas.
En la invención, el lípido comprende un lípido catiónico tal como, entre otros, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-D MA, DLin-KC2-D m A, DODMA y lípidos de amino alcohol. El lípido catiónico de aminoalcohol puede ser los lípidos descritos y/o producidos mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130150625. Como ejemplo no limitativo, el lípido catiónico puede ser 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-{[(9Z,2Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 1 en el documento US20130150625); 2-amino-3-[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]-2-{[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 2 en el documento US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-[(octiloxi)metil]propan-1-ol (Compuesto 3 en el documento US20130150625); y 2-(dimetilamino)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-{[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 4 en el documento US20130150625); o cualquier sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo. En la invención, la vacuna de ARNm se formula en una nanopartícula lipídica como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Típicamente, las formulaciones de nanopartículas lipídicas comprenden un lípido, en particular, un lípido catiónico ionizable, por ejemplo, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) o 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), y comprenden además un lípido neutro, un esterol y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo, un lípido PEG o modificado con PEG.
Los ejemplos de lípidos neutros incluyen, de modo no taxativo, DSPC, POPC, DPPC, DOPE y SM. Un ejemplo de un esterol es el colesterol. En algunas realizaciones, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio de 2.000 Da. En otras realizaciones, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio menor que 2.000 Da, por ejemplo, aproximadamente 1.500 Da, aproximadamente 1.000 Da o aproximadamente 500 Da. Los ejemplos no taxativos de lípidos modificados por PEG incluyen PEG-diestearoil glicerol (PEG-DMG) (al que también se hace referencia como PEG-C14 o C14-PEG), PEG-cDMA (adicionalmente discutido en Reyes y col. J. Controlled Release, 107,276-287 (2005)).
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen un 60 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-d imetilamino etil-[1,3]-d ioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-yl) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 7,5 % del lípido neutro, 31 % del esterol y 1,5 % del p EG o lípido modificado con PEG en base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen un 50 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilamino etil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y di((Z)-non-2-en-1-yl) 9-((4-(dimefhilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 10 % del lípido neutro, 38,5 % del esterol y 1,5 % del PEG o lípido modificado con PeG en base molar.
En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen un 57,2 % de un lípido catiónico seleccionado entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin -MC3-D M A), y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 7,1 % del lípido neutro, 34,3 % del esterol y 1,4 % del lípido p Eg o modificado con PEG sobre una base molar.
En algunas realizaciones, la relación molar de lípidos es 50110138,511,5 (% molar de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, lípido modificado con DSPC/Chol/PEG, por ejemplo, PEG-DMG, PEG-DSG o PEG-DPG), o 57,217.
1134.311.4 (% mol de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DPPC/Chol/lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-cDMA).
Se describen ejemplos no limitativos de composiciones de nanopartículas lipídicas y procedimientos para fabricarlas, por ejemplo, en Semple y col. (2010) Nat Biotechnol 28:172-176; Jayarama y col. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51: 8529-8533; y Maier y col. (2013) Molecular Therapy 21,1570-1578.
En la invención, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención son nanopartículas lipídicas de 4 componentes. La nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural. En la invención, la nanopartícula lipídica comprende un 40-60 % de lípido catiónico, un 5-15 % de un lípido no catiónico, un 1-2 % de un lípido PEG y un 30-50 % de un lípido estructural. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula lipídica puede comprender un 50 % de lípido catiónico, un 10 % de lípido no catiónico, un 1,5 % de lípido PEG y un 38,5 % de lípido estructural. En una realización, el lípido catiónico puede ser cualquier lípido catiónico descrito en esta invención, tal como, pero sin limitación, DLin-KC2-D MA, DLin-MC3-DMA y L319. En la invención, el lípido estructural es colesterol.
En la invención, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención comprenden un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural. A modo de ejemplo no limitativo, las nanopartículas lipídicas comprenden el 50% del lípido catiónico DLin-KC2-DMA, el 10 % del lípido no catiónico DSPC, el 1,5 % del lípido PEG PEG-DOMG y el 38,5 % del colesterol lipídico estructural., A modo de ejemplo no limitativo, las nanopartículas lipídicas comprenden el 50 % del lípido catiónico DLin-MC3-DMA, el 10% del lípido no catiónico DSPC, el 1,5 % del lípido PEG PEG-DOMG y el 38,5 % del lípido estructural colesterol. A modo de ejemplo no limitativo, las nanopartículas lipídicas comprenden el 50 % del lípido catiónico DLin-MC3-DMA, el 10 % del lípido no catiónico DSPC, el 1,5 % del lípido PEG PEG-DMG y el 38,5 % del colesterol lipídico estructural.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición de vacuna pueden variar, dependiendo de la identidad, tamaño y/o condición del sujeto que se está tratando y dependiendo además de la vía por la cual el se va a administrar la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 % y 99 % (p/p) del ingrediente activo. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 % y 100 %, por ejemplo, entre ,5 y 50 %, entre 1-30 %, entre 5-80 %, al menos 80 % (p/p) de ingrediente activo.
En algunas realizaciones, la composición de la vacuna de ARN (es decir, ARNm) del virus respiratorio puede comprender el polinucleótido descrito en esta invención, formulado en una nanopartícula lipídica que comprende MC3, colesterol, DSPc y PEG2000-DMG, el tampón citrato trisódico, sacarosa y agua para inyección. Como ejemplo no limitativo, la composición comprende: 2,0 mg/mL de la sustancia fármaco, 21,8 mg/mL de MC3, 10,1 mg/mL de colesterol, 5,4 mg/mL de DSPC, 2,7 mg/mL de PEG2000-DMG, 5,16 mg/mL de citrato trisódico, 71 mg/mL de sacarosa y 1,0 mL de agua para inyección.
En algunas realizaciones, una nanopartícula (es decir, una nanopartícula lipídica) tiene un diámetro promedio de 10­ 500 nm, 20-400 nm, 30-300 nm, 40-200 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula (es decir, una nanopartícula lipídica) tiene un diámetro promedio de 50-150 nm, 50-200 nm, 80-100 nm u 80-200 nm.
Liposomas, Lipoplexos y Nanopartículas Lipídicas
En la invención, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención comprenden un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico Dlin-KC2-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DOMG y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico Dlin-MC3-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DOMG y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico Dlin-MC3-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DMG y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol.
Como ejemplo no limitante, el lípido catiónico puede ser seleccionado de entre (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilhexacosa-17, 20-dien-9-amina, (1Z,19Z)-N5N-dimetilpentacosa-l 6, 19-dien-8-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetildocosa-13,16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetilhenicosa-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-6-amina, (15Z, 18Z) -N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-10-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa -15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimeihyloctacosa-19,22-dien -9-a mina,(18Z,21 z )-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilhexacosa-17,20-dien-7-amina, (16Z,19Z) -N,N-dimetilpentacosa-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriaconta-22,25-dien-10-amina, (21 Z,24Z)-N,N-dimetiltriaconta-21,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptacos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilhexacos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptacosa n-1 0-a mina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonacosa-20,23 -dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-I-nonylicosa-11,14-dien-I-yl] pirrolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptacos-20-en-l 0-amina, (15Z)-N,N-dimetil eptacos-15-en-l 0-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonacos-14-en-l0-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonacos-17- en-l0-a mina, (24Z)-N,N-dimetiltritriacont-24-en-l0-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-l 0-amina, (22Z)-N, N-dimetilhentriacont-22-en-l0-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentacos-16-en-8-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenicosa-12, 15-dien-1-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dienl-amina, N,N-dimetil-l-[(lS,2R)-2 -octilciclopropil] eptadecan-8-amina, 1-[(1S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2 -octilciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-21-[(lS,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-l0-amina,N,N-dimetil-1-[(1S,2S)-2 -f[(iR,2R)-2-pentilciclopropil]metil)ciclopropil]nonadecan-10-amina,N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina, N, N-dimetil-[(lR,2S)-2-undecilciclopropil]tetradecan-5-amina, N,N-dimetil-3-(7-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptil} dodecan-1- amina, 1-[(1R,2S)-2-heptilciclopropilo ]-N,N-dimetiloctadecan-9-amina, 1-[(1S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan -6-amina, N,N-dimetil-1-[(lS,2R)-2-octilciclopropil]pentadecan -8-a mina, R-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, S-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1- iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil)pirrolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-[ (5Z)-oct-5-en-1 -iloxi]propan-2-amina, 1 -{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi )metil]etil)azetidina, (2S)-1-(hexiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2S)-1-(heptiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1 -(noniloxi)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-octadec-9-en -1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina; (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-octadeca-6,9,12-trien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S) -1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1 -iloxi]-N,N-dimetil-3-(pentiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-(hexiloxi)-3-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1 -iloxi]-N,Ndimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z) -ico sa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-docosa-l3,16-dien-l -iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(l3Z,16z)-docosa-13,16-dien-1-iloxi]-3-( hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilipropan-2-amina, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-yioxy]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1 -iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloctiloxi]-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloctil)oxi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(octiloxi)-3-((8-[(1S,2S)-2-([(1R,2R)- 2-pentilciclopropil]metil)ciclopropil}octil)oxi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-([8-(2-oc1ilciclopropil)octil]oxi)-3-(octiloxi)propan-2-a mina y (1lE,20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-l1,20,2-trien-10-amin e o sales o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En algunas realizaciones, las formulaciones de LNP de las vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) pueden contener PEG-c-DOMG en una proporción molar de lípidos del 1,5 %.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de las vacunas de ARN (es decir, ARNm) pueden incluir al menos uno de los lípidos PEGilados descritos en la Publicación Internacional No. WO2012099755.
En algunas realizaciones, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoeta no lamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000). En algunas realizaciones, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica, DSPC y colesterol. Como ejemplo no limitante, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol. Como otro ejemplo no limitativo, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol en una proporción molar de 2:40:10:48 (ver por ejemplo, Geallycol., Nonviral delivery of self-amplifying RNA(e.g., mRNA) vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294).
Las nanopartículas lipídicas descritas en esta invención pueden fabricarse en un entorno estéril.
Las formulaciones de nanopartículas pueden comprender un conjugado de fosfato. El conjugado de fosfato puede aumentar los tiempos de circulación in vivo y/o aumentar la entrega dirigida de la nanopartícula. Como ejemplo no limitante, los conjugados de fosfato pueden incluir un compuesto de cualquiera de las fórmulas descritas en la Solicitud Internacional No. WO2013033438.
La formulación de nanopartícula puede comprender un conjugado de polímero. El conjugado de polímero puede ser un conjugado soluble en agua. El conjugado de polímero puede tener una estructura descrita en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20130059360, En un aspecto, los conjugados de polímeros con los polinucleótidos de la presente invención se pueden realizar utilizando los procedimientos y/o reactivos poliméricos segmentados descritos en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20130072709. En algunas realizaciones, el conjugado de polímero puede tener grupos laterales pendientes que comprenden restos de anillo, tales como, de modo no taxativo, los conjugados de polímero descritos en la Publicación de patente de EE. UU. No. US20130196948,
Las formulaciones de nanopartículas pueden comprender un conjugado para mejorar la administración de nanopartículas de la presente divulgación en un sujeto. Además, el conjugado puede inhibir la eliminación fagocítica de las nanopartículas en un sujeto. En un aspecto, el conjugado puede ser un péptido "propio" diseñado a partir de la proteína de membrana humana CD47 (por ejemplo, las partículas "propias" descritas por Rodriguez y col. (Science 2013 339,971-975)). Como lo muestra Rodríguez y col., los autopéptidos retrasaron la eliminación de nanopartículas mediada por macrófagos, lo que mejoró la entrega de las nanopartículas. En otro aspecto, el conjugado puede ser la proteína de membrana CD47 (por ejemplo, ver Rodriguez y col. Science 2013 339,971-975). Rodriguez y col. mostró que, de manera similar a los péptidos "propios", el CD47 puede aumentar la proporción de partículas circulantes en un sujeto en comparación con los péptidos revueltos y las nanopartículas recubiertas con PEG,
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de la presente divulgación se formulan en nanopartículas que comprenden un conjugado para mejorar la administración de las nanopartículas de la presente divulgación en un sujeto. El conjugado puede ser la membrana CD47 o el conjugado puede derivarse de la proteína de membrana CD47, tal como el "autopéptido" descrito previamente. En algunas realizaciones, la nanopartícula puede comprender PEG y un conjugado de CD47 o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, la nanopartícula puede comprender tanto el “autopéptido” descrito anteriormente como la proteína de membrana CD47.
En algunas realizaciones, un “autopéptido” y/o proteína CD47 puede conjugarse a una partícula similar al virus o seudovirión, como se describe en esta invención, para la administración de las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de la presente divulgación.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de vacuna de ARN (es decir, ARNm) comprenden los polinucleótidos de la presente descripción y un conjugado que puede tener un enlace degradable. Los ejemplos no taxativos de conjugados incluyen un resto aromático que comprende un átomo de hidrógeno ionizable, un resto espaciador y un polímero soluble en agua. A modo de ejemplo no taxativo, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado con un enlace degradable y procedimientos para administrar dichas composiciones en la Publicación de patente de EE. UU. No. US20130184443,
Las formulaciones de nanopartículas pueden ser una nanopartícula de carbohidrato que comprende un vehículo de carbohidrato y una vacuna de ARN (es decir, ARNm). A modo de ejemplo no taxativo, el vehículo nde carbohidrato puede incluir, de modo no taxativo, un material similar a glicógeno o fitoglicógeno modificado con anhídrido, succinato de fitoglicógeno de octenilo, fitoglicógeno de beta-dextrina, fitoglicógeno de beta-dextrina modificado con anhídrido. (Ver por ejemplo, Publicación Internacional No. WO2012109121).
Las formulaciones de nanopartículas de la presente divulgación se pueden recubrir con un tensioactivo o polímero para mejorar la entrega de la partícula. En algunas realizaciones, la nanopartícula se puede recubrir con un recubrimiento hidrófilo tal como, entre otros, recubrimientos de PEG. y/o recubrimientos que tienen una carga superficial neutra. Los recubrimientos hidrofílicos pueden ayudar a administrar nanopartículas con cargas útiles más grandes, como, entre otras, vacunas de ARN (es decir, ARNm) dentro del sistema nervioso central. A modo de ejemplo no taxativo, se describen nanopartículas que comprenden un recubrimiento hidrofílico y procedimientos para elaborar dichas nanopartículas en la Publicación de patente de EE. UU. No. US20130183244,
Las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden mejorarse al reemplazar el lípido catiónico con un lípido catiónico biodegradable que se sepa que es una nanopartícula lipídica de eliminación rápida (reLNP - rapidly eliminated lipid nanoparticle). Se ha demostrado que los lípidos catiónicos ionizables, como, entre otros, DLinDMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-D MA, se acumulan en plasma y tejidos con el tiempo y pueden ser una fuente potencial de toxicidad. el metabolismo de los lípidos eliminados rápidamente puede mejorar la tolerabilidad y el índice terapéutico de las nanopartículas lipídicas en un orden de magnitud de 1 mg/kg dosis a un 10 mg/kg dosis en rata. La inclusión de un enlace éster degradado enzimáticamente puede mejorar el perfil de degradación y metabolismo del componente catiónico, manteniendo al mismo tiempo la actividad de la formulación reLNP. El enlace éster puede ubicarse internamente dentro de la cadena lipídica o puede ubicarse terminalmente en el extremo terminal. de la cadena lipídica. El enlace de éster interno puede reemplazar cualquier carbono de la cadena lipídica.
En algunas realizaciones, el enlace éster interno puede ubicarse en cualquier lado del carbono saturado.
En algunas realizaciones, se puede provocar una respuesta inmune administrando una nanopartícula lipídica que puede incluir una nanoespecie, un polímero y un inmunógeno. (Publicación de EE. UU. N° 20120189700 y Publicación internacional N° WO2012099805). El polímero puede encapsular la nanoespecie o encapsular parcialmente la nanoespecie. El inmunógeno puede ser una proteína recombinante, un ARN modificado y/o un polinucleótido descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica puede formularse para su uso en una vacuna tal como, entre otras, contra un patógeno.
Las nanopartículas lipídicas pueden diseñarse para alterar las propiedades superficiales de las partículas, de manera que las nanopartículas lipídicas puedan penetrar la barrera de mucosa. La mucosa está ubicada en el tejido mucoso, tales como, por ejemplo, oral (por ejemplo, las membranas bucales y esofágicas y el tejido de las amígdalas), oftálmico, gastrointestinal (por ejemplo, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto), nasal, respiratorio (por ejemplo, membrana nasal, faríngea, traqueal y bronquial), genital (por ejemplo, membrana vaginal, del cuello del útero y uretral). Se creía que las nanopartículas mayores que 10-200 nm que se prefieren por su mayor efectividad de encapsulación del fármaco y la capacidad de proporcionar administración sostenida para un conjunto amplio de fármacos, eran muy grandes como para difundirse rápidamente a través de las barreras de mucosa. La mucosa se secreta, dispersa, descarta o digiere y recicla continuamente, de manera que la mayoría de las partículas atrapadas puedan eliminarse del tejido mucoso en segundos o en unas pocas horas. Las nanopartículas poliméricas mayores (con un diámetro entre 200 nm y 500 nm) que se han recubierto de forma densa con un polietilenglicol (PEG) de peso molecular bajo se difunden a través de la mucosa solamente de 4 a 6 veces más lentamente que la difusión de las mismas partículas en agua (Lai y col. PNAS 2007 104(5):1482-487; Lai y col. Adv Drug Deliv Rev. 2009 61(2): 158­ 171). El transporte de nanopartículas puede determinarse mediante el uso de velocidades de permeación y/o técnicas de microscopía fluorescente, inclusive, de modo no taxativo, recuperación de fluorescencia a continuación de fotoblanqueo (FRAP) y rastreo de partículas múltiples (MPT) de alta resolución. A modo de ejemplo no taxativo, las composiciones que pueden penetrar una barrera de mucosa pueden elaborarse de la forma descrita en la Patente de EE. UU. No. 8,241,670 o Publicación de Patente Internacional No. WO2013110028,
Las nanopartículas lipídicas diseñadas para penetrar la mucosa pueden comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero y vitamina y/o un copolímero de tribloque. El material polimérico puede incluir, de modo no taxativo, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimeacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. El material polimérico puede ser biodegradable y/o biocompatible. Se describen ejemplos no limitantes de polímeros biocompatibles en la publicación de patente de EE.UU. n° WO2013116804. El material polimérico puede estar adicionalmente irradiado. A modo de ejemplo no taxativo, el material polimérico puede someterse a radiación gamma (ver por ejemplo, Solicitud Internacional No. WO201282165). Ejemplos no taxativos de polímeros específicos incluyen poli(caprolactona) (PCL), polímero de acetato de etilenvinilo (EVA), ácido (poli)láctico (PLA), ácido (poli)(L-láctico (PLLA), ácido (poli)glicólico (PGA), ácido (poli)láctico-co-glicólico (PLGA), ácido (poli)L-láctico-co-glicólico (PLLGA), poli(D,L-láctido) (PDLA), poli(L-láctido) (PLLA), poli(D,L-láctido-co-caprolactona), poli(D,L-láctido-co-caprolactona-co-glicólido), poli(D,L láctido-co-PEO-co-D,L-láctido), poli(D,L-láctido-co-PPO-co-D,L-láctido), cianoacrilato de polialquilo, poliuretane, poli-L-lisina (PLL), hidroxipropil metacrilato (HPMA), polietileneglicol, ácido poli-L-glutámico, ácidos (poli)hidroxi, polianhídridos, poliortoésteres, amidas de (poli)éster, poliamidas, éteres de (poli)éster, policarbonatos, polialquilenos, tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles, tales como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tales como tereftalato de (poli)etileno, alcoholes polivinílicos (PVA), éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, tales como acetato de (poli)vinilo, haluros de polivinilo, tales como cloruro de (poli)vinilo (PVC), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celuloses derivadas, tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros of ácidos acrílicos, tales como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxámeros, poli(orto)ésteres, ácido (poli)butírico, ácido (poli)valérico, poli(láctido-co-caprolactona), PEG-PLGA-PEG y carbonato de trimetileno, polivinilpirrolidona.La nanopartícula lipídica se puede recubrir o asociar con un copolímero como, entre otros, un copolímero de bloque (como un copolímero de bloque de poliéter-poliamida ramificado descrito en la Publicación Internacional No. WO2013012476), y (polietilenglicol) )-(poli(óxido de propileno))-(poli(etilenglicol)) copolímero tribloque (ver por ejemplo, Publicación de EE. UU. 20120121718 y Publicación de EE. UU. 20100003337 y Pat. De EE. UU. No. 8.263.665). El copolímero puede ser un polímero que se considera en general seguro (GRAS) y la formación de la nanopartícula lipídica puede ser de una manera tal que no se creen entidades químicas nuevas. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender poloxámeros que recubren nanopartículas de PLGA sin formar entidades químicas nuevas que todavía son capaces de penetrar rápidamente en la mucosa humana (Yang y col. Chem. Int. Ed. 2011 50:2597-2600). Un procedimiento escalable no limitativo para producir nanopartículas que pueden penetrar en la mucosidad humana es descrito por Xu y col. (ver, por ejemplo, J Control Release 2013,170(2):279-86).
La vitamina del conjugado de polímero-vitamina puede ser vitamina E. La porción de vitamina del conjugado se puede sustituir con otros componentes adecuados como, por ejemplo, vitamina A, vitamina E, otras vitaminas, colesterol, un resto hidrofóbico o un componente hidrofóbico de otros surfactantes (por ejemplo, cadenas de esterol, ácidos grasos, cadenas de hidrocarburos y cadenas de óxido de alquileno).
La nanopartícula lipídica diseñada para penetrar la mucosidad puede incluir agentes que alteran la superficie como, entre otros, polinucleótidos, proteínas aniónicas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), tensioactivos (por ejemplo, tensioactivos catiónicos como, por ejemplo, bromuro de dimetil octadecil-amonio), azúcares o derivados del azúcar (por ejemplo, ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (porejemplo, heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (por ejemplo, N-acetilcisteína, artemisa, bromelina, papaína, clerodendrum, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteína, stepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y varias DNasas, incluida la rhDNasa. El agente de alteración de la superficie se puede incrustar o enredar en la superficie de la partícula o desechar (por ejemplo, mediante recubrimiento, adsorción, enlace covalente u otros procesos) en la superficie de la nanopartícula lipídica (ver por ejemplo, Publicación de EE. UU. 20100215580 y Publicación de EE. UU. 20080166414 y US20130164343).
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que penetran en la mucosidad pueden comprender al menos un polinucleótido descrito en esta invención. El polinucleótido puede estar encapsulado en la nanopartícula lipídica y/o dispuesto en la superficie de la partícula, el polinucleótido puede acoplarse covalentemente a la nanopartícula lipídica. Las formulaciones de nanopartículas lipídicas que penetran en el moco pueden comprender una pluralidad de nanopartículas, además, las formulaciones pueden contener partículas que pueden interactuar con el moco y alterar la estructura y/o propiedades adhesivas del moco circundante para disminuir la mucoadhesión, lo que puede aumentar la entrega de las nanopartículas lipídicas que penetran en el moco al tejido de la mucosa.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que penetran en la mucosidad pueden ser una formulación hipotónica que comprende un revestimiento que mejora la penetración en la mucosa. La formulación puede ser hipotónica para el epitelio en el cual se administra. Ejemplos no taxativos de formulaciones hipotónicas se pueden encontrar en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013110028,
En algunas realizaciones, con el fin de mejorar la administración a través de la barrera mucosa, la formulación de vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) puede comprender o ser una solución hipotónica. Se descubrió que las soluciones hipotónicas aumentan la velocidad a la que las partículas mucoinertes, como, entre otras, las partículas que penetran en la mucosidad, pueden alcanzar la superficie epitelial vaginal (ver por ejemplo, Ensign y col. Biomaterials 201334(28):6922-9).
En algunas realizaciones, dichas formulaciones también pueden construirse o modificarse las composiciones de manera que se dirijan pasiva o activamente a diferentes tipos celulares in vivo, incluidos, entre otros, hepatocitos, células inmunitarias, células tumorales, células endoteliales, células presentadoras de antígenos y leucocitos (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song y col., Nat Biotechnol. 2005 23:7M-717; Judge y col., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann y col., Microvasc Res 2010 80:286-293; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier y col., Pulm Pharmacol, Ther. 201023:334-344; Basha y col., Mol. Ther.
2011 19:2186-2200; Fenske y Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:25-44; Peer y col., Science. 2008 319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133). Un ejemplo de orientación pasiva de formulaciones a células hepáticas incluye las formulaciones de nanopartículas lipídicas basadas en DLin-DMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-d Ma , que han demostrado unirse a la apolipoproteína E y promover la unión y la absorción de estas formulaciones. en hepatocitos in vivo (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357-1364). Las formulaciones también pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos en su superficie, como se ejemplifica, pero no se limita a, folato, transferrina, N-acetilgalactosamina (GalNAc) y estrategias dirigidas a anticuerpos (Kolhatkary col., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio and Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412; Yu y col., Mol Membr Biol. 2010 27:286-298; Patil y col., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit y col., Biomacromolecules.
2011 12:2708-2714; Zhaoy col., Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319; Akinc y col., Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan y col., Methods Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie y col., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:4095-4100; Kimycol., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya y col., Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song y col., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Peer y col., Science. 2008 319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133).
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de la presente descripción pueden formularse para la liberación controlada y/o administración dirigida. Tal como se usa en esta invención, “liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a un patrón particular de liberación para efectuar un resultado terapéutico. En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) pueden encapsularse en un agente de administración descrito en esta invención y/o conocido en la técnica para liberación controlada y/o administración dirigida. Tal como se usa en esta invención, el término "encapsular" significa envolver, encerrar o rodear. En lo que se refiere a la formulación de los compuestos de la divulgación, la encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. El término "sustancialmente encapsulado" significa que al menos más del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 o más del 99,999 % de la composición farmacéutica o compuesto de la la divulgación puede estar envuelta, rodeada o encerrada dentro del agente de entrega. “Encapsulación parcial” significa que menos que 10, 10, 20, 30, 40, 50 o menos de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción puede encontrarse envuelto, encerrado o rodeado dentro del agente de entrega. Ventajosamente, la encapsulación puede estar determinada mediante la medición del escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción mediante el uso de fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos 1,5,10,20,30, 40,50, 60,70,80,85, 90, 95,96,97,98, 99,99,9, 99,99 o más del 99,99 % del producto farmacéutico la composición o el compuesto de la descripción están encapsulados en el agente de administración.
En algunas realizaciones, la formulación de liberación controlada puede incluir, de modo no taxativo, copolímeros de tribloque. Como ejemplo no taxativo, la formulación puede incluir dos tipos distintos de copolímeros de tribloque (Pub. Internacional No. WO2012131104 y WO2012131106;).
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) pueden encapsularse en una nanopartícula lipídica o una nanopartícula lipídica eliminada rápidamente y las nanopartículas lipídicas o una nanopartícula lipídica eliminada rápidamente pueden encapsularse luego en un polímero, hidrogel y/o sellador quirúrgico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica. Como ejemplo no limitante, el polímero, hidrogel o sellador quirúrgico puede ser PLGA, etileno acetato de vinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, Ga ), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores a base de PEG y COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica puede encapsularse en cualquier polímero conocido en la técnica que pueda formar un gel al inyectarse en un sujeto. Como otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica puede encapsularse en una matriz de polímero que puede ser biodegradable.
En algunas realizaciones, la formulación de vacuna de ARN (es decir, ARNm) para liberación controlada y/o administración dirigida también puede incluir al menos un recubrimiento de liberación controlada. Los recubrimientos de liberación controlada incluyen, entre otros, OPADRY®, polivinilpirrolidona/copolímero de acetato de vinilo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® y derivados de celulosa como las dispersiones acuosas de etilcelulosa (AQUACOAT® y SURELEASE®).
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) de liberación controlada y/o formulación de administración dirigida puede comprender al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, entre otros, poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) de liberación controlada y/o formulación de administración dirigida que comprende al menos un polinucleótido puede comprender al menos un PEG y/o derivados poliméricos relacionados con p Eg como se describe en Patente de EE. UU. No. 8.404.222.
En algunas realizaciones, la formulación de administración de liberación controlada de la vacuna de ARN (es decir, ARNm) que comprende al menos un polinucleótido puede ser el sistema polimérico de liberación controlada descrito en US20130130348.
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de la presente divulgación pueden encapsularse en una nanopartícula terapéutica, denominada en esta invención "vacunas de ARN (por ejemplo, ARNm) de nanopartículas terapéuticas". Las nanopartículas terapéuticas pueden formularse mediante procedimientos descritos en esta invención y conocidos en la técnica, tales como, pero no limitados, las Pub. Internacionales WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, Publicaciones de EE. UU. Nos. US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20130123351 and US20130230567 y Patente de EE. UU. No. 8.206.747, 8.293.276, 8.318.208 y 8.318.211. En otra realización, las nanopartículas poliméricas terapéuticas pueden identificarse mediante los procedimientos descritos en la publicación de EE.UU. N° US20120140790.
En algunas realizaciones, la vacuna terapéutica de nanopartículas de ARN (es decir, ARNm) puede formularse para liberación sostenida. Tal como se usa en esta invención, "liberación sostenida" hace referencia a una composición farmacéutica o compuesto que se conforma a una velocidad de liberación en un período específico de tiempo. El período de tiempo puede incluir, de modo no taxativo, horas, días, semanas, meses y años. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula de liberación sostenida puede comprender un polímero y un agente terapéutico como, entre otros, los polinucleótidos de la presente descripción (véase la Publicación internacional No. 2010075072 y Pub. De EE. UU. No. US20100216804, US20110217377 y US20120201859). En otro ejemplo no limitativo, la formulación de liberación sostenida puede comprender agentes que permitan una biodisponibilidad persistente, como, entre otros, cristales, geles macromoleculares y/o suspensiones de partículas (véase la Publicación de Patente de EE. UU.No US20130150295,
En algunas realizaciones, las vacunas terapéuticas de ARN de nanopartículas (es decir, ARNm) pueden formularse para ser específicas de la diana. A modo de ejemplo no taxativo, las nanopartículas terapéuticas pueden incluir un corticoesteroide (ver Pub. International N° WO2011084518). A modo de ejemplo no taxativo, las nanopartículas terapéuticas pueden formularse en las nanopartículas descritas en las Pub Internacionales N° WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y Pub EE. UU. N° US20100069426, US20120004293 y US20100104655.
En algunas realizaciones, las nanopartículas de la presente descripción pueden comprender una matriz polimérica. A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula puede comprender dos o más polímeros tales como, de modo no taxativo, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero de dibloque. En algunas realizaciones, el copolímero de dibloque puede incluir PEG combinado con un polímero tal como, de modo no taxativo, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos. En otra realización más, el copolímero de dibloques puede ser un copolímero de dibloques de alto X como los descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013120052.
A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero en bloque PLGA-PEG (ver la Publicación EE. UU. N° US20120004293 and U.S. Patent No. 8,236,330). En otro ejemplo no limitativo, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula sigilosa que comprende un copolímero dibloque de PEG y PLA o PEG y PLGA(ver Patente de EE. UU. No 8,246,968 y Publicación Internacional No. WO2012166923). En aun otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula no detectable o una nanopartícula no detectable específica de la diana tal como se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130172406,
En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica puede comprender un copolímero multibloque (ver p.ej., Pat. EE. UU. No. 8.263.665 y 8.287.910 y Pub. de Patente de EE. UU. No. US20130195987).
En otro ejemplo no limitante más, la nanopartícula lipídica comprende el copolímero de bloques PEG-PLGA-PEG (ver p.ej., el hidrogel termosensible (PEG-PLGA-PEG) que se usó como vehículo de administración del gen TGF-beta1 en Lee y col. Thermosensitive Hydrogel as a Tgf-p1 Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing. Pharmaceutical Research, 2003 20(12): 1995-2000; como un sistema de entrega controlada de genes en Li y col. Controlled Gene Delivery System Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel, Pharmaceutical Research 2003 20(6):884-888; y Chang y col., Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle. J Controlled Release. 2007 118:245-253). Las vacunas de ARN (es.decir, ARNm) de la presente descripción pueden formularse en nanopartículas lipídicas que comprenden el copolímero de bloque PEG-PLGA-PEG.
En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica puede comprender un copolímero de multibloque (verp.ej., Pat. EE. UU. No. 8.263.665 y 8.287.910 y Pub. Patente nEE. UU. No. US20130195987).
En algunas realizaciones, los copolímeros de bloque descritos en el presente documento pueden incluirse en un complejo de poliiones que comprende una micela no polimérica y el copolímero de bloque. (verp.ej., Publicación EE. UU. No. 20120076836).
En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica puede comprender al menos un polímero acrílico. Los polímeros acrílicos incluyen, de modo no taxativo, ácido acrílico, ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico y ácido acrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de amino alquil metacrilato, ácido (poli)acrílico, ácido (poli)metacrílico, policianoacrilatos y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas comprenden al menos un polímero de éster (poli)vinílico. El polímero de éster (poli)vinílico puede ser un copolímero tal como un copolímero aleatorio. A modo de ejemplo no taxativo, el copolímero aleatorio puede tener una estructura tal como las descritas en la Solicitud Internacional No. WO2013032829 o Publicación de Patente de EE. UU. No US20130121954. En algunas realizaciones, los polímeros de éster poli(vinílico) puede conjugarse con los polinucleótidos descritos en esta invención.
En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica puede comprender al menos un copolímero de dibloque. El copolímero dibloque puede ser, entre otros, un copolímero de ácido poli(láctico)-poli(etilen)glicol (ver, p.ej., Publicación de Patente Internacional No. WO2013044219). Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula terapéutica se puede utilizar para tratar el cáncer (ver la publicación internacional No. WO2013044219).
En algunas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero catiónico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica.
En algunas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero que contiene amina como, entre otros, polilisina, polietilenimina, dendrímeros de poli(amidoamina), poli(beta-amino ésteres) (ver, p.ej., Patente EE. UU. No. 8.287.849) y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, las nanopartículas descritas en esta invención pueden comprender un lípido catiónico de amina tal como los descritos en la Solicitud de Patente Internacional No. WO2013059496. En algunas realizaciones, los lípidos catiónicos pueden tener un resto amino-amida o amino-amina.
En algunas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra realización, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.
En algunas realizaciones, los nanovehículos sintéticos pueden contener un agente inmunoestimulante para mejorar la respuesta inmunitaria a partir de la administración del nanovehículo sintético. Como un ejemplo no limitante, el nanovehículo sintético puede comprender un agente inmunoestimulador de Th1 que puede mejorar una respuesta basada en Th1 del sistema inmune (ver Pub Internacional N° WO2010123569 y Publicación EE. UU. N° US20110223201).
Los nanovehículos sintéticos pueden formularse para la liberación dirigida. En algunas realizaciones, el nanoportador sintético se formula para liberar los polinucleótidos a un pH específico y/o después del intervalo de tiempo deseado. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula sintética se puede formular para liberar las vacunas de ARN (p.ej., ARNm) después de 24 horas y/o a un pH de 4,5 (ver Publicaciones Internacionales Nos. WO2010138193 y WO2010138194 y Pub EE. UU. Nos. US20110020388 y US20110027217).
En algunas realizaciones, los nanoportadores sintéticos pueden formularse para la liberación controlada y/o sostenida de los polinucleótidos descritos en esta invención. Como ejemplo no limitativo, los nanoportadores sintéticos para la liberación sostenida pueden formularse mediante procedimientos conocidos en la técnica, descritos en el presente documento y/o o como se describe en la publicación internacional N° WO2010138192 y Pub de EE. UU. No.
20100303850.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es.decir, ARNm) puede formularse para liberación controlada y/o sostenida donde la formulación comprende al menos un polímero que es un polímero de cadena lateral cristalina (CYSC). Los polímeros CYSC se describen en Patente de EE. UU. No. 8.399.007.
En algunas realizaciones, la nanopartícula puede optimizarse para administraci3ón por vía oral. La nanopartícula puede comprender al menos un biopolímero catiónico tal como, de modo no taxativo, quitosano o un derivado del mismo. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula puede formularse mediante los procedimientos descritos en Publicación EE. UU. No. 20120282343.
En algunas realizaciones, los LNP comprenden el lípido KL52 (un aminolípido descrito en Publicación de Solicitud de EE. UU. No. 201210295832. La actividad y/o seguridad (tal como se mide al examinar uno o más de ALT/AST, conteo de linfocitos e inducción de citocinas, por ejemplo) de la administración de las LNP puede mejorarse mediante la incorporación de dichos lípidos. Las LNP que comprenden KL52 puede administrarse por vía intravenosa y/o en una o más dosis. En algunas realizaciones, la administración de LNP que comprenden KL52 produce una expresión igual o mejorada de ARNm y/o proteínas en comparación con las LNP que comprenden MC3.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es.decir, ARNm) puede administrarse utilizando LNP más pequeños. Dichas partículas pueden comprender un diámetro desde menor que 0,1 um hasta 100 nm tal como, de modo no taxativo, menor que 0,1 um, menor que 1,0 um, menor que 5 um, menor que 10 um, menor que 15 um, menor que 20 um, menor que 25 um, menor que 30 um, menor que 35 um, menor que 40 um, menor que 50 um, menor que 55 um, menor que 60 um, menor que 65 um, menor que 70 um, menor que 75 um, menor que 80 um, menor que 85 um, menor que 90 um, menor que 95 um, menor que 100 um, menor que 125 um, menor que 150 um, menor que 175 um, menor que 200 um, menor que 225 um, menor que 250 um, menor que 275 um, menor que 300 um, menor que 325 um, menor que 350 um, menor que 375 um, menor que 400 um, menor que 425 um, menor que 450 um, menor que 475 um, menor que 500 um, menor que 525 um, menor que 550 um, menor que 575 um, menor que 600 um, menor que 625 um, menor que 650 um, menor que 675 um, menor que 700 um, menor que 725 um, menor que 750 um, menor que 775 um, menor que 800 um, menor que 825 um, menor que 850 um, menor que 875 um, menor que 900 um, menor que 925 um, menor que 950 um, menor que 975 um o menor que 1000 um.
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es.decir, ARNm) pueden administrarse mediante el uso de LNP más pequeñas, que pueden comprender un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente nm a aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente nm aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente nm aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente nm aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente nm aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente nm aproximadamente 10 nm de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente nm aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente nm aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente nm aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm y/o de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm.
En algunas realizaciones, dichas LNP se sintetizan mediante el uso de procedimientos que comprenden mezcladoras de microfluidos. Ejemplos de mezcladoras de microfluidos pueden incluir, entre otros, un micromezclador interdigital de hendidura que incluye, entre otros, los fabricados por Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austria) y/o un micromezclador en espiga escalonado (SHM) (Zhigaltsev, I.V. y col., se ha publicado el diseño ascendente y la síntesis de sistemas de nanopartículas de lípidos de tamaño límite con núcleos acuosos y de triglicéridos usando mezcla microfluídica de milisegundos (Langmuir. 2012. 28:3633-40; Belliveau, N.M. Y col., Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2012. 1:e37; Chen, D. y col., Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. J Am Chem Soc. 2012. 134(16):6948-51). En algunas realizaciones, los procedimientos para la generación de LNP que comprenden SHM comprenden además la mezcla de al menos dos corrientes de entrada, donde la mezcla se produce mediante advección caótica inducida por microestructura (MICA - Microstructure-Induced Chaotic Advection). Según este procedimiento, las corrientes de fluido fluyen a través de canales presentes en un patrón de espiga, lo que provoca un flujo rotacional y pliega los fluidos entre sí. Este procedimiento también puede comprender una superficie para mezclar fluidos, donde la superficie cambia de orientación durante el ciclado de fluido. Los procedimientos para generar LNP mediante el uso de SHM incluyen aquellos descritos en la Publicación de Solicitud de EE. UU. No.
2004/0262223 y 2012/0276209,
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es.decir, ARNm) de la presente descripción puede formularse en nanopartículas lipídicas creadas mediante el uso de una micromezcladora tal como, de modo no taxativo, una mezcladora microestructurada interdigital de ranura (SIMM-V2), una micromezcladora interdigital de ranura estándar (SSIMM), Caterpillar (CPMM) o Impinging-jet (IJMM) del Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz Alemania).
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de la presente descripción pueden formularse en nanopartículas lipídicas creadas mediante el uso de tecnología de microfluidos (ver, p.ej., Whitesides, George M. The Origins and the Future of Microfluidics. Nature, 2006442: 368-373; y Abraham y col., Chaotic Mixer for Microchannels. Science, 2002 295: 647-651). A modo de ejemplo no taxativo, la formulación de microfluidos controlada incluye un procedimiento pasivo para mezclar corrientes de flujos constantes impulsados por presión en microcanales con un número bajo de Reynolds (ver, p.ej., Abraham y col. Chaotic Mixer for Microchannels. Science, 2002 295: 647-651).
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es.decir, ARNm) de la presente descripción pueden formularse en nanopartículas lipídicas creadas mediante el uso de un chip de micromezcladora tal como, de modo no taxativo, los de Harvard Apparatus (Holliston, MA) o Dolomite Microfluidics (Royston, UK). Un chip de micromezcladora puede utilizarse para mezclar rápidamente dos o más corrientes de fluido con un mecanismo de división y recombinación.
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es.decir, ARNm) de la divulgación se pueden formular para su administración utilizando las microesferas de encapsulación de fármacos descritas en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468 o Patente EE. UU. No. 8,440,614. Las microesferas pueden comprender un compuesto de la fórmula (I), (II), (III), (IV), (V) o (VI) tal como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468. En algunas realizaciones, los aminoácidos, péptidos, polipéptidos, lípidos (APPL) son útiles para administrar las vacunas de ARN (es.decir, ARNm) de la divulgación a las células (véase la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468).
En algunas realizaciones, las vacunas de ARN (es.decir, ARNm) de la descripción se pueden formular en nanopartículas lipídicas que tienen un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm tales como, entre otros, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas pueden tener un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm.
En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica puede tener un diámetro mayor que 100 nm, mayor que 150 nm, mayor que 200 nm, mayor que 250 nm, mayor que 300 nm, mayor que 350 nm, mayor que 400 nm, mayor que 450 nm, mayor que 500 nm, mayor que 550 nm, mayor que 600 nm, mayor que 650 nm, mayor que 700 nm, mayor que 750 nm, mayor que 800 nm, mayor que 850 nm, mayor que 900 nm, mayor que 950 nm o mayor que 1000 nm.
Las nanopartículas de la presente invención además pueden incluir nutrientes como, entre otros, aquellos cuyas deficiencias pueden provocar peligros de salud desde anemia hasta defectos del tubo neural (ver, p.ej., las nanopartículas descritas en la Publicación de Patente Internacional No WO2013072929). A modo de ejemplo no taxativo, el nutriente puede ser hierro en forma de sales ferrosas, férricas o hierro elemental, yodo, ácido fólico, vitaminas o micronutrientes.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es.decir, ARNm) puede estar asociada con compuestos catiónicos o policatiónicos, que incluyen protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros péptidos o proteínas catiónicos, como poli-L-lisina (PLL), poliarginina, polipéptidos básicos, péptidos de penetración celular (CPP), incluidos los péptidos de unión al VIH, Tat del VIH-1 (VIH), péptidos derivados de Tat, penetratina, VP22 derivado o péptidos análogos, Pestivirus Erns, HSV, VP22 (Herpes simplex), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTD), PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, péptido(s) MPG, Pep-1, oligómeros L, péptido(s) de calcitonina, Antennapedia -péptidos derivados (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, FGF, lactoferrina, Transportan, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, histonas, polisacáridos catiónicos, para ejemplo quitosano, polibreno, polímeros catiónicos,p.e/. polietilenimina (PEI), lípidos catiónicos, p.ej. DOTMA: cloruro de [1-(2,3-sioleiloxi)propil)]-N,N,N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE : dioleilfosfatidiletanolamina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEp C, DOGS: dioctadecilamidoglicilspermina, DIm Ri: bromuro de dimiristooxipropildimetilhidroxietilamonio, DOTAP: dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano, DC-6-14: O,O-ditetradecanoil-N cloruro de -.alfa.-trimetilamonioacetil)dietanolamina, CLIP 1: cloruro de rac-[(2,3-dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)]-dimetilamonio, CLIP6: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropiloximetiloxi)etil]-trimetilamonio, CLIP9: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropiloxisucciniloxi)etil]-trimetilamonio, oligofectamina o polímeros catiónicos o policatiónicos,p.e/. poliaminoácidos modificados, como polímeros de beta-aminoácidos o poliamidas inversas, etc., polietilenos modificados, como PVP (bromuro de poli(N-etil-4-vinilpiridinio)), etc., acrilatos modificados, como pDMAEMA (poli(dimetilaminoetil metilacrilato)), etc., amidoaminas modificadas como pAMAM (poli(amidoamina)), etc., polibetaminoéster modificado (PBAE), como diacrilato-co de 1,4 butanodiol modificado con extremo de diamina Polímeros de -5-amino-1-pentanol, etc., dendrímeros, como dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros basados en pAMAM, etc., poliimina(s), como PEI: poli(etilenimina), poli(propilenimina), etc., polialilamina, polímeros a base de azúcar, como polímeros a base de ciclodextrina, polímeros a base de dextrano, quitosano,etc., polímeros basados en estructura principal de silan, tales como copolímeros PMOXA-PDMS, etc., polímeros en bloque que consisten en una combinación de uno o más bloques catiónicos (p.ej. seleccionados de entre un polímero catiónico como se mencionó anteriormente) y de uno o más bloques hidrofílicos o hidrofóbicos (p.ej. polietilenglicol), etc.
En otras realizaciones, la vacuna de ARN (es.decir, ARNm) no está asociada con compuestos catiónicos o policatiónicos.
En algunas realizaciones, una nanopartícula comprende compuestos de Fórmula (I):
Figure imgf000050_0001
o sales o isómeros del mismo, donde:
Ri se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C5-3o, alquenilo C5-2o, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 son seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R'OR", o R2 y R3, junto con el átomo para que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo; R4 se selecciona de entre el grupo que consiste en carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR,
-CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q es seleccionado de entre un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -
OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2,
-C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8,
-O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR,
-N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, - N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NRg)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, y -C(R)N(R)2C(O)o R, y cada n es seleccionado independientemente de entre 1,2, 3, 4, y 5;
cada R5 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M ’ son seleccionados independientemente de entre C(O)O, Oc (O), C(O)N(R’),
-N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 se selecciona de entre el grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
Rg es seleccionado de entre el grupo que consiste en H, CN, n O2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo y heterociclo C3-6;
cada R es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C3-14 y
alquenilo C3-14;
cada R’ se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-12 y
alquenilo C2-12 ;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6 ;
cada X es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m es seleccionado de entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13.
En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de fórmula (I) incluye aquellos en los que cuando R4 es -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, o -CQ(R)2, a continuación (i) Q no es -N(R)2 cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6, o 7 miembros cuando n es 1 o 2.
En algunas realizaciones, otro subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 son seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R'OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 es seleccionado de entre el grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR,
- CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q es seleccionado de entre un carbociclo C3-6, un heteroarilo de
5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de entre N, O y S, -OR,
- O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2,
- N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2 -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)Rb,
- O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR,
- N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2,
- N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)2, -C(=NRg)N(R)2, -C(=NRg)R, -C(O)N(R)OR, y un heterocicloalquilo de
5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de entre N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre oxo (=O), OH, amino, mono- o dialquilamino, y alquilo C1-3, y cada n se selecciona independientemente de entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y cada R6 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y M y M' son seleccionados independientemente de entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
Rb es seleccionado de entre el grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6 ;
Rg es seleccionado de entre el grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo
C2-6, carbociclo y heterociclo C3-6 ;
cada R es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" es seleccionado independientemente
Figure imgf000051_0001
e entre el grupo que consiste en
Figure imgf000051_0002
alquilo C3-14 y alquenilo C3-1 cada R* es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-1 cada Y es independientemente un carbociclo C3-6 ;
cada X es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m es seleccionado de entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o isómeros del mismo.
En algunas realizaciones, otro subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';
R2 y R3 son seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R'OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 es seleccionado de entre el grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 no sustituido, donde Q es seleccionado de entre un carbociclo C3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de entre N, O y S, -OR,
-O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2,
-N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)Rb,
-O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR,
-N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2,
-N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)2, -C(=NRg)R, -C(O)N(R)OR, y -C(=NRg)N(R)2, y cada n es seleccionado independientemente de entre 1, 2, 3, 4, y 5; y cuando Q es un heterociclo de 5-14 miembros y (i)
R4 es -(CH2)nQ en el que n es 1 o 2, o (ii) R4 es -(CH2)nCHQR en el que n es 1, o (iii) R4 es -CHQR, y -CQ(R)2, a continuación Q es un heteroarilo de 5 a 14 miembros o un heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros;
cada R5 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R6 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' son independientemente seleccionados de entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 es seleccionado de entre el grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
R9 es seleccionado de entre el grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo y heterociclo C3-6;
cada R es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m es seleccionado de entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o isómeros del mismo.
En algunas realizaciones, otro subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R'; R2 y R3 son seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R'OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo; R4 es seleccionado de entre el grupo que consiste ben un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1.6 no sustituido, donde Q es seleccionado de entre un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de entre N, O y S, -OR,
-O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2,
-N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8,
-O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR,
-N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, y -C(=NR9)N(R)2, y cada n se selecciona independientemente de entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' son seleccionados independientemente de entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 es seleccionado de entre el grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C3-6;
R9 es seleccionado de entre el grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo y heterociclo C3-6;
cada R es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m es seleccionado de entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o isómeros del mismo.
En algunas realizaciones, otro subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales R1 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R'; R2 y R3 son seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C2-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R'OR", o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo; R4 es -(CH2)nQ o -(CH2)nCHQR, donde Q es -N(R)2, y n es seleccionado de entre 3, 4, and 5;
cada R5 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' son independientemente seleccionados de entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R' es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m es seleccionado de entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o isómeros del mismo.
En algunas realizaciones, otro subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
Ri es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C5-3o, alquenilo C5-2o, -R*YR", -YR", y -R"M'R'; R2 y R3 son seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R 2y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo; R4 es seleccionado de entre el grupo que consiste en -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, donde Q is -N(R)2, y n es seleccionado de entre 1,2, 3, 4, y 5;
cada R5 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; My M' son independientemente seleccionados de entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 es seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R' es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR", -YR", y H;
cada R" es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R' es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X es seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y
m es seleccionado de entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o isómeros del mismo.
En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye los de Fórmula (IA):
Figure imgf000053_0001
o una de las sales o isómeros de los mismos, donde I se selecciona de entre 1,2, 3, 4 y 5; m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9; M1 es un enlace o M'; R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)Ra, -NHC(=NRg)N(R)2, -NHC(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 son seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14.
En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye los de Fórmula (II):
Figure imgf000053_0002
o sales o isómeros de los mismos, donde I se selecciona de entre 1, 2, 3, 4 y 5; M1 es un enlace o M'; R4 es alquilo C1-3 no sustituido, o -(CH)nQ, donde n es 2, 3, o 4, y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)Rs, -NHC(=NRg)N(R)2, -NHC(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente de entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo acilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-14, y alquenilo C2-14.
En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluye los de la Fórmula (IIa), (IIb), (IIc) o (IIe):
Figure imgf000054_0001
o sales o isómeros de los mismos, donde R4 es como se describe en esta invención..
En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de fórmula (I) incluye los de fórmula (Ild):
Figure imgf000054_0002
o sales o isómeros de los mismos, donde n es 2, 3 ó 4; y m, R', R”, y R2 a R6 son como se describe en esta invención Por ejemplo, cada uno de R2 y R3 puede ser seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14.
En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye los de Fórmula (IIa), (IIb), (IIc) o (IIe):
Figure imgf000054_0003
Figure imgf000055_0001
o una de las sales o isómeros de los mismos, donde R4 es como se describe en esta invención.
En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye los de Fórmula (Ild):
Figure imgf000055_0002
o una de las sales o isómeros de los mismos, donde n es 2, 3, ó 4; y m, R', R”, y R2 a R6 son como se describen en esta invención. Por ejemplo, cada uno de R2 y R3 puede ser e seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14.
En algunas realizaciones, el compuesto de la Fórmula (I) se selecciona de entre el grupo que consiste en:
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En algunas realizaciones, el compuesto de la Fórmula (I) se selecciona de entre el grupo que consiste en
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y sales e isómeros del mismo.
En algunas realizaciones, una nanopartícula comprende el siguiente compuesto:
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o sales e isómeros del mismo.
En algunas realizaciones, la descripción presenta una composición de nanopartículas que incluye un componente lipídico que comprende un compuesto tal como se describe en esta invención (p.ej., (por ejemplo, un compuesto según la Fórmula (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) o (IIe)).
En algunas realizaciones, la descripción presenta una composición farmacéutica que comprende una composición de nanopartículas de acuerdo con las realizaciones que anteceden y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica se refrigera o congela para almacenamiento y/o transporte (p.ej., para almacenarse a una temperatura de 4 °C o menor, tal como una temperatura de aproximadamente -150 °C a aproximadamente 0 °C o de aproximadamente -80 °C a aproximadamente -20 °C (p.ej., aproximadamente -5 °C, -10 °C, -15 °C, -20 °C, -25 °C, -30 °C, -40 °C, -50 °C, -60 °C, -70 °C, -80 °C, -90 °C, -130 °C o -150 °C). Por ejemplo, la composición farmacéutica es una solución que se refrigera para almacenamiento y/o transporte, por ejemplo, a aproximadamente -20 °C, -30 °C, -40 °C, -50 °C, -60 °C, -70 °C o -80 °C.
La descripción también incluye procedimientos para sintetizar un compuesto de la Fórmula (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) o (IIe) y procedimientos para confeccionar una composición de nanopartículas que incluye un componente lipídico que comprende el compuesto de la Fórmula (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) o (IIe).
M odos de A dm inistración de la Vacuna
Las vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención pueden administrarse por cualquier vía que dé como resultado un resultado terapéuticamente efectivo. Esto incluye, de modo no taxativo, la administración intradérmica, intranasal, intramuscular y/o subcutánea. La presente invención proporciona vacunas para usar en un procedimiento para impedir y/o tratar una enfermedad BetaCoV, comprendiendo el procedimiento administrar las vacunas de ARN (es decir, ARNm) a un sujeto que las necesite. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. Las composiciones de vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención se formulan típicamente en forma de conjuntos de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de las composiciones de vacunas de ARN (es decir, ARNm) de la invención puede ser decidido por el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. Los efectos terapéuticos específicos, la eficacia profiláctica o el nivel de dosis de formación de imágenes apropiado para cualquier paciente particular dependerán de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y factores semejantes bien conocidos en las artes médicas.
En algunas realizaciones, las composiciones de vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención pueden administrarse a niveles de dosificación suficientes para administrar 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg, 0,001 mg/kg a 0,05 mg/kg, 0,005 mg/kg a 0,05 mg/kg, 0,001 mg/kg a 0,005 mg/kg, 0,05 mg/kg a 0,5 mg/kg, 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, 0,1 mg/kg a 40 mg/kg, 0,5 mg/kg a 30 mg/kg, 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, o 1 mg/kg a 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, por semana, por mes, etc. para obtener el efecto terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado (ver, p.ej., el intervalo de dosis unitarias descrito en la Publicación Internacional No WO2013078199). La dosis deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada 2 meses, cada tres meses, cada 6 meses, etc. En algunas realizaciones, la dosificación deseada se puede administrar usando múltiples administraciones (p.ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones). Cuando se emplean múltiples administraciones, se pueden utilizar pautas de dosificación dividida, tales como las descritas en esta invención. En realizaciones ejemplares, las composiciones de vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención pueden administrarse a niveles de dosificación suficientes para administrar de 0,0005 mg/kg a 0,01 mg/kg, p.ej., de aproximadamente 0,0005 mg/kg a aproximadamente 0,0075 mg/kg, p.ej., aproximadamente 0,0005 mg/kg, aproximadamente 0,001 mg/kg, aproximadamente 0,002 mg/kg, aproximadamente 0,003 mg/kg, aproximadamente 0,004 mg/kg o aproximadamente 0,005 mg/kg.
En algunas realizaciones, las composiciones de vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de loa invención pueden administrarse una o dos veces (o más) a niveles de dosificación suficientes para administrar de 0,025 mg/kg a 0,250 mg/kg, de 0,025 mg/kg a 0,500 mg/kg, de 0,025 mg/kg a 0,750 mg/kg o de 0,025 mg/kg a 1,0 mg/kg.
En algunas realizaciones, las composiciones de vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención pueden administrarse dos veces (por ejemplo, Día 0 y Día 7, Día 0 y Día 14, Día 0 y Día 21, Día 0 y Día 28, Día 0 y Día 60, Día 0 y Día 90, Día 0 y Día 120, Día 0 y Día 150, Día 0 y Día 180, Día 0 y 3 meses después, Día 0 y 6 meses después, Día 0 y 9 meses después, Día 0 y 12 meses después, Día 0 y 18 meses después, Día 0 y 2 años después, Día 0 y 5 años después o Día 0 y 10 años después) en una dosis total o niveles de dosis suficientes para administrar una dosis total de 0,0100 mg, 0,025 mg, 0,050 mg, 0,075 mg, 0,100 mg, 0,125 mg, 0,150 mg, 0,175 mg, 0,200 mg, 0,225 mg, 0,250 mg, 0,275 mg, 0,300 mg, 0,325 mg, 0,350 mg, 0,375 mg, 0,400 mg, 0,425 mg, 0,450 mg, 0,475 mg, 0,500 mg, 0,525 mg, 0,550 mg, 0,575 mg, 0,600 mg, 0,625 mg, 0,650 mg, 0,675 mg, 0,700 mg, 0,725 mg, 0,750 mg, 0,775 mg, 0,800 mg, 0,825 mg, 0,850 mg, 0,875 mg, 0,900 mg, 0,925 mg, 0,950 mg, 0,975 mg o 1,0 mg. La presente descripción abarca dosis y frecuencias de administración mayores y menores. Por ejemplo, una composición de vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención puede administrarse tres o cuatro veces.
En algunas realizaciones, las composiciones de vacunas de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención pueden administrarse dos veces (por ejuemplo, Día 0 y Día 7, Día 0 y Día 14, Día 0 y Día 21, Día 0 y Día 28, Día 0 y Día 60, Día 0 y Día 90, Día 0 y Día 120, Día 0 y Día 150, Día 0 y Día 180, Día 0 y 3 meses después, Día 0 y 6 meses después, Día 0 y 9 meses después, Día 0 y 12 meses después, Día 0 y 18 meses después, Día 0 y 2 años después, Día 0 y 5 años después o Día 0 y 10 años después) en una dosis total o niveles de dosis suficientes para administrar una dosis total de 0,010 mg, 0,025 mg, 0,100 mg o 0,400 mg.
En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención a utilizar en un procedimiento de vacunación de un sujeto se administra al sujeto como una única dosificación de 10 pg/kg a 400 pg/kg de la vacuna de ácido nucleico (en una cantidad efectiva para vacunar al sujeto). En algunas realizaciones, la vacuna de ARN (es decir, ARNm) de la invención para su uso en un procedimiento de vacunación de un sujeto se administra al sujeto como una dosis única de entre 10 pg y 400 pg de la vacuna de ácido nucleico (en una forma efectiva). cantidad para vacunar al sujeto), en algunas realizaciones, una vacuna de ARN de virus respiratorio (es decir, ARNm) de la invención para usar en un procedimiento para vacunar a un sujeto se administra al sujeto como una dosis única de 25-1000 pg (por ejemplo., una dosis única de ARNm que codifica hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o antígeno BetaCoV). En algunas realizaciones, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención se administra al sujeto como una dosificación única de 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 pg. Por ejemplo, una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención puede administrarse al sujeto como una dosificación única de 25-100, 25-500, 50-100, 50-500, 50-1000, 100-500, 100­ 1000, 250-500, 250-1000 o 500-1000 pg. En algunos aspectos, a una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios de la invención para su uso en un procedimiento de vacunación de un sujeto se administra al sujeto como dos dosificaciones, donde la combinación de estas equivale a 25-1000 pg de la vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios.
Una composición farmacéutica de vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios descrita en esta invención puede formularse en una forma de dosificación descrita en esta invención, tal como una forma intranasal, intratraqueal o inyectable (por ejemplo, una forma intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intradérmica, intracardíaca, intraperitoneal y subcutánea).
Form ulaciones de vacunas de A R N de virus respiratorios (p o r ejem plo, m RNA) y p rocedim ientos de uso
La presente invención proporciona la vacuna de ARNm definida en las reivindicaciones para su uso en un procedimiento para impedir y/o tratar una enfermedad BetaCoV en un sujeto.
La información técnica expuesta a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
Además, las referencias incidentales a procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y procedimientos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no deben interpretarse como una reivindicación de protección para dichos procedimientos como tales, sino que deben interpretarse como refiriéndose a productos, en particular sustancias o composiciones, para uso en cualquiera de estos procedimientos.
La presente descripción proporciona formulaciones de la vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios, donde la vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) se formula en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un sujeto (por ejemplo, producción de anticuerpos específicos para un polipéptido antigénico hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV). Una “cantidad efectiva” es una dosis de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) efectiva para producir una respuesta inmunitaria específica para un antígeno. También se describen en este documento procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un sujeto. En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria específica de antígeno se caracteriza midiendo un anti-hMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o título de anticuerpo anti-polipéptido anti-BetaCoV producido en un sujeto al que se le administró una vacuna de ARN de virus respiratorio (por ejemplo, ARNm) como se describe en esta invención. Un título de anticuerpo es una medición de la cantidad de anticuerpos dentro de un sujeto, por ejemplo, anticuerpos que son específicos para un antígeno en particular (por ejemplo, un polipéptido antigénico anti-hMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) o epítopo de un antígeno. El título de anticuerpos generalmente se expresa como el inverso de la mayor dilución que proporciona un resultado positivo. Por ejemplo, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es un ensayo común para determinar títulos de anticuerpo.
En algunos aspectos, se usa un título de anticuerpos para evaluar si un sujeto ha tenido una infección o para determinar si se requieren inmunizaciones. En algunos aspectos, se usa un título de anticuerpos para determinar la fuerza de una respuesta autoinmune, para determinar si se necesita una inmunización de refuerzo, para determinar si una vacuna anterior fue efectiva e identificar infecciones recientes o previas, de acuerdo con el presente En la divulgación, se puede usar un título de anticuerpos para determinar la fuerza de una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto por la vacuna de ARN (p.ej., ARNm) del virus respiratorio.
En algunos aspectos, el título de un anticuerpo anti-polipéptido antigénico (por ejemplo, un polipéptido antigénico antihMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) producido en un sujeto aumenta en al menos 1 log en relación con un control. Por ejemplo, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto puede aumentar al menos 1,5, al menos 2, al menos 2,5 o al menos 3 log con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en el sujeto aumenta 1, 1,5, 2, 2,5 o 3 log con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo de polipéptido anti-antigénico producido en el sujeto aumenta 1-3 log con respecto a un control. Por ejemplo, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto puede aumentar 1-1,5, 1-2, 1-2,5, 1-3, 1,5-2, 1,5-2,5, 1,5-3, 2-2,5, 2-3 o 2,5-3 log con respecto a un control.
En algunos aspectos, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico (por ejemplo, un polipéptido antigénico antihMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) producido en un sujeto aumenta al menos 2 veces con respecto a un control. Por ejemplo, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto puede aumentar al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en el sujeto aumenta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces con respecto a un control. En algunos aspectos, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto aumenta 2-10 veces con respecto a un control. Por ejemplo, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto puede aumentar 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-10, 5­ 9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-10, 7-9, 7-8, 8-10, 8-9 o 9-10 veces con respecto a un control.
Un control, en algunos aspectos, es el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico (por ejemplo, un polipéptido antigénico anti-hMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) producido en un sujeto al que no se ha administrado una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorio de la presente descripción. En algunos aspectos, un control es un polipéptido anti-antigénico (por ejemplo, un anti-hMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o o polipéptido antigénico anti-BetaCoV) título de anticuerpos producido en un sujeto al que se le ha administrado una vacuna viva atenuada de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV. Una vacuna atenuada es una vacuna producida mediante la reducción de la virulencia de una vacuna viable (viva). Se altera un virus atenuado en una forma que lo torna inofensivo o menos virulento en comparación con el virus vivo no modificado. En algunos aspectos, un control es un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico (por ejemplo, un polipéptido antigénico anti-hMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) producido en un sujeto al que se le administró hMPV inactivado, Vacuna PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV. En algunos aspectos, se usa como control un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico (por ejemplo, un polipéptido antigénico anti-hMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) producido en un sujeto al que se le administró una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada. Las vacunas de proteínas recombinantes suelen incluir antígenos proteicos que fueron producidos en un sistema de expresión heterólogo (por ejemplo, bacteria o levadura) o que se purificaron a partir de grandes cantidades del organismo patogénico. En algunos aspectos, se usa como control un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico (por ejemplo, un polipéptido antigénico anti-hMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) producido en un sujeto al que se le administró una vacuna de partícula similar al virus (VLP) de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV. Por ejemplo, una vacuna de VLP de hMPV utilizada como control puede ser una VLP de hMPV, que comprende (o consiste en) proteínas virales de matriz (M) y fusión (F), generadas mediante la expresión de proteínas virales en células epiteliales (293-F) de riñón embriónico humano adaptado por suspensión (ver, p.ej., Cox RG y col., J Virol.
2014 Jun; 88(11): 6368-6379).
En algunos aspectos, una cantidad efectiva de una vacuna de ARN (es decir, ARNm) de virus respiratorios es una dosis que se reduce en comparación con la dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante. Tal como se proporciona en esta invención, un “estándar de cuidado” hace referencia a lineamientos para tratamiento médico o psicológico y puede ser general o específico. El "estándar de atención" especifica el tratamiento apropiado basado en la evidencia científica y la colaboración entre los profesionales médicos involucrados en el tratamiento de una condición dada. Es el proceso de diagnóstico y tratamiento que un physician/clinician debe seguir para un determinado tipo de paciente, enfermedad o circunstancia clínica. Tal como se proporciona en esta invención, “dosis del estándar de atención” hace referencia a la dosis de una vacuna de una proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada, o una vacuna de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV inactivado o atenuado vivo, que un médico u otro profesional en medicina administraría a un sujeto para tratar o prevenir hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV, o una afección relacionada con hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV, a la vez que sigue los lineamientos de estándar de cuidado para el tratamiento o prevención de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV, o una afección relacionada con hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV.
En algunos aspectos, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico (por ejemplo, un polipéptido antigénico antihMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) producido en un sujeto al que se administró una cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es equivalente a un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico (por ejemplo, un polipéptido antigénico anti-hMPV, anti-PIV3, anti-RSV, anti-MeV y/o anti-BetaCoV) producido en un sujeto de control al que se administró una dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, Rs V, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada o una vacuna de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV inactivado o atenuado vivo.
En algunos aspectos, una cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis equivalente a una reducción de al menos 2 veces en una dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada. Por ejemplo, una cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios puede ser una dosis equivalente a una reducción de al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces en una dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada. En algunos aspectos, una cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis equivalente a una reducción de al menos 100 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces en una dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada. En algunos aspectos, una cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis equivalente a una reducción de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 250, 500 o 1000 veces en una dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada. En algunos aspectos, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto al que se le administró una cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es equivalente a un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto de control al que se le administró la dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada, o una vacuna de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV inactivado o atenuado vivo. En algunos aspectos, una cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis equivalente a una reducción de 2 veces a 1000 veces (por ejemplo, de 2 veces a 100 veces, de 10 veces a 1000 veces) en la dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada, donde el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto de control al que se le administró la dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada, o una vacuna de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV inactivado o atenuado vivo.
En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis equivalente a una reducción de 2 a 1000, 2 a 900, 2 a 800, 2 a 700, 2 a 600, 2 a 500, 2 a 400, 2 a 300, 2 a 200, 2 a 100, 2 a 90, 2 a 80, 2 a 70, 2 a 60, 2 a 50, 2 a 40, 2 a 30, 2 a 20, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 1000, 3 a 900, 3 a 800, 3 a 700, 3 a 600, 3 a 500, 3 a 400, 3 a 3 a 00, 3 a 200, 3 a 100, 3 a 90, 3 a 80, 3 a 70, 3 a 60, 3 a 50, 3 a 40, 3 a 30, 3 a 20, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 1000, 4 a 900, 4 a 800, 4 a 700, 4 a 600, 4 a 500, 4 a 400, 4 a 4 a 00, 4 a 200, 4 a 100, 4 a 90, 4 a 80, 4 a 70, 4 a 60, 4 a 50, 4 a 40, 4 a 30, 4 a 20, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 4 a 4, 5 a 1000, 5 a 900, 5 a 800, 5 a 700, 5 a 600, 5 a 500, 5 a 400, 5 a 300, 5 a 200, 5 a 100, 5 a 90, 5 a 80, 5 a 70, 5 a 60, 5 a 50, 5 a 40, 5 a 30, 5 a 20, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 1000, 6 a 900, 6 a 800, 6 a 700, 6 a 600, 6 a 500, 6 a 400, 6 a 300, 6 a 200, 6 a 100, 6 a 90, 6 a 80, 6 a 70, 6 a 60, 6 a 50, 6 a 40, 6 a 30, 6 a 20, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 1000, 7 a 900, 7 a 800, 7 a 700, 7 a 600, 7 a 500, 7 a 400, 7 a 300, 7 a 200, 7 a 100, 7 a 90, 7 a 80, 7 a 70, 7 a 60, 7 a 50, 7 a 40, 7 a 30, 7 a 20, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 1000, 8 a 900, 8 a 800, 8 a 700, 8 a 600, 8 a 500, 8 a 400, 8 a 300, 8 a 200, 8 a 100, 8 a 90, 8 a 80, 8 a 70, 8 a 60, 8 a 50, 8 a 40, 8 a 30, 8 a 20, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 1000, 9 a 900, 9 a 800, 9 a 700, 9 a 600, 9 a 500, 9 a 400, 9 a 300, 9 a 200, 9 a 100, 9 a 90, 9 a 80, 9 a 70, 9 a 60, 9 a 50, 9 a 40, 9 a 30, 9 a 20, 9 a 10, 10 a 1000, 10 a 900, 10 a 800, 10 a 700, 10 a 600, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 10 a 90, 10 a 80, 10 a 70, 10 a 60, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 20, 20 a 1000, 20 a 900, 20 a 800, 20 a 700, 20 a 600, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 100, 20 a 90, 20 a 80, 20 a 70, 20 a 60, 20 a 50, 20 a 40, 20 a 30, 30 a 1000, 30 a 900, 30 a 800, 30 a 700, 30 a 600, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 100, 30 a 90, 30 a 80, 30 a 70, 30 a 60, 30 a 50, 30 a 40, 40 a 1000, 40 a 900, 40 a 800, 40 a 700, 40 a 600, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 100, 40 a 90, 40 a 80, 40 a 70, 40 a 60, 40 a 50, 50 a 1000, 50 a 900, 50 a 800, 50 a 700, 50 a 600, 50 a 500, 50 a 400, 50 a 300, 50 a 200, 50 a 100, 50 a 90, 50 a 80, 50 a 70, 50 a 60, 60 a 1000, 60 a 900, 60 a 800, 60 a 700, 60 a 600, 60 a 500, 60 a 400, 60 a 300, 60 a 200, 60 a 100, 60 a 90, 60 a 80, 60 a 70, 70 a 1000, 70 a 900, 70 a 800, 70 a 700, 70 a 600, 70 a 500, 70 a 400, 70 a 300, 70 a 200, 70 a 100, 70 a 90, 70 a 80, 80 a 1000, 80 a 900, 80 a 800, 80 a 700, 80 a 600, 80 a 500, 80 a 400, 80 a 300, 80 a 200, 80 a 100, 80 a 90, 90 a 1000, 90 a 900, 90 a 800, 90 a 700, 90 a 600, 90 a 500, 90 a 400, 90 a 300, 90 a 200, 90 a 100, 100 a 1000, 100 a 900, 100 a 800, 100 a 700, 100 a 600, 100 a 500, 100 a 400, 100 a 300, 100 a 200, 200 a 1000, 200 a 900, 200 a 800, 200 a 700, 200 a 600, 200 a 500, 200 a 400, 200 a 300, 300 a 1000, 300 a 900, 300 a 800, 300 a 700, 300 a 600, 300 a 500, 300 a 400, 400 a 1000, 400 a 900, 400 a 800, 400 a 700, 400 a 600, 400 a 500, 500 a 1000, 500 a 900, 500 a 800, 500 a 700, 500 a 600, 600 a 1000, 600 a 900, 600 a 800, 600 a 700, 700 a 1000, 700 a 900, 700 a 800, 800 a 1000, 800 a 900 o 900 a 1000 veces en la dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante. En algunos aspectos, el título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en un sujeto de control alque se le administró la dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, r Sv , MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada, o una vacuna de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV inactivado o atenuado vivo. En algunos aspectos, la cantidad efectiva es una dosis equivalente (o equivalente a al menos) a una reducción de 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 1280, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 4360, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 5760, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 veces en la dosis del estándar de referencia de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante. En algunos aspectos, un título de anticuerpo anti-polipéptido antigénico producido en el sujeto es equivalente a un título de anticuerpo antipolipéptido antigénico producido en un sujeto de control al que se le administró la dosis del estándar de cuidado de una vacuna de proteína de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV recombinante o purificada, o una vacuna de hMPV, PIV3, RSV, MeV y/o BetaCoV inactivado o atenuado vivo.
En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis total de 50-1000 |jg. En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis total de 50-1000, 50- 900, 50-800, 50-700, 50-600, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-100, 50-90, 50-80, 50-70, 50-60, 60-1000, 60- 900, 60-800, 60-700, 60-600, 60-500, 60-400, 60-300, 60-200, 60­ 100, 60-90, 60-80, 60-70, 70-1000, 70- 900, 70-800, 70-700, 70-600, 70-500, 70-400, 70-300, 70-200, 70-100, 70-90, 70-80, 80-1000, 80- 900, 80-800, 80-700, 80-600, 80-500, 80-400, 80-300, 80-200, 80-100, 80-90, 90-1000, 90- 900, 90-800, 90-700, 90-600, 90-500, 90-400, 90-300, 90-200, 90-100, 100-1000, 100- 900, 100-800, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 200-1000, 200-900, 200-800, 200-700, 200-600, 200-500, 200-400, 200-300, 300-1000, 300-900, 300-800, 300-700, 300-600, 300-500, 300-400, 400-1000, 400-900, 400-800, 400-700, 400-600, 400-500, 500-1000, 500-900, 500-800, 500-700, 500-600, 600-1000, 600-900, 600-900, 600-700, 700-1000, 700-900, 700-800, 800-1000, 800-900 o 900-1000 jg . En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, (es decir, ARNm) de virus respiratorios es una dosis total de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 jg . En algunos aspectos, la cantidad efectiva es una dosis de 25­ 500 jg administrada al sujeto un total de dos veces. En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis de 25-500, 25-400, 25-300, 25-200, 25-100, 25-50, 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-100, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 150-500, 150-400, 150-300, 150-200, 200-500, 200-400, 200-300, 250-500, 250-400, 250-300, 300-500, 300-400, 350-500, 350-400, 400-500 o 450-500 jg administrada al sujeto un total de dos veces. En algunos aspectos, la cantidad efectiva de una vacuna de ARN (por ejemplo, ARNm) de virus respiratorios es una dosis total de 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 jg administrada al sujeto un total de dos veces.
Esta divulgación no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La divulgación es susceptible de otras realizaciones y de practicarse o llevarse a cabo de varias maneras. Además, la fraseología y terminología utilizadas en esta invención tienen fines descriptivos y no deben considerarse limitantes. El uso de las expresiones “que incluye”, “que comprende” o “que tiene”, “que contiene”, “que implica” y variaciones de las mismas en esta invención, está destinado a abarcar los elementos enumerados después de ellas y equivalentes de los mismos, así como elementos adicionales.
EJEMPLOS
Ejem plo 1. Fabricación de polinucleótidos
Según la presente divulgación, la fabricación de polinucleótidos y/o partes o regiones de los mismos se puede lograr utilizando los procedimientos enseñados en la publicación internacional WO2014/152027, titulada "Manufacturing Methods for Production of RNA Transcripts".
Los procedimientos de purificación pueden incluir los enseñados en la Publicación Internacional WO2014/152030 y Publicación Internacional WO2014/152031.
Los procedimientos de detección y caracterización de los polinucleótidos se pueden realizar como se enseña en la Publicación Internacional WO2014/144039.
La caracterización de los polinucleótidos de la descripción puede lograrse mediante el uso de mapeo de polinucleótidos, secuenciación de transcriptasa inversa, análisis de distribución de carga, detección de impurezas de ARN o cualquier combinación de dos o más de los que anteceden. “Caracterizar” comprende determinar la secuencia de transcripción de ARN, determinar la pureza de la transcripción de ARN o determinar la heterogeneidad de la carga de la transcripción de ARN, por ejemplo. Dichos procedimientos se enseñan, por ejemplo, en la Publicación Internacional WO2014/144711 y la Publicación Internacional WO2014/144767.
Ejem plo 2. S íntesis de polinucleótidos quim éricos
De acuerdo con la presente divulgación, dos regiones o partes de un polinucleótido quimérico pueden unirse o ligarse usando química de trifosfato. Se sintetiza químicamente una primera región o parte de 100 nucleótidos o menos con un monofosfato en 5' y desOH en el extremo 3' u OH bloqueado, por ejemplo. Si la región es más extensa que 80 nucleótidos, es posible sintetizarla como dos cadenas para su ligación.
Si la primera región o parte se sintetiza como una región o parte modificada en forma no posicional mediante transcripción in vitro (IVT), puede seguir la conversión de monofosfato en 5' con posterior protección del extremo 3'.
Los grupos protectores de monofosfato se pueden seleccionar de entre cualesquiera de los conocidos en la técnica.
La segunda región o parte del polinucleótido quimérico puede sintetizarse utilizando procedimientos de síntesis química o IVT. Los procedimientos IVT pueden incluir una ARN polimerasa que puede utilizar un cebador con una capa modificada. Alternativamente, una capa de hasta 130 nucleótidos puede sintetizarse químicamente y acoplarse a la región o parte de IVT.
Para los procedimientos de ligación, la ligación con ADN ligasa T4 seguida del tratamiento con DNasa debería evitar la concatenación fácilmente.
No es necesario fabricar el polinucleótido quimérico completo con una estructura principal de fosfato-azúcar. Si una de las regiones o partes codifica un polipéptido, a continuación dicha región o parte puede comprender una estructura principal de fosfato-azúcar.
A continuación, se realiza la ligadura usando cualquier química de clic conocida, química de ortoclic, solulink u otras químicas de bioconjugado conocidas por los expertos en la técnica.
R uta sintética
El polinucleótido quimérico puede elaborarse mediante una serie de segmentos de partida. Dichos segmentos incluyen:
(a) un segmento en 5' protegido y con capa que comprende un OH en 3' normal (SEG. 1)
(b) un segmento de trifosfato en 5' que puede incluir la región codificante de un polipéptido y un OH en 3' normal (SEG.2)
(c) el segmento de monofosfato en 5' para el extremo 3' del polinucleótido quimérico (por ejemplo, la cola) que comprende cordicepina o carece de OH en 3' (SEG. 3)
Después de la síntesis (química o IVT), el segmento 3 (SEG. 3) se trata con cordicepina y a continuación con pirofosfatasa para crear el 5'monofosfato.
El segmento 2 (SEG. 2) se liga a continuación a SEG. 3 usando ARN ligasa. A continuación, el polinucleótido ligado se purifica y se trata con pirofosfatasa para escindir el difosfato. La construcción SEG.2-SEG 3 tratada es a continuación purificada y SEG. 1 es ligado al extremo 5'. Puede realizarse una etapa de purificación adicional del polinucleótido quimérico.
Cuando el polinucleótido quimérico codifica un polipéptido, los segmentos ligados o unidos pueden representarse como: 5'UTR (SEG. 1), marco de lectura abierto u ORF (SEG. 2) y 3'UTR+PoliA (SEG. 3).
Los rendimientos de cada etapa pueden ser tanto como 90-95 %.
Ejem plo 3. PCR p ara la producción de A DN c
Los procedimientos de PCR para la preparación de cDNA se pueden realizar usando 2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix by Kapa Biosystems (Wobufn, MA). Este sistema incluye 2x KAPA ReadyMix 12,5 pl; Cebador directo (10 |jM) 0,75 pl; Cebador inverso (10 pM) 0,75 pl; ADNc molde 100 ng; y dH2O diluida a 25,0 pl. Las condiciones de reacción pueden ser a 95 °C durante 5 min. La reacción se puede realizar durante 25 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, luego 58 °C durante 15 segundos, luego 72 °C durante 45 segundos, luego 72 °C durante 5 minutos, luego 4 °C hasta el final.
La reacción se limpia con el micro kit PURELINK™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante (hasta 5 |jg). Las reacciones más grandes requerirán una limpieza con un producto de mayor capacidad. Después de la limpieza, el ADNc se cuantifica usando el NANODROP™ y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ADNc tiene el tamaño esperado. A continuación, el ADNc se envía para análisis de secuenciación antes de proceder a la reacción de transcripción in vitro.
Ejem plo 4. Transcripción In vitro (IVT)
La reacción de transcripción in vitro genera polinucleótidos de ARN. Dichos polinucleótidos pueden comprender una región o parte de los polinucleótidos de la descripción, inclusive polinucleótidos de ARN (por ejemplo, ARNm) modificados químicamente. Los polinucleótidos de ARN modificados químicamente pueden ser polinucleótidos modificados de manera uniforme. La reacción de transcripción in vitro utiliza una mezcla especial de trifosfatos de nucleótidos (NTP). Los NTP pueden comprender NTP modificados químicamente o una mezcla de NTP naturales y modificados químicamente o NTP naturales.
Una reacción de transcripción in vitro típica incluye lo siguiente:
1) ADNc plantilla 1,0 jg
2) Tampón de transcripción 10x (Tris-HCl 400 mM pH 8,0, MgCl2 190 mM, DTT 50 mM, 2,0
espermidina 10 mM) j l
3) NTP personalizados (25 mM cada uno) 02 j l
4) Inhibidor de RNasa 20 U
5) T7 ARN polimerasa 3000
U
6) dH2O hasta 20,0 jl. y 7) Incubación a 37 °C durante 3 h-5 h.
La mezcla IVT bruta se puede almacenar a 4 °C durante la noche para su limpieza al día siguiente. A continuación, se utiliza 1 U de DNasa libre de RNasa para digerir la plantilla original. Después de 15 minutos de incubación a 37 °C, el ARNm se purifica usando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit puede purificar hasta 500 jg de ARN. Después de la limpieza, el ARN se cuantifica utilizando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido degradación del ARN.
Ejem plo 5. Protección enzim ática
La protección de un polinucleótido de ARN se realiza de la siguiente manera cuando la mezcla incluye: IVT ARN 60 jg-180 jg y dH2O hasta 72 jl. La mezcla se incuba a 65 °C durante 5 minutos para desnaturalizar el ARN y a continuación se transfiere inmediatamente a hielo.
A continuación, el protocolo implica la mezcla de tampón de protección 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 80), KCl 60 mM, MgCl2 12.5 mM (10,0 jl); GTP 20 mM (5,0 jl); S-adenosil metionina 20 mM (2,5 jl); Inhibidor de ARNasa (100 U); 2'-O-metiltransferasa (400 U); Enzima de protección contra Vaccinia (Guanilil transferasa) (40 U); dH2O (hasta 28 jl); e incubación a 37 °C durante 30 minutos para 60 jg de ARN o hasta 2 horas para 180 jg de ARN.
A continuación, el polinucleótido sintético protegido se purifica usando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la limpieza, el polinucleótido sintético protegido se cuantifica usando NANODROP™ (ThermoFisher, Waltham, MA) y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido degradación del ARN. El producto de ARN también se puede secuenciar ejecutando una PCR de transcripción inversa para generar el ADNc para la secuenciación.
Ejem plo 6. Reacción de descolado de PoliA
Sin una poli-T en el ADNc, se debe realizar una reacción de descolado de poli-A antes de limpiar el producto final. Esto se hace mezclando ARN de IVT protegido (100 jl); Inhibidor de ARNasa (20 U); Tampón de descolado 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), NaCl 2,5 M, MgCl2 100 mM)(12,0 jl); 20 mM ATP (6,0 jl); Poli-A Polimerasa (20 U); dH2O hasta 123.5 j l e incubación a 37 °C durante 30 min. Si la cola de poli-A ya está en la transcripción, a continuación la reacción de descolado puede omitirse y proceder directamente a la limpieza con el kit MEGACLEAR™ (Austin, TX) (hasta 500 jg). La polimerasa poli-A es preferiblemente una enzima recombinante expresada en levadura.
Debe entenderse que la procesividad o integridad de la reacción de cola de poliA no siempre puede dar como resultado una cola de poliA del tamaño exacto. Por lo tanto, se encuentran dentro del alcance de la presente descripción las colas poliA con una longitud de aproximadamente 40-200 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 o 165.
Ejem plo 7. Caperuzas naturales en 5 ’ y análogos de caperuzas en 5 ’
La protección en 5' de los polinucleótidos se puede completar de manera concomitante durante la reacción de transcripción in Wfrousando los siguientes análogos químicos de protección de ARN para generar la estructura de protección en 5'-guanosina de acuerdo con los protocolos del fabricante: 3'-O-Me-m7G(5') ppp(5') G [el tope ARCA];G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, Ma ). La protección 5' del ARN modificado puede completarse después de la transcripción utilizando una enzima de protección del virus Vaccinia para generar la estructura "Cap 0": m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). La estructura Capa 1 puede generarse usando tanto la Enzima de Protección del Virus Vaccinia como una 2'-O metiltransferasa para generar: m7G (5 ') ppp (5') G-2'-O-metilo. La estructura Capa 2 puede generarse a partir de la estructura Capa 1 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. La estructura Capa 3 puede generarse a partir de la estructura Capa 2 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. Las enzimas se derivan preferiblemente de una fuente recombinante.
Cuando se transfectan en células de mamífero, los ARNm modificados tienen una estabilidad de entre 12-18 horas, o mayor que 18 horas, por ejemplo, 24, 36, 48, 60, 72, o mayor que 72 horas.
Ejem plo 8: Ensayos de Protección
Ensayo de expresión de proteínas
Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) que codifican un polipéptido, que contienen cualquiera de las caperuzas indicadas en esta invención, pueden transfectarse en células a concentraciones iguales. La cantidad de proteína secretada en el medio de cultivo puede analizarse mediante ELISA 6, 12, 24 y/o 36 horas después de la transfección. Los polinucleótidos sintéticos que secretan niveles mayores de proteína en el medio corresponden a un polinucleótido sintético con una estructura de casquete más competente desde el punto de vista de la traducción.
S íntesis de análisis de pureza
Los polinucleótidos de ARN (por ejemplo, ARNm) que codifican un polipéptido, que contienen cualquiera de las caperuzas indicados en esta invención, pueden compararse a fines de la pureza mediante el uso de electroforesis en gel de Agarosa-Urea o análisis de HPLC. Los polinucleótidos de ARN con una banda consolidada única por electroforesis corresponden al producto de mayor pureza comparado con los polinucleótidos con múltiples bandas o bandas veteadas. Los polinucleótidos de ARN modificados químicamente con un único pico de HPLC también corresponden a un producto de mayor pureza. La reacción de protección con una efectividad mayor proporciona una población de polinucleótidos más mura.
A nális is de citocina
Los polinucleótidos de ARN (por ejemplo, ARNm) que codifican un polipéptido, que contienen cualquiera de las caperuzas indicadas en esta invención, pueden transfectarse en células a múltiples concentraciones. La cantidad de citocinas proinflamatorias, tales como TNF-alfa e IFN-beta, secretada en el medio de cultivo puede analizarse mediante ELISA6, 12, 24 y/o 36 horas después de la transfección. Los polinucleótidos de ARN que dan como resultado la secreción de niveles más altos de citocinas proinflamatorias en el medio corresponden a polinucleótidos que contienen una estructura de caperuza activadora del sistema inmunitario.
Eficacia de reacción de protección
Los polinucleótidos de ARN (por ejemplo, ARNm) que codifican un polipéptido, que contienen cualquiera de las caperuzas indicadas en esta invención, pueden analizarse para detectar la efectividad de la reacción de protección mediante LC-MS luego del tratamiento de nucleasa. El tratamiento con nucleasa de polinucleótidos protegidos produce una mezcla de nucleótidos libres y la estructura de la capa de 5'-5-trifosfato protegida detectable por LC-MS. La cantidad de producto protegido en los espectros de LC-MS se expresa como un porcentaje del polinucleótido total de la reacción y correspondería a la efectividad de la reacción de protección. La estructura de caperuza con mayor eficiencia de reacción de protección tendría una mayor cantidad de producto protegido por LC-MS.
Ejem plo 9. E lectroforesis en g e l de agarosa de A R N m odificado o productos de PCR de R T
Los polinucleótidos de ARN individuales (200-400 ng en un volumen de 20 j l) o los productos de PCR transcritos inversamente (200-400 ng) se pueden cargar en un pocillo en un E-Gel de agarosa al 1,2 % no desnaturalizante (Invirogen, Carlsbad, CA) y correr durante 12-15 minutos, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Ejem plo 10: Datos espectrales U V y cuantificación de A R N m odificado con Nanodrops
Se utilizaron polinucleótidos de ARN en amortiguador TE (1 |jl) para lecturas de absorbancia de UV Nanodrop para cuantificar el rendimiento de cada polinucleótido a partir de una reacción de transcripción in vitro o síntesis química.
Ejem plo 11: Form ulación de A R N m m odificado utilizando Lipidoides
Los polinucleótidos de ARN (por ejemplo, ARNm) pueden formularse para experimentos in vitro mediante la mezcla de polinucleótidos con el lipidoide a una proporción establecida antes de la adición a las células. La formulaciónin vivo puede requerir la adición de ingredientes adicionales para facilitar la circulación por el cuerpo. Para evaluar la capacidad de estos lipidoides para formar partículas adecuadas para el trabajo in vivo, se puede utilizar un procedimiento de formulación estándar para las formulaciones de siRNA-lipidoide como punto de partida. Después de la formación de la partícula, se agrega polinucleótido y se deja integrar en el complejo. La efectividad de encapsulación se determina mediante el uso de ensayos de exclusión de colorante estándar.
Ejem plo 12: Estudio de inm unogenic idad (E jem plo de Referencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la inmunogenicidad de los ratones de vacunas de hMPV candidatas que comprenden un polinucleótido de ARNm que codifica la glicoproteína de fusión (F), glicoproteína G superficial principal o una combinación de estas, obtenida de hMPV.
Los ratones se inmunizan por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID) con vacunas candidatas. Las vacunas candidatas están químicamente modificadas o sin modificar. Se administra un total de cuatro inmunizaciones en intervalos de 3 semanas (es decir, a las semanas 0, 3, 6 y 9) y se recolecta el suero luego de cada inmunización hasta las semanas 33-51. Se determinan mediante ELISA los títulos de anticuerpo en suero contra la glicoproteína de fusión (F) o la glicoproteína (G) superficial mayor. Se agrupan los sueros recolectados de cada ratón durante las semanas 10-16 y se purifica la IgG total. Se utilizan los anticuerpos purificados para microscopía inmunoelectrónica, evaluación de afinidad con los anticuerpos y ensayos de protección in vitro.
Ejem plo 13: Exposición de roedores a h M P V (E jem plo de Referencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la efectividad en ratas algodoneras de las vacunas de hMPV candidatas contra una exposición letal mediante el uso de una vacuna de hMPV que comprende ARNm que codifica la glicoproteína de fusión (F), glicoproteína G superficial principal o una combinación de ambos antígenos obtenida de hMPV. Las ratas algodoneras se expusieron a una dosis letal del hMPV.
Los animales se inmunizan por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID) a la semana 0 y a la semana 3 con vacunas candidatas de hMPV con y sin adyuvante. Las vacunas candidatas están químicamente modificadas o sin modificar. A continuación, los animales se exponen a una dosis letal de hMPV a la semana 7 por vía IV, IM o ID. El punto final fue el día 13 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis. Se evaluó la temperatura corporal y el peso, y se registraron todos los días.
En experimentos en los que se usa una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP), la formulación puede incluir un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural en proporciones de 50:10:1,5:38,5. El lípido catiónico es DLin-KC2-DMA (50 mol %) o DLin-MC3-DMA (50 mol %), el lípido no catiónico es DSPC (10 mol %), el lípido PEG es PEG-DOMG (1,5 mol % ) y el lípido estructural es el colesterol (38,5 mol%), por ejemplo.
Ejem plo 14: Inm unogenic idad de la vacuna de A R N m de h M P V en ratones B ALB/c (E jem plo de R eferencia)
Se diseñó el presente estudio para evaluar la inmunogenicidad en ratones BALB/c de las vacunas candidatas de hMPV que comprenden un polinucleótido de ARNm que codifica la glicoproteína de fusión (F) hMPV. El polinucleótido de ARNm codifica la proteína de fusión de longitud completa y comprende la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje obtenida de la cepa A2a de hMPV. Los ratones se dividieron en 3 grupos (n=8 para cada grupo) y se inmunizaron por vía intramuscular (IM) con PBS, una dosis de 10 jg de vacunas de ARNm que codifican la proteína de fusión de hMPV o una dosis de 2 jg de vacunas de ARNm que codifican la proteína de fusión de hMPV. Se administraron un total de dos inmunizaciones a intervalos de 3 semanas (es decir, en las semanas 0 y 3) y se recogieron los sueros después de cada inmunización de acuerdo con el programa descrito en la Tabla 1. Los títulos de anticuerpos séricos contra la glicoproteína de fusión hMPV se determinaron mediante ELISA. y se detectaron anticuerpos en los sueros recogidos a partir del día 14. Ambas dosis de vacuna evaluadas indujeron niveles similares de respuesta inmunitaria en los ratones (Figuras 2A-2C).
Además, los sueros de los ratones se utilizaron para el isotipado de IgG (Figuras 3A-3C). Tanto la IgG1 como la IgG2a específicas de la proteína de fusión hMPV se detectaron en sueros de ratones. La vacuna de ARNm de proteína de fusión hMPV también indujo respuestas de citoquinas Th1 y Th2, con un sesgo Th1.
Los sueros de ratones inmunizados con dosis de 10 pg o 2 pg de la vacuna de ARNm de proteína de fusión de hMPV contienen anticuerpos neutralizadores. También se evaluó la capacidad de estos anticuerpos de neutralizar la cepa B2 de hMPV. Los sueros que contienen anticuerpos neutralizaron exitosamente el virus B2 de hMPV (Figura 4).
Exam ple 15: Células T/ Estim ulación (E jem plo de R eferencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la estimulación de células T en los esplenocitos de ratones inmunizados con vacunas de ARNm que codifican la proteína de fusión de hMPV, tal como se describe en esta invención. La inmunización de ratones BALB/c se realizó tal como se describe en el Ejemplo 14. Los esplenocitos de cada grupo se agruparon y se separaron en dos partes. Una parte de los esplenocitos de cada grupo de ratones se estimuló con medio sin hMPV, Concanavalina A o un grupo peptídico de proteína de fusión de hMPV que comprende 15-mers (longitud de 15 aminoácidos); mientras que la otra parte de los esplenocitos de cada grupo de ratones se estimuló con medio sin hMPV, Concanavalina A o virus de hMPV inactivado. Las citocinas de ratón secretadas se midieron mediante el uso del ensayo Meso Scale Discovery (MSD).
Se midieron las citocinas específicas para las respuestas de Th1 o Th2. Para la respuesta de Th1, se detectó IFN-y, IL2 y IL12 en los esplenocitos estimulados con el grupo peptídico de proteína de fusión de hMPV a un nivel similar al de Concanavalina A (Figuras 5A-5C). Para una respuesta Th2, el conjunto de péptidos de la proteína de fusión hMPV indujo la secreción de IL10, TNF-a, IL4 e IL detectables, pero no de IL5, mientras que la concanavalina A estimuló la secreción de todas las citocinas Th2 mencionadas anteriormente (Figs. 6A-6E) a un nivel mucho más alto.
Por el contrario, el virus de hMPV inactivado solo indujo la secreción de IL2 en la respuesta de Th1, comparable con la de la Concanavalina A (Figuras 7A-7C). Para la respuesta Th2, el virus hMPV inactivado indujo la secreción de IL10, TNF-a, IL4 e IL6 detectables, pero no de IL5, mientras que la concanavalina A estimuló la secreción de todas las citocinas Th2 mencionadas anteriormente (Figs. 8A-8E) en un nivel mucho más alto.
Ejem plo 16: Exposición de roedores a h M P V en ratas algodoneras inm unizadas con una vacuna de A R N m que codifica la pro te ína de fusión de hM P V
El presente estudio fue diseñado para probar la eficacia en ratas algodoneras de las vacunas hMPV frente a un desafío letal. Se usaron vacunas de ARNm que codifican la proteína de fusión hMPV. El polinucleótido de ARNm codifica una proteína de fusión de longitud completa y comprende la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje obtenida de la cepa A2a de hMPV.
Se inmunizaron ratas algodoneras por vía intramuscular (IM) a la semana 0 y semana 3 con las vacunas de ARNm que codifican la proteína de fusión de hMPV con dosis de 2 pg o 10 pg para cada inmunización. A continuación, los animales se expusieron a una dosis letal de hMPV a la semana 7 luego de la inmunización inicial por vía IV, IM o ID. El punto final fue el día 13 después de la infección, muerte o eutanasia. Se midieron los títulos virales en las narices y pulmones de las ratas algodoneras. Los resultados (Figuras 9A y 9B) muestran que una dosis de 10 pg de vacuna de ARNm protegió a los ratones algodoneros un 100 % en el pulmón y redujo drásticamente el título viral en la nariz luego de la exposición (reducción de ~2 log). Además, una dosis de 2 pg de la vacuna de ARNm mostró una reducción de 1 log en el título viral pulmonar en los ratones algodoneros expuestos.
Además, la histopatología de los pulmones de los ratones algodoneros inmunizados y expuestos no mostró ninguna patología asociada con la enfermedad potenciada por la vacuna (Figura 10).
Ejem plo 17: Estudio de inm unogenic idad (E jem plo de Referencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la inmunogenicidad de los ratones de vacunas de PIV3 candidatas que comprenden un polinucleótido de ARNm que codifica la hemaglutinina-neuraminidasa o la proteína de fusión (F o F0) obtenida de PIV3.
Los ratones se inmunizan por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID) con vacunas candidatas. Las vacunas candidatas están químicamente modificadas o sin modificar. Se administra un total de cuatro inmunizaciones en intervalos de 3 semanas (es decir, a las semanas 0, 3, 6 y 9) y se recolecta el suero luego de cada inmunización hasta las semanas 33-51. Se determinan los títulos de anticuerpo en suero contra la hemaglutinina-neuraminidasa o proteína de fusión (F o F0) mediante ELISA. Se agrupan, opcionalmente, los sueros recolectados de cada ratón durante las semanas 10-16 y se purifican las IgG totales. Se utilizan los anticuerpos purificados para microscopía inmunoelectrónica, evaluación de afinidad con los anticuerpos y ensayos de protección in vitro.
Ejem plo 18: Exposición de roedores P IV 3 (E jem plo de Referencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la efectividad en ratas algodoneras de vacunas de PIV3 candidatas contra una exposición letal mediante el uso de una vacuna de PIV3 que comprende ARNm que codifica la hemaglutininaneuraminidasa o la proteína de fusión (F o F0) obtenida de PIV3. Las ratas algodoneras se expusieron a una dosis letal del PIV3.
Los animales se inmunizan por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID) a la semana 0 y a la semana 3 con vacunas candidatas de PIV3 con y sin adyuvante. Las vacunas candidatas están químicamente modificadas o sin modificar. A continuación, los animales se exponen a una dosis letal de PIV3 a la semana 7 por vía IV, IM o ID. El punto final fue el día 13 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis. Se evaluó la temperatura corporal y el peso, y se registraron todos los días.
En experimentos en los que se usa una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP), la formulación puede incluir un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural en proporciones de 50:10:1,5:38,5. El lípido catiónico es DLin-KC2-DMA (50 mol %) o DLin-MC3-DMA (50 mol %), el lípido no catiónico es DSPC (10 mol %), el lípido PEG es PEG-DOMG (1,5 mol % ) y el lípido estructural es el colesterol (38,5 mol%), por ejemplo.
Ejem plo 19: Exposición de ratas algodoneras hM P V /P IV (E jem plo de R eferencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la efectividad en ratas algodoneras de las vacunas candidatas de ARNm de hMPV, vacunas de ARNm de PIV3 o vacunas de ARNm de combinación de hMPV/PIV contra una exposición letal mediante el uso de la cepa PIV3 o hMPV/A2. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 9.
Ratas algodoneras de 10 a 12 semanas de edad se dividieron en 12 grupos (n=5), y cada grupo se vacunó con vacunas de ARNm indicadas en la Tabla 9. La vacuna de PIV3 comprende ARNm que codifica hemaglutinina-neuraminidasa o proteína de fusión (F o F0) obtenida de PIV3. La vacuna de ARNm de hMPV codifica la proteína de fusión de hMPV de longitud completa. La vacuna de ARNm de combinación de hMPV/PIV es una mezcla de la vacuna de PIV3 y la vacuna de hMPV con una relación 1:1.
Ratas algodoneras se inmunizaron por vía intramuscular (IM) en la semana 0 y la semana 3 con vacunas candidatas con las dosis indicadas en la Tabla 9. Ratas algodoneras inmunizadas con vacunas de ARNm de hMPV o hMPV/PIV Las vacunas combinadas de ARNm fueron desafiadas con una dosis letal de hMPV/A2 cepa en la semana 7 por vía IM. Las ratas algodoneras inmunizadas con las vacunas de ARNm de PIV o las vacunas de ARNm de combinación de hMPV/PIV se expusieron a una dosis letal de la cepa PIV3 a la semana 7 por vía IM.
El punto final fue el día 13 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis. Se evaluó la temperatura corporal y el peso, y se registraron todos los días.
Se evaluaron los títulos virales de pulmón y nariz de hMPV/A2 (Figura 12) o PIV3 (Figura 13). Se evaluó la histopatología pulmonar de la rata algodonera inmunizada y expuesta para determinar la patología asociada con la enfermedad mejorada por la vacuna. Se evaluaron los títulos de anticuerpo de neutralización en el suero de las ratas algodoneras inmunizadas al día 0 y 42 luego de la inmunización (Figura 11).
Se midieron los títulos de anticuerpo de neutralización de hMPV/A2 (Figura 14) o PIV3 (Figura 15) en las muestras de suero de la rata algodonera inmunizada 42 días después de la inmunización. Todas las vacunas de ARNm evaluadas indujeron anticuerpos de neutralización potentes en las ratas algodoneras. También se evaluó la histopatología pulmonar de las ratas algodoneras inmunizadas (Figura 16). Se observó una aparición baja de alveolitis y neumonía intersticial, lo que indicó una ausencia de mejora dependiente de los anticuerpos (ADE) de las enfermedades asociadas con hMPV o PIV.
Ejem plo 20: Estudio de inm unogenic idad del betacoronavirus
El presente estudio se diseñó para evaluar la inmunogenicidad en conejos de vacunas candidatas de betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH o HCoV-HKU1 o una combinación de los mismos) que comprenden un polinucleótido de ARNm que codifica la proteína espicular (S), el subconjunto S1 (S1) de la proteína especular o el subconjunto S2 (S2) de la proteína espicular obtenida de betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH o HCoV-HKU1).
Los conejos se vacunaron en las semanas 0 y 3 mediante las vías intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID). Un grupo se mantuvo sin vacunar y a uno se le administró betacoronavirus activado. El suero se recolecta de cada conejo en las semanas 1, 3 (antes de la dosis) y 5. Se analizan los sangrados individuales para determinar la actividad anti-S, anti-S1 o anti-S2 a través de un ensayo de neutralización de virus de los tres puntos de tiempo y muestras agrupadas. a partir de la semana 5 solo se analizan mediante Western blot utilizando betacoronavirus inactivado (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH o HCoV-HKU1 inactivados).
En experimentos en los que se usa una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP), la formulación puede incluir un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural en proporciones de 50:10:1,5:38,5. El lípido catiónico es DLin-KC2-DMA (50 mol %) o DLin-MC3-DMA (50 mol %), el lípido no catiónico es DSPC (10 mol %), el lípido PEG es PEG-DOMG (1,5 mol % ) y el lípido estructural es el colesterol (38,5 mol%), por ejemplo.
Ejem plo 21: Exposición a betacoronavirus
El presente estudio se diseñó para evaluar la efectividad en conejos de vacunas candidatas de betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 o una combinación de los mismos) contra una exposición letal mediante el uso de una vacuna de betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 o una combinación los mismos) que comprende ARNm que codifica la proteína espicular (S), el subconjunto S1 (S1) de la proteína especular o el subconjunto S2 (S2) de la proteína espicular obtenida de betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH o HCoV-HKU1). Los conejos se exponen a una dosis letal (10xLD90; ~100 conjuntos que forman placa; PFU) de betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH o HCoV-HKU1).
Los animales utilizados son conejos hembra de 6-8 semanas de vida en grupos de a 10. Los conejos se vacunan en las semanas 0 a 3 a través de una vía de administración IM, ID o IV. Las vacunas candidatas están químicamente modificadas o sin modificar. Se evalúa el suero del conejo para la microneutralización (ver el Ejemplo 14). A continuación los conejos se exponen a ~1 LD90 de betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH o HCoV-HKU1) en la semana 7 a través de una vía de administración IN, IM, ID o IV. El punto final fue el día 13 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis. Se evaluó la temperatura corporal y el peso, y se registraron todos los días.
Ejem plo 22: E nsayos de M icroneutralización
Se realizan nueve diluciones dobles en serie (1:50-1:12,800) de suero de conejo en 50 pl de medio de cultivo de virus (VGM) con tripsina en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se agregan cincuenta microlitros de virus que contiene ~ 50 pfu de betacoronavirus (por ejemplo, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-NL, HCoV-NH o HCoV-HKU1) a las diluciones de suero y se dejan incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente (TA). Se incluyen por triplicado en cada placa los pocillos de control positivo del virus sin suero y los pocillos de control negativo sin virus ni suero. Mientras se incuban las mezclas de suero-virus, se prepara una suspensión individual de células Madin-Darby Canine-Kidney mediante tratamiento con tripsina (Gibco tripsina pancreática bovina al 0,5 % en EDTA) de una monocapa confluente y las células suspendidas se transfieren a un tubo de centrífuga de 50 ml, se rellena con PBS estéril y se mezcla suavemente. A continuación se sedimentan las células a 200 g durante 5 minutos, se aspira el sobrenadante y las células se vuelven a suspender en PBS. Este procedimiento se repite una vez y las células se vuelven a suspender a una concentración de 3 * 105/ml en VGM con tripsina porcina. A continuación se agregan 100 pl de células a las mezclas de suero-virus y las placas se incuban a 35 °C en CO2 durante 5 días. Las placas se fijan con acetona al 80 % en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) durante 15 minutos a TA, se secan al aire y a continuación se bloquean durante 30 minutos con PBS que contiene gelatina al 0,5 % y FCS al 2 %. Un anticuerpo de las proteínas S, proteína S1 o proteína S2 se diluye en PBS con gelatina al 0,5 %/FCS al 2 %/Tween 20 al 0,5 % y se incuba a TA durante 2 horas. Se lavan los pocillos y se agrega IgG antirratón de cabra conjugada con peroxidasa del rábano picante, seguido por otra incubación de 2 horas. A continuación del lavado, se agrega diclorhidrato de O-fenilendiamina y se define el título de neutralización como el título del suero que redujo el desarrollo de color un 50 % en comparación con los pocillos de control positivo.
Ejem plo 23: Estudio de inm unogenic idad de la vacuna de M E R S -C oV en ratones
El presente estudio se diseñó para evaluar la inmunogenicidad en ratones de las vacunas candidatas de MERS-CoV que comprenden un polinucleótido de ARNm que codifica la proteína espicular (S) de longitud completa, o el subconjunto S2 (S2) de la proteína espicular obtenida de MERS-CoV.
Los ratones se vacunaron con una dosis de 10|jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV que codifica la proteína espicular (S) de longitud completa de MERS-CoV, o el subconjunto S2 (S2) de la proteína espicular los días 0 y 21. Se recolectaron sueros de cada ratón los días 0, 21, 42 y 56. Se evaluaron las extracciones individuales de sangre para detectar la actividad anti-S y anti-S2 a través de un ensayo de neutralización de virus en los cuatro puntos temporales.
Tal como se muestra en la Figura 17, la vacuna de MERS-CoV que codifica la proteína S de longitud completa indujo una respuesta inmunitaria potente luego de la dosis de refuerzo al día 21. Adicionalmente, la vacuna de proteína S de longitud completa generó títulos de anticuerpo de neutralización mucho mayores en comparación con s2 sola (Figura 18).
Ejem plo 24: Estudio de inm unogenic idad de la vacuna de M E R S -C oV en conejos blancos Nueva Zelanda
El presente estudio se diseñó para evaluar la inmunogenicidad de las vacunas de ARNm candidatas de MERS-CoV que codifican la proteína espicular (S) de longitud completa. Los conejos blancos Nueva Zelanda utilizados en este estudio pesaron aproximadamente 4-5 kg. Los conejos se dividieron en tres grupos (Grupo 1a, Grupo 1b y Grupo 2, n=8). Los conejos del Grupo 1a se inmunizaron por vía intramuscular (IM) con una dosis de 20 |jg de la vacuna de ARNm MERS-CoV que codifica la proteína Spike de longitud completa el día 0. Los conejos del Grupo 1b se inmunizaron por vía intramuscular (IM) con una dosis de 20 jg de la Vacuna de ARNm de MERS-CoV que codifica la proteína Spike de longitud completa el día 0 y nuevamente el día 21 (dosis de refuerzo). El Grupo 2 recibió placebo (PBS). A continuación se expusieron los conejos inmunizados y se recolectaron muestras 4 días después de la exposición. Se determinaron las cargas virales en los pulmones, lavaje broncoalveolar (Bal), nariz y garganta de los ratones, por ejemplo, mediante PCR cuantitativa. También se detectaron virus replicantes en los tejidos pulmonares de los conejos. Se evaluaron las histopatologías pulmonares y se determinaron los títulos de anticuerpo de neutralización en muestras de suero de los conejos.
Dos dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjeron una reducción de 3 log de la carga viral en la nariz y llevaron a una protección completa en la garganta de los conejos blancos Nueva Zelanda (Figura 19A). Dos dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV también produjeron una reducción de 4 log de la carga viral en el BAL de los conejos blancos Nueva Zelanda (Figura 19B). Una dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjo una reducción de 2 log de la carga viral, mientras que dos dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjeron una reducción de la carga viral superior a 4 log en los pulmones de conejos blancos Nueva Zelanda (Figura 19c ).
Los resultados de PCR cuantitativa muestran que dos dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV produjeron una reducción superior al 99 % (2 log) de los virus en los pulmones de los conejos blancos Nueva Zelanda (Figura 20A). No se detectaron virus replicantes en los pulmones (Figura 20B).
Además, tal como se muestra en la Figura 21, dos dosis de 20 jg de la vacuna de ARNm de MERS-CoV indujeron una cantidad significativa de anticuerpos de neutralización contra MERS-CoV (EC50 entre 500-1000). El título de anticuerpo inducido por la vacuna de ARNm de MERS-CoV es 3-5 veces mejor que cualquier otra vacuna evaluada en el mismo modelo.
Ejem plo 25: Estudio de inm unogenic idad (E jem plo de Referencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la inmunogenicidad en ratones de vacunas candidatas de MeV que comprenden un polinucleótido de ARNm que codifica la proteína hemaglutinina (HA) de MeV, la proteína de fusión (F) de MeV o una combinación de ambas.
Los ratones se inmunizan por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID) con vacunas candidatas. Se administra un total de cuatro inmunizaciones en intervalos de 3 semanas (es decir, a las semanas 0, 3, 6 y 9) y se recolecta el suero luego de cada inmunización hasta las semanas 33-51. Se determinan los títulos de anticuerpo en suero contra la proteína HA de MeV o la proteína F de MeV mediante ELISA.
Ejem plo 26: Exposición de roedores M eV (E jem plo de Referencia)
El presente estudio se diseñó para evaluar la efectividad en ratones transgénicos de vacunas candidatas de MeV contra una exposición letal mediante el uso de una vacuna de MeV que comprende un ARNm que codifica la proteína HA de MeV o la proteína F de MeV. Los ratones transgénicos expresan el receptor CD46 humano o la molécula de activación de linfocitos de señalización (SLAM) (también denominada CD150). Los seres humanos son el único hospedador natural para la infección por MeV; por lo tanto, se requieren líneas transgénicas para este estudio. CD46 es una proteína reguladora de complemento que protege el tejido del hospedador de la deposición de complementos al unirse a los componentes de complemento C3b y C4b. Su expresión en líneas celulares de linfoides y fibroblastos murinos provoca que estas células, que de otra forma son refractorias, permitan la infección por MeV, y la expresión de CD46 en células de primate es similar al tropismo clínico de la infección por MeV en seres humanos y primates no humanos (Rail GF y col. PNAS USA 1997;94(9):4659-63). SLAM es una glicoproteína de membrana de tipo 1 que pertenece a la superfamilia de la inmunoglobulina. Se expresa en la superficie de linfocitos activados, macrófagos y células dendríticas, y se piensa que desempeña un papel importante en la señalización de linfocitos. SLAM es un receptortanto para las cepas de MeV de la vacuna como de tipo salvaje (Sellin CI y col. J Virol. 2006;80(13):6420-29),
Los ratones transgénicos de CD46 o SLAM/CD150 se exponen a una dosis letal del MeV. Los animales se inmunizan por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID) a la semana 0 y a la semana 3 con vacunas candidatas de MeV con y sin adyuvante. A continuación, los animales se exponen a una dosis letal de MeV a la semana 7 por vía IV, IM o ID. El punto final fue el día 13 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis. Se evaluó la temperatura corporal y el peso, y se registraron todos los días.
La formulación de LNP consistió en un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural en proporciones de 50:10:1,5:38,5. El lípido catiónico fue DLin-KC2-DMA (50 mol %), el lípido no catiónico fue DSPC (10 mol %), el lípido PEG fue PEG-DOMG (1,5 mol %) y el lípido estructural fue colesterol (38,5 mol % ), por ejemplo.
Cada una de las secuencias descritas en esta invención abarca una secuencia modificada químicamente o una secuencia no modificada que no incluye modificaciones de nucleótidos.
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Tabla 3. Secuencias de aminoácidos de hMPV Eem lo de de Referencia
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Tabla 6. Secuencias de aminoácidos de PIV3 Eem lo de Referencia
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Tabla 7. Números de acceso de NCBI para PIV3 (secuencias de aminoácidos y ácido nucleico) (Ejemplo de
R f r n i
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Tabla 8. Péptidos señal
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Tabla 9. Diseño de estudio de exposición de rata de algodón hMPV/PIV (Ejemplo de Referencia)
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Tabla 10. Secuencia de ácido nucleico de betacoronavirus
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Tabla 11. Secuencia de aminoácidos de betacoronavirus
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Tabla 12. Secuencias de aminoácidos de glicoproteína espicular de longitud completa (CepasHomo sapiens)
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Tabla 13. Secuencias de ácido nucleico MeV (Ejemplo de Referencia)
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Tabla 14. Secuencias de aminoácidos MeV (Ejemplo de Referencia)
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Tabla 15. Números de acceso NCBI MeV (Secuencias de aminoácidos) (Ejemplo de Referencia)
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Tabla 16. Secuencias de ácido nucleico de flagelina
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Tabla 17. Secuencia de aminoácidos de flagelina
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
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ı92
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ı93
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ı94
Tabla 19. Secuencias de aminoácidos mutantes del metapneumovirus humano (Ejemplo de Referencia)
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una vacuna de ARN mensajero (ARNm) de betacoronavirus (BetaCoV) que comprende al menos un polinucleótido de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico BetaCoV;
donde el al menos un polipéptido antigénico BetaCoV es (a) una proteína espicular (S) o un fragmento inmunogénico de la misma, o (b) un subconjunto S1 o un subconjunto S2 de la proteína S o un fragmento inmunogénico de la misma;
donde la vacuna BetaCoV se formula en una nanopartícula lipídica, donde la nanopartícula lipídica comprende 40­ 60 % de lípido catiónico, 5-15 % de lípido no catiónico, 1-2 % de lípido PEG y 30-50 % de colesterol.
2. La vacuna de la reivindicación 1, donde el marco de lectura abierto codifica una proteína S.
3. La vacuna de la reivindicación 1, donde el marco de lectura abierto codifica un subconjunto S1 o un subconjunto S2 de la proteína S.
4. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el BetaCoV es MERS-CoV, SARS-CoV, HCoVOC43, HCoV-229E, HCoV-NL63 o HCoV-HKUl.
5. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde al menos un polinucleótido de ARNm comprende una región no traducida (UTR) en 5', una UTR en 3', una caperuza en 5' y una cola poli(A).
6. La vacuna de la reivindicación 5, donde la caperuza en 5' es una caperuza terminal en 5' 7mG(5')ppp(5')NlmpNp.
7. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde al menos un polinucleótido de ARNm comprende al menos una modificación química; opcionalmente, donde al menos una modificación química es una modificación de N1-metilpseudouridina o una modificación de N1-etilpseudouridina.
8. La vacuna de la reivindicación 7, donde al menos el 80 % del uracilo en el marco de lectura abierto tiene una modificación química.
9. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el lípido catiónico es un lípido catiónico ionizable y el lípido no catiónico es un lípido neutro.
10. La vacuna de la reivindicación 9, donde el lípido neutro se selecciona de entre DSPC, DPPC, POPC, DOPE y SM.
11. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la nanopartícula lipídica comprende un compuesto del Compuesto 3, 18, 20, 25, 26, 29, 30, 60, 108-112 o 122:
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,
Figure imgf000457_0001
12. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para uso en un procedimiento de prevención y/o tratamiento de una enfermedad BetaCoV en un sujeto.
13. La vacuna para uso de la reivindicación 12, donde la vacuna se administra al sujeto mediante inyección intradérmica o intramuscular.
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