TW202321446A - 多管柱層析ｍＲＮＡ純化 - Google Patents
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Abstract
本文描述使用連續多管柱層析方法自進料溶液中純化核酸(例如，mRNA)之方法。亦描述藉由使用多個管柱並行地進行純化方法來增加層析方法之效率的方法。
Description
信使RNA (mRNA)由於mRNA之效能及可程式性而為習知小分子及蛋白質治療劑的新興替代物。可將編碼所需治療蛋白之mRNA投與個體以使該蛋白質
在活體內表現來實現治療效果，諸如由突變基因編碼之蛋白質之疫苗接種或置換。使用噬菌體RNA聚合酶
在活體外轉錄DNA模板係產生用於治療應用之mRNA之有用方法。然而，
活體外轉錄之mRNA必須在下游使用之前進行純化。
本揭示案之一些態樣係關於使用連續多管柱層析(MCC)製程來純化核酸(諸如mRNA)之方法。多管柱層析可裝載串聯連接之多個層析管柱，以致可將來自一個管柱之流通液引導至一或多個串聯的第二管柱之固定相上。流通液或穿透液中未由第一管柱之固定相捕獲的任何核酸均可由第二管柱之固定相捕獲。藉由捕獲來自第一管柱之穿透液，第二管柱可防止核酸損失，而不會顯著降低該製程之生產率。因此，可將較大量之核酸裝載至第一管柱上，超出樹脂之結合能力。一旦第一管柱已達到核酸飽和，該多管柱層析系統即可調節輸入方向，使得現在達到mRNA飽和之第一管柱經歷洗滌及溶析步驟以分離結合之mRNA。在洗滌及溶析步驟中，可將新鮮進料溶液裝載至一個第二管柱上，該第二管柱先前已接收來自第一管柱之流通液以防止穿透液mRNA之損失。一旦結合之核酸已自第一管柱溶析出，第一管柱即可再生且達到平衡以恢復其繼續捕獲更多核酸之能力。
管柱可經歷此循環：1)平衡；2)接收來自前一串聯管柱的含有核酸之流通液，其中視情況重複此步驟；3)接收含有濃核酸之新鮮進料溶液；4)洗滌以移除雜質；5)溶析以收集經純化之核酸；及6)再生以恢復核酸結合能力。與傳統分批層析相比，此循環允許核酸進料溶液在「質傳區」中花費更多時間。在層析管柱之空閒區中，樹脂已裝載mRNA且等待洗滌或溶析步驟，或樹脂新鮮地再生且等待新鮮核酸裝載材料。在質傳區中，樹脂正在主動地裝載核酸，或先前裝載核酸之樹脂正在主動地進行洗滌、溶析、再生或平衡。空閒區為非生產性的，且在傳統分批層析期間代表管柱之大部分。由於多個管柱同時操作，多管柱層析可跨數個較小管柱分隔此生產性質傳區，導致與傳統分批層析相比，製程生產率高得多。此外，藉由並行地處理較小管柱，而非如傳統分批層析方法中之單個管柱，減少了其中固定相不與任何核酸相互作用之空閒時間量。因此，就可在既定時長內使用既定量之固定相純化之核酸而言，與分批層析方法相比，多管柱層析法具有較高生產率。此外，一個管柱之流通液可經分隔且經引導至多個並聯的第二管柱，從而允許將更濃縮之mRNA進料溶液施加至一級管柱，同時使任何第二管柱超載之風險降至最低。使用更濃縮之進料溶液且因此能夠在既定時間量內純化更多mRNA，這抵消了平行管柱中對額外樹脂之需求，由此相對於分批層析方法增加平行多管柱層析方法之生產率。
因此，本揭示案之一些態樣包含使用至少三個能夠串聯使用之層析管柱來純化核酸的方法，該等方法包括：
(i)(a) 藉由使第一層析管柱之第一固定相與包含一或多種核酸之進料溶液接觸來裝載第一層析管柱，視情況其中該一或多種核酸包含mRNA；
(ii)(a) 藉由與第一層析管柱串聯，使第二層析管柱之第二固定相與已接觸第一管柱之第一固定相的進料溶液接觸來裝載第二層析管柱；
(iii)(a) 使第二固定相與進料溶液中尚未與第一固定相接觸之部分接觸；
(iii)(b) 與第二層析管柱串聯，使第三層析管柱之第三固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的部分接觸；及
(iv)(a) 自第一層析管柱溶析該一或多種核酸。
在一些實施例中，自第一層析管柱溶析係在其中第一層析管柱及第二層析管柱未串聯之條件下進行的。
在一些實施例中，該至少三個能夠串聯使用之層析管柱包含3、4、5、6、7、8個或更多個層析管柱。
在一些實施例中，第一層析管柱能夠與第八層析管柱及第二層析管柱串聯使用；第二層析管柱能夠與第三層析管柱串聯使用；第三層析管柱能夠與第四層析管柱串聯使用；第四層析管柱能夠與第五層析管柱串聯使用；第五層析管柱能夠與第六層析管柱串聯使用；第六層析管柱能夠與第七層析管柱串聯使用；且第七層析管柱能夠與串聯的第八層析管柱串聯使用。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
使最後一個層析管柱之最後固定相與進料溶液中尚未與固定相接觸之額外部分接觸；及
與最後一個層析管柱串聯，使第一層析管柱之第一固定相與進料溶液之額外部分中已接觸最後一個層析管柱之最後固定相的部分接觸。
在一些實施例中，每個層析管柱之輸出液未經引導至超過一個其他層析管柱。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(ii)(b) 藉由與第一層析管柱串聯，使第三層析管柱之第三固定相與進料溶液中已接觸第一管柱之第一固定相的部分接觸，與第二層析管柱並聯地裝載第三層析管柱。
在一些實施例中，本揭示案係關於一種使用至少四個層析管柱來純化核酸之方法，其中每個管柱能夠與兩個或更多個其他管柱串聯及並聯使用，該方法包括：
(i) 藉由使第一層析管柱之第一固定相與包含一或多種核酸之進料溶液接觸來裝載第一層析管柱，視情況其中該一或多種核酸為mRNA；
(ii) 藉由與第一層析管柱串聯，使(a)第二層析管柱之第二固定相與進料溶液中已接觸第一層析管柱之第一固定相的第一部分接觸，及使(b)第三層析管柱之第三固定相與進料溶液中已接觸第一層析管柱之第一固定相的第二部分接觸，並聯地裝載第二層析管柱及第三層析管柱；
(iii) 藉由使第二固定相與進料溶液中尚未與第一固定相接觸之部分接觸來裝載第二層析管柱；
(iv) 藉由與第二層析管柱串聯，使(a)第三層析管柱之第三固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的第一部分接觸，及使(b)第四層析管柱之第四固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的第二部分接觸，並聯地裝載第三層析管柱及第四層析管柱；及
(v)(a) 自第一層析管柱溶析該一或多種核酸。
在一些實施例中，進料溶液中已接觸第一層析管柱之第一固定相的第一部分大致等於進料溶液中已接觸第一層析管柱之第一固定相的第二部分。
在一些實施例中，該至少四個層析管柱包含4、5、6、7、8、9、10個或更多個層析管柱
在一些實施例中，每個層析管柱之輸出液能夠經引導至2、3、4、5、6、7或8個其他層析管柱。
在一些實施例中，該至少四個管柱包含8個層析管柱，其中：
i) 第一層析管柱能夠與並聯之第二層析管柱及第三層析管柱串聯使用；
ii) 第二層析管柱能夠與並聯之第三層析管柱及第四層析管柱串聯使用；
iii) 第三層析管柱能夠與並聯之第四層析管柱及第五層析管柱串聯使用；
iv) 第四層析管柱能夠與並聯之第五層析管柱及第六層析管柱串聯使用；
v) 第五層析管柱能夠與並聯之第六層析管柱及第七層析管柱串聯使用；
vi) 第六層析管柱能夠與並聯之第七層析管柱及第八層析管柱串聯使用；
vii) 第七層析管柱能夠與並聯之第八層析管柱及第一層析管柱串聯使用；且
viii) 第八層析管柱能夠與並聯之第一層析管柱及第二層析管柱串聯使用。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
使最後一個層析管柱之最後固定相與進料溶液中尚未與固定相接觸之額外部分接觸；及
與最後一個層析管柱串聯，並行地使(a)第一層析管柱之第一固定相與額外進料溶液中已接觸最後一個層析管柱之最後固定相的第一部分接觸，及使(b)第二層析管柱之第二固定相與進料溶液之額外部分中已接觸最後一個層析管柱之最後固定相的第二部分接觸。
在一些實施例中，該方法為自動化方法。
在一些實施例中，其中每個層析管柱能夠獨立地接收來自進料溶液、洗滌溶液、溶析溶液、清潔溶液及平衡溶液之輸入材料。
在一些實施例中，每個層析管柱能夠獨立地將材料引導至串聯使用之不同層析管柱、廢物收集區及產物收集區。
在一些實施例中，同時進行以下步驟：裝載至少一個管柱；洗滌至少一個管柱；對至少一個管柱進行溶析；清潔至少一個管柱；及使至少一個管柱平衡。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(ii)(b) 使第一固定相與洗滌溶液接觸，其中包含洗滌溶液之輸出液經引導至廢物收集區。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(iv) (b) 使第一固定相與清潔溶液接觸，其中包含再生溶液之輸出液經引導至廢物收集區。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(iv)(c) 使第一固定相與平衡溶液接觸，其中包含平衡溶液之輸出液經引導至廢物收集區。
在一些實施例中，該至少三個固定相中之每一者均包含樹脂粒子。
在一些實施例中，每個固定相包含oligo-dT。
在一些實施例中，該至少三個層析管柱中之每一者均包含共計約0.5 L至約2 L、約2 L至約5 L、約5 L至約10 L或約10 L至約20 L之固定相。
在一些實施例中，進料溶液包含約 2 mg/mL至約5 mg/mL mRNA、約2.25 mg/mL至約4 mg/mL mg/mL mRNA或約2.5 mg/mL至約3 mg/mL mRNA。
在一些實施例中，第一層析管柱之裝載包括使第一固定相與至少2 g、至少3 g、至少4 g、至少5 g、至少6 g、至少7 g、至少8 g、至少9 g、至少10 g或更多mRNA/L存在於第一層析管柱中之固定相接觸。
在一些實施例中，進料溶液具有約300 mM至約600 mM之鹽濃度。在一些實施例中，其中進料溶液具有約500 mM之鹽濃度，在一些實施例中，鹽濃度為進料溶液中之氯化鈉的濃度。
在一些實施例中，在(i)(a)之裝載之前將高鹽緩衝液添加至進料溶液中，其中(i)(a)之裝載發生在添加高鹽緩衝液之後的5分鐘或更短時間、4分鐘或更短時間、3分鐘或更短時間、2分鐘或更短時間或1分鐘或更短時間內。
在一些實施例中，步驟(i)(a)之接觸進行約2分鐘至約10分鐘、約3分鐘至約7分鐘或約5分鐘至約6分鐘。
在一些實施例中，(iv)(a)之溶析進行約1分鐘至約4分鐘、約1.25分鐘至約3分鐘或約1.5分鐘至約2分鐘。
在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少0.25 g、至少0.5 g、至少0.75、至少2 g、至少3 g、至少4 g、至少5 g、至少6 g、至少7 g、至少8 g、至少9 g或多達10 g mRNA，視情況其中在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少4 g mRNA。
在一些實施例中，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之經溶析mRNA包含聚A尾，視情況其中至少95%之經溶析mRNA包含聚A尾。
在一些實施例中，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之經溶析mRNA具有約相同長度，視情況其中至少85%之經溶析mRNA具有約相同長度。
在一些實施例中，進料溶液中至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之mRNA經溶析，視情況其中進料溶液中至少75%之mRNA經溶析。
在一些實施例中，該方法之生產率為至少約0.25 g / Lh，視情況其中該方法之生產率為約0.5 g / Lh、約0.75 g / Lh、約2 g / Lh、約3 g / Lh、約4 g / Lh、約5 g / Lh、約6 g / Lh、約7 g / Lh、約8 g / Lh、約9 g / Lh、約10 g / Lh或更高。
相關申請案
本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張2021年8月13日提出申請之美國臨時申請案第63/233,171號及2021年10月22日提出申請之美國臨時申請案第63/270,821號的權益，該等美國臨時申請案中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。
本揭示案係關於自
活體外轉錄(IVT)或
活體外加帽反應中純化核酸(諸如mRNA)之方法。mRNA可由IVT產生，但包括三磷酸核苷酸、DNA模板、用於裂解DNA模板之DNase以及RNA聚合酶在內的IVT反應組分之存在可催化mRNA降解，抑制脂質奈米粒子之封裝，且抑制
活體內mRNA轉譯。因此，在用於下游應用(諸如脂質奈米粒子之封裝及/或投與個體)之前，mRNA必須與IVT反應組分及其他產物(諸如雙鏈RNA (dsRNA))分離。多管柱層析利用可串聯連接之多個層析管柱來裝載核酸(
例如，mRNA)，使得來自一個管柱之流通液可經引導至串聯的下一管柱之固定相上。流通液或穿透液中未由第一管柱之固定相捕獲的核酸可由一或多個第二管柱之固定相捕獲。藉由捕獲來自第一管柱之穿透液，第二管柱會防止核酸損失，而不會引起製程生產率之顯著損失。因此，可將較大量之核酸添加至第一管柱中，而無由於超過第一管柱之動態結合能力而造成損失的風險。一旦第一管柱已達到核酸飽和，含有核酸之輸入溶液即可直接施加至一個第二管柱，同時核酸自第一管柱溶析出。一旦結合之核酸已自第一管柱溶析出，第一管柱即可再生且達到平衡以恢復其捕獲更多核酸之能力，諸如存在於來自該系列管柱中的最後一個管柱之流通液中之彼等核酸。該集合中之所有管柱均經歷此循環：1)平衡；2)接收來自前一串聯管柱的含有核酸之流通液，其中視情況重複此步驟；3)接收含有濃核酸之進料溶液；4)洗滌以移除雜質；5)溶析以收集核酸；及6)再生以恢復核酸結合能力，核酸進料溶液在「質傳區」中花費更多時間，在該「質傳區」中，核酸主動地與固定相結合，而非移動通過達到核酸飽和之固定相。在層析管柱之空閒區中，樹脂已裝載mRNA且等待洗滌或溶析步驟，或樹脂新鮮地再生且等待新鮮核酸裝載材料。在質傳區中，樹脂正在主動地裝載核酸，或先前裝載核酸之樹脂正在主動地進行洗滌、溶析、再生或平衡。空閒區為非生產性的，且在傳統分批層析期間代表管柱之大部分。由於多個管柱同時操作，多管柱層析跨數個較小管柱分隔此生產性質傳區，導致與傳統分批層析相比，製程生產率高得多。此外，藉由並行處理較小管柱，而非如傳統分批層析中之單個管柱，減少了其中固定相不與任何核酸相互作用之空閒時間量。因此，就可在既定時長內使用既定量之固定相純化之核酸而言，與分批層析方法相比，多管柱層析法具有較高生產率。此外，一個管柱之流通液可經分隔且經引導至多個並聯的第二管柱，從而允許將更濃縮之mRNA進料溶液應施加至一級管柱，同時使任何第二管柱超載之風險降至最低。使用更濃縮之進料溶液且因此能夠在既定時間量內純化更多mRNA，這抵消了平行管柱中對額外樹脂之需求，由此相對於分批層析方法增加平行多管柱層析方法之生產率。
管柱層析
本揭示案之態樣係關於使用多管柱層析來純化核酸之方法。多管柱層析係指管柱層析方法，其中多個管柱串聯連接，使得流出一個管柱之液體必要時可經引導至該系列中的下一管柱中，或若非必要，則可經引導至單獨容器中。下文更詳細描述之管柱層析藉由使含有混合物之移動相穿過含有固定相之管柱來分離該混合物的組分。在一些實施例中，將待純化之組合物添加至管柱之固定相的頂部，且添加移動相以溶解該等組合物。移動相穿過管柱之固定相，且移動相之溶解組分與管柱之固定相以不同親和力相互作用。與固定相微弱地相互作用之組分遷移得更快，更早到達管柱之底部。相比之下，更強地相互作用之組分在管柱中保留更久。因為組合物之不同組分在不同時間到達管柱之底部，故其可單獨地收集至不同的收集容器中，從而允許自含有多種組分之組合物收集所需組分。在一些實施例中，使用逆相管柱層析來純化mRNA組合物。在逆相管柱層析中，固定相為非極性的，而移動相為極性的。
在層析方法之一些實施例中，層析管柱為離子交換管柱。離子交換層析允許基於可離子化分子(諸如核酸及蛋白質)之淨電荷來分離該等分子，這可藉由改變包含一或多種待分離分子之溶液的pH來操縱。當將包含一或多種待分離分子之溶液裝載至離子交換管柱之固定相上時，具有與固定相的電荷互補之電荷之分子(
例如，與帶正電荷的固定相接觸之帶負電荷分子)將保留於管柱中，而無互補電荷之分子將穿過固定相。接著，可將不同pH之一或多種移動相施加至固定相以改變所保留分子之電荷，使得含有所需分子(諸如核酸)之部分可自管柱中溶析出。
在一些實施例中，層析管柱為親和管柱。親和管柱包含對所需分子具有親和力之固定相。例如，包含至少六個連續組胺酸殘基之胺基酸序列(
例如，His-Tag)的蛋白質容易由固定相上之鎳離子結合，從而允許保留含有His-Tag之蛋白質，而其他蛋白質穿過固定相。接著可洗滌管柱以移除任何殘餘雜質，隨後藉由應用破壞結合之所需分子與固定相之結合的溶液來溶析該等分子。多種固定相適合藉由親和層析來純化核酸，包括oligo-dT、聚(rI)及聚(rC)，以及包含一或多個與所需核酸上之核酸序列互補的核酸序列之核酸探針。參見例如Morales等人
Bio-protocol. 2013. 3(13): e808。
在一些實施例中，層析管柱為疏水性相互作用管柱。疏水性相互作用層析允許基於分子之疏水性來分離分子。通常，將包含所需分子及一或多種雜質之高鹽溶液施加至固定相，其中高鹽含量會降低溶解度且促進與固定相的結合。接著，將一或多種具有逐漸降低之鹽濃度的移動相施加至管柱，使得溶析之部分含有逐漸增加之疏水性分子。
在一些實施例中，層析管柱為混合模式層析管柱。在混合模式層析中，使用所需分子之多種特性，諸如基於疏水性之離子化狀態及溶解度，使所需分子與一或多種雜質分離。將含有所需分子之溶液施加至管柱之固定相，以使所需分子與固定相結合，且使一或多種移動相穿過固定相以移除雜質。每種移動相可具有不同離子強度、pH及/或鹽濃度，以促進一或多種雜質之釋放，但允許所需分子保持與固定相結合。在移除雜質之後，將具有所需離子強度、pH及鹽濃度之溶析溶液施加至固定相以促進自固定相中釋放所需分子。
在一些實施例中，層析管柱為尺寸排阻層析管柱。尺寸排阻層析基於分子通過凝膠或其他多孔固定相過濾之速率來分離分子，該過濾速率取決於其尺寸。較小分子(諸如較短蛋白質或核酸)擴散通過凝膠孔且因此需要較長時間來穿過管柱，而較大分子更快地穿過管柱，因為該等分子未被凝膠孔截留。
在一些實施例中，層析管柱包括中空纖維膜。中空纖維膜(HFM)係指中空圓柱體，其中該圓柱體之壁包括纖維膜。中空纖維膜之壁可包含固定相，諸如oligo-dT樹脂或珠粒，其允許結合所需分子，諸如mRNA。接著可使含有所需分子之溶液穿過中空纖維膜之中空中心，從而允許保留所需分子，隨後進行一或多個洗滌及/或溶析步驟以使所需分子與任何雜質分離。以此方式，膜之壁充當層析管柱之固定相，充當堆疊至層析管柱之內部空間中的微粒固定相之替代物。然而，中空纖維膜之中心內的空洞空間允許溶液在比使用經堆疊層析管柱時通常可行的壓力更大之壓力下穿過。中空纖維膜可用作堆疊至層析管柱內部中之固定相的替代物，或中空纖維膜之內部可經微粒固定相(諸如樹脂或珠粒)堆疊，從而允許經堆疊固定相及膜壁保留所需分子。中空纖維膜可包含本文所述之一或多種固定相，諸如離子交換層析管柱、親和層析管柱、混合模式層析管柱或逆相層析管柱之固定相。在一些實施例中，每個中空纖維膜均包含oligo-dT。
在一些實施例中，一或多個層析管柱經一或多個包含固定相之片狀膜替代。與含有使溶液穿過之中空中心的圓柱形中空纖維膜形成對比，將溶液施加至薄片之一側，且在穿過一或多個薄片之後離開另一側。在一些實施例中，片狀膜包含單個平直薄片。在一些實施例中，片狀膜包含纏繞成螺旋狀之薄片。在一些實施例中，片狀膜包含替代單個層析管柱之多個薄片，其中將溶液施加至該堆疊中之第一薄片，且溶液在穿過每個薄片之後離開該堆疊。片狀膜可包含本文所述之一或多種固定相，諸如離子交換層析管柱、親和層析管柱、混合模式層析管柱或逆相層析管柱之固定相。在一些實施例中，每個片狀膜均包含oligo-dT。
在一些實施例中，管柱及/或膜之固定相包含oligo-dT逆相介質(
例如樹脂或珠粒)。在一些實施例中，固定相之粒子、樹脂及/或珠粒包含oligo-dT。在一些實施例中，管柱之中空纖維膜包含oligo-dT。Oligo-dT係指包含多個重複胸苷鹼基之DNA寡核苷酸。重複胸苷鹼基之此序列與mRNA之聚A尾結合。藉由鍵結(
例如共價鍵結)至固定相之粒子上使oligo-dT固定，這促進mRNA與固定相之結合。在一些實施例中，mRNA組合物之一或多種mRNA與固定相結合且比其他組分更慢地遷移通過管柱。在一些實施例中，管柱保留mRNA組合物之一或多種mRNA，同時移除雜質。在一些實施例中，藉由將另一移動相(
例如，洗滌溶液)添加至管柱中來移除雜質，其中攜帶雜質之洗滌溶液穿過管柱，而mRNA保持與固定相結合。在一些實施例中，在自管柱中移除雜質之後，將另一移動相(
例如，溶析緩衝液)添加至管柱中以自管柱中溶析一或多種mRNA。在一些實施例中，在自管柱中溶析一或多種mRNA之後，使清潔溶液穿過管柱以再生管柱結合mRNA之能力。在一些實施例中，在使管柱再生之後，使平衡溶液穿過管柱以移除殘餘清潔溶液且使管柱準備結合mRNA。
移動相之pH可變化。在一些實施例中，移動相之pH在約pH 5.0與pH 9.5之間(
例如，約5.0、約5.5、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、約9.0或約9.5)。在一些實施例中，移動相之pH在約pH 6.8與pH 8.5之間(
例如，約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、約8.0、約8.3或約8.5)。在一些實施例中，移動相之pH為約7.0。
管柱之固定相的粒徑(
例如，如藉由粒子直徑所量測)可變化。在一些實施例中，固定相之粒徑介於約1 μm至約100 μm (
例如， 1與100之間的任何值(包括端點))之直徑範圍內。在一些實施例中，管柱固定相之粒徑介於約2 μm至約10 μm、約2 μm至約6 μm或約4 μm之直徑範圍內。粒子之孔徑(
例如，如藉由孔之直徑所量測)亦可變化。在一些實施例中，粒子包含具有約500 Å至約5000 Å、約800 Å至約3000 Å或約1000 Å至約2000 Å之直徑的孔。在一些實施例中，粒子包含具有約100 Å至約10,000 Å之直徑的孔。在一些實施例中，粒子包含具有約100 Å至約5000 Å、約100 Å至約1000 Å或約1000 Å至約2000 Å之直徑的孔。在一些實施例中，固定相包含聚苯乙烯二乙烯基苯。在一些實施例中，固定相包含oligo-dT逆相介質(
例如樹脂或珠粒)。
管柱(
例如在純化期間，管柱內之固定相)之溫度可變化。在一些實施例中，管柱具有約4℃至約99℃之溫度(
例如，4℃與99℃之間的任何溫度)。在一些實施例中，管柱具有約4℃至約40℃之溫度(
例如，4℃與40℃之間的任何溫度，例如約4℃、約10℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃或約40℃)。在一些實施例中，管柱具有約20℃至約40℃之溫度(
例如，20℃與40℃之間的任何溫度)。在一些實施例中，管柱具有約30℃之溫度。在一些實施例中，RNA與oligo-dT樹脂之結合發生在低於40℃之溫度下。在一些實施例中，RNA與oligo-dT樹脂之結合發生在4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃或15℃至25℃之溫度下。
在純化方法之一些實施例中，移動相包含Tris及/或螯合劑，諸如EDTA (
例如Tris-EDTA，亦稱作TAE)。如本文所用，「移動相」係包含水及/或一或多種用於攜帶一或多種分析物(諸如核酸或核酸混合物)通過管柱之有機溶劑的水溶液。在一些實施例中，移動相包含極性有機溶劑。適合包括於移動相中之極性有機溶劑的實例包括但不限於醇、酮、硝酸鹽、酯、醯胺及烷基亞碸。在一些實施例中，移動相包含一或多種選自由乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、二甲基甲醯胺、乙酸甲酯、丙酮及二甲亞碸(DMSO)、己二醇、極性非質子溶劑(包括
例如四氫呋喃(THF)、二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、乙腈、丙酮等)、C
1-4烷醇、C
1-6烷二醇及C
2-4烷酸組成之群之有機溶劑。移動相中之有機溶劑的濃度可變化。例如，在一些實施例中，移動相中之有機溶劑的體積百分率(v/v)自移動相之0% (不存在)至約100%變化。在一些實施例中，移動相中之有機溶劑的體積百分率在約5%與約75% v/v之間。在一些實施例中，移動相中之有機溶劑的體積百分率在約25%與約60% v/v之間。在一些實施例中，移動相中之有機溶劑的濃度為約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%或約90% v/v。在一些實施例中，移動相包含乙腈。在一些實施例中，移動相包含額外組分，例如，如美國專利公開案US 2005/0011836中所述，該案之完整內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液(
例如，1、2、3、4、5種或更多種)包含至少兩種離子配對劑(
例如，2、3、4、5種或更多種)。如本文所用，「離子配對劑」或「離子對」係指一種劑(
例如，小分子)，其充當HPLC分析物(
例如核酸)上之帶電(
例如，離子化或可離子化)官能基的相對離子且由此在該分析物移動通過HPLC管柱之固定相時改變該分析物之滯留時間。通常，離子配對劑係分類為陽離子離子配對劑(其與帶負電荷之官能基相互作用)或陰離子離子配對劑(其與帶正電荷之官能基相互作用)。術語「離子配對劑」及「離子對」進一步涵蓋所締合之相對離子(
例如，用於陽離子離子配對劑之乙酸根、磷酸根、碳酸氫根、溴離子、氯離子、檸檬酸根、硝酸根、亞硝酸根、氧化物、硫酸根及其類似離子，及用於陰離子離子配對劑之鈉、鈣及其類似離子)。在一些實施例中，由本揭示案描述之方法中使用的一或多種離子配對劑為陽離子離子配對劑。陽離子離子配對劑之實例包括但不限於某些質子化胺或四級胺(包括
例如一級胺、二級胺及三級胺)及其鹽，諸如三乙基銨鹽(
例如三乙基乙酸銨(TEAA))、三丁基銨鹽(
例如四丁基磷酸銨(TBAP)或四丁基氯化銨(TBAC))、己基銨鹽(
例如己基乙酸銨(HAA))、二丁基銨鹽(
例如二丁基乙酸銨(DBAA))、四丙基銨鹽(
例如四丙基溴化銨(TPAB))、十二烷基三甲基銨鹽(
例如十二烷基三甲基氯化銨(DTMAC))或四(癸基)銨鹽(
例如四(癸基)溴化銨(TDAB))、二己基銨鹽(
例如二己基乙酸銨(DHAA))、二丙基銨鹽(
例如二丙基乙酸銨(DPAA))、肉豆蔻基三甲基銨鹽(
例如肉豆蔻基三甲基溴化銨(MTEAB))、四乙基銨鹽(
例如四乙基溴化銨(TEAB))、四庚基銨鹽(
例如四庚基溴化銨(THepAB))、四己基銨鹽(
例如四己基溴化銨(THexAB))、四(癸基)銨鹽(
例如四(癸基)溴化銨(TrDAB))、四甲基銨鹽(
例如四甲基溴化銨(TMAB))、四辛基銨鹽(
例如四辛基溴化銨(TOAB))或四戊基銨鹽(
例如四戊基溴化銨(TPeAB))。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含兩種或更多種離子配對劑之組合，該等離子配對劑選自由三乙基銨鹽、三丁基銨鹽、己基銨鹽、二丁基銨鹽、四丙基銨鹽、十二烷基三甲基銨鹽、四(癸基)銨鹽、二己基銨鹽、二丙基銨鹽、肉豆蔻基三甲基銨鹽、四乙基銨鹽、四庚基銨鹽、四己基銨鹽、四(癸基)銨鹽、四甲基銨鹽、四辛基銨鹽及四戊基銨鹽組成之群。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含兩種或更多種離子配對劑之組合，該等離子配對劑選自由HAA、TBAP、TPAB、TBAC、DBAA、TEAA、DTMAC、TDAB、DHAA、DPAA MTEAB、TEAB、THepAB、THexAB、TrDAB、TMAB、TOAB及TPeAB組成之群。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含(i) TPAB及TBAC、(ii) DBAA及TEAA或(iii) TBAP及TEAA之組合。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含TPAB及TBAC之組合。
在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液(
例如，1、2、3、4、5種或更多種)包含單一離子配對劑。在一些實施例中，由本揭示案描述之方法中使用的一或多種離子配對劑為陽離子離子配對劑。在一些實施例中，離子配對劑為陽離子離子配對劑。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含選自由三乙基銨鹽、三丁基銨鹽、己基銨鹽、二丁基銨鹽、四丙基銨鹽、十二烷基三甲基銨鹽、四(癸基)銨鹽、二己基銨鹽、二丙基銨鹽、肉豆蔻基三甲基銨鹽、四乙基銨鹽、四庚基銨鹽、四己基銨鹽、四(癸基)銨鹽、四甲基銨鹽、四辛基銨鹽及四戊基銨鹽組成之群之鹽。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含HAA、TBAP、TPAB、TBAC、DBAA、TEAA、DTMAC、TDAB、DHAA、DPAA MTEAB、TEAB、THepAB、THexAB、TrDAB、TMAB、TOAB、TPeABHAA、TBAP、TPAB、TBAC、DBAA、TEAA、DTMAC或TDAB。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑中的每一者均包含一種離子配對劑。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑中的每一者均包含相同離子配對劑。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑中的每一者均包含選自由三乙基銨鹽、三丁基銨鹽、己基銨鹽、二丁基銨鹽、四丙基銨鹽、十二烷基三甲基銨鹽、四(癸基)銨鹽、二己基銨鹽、二丙基銨鹽、肉豆蔻基三甲基銨鹽、四乙基銨鹽、四庚基銨鹽、四己基銨鹽、四(癸基)銨鹽、四甲基銨鹽、四辛基銨鹽及四戊基銨鹽組成之群之鹽。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑中的每一者均包含HAA、TBAP、TPAB、TBAC、DBAA、TEAA、DTMAC、TDAB、DHAA、DPAA MTEAB、TEAB、THepAB、THexAB、TrDAB、TMAB、TOAB、TPeABHAA、TBAP、TPAB、TBAC、DBAA、TEAA、DTMAC或TDAB。如本文所用，陽離子之鹽係指包含陽離子及陰離子相對離子之組合物。例如，「四丁基銨鹽」可指四丁基磷酸銨、四丁基氯化銨、四丁基溴化銨、四丁基磷酸銨或包含陽離子四丁基銨及陰離子相對離子之另一組合物。在一些實施例中，離子配對劑包含陽離子及陰離子相對離子，其中陽離子選自由三乙基銨、三丁基銨、己基銨、二丁基銨、四丙基銨、十二烷基三甲基銨、四(癸基)銨、二己基銨、二丙基銨、肉豆蔻基三甲基銨、四乙基銨、四庚基銨、四己基銨、四(癸基)銨、四甲基銨、四辛基銨及四戊基銨組成之群，且陰離子相對離子選自由溴離子、氯離子、磷酸根及乙酸根組成之群。
質子化及四級胺離子配對劑可由下式表示：
其中各R獨立地為氫、視情況經取代之脂族基、視情況經取代之雜脂族基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；其限制條件在於R之至少一個實例不為氫； 且A為陰離子相對離子。
術語「脂族」係指烷基、烯基、炔基及碳環基。同樣，術語「雜脂族」係指雜烷基、雜烯基、雜炔基及雜環基。術語「芳基」係指單環或多環(
例如雙環或三環) 4n+2芳環系統(
例如，具有環狀陣列中共享之6、10或14個π電子)之基團，其具有由芳環系統提供之6–14個環碳原子及零個雜原子(「C6-14芳基」)。術語「雜芳基」係指5-14員單環或多環(
例如雙環、三環) 4n+2芳環系統(
例如，具有環狀陣列中共享之6、10或14個π電子)之基團，其具有由芳環系統提供之環碳原子及1–4個環雜原子，其中每個雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-14員雜芳基」)。合適之陰離子相對離子包括但不限於乙酸根、三氟乙酸根、磷酸根、氯離子、溴離子 六氟磷酸根、硫酸根、甲基磺酸根、三氟甲基磺酸根、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)、1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇(HFMIP)及其類似離子。
術語「視情況經取代」係指經取代或未經取代。一般而言，術語「經取代」意謂基團上存在之至少一個氫經可允許取代基，
例如取代後產生穩定化合物之取代基取代，該化合物
例如不會自發地進行諸如藉由重排、環化、消除或其他反應實現之轉變的化合物。
在一些實施例中，包含至少兩種離子配對劑之移動相的溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液或第二溶劑溶液)之莫耳比在約1:1,000至約1,000:1之間，使得核酸及可能存在之脂質以不同速率穿過管柱。在一些實施例中，該至少兩種離子配對劑之莫耳比在約1:1,000至約1,000:1、1:900至約900:1、1:800至約800:1、1:700至約700:1、1:600至約600:1、1:500至約500:1、1:400至約400:1、約1:300至約300:1、約1:200至約200:1、約1:100至約100:1、約50:1至約1:50、約40:1至約1:40、約30:1至約1:30、約20:1至約1:20或約10:1至約1:10之間。在一些實施例中，每種溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比在約1:100至約100:1之間。在一些實施例中，該至少兩種離子配對劑之莫耳比在約1:100至約100:1、1:90至約90:1、1:80至約80:1、1:70至約70:1、1:60至約60:1、1:50至約50:1、1:40至約40:1、約1:30至約30:1、約1:20至約20:1、約1:10至約10:1、約5:1至約1:5、約4:1至約1:4、約3:1至約1:3或約2:1至約1:2之間。在一些實施例中，該至少兩種離子配對劑之莫耳比為1:1。
在一些實施例中，包含至少兩種離子配對劑之移動相的溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液或第二溶劑溶液)之莫耳比在約1:6至約6:1之間，使得核酸及可能存在之脂質以不同速率穿過管柱。在一些實施例中，每種溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比在約1:4至約4:1之間。在一些實施例中，該至少兩種離子配對劑之莫耳比在約1:3至約3:1、約1:2至約2:1或約1:1.5至約1.5:1之間。在一些實施例中，該至少兩種離子配對劑之莫耳比為1:1。
溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液或第二溶劑溶液)中之每種離子配對劑的濃度可介於包括約1 mM至包括約25 M範圍內(
例如，約1 mM、約2 mM、約5 mM、約10 mM、約50 mM、約100 mM、約200 mM、約500 mM、約1 M、約1.2 M、約1.5 M、約1.75 M、約2M、約2.25 M、約2.5 M、約2.75 M、約3 M、約3.25 M、約3.5 M、約3.75 M、約4 M、約4.25 M、約4.5 M、約4.75 M、約5 M、約5.5 M、約6 M、約6.5 M、約7 M、約7.5 M、約8 M、約8.5 M、約9 M、約9.5 M、約10 M、約11 M、約12 M、約13 M、約14 M、約15 M、約16 M、約17 M、約18 M、約19 M或約20 M)。在一些實施例中，移動相(
例如，第一溶劑溶液或第二溶劑溶液)中之離子配對劑的濃度介於約10 mM – 20 M、20 mM – 15 M、30 mM – 12 M、40 mM – 10 M、50 mM – 8 M、75 mM – 5 M、100 mM – 2.5 M、125 mM – 2 M、150 mM – 1.5 M、175 mM – 1 M或200 mM – 500 mM範圍內。在一些實施例中，每種離子配對劑之濃度獨立地介於約10 mM – 20 M、20 mM – 15 M、30 mM – 12 M、40 mM – 10 M、50 mM – 8 M、75 mM – 5 M、100 mM – 2.5 M、125 mM – 2 M、150 mM – 1.5 M、175 mM – 1 M或200 mM – 500 mM範圍內。在一些實施例中，第一或第二溶劑溶液包含單一離子配對劑，其以約10 mM – 20 M、20 mM – 15 M、30 mM – 12 M、40 mM – 10 M、50 mM – 8 M、75 mM – 5 M、100 mM – 2.5 M、125 mM – 2 M、150 mM – 1.5 M、175 mM – 1 M或200 mM – 500 mM之量存在。
溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液或第二溶劑溶液)中之每種離子配對劑的濃度可介於包括約1 mM至包括約2 M範圍內(
例如，約1 mM、約2 mM、約5 mM、約10 mM、約50 mM、約100 mM、約200 mM、約500 mM、約1 M、約1.2 M、約1.5 M或約2 M)。在一些實施例中，移動相(
例如，第一溶劑溶液或第二溶劑溶液)中之離子配對劑的濃度介於約10 mM – 1 M、40 mM – 300 mM、50 mM-500 mM、75 mM-400 mM、100 mM-300 mM、200-300 mM、200-250 mM或250-300 mM範圍內。在一些實施例中，每種離子配對劑之濃度獨立地介於約10 mM – 1 M、40 mM – 300 mM、50 mM-500 mM、75 mM-400 mM、100 mM-300 mM、200-300 mM、200-250 mM或250-300 mM範圍內。在一些實施例中，兩種離子配對劑以約20 mM: 40 mM、50 mM: 50 mM、50 mM: 60 mM、50 mM: 75 mM、50 mM: 100 mM、50 mM:150 mM、100 mM: 100 mM、100 mM: 125 mM、100 mM: 150 mM、100 mM: 175 mM、100 mM: 200 mM、100 mM: 200 mM、100 mM: 250 mM、100 mM: 300 mM、125 mM: 125 mM、125 mM: 150 mM、125 mM: 175 mM、125 mM: 200 mM、125 mM: 250 mM、125 mM: 300 mM、150 mM: 175 mM、150 mM: 200 mM、150 mM: 250 mM、150 mM: 300 mM、200 mM: 200 mM、200 mM: 250 mM、200 mM: 300 mM、250 mM: 250 mM、250 mM: 300 mM或300 mM: 300 mM之濃度存在。
離子配對劑濃度之實例包括但不限於40 mM TEAA: 20 mM DBAA、100 mM TEAA: 50 mM DBAA、50 mM TBAP: 50 mM TEAA、250 mM TBAP: 250 mM TEAA、300 mM TBAP: 300 mM TEAA、50 mM TBAP: 150 mM TEAA、125 mM TBAP: 250 mM TEAA、250 mM TBAP: 250 mM TEAA、300 mM TBAP: 300 mM TEAA、50 mM DBAA: 50 mM TEAA、60 mM DBAA: 50 mM TEAA、75 mM DBAA: 50 mM TEAA、175 mM DBAA: 125 mM TEAA、100 mM DBAA: 100 mM TEAA、50 mM TBAP: 100 mM TEAA、100 mM TBAP: 200 mM TEAA、125 mM TBAP: 250 mM TEAA、150 mM TABP: 200 mM TEAA、150 mM TBAP: 200 mM TEAA、150 mM TBAP: 250 mM TEAA、50 mM TBAP: 150 mM TEAA、100 mM TBAP: 150 mM TEAA、250 mM TBAP: 200 mM TEAA、250 mM TBAP: 250 mM TEAA或200 mM TBAP: 300 mM TEAA。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含TPAB及TBAC之組合。在一些實施例中，TPAB及TBAC之濃度獨立地介於50 mM-300 mM範圍內。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含200 mM TPAB: 200 mM TBAC、250 mM TPAB: 250 mM TBAC或300 mM TPAB: 300 mM TBAC。在一些實施例中，移動相之一或多種溶劑溶液包含250 mM TPAB: 250 mM TBAC。
離子配對劑通常分散於移動相中。如本文所用，「移動相」係包含水及/或一或多種用於攜帶一或多種HPLC分析物(諸如囊封於脂質奈米粒子中之核酸、脂質奈米粒子中之核酸混合物或包含脂質奈米粒子中之核酸或核酸混合物的醫藥組合物)通過HPLC管柱之有機溶劑的水溶液。在一些實施例中，用於如由本揭示案描述之HPLC方法中的移動相包含多種(
例如，2、3、4、5種或更多種)溶劑溶液。在由本揭示案描述之HPLC方法的一些實施例中，移動相包含兩種溶劑溶液，即第一溶劑溶液及第二溶劑溶液(
例如，移動相A及移動相B)。在一些實施例中，溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:1,000至1,000:1。在一些實施例中，每種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:1,000至1,000:1。在一些實施例中，溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:100至100:1。在一些實施例中，每種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:100至100:1。在一些實施例中，溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:75至75:1。在一些實施例中，每種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:75至75:1。在一些實施例中，溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:50至50:1。在一些實施例中，每種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:50至50:1。在一些實施例中，溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:25至25:1。在一些實施例中，每種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:25至25:1。在一些實施例中，溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:10至10:1。在一些實施例中，每種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:10至10:1。在一些實施例中，溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:6至6:1。在一些實施例中，每種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:6至6:1。在一些實施例中，溶劑溶液包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:4至4:1。在一些實施例中，每種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)包含至少兩種離子配對劑，其莫耳比為1:4至4:1。
在一些實施例中，移動相之至少一種溶劑溶液包含有機溶劑。通常，IP-RP HPLC移動相包含極性有機溶劑。適合包括於移動相中之極性有機溶劑的實例包括但不限於醇、酮、硝酸鹽、酯、醯胺及烷基亞碸。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)包含一或多種選自由極性非質子溶劑、C
1-4烷醇、C
1-6烷二醇及C
2-4烷酸組成之群之有機溶劑。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)包含一或多種選自由丙酮、乙腈、二甲基甲醯胺、二甲亞碸(DMSO)、乙醇、己二醇、異丙醇、甲醇、乙酸甲酯、丙醇及四氫呋喃組成之群之有機溶劑。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)包含乙腈。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)包含額外組分，例如，如美國專利公開案US 2005/0011836中所述，該案之完整內容以引用之方式併入本文中。
移動相(
例如，移動相之每種溶劑溶液)中之有機溶劑的濃度可變化。例如，在一些實施例中，移動相中之有機溶劑的體積百分率(v/v)自移動相之0% (不存在)至約100%變化。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)中之有機溶劑的體積百分率在約5%與約75% v/v之間。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)中之有機溶劑的體積百分率在約25%與60% v/v之間。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)中之有機溶劑的體積百分率為至少約50% v/v。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)中之有機溶劑的體積百分率為約50%至約95%、約55%至約90%、約60%至約85%、約65%至約80%或約70% v/v至約75% v/v。在一些實施例中，移動相(
例如，移動相之至少一種溶劑溶液)中之有機溶劑的濃度為約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90% v/v或約95% v/v。
在一些實施例中，該第一溶劑溶液不包含有機溶劑。在一些實施例中，第二溶劑溶液中之有機溶劑的體積百分率為至少約50% v/v。在一些實施例中，第二溶劑溶液中之有機溶劑的體積百分率為約50%至約95%、約55%至約90%、約60%至約85%、約65%至約80%或約70% v/v至約75% v/v。在一些實施例中，第二溶劑溶液中之有機溶劑的體積百分率為約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90% v/v或約95% v/v。
移動相之pH (
例如，移動相之每種溶劑溶液的pH)可變化。在一些實施例中，移動相之pH在約pH 5.0與pH 9.5之間(
例如，約5.0、約5.5、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、約9.0或約9.5)。在一些實施例中，移動相之pH在約pH 6.8與pH 9.0之間(
例如，約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、約8.0、約8.3、約8.5或約9.0)。在一些實施例中，移動相之pH為約8.0。
在一些實施例中，第一溶劑溶液之pH在約pH 5.0與pH 9.5之間(
例如，約5.0、約5.5、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、約9.0或約9.5)。在一些實施例中，第一溶劑溶液之pH在約pH 6.8與pH 9.0之間(
例如，約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、約8.0、約8.3、約8.5或約9.0)。在一些實施例中，第一溶劑溶液之pH為約8.0。
在一些實施例中，第二溶劑溶液之pH在約pH 5.0與pH 9.5之間(
例如，約5.0、約5.5、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、約9.0或約9.5)。在一些實施例中，第二溶劑溶液之pH在約pH 6.8與pH 9.0之間(
例如，約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、約8.0、約8.3或約8.5)。在一些實施例中，第二溶劑溶液之pH為約8.0。
移動相中之兩種或更多種溶劑溶液的濃度可變化。例如，在包含兩種溶劑溶液(
例如，第一溶劑溶液及第二溶劑溶液)之移動相中，第一溶劑溶液之體積百分率可介於約0% (不存在)至約100%範圍內。在一些實施例中，第一溶劑溶液之體積百分率可介於約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%或約90% v/v範圍內。
相反地，在一些實施例中，移動相之第二溶劑溶液的體積百分率可介於約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%或約90% v/v範圍內。
在一些實施例中，在核酸溶析期間，第一溶劑溶液與第二溶劑溶液之比率保持恆定(
例如，等度)。然而，熟習此項技術者應理解，在其他實施例中，第一溶劑溶液與第二溶劑溶液之相對比率可在整個溶析步驟中變化。例如，在一些實施例中，在溶析步驟期間，第一溶劑溶液相對於第二溶劑溶液之比率有所增加。在一些實施例中，在溶析步驟期間，第一溶劑溶液相對於第二溶劑溶液之比率有所減少。
移動相(
例如，溶劑溶液)中之一或多種離子配對劑的濃度可變化。在溶析步驟期間，移動相(或溶劑溶液)中之至少兩種離子配對劑的相對比率可變化或保持恆定(
例如，等度)。在一些實施例中，在溶析步驟期間，第一離子配對劑相對於第二離子配對劑之比率有所增加。在一些實施例中，在溶析步驟期間，第一離子配對劑相對於第二離子配對劑之比率有所增加。例如，在一些實施例中，TPAB與TBAC之比率介於約4:1至約1:4、約3:1至約1:3、約2:1至約1:2或約1:1至1:3範圍內。
移動相(
例如，溶劑溶液)關於一或多種有機溶劑之濃度可為梯度或等度的。
多管柱層析
本揭示案之態樣使用多管柱層析來純化核酸之方法。多管柱層析係指管柱層析方法，其中多個管柱能夠串聯連接，使得流出一個管柱之液體必要時可經引導至集合中的一或多個接下來管柱中，或若非必要，則可經引導至單獨容器中。一些態樣係關於使用至少三個能夠串聯使用之層析管柱來純化核酸的方法，該方法包括：
(i)(a) 藉由使第一層析管柱之第一固定相與包含一或多種核酸之進料溶液接觸來裝載第一層析管柱，視情況其中該一或多種核酸為mRNA；
(ii)(a) 藉由與第一層析管柱串聯，使第二層析管柱之第二固定相與進料溶液中已接觸第一層析管柱之第一固定相的部分接觸來裝載第二層析管柱；及
(iv)(a) 自第一層析管柱溶析該一或多種核酸。在一些實施例中，層析管柱集合中之最後一個層析管柱能夠與第一層析管柱串聯使用。「裝載」管柱係指將含有所需分子，諸如核酸(
例如，mRNA)之溶液添加至管柱之固定相中，由此該溶液穿過管柱之固定相，從而使該分子與固定相結合。在一些實施例中，藉由自儲存容器(諸如其中使用IVT來產生mRNA之容器)直接添加進料溶液來裝載管柱。在一些實施例中，藉由將串聯的第一管柱之輸出液添加至串聯的第二管柱之固定相上來裝載串聯的第二管柱。除非上下文另有明確說明，否則管柱之「輸入物」係指添加至管柱之固定相中的材料，諸如核酸及/或移動相。除非上下文另有明確說明，否則管柱之「輸出液」係指在穿過固定相之後流出管柱的液體，諸如包含雜質、廢物及/或核酸之溶液。除非上下文另有明確說明，否則管柱之「流通液」或「穿透液」係指在穿過固定相之後流出管柱的液體，該液體包含管柱之固定相未結合的核酸。若第一管柱之輸出液能夠經引導至第二管柱，由此成為第二管柱之輸入物，則據說兩個管柱「能夠串聯使用」。在具有超過兩個管柱之管柱集合中，若該集合中之每個管柱均能夠與該集合中的至少1個其他管柱串聯使用，則該管柱集合「能夠串聯使用」。例如，若管柱集合含有3個管柱，則在一些實施例中，第一管柱能夠與第二管柱串聯使用，第二管柱能夠與第一管柱及第三管柱串聯使用，且第三管柱能夠與第二管柱串聯使用；在一些實施例中，第一管柱及第三管柱亦能夠串聯使用。
兩個管柱可能夠串聯使用，使得必要時，包含核酸之流通液可經引導至串聯的下一管柱中，但若輸出液反而經引導至別處，諸如進入廢物收集區或產物收集區中，則據說該兩個管柱未「串聯使用」。例如，若第一管柱之輸出液流入閥中，該閥可將輸出液引導至第二管柱或另一方向，諸如收集容器，則該兩個管柱能夠串聯使用，但若該閥實際上將輸出液引導至第二管柱，則據說該兩個管柱串聯使用(注意，兩個管柱被視為串聯使用，即使一個管柱正在產生輸出材料且另一者正在接收該材料作為輸入物)。若第一管柱之輸出液經引導至第二管柱中(
例如，使用管道、端口、閥或將第一管柱之輸出液引導至第二管柱的任何其他方式)，由此成為第二管柱之輸入物，則據說兩個管柱「串聯使用」。在一些實施例中，兩個或更多個管柱能夠串聯使用，但並非所有管柱同時串聯使用。在一些實施例中，當第一管柱裝載包含核酸之進料溶液時，串聯使用兩個或更多個管柱，由此允許將第一管柱之輸出液添加至串聯的第二管柱中，使得第一管柱之流通液中存在的任何核酸均可由第二管柱之固定相捕獲。在一些實施例中，未串聯使用能夠串聯使用之管柱，諸如當一個管柱正在進行洗滌、溶析、清潔或平衡時。在一些實施例中，用於洗滌、清潔或平衡管柱之溶液經引導至廢物收集區中。在一些實施例中，用於自管柱中溶析核酸之溶液經引導至產物收集區(
例如，容器(container/vessel)或小瓶)中。在一些實施例中，一組管柱包括第一管柱、最後一個管柱及N個中間管柱，其中第一管柱之輸出液能夠經引導至中間管柱中，其中N-1個中間管柱中之每一者的輸出液能夠經引導至另一中間管柱中，且一個中間管柱之輸出液能夠經引導至最後一個管柱中。在此類串聯連接之一組管柱中，第一管柱之輸入物能夠經引導至相繼的中間管柱中，接著經引導至最後一個管柱中，最終作為最後一個管柱之輸出液流過。在一些實施例中，最後一個管柱串聯連接至第一管柱，其中最後一個管柱之輸出液能夠經引導至第一管柱中。在此類一組管柱中，既定管柱之輸入物可穿過自既定管柱開始的任何相繼系列之管柱，且任何管柱均可被視為添加外部輸入物之「第一管柱」。在一些實施例中，中間管柱之數目N為任何整數(
例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。在一些實施例中，N為0，其中該方法僅使用串聯連接之第一管柱及最後一個管柱，無中間管柱。在一些實施例中，N為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施例中，N為至少6。
一些態樣係關於使用至少四個層析管柱來純化核酸之方法，其中每個管柱能夠與兩個或更多個其他管柱串聯及並聯使用，該方法包括：
(i) 藉由使第一層析管柱之第一固定相與包含一或多種核酸之進料溶液接觸來裝載第一層析管柱，視情況其中該一或多種核酸為mRNA；
(ii) 藉由與第一層析管柱串聯，使(a)第二層析管柱之第二固定相與進料溶液中已接觸第一層析管柱之第一固定相的第一部分接觸，及使(b)第三層析管柱之第三固定相與進料溶液中已接觸第一層析管柱之第一固定相的第二部分接觸，並聯地裝載第二層析管柱及第三層析管柱；
(iii) 藉由使第二固定相與進料溶液中尚未與第一固定相接觸之部分接觸來裝載第二層析管柱；
(iv) 藉由與第二層析管柱串聯，使(a)第三層析管柱之第三固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的第一部分接觸，及使(b)第四層析管柱之第四固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的第二部分接觸，並聯地裝載第三層析管柱及第四層析管柱；及
(iv)(a) 自第一層析管柱溶析該一或多種核酸。
在一些實施例中，(ii)之裝載進一步包括藉由與第一層析管柱串聯，使一或多個額外層析管柱之一或多個額外固定相與進料溶液中已接觸第一層析管柱之第一固定相的一或多個額外部分接觸，與第二層析管柱及第三層析管柱並聯地裝載一或多個額外層析管柱。
在一些實施例中，(ii)之第二層析管柱及第三層析管柱在約相同時間進行裝載。在一些實施例中，(ii)之一或多個額外層析管柱與第二層析管柱及第三層析管柱在約相同時間進行裝載。在一些實施例中，(iv)(a)之第三層析管柱及第四層析管柱在約相同時間進行裝載。在一些實施例中，第一管柱能夠與多個管柱串聯及並聯使用。例如，若第一管柱之輸出液能夠經分隔且經引導至第二管柱及第三管柱兩者，則第一管柱能夠與第二層析管柱及第三管柱串聯及並聯使用。在一些實施例中，第一管柱之輸出液經分隔成大致相等量，使得串聯連接之每個管柱接收大致相等量的來自第一管柱之輸出液。在一些實施例中，第一管柱之輸出液經分隔成不等量，使得串聯連接之一或多個管柱接收不同量的來自第一管柱之輸出液。在一些實施例中，該集合中之最後一個層析管柱能夠與並聯之第一層析管柱及第二層析管柱串聯使用。在一些實施例中，集合中之最後一個層析管柱能夠與2、3、4、5、6、7、8個或更多個並聯之層析管柱串聯使用。
在一些實施例中，一組管柱包括第一管柱、N個中間管柱(其中N為至少2)以及最後一個管柱，其中第一管柱之輸出液能夠並行地經引導至兩個或更多個中間管柱中，每個中間管柱之輸出液能夠並行地經引導至兩個或更多個其他管柱中，至少一個中間管柱之輸出液能夠並行地經引導至另一中間管柱中及最後一個管柱中，至少一個中間管柱之輸出液能夠並行地經引導至最後一個管柱中及第一管柱中，且最後一個管柱之輸出液能夠並行地經引導至第一管柱中及至少一個中間管柱中。在一些實施例中，中間管柱之數目N為任何大於1之整數(
例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。在一些實施例中，N為2，其中該方法使用四個管柱，且每個管柱串聯連接至2個並聯之其他管柱。在一些實施例中，N為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施例中，N為至少6。
在一些實施例中，每個管柱之輸出液能夠經引導至P個並聯之其他管柱中，其中P為至少2，但小於集合中之管柱數目。在一些實施例中，P為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在一些實施例中，P為至少5。
在一些實施例中，使管柱與進料溶液或來自前一串聯管柱之輸出液接觸的步驟進行約2分鐘至約10分鐘、約3分鐘至約7分鐘或約5分鐘至約6分鐘。在一些實施例中，(iv)(a)之溶析進行約1分鐘至約4分鐘、約1.25分鐘至約3分鐘或約1.5分鐘至約2分鐘。
在一些實施例中，自第一層析管柱溶析係在其中第一層析管柱及第二層析管柱未串聯之條件下進行的。若兩個管柱之輸出液均未經引導至另一管柱(
亦即，第一管柱之輸出液未作為輸入物添加至第二管柱中，且第二管柱之輸出液未添加至第一管柱中)，則兩個管柱「未串聯」。在用於純化核酸之層析方法中，可將含有核酸之溶析液引導至產物收集區，諸如用於儲存經純化核酸之容器中。
在一些實施例中，第二層析管柱為最後一個層析管柱。若第二層析管柱為最後一個層析管柱，則該方法僅使用兩個能夠串聯連接之層析管柱。在僅使用兩個層析管柱之實施例中，管柱之輸出液未經引導至超過一個管柱中。
在一些實施例中，該至少三個能夠串聯使用之層析管柱包含3、4、5、6、7、8個或更多個層析管柱。在一些實施例中，3個層析管柱能夠串聯連接。在一些實施例中，4個層析管柱能夠串聯連接。在一些實施例中，5個層析管柱能夠串聯連接。在一些實施例中，6個層析管柱能夠串聯連接。在一些實施例中，7個層析管柱能夠串聯連接。在一些實施例中，8個層析管柱能夠串聯連接。在一些實施例中，9個層析管柱能夠串聯連接。在一些實施例中，10個層析管柱能夠串聯連接。
一些實施例包括第一層析管柱、最後一個層析管柱及一或多個額外層析管柱。在一些實施例中，每個額外層析管柱能夠與兩個其他層析管柱連續串聯使用：一個作為材料之接收者且一個作為材料之給予者。在一些實施例中，每個層析管柱能夠與兩個並聯之其他層析管柱串聯使用。在一些實施例中，第一層析管柱能夠與最後一個(
例如，第八)及第二層析管柱連續串聯使用(
例如，接收來自最後一個層析管柱之輸入物，且輸出液經引導至第二層析管柱中)；第二層析管柱能夠與第一層析管柱及第三層析管柱連續串聯使用；第三層析管柱能夠與第二層析管柱及第四層析管柱連續串聯使用；第四層析管柱能夠與第三層析管柱及第五層析管柱連續串聯使用；第五層析管柱能夠與第四層析管柱及第六層析管柱連續串聯使用；第六層析管柱能夠與第五層析管柱及第七層析管柱連續串聯使用；第七層析管柱能夠與第六層析管柱及第八層析管柱連續串聯使用；且第八層析管柱能夠與第七層析管柱及第一層析管柱連續串聯使用。
一些實施例包括至少四個層析管柱，其中既定層析管柱能夠與多個並聯之其他管柱串聯使用，其中既定管柱之輸出液經分隔且施加至一或多個其他管柱中之每一者。在一些實施例中，管柱集合包括八個層析管柱，其中第一層析管柱能夠與並聯之第二層析管柱及第三管柱串聯使用；第二層析管柱能夠與並聯之第三管柱及第四管柱串聯使用；第三層析管柱能夠與並聯之第四管柱及第五管柱串聯使用；第四管柱能夠與並聯之第五管柱及第六管柱串聯使用；第五管柱能夠與並聯之第六管柱及第七管柱串聯使用；第六管柱能夠與並聯之第七管柱及第八管柱串聯使用；第七管柱能夠與並聯之第八管柱及第一管柱串聯使用；且第八管柱能夠與並聯之第一管柱及第二管柱串聯使用。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(iii)(a) 使第二固定相與進料溶液中尚未與第一固定相接觸之部分接觸；及
(iii)(b) 與第二層析管柱串聯，使第三層析管柱之第三固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的部分接觸。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(iii) 藉由使第二固定相與進料溶液中尚未與第一固定相接觸之部分接觸來裝載第二層析管柱；
(iv) 藉由與第二層析管柱串聯，使(a)第三層析管柱之第三固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的第一部分接觸；及
使(b)第四層析管柱之第四固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的第二部分接觸，並聯地裝載第三層析管柱及第四層析管柱。
在一些實施例中，(iv)之裝載進一步包括藉由與第二層析管柱串聯，使一或多個額外層析管柱之一或多個額外固定相與進料溶液中已接觸第二層析管柱之第二固定相的一或多個額外部分接觸，與第三層析管柱及第四層析管柱並聯地裝載一或多個額外層析管柱。
在一些實施例中，該方法進一步包括：使最後一個層析管柱之最後固定相與進料溶液中尚未與固定相接觸之額外部分接觸；及與最後一個層析管柱串聯，使第一層析管柱之第一固定相與進料溶液中已接觸最後一個層析管柱之最後固定相的額外部分接觸。在一些實施例中，該方法進一步包括：與最後一個層析管柱串聯，並行地使(a)第一層析管柱之第一固定相與額外進料溶液中已接觸最後一個層析管柱之最後固定相的第一部分接觸，及使(b)第二層析管柱之第二固定相與額外進料溶液中已接觸最後一個層析管柱之最後固定相的第二部分接觸。在一些實施例中，該方法進一步包括與最後一個層析管柱串聯，與第一層析管柱及第二層析管柱並行地使(c)一或多個額外層析管柱之一或多個額外固定相與額外進料溶液中已接觸最後一個層析管柱之最後固定相的一或多個額外部分接觸。在一些實施例中，最後固定相之流通液包含核酸且添加至第一層析管柱之第一固定相中。在一些實施例中，最後固定相之流通液包含核酸且與添加至第一層析管柱中並行地，亦添加至第二層析管柱之第二固定相中。在一些實施例中，最後固定相之流通液包含核酸且與添加至第一層析管柱及第二層析管柱中並行地，亦添加至一或多個額外層析管柱之額外固定相中。在一些實施例中，在添加來自最後一個層析管柱之流通液之前，第一、第二及一或多個額外層析管柱已進行洗滌、溶析、清潔及平衡。
在一些實施例中，該方法為自動化方法。在自動化方法之一些實施例中，電腦及/或幫浦控制含有包括進料溶液、洗滌溶液、溶析溶液、清潔溶液及平衡溶液在內的一或多種溶液之裝置，且控制每種溶液進入一或多個管柱中之方向，以確保輸入物及輸出液根據所需方法經引導。在一些實施例中，電腦控制每個層析管柱之輸出液的方向，從而確定每種輸出液是否經引導至另一層析管柱、廢物收集區或產物收集區中。
在一些實施例中，每個層析管柱能夠獨立地接收來自前一串聯管柱之輸出液、來自進料溶液、洗滌溶液、溶析溶液、清潔溶液及平衡溶液之輸入材料。
在一些實施例中，每個層析管柱能夠獨立地將材料引導至單獨串聯或並聯使用之一或多個不同層析管柱、廢物收集區及產物收集區。在一些實施例中，管柱之輸出液經引導通過閥，該閥能夠將輸出液引導至單獨串聯或並聯使用之一或多個不同層析管柱、廢物收集區或產物收集區。在一些實施例中，該閥由使用者手動調節以將輸出液引導至不同層析管柱、廢物收集區或產物收集區。在一些實施例中，電腦控制該閥是否將輸出液引導至不同層析管柱、廢物收集區或產物收集區。
在一些實施例中，同時進行以下步驟：用進料溶液裝載至少一個管柱；洗滌至少一個管柱；對至少一個管柱進行溶析；清潔至少一個管柱；及使至少一個管柱平衡。在一些實施例中，在約相同時間將進料溶液、洗滌溶液、溶析溶液、清潔溶液及平衡溶液中之每一者添加至不同管柱中。在一些實施例中，進料溶液、洗滌溶液、溶析溶液、清潔溶液及平衡溶液中之每一者在約相同時間存在於獨立管柱中。在一些實施例中，在約相同時間，用來自裝載進料溶液之管柱的輸出液裝載一或多個其他管柱。在一些實施例中，來自裝載進料溶液之管柱的輸出液在約相同時間存在於一或多個其他管柱中。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(ii)(b) 使第一固定相與洗滌溶液接觸，其中包含洗滌溶液之輸出液經引導至廢物收集區。洗滌溶液係指一種移動相，其與混合物之其他組分(諸如鹽、三磷酸核苷酸及
活體外轉錄反應中使用的酶)之相互作用比與mRNA之相互作用更強。洗滌溶液穿過包含與固定相結合之mRNA的管柱之固定相，因此攜帶雜質通過該管柱，該等雜質可經引導至廢物容器中，同時允許mRNA保持與固定相結合。「洗滌」管柱係指使洗滌溶液穿過管柱之製程。洗滌包含與固定相結合之mRNA的管柱允許自管柱中移除雜質，由此允許隨後溶析出具有降低之雜質濃度的mRNA。
在一些實施例中，洗滌溶液包含Tris。在一些實施例中，洗滌溶液中之Tris的濃度為約0.1 mM至500 mM。在一些實施例中，洗滌溶液中之Tris的濃度為約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM、約10 mM至約100 mM或約100 mM至約500 mM。在一些實施例中，洗滌溶液包含約10 mM Tris。
在一些實施例中，洗滌溶液包含EDTA。在一些實施例中，洗滌溶液中之EDTA的濃度為約0.01 mM至100 mM。在一些實施例中，洗滌溶液中之EDTA的濃度為約0.01 mM至約0.1 mM、約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM或約10 mM至約100 mM。在一些實施例中，洗滌溶液包含約1 mM EDTA。
在一些實施例中，洗滌溶液包含選自由乙酸鈉(NaCOOH)、乙酸銨(NH
4COOH)、乙酸鉀(KCOOH)、氯化鈉(NaCl)、氯化鋰(LiCl)及氯化鉀(KCl)組成之群之鹽。在一些實施例中，洗滌溶液中之鹽的濃度在約0.01 mM至約10 M之間。在一些實施例中，洗滌溶液中之鹽的濃度為約0.01 mM至約0.1 mM、約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM、約10 mM至約100 mM、約100 mM至約1 M或約1 M至約10 M。在一些實施例中，洗滌溶液包含NaCl。在一些實施例中，洗滌溶液中之NaCl的濃度在約0.01 mM至約10 M之間。在一些實施例中，洗滌溶液中之NaCl的濃度為約0.01 mM至約0.1 mM、約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM、約10 mM至約100 mM、約100 mM至約1 M或約1 M至約10 M。在一些實施例中，洗滌溶液包含約0.1 M NaCl。在一些實施例中，洗滌溶液包含約0.5 M NaCl。
在一些實施例中，洗滌溶液之pH為約6.5至約8.5。在一些實施例中，洗滌溶液之pH為約6.5至約7.0、約7.0至約7.5、約7.5至約8.0及約8.0至約8.5。在一些實施例中，洗滌溶液之pH為約7.2至約7.6。在一些實施例中，洗滌溶液具有約7.4之pH。
在一些實施例中，洗滌溶液包含約10 mM Tris、約1 mM EDTA、約0.1 M NaCl，且具有約7.4之pH。在一些實施例中，洗滌溶液包含約10 mM Tris、約1 mM EDTA、約0.5 M NaCl，且具有約pH 7.4。在一些實施例中，添加至管柱之固定相中的洗滌溶液之體積為管柱之固定相之體積的約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(iv)(c) 使第一固定相與清潔溶液接觸，其中包含清潔溶液之輸出液經引導至廢物收集區。「清潔溶液」、「再生溶液(rejuvenation solution/rejuvenating solution)」係指自管柱中移除殘餘核酸及其他雜質之溶液，使得該管柱可用於捕獲新的核酸物質，而不會受到先前捕獲之核酸污染。在一些實施例中，清潔溶液包含NaOH。在一些實施例中，清潔溶液中之NaOH的濃度為約0.01 mM至約0.1 mM、約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM、約10 mM至約100 mM、約100 mM至約1 M或約1 M至約10 M。在一些實施例中，清潔溶液包含約0.05 M NaOH至0.5 M NaOH。在一些清潔中，清潔溶液包含0.1 M NaOH。在一些實施例中，添加至管柱之固定相中的清潔溶液之體積為管柱之固定相之體積的約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，添加至管柱中之清潔溶液之體積約為管柱之固定相之體積的約3倍。在一些實施例中，將清潔溶液施加至管柱持續至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55或至少60分鐘。
在一些實施例中，該方法進一步包括：
(iii)(d) 使第一固定相與平衡溶液接觸，其中包含平衡溶液之輸出液經引導至廢物收集區。「平衡溶液(Equilibration solution/equilibrating solution)」係指能夠增強固定相結合核酸之能力的溶液。使管柱「平衡」係指使平衡溶液穿過管柱之過程。當包含核酸之溶液穿過固定相時，在溶液與固定相之間之界面處的pH、電導率及鹽濃度會影響捕獲核酸之效率。使管柱平衡會調節固定相之pH、電導率及/或鹽濃度，此類在平衡之後穿過管柱之核酸的結合比管柱尚未平衡時更有效。
在一些實施例中，平衡溶液包含Tris。在一些實施例中，平衡溶液中之Tris的濃度為約0.1 mM至500 mM。在一些實施例中，平衡溶液中之Tris的濃度為約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM、約10 mM至約100 mM或約100 mM至約500 mM。在一些實施例中，平衡溶液包含50 mM Tris。
在一些實施例中，平衡溶液包含EDTA。在一些實施例中，平衡溶液中之EDTA的濃度為約0.01 mM至100 mM。在一些實施例中，平衡溶液中之EDTA的濃度為約0.01 mM至約0.1 mM、約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM或約10 mM至約100 mM。在一些實施例中，平衡溶液包含5 mM EDTA。
在一些實施例中，平衡溶液之pH為約6.5至約8.5。在一些實施例中，平衡溶液之pH為約6.5至約7.0、約7.0至約7.5、約7.5至約8.0及約8.0至約8.5。在一些實施例中，平衡溶液之pH為約7.2至約7.6。在一些實施例中，平衡溶液具有約7.4之pH。
在一些實施例中，平衡溶液包含約50 mM Tris、約5 mM EDTA，且具有約7.4之pH。
在一些實施例中，添加至管柱之固定相中的平衡溶液之體積為管柱之固定相之體積的約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，添加至管柱中之平衡溶液之體積約為管柱之固定相之體積的約3倍。
在一些實施例中，一組管柱中之每個管柱能夠接收來自能夠串聯使用之前一管柱的輸入物，或替代地接收來自外部來源之一或多種輸入物。在一些實施例中，來自外部來源之輸入物為包含mRNA之進料溶液、洗滌溶液、溶析緩衝液、清潔溶液或平衡溶液。在一些實施例中，一組管柱中之管柱依序接收以下輸入物：
(i) 來自前一串聯管柱之輸出液，其中來自前一管柱之輸出液包含核酸，視情況其中該核酸為mRNA；
(ii) 包含核酸之進料溶液，視情況其中該核酸為mRNA；
(iii) 洗滌溶液；
(iv) 溶析緩衝液；
(v) 清潔溶液；
(vi) 平衡緩衝液；
其中在添加下一輸入物之前，停止向管柱中添加一種輸入物。在一些實施例中，步驟(i)重複兩次或更多次，其中每次重複步驟(i)時，該管柱接收來自不同的前一串聯管柱之輸出液。在一些實施例中，該方法包括在停止添加一種輸入物之後等待至少30秒、60秒、90秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒或300秒之時期，接著添加下一輸入物。在一些實施例中，直至至少70%、至少80%、至少90%或多達100%之先前輸入物已離開管柱，方才添加下一輸入物。在一些實施例中，在添加(vi)之來自前一串聯管柱之輸出液之後，將包含核酸之進料溶液添加至管柱中，開始新的循環。在一些實施例中，重複該循環，直至耗盡包含核酸之進料溶液。在一些實施例中，在耗盡包含核酸之進料溶液之後，將洗滌溶液添加至管柱中以移除雜質，隨後添加溶析緩衝液以溶析結合之核酸。在一些實施例中，在多個管柱上並行地進行輸入物之循環。在一些實施例中，在該組中之所有管柱上並行地進行該循環。在一些實施例中，在耗盡包含核酸之進料溶液之後，將洗滌溶液添加至每個包含結合之核酸的管柱中以移除雜質，隨後添加溶析緩衝液以溶析結合之核酸。
在一些實施例中，該方法包括重複步驟(i)(a)至(iv)(c)，其中第一層析管柱被視為步驟(iv)(a)至(iv)(c)之最後一個層析管柱，且一或多個額外層析管柱中的第一個被視為步驟(i)(a)至(iv)(c)之第一層析管柱。
在一些實施例中，包含核酸之進料溶液的pH在約6.8與8.5之間。在一些實施例中，包含核酸之進料溶液的pH為約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4或約8.5。在一些實施例中，進料溶液之pH為約7.0。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH在約6.8與8.5之間。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4或約8.5。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約6.8。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約6.9。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.0。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.1。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.2。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.3。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.4。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.5。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.6。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.7。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.8。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約7.9。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之pH為約8.0。
在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者均包含共計約0.5 L至約2 L、約2 L至約5 L、約5 L至約10 L或約10 L至約20 L之固定相。管柱中之固定相的體積係指由固定相與管柱之內壁及/或空氣的界面形成之三維形狀之體積。例如，在具有25π cm
2面積且經固定相堆疊形成100 cm圓柱體之圓柱形管柱中，管柱中之固定相的總體積將為2,500π cm
3，大致為7,854 cm
3或7.854 L。
管柱(
例如，管柱內之固定相)之溫度可變化。在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者具有約20℃至約100℃之溫度(
例如，20℃與99℃之間的任何溫度)。在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者具有約40℃至約100℃之溫度(
例如，40℃與99℃之間的任何溫度，例如約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃、約90℃、約95℃或約100℃)。在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者具有約70℃至約90℃之溫度(
例如，70℃與90℃之間的任何溫度)。在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者具有約80℃之溫度。
管柱(
例如，管柱內之固定相)之溫度可變化。在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者具有約4℃至約99℃之溫度(
例如，4℃與99℃之間的任何溫度)。在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者具有約4℃至約40℃之溫度(
例如，4℃與40℃之間的任何溫度，例如約4℃、約10℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃或約40℃)。在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者具有約20℃至約40℃之溫度(
例如，20℃與40℃之間的任何溫度)。在一些實施例中，該第一及一或多個額外層析管柱中之每一者具有約30℃之溫度。在一些實施例中，RNA與oligo-dT樹脂之結合發生在低於40℃之溫度下。在一些實施例中，RNA與oligo-dT樹脂之結合發生在4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃或15℃至25℃之溫度下。
在一些實施例中，進料溶液之電導率為約2–5 mS/cm、2–7 mS/cm、5–10 mS/cm、5–15 mS/cm、5–7 mS/cm、6–9 mS/cm、8–10 mS/cm、9–12 mS/cm、10–15 mS/cm、15–20 mS/cm、20–25 mS/cm、25–30 mS/cm、30–35 mS/cm、35–40 mS/cm、40–45 mS/cm、45–50 mS/cm、50–60 mS/cm、60–70 mS/cm、70–80 mS/cm、80–90 mS/cm或90–100 mS/cm。在一些實施例中，進料溶液之電導率為至少10 mS/cm。在一些實施例中，進料溶液之電導率為約40 mS/cm。在一些實施例中，與管柱之固定相接觸的溶液之電導率為約2–5 mS/cm、2–7 mS/cm、5–10 mS/cm、5–15 mS/cm、5–7 mS/cm、6–9 mS/cm、8–10 mS/cm、9–12 mS/cm、10–15 mS/cm、15–20 mS/cm、20–25 mS/cm、25–30 mS/cm、30–35 mS/cm、35–40 mS/cm、40–45 mS/cm、45–50 mS/cm、50–60 mS/cm、60–70 mS/cm、70–80 mS/cm、80–90 mS/cm或90–100 mS/cm。在一些實施例中，與固定相接觸之溶液的電導率為至少10 mS/cm。在一些實施例中，與固定相接觸之溶液的電導率為約40 mS/cm。mRNA與oligo-dT之相互作用及因此mRNA與管柱之固定相的結合需要使聚A尾之腺嘌呤核苷酸暴露，以便與oligo-dT之胸苷鹼基形成氫鍵。若mRNA之聚A尾形成其中較少腺嘌呤鹼基暴露之二級結構，則mRNA更有可能穿過固定相而不與oligo-dT結合，從而降低層析製程之效率。調節進料溶液或在溶液及固定相之界面處之電導率會促進mRNA之聚A尾中的二級結構之展開，以及腺嘌呤鹼基之暴露，由此促進mRNA與固定相之結合。
在一些實施例中，藉由添加高鹽緩衝液來增加或實現進料溶液之電導率。在一些實施例中，高鹽緩衝液(
例如，可與進料溶液混合)包含至少50 mM、至少60 mM、至少70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少100 mM、至少125 mM、至少150 mM、至少200 mM、至少250 mM、至少300 mM、至少350 mM、至少400 mM、至少500 mM、至少600 mM、至少700 mM、至少800 mM、至少900 mM或至少1000 mM之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽緩衝液包含50-500 mM、50-250 mM、50-100 mM、50-75 mM、60-150 mM、75-500 mM、75-200 mM、100-500 mM、100-250 mM、150-350 mM、200-400 mM、250-500 mM、300-400 mM、350-450 mM、400-500 mM、400-600 mM、500-700 mM、500-750 mM、700-1000 mM、750-900 mM或850-1000 mM之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽緩衝液包含1-2 M、2-3 M、3-4 M或4-5 M之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽緩衝液包含至少5 mS/cm、至少6 mS/cm、至少7 mS/cm、至少8 mS/cm、至少9 mS/cm、至少10 mS/cm、至少12 mS/cm或至少15 mS/cm之電導率。在一些實施例中，高鹽緩衝液包含5-10 mS/cm、5-15 mS/cm、5-7 mS/cm、6-9 mS/cm、8-10 mS/cm、9-12 mS/cm或10-15 mS/cm之電導率。在一些實施例中，在高鹽緩衝液添加之後，進料溶液之鹽濃度為至少100 mM、至少200 mM、至少300 mM、至少400 mM、至少500 mM、至少600 mM、至少700 mM、至少800 mM、至少900 mM、至少1 M或更高。在一些實施例中，在高鹽緩衝液添加之後，進料溶液具有約100 mM至約200 mM、約200 mM至約400 mM、約400 mM至約600 mM、約600 mM至約800 mM、約800 mM至約1 M、約1 M至約1.5 M、約1.5 M至約2 M、約2 M至約2.5 M、約2.5 M至約3 M、約3 M至約4 M或約4 M至約5 M之鹽濃度。在一些實施例中，在高鹽緩衝液添加之後，進料溶液具有約400 mM至約600 mM之鹽濃度。在一些實施例中，在高鹽緩衝液添加之後，進料溶液包含約500 mM之鹽濃度。在一些實施例中，進料溶液之鹽濃度係指組合物中之氯化鈉、氯化鉀、氯化鋰、磷酸一鈉或磷酸三鈉的濃度。
在一些實施例中，進料溶液包含約0.25 mg/ml至約10 mg/ml mRNA、約0.5 mg/ml至約8 mg/ml mRNA、約0.75至約7 mg/ml mRNA、約1 mg/ml至約6 mg/ml mRNA、約2 mg/mL至約5 mg/mL mRNA、約2.25 mg/mL至約4 mg/mL mg/mL mRNA或約2.5 mg/mL至約3 mg/mL mRNA。在一些實施例中，進料溶液包含至少5 mg/mL、至少6 mg/mL、至少7 mg/mL、至少8 mg/mL、至少9 mg/mL、至少10 mg/mL或更多mRNA。在一些實施例中，進料溶液包含約5 mg/mL至約10 mg/mL mRNA。在一些實施例中，進料溶液包含約6 mg/mL至約10 mg/mL mRNA。在一些實施例中，進料溶液包含約7 mg/mL至約10 mg/mL mRNA。在一些實施例中，進料溶液包含約8 mg/mL至約10 mg/mL mRNA。在一些實施例中，進料溶液包含約9 mg/mL至約10 mg/mL mRNA。在一些實施例中，將進料溶液添加至管柱中持續足以遞送對應於管柱之結合能力的至少80%、至少90%、至少95%或多達100%之量的mRNA之持續時間。在一些實施例中，將進料溶液添加至管柱中持續足以使管柱之固定相達到mRNA飽和之持續時間。在一些實施例中，在管柱之固定相達到mRNA飽和之後，將進料溶液添加至下一串聯管柱中。
在一些實施例中，第一層析管柱之裝載包括使第一固定相與至少2 g、至少3 g、至少4 g、至少5 g、至少6 g、至少7 g、至少8 g、至少9 g、至少10 g或更多mRNA/L存在於第一層析管柱中之固定相接觸。添加至既定體積之固定相中的核酸(
例如，mRNA)之質量係稱作「負載挑戰」。例如，在其中將含有共計4 g mRNA之進料溶液添加至含有0.5 L固定相之管柱中的方法中，負載挑戰為8 g/L。在一些實施例中，負載挑戰為約2–50 g/L、2–40 g/L、2–30 g/L、2–10 g/L、5–50 g/L、5–40 g/L、5–30 g/L、5–20 g/L、5–10 g/L、10–50 g/L、10–40 g/L、10–30 g/L或10–20 g/L。在一些實施例中，負載挑戰為約2 g/L至約5 g/L、約5 g/L至約10 g/L、約10 g/L至約15 g/L、約15 g/L至約20 g/L、約20 g/L至約30 g/L、約30 g/L至約40 g/L或約40 g/L至約50 g/L。在一些實施例中，負載挑戰為至少2 g/L、至少3 g/L、至少4 g/L、至少5 g/L、至少6 g/L、至少7 g/L、至少8 g/L、至少9 g/L、至少10 g/L、至少15 g/L、至少20 g/L、至少25 g/L、至少30 g/L、至少35 g/L、至少40 g/L、至少45 g/L或至少50 g/L。
在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少0.25 g、至少0.5 g、至少0.75 g、至少1 g、至少2 g、至少3 g、至少4 g、至少5 g、至少6 g、至少7 g、至少8 g、至少9 g或多達10 g mRNA。在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少4 g mRNA。在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少5 g mRNA。在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少6 g mRNA。在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少7 g mRNA。在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少8 g mRNA。在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少9 g mRNA。在一些實施例中，在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少10 g mRNA。在一些實施例中，將至少10 g不純RNA裝載至管柱上(
亦即，進行純化)，諸如20 g、30 g、40 g、50 g、75 g、100 g、200 g、300 g、400 g、500 g、600 g、700 g、800 g、900 g、1,000 g或更多。在一些實施例中，自首次將進料溶液添加至任何管柱中時開始，且在進料溶液耗盡時結束，量測進行該方法所花費之時間量。在一些實施例中，自首次將進料溶液添加至任何管柱中時開始，且在進料溶液耗盡時溶析出含有mRNA之任何管柱中的任何結合之mRNA之後結束，量測進行該方法所花費之時間量。
在一些實施例中，至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之經溶析mRNA包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少70%之經溶析mRNA包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少80%之經溶析mRNA包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少90%之經溶析mRNA包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少95%之經溶析mRNA包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之經溶析mRNA具有約相同長度。在一些實施例中，至少85%之經溶析mRNA具有約相同長度。在一些實施例中，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之經溶析mRNA具有預期長度。在一些實施例中，至少85%之經溶析mRNA具有預期長度。預期長度係指由用於
活體外轉錄之DNA模板編碼的序列之長度。
在一些實施例中，溶析出進料溶液之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之mRNA。在一些實施例中，溶析出進料溶液之至少75%之mRNA。
本文所揭示之多管柱層析方法產生較高生產率。如本文所用，「生產率」係指自製程獲得之輸出產物(
亦即，核酸)之定量值。更特定言之，生產率係在既定時間長度內使用既定體積之固定相純化的核酸之定量量度，以(質量)⋅(固定相之體積)
–1⋅(時間)
–1(
例如，g⋅L
–1⋅h
–1)為單位表述。在一些實施例中，該方法之生產率為至少約0.25 g / Lh，視情況其中該方法之生產率為約0.5 g / Lh、約0.75 g / Lh、約3 g / Lh、約4 g / Lh、約5 g / Lh、約6 g / Lh、約7 g / Lh、約8 g / Lh、約9 g / Lh、約10 g / Lh或更高。相對於在等效條件下使用分批層析方法純化之核酸的量，評估出較高生產率。在一些實施例中，該方法導致相對於分批層析方法增加至少50%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450%、至少500%、至少550%、至少600%、至少650%、至少700%、至少750%、至少800%、至少850%、至少900%、至少950%、至少1000%、至少1100%、至少1200%、至少1300%、至少1400%、至少1500%、至少1600%、至少1700%、至少1800%、至少1900%或高達2000%。在一些實施例中，多管柱層析導致約50%至約300%、約300%至約500%、約500%至約700%、約700%至約1000%、約1000%至約1500%或約1500%至約2000%之生產率增加。分批層析方法係指一種管柱層析方法，其中使用一或多個未串聯連接之管柱來純化核酸。在一些實施例中，相對於使用等量樹脂之分批層析方法來量測由多管柱層析方法產生之生產率增加。在一些實施例中，相對於使用分佈於多個管柱中之等量樹脂的分批層析方法來量測生產率增加。在一些實施例中，相對於使用單一管柱中之等量樹脂的分批層析方法來量測生產率增加。在一些實施例中，相對於其中純化相同核酸物質(
例如，包含相同核酸序列之核酸)之分批層析方法來量測生產率增加。在一些實施例中，包含於多管柱層析方法之管柱內的樹脂之總體積在約0.1 L至約100 L之間。在一些實施例中，樹脂之總體積為約0.1 L至約0.5 L、0.5 L至約2 L、約2 L至約4 L、約4 L至約6 L、約6 L至約8 L、約8 L至約10 L、約10 L至約15 L、約15 L至約20 L、約20 L至約25 L、約25 L至約30 L、約30 L至約40 L、約40 L至約50 L、約50 L至約75 L或約75 L至約100 L。
管柱層析之鹽強化
在一些實施例中，將高鹽緩衝液添加至進料溶液中以增加鹽濃度，將該組合物添加至固定相中以使mRNA與固定相結合，且自固定相溶析出結合之mRNA以獲得經溶析mRNA。高鹽緩衝液之添加會促進mRNA形成緊密二級結構，但會使聚(A)尾暴露。聚(A)尾之暴露允許mRNA與固定相(諸如oligo-dT樹脂)結合，但由高鹽濃度誘導之緊密結構會減少空間相互作用，其中固定相結合之第一mRNA的一部分防止第二mRNA與固定相結合。因此，與添加具有較低鹽濃度之等效進料溶液相比，將高鹽進料溶液添加至固定相中會導致更多mRNA分子與固定相結合。然而，mRNA必須溶解於溶液中以便穿過固定相。因此，高鹽濃度對增加mRNA與固定相之結合的益處必須與mRNA沈澱之風險達到平衡。令人驚訝的是，即使在高鹽濃度下，沈澱亦需要延長之時間量。因此，向進料溶液中添加高鹽緩衝液以產生高鹽進料溶液，隨後在其後不久將高鹽進料溶液添加至固定相中，這允許實現高鹽濃度對固定相結合之益處，而不會因mRNA沈澱而導致產量降低。
在一些實施例中，該方法包括在添加高鹽緩衝液之前加熱進料溶液以使RNA變性(
亦即，將高鹽緩衝液添加至包含變性RNA之組合物中)。變性會破壞核酸(
例如mRNA)之二級結構，從而促進結合雜質之釋放及線性核酸結構之形成。RNA可使用任何方法變性。在一些實施例中，藉由在添加高鹽緩衝液之前加熱進料溶液使RNA變性。在一些實施例中，藉由在添加高鹽緩衝液之後加熱進料溶液使RNA變性。在一些實施例中，藉由將進料溶液加熱至60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃、65℃至85℃、65℃至75℃、70℃至90℃、70℃至80℃、65℃至70℃、70℃至75℃或75℃至95℃使RNA變性。在一些實施例中，加熱進料溶液持續少於2分鐘、少於90秒、少於1分鐘、少於50秒、少於40秒、少於30秒、少於20秒或少於10秒。在一些實施例中，加熱進料溶液持續5-90秒、5-60秒、5-30秒、5-15秒、10-60秒、10-30秒、20-60秒、20-40秒、30-90秒、30-60秒、40-90秒、40-60秒、60-120秒、60-90秒或90-120秒。在一些實施例中，在變性劑分子(
例如，使RNA不穩定或變性之化學小分子)存在下加熱高鹽進料溶液。變性劑分子可包括二甲亞碸(
例如，濃度為0.05-1% v/v、0.1-0.5% v/v、0.05-0.5% v/v或0.25-0.75% v/v)、胍(
例如，濃度為50-250 mM、100-500 mM、250-1000 mM、1-8 M、2-6 M、3-5 M或5-8 M)或脲(
例如，濃度為50-250 mM、100-500 mM、250-1000 mM、1-8 M、2-6 M、3-5 M或5-8 M)。
在一些實施例中，藉由增色曲線(
例如，光譜熔化曲線)來確定在變性過程(
例如，將進料溶液加熱至60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃、65℃至85℃、65℃至75℃、70℃至90℃、70℃至80℃、65℃至70℃、70℃至75℃或75℃至95℃)期間進料溶液中之變性RNA之相對量的變化。在一些實施例中，藉由量測組合物中之總RNA之二級結構的變化(
例如，藉由確定紫外吸收之變化)來確定變性RNA之相對量的變化。在一些實施例中，在變性過程(
例如，將進料溶液加熱至60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃、65℃至85℃、65℃至75℃、70℃至90℃、70℃至80℃、65℃至70℃、70℃至75℃或75℃至95℃)之前及之後，藉由監測組合物中之總RNA之二級結構的變化(
例如，藉由確定紫外吸收之變化)來確定變性RNA之相對量的變化。
在一些實施例中，變性RNA進料溶液中之總RNA的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%包含變性RNA。在一些實施例中，變性RNA進料溶液中之總RNA的至少90% (
例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)包含變性RNA。在一些實施例中，變性RNA進料溶液中之總RNA的50-70%、45-60%、55-70%、60-80%、60-100%、75-100%、50-95%、75-95%、80-100%、80-90%、90-95%、95-100%、90-99%或95-99%包含變性RNA。在一些實施例中，藉由增色曲線(
例如，光譜熔化曲線)來確定變性RNA進料溶液中之變性RNA的相對量。可使用分光光度計來量測(
例如在RNA之變性期間，
例如藉由加熱)在加熱期間之結構損失後核酸(諸如RNA)展現消光係數之增加的特性。在一些實施例中，在205 nm、220 nm、260 nm或200-300 nm下量測RNA之消光係數。在一些實施例中，使用如S.J. Schroeder及D.H. Turner, 「Optical melting measurements of nucleic acid thermodynamics」, Methods Enzymol. 468 (2009) 371–387；或Gruenwedel, D.W., 「Nucleic Acids: Properties and Determination」, Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition, 2003, 第4147-4152頁中所述之方法來確定變性RNA進料溶液中之變性RNA的相對量。
在一些實施例中，藉由在線混合將高鹽緩衝液添加至RNA進料溶液中。在一些實施例中，在線混合係指使溶液之第一連續流與溶液之第二連續流混合。在一些實施例中，第一及第二連續流由獨立的幫浦(
例如，獨立蠕動幫浦)控制。在一些實施例中，在線混合依賴於流動控制條件，例如其中流動參數(
例如，流動速率、溫度)由包括至少一個幫浦系統之流動調節器件控制的製程流動條件。在一些實施例中，第一連續流為高鹽緩衝液(
例如，包含至少100 mM鹽)，且第二連續流為包含RNA之組合物。在一些實施例中，RNA進料溶液已去鹽(
例如，為低鹽RNA進料溶液)及/或包含變性RNA。在線混合通常在包含RNA之組合物與固定相結合之前不久發生。在一些實施例中，在線混合發生少於2分鐘、少於90秒、少於1分鐘、少於50秒、少於40秒、少於30秒、少於20秒或少於10秒。在一些實施例中，在線混合發生5-90秒、5-60秒、5-30秒、5-15秒、10-60秒、10-30秒、20-60秒、20-40秒、30-90秒、30-60秒、40-90秒、40-60秒、60-120秒、60-90秒或90-120秒。在一些實施例中，在線混合在4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃或15℃至25℃之溫度下發生。
在一些實施例中，藉由推注添加將高鹽緩衝液添加至RNA進料溶液中。與其中連續組合兩種液體流之在線混合形成對比，推注添加涉及將一種組合物離散添加至另一組合物中。推注添加可在數秒或數分鐘內進行，且隨後混合以將高鹽緩衝液併入整個RNA進料溶液中，由此將高鹽緩衝液之鹽分佈於整個RNA進料溶液中。
在一些實施例中，在使包含RNA之組合物與固定相結合之前5-90秒、5-60秒、5-30秒、5-15秒、10-60秒、10-30秒、20-60秒、20-40秒、30-90秒、30-60秒、40-90秒、40-60秒、60-120秒、60-90秒或90-120秒，將高鹽緩衝液添加至RNA進料溶液中。在一些實施例中，在將高鹽RNA進料溶液添加至固定相中之前1-60分鐘、1-45分鐘、1-30分鐘、1-25分鐘、1-20分鐘、1-15分鐘、1-10分鐘、1-5分鐘或1-2分鐘，發生高鹽緩衝液之添加。在一些實施例中，將高鹽RNA進料溶液添加至固定相中發生在將高鹽緩衝液添加至RNA進料溶液中之後的1小時或更短時間、45分鐘或更短時間、30分鐘或更短時間、25分鐘或更短時間、20分鐘或更短時間、15分鐘或更短時間、10分鐘或更短時間、9分鐘或更短時間、8分鐘或更短時間、7分鐘或更短時間、6分鐘或更短時間、5分鐘或更短時間、4分鐘或更短時間、3分鐘或更短時間、2分鐘或更短時間或1分鐘或更短時間內。在一些實施例中，高鹽緩衝液、RNA進料溶液及/或藉由添加高鹽緩衝液產生之高鹽RNA進料溶液具有4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃或15℃至25℃之溫度。
在一些實施例中，高鹽緩衝液(
例如，可與RNA進料溶液混合)包含至少50 mM、至少60 mM、至少70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少100 mM、至少125 mM、至少150 mM、至少200 mM、至少250 mM、至少300 mM、至少350 mM、至少400 mM、至少500 mM、至少600 mM、至少700 mM、至少800 mM、至少900 mM或至少1000 mM之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽緩衝液包含50-500 mM、50-250 mM、50-100 mM、50-75 mM、60-150 mM、75-500 mM、75-200 mM、100-500 mM、100-250 mM、150-350 mM、200-400 mM、250-500 mM、300-400 mM、350-450 mM、400-500 mM、400-600 mM、500-700 mM、500-750 mM、700-1000 mM、750-900 mM或850-1000 mM之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽緩衝液包含1-2 M、2-3 M、3-4 M或4-5 M之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽緩衝液包含至少5 mS/cm、至少6 mS/cm、至少7 mS/cm、至少8 mS/cm、至少9 mS/cm、至少10 mS/cm、至少12 mS/cm或至少15 mS/cm之電導率。在一些實施例中，高鹽緩衝液包含5-10 mS/cm、5-15 mS/cm、5-7 mS/cm、6-9 mS/cm、8-10 mS/cm、9-12 mS/cm或10-15 mS/cm之電導率。
在一些實施例中，使包含RNA之組合物與高鹽緩衝液混合會產生包含RNA及濃度為至少100 mM之鹽的高鹽RNA進料溶液。在一些實施例中，使包含RNA之組合物與高鹽緩衝液混合會產生包含RNA及濃度為100-500 mM、100-250 mM、150-350 mM、200-400 mM、250-500 mM、300-400 mM、350-450 mM、400-500 mM、400-600 mM、500-700 mM、500-750 mM、700-1000 mM、750-900 mM或850-1000 mM之鹽的組合物。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液之鹽濃度為至少100 mM、至少200 mM、至少300 mM、至少400 mM、至少500 mM、至少600 mM、至少700 mM、至少800 mM、至少900 mM、至少1 M或更高。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液具有約100 mM至約200 mM、約200 mM至約400 mM、約400 mM至約600 mM、約600 mM至約800 mM、約800 mM至約1 M、約1 M至約1.5 M、約1.5 M至約2 M、約2 M至約2.5 M、約2.5 M至約3 M、約3 M至約4 M或約4 M至約5 M之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽mRNA進料溶液具有約400 mM至約600 mM之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液包含約500 mM之鹽濃度。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液之鹽濃度係指組合物中之氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、硫酸銨、磷酸一鈉、磷酸二鈉或磷酸三鈉的濃度。在一些實施例中，使包含RNA之組合物與高鹽緩衝液混合會產生包含RNA及鹽之組合物，其具有小於2 mS/cm之電導率。在一些實施例中，使包含RNA之組合物與高鹽緩衝液混合會產生包含RNA及鹽之組合物，其具有2-5 mS/cm、2-7 mS/cm、5-10 mS/cm、5-15 mS/cm、5-7 mS/cm、6-9 mS/cm、8-10 mS/cm、9-12 mS/cm或10-15 mS/cm之電導率。
在一些實施例中，緩衝液(
例如，低鹽或高鹽緩衝液)包括NaCl、KCl、LiCl、NaH
2PO
4、Na
2HPO
4或Na
3PO
4。在一些實施例中，緩衝液(
例如，低鹽或高鹽緩衝液)包含鈉、鉀、鎂、磷酸鹽、氯化物之任何來源或鹽離子之任何其他來源。在一些實施例中，緩衝液(
例如，低鹽或高鹽緩衝液)可進一步包含緩沖劑以便維持一致的pH。在一些實施例中，緩衝液(
例如，低鹽或高鹽緩衝液)包含中性pH。在一些實施例中，緩衝液(
例如，低鹽或高鹽緩衝液)包含約6、約6.5、約7、約7.4、約8或約6-8之pH。用於本文中之緩衝劑的實例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、天冬胺酸、麩胺酸、馬來酸鹽、二甲胂酸鹽、2-(N-嗎啉基)-乙烷磺酸(MES)、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙烷磺酸(ACES)、哌嗪-N,N′-2-乙烷磺酸(PIPES)、2-(N-嗎啉基)-2-羥基-丙烷磺酸(MOPSO)、N,N-雙-(羥基乙基)-2-胺基乙烷磺酸(BES)、3-(N-嗎啉基)-丙烷磺酸(MOPS)、N-2-羥基乙基-哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES)、3-(N-參-(羥基甲基)甲基胺基)-2-羥基丙烷磺酸(TAPSO)、3-(N,N-雙[2-羥基乙基]胺基)-2-羥基丙烷磺酸(DIPSO)、N-(2-羥基乙基)哌嗪-N′-(2-羥基丙烷磺酸) (HEPPSO)、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(EPPS)、N-[參(羥基甲基)-甲基]甘胺酸(Tricine)、N,N-雙(2-羥基乙基)甘胺酸(Bicine)、[(2-羥基-1,1-雙(羥基甲基)乙基)胺基]-1-丙烷磺酸(TAPS)、N-(1,1-二甲基-2-羥基乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸(AMPSO)、參(羥基甲基)胺基甲烷(Tris)及雙[2-羥基乙基]亞胺基參-[羥基甲基]甲烷(Bis-Tris)。用於本文中之其他緩衝液組合物、緩衝液濃度及溶液之額外組分將為熟習此項技術者顯而易知的。
在一些實施例中，混合包括使包含RNA之組合物冷卻至4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8 ℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃或15℃至25℃之溫度。在一些實施例中，混合包括使包含RNA之組合物冷卻至低於60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃、20℃、15℃、10℃或5℃之溫度。在一些實施例中，冷卻與使包含RNA及低鹽緩衝液之組合物與高鹽緩衝液混合同時發生。在一些實施例中，在冷卻期間，使包含RNA之組合物維持小於20 mM、小於15 mM、小於10 mM、小於5 mM或小於1 mM之總鹽濃度。在一些實施例中，在冷卻期間，使包含RNA之組合物維持1-20 mM、1-15 mM、1-10 mM、1-5 mM、5-20 mM、5-10 mM、10-20 mM、10-15 mM或15-20 mM之總鹽濃度。在一些實施例中，冷卻與使包含RNA及低鹽緩衝液之組合物與高鹽緩衝液混合同時發生。在一些實施例中，在冷卻期間，使包含RNA之組合物維持在小於2.5 mS/cm、小於2 mS/cm、小於1.5 mS/cm、小於1 mS/cm或小於0.5 mS/cm下。在一些實施例中，冷卻與 使包含RNA及低鹽緩衝液之組合物與高鹽緩衝液混合同時發生。在一些實施例中，在冷卻期間，使包含RNA之組合物維持在0.1-2.5 mS/cm、0.1-2 mS/cm、0.5-2 mS/cm、0.5-1 mS/cm、1-2 mS/cm、1-1.5 mS/cm或1-1.25 mS/cm下。
層析方法之一些實施例涉及產生高鹽RNA進料溶液，其中大部分或所有RNA分子溶解於溶液中。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液包含至少2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L、4.0 g/L、4.5 g/L、5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L或更多之溶解RNA。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液包含約2.0 g/L至約4.0 g/L、約4.0 g/L至約6.0 g/L、約6.0 g/L至約8.0 g/L或約8.0 g/L至約10.0 g/L之溶解RNA。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液包含約4.0 g/L至約6.0 g/L之溶解RNA。在一些實施例中，高鹽mRNA進料溶液中之至少至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之RNA為溶解mRNA。在一些實施例中，該組合物中之沈澱(
亦即，固體) RNA的濃度為0.5 g/L或更少、0.4 g/L或更少、0.3 g/L或更少、0.2 g/L或更少、0.1 g/L或更少或0.05 g/L或更少。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液不包含沈澱RNA。量測組合物中之沈澱RNA的質量之方法一般為此項技術中已知的，且包括沈澱物之分離及稱重，或使沈澱物去鹽及再溶解以藉由光譜法定量RNA之量。在一些實施例中，藉由確定組合物中之沈澱RNA的質量、確定組合物中之溶解RNA的質量及計算組合物中所有作為沈澱RNA之RNA的百分率來計算組合物中作為溶解RNA之RNA的百分率。在一些實施例中，不存在沈澱物或沈澱物中不存在RNA指示該組合物中之所有RNA均為溶解RNA。本文中之方法的一些實施例涉及使包含RNA之組合物與固定相結合(
亦即，接觸)。在一些實施例中，本文中之方法包括在使RNA進料溶液與高鹽緩衝液混合之後，使包含RNA之組合物與固定相結合。
在一些實施例中，固定相包含纖維、粒子、樹脂及/或珠粒，固定相之實例包括但不限於樹脂、二氧化矽(
例如，烷基化及非烷基化二氧化矽)、聚苯乙烯(
例如，烷基化及非烷基化聚苯乙烯)、聚苯乙烯二乙烯基苯等。在一些實施例中，固定相包含粒子，例如多孔粒子。在一些實施例中，固定相(
例如，固定相之粒子)為疏水性的(
例如，由本質上疏水性材料製成，諸如聚苯乙烯二乙烯基苯)，或包含疏水性官能基。在一些實施例中，固定相為膜或整體固定相。整體固定相係藉由管柱管道內部之
原位聚合或固結製備的連續、單一、多孔結構。在一些實施例中，使表面官能化以將其轉化為具有所需層析結合特性之吸附劑。
HPLC固定相之粒徑(
例如，如藉由粒子直徑所量測)可變化。在一些實施例中，HPLC固定相之粒徑介於約1 μm至約100 μm (
例如，1與100之間的任何值(包括端點))之直徑範圍內。在一些實施例中，HPLC固定相之粒徑介於約2 μm至約10 μm、約2 μm至約6 μm或約4 μm之直徑範圍內。粒子之孔徑(
例如，如藉由孔之直徑所量測)亦可變化。在一些實施例中，粒子包含具有約100 Å至約10,000 Å之直徑的孔。在一些實施例中，粒子包含具有約100 Å至約5000 Å、約100 Å至約1000 Å或約1000 Å至約2000 Å之直徑的孔。在一些實施例中，固定相包含聚苯乙烯二乙烯基苯，例如，如PLRP-S 4000管柱或DNAPac-RP管柱中所用。
在一些實施例中，固定相包含疏水性相互作用層析(HIC)固定相，諸如HIC樹脂。此處所述之方法的一些實施例可包含任何HIC樹脂。在一些實施例中，HIC樹脂包含一或多種丁基、苯基、辛基、第三丁基、甲基及/或乙基官能基。在一些實施例中，HIC樹脂為HiTrap Butyl HP樹脂、CaptoPhenyl樹脂、Phenyl Sepharose 6樹脂、Phenyl Sepharose™高效能樹脂、Octyl Sepharose™高效能樹脂、Fractogel™ EMD Propyl樹脂、Fractogel™ EMD Phenyl樹脂、Macro-Prep™ Methyl樹脂、HiScreen Butyl FF、HiScreen Octyl FF或Tosoh Hexyl。在一些實施例中，HIC樹脂係具有2000埃孔之(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB) R150珠粒樹脂。
在一些實施例中，固定相包含捕獲核酸(
例如，寡核苷酸或聚核苷酸)，其包含與高鹽RNA進料溶液之mRNA的核苷酸序列互補之核苷酸序列。捕獲核酸與在高鹽RNA進料溶液中之mRNA上的互補序列之間之Watson-Crick鹼基配對會促進固定相對mRNA之保留，而缺乏該互補序列之核酸由於缺乏與捕獲核酸的雜交而通過固定相。在一些實施例中，捕獲核酸為DNA。在其他實施例中，捕獲核酸為RNA。在一些實施例中，捕獲核酸包含5-200、10-50、10-100、50-200、100-150或125-200個核苷酸長之核苷酸序列，其與高鹽組合物中之mRNA之核苷酸序列互補。在一些實施例中，捕獲核酸為5-200、10-50、10-100、50-200、100-150或125-200個核苷酸長。在一些實施例中，捕獲核酸藉由連接體與固定相之珠粒及/或樹脂連接。
在一些實施例中，固定相包含oligo-dT樹脂。在一些實施例中，oligo-dT樹脂係經聚dT衍生化之具有2000埃孔之(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)珠粒樹脂。在一些實施例中，聚dT包含5-200、10-50、10-100、50-200、100-150或125-200個胸苷及/或尿嘧啶。在一些實施例中，聚dT包含20個胸苷長。在一些實施例中，聚dT直接地與珠粒樹脂連接。在一些實施例中，聚dT經由連接體與珠粒樹脂連接。
在一些實施例中，在使RNA與樹脂結合之前，用緩衝液平衡固定相。在一些實施例中，用包含100 mM NaCl、10 mM Tris及1 mM EDTA之緩衝液(pH 7.4)平衡固定相。在一些實施例中，在RNA與固定相結合之後，用緩衝液洗滌固定相。在一些實施例中，洗滌步驟包含緩衝液(pH 7.4)，該緩衝液包含100 mM NaCl、10 mM Tris及1 mM EDTA。
在一些實施例中，RNA與固定相之結合發生在低於40℃之溫度下。在一些實施例中，RNA與固定相之結合發生在4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃或15℃至25℃之溫度下。
在一些實施例中，使包含RNA之高鹽RNA進料溶液與固定相結合或接觸持續少於20分鐘、少於18分鐘、少於15分鐘、少於12分鐘、少於小於10分鐘、少於9分鐘、少於8分鐘、少於7分鐘、少於6分鐘、少於5分鐘、少於4分鐘、少於3分鐘、少於2分鐘或少於1分鐘之總滯留時間。在一些實施例中，使包含RNA之組合物與固定相結合或接觸持續1-2、1-5、2-5、2-10、5-20、5-10、5-15、8-15、10-15、12-20或15-20分鐘之總滯留時間。
在一些實施例中，固定相包含於管柱中。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液中之RNA濃度為管柱之動態結合能力的小於100%、小於90%、小於80%、小於70%、小於60%或小於50%。動態結合能力係指分析物(
例如，RNA)之量或濃度，該分析物可穿過管柱而無顯著穿透。使管柱或固定相與包含超過動態結合能力之分析物濃度之組合物接觸會導致分析物穿過固定相而未結合，從而降低分析物產率。在一些實施例中，高鹽RNA進料溶液中之至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之mRNA與固定相結合。
在一些實施例中，在使RNA與固定相結合之前添加高鹽緩衝液會增加該方法之生產率。在一些實施例中，該方法之生產率為至少約0.25 g / Lh，視情況其中該方法之生產率為約0.5 g / Lh、約0.75 g / Lh、約3 g / Lh、約4 g / Lh、約5 g / Lh、約6 g / Lh、約7 g / Lh、約8 g / Lh、約9 g / Lh、約10 g / Lh或更高。在一些實施例中，包含於管柱內之固定相之總體積在約0.1 L至約100 L之間。在一些實施例中，固定相之總體積為約0.1 L至約0.5 L、0.5 L至約2 L、約2 L至約4 L、約4 L至約6 L、約6 L至約8 L、約8 L至約10 L、約10 L至約15 L、約15 L至約20 L、約20 L至約25 L、約25 L至約30 L、約30 L至約40 L、約40 L至約50 L、約50 L至約75 L或約75 L至約100 L。
在一些實施例中，該等方法包括自固定相溶析RNA。在一些實施例中，使用水或緩衝液(
例如，包含10 mM Tris、1 mM EDTA之緩衝液，pH 8.0)自固定相溶析RNA。
在一些實施例中，自固定相溶析之RNA包含至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之加聚-A尾RNA。在一些實施例中，自固定相溶析之RNA包含約20-100%、20-90%、20-80%、20-70%、20-60%、20-50%、20-40%、20-30%、25-75%、30-50%、40-60%、50-70%、45-60%、55-70%、60-80%、60-100%、75-100%、50-95%、75-95%、80-100%、80-90%、90-95%、95-100%、90-99%或95-99%之加聚-A尾mRNA。在一些實施例中，自固定相溶析之RNA包含至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之加聚-A尾mRNA。
在一些實施例中，使包含RNA之混合物去鹽以產生低鹽RNA進料溶液(
例如，具有小於50 mM之總鹽濃度)。在一些實施例中，在RNA變性及/或與高鹽緩衝液混合之前，使包含RNA之混合物(
例如，藉由IVT反應產生之混合物)去鹽。在一些實施例中，去鹽發生在變性(
例如，藉由加熱)之後，但在高鹽緩衝液添加之前。在一些實施例中，去鹽發生在變性之前，且加熱低鹽mRNA進料溶液以使mRNA變性。在一些實施例中，在高鹽緩衝液添加之前，使RNA進料溶液去鹽，但未變性。
在一些實施例中，低鹽RNA進料溶液包含鈉、鉀、鎂、錳、鈣、硫酸鹽、磷酸鹽及/或氯化物鹽。在一些實施例中，低鹽RNA進料溶液包含氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、硫酸鉀、氯化鎂、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸鈣及/或硫酸鈣。在一些實施例中，低鹽RNA進料溶液包含小於20 mM、小於15 mM、小於10 mM、小於5 mM或小於1 mM之總鹽濃度。在一些實施例中，低鹽RNA進料溶液包含1-20 mM、1-15 mM、1-10 mM、1-5 mM、5-20 mM、5-10 mM、10-20 mM、10-15 mM或15-20 mM之鹽濃度。在一些實施例中，低鹽RNA進料溶液產生小於2.5 mS/cm、小於2 mS/cm、小於1.5 mS/cm、小於1 mS/cm或小於0.5 mS/cm之電導率。在一些實施例中，低鹽RNA進料溶液包含0.1-2.5 mS/cm、0.1-2 mS/cm、0.5-2 mS/cm、0.5-1 mS/cm、1-2 mS/cm、1-1.5 mS/cm或1-1.25 mS/cm之電導率。
在一些實施例中，藉由使RNA與疏水性相互作用層析(HIC)樹脂結合且自HIC樹脂溶析RNA以產生低鹽RNA進料溶液來實現使包含RNA之混合物去鹽。在一些實施例中，在使RNA與樹脂結合之前，用緩衝液平衡HIC樹脂。在一些實施例中，用包含100 mM NaCl、10 mM Tris、1 mM EDTA之緩衝液(pH 7.4)平衡HIC樹脂。在一些實施例中，使用水或緩衝液自HIC樹脂溶析RNA。此處所述之方法的一些實施例可包含任何HIC樹脂。在一些實施例中，HIC樹脂包含丁基、苯基、辛基、第三丁基、甲基及/或乙基官能基。在一些實施例中，HIC樹脂為HiTrap Butyl HP樹脂、CaptoPhenyl樹脂、Phenyl Sepharose 6樹脂、Phenyl Sepharose™高效能樹脂、Octyl Sepharose™高效能樹脂、Fractogel™ EMD Propyl樹脂、Fractogel™ EMD Phenyl樹脂、Macro-Prep™ Methyl樹脂、HiScreen Butyl FF、HiScreen Octyl FF或Tosoh Hexyl。在一些實施例中，HIC樹脂係具有2000埃孔之(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB) R150珠粒樹脂。
在一些實施例中，藉由用水(
例如，10x水稀釋)稀釋包含RNA之混合物、將該混合物切向流過濾(TFF)至水或環境oligo-dT中(
亦即，在天然、非變性RNA條件下)來實現使該混合物去鹽。在一些實施例中，藉由切向流過濾來實現使包含RNA之混合物去鹽。
在一些實施例中，使RNA進料溶液(
例如，低鹽RNA進料溶液)變性。在一些實施例中，低鹽RNA進料溶液在與高鹽緩衝液混合之前(
例如，即將混合之前)變性且隨後使變性RNA與固定相結合。
核酸
本揭示案之態樣係關於包含核酸之組合物及產生核酸之方法。如本文所用，術語「核酸」包括多個核苷酸(
亦即，包含與磷酸酯基及可交換之有機鹼基連接之糖(
例如核糖或去氧核糖)的分子，該有機鹼基為經取代之嘧啶(
例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或經取代之嘌呤(
例如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)))。術語核酸包括聚核糖核苷酸以及聚去氧核糖核苷酸。術語核酸亦包括多核苷(亦即多核苷酸減去磷酸酯)及任何其他含有有機鹼基之聚合物。核酸之非限制性實例包括染色體、基因體基因座、編碼聚核苷酸或多肽之基因或基因區段、基因之編碼序列、非編碼序列(
例如內含子、5′-UTR或3′-UTR)、初級mRNA、前mRNA、cDNA、mRNA等。核酸(
例如mRNA)可包括取代及/或修飾。在一些實施例中，取代及/或修飾位於一或多個鹼基及/或糖中。例如，在一些實施例中，核酸(
例如，mRNA)包括具有有機基團(諸如甲基)之核苷酸，該有機基團在N6位附接至核酸鹼基。因此，在一些實施例中，mRNA包括一或多個N6-甲基腺苷核苷酸。核苷酸之磷酸酯、糖或核酸鹼基亦可取代另一磷酸酯、糖或核酸鹼基。例如，尿苷鹼基可取代假尿苷鹼基，其中尿嘧啶鹼基藉由碳-碳鍵而非氮-碳鍵附接至糖。因此，在一些實施例中，核酸(
例如mRNA)之主鏈組成為異質的，由此含有連接在一起的聚合物單元之任何可能組合，諸如肽-核酸(其具有帶核酸鹼基之胺基酸主鏈)。
核酸序列之一些實施例包括已自其天然存在之環境中移出的核酸序列、重組或經選殖之DNA分離物以及化學合成之類似物或由異源系統生物合成之類似物。
「經工程改造之核酸」係自然界中不存在之核酸。然而，應理解，雖然經工程改造之核酸整體並非天然存在的，但其可包括自然界中存在之核苷酸序列。在一些實施例中，經工程改造之核酸包含來自不同生物體(
例如，來自不同物種)之核苷酸序列。例如，在一些實施例中，經工程改造之核酸包括細菌核苷酸序列、人類核苷酸序列及/或病毒核苷酸序列。
經工程改造之核酸包括重組核酸及合成核酸。「重組核酸」係藉由接合核酸(
例如，經分離之核酸、合成核酸或其組合)而構建之分子且在一些實施例中，可在活細胞中複製。「合成核酸」係經擴增或化學合成或藉由其他方式合成之分子。合成核酸包括經化學修飾或以其他方式經修飾、但可與天然存在之核酸分子進行鹼基配對的彼等核酸。重組及合成核酸亦包括由前述任一者複製產生之彼等分子。核酸可包含天然存在之核苷酸及/或非天然存在之核苷酸，諸如經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，核酸存在於載體中(或其上)。載體之實例包括但不限於細菌質體、噬菌體、黏接質體、質體、F型黏接質體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、病毒及逆轉錄病毒(例如牛痘、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、單純疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、禽痘病毒、偽狂犬病、桿狀病毒)及其衍生之載體。在一些實施例中，用作
活體外轉錄(IVT)之輸入分子的核酸(
例如，DNA)存在於質體載體中。
當應用於核酸序列時，術語「經分離」表示聚核苷酸序列已自其天然遺傳環境中移出且因此不含其他外來或不想要之編碼序列(但可包括天然存在之5′及3′非轉譯區，諸如啟動子及終止子)，且呈適合在經遺傳工程改造之蛋白質產生系統內使用的形式。此類經分離分子係與其天然環境分離之彼等分子。
在一些實施例中，IVT之輸入DNA為核酸載體。「核酸載體」係攜帶至少一個外源或異源核酸片段之聚核苷酸。核酸載體可如「分子載體」般發揮作用，從而將核酸或聚核苷酸之片段遞送至宿主細胞中或作為IVT之模板。如本文所用，「
活體外轉錄模板」(IVT模板)或「輸入DNA」係指適合用於IVT反應以產生信使RNA (mRNA)之去氧核糖核酸(DNA)。在一些實施例中，IVT模板編碼5′非轉譯區，含有開放閱讀框，且編碼3′非轉譯區及聚A尾。IVT模板之特定核苷酸序列組成及長度將取決於由該模板編碼之所關注mRNA。
在一些實施例中，核酸載體為環狀核酸，諸如質體。在其他實施例中，其為線性化核酸。根據一些實施例，核酸載體包含預定限制位點，其可用於線性化。線性化限制位點決定使載體核酸開放/線性化之位置。針對線性化所選擇之限制酶較佳應不在載體之關鍵組分內切割。
核酸載體可包括插入物，其可為表現卡匣或開放閱讀框(ORF)。「開放閱讀框」係以起始密碼子(
例如甲硫胺酸(ATG))開始且以終止密碼子(
例如TAA、TAG或TGA)結束之鄰接DNA區段且編碼蛋白質或肽(
例如，治療性蛋白質或治療性肽)。在一些實施例中，表現卡匣編碼至少包括以下元件之RNA：5′非轉譯區、編碼mRNA之開放閱讀框區、3′非轉譯區及聚A尾。開放閱讀框可編碼任何mRNA序列或其部分。
在一些實施例中，核酸載體包含5′非轉譯區(UTR)。「5′非轉譯區(UTR)」係指mRNA中直接位於起始密碼子(
亦即，由核糖體轉譯之mRNA轉錄本的第一個密碼子)上游(
亦即，5′)之區域，該區域不編碼蛋白質或肽。5′ UTR在本文中進一步描述，例如描述於標題為「非轉譯區」之部分中。
在一些實施例中，核酸載體包含3′非轉譯區(UTR)。「3′非轉譯區(UTR)」係指mRNA中直接位於終止密碼子(
亦即，mRNA轉錄本中對轉譯之終止發送信號的密碼子)下游(
亦即，3′)之區域，該區域不編碼蛋白質或肽。3′ UTR在本文中進一步描述，例如描述於標題為「非轉譯區」之部分中。
術語5′及3′在本文中用於描述與遺傳元件之位置及/或事件之方向(5′至3′)相關之核酸序列特徵，
例如在5′至3′方向上進行的RNA聚合酶之轉錄或核糖體之轉譯。同義詞為上游(5′)及下游(3′)。按慣例，DNA序列、基因圖譜、載體卡及RNA序列自左至右以5′至3′繪製，或用箭頭指示5′至3′方向，其中箭頭指向3′方向。因此，當遵循此慣例時，5′ (上游)指示朝向左手側定位之遺傳元件，且3′ (下游)指示朝向右手側定位之遺傳元件。
本揭示案之態樣係關於分子之群體。如本文所用，分子(
例如DNA分子)之「群體」一般係指包含所關注分子(
例如DNA)之複數個複本的製劑(
例如質體製劑)，例如包含複數個編碼所關注分子之表現載體(
例如，編碼所關注RNA之DNA)的細胞提取物製劑。
核酸(
例如，mRNA)通常包含複數個核苷酸。核苷酸包括含氮鹼基、五碳糖(核糖或去氧核糖)及至少一個磷酸酯基。核苷酸包括單磷酸核苷、二磷酸核苷及三磷酸核苷。單磷酸核苷(NMP)包括與核糖及單個磷酸酯連接之核鹼基；二磷酸核苷(NDP)包括與核糖及兩個磷酸酯連接之核鹼基；且三磷酸核苷(NTP)包括與核糖及三個磷酸酯連接之核鹼基。核苷酸類似物係具有核苷酸之一般結構或在結構上與核苷酸類似之化合物。例如，核苷酸類似物包括核苷酸的核鹼基之類似物、糖之類似物及/或磷酸酯基之類似物。
核苷包括含氮鹼基及5-碳糖。因此，核苷加上磷酸酯基產生核苷酸。核苷類似物係具有核苷之一般結構或在結構上與核苷類似之化合物。例如，核苷類似物包括核苷的核鹼基之類似物及/或糖之類似物。
應理解，除非另有說明，否則術語「核苷酸」包括天然存在之核苷酸、合成核苷酸及經修飾之核苷酸。用於產生RNA (
例如，在IVT反應中)之天然存在之核苷酸的實例包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鳥苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸尿苷(UTP)及三磷酸5-甲基尿苷(m
5UTP)。在一些實施例中，使用二磷酸腺苷(ADP)、二磷酸鳥苷(GDP)、二磷酸胞苷(CDP)及/或二磷酸尿苷(UDP)。
核苷酸類似物之實例包括但不限於抗病毒核苷酸類似物、磷酸鹽類似物(可溶或經固定、可水解或不可水解)、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸，
例如帽類似物或用於酶加帽之前驅體/受質(牛痘或連接酶)、經官能基標記以促進帽或5’部分(IRES)之接合/結合的核苷酸、經5’ PO
4標記以促進帽或5’部分之接合的核苷酸或經可化學或酶促裂解的官能基/保護基標記之核苷酸。抗病毒核苷酸/核苷類似物之實例包括但不限於更昔洛韋(Ganciclovir)、恩替卡韋(Entecavir)、替比夫定(Telbivudine)、阿糖腺苷及西多福韋(Cidofovir)。
經修飾之核苷酸可包括經修飾之核鹼基。例如，本揭示案之RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)可包括選自假尿苷(ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4′-硫代尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷(mo5U)及2′-O-甲基尿苷的經修飾之核鹼基。在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括前述經修飾之核鹼基中的至少兩種(
例如，2、3、4種或更多種)之組合。
活體外轉錄
本揭示案之態樣係關於產生(
例如，合成) RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)之方法，該等方法包括使DNA模板(
例如，第一輸入DNA及第二輸入DNA)與RNA聚合酶(
例如，T7 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶變異體等)在引起RNA轉錄本產生之條件下接觸。此過程係稱作「
活體外轉錄」或「IVT」。IVT條件通常需要含有啟動子之經純化DNA模板、三磷酸核苷、包括二硫蘇糖醇(DTT)及鎂離子之緩衝液系統以及RNA聚合酶。轉錄反應中使用之確切條件取決於特定應用所需之RNA的量。藉由在轉錄緩衝液中用RNA聚合酶及三磷酸核苷，包括GTP、ATP、CTP及UTP (或核苷酸類似物)培育DNA模板來進行典型IVT反應。由此反應產生具有5ꞌ末端三磷酸鳥苷之RNA轉錄本。
在一些實施例中，IVT反應使用選自由T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、K11 RNA聚合酶及SP6 RNA聚合酶組成之群的RNA聚合酶。在一些實施例中，IVT反應使用T3 RNA聚合酶。在一些實施例中，IVT反應使用SP6 RNA聚合酶。在一些實施例中，IVT反應使用K11 RNA聚合酶。在一些實施例中，IVT反應使用T7 RNA聚合酶。在一些實施例中，野生型T7聚合酶用於IVT反應中。在一些實施例中，突變型T7聚合酶用於IVT反應中。在一些實施例中，T7 RNA聚合酶變異體包含與野生型T7 (WT T7)聚合酶共享至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，T7聚合酶變異體係由國際申請公開案第WO2019/036682號或第WO2020/172239號描述之T7聚合酶變異體，該等公開案中之每一者的完整內容以引用之方式併入本文中。相對於WT T7 RNA聚合酶具有一或多種突變之T7 RNA聚合酶變異體在IVT反應中具有數種優勢，包括經改良之速度、保真度及減少之雙鏈RNA (dsRNA)轉錄本產生。當引入細胞中時，雙鏈RNA轉錄本(其中RNA轉錄本之至少一部分與另一RNA分子雜交)引發先天免疫反應，從而導致dsRNA的兩條鏈降解。在IVT期間使dsRNA轉錄本之形成減至最少使得能夠產生免疫原性更低且因此更穩定之RNA組合物。在一些實施例中，包含RNA之組合物中的雙鏈RNA之濃度為5% (% w/w)或更低、4%或更低、3%或更低、2.5%或更低、2%或更低、1.75%或更低、1.5%或更低、1.25%或更低、1%或更低、0.9%或更低、0.8%或更低、0.7%或更低、0.6%或更低、0.5%或更低、0.4%或更低、0.3%或更低、0.25%或更低、0.2%或更低、0.175%或更低、0.15%或更低、0.125%或更低或0.1%或更低。在一些實施例中，包含RNA之組合物中的雙鏈RNA之濃度為0.05% (% w/w)或更低、0.04%或更低、0.03%或更低、0.02%或更低或0.01%或更低。量測組合物中之dsRNA的存在及/或量之方法為此項技術中已知的。用於量測樣品之dsRNA含量之方法的非限制性實例包括ELISA及使用對dsRNA具特異性之抗體之免疫印跡。另外，可使用諸如光譜法(NanoDrop)、qRT-PCR及/或ddPCR之技術來量測樣品中之RNA的總質量，且可使用當與dsRNA結合時發螢光之嵌入劑(諸如吖啶橙)來量測dsRNA之質量，其中藉由除法來計算dsRNA濃度。在一些實施例中，組合物中之dsRNA的濃度係指作為雙鏈RNA:RNA雜合體之一部分的RNA核苷酸之質量，其中來自該雜合體中之任一RNA的其他未雜交核苷酸對組合物中之dsRNA的量無貢獻。在其他實施例中，樣品中之dsRNA的濃度係指含有作為RNA:RNA雜合體之一部分的核苷酸之RNA分子的濃度。在一些實施例中，RNA聚合酶(
例如，T7 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶變異體)以0.01 mg/ml至1 mg/ml之濃度存在於反應(
例如，IVT反應)中。例如，RNA聚合酶可以0.01 mg/mL、0.05 mg/ml、0.1 mg/ml、0.5 mg/ml或1.0 mg/ml之濃度存在於反應中。
兩個序列(
例如核酸或胺基酸)之「一致性百分比」、「序列一致性」、「%一致性%」或 「%序列一致性%」(因為其可在本文中互換使用)係指兩個序列(
例如核酸或胺基酸)之間的相似性之定量量測。一致性百分比可使用如Karlin及Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993中修改之Karlin及Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990之算法來確定。此類算法併入Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)中。可用XBLAST程式(評分=50，字長=3)進行BLAST蛋白質搜索以獲得與所關注之蛋白質分子同源的胺基酸序列。在兩個序列之間存在空位之情況下，可使用Gapped BLAST，如Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997中所述。當使用BLAST及Gapped BLAST程式時，可使用各別程式(
例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數。當陳述一致性百分比或其範圍(
例如，至少、大於等)時，除非另有規定，否則端點應包括在內，且該範圍(
例如，至少70%一致性)應包括所引用之範圍內的所有範圍。
輸入去氧核糖核酸(DNA)用作RNA聚合酶之核酸模板。DNA模板可包括編碼所關注多肽(
例如，抗原性多肽)之聚核苷酸。在一些實施例中，DNA模板包括RNA聚合酶啟動子(
例如，T7 RNA聚合酶啟動子)，其位於編碼所關注多肽之聚核苷酸的5′處且可操作地連接至該聚核苷酸。DNA模板亦可包括編碼位於所關注基因之3′末端的聚腺苷酸化(聚A)區域之核苷酸序列。在一些實施例中，輸入DNA包含質體DNA (pDNA)。如本文所用，「質體DNA」或「pDNA」係指與細胞中之染色體DNA物理分離且可獨立地複製之染色體外DNA分子。在一些實施例中，自細胞(
例如，作為質體DNA製劑)中分離質體DNA。在一些實施例中，質體DNA包含複製起點，其可含有一或多種異源核酸，例如編碼可用作RNA聚合酶之模板的治療性蛋白質之核酸。質體DNA可為環狀或線性的(
例如，已藉由限制酶消化線性化之質體DNA)。
一些實施例包括進行包括多種輸入DNA (或輸入DNA之群體)之共IVT反應。在一些實施例中，共IVT反應中之每種輸入DNA (
例如，輸入DNA分子之群體)獲自不同來源(
例如單獨合成，例如在不同細胞或細胞群體中合成)。在一些實施例中，每種輸入DNA (
例如，輸入DNA之群體)獲自不同的細菌細胞或細菌細胞之群體。例如，在具有三個輸入DNA之群體之共IVT反應中，第一輸入DNA在細菌細胞群體A中產生，第二輸入DNA在細菌細胞群體B中產生，且第三輸入DNA在細菌群體C中產生，其中A、B及C中之每一者並非相同的細菌培養物(
例如，在同一容器或板中共培養)。在另一實例中，自不同來源獲得之兩種輸入DNA係i)在單獨合成反應中化學合成，或ii)藉由單獨擴增(
例如，聚合酶鏈反應(PCR反應))產生。
在一些實施例中，RNA轉錄本為IVT反應之產物。在一些實施例中，RNA轉錄本為信使RNA (mRNA)，其包括編碼與聚A尾連接之所關注多肽(
例如，治療性蛋白質或治療性肽)的核苷酸序列。在一些實施例中，mRNA為經修飾之mRNA (mmRNA)，其包括至少一種經修飾之核苷酸。在一些實施例中，藉由環化進一步修飾由IVT產生之RNA轉錄本，其中使線性RNA之兩個不相鄰核苷酸(
例如，5′及3′末端核苷酸)接合以產生無末端核苷酸之環狀RNA。
三磷酸核苷(NTP)可包含未經修飾或經修飾之ATP、經修飾或未經修飾之UTP、經修飾或未經修飾之GTP及/或經修飾或未經修飾之CTP。在一些實施例中，IVT反應之NTP包含未經修飾之ATP。在一些實施例中，IVT反應之NTP包含經修飾之ATP。在一些實施例中，IVT反應之NTP包含未經修飾之UTP。在一些實施例中，IVT反應之NTP包含經修飾之UTP。在一些實施例中，IVT反應之NTP包含未經修飾之GTP。在一些實施例中，IVT反應之NTP包含經修飾之GTP。在一些實施例中，IVT反應之NTP包含未經修飾之CTP。在一些實施例中，IVT反應之NTP包含經修飾之CTP。
IVT反應中之NTP的組成亦可變化。在一些實施例中，IVT反應中之每種NTP以等莫耳量存在。在一些實施例中，IVT反應中之每種NTP以非等莫耳量存在。例如，可使用超過GTP、CTP及UTP之ATP。作為非限制性實例，IVT反應可包括7.5毫莫耳濃度之GTP、7.5毫莫耳濃度之CTP、7.5毫莫耳濃度之UTP及3.75毫莫耳濃度之ATP。在一些實施例中，G:C:U:A之莫耳比為2:1:0.5:1。在一些實施例中，G:C:U:A之莫耳比為1:1:0.7:1。在一些實施例中，G:C:A:U之莫耳比為1:1:1:1。相同IVT反應可包括3.75毫莫耳濃度之帽類似物(
例如，三核苷酸帽或四核苷酸帽)。在一些實施例中，帽與G、C、U或A中之任一者的莫耳比為1:1。在一些實施例中，G:C:U:A:帽之莫耳比為1:1:1:0.5:0.5。在一些實施例中，G:C:U:A:帽之莫耳比為1:1:0.5:1:0.5。在一些實施例中，G:C:U:A:帽之莫耳比為1:0.5:1:1:0.5。在一些實施例中，G:C:U:A:帽之莫耳比為0.5:1:1:1:0.5。在一些實施例中，憑經驗計算IVT反應中之NTP的量。例如，可針對每種個別輸入DNA憑經驗確定IVT反應中之每種NTP的消耗速率，且接著可將基於彼等個別NTP消耗速率之NTP平衡比率添加至包含多種輸入DNA之IVT中。
在一些實施例中，IVT反應混合物包含一或多種經修飾之三磷酸核苷。在一些實施例中，IVT反應混合物包含一或多種選自由三磷酸N6-甲基腺苷、三磷酸假尿苷(ψ)、三磷酸1-甲基假尿苷(m
1ψ)、三磷酸5-甲氧基尿苷(mo
5U)、三磷酸5-甲基胞苷(m
5C)、三磷酸α-硫代-鳥苷及三磷酸α-硫代-腺苷組成之群的經修飾之三磷酸核苷。在一些實施例中，IVT反應混合物包含三磷酸N6-甲基腺苷。在一些實施例中，IVT反應混合物包含三磷酸假尿苷。在一些實施例中，IVT反應混合物包含三磷酸1-甲基假尿苷。在一些實施例中，反應混合物中之經修飾之三磷酸核苷的濃度為約0.1%至約100%、約0.5%至約75%、約1%至約50%或約2%至約25%。在一些實施例中，經修飾之三磷酸核苷的濃度為約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約15%、約20%或約25%。
在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括選自假尿苷(ψ)、1-甲基假尿苷(m
1ψ)、5-甲氧基尿苷(mo
5U)、5-甲基胞苷(m
5C)、α-硫代-鳥苷及α-硫代-腺苷之經修飾之核鹼基。在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括前述經修飾之核鹼基中的至少兩種(
例如，2、3、4種或更多種)之組合。
在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括假尿苷(ψ)。在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括1-甲基假尿苷(m
1ψ)。在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括5-甲氧基尿苷(mo
5U)。在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括5-甲基胞苷(m
5C)。在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括α-硫代-鳥苷。在一些實施例中，RNA轉錄本(
例如，mRNA轉錄本)包括α-硫代-腺苷。
在一些實施例中，聚核苷酸(
例如RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)經均一修飾(
例如，經完全修飾、在整個序列中經修飾)以進行特定修飾。舉例而言，聚核苷酸可經1-甲基假尿苷(m
1ψ)均一修飾，意謂mRNA序列中之所有尿苷殘基均經1-甲基假尿苷(m
1ψ)置換。同樣，可藉由用經修飾之殘基(諸如上文所陳述之彼等殘基中的任一者)進行置換，針對序列中存在之任一類型之核苷殘基對聚核苷酸進行均一修飾。或者，聚核苷酸(
例如RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)可未經均一修飾(
例如，經部分修飾、序列之一部分經修飾)。每一種可能性代表單獨實施例。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包括於IVT混合物中，且在轉錄期間隨機併入，使得RNA有經修飾之核苷酸及未經修飾之核苷酸的混合物。
IVT反應混合物之緩衝液系統可變化。在一些實施例中，緩衝液系統含有Tris。例如，IVT反應中使用之tris的濃度可為至少10 mM、至少20 mM、至少30 mM、至少40 mM、至少50 mM、至少60 mM、至少70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少100 mM或至少110 mM磷酸鹽。在一些實施例中，磷酸鹽之濃度為20-60 mM或10-100 mM。
在一些實施例中，緩衝液系統含有二硫蘇糖醇(DTT)。例如，IVT反應中使用之DTT的濃度可為至少1 mM、至少5 mM或至少50 mM。在一些實施例中，IVT反應中使用之DTT的濃度為1-50 mM或5-50 mM。在一些實施例中，IVT反應中使用之DTT的濃度為5 mM。
在一些實施例中，緩衝液系統含有鎂。在一些實施例中，存在於IVT反應中之NTP與鎂離子(Mg
2+；
例如MgCl
2)的莫耳比為1:1至1:5。例如，NTP與鎂離子之莫耳比可為1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
在一些實施例中，存在於IVT反應中之NTP與鎂離子(Mg
2+；
例如MgCl
2)的莫耳比為1:1至1:5。例如，NTP與鎂離子之莫耳比可為1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
在一些實施例中，緩衝液系統含有Tris-HCl、亞精胺(
例如，濃度為1–30 mM)、TRITON
®X-100 (聚乙二醇對(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯醚)及/或聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，IVT方法進一步包括使
活體外轉錄產物(
例如，mRNA)與其他反應組分分離(
例如，純化)之步驟。在一些實施例中，分離包括對IVT反應混合物進行層析。在一些實施例中，該方法包括逆相層析。在一些實施例中，該方法包括逆相管柱層析。在一些實施例中，層析包括基於尺寸(
例如，基於長度)之層析。在一些實施例中，該方法包括尺寸排阻層析。在一些實施例中，層析包括oligo-dT層析。
非轉譯區
非翻譯區(UTR)係核酸中在起始密碼子(5′ UTR)之前且在終止密碼子(3′ UTR)之後的未轉譯之部分。在一些實施例中，包含編碼一或多種蛋白質或肽之開放閱讀框(ORF)的本揭示案之核酸(
例如核糖核酸(RNA)，
例如信使RNA (mRNA))進一步包含一或多個UTR (
例如，5′ UTR或其功能片段、3′ UTR或其功能片段或其組合)。
UTR可與核酸中之編碼區同源或異源。在一些實施例中，UTR與編碼一或多種肽抗原決定基之ORF同源。在一些實施例中，UTR與編碼一或多種肽抗原決定基之ORF異源。在一些實施例中，核酸包含兩個或更多個5′ UTR或其功能片段，其中每一者均具有相同或不同的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸包含兩個或更多個3′ UTR或其功能片段，其中每一者均具有相同或不同的核苷酸序列。
在一些實施例中，對5′ UTR或其功能片段、3′ UTR或其功能片段或其任何組合進行序列最佳化。
在一些實施例中，5′ UTR或其功能片段、3′ UTR或其功能片段或其任何組合包含至少一種經化學修飾之核鹼基，
例如5-甲氧基尿嘧啶。
UTR可具有提供調節作用(
例如，增加或降低之穩定性、定位及/或轉譯效率)之特徵。可將包含UTR之核酸投與細胞、組織或生物體，且可使用常規方法來量測一或多種調節特徵。在一些實施例中，5′ UTR或3′ UTR之功能片段分別包含全長5′或3′ UTR之一或多種調節特徵。
天然5′ UTR具有在轉譯起始中起作用之特徵。其具有類似Kozak序列之印記，該等印記通常已知參與核糖體起始多種基因之轉譯的過程。亦已知5′ UTR形成參與延伸因子結合之二級結構。
藉由工程改造特定標靶器官之大量表現基因中通常可見的特徵，可增強核酸之穩定性及蛋白質產生。例如，引入肝臟表現之mRNA (諸如白蛋白、血清澱粉樣蛋白A、載脂蛋白A/B/E、轉鐵蛋白、甲型胎兒蛋白、紅血球生成素或因子VIII)的5′ UTR可增強核酸在肝細胞株或肝臟中之表現。同樣，對於肌肉(
例如MyoD、肌凝蛋白、肌紅蛋白、肌細胞生成素、Herculin)、內皮細胞(
例如Tie-1、CD36)、骨髓細胞(
例如C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)、白血球(
例如CD45、CD18)、脂肪組織(
例如CD36、GLUT4、ACRP30、脂聯素)以及肺上皮細胞(
例如SP-A/B/C/D)，有可能使用來自其他組織特異性mRNA之5′ UTR來改良彼組織中之表現。
在一些實施例中，UTR選自其蛋白質共享共同功能、結構、特徵或特性之轉錄本家族。例如，編碼多肽可屬於蛋白質家族(
亦即，共享至少一種功能、結構、特徵、定位、起源或表現模式)，該等蛋白質在特定細胞、組織中或在發育期間之某一時間表現。來自任何基因或mRNA之UTR均可與相同或不同蛋白質家族之任何其他UTR交換，以產生新的核酸。
在一些實施例中，5′ UTR及3′ UTR可為異源的。在一些實施例中，5′ UTR可源自與3′ UTR不同之物種。在一些實施例中，3′ UTR可源自與5′ UTR不同之物種。
國際專利申請案第PCT/US2014/021522號(公開案第WO/2014/164253號)提供可在本揭示案之核酸中用作ORF之側接區的例示性UTR之清單。本公開案出於此目的以引用之方式併入本文中。
可用於本揭示案之核酸的額外例示性UTR包括但不限於源自以下核酸序列之一或多個5′ UTR及/或3′ UTR：球蛋白，諸如α-或β-球蛋白(
例如非洲爪蟾、小鼠、兔或人類球蛋白)；強Kozak轉譯起始信號；CYBA (
例如人類細胞色素b-245 α多肽)；白蛋白(
例如人類白蛋白7)；HSD17B4 (羥基類固醇(17-β)去氫酶)；病毒(
例如菸草蝕刻病毒(TEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、登革熱病毒、巨細胞病毒(CMV；
例如CMV即刻早期1 (IE1))、肝炎病毒(
例如B型肝炎病毒)、辛德比斯病毒或PAV大麥黃矮病毒)；熱休克蛋白(
例如hsp70)；轉譯起始因子(
例如elF4G)；葡萄糖轉運蛋白(
例如hGLUT1 (人類葡萄糖轉運蛋白1))；肌動蛋白(
例如人類α或β肌動蛋白)；GAPDH；微管蛋白；組蛋白；檸檬酸循環酶；拓撲異構酶(
例如缺乏5′ TOP基序(寡嘧啶束)之TOP基因的5′ UTR)；核糖體蛋白Large 32 (L32)；核糖體蛋白(
例如人類或小鼠核糖體蛋白，例如rps9)；ATP合酶(
例如ATP5A1或粒線體H
+-ATP合酶之β次單元)；生長激素 (
例如牛(bGH)或人類(hGH))；延伸因子(
例如延伸因子1 α1 (EEF1A1))；錳超氧化物歧化酶(MnSOD)；肌細胞增強因子2A (MEF2A)；β-F1-ATP酶、肌酸激酶、肌紅蛋白、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)；膠原蛋白(
例如I型膠原蛋白α2 (Col1A2)、I型膠原蛋白α1 (Col1A1)、VI型膠原蛋白α2 (Col6A2)、VI型膠原蛋白α1 (Col6A1))；核糖體結合蛋白(
例如核糖體結合蛋白I (RPNI))；低密度脂蛋白受體相關蛋白(
例如LRP1)；心肌營養素樣細胞介素因子(
例如Nnt1)；鈣網蛋白(Calr)；前膠原蛋白-離胺酸-2-側氧基戊二酸-5-雙加氧酶1 (Plod1)；及核結合蛋白(
例如Nucb1)。
在一些實施例中，5′ UTR選自由以下組成之群：β-球蛋白5′ UTR；含有強Kozak轉譯起始信號之5′ UTR；細胞色素b-245 α多肽(CYBA) 5′ UTR；羥基類固醇(17-β)去氫酶(HSD17B4) 5′ UTR；菸草蝕刻病毒(TEV) 5′ UTR；委內瑞拉馬腦炎病毒(TEEV) 5′ UTR；編碼非結構蛋白之德國麻疹病毒(RV) RNA的5′ 近端開放閱讀框；登革熱病毒(DEN) 5′ UTR；熱休克蛋白70 (Hsp70) 5′ UTR；eIF4G 5′ UTR；GLUT1 5′ UTR；其功能片段及其任何組合。
在一些實施例中，3′ UTR選自由以下組成之群：β-球蛋白3′ UTR；CYBA 3′ UTR；白蛋白3′ UTR；生長激素(GH) 3′ UTR； VEEV 3′ UTR；B型肝炎病毒(HBV) 3′ UTR；α-球蛋白3′ UTR；DEN 3′ UTR；PAV大麥黃矮病毒(BYDV-PAV) 3′ UTR；延伸因子1 α1 (EEF1A1) 3′ UTR；錳超氧化物歧化酶(MnSOD) 3′ UTR；粒線體H(+)-ATP合酶之β次單元(β-mRNA) 3′ UTR；GLUT1 3′ UTR；MEF2A 3′ UTR；β-F1-ATP酶3′ UTR；其功能片段及其組合。
源自任何基因或mRNA之野生型UTR均可併入本揭示案之核酸中。在一些實施例中，
例如，可藉由改變UTR相對於ORF之方向或位置；或藉由額外核苷酸包括、核苷酸缺失、核苷酸交換或轉座，相對於野生型或原生UTR改變UTR以產生變異體UTR。在一些實施例中，可使用5′或3′ UTR之變異體，例如野生型UTR之突變體，或其中一或多個核苷酸添加至UTR之末端或自UTR之末端移除的變異體。
另外，一或多個合成UTR可與一或多個非合成UTR組合使用。
參見例如Mandal及Rossi,
Nat. Protoc. 2013 8(3):568-82，及可在www.addgene.org上獲得之序列，每一者之內容均以引用之方式整體併入本文中。UTR或其部分可以與其中選出該等UTR或其部分之轉錄本中相同的方向置放，或可改變方向或位置。因此，5′及/或3′ UTR可倒置、縮短、加長或與一或多個其他5′ UTR或3′ UTR組合。
在一些實施例中，核酸可包含多個UTR，
例如雙重、三重或四重5′ UTR或3′ UTR。例如，雙重UTR包含同一UTR之兩個複本，該等複本為串聯或實質上串聯的。例如，可使用雙重β-球蛋白3′ UTR (參見例如US2010/0129877，其內容出於此目的以引用之方式併入本文中)。
本揭示案之核酸可包含特徵之組合。例如，ORF可側接5′ UTR，其包含強Kozak轉譯起始信號；及/或3′ UTR，其包含用於模板化添加聚A尾之oligo(dT)序列。5′ UTR可包含來自相同及/或不同UTR之第一核酸片段及第二核酸片段(參見
例如US2010/0293625，出於此目的以引用之方式整體併入本文中)。
其他非UTR序列可用作本揭示案之核酸內的區域或亞區。例如，內含子或內含子序列之部分可併入本揭示案之核酸中。內含子序列之併入可增加蛋白質產生以及核酸表現水準。在一些實施例中，替代UTR或除了UTR以外，本揭示案之核酸包含內部核糖體進入位點(IRES) (參見
例如Yakubov等人, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010 394(1):189-193，其內容以引用之方式整體併入本文中)。在一些實施例中，核酸包含IRES來替代5′ UTR序列。在一些實施例中，核酸包含位於5′ UTR與開放閱讀框之間的IRES。在一些實施例中，核酸包含編碼病毒衣殼序列之ORF。在一些實施例中，核酸包含合成5′ UTR與非合成3′ UTR之組合。
在一些實施例中，UTR亦可包括至少一種轉譯增強子核酸、轉譯增強子元件(translation enhancer element/translational enhancer elements) (統稱為「TEE」，其係指增加由聚核苷酸產生之多肽或蛋白質的量之核酸序列)。作為非限制性實例，TEE可包括US2009/0226470 (出於此目的以引用之方式整體併入本文中)中所述之彼等，以及此項技術中已知之其他TEE。作為非限制性實例，TEE可位於轉錄啟動子與起始密碼子之間。在一些實施例中，5′ UTR包含TEE。在一態樣中，TEE為UTR中之保守元件，其可促進核酸之轉譯活性，諸如但不限於帽依賴性或帽非依賴性轉譯。在一非限制性實例中，TEE包含在Gtx同源域蛋白之5′-前導中的TEE序列。參見
例如Chappell等人,
PNAS.2004. 101:9590-9594，出於此目的以引用之方式整體併入本文中。
聚(A)尾
本揭示案之態樣係關於產生含有一或多個聚A尾之RNA的方法。「聚A尾」係mRNA中在開放閱讀框及/或3′ UTR下游，
例如直接下游(
亦即，3′)之區域，其含有多個連續的單磷酸腺苷。聚A尾可含有10至300個單磷酸腺苷。例如，聚A尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個單磷酸腺苷。在一些實施例中，聚A尾含有50至250個單磷酸腺苷。在相關生物學設定中(
例如，在細胞中、
在活體內等)，聚(A)尾用於保護mRNA免於酶促降解(
例如在細胞質中)，且有助於轉錄終止、mRNA自細胞核中輸出以及轉譯。
如本文所用，「聚A加尾效率」係指相對於使用輸入DNA之IVT反應中產生的mRNA之總數，藉由使用輸入DNA之IVT反應產生的具有聚A尾之mRNA之量(
例如，以百分率表述)。IVT反應之聚A加尾效率可變化，例如取決於所使用之RNA聚合酶、所使用之輸入DNA的量或純度等。在一些實施例中，IVT反應之聚A加尾效率大於85%、90%、95%或99.9%。計算聚A加尾效率之方法為已知的，例如藉由管柱層析(
例如oligo-dT層析)來確定相對於IVT反應中產生的總mRNA，含有聚A尾之mRNA之量。
在一些實施例中，藉由本文所述之方法產生的RNA組合物中之至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9% RNA包含聚A尾。在一些實施例中，藉由本文所述之方法產生的RNA組合物中之至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之各RNA包含聚A尾。效率(
例如，RNA組合物中含有聚A尾之RNA的百分率可i)在IVT反應之後及純化之前量測，或ii)在RNA組合物已經純化(
例如藉由層析，諸如oligo-dT層析)之後量測。
獨特聚A尾長度為本揭示案之核酸提供某些優勢。通常，當存在聚A尾時，其長度大於30個核苷酸長。在另一實施例中，聚A尾大於35個核苷酸長(
例如，至少或大於約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500或3,000個核苷酸)。
在一些實施例中，聚A尾係相對於整個核酸之長度或核酸之特定區域的長度而經設計。此設計可基於編碼區之長度、特定特徵或區域之長度或基於自核酸表現之最終產物的長度。
在此情況下，聚A尾之長度可比核酸或其特徵大10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%。聚A尾亦可經設計為其所屬核酸之一部分。在此情況下，聚A尾可為構築體之總長度、構建體區域或構築體之總長度減去聚A尾之10、20、30、40、50、60、70、80或90%或更高。此外，針對聚A結合蛋白之經工程改造之結合位點及核酸結合可增強表現。
mRNA組合物
本揭示案之一些態樣提供包含藉由任何本文所述之方法產生的RNA之組合物。在一些實施例中，藉由該方法產生之RNA組合物中的蛋白質之濃度為0.8% (% w/w) 或更低、0.6%或更低、0.4%或更低或0.2%或更低。量測樣品中之蛋白質之量的方法包括比色分析(
例如Bradford分析)、光譜法、ELISA、聚丙烯醯胺凝膠電泳電泳圖分析及層析分析。參見
例如Sapan等人
Biotechnol Appl Biochem. 1999. 29(2):99–108。在一些實施例中，RNA組合物中之蛋白質的濃度為0.8%或更低。在一些實施例中，RNA組合物中之蛋白質的濃度為0.6%或更低。在一些實施例中，RNA組合物中之蛋白質的濃度為0.5%或更低。在一些實施例中，RNA組合物中之蛋白質的濃度為0.4%或更低。在一些實施例中，RNA組合物中之蛋白質的濃度為0.3%或更低。在一些實施例中，RNA組合物中之蛋白質的濃度為0.2%或更低。
在一些實施例中，任何本文所述之組合物的RNA均為mRNA。在一些實施例中，RNA組合物之至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%之mRNA分子包含聚(A)尾。確定包含聚(A)尾之mRNA之頻率的方法包括基於qRT-PCR之方法及層析方法。例如，可藉由高效液相層析(HPLC)來分析包含mRNA之組合物，這將產生對應於無尾RNA之峰及對應於加尾RNA之峰。可比較該等峰之相對高度以確定該組合物中之加尾及無尾RNA的相對量。在一些實施例中，至少50%之mRNA分子包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少60%之mRNA分子包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少70%之mRNA分子包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少80%之mRNA分子包含聚(A)尾。在一些實施例中，至少90%之mRNA分子包含聚(A)尾。
在本文所述之組合物的一些實施例中，RNA在脂質奈米粒子中進行調配。脂質奈米粒子通常包含胺基脂質、非陽離子脂質、結構脂質及PEG脂質組分以及所關注之核酸貨物。脂質奈米粒子可使用此項技術中一般已知之組分、組合物及方法來產生，參見例如PCT/US2016/052352；PCT/US2016/068300；PCT/US2017/037551；PCT/US2015/027400；PCT/US2016/047406；PCT/US2016/000129；PCT/US2016/014280；PCT/US2017/038426；PCT/US2014/027077；PCT/US2014/055394；PCT/US2016/052117；PCT/US2012/069610；PCT/US2017/027492；PCT/US2016/059575；PCT/US2016/069491；PCT/US2016/069493；及PCT/US2014/066242，其均以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，脂質奈米粒子包含可離子化胺基脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子進一步包含：非陽離子脂質；甾醇；及經聚乙二醇(PEG)修飾之脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含：40-55 mol%之可離子化胺基脂質；5-15 mol%之非陽離子脂質；35-45 mol%之甾醇；及1-5 mol%的經PEG修飾之脂質。
在一些態樣中，本揭示案係關於一種包含在脂質奈米粒子中調配之mRNA的組合物，其中在脂質奈米粒子中調配之前mRNA中之蛋白質的濃度為0.8% (% w/w)或更低、0.6%或更低、0.4%或更低或0.2%或更低，且其中mRNA組合物之至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%之mRNA分子包含聚(A)尾。
實例
實例1：多管柱層析
使用多管柱連續層析(MCC)方法來純化活體外轉錄之mRNA。與使用單個較大管柱之分批層析形成對比，MCC使用多個串聯連接之管柱，從而允許將任何未由第一管柱捕獲之mRNA (穿透液)裝載至第二管柱上，防止穿透mRNA之損失，該損失原本在基於分批層析之方法中會發生。MCC方法之額外優勢在於其增加mRNA在其中oligo-dT樹脂尚未達到結合之mRNA飽和的「質傳區」中花費之時間量，且因此增加mRNA由oligo-dT樹脂主動捕獲之速率而非越過飽和oligo-dT。此外，當質傳區中之樹脂達到飽和時，結合之mRNA自管柱中溶析出來，其中管柱經溶析且移動至該系列管柱之末端，使得其稍後可捕獲額外mRNA。
多管柱層析使用容納多個管柱之機器來進行，每個管柱均能夠接收來自多個來源之一的輸入物，且將輸出液引導至另一管柱或輸出通道。自主開關系統控制每個管柱之輸入物及輸出液。先前用平衡緩衝液洗滌兩個管柱1及2，之後使含有
活體外轉錄之mRNA的輸入進料穿過管柱1。將來自管柱1之流通液引導至管柱2中，使得任何未由管柱1捕獲之mRNA將穿過管柱2而非損失(
圖 2A)。同時，用平衡緩衝液洗滌管柱3以準備將其用於mRNA捕獲。清潔先前已溶析出mRNA之管柱4以使其捕獲mRNA之能力再生。使溶析緩衝液穿過管柱5以溶析結合之mRNA，將結合之mRNA引導至「產物」收集通道中。洗滌已達到mRNA飽和之管柱6以移除雜質。
在下一步中，在管柱1已達到mRNA飽和之後，將含有mRNA之進料再引導至管柱2中，且將管柱2之輸出液引導至平衡的管柱3中(
圖 2B)。洗滌已達到mRNA飽和之管柱1以移除雜質。使最近已進行清潔之管柱4平衡以使其準備捕獲mRNA。清潔最近已溶析出mRNA之管柱5以使其mRNA結合能力再生。用溶析緩衝液沖洗最近已進行洗滌以自結合之mRNA中移除雜質之管柱6以溶析結合之mRNA，將結合之mRNA引導至收集通道中。重複此循環，直至所有輸入mRNA均已穿過管柱。除了在該製程開始時直接接收mRNA進料溶液之第一管柱外，此循環包括依序使每個管柱經受以下步驟：
(i) 平衡緩衝液(「使其平衡」)
(ii) 前一管柱之流通液，含有穿透mRNA
(iii) mRNA進料(「進料」)
(iv) 洗滌緩衝液(「洗滌」)
(v) 溶析緩衝液(「溶析」)
(vi) 清潔緩衝液(「清潔」)
在「清潔」步驟之後，將管柱移動至該系列中之最後一個位置且使其平衡，從而再次開始該循環。重複此循環，直至所有含有mRNA之進料溶液均已耗盡，且在mRNA進料溶液耗盡之後，所有管柱之溶析步驟均已完成。
表 1給出此製程之例示性概述，自初始準備步驟開始且使用六個管柱。
表 1 ： 6 個管柱之多管柱層析製程的概述。
| MCC製程之步驟(循環.步驟) | 管柱1 | 管柱2 | 管柱3 | 管柱4 | 管柱5 | 管柱6 |
| 準備 | 平衡溶液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | 儲存溶液 |
| 1.1 | mRNA之進料溶液 | 管柱1流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 |
| 1.2 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱2流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 |
| 1.3 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱3流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 |
| 1.4 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱4流通液 | 平衡溶液 |
| 1.5 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱5流通液 |
| 1.6 | 管柱6流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 |
| 2.1 | mRNA之進料溶液 | 管柱1流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 |
| 2.2 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱2流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 |
| 2.3 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱3流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 |
| 2.4 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱4流通液 | 平衡溶液 |
| 2.5 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱5流通液 |
| 2.6 | 管柱6流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 |
| 3.1 | mRNA之進料溶液 | 管柱1流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 |
| … | 重複直至mRNA之進料溶液耗盡。 | |||||
| … | 洗滌以移除雜質，且自已在最近的溶析步驟之後與mRNA接觸之任何管柱中溶析mRNA。 |
在此製程中，監測各管柱之輸出液的UV吸光度(
圖 3)。用溶析緩衝液沖洗過的管柱預期含有mRNA，該等管柱之輸出液之吸光度很高，指示mRNA之成功捕獲及溶析。相比之下，用洗滌緩衝液沖洗過的管柱預期含有諸如蛋白質之雜質，該等管柱之吸光度相對較低，指示洗滌步驟引起極少mRNA損失。進料溶液促進mRNA之聚A尾的線性化以與oligo-dT樹脂相互作用，監測進料溶液之電導率，且顯示出維持一致水準。分析來自每次連續溶析之溶析液中含有聚A尾之mRNA分子的百分率(尾純度，
圖 4A)，以及具有預期尺寸之mRNA分子的百分率(尺寸純度，
圖 4B)。每次連續溶析均存在增加尾及尺寸純度之趨勢，指示延長之MCC製程不會導致尾或尺寸純度的損失。
實例2：多管柱層析參數之生產率分析
使多管柱層析製程之產量、生產率、尾純度及尺寸純度模型化為隨多種可調參數而變化，該等可調參數包括：負載挑戰，即添加至每個管柱中之mRNA的濃度；負載滯留時間，即mRNA進料穿過每個管柱之時間量；溶析滯留時間，即溶析緩衝液穿過每個管柱之時間量；休息步驟滯留時間，即每個管柱再生所花費的時間量；所使用之管柱的數目；以及每個管柱之尺寸。使分批及多管柱層析製程之財務及資源成本以及預期生產率模型化為隨此等參數而變化。此等分析之結果顯示於
表 2中。就針對既定量之樹脂及時間純化的mRNA而言，在較大及較小規模下，多管柱層析允許顯著改善生產率，且成本顯著降低。
表 2 ：分批及多管柱層析製程之比較生產率。
實例3：並行環迴多管柱層析
| 製程 | 分批製程 (大規模) | 多管柱製程(大規模) | 分批製程 (測試規模) | 多管柱製程(測試規模) |
| 管柱數 | 1 | 5 | 1 | 5 |
| 總dT樹脂 | 40 L | 7.85 L | 3.8 L | 0.49 L |
| 負載挑戰(mg/mL mRNA) | 2 | 3 | 2 | 3 |
| 生產率(g⋅L –1⋅h –1) | 0.73 | 6.10 | 1.62 | 6.80 |
| 相對成本($) | 1 (大規模參考) | 0.174 | 1 (測試規模參考) | 0.129 |
使用類似於實例1中所述之製程的多管柱層析方法來純化
活體外轉錄之mRNA，只是當使第一層析管柱與含有mRNA之批量進料溶液接觸時，彼管柱之輸出液經分隔且並行引導至第二層析管柱及第三層析管柱中(
圖 1)。在第一管柱實質上達到mRNA飽和之後，將進料溶液直接施加至第二管柱，且將第二管柱之輸出液並行引導至第三管柱及第四管柱中。在第二管柱實質上飽和之後，將進料溶液直接施加至第三管柱，且將第三管柱之輸出液並行引導至第四管柱及第五管柱中。因此，第三管柱接收來自兩個不同管柱之輸出液，接著將含有mRNA之進料溶液直接施加至該管柱。在使用既定管柱來結合來自進料溶液之mRNA之後，如
實例 1中所述進行洗滌、溶析、清潔及平衡步驟。重複此循環，直至所有輸入mRNA均已穿過管柱。除了在該製程開始時直接接收mRNA進料溶液之第一管柱及在直接接收進料溶液之前僅接收來自另一管柱的流通液之第二管柱外，此循環包括依序使每個管柱經受以下步驟：
(i) 平衡緩衝液(「使其平衡」)；
(ii) 第一個前一管柱之流通液，含有來自進料溶液之穿透mRNA；
(iii) 第二個前一串聯管柱之流通液，含有來自進料溶液之穿透mRNA；
(iv) mRNA進料(「進料」)；
(v) 洗滌緩衝液(「洗滌」)；
(vi) 溶析緩衝液(「溶析」)；及
(vii) 清潔緩衝液(「清潔」)。
在「清潔」步驟之後，將管柱移動至該系列中之最後一個位置且使其平衡，從而再次開始該循環。重複此循環，直至所有含有mRNA之進料溶液均已耗盡，且在mRNA進料溶液耗盡之後，含有結合之mRNA的所有管柱之溶析步驟均已完成。
表 3給出此製程之例示性概述，自初始準備步驟開始且使用七個管柱。
表 3 ： 7 個管柱之平行多管柱層析製程的概述。
| MCC製程之步驟(循環.步驟) | 管柱1 | 管柱2 | 管柱3 | 管柱4 | 管柱5 | 管柱6 | 管柱7 |
| 準備 | 平衡溶液 | 平衡溶液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | 儲存溶液 |
| 1.1 | mRNA之進料溶液 | 管柱1流通液 | 管柱1流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 |
| 1.2 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱2流通液 | 管柱2流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 |
| 1.3 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱3流通液 | 管柱3流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 |
| 1.4 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱4流通液 | 管柱4流通液 | 平衡溶液 |
| 1.5 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱5流通液 | 管柱5流通液 |
| 1.6 | 管柱6流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱6流通液 |
| 1.7 | 管柱7流通液 | 管柱7流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 |
| 2.1 | mRNA之進料溶液 | 管柱1流通液 | 管柱1流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 |
| 2.2 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱2流通液 | 管柱2流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 |
| 2.3 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱3流通液 | 管柱3流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 |
| 2.4 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱4流通液 | 管柱4流通液 | 平衡溶液 |
| 2.5 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱5流通液 | 管柱5流通液 |
| 2.6 | 管柱6流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 | 管柱6流通液 |
| 2.7 | 管柱7流通液 | 管柱7流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 | mRNA之進料溶液 |
| 3.1 | mRNA之進料溶液 | 管柱1流通液 | 管柱1流通液 | 平衡溶液 | 清潔溶液 | 溶析溶液 | 洗滌溶液 |
| … | 重複直至mRNA之進料溶液耗盡。 | ||||||
| … | 洗滌以移除雜質，且自已在最近的溶析步驟之後與mRNA接觸之任何管柱中溶析mRNA。 |
對於進料溶液之每次連續添加及溶析，分析進料溶液(負載)及溶析液(運行)中存在於進料溶液或溶析液中之殘餘蛋白質(rProtein)的量(
圖 5)。進料溶液繼續含有一些殘餘蛋白質，但溶析液中之殘餘蛋白質水準始終較低，指示MCC製程有效地自mRNA進料溶液中移除殘餘蛋白質。
對分批製程、單一環迴MCC製程(諸如實例1中所述之彼等製程)以及此實例中所述之並行環迴MCC製程進行測試以量測生產率(就每體積樹脂及單位時間純化的mRNA而言)，以及產量百分率。在一些單一環迴MCC製程及所有並行環迴MCC製程中，用高鹽緩衝液補充mRNA進料溶液以增加鹽濃度，接著將進料溶液施加至管柱上。此等實驗之結果顯示於
表 4中。如同單一環迴MCC製程，並行環迴MCC製程相對於分批層析製程顯著改善生產率及產量。當mRNA進料溶液含有大量mRNA時，並行環迴MCC之益處最為顯著，因為相對於相同條件下之單一環迴MCC，在7.94之負載挑戰下並行環迴MCC純化使生產率增加20%且使產量百分比增加64%。此等結果指示，並行環迴MCC允許自濃縮之進料溶液中有效純化mRNA，這可更有效地使每個層析管柱達到飽和，其中多個管柱並行捕獲穿透mRNA，從而防止在其他情況下在單一或分批製程中可發生之mRNA損失，由此維持產量百分比。
表 4 ：分批、單一環迴 MCC 及並行環迴 MCC 製程之比較生產率。
實例 4 ： dT 層析製程之強化
| 製程 | mRNA負載挑戰(g/L) | NaCl (mM) | 循環時間(min) | 生產率(g⋅L –1⋅h –1) | %產量 |
| 分批 | 1.80 | 100 | 57.4 | 1.7 | 92.0% |
| 分批(高鹽) | 5.00 | 500 | 78.0 | 3.1 | 79.9% |
| 單一環迴MCC | 3.00 | 100 | 54.9 | 4.4 | 75.2% |
| 單一環迴MCC製程1 (高鹽) | 5.50 | 350 | 64.9 | 4.7 | 82.4% |
| 並行環迴MCC製程1 (高鹽) | 5.50 | 350 | 73.2 | 3.77 | 88.5% |
| 單一環迴MCC製程2 (高鹽) | 7.94 | 300 | 54.9 | 3.5 | 41.2% |
| 並行環迴MCC製程2 (高鹽) | 7.94 | 300 | 73.2 | 4.2 | 67.4% |
分析IVT反應規模與用於自IVT反應中純化mRNA之oligo-dT層析製程之參數之間的關係。隨著IVT反應按比例增加，oligo-dT層析製程需要日益增大之管柱來支持額外mRNA之結合及日益增大之緩衝液體積來支持層析(
圖 5A)。此外，必須使與oligo-dT管柱結合之mRNA溶析至更大體積中(
圖 5A)。對更大溶析體積之此需求快速變為速率限制性的，從而阻礙自更大規模之IVT反應中純化mRNA。然而，藉由增加oligo-dT管柱之結合能力來加強oligo-dT層析製程會減少所需之管柱尺寸(
圖 5B)、緩衝液體積(
圖 5C)及溶析體積(
圖 5D)。此等減少中之每一者均改善oligo-dT層析製程之效率，從而允許在不過度影響mRNA純化的情況下按比例增加IVT反應。
分析鹽濃度對mRNA與oligo-dT管柱之結合能力及經溶析mRNA之純度的影響。增加鹽濃度以線性方式改善mRNA與oligo-dT管柱之靜態及動態結合能力(
圖 7A)。令人驚訝的是，此改善不會影響含有聚(A)尾或具有預期長度之經溶析mRNA的百分率，指示增加鹽濃度會促進mRNA與oligo-dT管柱之結合，而不會對mRNA純度產生不利影響。
因為增加溶液中之一種溶質(
例如氯化鈉)的濃度可能導致其他溶質(
例如核酸)沈澱，故分析鹽濃度與mRNA溶解度之間的關係。將不同濃度之氯化鈉添加至含有規定量之mRNA的溶液中，且在25℃下培育1小時，或在4℃下培育隔夜。隔夜培育使mRNA超過閾限值0.5 mg/mL以自溶液中沈澱(
圖 7B)。然而，無論鹽濃度如何，在室溫下短暫培育期間，mRNA沈澱可忽略不計(
圖 7C)。此等結果指示，增加之鹽濃度需要時間來引起mRNA沈澱。因此，在將mRNA混合物添加至oligo-dT管柱中之前不久增加其鹽濃度會促進mRNA與管柱之結合，而不會導致不想要的沈澱。因此，增加鹽濃度可用於增加管柱之動態結合能力，由此改善oligo-dT層析製程之效率。如
表 5-6所示，在將mRNA組合物添加至oligo-dT樹脂中之前添加高鹽緩衝液會使自組合物中純化mRNA所需的總處理時間或管柱體積及因此oligo-dT樹脂體積分別減少46%至56%。在該兩種情況下，此改善之效率會增加mRNA純化之生產率，以(質量)⋅(固定相體積)
–1⋅(時間)
–1(
例如g⋅L
–1⋅h
–1)表述。此外，oligo-dT層析之鹽強化使純化mRNA所需的緩衝液之量減少52%–68%。
表 5 ：使用鹽強化之 Oligo-dT 層析製程 1 。
表 6 ：使用鹽強化之 Oligo-dT 層析製程 2 。
等效形式及範圍
| 製程1 | 使用500 mM NaCl之製程1 (同一管柱) | 使用500 mM NaCl之製程1 (較小管柱) | |
| 管柱直徑(cm) | 45 | 45 | 30 |
| 層析循環持續時間(min) | 57.4 | 80.7 | 78.2 |
| 循環次數 | 11 | 4 | 10 |
| 層析持續時間(h) | 11.3 | 6.1 | 13.8 |
| 所用之緩衝液(L) | 3125 | 1306 | 1315 |
| 製程2 | 使用500 mM NaCl之製程2 (同一管柱) | 使用500 mM NaCl之製程2 (較小管柱) | |
| 管柱直徑(cm) | 45 | 45 | 30 |
| 層析循環持續時間(min) | 68.5 | 69.9 | 72.1 |
| 循環次數 | 11 | 4 | 10 |
| 層析持續時間(h) | 12.8 | 6.6 | 12.8 |
| 所用之緩衝液(L) | 4119 | 1849 | 1311 |
儘管本文已描述且說明若干本發明實施例，但熟習此項技術者將容易設想用於執行功能及/或獲得結果及/或一或多種本文所述之優勢的多種其他手段及/或結構，且此類變化及/或修改中之每一者均應視為在本文所述之本發明實施例的範圍內。更一般而言，熟習此項技術者將容易瞭解，本文所述之所有參數、尺寸、材料及組態均意欲為例示性的，且實際參數、尺寸、材料及/或組態將取決於使用本發明教示之一或多種特定應用。熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述之特定本發明實施例之許多等效形式。因此，應理解，前述實施例僅藉助實例呈現，且在隨附申請專利範圍及其等效形式之範圍內，本發明實施例可不同於如特定描述及主張之方式來實踐。本揭示案之本發明實施例係有關本文所述之每一個別特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法。另外，若此類特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法不相互矛盾，則兩個或更多個此類特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法之任何組合均包括於本揭示案之發明範圍內。
應理解，如本文所定義且使用之所有定義均優先於字典定義、以引用方式併入之文件中之定義及/或所定義術語之通常含義。
本文所揭示之所有參考文獻、專利及專利申請案就各自所列舉之標的物而言均以引用的方式併入，該標的物在一些情形下可涵蓋文件之全部。
除非明確指示相反情形，否則如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用之不定冠詞「一種/個(a/an)」應理解為意指「至少一種/個」。
如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用，片語「及/或」應理解為意指如此結合之要素中之「任一者或兩者」，亦即，在一些情形下以結合方式存在且在其他情形下以分離方式存在之要素。以「及/或」列示之多個要素應以相同方式解釋，亦即，如此結合之要素中之「一或多者」。除由「及/或」子句特定鑑別之要素以外，可視情況存在其他要素，無論與特定鑑別之彼等要素相關抑或不相關。因此，作為非限制性實例，當與諸如「包含」之開放式語言聯合使用時，對「A及/或B」之提及在一些實施例中可指僅A (視情況包括除B以外之要素)；在另一實施例中，可指僅B (視情況包括除A以外之要素)；在另一實施例中，可指A及B兩者(視情況包括其他要素)；等。如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用，「或」應理解為具有與如上文所定義之「及/或」相同之含義。舉例而言，在分離清單中之項目時，「或」或「及/或」應解釋為包括性的，亦即，包括多個要素或要素清單中之至少一者(而且包括一者以上)及視情況存在的其他未列示之項目。只有術語明確地指示相反情形，諸如「......中之僅一者」或「......中之恰好一者」或在用於申請專利範圍中時，「由......組成」將指包括多個要素或要素清單中之恰好一個要素。一般而言，當前面有排他性術語(諸如「任一」、「......中之一者」、「......中之僅一者」或「......中之恰好一者」)時，如本文所用之術語「或」應僅解釋為指示排他性替代選擇(亦即，「一者或另一者但非兩者」)。當在申請專利範圍中使用時，「基本上由......組成」應具有其在專利法領域中所用之通常含義。
如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用，關於一或多個要素之清單之片語「至少一個」應理解為意指至少一個選自要素清單中之任一或多個要素之要素，但未必包括要素清單內特定列示之每一個要素中的至少一者，且不排除要素清單中要素之任何組合。此定義亦容許可視情況存在除片語「至少一個」所指之要素清單內特定鑑別之要素以外之要素，無論與特定鑑別之彼等要素相關抑或不相關。因此，作為非限制性實例，「A及B中之至少一者」(或等效地，「A或B中之至少一者」，或等效地，「A及/或B中之至少一者」)在一些實施例中可指至少一個(視情況包括一個以上) A而不存在B (且視情況包括除B以外之要素)；在另一實施例中，可指至少一個(視情況包括一個以上) B而不存在A (且視情況包括除A以外之要素)；在另一實施例中，可指至少一個(視情況包括一個以上) A及至少一個(視情況包括一個以上) B (且視情況包括其他要素)；等。每一種可能性代表本發明之單獨實施例。
應理解，除非明確指示相反情形，否則本說明書中關於數值及數值範圍之揭示內容包括i)所規定之精確值或範圍，及ii)「約」為所規定之值或範圍之值(
例如，落入合理範圍內的值或範圍(
例如，約10%相似))，如熟習此項技術者應理解。
亦應理解，除非明確指示相反情形，否則在本文所揭示之包括一個以上步驟或動作之任何方法中，該方法之步驟或動作的次序未必受限於揭示該方法之步驟或動作時的次序。
在申請專利範圍中以及在上文說明書中，所有過渡性片語(諸如「包含」、「包括」、「攜帶」、「具有」、「含有」、「涉及」、「容納」、「由......構成」及其類似片語)均應理解為開放式的，亦即意指包括但不限於。如美國專利局專利審查程序手冊(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures)第2111.03節中所陳述，僅過渡性片語「由......組成」及「基本上由......組成」應分別為封閉式或半封閉式過渡性片語。
圖 1顯示單一環迴與並行環迴製程之比較。外圓係指管柱之輸入物，而內圓係指彼輸入物離開管柱之後引導其到達之處。HSW=高鹽洗滌液；LSW=低鹽洗滌液；FT=流通液。
圖 2A-2B顯示用於進行mRNA之多管柱層析的裝置及其操作模式。
圖 2A描述多管柱層析製程中的第一步，其中將含有mRNA之進料溶液添加至管柱1中，將來自管柱1之穿透液引導至管柱2中，使管柱3達到平衡以準備結合mRNA，清潔管柱4以使其結合mRNA的能力再生，將mRNA自管柱5溶析至產物收集腔室中，且洗滌管柱6以移除雜質。
圖 2B描述多管柱層析製程中之第二步，其中將含有mRNA之進料溶液添加至管柱2中，將來自管柱2之穿透液引導至管柱3中，使管柱4達到平衡以準備結合mRNA，清潔管柱5以使其結合mRNA的能力再生，且將mRNA自管柱6溶析至產物收集腔室中。
圖 3顯示在整個多管柱層析製程中對管柱之輸出液的UV吸光度及進料溶液之電導率的監測。綠線指示預期含有mRNA之輸出液的吸光度，黃線指示預期含有廢棄產物之輸出液的吸光度，且紅線指示電導率。
圖 4A-4B顯示在多管柱層析製程中自連續管柱收集之mRNA的純度分析。
圖 4A顯示含有聚A尾之mRNA的百分率。
圖 4B顯示具有預期長度之mRNA的百分率。
圖 5顯示存在於施加至管柱之前(裝載)的mRNA及在來自多管柱層析製程中之管柱的連續溶析液中自管柱溶析出(運行)之mRNA中之殘餘蛋白質(rProtein)的量。
圖 6A-6D顯示鹽濃度對使用基於dT層析之純化時之mRNA純化效率的影響。
圖 6A顯示增加IVT反應之規模如何增加所需之緩衝液的量(正方形)、dT層析溶析體積(三角形)及mRNA純化所需之管柱內徑(ID，倒三角形)。
圖 6B-6D顯示加強dT層析製程如何減少所需之管柱內徑(
圖 6B)、所需之緩衝液的量(
圖 6C)及經純化mRNA之溶析所需的體積(
圖 6D)。虛線指示製程中之最大管柱直徑(
圖 6A-6B)及/或最大溶析體積(
圖 6A 及圖 6D)。
圖 7A-7C顯示鹽濃度與dT層析參數之間的關係。
圖 7A顯示就具有聚(A)尾之mRNA及預期長度而言，鹽濃度與管柱靜態結合能力(SBC)、動態結合能力(DBC)及純度之間的關係。
圖 7B-7C顯示在鹽添加及在4℃下培育隔夜(
圖 7B)或在25℃下培育1小時(
圖 7C)之後，鹽濃度與mRNA溶解度之間的關係。
Claims (34)
- 一種使用至少三個能夠串聯使用之層析管柱來純化核酸的方法，該方法包括： (i)(a) 藉由使第一層析管柱之第一固定相與包含一或多種核酸之進料溶液接觸來裝載該第一層析管柱，視情況其中該一或多種核酸包含mRNA； (ii)(a) 藉由與該第一層析管柱串聯，使第二層析管柱之第二固定相與該進料溶液中已接觸該第一管柱之該第一固定相的部分接觸來裝載該第二層析管柱； (iii)(a) 使該第二固定相與該進料溶液中尚未與該第一固定相接觸之部分接觸； (iii)(b) 與該第二層析管柱串聯，使第三層析管柱之第三固定相與該進料溶液中已接觸該第二層析管柱之該第二固定相的部分接觸；及 (iv)(a)自該第一層析管柱溶析該一或多種核酸。
- 如請求項1之方法，其中該自該第一層析管柱溶析係在其中該第一層析管柱及該第二層析管柱未串聯之條件下進行的。
- 如請求項1或2之方法，其中該至少三個能夠串聯使用之層析管柱包含3、4、5、6、7、8個或更多個層析管柱。
- 如請求項3之方法，其中該第一層析管柱能夠與第八層析管柱及該第二層析管柱串聯使用；該第二層析管柱能夠與該第一層析管柱及該第三層析管柱串聯使用；該第三層析管柱能夠與該第二層析管柱及第四層析管柱串聯使用；該第四層析管柱能夠與該第三層析管柱及第五層析管柱串聯使用；該第五層析管柱能夠與該第四層析管柱及第六層析管柱串聯使用；該第六層析管柱能夠與該第五層析管柱及第七層析管柱串聯使用；且該第七層析管柱能夠與該第六層析管柱及該第八層析管柱串聯使用。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該方法進一步包括： 使最後一個層析管柱之最後固定相與該進料溶液中尚未與固定相接觸之額外部分接觸；及 與該最後一個層析管柱串聯，使該第一層析管柱之該第一固定相與該進料溶液之該額外部分中已接觸該最後一個層析管柱之該最後固定相的部分接觸。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中每個層析管柱之輸出液未經引導至超過一個其他層析管柱。
- 如請求項1至5中任一項之方法，該方法進一步包括： (ii)(b) 藉由與該第一層析管柱串聯，使第三層析管柱之第三固定相與該進料溶液中已接觸該第一管柱之該第一固定相的部分接觸，與該第二層析管柱並聯地裝載該第三層析管柱。
- 一種使用至少四個層析管柱來純化核酸之方法，其中每個管柱能夠與兩個或更多個其他管柱串聯及並聯使用，該方法包括： (i) 藉由使第一層析管柱之第一固定相與包含一或多種核酸之進料溶液接觸來裝載第一層析管柱，視情況其中該一或多種核酸為mRNA； (ii) 藉由與該第一層析管柱串聯，使(a)第二層析管柱之第二固定相與該進料溶液中已接觸該第一層析管柱之該第一固定相的第一部分接觸，及使(b)第三層析管柱之第三固定相與該進料溶液中已接觸該第一層析管柱之該第一固定相的第二部分接觸，並聯地裝載該第二層析管柱及該第三層析管柱； (iii) 藉由使該第二固定相與該進料溶液中尚未與該第一固定相接觸之部分接觸來裝載該第二層析管柱； (iv) 藉由與該第二層析管柱串聯，使(a)該第三層析管柱之該第三固定相與該進料溶液中已接觸該第二層析管柱之該第二固定相的第一部分接觸，及使(b) 第四層析管柱之第四固定相與該進料溶液中已接觸該第二層析管柱之該第二固定相的第二部分接觸，並聯地裝載該第三層析管柱及該第四層析管柱；及 (iv)(a) 自該第一層析管柱溶析該一或多種核酸。
- 如請求項8之方法，其中該進料溶液中已接觸該第一層析管柱之該第一固定相的該第一部分大致等於該進料溶液中已接觸該第一層析管柱之該第一固定相的該第二部分。
- 如請求項8或9之方法，其中該至少四個層析管柱包含4、5、6、7、8、9、10個或更多個層析管柱。
- 如請求項8至10中任一項之方法，其中每個層析管柱之輸出液能夠經引導至2、3、4、5、6、7或8個其他層析管柱中。
- 如請求項11之方法，其中該至少四個管柱包含8個層析管柱，其中： i) 該第一層析管柱能夠與並聯之該第二層析管柱及該第三層析管柱串聯使用； ii) 該第二層析管柱能夠與並聯之該第三層析管柱及該第四層析管柱串聯使用； iii) 該第三層析管柱能夠與並聯之該第四層析管柱及第五層析管柱串聯使用； iv) 該第四層析管柱能夠與並聯之該第五層析管柱及第六層析管柱串聯使用； v) 該第五層析管柱能夠與並聯之該第六層析管柱及第七層析管柱串聯使用； vi) 該第六層析管柱能夠與並聯之該第七層析管柱及第八層析管柱串聯使用； vii) 該第七層析管柱能夠與並聯之該第八層析管柱及該第一層析管柱串聯使用；且 viii) 該第八層析管柱能夠與並聯之該第一層析管柱及該第二層析管柱串聯使用。
- 如請求項8至12中任一項之方法，該方法進一步包括： 使最後一個層析管柱之最後固定相與該進料溶液中尚未與固定相接觸之額外部分接觸；及 與該最後一個層析管柱串聯，並行地使(a)該第一層析管柱之該第一固定相與該額外進料溶液中已接觸該最後一個層析管柱之該最後固定相的第一部分接觸，及使(b)該第二層析管柱之該第二固定相與該進料溶液之該額外部分中已接觸該最後一個層析管柱之該最後固定相的第二部分接觸。
- 如請求項1至13中任一項之方法，其中該方法為自動化方法。
- 如請求項1至14中任一項之方法，其中每個層析管柱能夠獨立地接收來自該進料溶液、洗滌溶液、溶析溶液、清潔溶液及平衡溶液之輸入材料。
- 如請求項1至15中任一項之方法，其中該等層析管柱中之一或多者且視情況全部能夠獨立地將材料引導至串聯使用之不同層析管柱、廢物收集區及產物收集區。
- 如請求項1至16中任一項之方法，其中同時進行以下步驟：用進料溶液裝載至少一個管柱；洗滌至少一個管柱；對至少一個管柱進行溶析；清潔至少一個管柱；及使至少一個管柱平衡。
- 如請求項1至17中任一項之方法，其中該方法進一步包括： (ii)(b) 使該第一固定相與洗滌溶液接觸，其中包含該洗滌溶液之輸出液經引導至廢物收集區。
- 如請求項1至18中任一項之方法，其中該方法進一步包括： (iv)(b) 使該第一固定相與清潔溶液接觸，其中包含該清潔溶液之輸出液經引導至廢物收集區。
- 如請求項1至19中任一項之方法，其中該方法進一步包括： (iv)(c) 使該第一固定相與平衡溶液接觸，其中包含該平衡溶液之輸出液經引導至廢物收集區。
- 如請求項1至20中任一項之方法，其中該等固定相中之每一者均包含樹脂粒子。
- 如請求項1至21中任一項之方法，其中該等固定相中之每一者均包含oligo-dT。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該至少三個層析管柱合起來包含共計約0.5 L至約2 L、約2 L至約5 L、約5 L至約10 L或約10 L至約20 L之固定相。
- 如請求項1至23中任一項之方法，其中該進料溶液包含約2 mg/mL至約5 mg/mL mRNA、約2.25 mg/mL至約4 mg/mL mg/mL mRNA或約2.5 mg/mL至約3 mg/mL mRNA。
- 如請求項1至24中任一項之方法，其中該第一層析管柱之裝載包括使該第一固定相與至少2 g、至少3 g、至少4 g、至少5 g、至少6 g、至少7 g、至少8 g、至少9 g、至少10 g或更多mRNA/L存在於該第一層析管柱中之固定相接觸。
- 如請求項1至25中任一項之方法，其中該進料溶液具有約300 mM至約600 mM之鹽濃度， 視情況，其中該進料溶液具有約500 mM之鹽濃度， 視情況，其中該鹽濃度為該進料溶液中之氯化鈉的濃度。
- 如請求項1至26中任一項之方法，其中在(i)(a)之裝載之前將高鹽緩衝液添加至該進料溶液中，其中(i)(a)之裝載發生在該高鹽緩衝液之該添加之後的5分鐘或更短時間、4分鐘或更短時間、3分鐘或更短時間、2分鐘或更短時間或1分鐘或更短時間內。
- 如請求項1至27中任一項之方法，其中步驟(i)(a)之該接觸進行約2分鐘至約10分鐘、約3分鐘至約7分鐘或約5分鐘至約6分鐘。
- 如請求項1至28中任一項之方法，其中(iv)(a)或(v)(a)之溶析進行約1分鐘至約4分鐘、約1.25分鐘至約3分鐘或約1.5分鐘至約2分鐘。
- 如請求項1至29中任一項之方法，其中在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少0.25 g、至少0.5 g、至少0.75 g、至少3 g、至少4 g、至少5 g、至少6 g、至少7 g、至少8 g、至少9 g或多達10 g mRNA，視情況其中在進行該方法時每小時每公升包含於所有管柱中之固定相溶析出至少4 g mRNA。
- 如請求項1至30中任一項之方法，其中至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之經溶析mRNA包含聚A尾，視情況其中至少95%之經溶析mRNA包含聚A尾。
- 如請求項1至31中任一項之方法，其中至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之經溶析mRNA具有約相同長度，視情況其中至少85%之經溶析mRNA具有約相同長度。
- 如請求項1至32中任一項之方法，其中該進料溶液中至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%之mRNA經溶析，視情況其中該進料溶液中至少75%之mRNA經溶析。
- 如請求項1至33中任一項之方法，其中該方法之生產率為至少約0.25 g / Lh，視情況其中該方法之生產率為約0.5 g / Lh、約0.75 g / Lh、約2 g / Lh、3 g / Lh、約4 g / Lh、約5 g / Lh、約6 g / Lh、約7 g / Lh、約8 g / Lh、約9 g / Lh、約10 g / Lh或更高。
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