KR20210125536A - 접선 유동 여과에 의한 mRNA 정제 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 mRNA 분자를 정제하는 방법으로서, (Ia) 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 침전된 mRNA 분자를 정제하는 단계, (Ib) 정제된 침전된 mRNA 분자를 세척하고 용해시키는 단계, (IIa) 킬레이트제를 포함하는 용액을 사용하여 mRNA 분자를 정제하는 단계, 이어서 (IIb) 정제된 mRNA 분자를 세척하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 접선 유동 여과를 사용하여 수행되는 것인 방법을 제공한다.

Description

접선 유동 여과에 의한 mRNA 정제

본 발명은 mRNA 분자를 정제하는 방법으로서, (Ia) 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 침전된 mRNA 분자를 정제하는 단계, (Ib) 정제된 침전된 mRNA 분자를 세척하고 용해시키는 단계, (IIa) 킬레이트제를 포함하는 용액을 사용하여 mRNA 분자를 정제하는 단계, 이어서 (IIb) 정제된 mRNA 분자를 세척하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 접선 유동 여과를 사용하여 수행되는 것인 방법에 관한 것이다.

유전 정보는 세포에 데옥시리보핵산 (DNA)으로서 저장되며 필요할 때 리보핵산 (RNA)으로 전사될 수 있다. DNA와 RNA 분자는 둘 다 질소성 염기, 5개 탄소 당, 및 적어도 1개의 포스페이트 기로 이루어진 뉴클레오티드로 구성된다. 단백질 합성을 위한 유전 정보를 운반하는 mRNA 분자를 포함한 상이한 유형의 RNA 분자가 존재한다. 진핵생물에서, 이들 mRNA 분자는 미숙한 mRNA 분자로서 DNA로부터 전사되고, 예를 들어 5' 캡 및 3' 폴리아데노신 (폴리(A)) 꼬리를 부가함으로써 후속적으로 변형된다. 성숙한 mRNA 분자는 세포핵으로부터 세포질로 전달되어 단백질로 번역된다. 따라서, DNA 서열 뿐만 아니라 성숙한 mRNA 분자의 양, 안정성 및 번역 효율은 주로 세포에서 단백질 합성을 결정한다.

예를 들어, 치료 맥락에서 세포에서 원하는 단백질의 합성을 최적화하기 위해, mRNA 기반 접근법은 유망한 도구를 나타낸다. mRNA 분자의 사용은 분자가 단백질 번역을 위해 세포의 세포질에만 도입되어야 한다는 이점이 있다 (Tavernier et al., 2011, J Control Release, 150(3):238-247; Yamamoto et al., 2009, Eur J Pharm Biopharm, 71(3):484-489). 적절한 운반체 예컨대 플라스미드에 포함된 각각의 DNA 서열의 사용과 비교하여, mRNA 분자의 사용은 더욱이 덜 어렵고, 더 효율적이며, 플라스미드 또는 그의 일부가 게놈 내로 혼입되는 경우에 염색체 DNA가 변경될 상당한 위험을 피할 수 있다. mRNA 분자는 주로, 예를 들어 치료 적용에서 시험관내 전사에 의해 생성된다. 이러한 접근법은 플라스미드 DNA 자체의 선형화 또는 플라스미드 DNA로부터의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생성되는 DNA 주형을 기반으로 한다. 접근법 둘 다는 널리 확립되어 있으며 쉽게 확장될 수 있다. 그러나, 두 경우 모두에서, mRNA 분자는 하류 적용에 사용될 수 있기 전에 정제되어야 한다.

합성된 mRNA 분자의 정제는 오염물질이 특히 치료 맥락에서 대부분의 하류 적용에 부정적인 영향을 미치기 때문에 중요하다. 상이한 부산물은 mRNA 합성과 같은 하류 프로세스에서 사용되고/거나 생성된 성분과 같은 원하는 mRNA 분자를 오염시킬 수 있다. 생체내 및 시험관내 접근법 둘 다의 경우, 예를 들어 가수분해 및 부전 전사에 의해 짧은 mRNA 분자 단편이 발생할 수 있다. mRNA 분자 가수분해는 촉매 또는 효소의 존재 하에 발생할 수 있지만, 또한 자발적으로 발생할 수 있고, 각각의 mRNA 분자의 분해를 초래하므로, 가변 길이의 mRNA 분자 단편을 형성한다. 부전 전사의 경우 (예를 들어, 문헌 [Revyakin et al., 2006, Science, 314(5802):1139-1143] 참조), RNA 폴리머라제는 전사를 위해 DNA 분자에서의 각각의 프로모터 요소와 결합하고, 전사 시작 부위 주변의 DNA 이중 가닥을 풀어주며, mRNA 분자의 합성으로 시작된다. 그러나, 일부 경우에는 RNA 폴리머라제가 DNA의 프로모터 영역을 벗어나지 않지만, DNA 분자의 일부를 전사하는 동안 정지 상태를 유지한다. 풀린 DNA가 효소 내에 축적됨에 따라, RNA 폴리머라제는 전사를 위한 유전 정보가 저장된 DNA의 일부를 배출하고 1개 내지 15개 뉴클레오티드 길이의 합성된 RNA 분자를 방출한다 (예를 들어 문헌 [Goldman et al., 2009, Science, 324(5929):927-928] 참조). 예를 들어, 이러한 짧은 mRNA 분자 단편을 포함하는 제약 조성물의 투여 시 원하지 않는 면역 반응을 피하기 위해서는, 특히 치료 맥락에서 추가의 하류 적용을 위해 정제된 비-단편화 mRNA 분자를 수득하는 것이 매우 바람직하다.

침전 및 여과 뿐만 아니라 그의 조합을 포함한, mRNA 분자의 정제를 위한 상이한 접근법이 존재한다. 원하지 않는 염, 뉴클레오티드 및 단백질을 제거하기 위해, RNA 침전 기반 접근법은 예를 들어 선택 완충제에 재현탁될 수 있는 펠릿으로서 정제된 RNA 분자를 수득하기 위한 용이하고 비용 효과적인 방법을 나타낸다. 예를 들어 구아니딘 티오시아네이트 (GSCN), 암모늄 아세테이트 (NH₄OAc), 에탄올, 리튬 클로라이드 및 나트륨 아세테이트를 포함하는 상이한 용액을 침전에 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Walker and Lorsch, 2013, Methods Enzymol, 530:337-343]에 고찰됨). 다른 한편으로는, 여과 방법은 표적 분자 예컨대 mRNA 분자를 정제하기 위한 기계적 개념을 기반으로 한다. 여과의 경우, 공급물, 즉 표적 분자 예컨대 mRNA 분자를 포함하는 용액 또는 현탁액은 필터 막을 통과 또는 가로지르며, 후자는 접선 유동 여과 (TFF)로서 지칭된다.

WO 2014/152966 A1 및 WO 2015/164773 A1은 예를 들어 다양한 용액 및/또는 현탁액 용적으로 TFF를 사용하여 mRNA 분자를 정제하는 방법을 개시하고 있다. mRNA 분자는 예를 들어 우레아, GSCN 및/또는 칼륨 클로라이드를 사용하여 mRNA 분자를 침전시킴으로써 정제되고, 침전물은 여러 번 세척된다. 그러나, 두 경우 모두에서, 짧은 mRNA 단편 예컨대 부전 mRNA 분자 및/또는 가수분해 산물의 관점에서 상기 방법이 표적 mRNA 분자를 정제할 수 있는 것으로 제시되지 않는다.

WO 2016/193206 A1은 RNA를 생산하고 정제하는 방법을 개시하며, 여기서 RNA 정제는 적어도 하나의 TFF 단계를 포함하고 바람직하게는 페놀/클로로포름 추출 및/또는 DNA 및/또는 RNA 침전을 포함하는 단계는 포함하지 않는다. 더욱이, RNA 분자는 바람직하게는, 예를 들어 양이온 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피, 및/또는 역상 크로마토그래피를 사용하는 부가의 정제 단계를 적용함으로써 정제된다. 상기와 같은 문헌은 부전 mRNA 분자 및/또는 mRNA 분자 가수분해 산물의 관점에서 표적 RNA 분자의 정제를 개시하지 않는다.

WO 2018/157133 A1은 mRNA 분자의 대규모 정제 방법을 개시하고 있다. 상기 발명은 특히 깨끗하고 균질한 mRNA 분자 조성물을 제조하기 위한 교반 셀 또는 진탕 누체(Nutsche) 여과 장치의 용도에 관한 것이다. 실시예에 제시된 바와 같이, GSCN을 사용하여 mRNA 분자를 침전시키고, GSCN과 에탄올을 포함하는 용액을 사용하여 침전물을 세척한다. 흥미롭게도, 청구된 방법에 의해 수득된 mRNA 분자 조성물은 TFF를 사용하여 정제된 mRNA 분자를 포함하는 조성물과 비교되며, TFF 기반 정제만이 표적 mRNA 분자 외에 잔류 효소를 포함하는 용액을 생성하는 것으로 제시된다.

따라서, 특히 부전 mRNA 분자 및 mRNA 분자 가수분해 산물의 관점에서, 대규모로 mRNA 분자를 효율적으로 정제할 수 있는 대안적 해결책이 여전히 필요하며, 이는 GSCN과 같이 하류 적용에 문제가 될 수 있는 염의 낮은 수준을 보장하고, 쉽게 자동화될 수 있는 시스템을 사용한다.

본 출원은 청구범위에 나열된 바와 같은 실시양태를 제공함으로써 고처리량으로 정제된 mRNA 분자를 수득하기 위한 필요성에 역점을 둔다.

특히, 본 발명은 mRNA 분자를 정제하는 방법으로서, (Ia) 제1 용액을 사용하여 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 침전된 mRNA 분자를 정제하는 단계, (Ib) 제2 용액을 사용하여 단계 (Ia)로부터 수득된 정제된 침전된 mRNA 분자를 세척하고 용해시키는 단계, (IIa) 킬레이트제를 포함하는 제3 용액을 사용하여 단계 (Ib)로부터 수득된 용해된 mRNA 분자로부터 mRNA 분자를 정제하는 단계, 이어서 (IIb) 제4 용액을 사용하여 단계 (IIa)로부터 수득된 정제된 mRNA 분자를 세척하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 접선 유동 여과를 사용하여 수행되는 것인 방법에 관한 것이다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 방법은 mRNA 분자의 고도의 정제를 초래하고, 따라서 정제된 mRNA 분자를 포함하지만 mRNA 분자 가수분해 산물 및 부전 mRNA 분자는 전혀 또는 거의 포함하지 않는 용액을 생성시키는 것으로 밝혀졌다. 특히, 상기 방법을 적용함으로써, 하류 적용에 문제가 될 수 있는 mRNA 분자 가수분해 산물, 부전 mRNA 분자, 단백질 및 염이 효율적으로 제거되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 방법을 적용함으로써, 하류 적용 예컨대 제약 적용에 적합한 정제된 mRNA 분자를 포함하는 용액이 수득될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "정제하는 방법"은 정제될 표적 분자 및 표적 분자 이외의 성분을 포함하는 혼합물, 예를 들어 용액 또는 현탁액으로부터 표적 분자를 수득하는 방법을 지칭하며, 여기서 표적 분자의 농도는 상기 방법을 수행하기 전의 혼합물 내의 표적 분자의 농도와 비교하여 상기 방법을 수행한 후에 수득된 용액에서 증강되거나 증가된다. 표적 분자의 정제는 또한 표적 분자 이외의 성분을 제거하거나 또는 적어도 실질적으로 제거함으로써 상기 표적 분자의 강화로서 지칭될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 표적 분자는 mRNA 분자이다. 본원에서, 상호교환가능하게 사용되는 용어 "mRNA" 및 "mRNA 분자"는, 예를 들어 A, C, G 및/또는 U 뉴클레오티드, 즉 각각의 질소성 염기로서 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실을 포함하는 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 더욱이, mRNA 분자는 번역 동안 아미노산 서열의 합성 동안 주형으로서 사용될 수 있는 하나 이상의 코딩 서열을 함유한다. 따라서, 정제될 mRNA 분자는 바람직하게는, 코딩 서열, 즉 아미노산 서열 예컨대 단백질로 번역될 수 있고 시작 및 정지 코돈을 포함하는 서열을 포함한다. 코딩 서열은 자연적으로 발생하는 서열, 사용될 자연 서열로부터 유래된 부분적으로 또는 완전히 코돈 최적화된 서열, 또는 인공 서열일 수 있다. 코돈 최적화는 일부 경우에 주어진 아미노산에 대해 일부 종에 의해 우선적으로 사용되는 코돈이 존재함에 따라, 각각의 mRNA 분자의 번역 효율을 증가시킴으로써 단백질 발현을 최대화하기 위해 적용되는 기술을 지칭한다. 추가로, 상기 mRNA 분자는 5' 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR), 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(들) (IRES), 번역을 촉진하기 위한 하나 이상의 부가 서열, 및/또는 작용의 지속기간을 조정 및/또는 연장하기 위한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. mRNA 분자의 추가 특징은 하기에 추가로 상세히 기재되어 있다.

따라서, 용어 "mRNA"는 아미노산 서열의 발현에 적합하거나 또는 아미노산 서열 예컨대 단백질로 번역가능한 임의의 RNA 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, "mRNA 분자"는 그것을 명확히 규명하는 특성 및/또는 활성을 나타내며, 따라서 아미노산 서열 예컨대 그것을 명확히 규명하는 활성 및/또는 특성을 나타내는 상기 아미노산 서열을 갖는 단백질로 번역될 수 있는 mRNA 분자로서 이해되도록 의도된다.

본원에서, 용어 "아미노산 서열"은 임의의 종류의 아미노산 서열, 즉 각각 펩티드 결합을 통해 연결되는 2개 이상의 아미노산의 쇄를 포괄하고, 임의의 관심 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 코딩된 아미노산 서열은 적어도 5개의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 50개, 100개, 200개 또는 500개의 아미노산 길이이다. 따라서, 용어 "아미노산 서열"은 짧은 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 융합 단백질, 단백질 뿐만 아니라 그의 단편, 예컨대 공지된 단백질의 부분, 바람직하게는 기능적 부분을 포괄한다. 이들은, 예를 들어 항체를 생성하는데 유효할 수 있는 단백질의 생물학적으로 활성인 부분 또는 항원성 부분 예컨대 에피토프일 수 있다. 아미노산 서열의 기능과 관련하여, 제한은 없으며 가능한 아미노산 서열은 하기에 추가로 상세히 기재되어 있다.

대조적으로, 상기 mRNA 분자의 정제 동안 제거될 성분, 및 따라서, 표적 분자 이외의 성분은, 예를 들어 가수분해에 의해 부분적으로 또는 완전히 분해되는 mRNA 분자를 포함한다. 가수분해에 의한 분해는 랜덤 프로세스이며, 그 결과로 생성된, 본원에서 "가수분해 산물" 또는 또한 "mRNA 분자 가수분해 산물"로서 지칭되는 분해 산물은 가수분해된 mRNA 분자보다 적어도 1개의 뉴클레오티드만큼 더 짧다. 따라서, 가수분해된 mRNA 분자의 길이에 따라, 그 결과로 생성된 가수분해 산물은 예를 들어 10,000개 미만의 뉴클레오티드, 바람직하게는 5,000개 미만의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 500개 미만의 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 250개 미만의 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 170개 미만의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 120개 미만의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 제거될 성분에 대한 또 다른 예는 예를 들어 50개 미만의 뉴클레오티드, 바람직하게는 25개 미만의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 15개 미만의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있는 부전 mRNA 분자이다.

더욱이, mRNA 분자의 정제 동안 제거될 성분은 예를 들어 표적 분자의 시험관내 합성 예컨대 mRNA 분자의 시험관내 전사 동안 사용되는 성분 및/또는 표적 분자의 합성을 위한 및/또는 mRNA 분자의 전사를 위한 주형의 증폭에 사용되는 세포에 포함된 성분을 포함한다. mRNA 분자의 시험관내 전사의 경우, 이러한 성분은 예를 들어 시험관내 전사에 사용되는 단백질 예컨대 효소; 염; 이온 예컨대 마그네슘 이온; 뉴클레오시드트리포스페이트; 5' 캡 및/또는 5' 캡 유사체를 포함한 모노-, 디- 및/또는 트리포스페이트; 부전 전사체; 가수분해 산물; 완충제 예컨대 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS); 및/또는 킬레이트제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 수행된다. TFF는 정제될 mRNA 분자를 포함하는 현탁액 또는 용액이 바람직하게는 보유물에 보유되는 mRNA 분자와 함께 필터 막의 표면을 가로질러 접선 방향으로 유동하는 것을 특징으로 한다. 따라서, mRNA 분자를 정제하기 위한 TFF를 수행함으로써 시간에 따라 필터 막을 막을 수 있는 필터 케이크의 존재를 피할 수 있고, 따라서 필터 막을 사용할 수 있는 시간이 증가된다.

따라서, 본 발명에 따른 표적 분자를 정제하는 시스템은 TFF 시스템이다. TFF 시스템은 전형적으로 필터 장치 예컨대 캡슐, 카세트 및 홀더, 또는 중공 섬유 모듈, 펌프, 튜빙, 밸브 또는 클램프, 및 유체 저장소, 및 임의로 압력 게이지를 포함한다 (도 1 참조). 이러한 TFF 시스템은 높은 mRNA 분자 농도에서도 필터 막 공극을 막지 않고 연속적으로 사용될 수 있다. TFF 시스템의 사용은 정제될 mRNA 분자의 고처리량 정제를 허용하므로 유리하다.

주목할 만하게, 용어 "용액"은 통상적으로 2가지 이상의 물질의 균질한 혼합물을 지칭하며, 특히 액체 상태의 물질에 적용되지만 기체 및 고체의 용액도 가능하다. 본원에서, 용어 "용액"은 특히 본 발명에 따른 "제1 용액", "제2 용액", "제3 용액" 및 "제4 용액"의 경우에, 액체 예컨대 물, 바람직하게는 액체의 균질한 혼합물 뿐만 아니라 예를 들어 액체와 바람직하게는 용해된 염의 혼합물을 포괄한다.

본 발명에 따르면, mRNA 분자를 정제하는 방법으로서, 단계 (Ia)로서 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 침전된 mRNA 분자의 정제를 포함하는 방법이 제공된다. 상기 정제는 제1 용액을 사용하여 달성된다. 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액은 예를 들어 세포 용해 또는 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 침전된 mRNA 분자는 세포 또는 시험관내 전사 혼합물의 성분, 예컨대 단백질 및 효소를 포함한 아미노산 서열, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 완충제 성분, 및 임의로 5' 캡 및 5' 캡 유사체로부터 정제되어야 한다. 5' 캡 및 5' 캡 유사체는 예를 들어 mRNA 분자가 시험관내에서 전사되고 공동-전사적으로 5' 캡핑된 경우에 단계 (Ia)를 수행하는데 사용되는 현탁액에 포함될 수 있다. 따라서, 단계 (Ia)는 침전된 mRNA 분자로부터 시험관내 전사 혼합물로부터의 성분 또는 세포성 성분을 제거하는데 유리하다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 용액은 암모늄 아세테이트 (NH₄OAc)를 함유한다. 따라서, 침전된 mRNA 분자는 NH₄OAc를 포함하는 제1 용액을 사용하여 현탁액으로부터 정제된다. 더욱이, 제1 용액은 바람직하게는 1 내지 12의 범위, 보다 바람직하게는 1 내지 10의 범위, 보다 더 바람직하게는 3 내지 9의 범위, 가장 바람직하게는 6 내지 8의 범위의 pH를 갖는다. 따라서, 침전된 mRNA 분자는 NH₄OAc를 포함하고 1 내지 12의 범위, 바람직하게는 1 내지 10의 범위, 보다 바람직하게는 3 내지 9의 범위, 보다 더 바람직하게는 6 내지 8의 범위의 pH를 갖는 제1 용액을 사용하여 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 정제된다.

본 발명에 따라 mRNA 분자를 정제하는 방법은 단계 (Ib)로서, 제2 용액을 사용하여 상기 기재된 단계 (Ia)로부터 수득된 정제된 침전된 mRNA 분자를 세척하고 용해시키는 것을 추가로 포함한다. 상기 제2 용액은 mRNA 분자가 재현탁될 수 있고 mRNA 분자가 안정하게 유지되는, 즉 가수분해되지 않는 임의의 용액, 예를 들어 물일 수 있다. 단계 (Ib)를 수행하는 것은 특히 제1 용액의 성분을 제거하고 용해된 mRNA 분자를 수득하는데 유리하다.

본 발명의 일부 실시양태에서 제2 용액은 물이다.

본 발명에 따라 mRNA 분자를 정제하는 방법은 단계 (IIa)로서, 킬레이트제를 포함하는 제3 용액을 사용하여 단계 (Ib)로부터 수득된 용해된 mRNA 분자로부터 mRNA 분자를 정제하는 것을 추가로 포함한다. 이는 용해된 mRNA 분자를 포함하는 용액으로부터 부전 mRNA 분자 및 가수분해 산물을 제거하는데 특히 유리하다.

용어 "킬레이트제"는 양이온을 킬레이트하는 분자, 및 특히 몇 가지 요인 예컨대 pH 및/또는 온도, 킬레이트제의 농도, 및/또는 킬레이트될 양이온의 유형에 따라 배위 착물의 중심 원자와 결합할 수 있는 공여자 기를 갖는 분자를 지칭한다. 킬레이트제는 예를 들어 분자당 덴테이트의 수, 즉 공여자 기의 수 및/또는 킬레이트될 양이온에서의 배위 위치의 수로써 특징지울 수 있다. 예를 들어, 킬레이트제 EDTA는 6개의 덴테이트를 가지며 1:1 킬레이트제 2가 양이온 착물에서 2가 양이온을 킬레이트한다.

바람직하게는, 본 발명의 맥락에서, 용어 "킬레이트제"는 2가 및/또는 3가 양이온 예컨대 예를 들어 2가 마그네슘 및 칼슘 이온 및/또는 3가 철 이온을 착화할 수 있는 킬레이트제를 지칭한다. 일반적으로, 특히 2가 및/또는 3가 양이온을 효율적으로 착화한다는 관점에서, 양이온에서 4개 미만의 배위 위치를 갖는 킬레이트제는 양이온에서 4개 이상의 배위 위치를 갖는 킬레이트제와 비교하여 더 낮은 킬레이트 활성을 갖는다.

본 발명에 따른 킬레이트제는 킬레이트될 양이온에서 적어도 4개의 배위 위치를 갖는 킬레이트제, 보다 바람직하게는 킬레이트될 양이온에서 4개 초과의 배위 위치를 갖는 킬레이트제, 보다 더 바람직하게는 본원에서 "강력한 킬레이트제"로서 지칭되기도 하는, 분자당 적어도 4개의 덴테이트를 갖는 킬레이트제, 보다 바람직하게는 제약 조성물 및/또는 제형에 사용되는 킬레이트될 양이온에서 4개 초과의 배위 위치를 갖는 킬레이트제, 및 보다 더 바람직하게는 EDTA이다. 제약 조성물에 사용되는 킬레이트될 양이온에서 4개 초과의 배위 위치를 갖는 킬레이트제는 예를 들어 Na2EDTA 용액 [예를 들어, 2 g/10 ml; 예를 들어, GPU파마 게엠베하(GPUPharma GmbH) 참조] 및/또는 칼슘 디나트륨 EDTA [예를 들어, 50 mg/ml, Amp. 10 ml; 예를 들어 래보러토리즈(Laboratoires) SERB 참조]를 포함하는 안티도트(antidot)에 사용되거나, 또는 예를 들어 부형제로서 사용된다 [예를 들어 페니단(Phenhydan) 데시틴 아르즈나이미텔 게엠베하(Desitin Arzneimittel GmbH); 또는 솔루비트(Soluvit) N, 박스터(Baxter); 또는 플루이무실(Fluimucil), 잠본 게엠베하(Zambon GmbH) 참조].

따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서 킬레이트제는 EDTA이다.

바람직한 킬레이트제의 예는 가장 바람직한 킬레이트제인 EDTA와 함께 표 1에 열거되어 있다.

표 1

강력한 킬레이트제 예컨대 EDTA는 특히 2가 양이온 예컨대 마그네슘 양이온을 효율적으로 제거할 수 있다. 마그네슘 양이온은 예를 들어 mRNA 분자의 전사에 관여하는 효소에 필요하므로, 세포성 및 시험관내 전사 혼합물에 높은 수준으로 존재한다. 단계 (IIa)에서 강력한 킬레이트제 예컨대 EDTA를 사용하여 가수분해 산물 및 부전 mRNA 분자를 효율적으로 제거함으로써, mRNA 분자를 고도로 정제할 수 있는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 상기 언급된 양이온은 mRNA 분자의 2차 및 3차 구조의 형성을 지원할 수 있으며 특히 2가 양이온 예컨대 마그네슘 양이온의 제거는 mRNA 분자의 정제에 특히 관련이 있을 수 있다고 가정하는데, 이는 부전 mRNA 분자 및 가수분해 산물이 상기 양이온의 존재 하에 정제될 mRNA 분자와 결합하는 경향이 있을 수 있기 때문이다. 따라서, 단계 (IIa)에서 강력한 킬레이트제 예컨대 EDTA를 사용하여 2가 양이온을 제거함으로써 융점이 저하되고 mRNA 분자의 2차 및/또는 3차 구조가 영향을 받는 것으로 여겨진다. 따라서, 부전 mRNA 분자 및 가수분해 산물은 투과물로서 제거될 수 있다. 따라서, 단계 (IIa)는 부전 mRNA 분자 및 가수분해 산물을 제거하는데 특히 유리하다.

본 발명에 따르면, 제3 용액은 킬레이트제, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 강력한 킬레이트제, 가장 바람직하게는 EDTA를 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 주어진 킬레이트제의 착물 구축 상수가 pH에 의해 영향을 받기 때문에 킬레이트제의 착화 능력은 pH에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, EDTA는 마그네슘 이온을 킬레이트한다는 관점에서 더 높은 pH 값 예컨대 8 내지 10의 pH에서 특히 강력하다. 그러나, 주어진 킬레이트제의 착화 능력과 정제될 mRNA 분자의 안정성 간의 최적의 트레이드-오프의 관점에서 pH를 조정하는 것이 바람직하다. 이러한 맥락에서, 강력한 킬레이트제 예컨대 EDTA는 1 내지 10, 바람직하게는 6 내지 8의 pH에서 특히 2가 양이온을 효율적으로 제거할 수 있다는 것이 관찰되었다. 따라서, 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이것에 의해 특히, mRNA 분자와 결합되는 가수분해 산물 및 부전 mRNA 분자의 융점은 강력한 킬레이트제 예컨대 EDTA에 의해 저하될 수 있고, 따라서 부전 mRNA 분자 및 가수분해 산물이, 정제될 mRNA 분자의 안정성을 보존하는 값으로 동시에 조정되는 pH를 가지면서 제거될 수 있다고 가정된다.

따라서, 바람직한 실시양태에서 킬레이트제를 함유하는 제3 용액에서의 pH 값은 각각의 킬레이트제가 최적의 킬레이트 능력을 갖는 pH 값으로 조정된다.

따라서, 예를 들어, 1 내지 10의 pH , 바람직하게는 6 내지 8의 pH에서 강력한 킬레이트제 예컨대 EDTA를 사용하는 것은 2가 양이온의 효율적인 제거에 유리하며, 따라서 결과적으로 부전 mRNA 분자 및 가수분해 산물의 효율적인 제거에 유리하다. 상기 언급된 대안적인 킬레이트제 중 하나가 사용되는 경우, 상기 대안이 이온, 바람직하게는 2가 마그네슘 양이온을 제거하는데 효과적인 pH 값으로 pH를 조정하는 것이 필요할 수 있다. 상응하는 pH 범위는 바람직한 킬레이트제에 대해 상기 표에 표시되어 있다.

일부 실시양태에서, 제3 용액은 1 내지 10의 범위, 바람직하게는 3 내지 9의 범위, 보다 바람직하게는 6 내지 8의 범위의 pH를 갖는다.

제3 용액의 pH는 완충제를 사용하여 수득될 수 있다. 바람직한 완충제 (그들 각각의 pH 범위가 괄호 안에 주어짐)는 2-[비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올 (비스-트리스; pH 범위 5.8-7.2), N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산 (ADA; pH 범위 6.0-7.2), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (ACES; pH 범위 6.1-7.5), 1,4-피페라진디에탄술폰산 (PIPES; pH 범위 6.1-7.5), 2-히드록시-3-모르폴린-4-일프로판-1-술폰산 (MOPSO; pH 범위 6.2-7.6), 1,3-비스(트리스(히드록시메틸)메틸아미노)프로판 (비스-트리스 프로판; pH 범위 6.3-9.5), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES, pH 범위 6.4-7.8), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS; pH 범위 6.5-7.9), 2-[[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄술폰산 (TES; pH 범위 6.8-8.2), 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES; pH 범위 6.8-8.2), 3-(N,N-비스[2-히드록시에틸]아미노)-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO; pH 범위 7.0-8.2), 4-(N-모르폴리노)부탄술폰산 (MOBS; pH 범위 6.9-8.3), 및 3-[[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]-2-히드록시프로판-1-술폰산 (TAPSO; pH 범위 7.0-8.2)을 포함한다. 특히 바람직한 완충제는 바람직하게는 6 내지 8, 보다 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 pH를 갖는 MOPS이다.

일부 실시양태에서, 제3 용액은 1 내지 10의 범위, 바람직하게는 3 내지 9의 범위, 보다 바람직하게는 6 내지 8의 범위의 pH를 가지며, 완충제, 바람직하게는 MOPS를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제3 용액은 MOPS 완충제를 포함하고 바람직하게는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 부가하기 전에 MOPS 완충제의 pH를 조정함으로써 수득된다.

따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 특히 2가 양이온, 예컨대 마그네슘 양이온을 제거하기 위한 킬레이트제로서 바람직하게는 EDTA를 포함하는 제3 용액은 MOPS 완충제를 추가로 포함하고 6 내지 8의 pH를 갖는다. 본 발명의 일부 실시양태에서 제3 용액은 MOPS 완충제를 제조하고, 상기 MOPS 완충제의 pH를 1 내지 10, 바람직하게는 6 내지 8의 pH로 조정한 다음, 바람직한 킬레이트제로서 EDTA를 부가함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제3 용액은 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA를 포함하고 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 pH를 갖는다.

본 발명에 따라 mRNA 분자를 정제하는 방법은 단계 (IIb)로서, 제4 용액을 사용하여 단계 (IIa)로부터 수득된 정제된 mRNA 분자를 세척하는 것을 추가로 포함한다. 제4 용액은 mRNA 분자가 안정적으로 유지되는, 즉 가수분해되지 않는 임의의 용액일 수 있다. 단계 (IIb)는 예를 들어 나트륨 클로라이드 또는 시트레이트를 포함하거나 또는 물인 상기 제4 용액으로 제3 용액의 성분을 제거하는데 유리하다.

상기 언급된 바와 같이, 제2 및 제4 용액은 mRNA 분자가 안정하게 유지되는, 즉 가수분해되지 않는 임의의 용액일 수 있다. 이러한 유체는 예를 들어 물, 바람직하게는 뉴클레아제 무함유 물 또는 RNase-무함유 물 예컨대 주사용수 (WFI 수)일 수 있다. 제4 용액의 경우 그러한 유체는 추가로 예를 들어 HEPES 완충된 글루코스, 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트일 수 있다.

따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서 제4 용액은 물이다.

본 발명의 일부 실시양태에서 제2 및 제4 용액은 물이다.

본 발명의 일부 실시양태에서 제4 용액은 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제2 용액은 물이고/거나, 제4 용액은 물이거나 또는 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트를 포함한다. 이는 추가의 하류 프로세싱 또는 적용 전에 부가의 단계에서 제거되어야 하는 성분을 도입하지 않고 단계 (IIb) 후에 정제된 mRNA 분자를 포함하는 용액을 수득하는데 유리하다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 제2 용액은 물이고 제4 용액은 바람직하게는 4 내지 5의 pH에서 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트를 포함한다. 이는 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트가 바람직하게는 정제된 mRNA 분자를 포함하는 제약 조성물에 포함되기 때문에, 특히 치료상 맥락에서 매우 유리하다. 따라서, 이는 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트가 제약 조성물의 성분으로 자주 사용되기 때문에, 수득된 mRNA 분자를 제약 조성물로 후속 제형화하는 관점에서 유리하다. 따라서, 제약 조성물의 바람직한 성분인 나트륨 클로라이드 또는 시트레이트를 포함하는 제4 용액을 사용하면, 상기 mRNA 분자를 정제하고 이를 제약 조성물로 제형화하는데 필요한 단계를 시간 및 비용 효율적으로 통합할 수 있다.

제4 용액이 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트를 포함하는 경우, 제4 용액의 pH는 바람직하게는 3 내지 6, 보다 바람직하게는 3.5 내지 5.5, 보다 더 바람직하게는 4 내지 5이다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 에탄올은 상기 방법에 사용된 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 용액 중 어느 것에도 포함되지 않는다.

상기 언급된 바와 같이, 놀랍게도 본 발명에 따른 방법을 적용함으로써 mRNA 분자의 고도의 정제가 수득될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는, 상기 방법을 수행함으로써 수득된 용액은 정제된 mRNA 분자를 포함하지만 가수분해 산물 및 부전 mRNA 분자는 포함하지 않거나 매우 낮은 수준만 포함한다. 보다 바람직하게는 mRNA 분자의 백분율은 단계 (IIb) 후에 수득된 용액에서 모든 RNA 분자 (mRNA 분자, 가수분해 산물 및 부전 mRNA 분자)의 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%이다. 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 널리 공지된 방법, 예컨대 예를 들어 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해 또는 모세관 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동, 예컨대 단편 분석기 분석에 의해 수득된 전기영동도를 조사함으로써 측정될 수 있다. 후자의 접근법은 하기 실시예에서 예시적으로 보다 상세히 설명된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 적어도 단계 (IIa), 바람직하게는 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 0℃ 내지 25℃, 바람직하게는 2℃ 내지 8℃의 온도에서 수행된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 적어도 단계 (IIa)의 경우, 즉 강력한 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 포함하는 제3 용액을 사용하여 단계 (Ib)로부터 수득된 용해된 mRNA 분자로부터 mRNA 분자를 정제하는 경우 0℃ 내지 25℃에서 수행된다. 따라서, 부전 mRNA 분자 및 가수분해 산물은 0℃ 내지 25℃의 온도, 바람직하게는 2℃ 내지 8℃의 온도에서 단계 (IIa)를 수행함으로써 제거된다. 특히 더 낮은 온도, 예컨대 2℃ 내지 8℃의 온도는, 가수분해에 의한 mRNA 분자의 분해량이 더 높은 온도 예컨대 25℃ 초과의 온도에서 특히 단계 (IIa)를 수행할 때 관찰되는 분해량과 비교하여 저하되기 때문에 유리하다. 따라서, 다량의 정제된 mRNA 분자를 수득하기 위해, 본 발명에 따른 방법의 적어도 단계 (IIa), 바람직하게는 적어도 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 0℃ 내지 25℃, 바람직하게는 2℃ 내지 8℃의 온도에서 수행하는 것이 유리하다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 현탁액에 포함된 침전된 mRNA 분자는 바람직하게는 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 수득된다. 따라서, 본 발명에 따라 정제될 mRNA 분자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게는, mRNA 분자는 DNA 주형을 사용하여 시험관내에서 전사된다.

시험관내 전사에는 프로모터, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충 시스템 및 적절한 RNA 폴리머라제 예컨대 T7 RNA 중합효소를 함유하는 정제된 선형 또는 선형화된 DNA 주형이 필요하다. 예를 들어, 이러한 정제된 선형 DNA 주형은 시험관내에서 화학적으로 합성될 수 있고, 이어서 임의로 예를 들어 PCR 기반 방법을 사용하여 주형 증폭될 수 있다. 또 다른 한편으론, 전사를 위한 DNA 주형은 일반적으로 세포 용해에 의해 수득되고, 정제되며, 예를 들어 부위-특이적 제한 효소를 사용하여 선형화되는 DNA 플라스미드로부터 수득될 수 있다. 두 경우 모두에서, 수득된 선형 DNA 주형 서열은 표준 실험실 프로토콜을 사용하여 A, C, G 및 U 뉴클레오티드의 존재 하에 mRNA 분자의 시험관내 전사에 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서 정제될 mRNA 분자는 비변형된 및/또는 변형된 뉴클레오티드의 존재 하에 시험관내 전사에 의해 생산된다. 따라서, 정제될 mRNA 분자는 비변형된 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 사용함으로써 선형 또는 선형화된 DNA 주형을 기반으로 하는 시험관내 전사에 의해 합성될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "비변형된 뉴클레오티드"는 상기 기재된 바와 같은 A, C, G, T 및 U 뉴클레오티드를 지칭한다. 특히, mRNA 분자의 시험관내 전사의 경우, 상기 용어는 A, C, G 및 U 뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 A, C, G, T 및 U 뉴클레오티드의 임의의 자연적으로 발생하거나 또는 화학적으로 합성된 이성질체 뿐만 아니라 예를 들어 화학적 변형 또는 치환된 잔기를 갖는 임의의 자연적으로 발생하거나 또는 화학적으로 합성된 유사체, 대체물 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 그의 이성질체를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드는 염기 변형 및/또는 당 변형을 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 또한, 예를 들어, mRNA 분자의 5개 프라임 캡과 관련하여 포스페이트 기 변형을 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 공유 변형에 의해 전사 후 합성되는 뉴클레오티드를 포함한다. 추가로, 비변형된 및 변형된 뉴클레오티드의 임의의 적합한 혼합물이 가능하다. 변형된 뉴클레오티드의 비-제한적인 수의 예는 문헌에서 찾을 수 있고 (예를 들어 문헌 [Cantara et al., Nucleic Acids Res, 2011, 39(Issue suppl_1):D195-D201; Helm and Alfonzo, Chem Biol, 2014, 21(2):174-185; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51(29):7110-31]), 일부 바람직한 변형된 뉴클레오티드는 각각의 뉴클레오시드 잔기에 기초하여 하기에 예시적으로 언급된다:

1-메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-히드록시노르발릴 카르바모일아데노신, 2-메틸아데노신, 2'-O-리보실포스페이트 아데노신, N6-메틸-N6-트레오닐카르바모일아데노신, N6-아세틸아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-메틸아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, N6-히드록시노르발릴카르바모일아데노신, 1,2'-O-디메틸아데노신, N6,2'-O-디메틸아데노신, 2'-O-메틸아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6-2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 7-메틸아데노신, 2-메틸티오-아데노신, 2-메톡시-아데노신, 2'-아미노-2'-데옥시아데노신, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 2'-플루오로-2'-데옥시아데노신, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데노신, 7-데아자-8-아자-아데노신, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린; 2-티오시티딘, 3-메틸시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 5-히드록시시티딘, 리시딘, N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘, 5-포르밀-2'-O-메틸시티딘, 5,2'-O-디메틸시티딘, 2-O-메틸시티딘, N4,2'-O-디메틸시티딘, N4,N4,2'-O-트리메틸시티딘, 이소시티딘, 슈도시티딘, 슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2'-메틸-2'-데옥시시티딘, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 5-브로모시티딘, 2'-아지도-2'-데옥시시티딘, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘, 2'-플루오르-2'-데옥시시티딘, 5-아자-시티딘, 3-메틸-시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린; 1-메틸구아노신, N2,7-디메틸구아노신, N2-메틸구아노신, 2'-O-리보실포스페이트 구아노신, 7-메틸구아노신, 히드록시와이부토신, 7-아미노메틸-7-데아자구아노신, 7-시아노-7-데아자구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, N2,7,2'-O-트리메틸구아노신, N2,2'-O-디메틸구아노신, 1,2'-O-디메틸구아노신, 2'-O-메틸구아노신, N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신, N2,N2J-트리메틸구아노신, 이소구아노신, 4-데메틸와이오신, 에폭시큐오신, 과소변형된 히드록시와이부토신, 메틸화된 과소변형된 히드록시와이부토신, 이소와이오신, 퍼옥시와이부토신, 갈락토실-큐오신, 만노실-큐오신, 큐오신, 아르케오신, 와이부토신, 메틸와이오신, 와이오신, 7-아미노카르복시프로필데메틸와이오신, 7-아미노카르복시프로필와이오신, 7-아미노카르복시프로필와이오신메틸에스테르, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, N1-메틸구아노신, 2'-아미노-3'-데옥시구아노신, 2'-아지도-2'-데옥시구아노신, 2'-플루오로-2'-데옥시구아노신, 2-티오우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘, 3-메틸우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-카르복시메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 5-히드록시우리딘, 5-메틸우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 5-카르바모일메틸우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르, 디히드로우리딘, 5-메틸디히드로우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)-2'-O-메틸우리딘 메틸 에스테르, 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오우리딘, 3,2'-O-디메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르바모일히드록시메틸우리딘, 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르바모일메틸-2-티오우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘, 5,2'-O-디메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 2'-O-메틸-2-티오우리딘, 2-티오-2'-O-메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메톡시우리딘, 5-아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오우리딘, 슈도우리딘, 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘, 1-메틸슈도우리딘, 3-메틸슈도우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 5-포르밀우리딘, 5-아미노메틸-2-제라닐우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-브로모우리딘, 2'-메틸-2'-데옥시우리딘, 2'-아미노-2'-데옥시우리딘, 2'-아지도-2'-데옥시우리딘, 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘, 이노신, 1-메틸이노신, 1,2'-O-디메틸이노신, 2'-O-메틸이노신, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 1,2'-O-디메틸아데노신, 1,2'-O-디메틸구아노신, 1,2'-O-디메틸이노신, 2,8-디메틸아데노신, 2-메틸티오메틸렌티오-N6-이소펜테닐-아데노신, 2-제라닐티오우리딘, 2-리시딘, 2-메틸티오 시클릭 N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐) 아데노신, 2-메틸티오-N6-히드록시노르발릴카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-셀레노우리딘, 2-티오-2'-O-메틸우리딘, 2'-O-메틸아데노신, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸이노신, 2'-O-메틸슈도우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 2'-O-리보실아데노신포스페이트, 2'-O-리보실구아노신포스페이트, 3,2'-O-디메틸우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)-5,6-디히드로우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘, 5,2'-O-디메틸시티딘, 5,2'-O-디메틸우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)-2'-O-메틸우리딘 메틸 에스테르, 55-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘, 5-아미노메틸-2-제라닐티오우리딘, 5-아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-아미노메틸우리딘, 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르복시히드록시메틸우리딘, 5-카르복시메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-제라닐티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-시아노메틸우리딘, 5-포르밀-2'-O-메틸시티딘, 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-제라닐티오우리딘, 7-아미노카르복시프로필-데메틸와이오신, 7-메틸구아노신, 8-메틸아데노신, N2,2'-O-디메틸구아노신, N2,7,2'-O-트리메틸구아노신, N2,7-디메틸구아노신, N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신, N2,N2,7-트리메틸구아노신, N2,N2,7-트리메틸구아노신, N4,2'-O-디메틸시티딘, N4,N4,2'-O-트리메틸시티딘, N4,N4-디메틸시티딘, N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘, N6,2'-O-디메틸아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸아데노신, N6-포르밀아데노신, N6-히드록시메틸아데노신, 아그마티딘, 2-메틸티오 시클릭 N6-트레오닐카르바모일아데노신, 글루타밀-큐오신, 임의의 뉴클레오티드에 부가된 구아노신, 구아닐화된 5' 말단, 히드록시-N6-트레오닐카르바모일아데노신; 가장 바람직하게는 슈도-우리딘, N1-메틸-슈도-우리딘, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 5-메틸시티딘, 2-티오우리딘, 5-아이오도우리딘 및/또는 5-메틸-우리딘.

더욱이, 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 동위원소 예컨대 중수소를 함유하는 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "동위원소"는 동일한 수의 양성자를 갖지만 상이한 수의 중성자를 가지므로 상이한 질량 수를 초래하는 원소를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 수소의 동위원소는 중수소에 제한되지 않고 또한 삼중수소를 포함한다. 더욱이, mRNA 분자는 또한 예를 들어 탄소, 산소, 질소 및 인을 포함한 다른 원소의 동위원소를 함유할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드가 중수소화되거나 또는 수소 또는 산소, 탄소, 질소 또는 인의 또 다른 동위원소를 함유하는 것이 또한 가능하다.

따라서, 정제될 mRNA 분자가 4가지 뉴클레오티드 유형, 즉 A, C, G 및 U 뉴클레오티드의 존재 하에 시험관내 전사에 의해 생산되는 경우, 변형된 뉴클레오티드 유형의 총 수는 0, 1, 2, 3 또는 4일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 하나의 뉴클레오티드 유형의 적어도 하나의 뉴클레오티드, 예를 들어, 적어도 하나의 U 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 2가지 뉴클레오티드 유형 중 적어도 하나의 뉴클레오티드, 예를 들어, 적어도 하나의 U 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 C 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 3가지 뉴클레오티드 유형 중 적어도 하나의 뉴클레오티드, 예를 들어, 적어도 하나의 G 뉴클레오티드, 적어도 하나의 U 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 C 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 4가지 모든 뉴클레오티드 유형 중 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 이들 모든 실시양태에서 뉴클레오티드 유형당 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형될 수 있으며, 뉴클레오티드 유형당 상기 변형된 뉴클레오티드의 백분율은 0%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%이다.

일부 실시양태에서, 정제될 mRNA 분자에 포함된 변형된 뉴클레오티드의 총 백분율은 0%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%이다.

정제될 mRNA 분자는 예를 들어 U 뉴클레오티드의 0.5 내지 50%, 바람직하게는 5 내지 50% 및 C 뉴클레오티드의 5 내지 50%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도시티딘이다.

일부 실시양태에서, 정제될 mRNA 분자는 U 뉴클레오티드의 15 내지 25% 및 C 뉴클레오티드의 5 내지 15%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-메틸우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도시티딘이다.

일부 실시양태에서, 정제될 mRNA 분자는 U 뉴클레오티드의 30 내지 50% 및 C 뉴클레오티드의 10 내지 20%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도시티딘이다.

일부 실시양태에서, 정제될 mRNA 분자는 U 뉴클레오티드의 30 내지 50% 및 C 뉴클레오티드의 5 내지 15%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-아이오도시티딘이다.

일부 실시양태에서, 정제될 mRNA 분자는 U 뉴클레오티드의 0.5 내지 5% 및 C 뉴클레오티드의 25 내지 35%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 2-티오우리딘이고 상기 변형된 C 뉴클레오티드는 바람직하게는 5-메틸시티딘이다.

정제될 mRNA 분자는 예를 들어 또한 U 뉴클레오티드의 50 내지 100%, 바람직하게는 100%가 변형되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형된 U 뉴클레오티드는 바람직하게는 N1-메틸-슈도-우리딘이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (Ia) 전에, 암모늄 아세테이트를 사용하여 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다. mRNA 분자의 침전은 특히 mRNA 침전이 쉽고 비용 효율적이기 때문에 염, 뉴클레오티드 및 단백질을 제거하는데 유리하다. 예를 들어 GSCN, NH₄OAc, 에탄올, 리튬 클로라이드, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 클로라이드를 포함하는 상이한 용액이 침전을 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 그러나, 특히 치료 적용의 경우에는 GSCN 및 LDS와 같은 염을 피하는 것이 매우 유리하다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서 mRNA 분자는 NH₄OAc를 사용하여 침전된다. 따라서, 단계 (Ia)에서 사용되는 현탁액은 바람직하게는 mRNA 분자를 침전시키기 위해 NH₄OAc를 사용하여 수득된다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시양태에서 제1 용액은 암모늄 아세테이트를 함유한다. 바람직하게는, 현탁액 및 제1 용액 중 NH₄OAc의 총량은 0.1 mol/l 내지 5 mol/l, 바람직하게는 1 mol/l 내지 4 mol/l, 보다 바람직하게는 2 mol/l 내지 3 mol/l이므로, 5 mol/l 미만, 바람직하게는 4 mol/l 미만, 보다 바람직하게는 3 mol/l 미만이다. 적은 양의 암모늄 아세테이트가 시간 및 비용 효율적인 하류 프로세싱의 관점에서 매우 유리하다. 제1 용액은 1 내지 12, 바람직하게는 6.5 내지 7.5 범위의 pH를 추가로 가질 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 용액은 암모늄 아세테이트를 함유하고, 여기서 현탁액 및 제1 용액 중 NH₄OAc의 총량은 1 mol/l 내지 4 mol/l, 바람직하게는 2 mol/l 내지 3 mol/l이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 용액은 1 내지 12, 바람직하게는 6.5 내지 7.5 범위의 pH를 갖고, 암모늄 아세테이트를 함유하며, 여기서 현탁액 및 제1 용액 중 NH₄OAc의 총량은 1 mol/l 내지 4 mol/l, 바람직하게는 2 mol/l 내지 3 mol/l이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, mRNA 분자를 정제하는 방법은 단계 (IIa)에 따른 킬레이트제를 포함하는 제3 용액을 사용하여 mRNA 분자를 정제하기 전에 단계 (Ib)로부터 수득된 용해된 mRNA 분자에 제5 용액을 부가하는 단계를 추가로 포함한다. 제5 용액은 바람직하게는 제3 용액과 동일한 킬레이트제를 포함한다. 따라서, 제5 용액은 바람직하게는 특히 2가 양이온 예컨대 마그네슘 양이온을 제거하기 위한 킬레이트제로서 EDTA, 및 임의로 MOPS 완충제를 포함한다. 그러나, 제5 용액에 포함된 킬레이트제의 농도는 바람직하게는 제3 용액에 포함된 킬레이트제의 농도보다 더 높다. 단계 (IIa)를 수행하기 전에 단계 (Ib)로부터 수득된 용해된 mRNA 분자에 제5 용액을 부가함으로써, 단계 (Ib)로부터 수득된 mRNA 분자가 현탁된 용액의 조성을, 단계 (IIa)에서 사용된 제3 용액의 조성으로 조정할 수 있다. 이는 잠재적인 희석 효과가 저하될 수 있고 이에 따라 본원에 개시된 방법에 따른 mRNA 분자 정제의 처리량 및/또는 재현성이 증가될 수 있다는 이점이 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, mRNA 분자를 정제하는 방법은 mRNA 분자를 탈인산화 및/또는 폴리아데닐화 및/또는 후-캡핑하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, mRNA 분자는 본 발명의 방법을 사용하여 정제될 수 있을 뿐만 아니라 기능적 아미노산 서열 예컨대 단백질로 번역될 수 있는 능력을 보장하도록 부가적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 mRNA 분자의 시험관내 합성 또는 전사 동안 및/또는 공동-전사 5' 캡핑 동안 부가되는 5' 모노-, 디-, 및/또는 트리포스페이트를 제거하기 위한 mRNA 분자의 탈인산화; 폴리(A) 꼬리가 대부분의 경우에 mRNA 분자의 수명을 결정하는 주요 요인이기 때문에 mRNA 분자의 폴리아데닐화; 및 공동-전사 5' 캡핑이 수행되지 않은 경우의 mRNA 분자의 후-캡핑을 포함한다. 특히 5' 캡과 3' 폴리(A) 꼬리가 mRNA 효율을 결정하는 주요 요인인 것으로 간주되므로, 이러한 특징을 mRNA 분자 정제 방법에 혼입하는 것은 mRNA 분자 프로세싱의 시간 및 비용 효율성을 최대화하고 정제된 mRNA 분자의 작용 지속기간을 최대화한다는 관점에서 유리하다.

5' 캡의 존재는 mRNA 분자의 안정성을 증강시키고 따라서 mRNA 분자의 작용 지속기간을 연장하는데 유리하다.

따라서, 정제될 침전된 mRNA 분자가 5' 캡 또는 5' 캡 유사체를 포함하지 않는 경우, mRNA 분자는 바람직하게는, 예를 들어 C1-m7G 캡 또는 m7GpppG 캡의 효소적 부가에 의해 전사 후에 5' 캡핑된다.

그러나, 보다 바람직하게는 mRNA 분자는, 예를 들어 ARCA 캡 유사체를 사용하거나 또는 트라이링크(Trilink) 기술 [클린캡(CleanCap) 기술; US 2018/273576 A1 참조]을 적용함으로써 공동-전사적으로 5' 캡핑된다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 TFF 방법을 사용하는 것이 클린 캡 유사체를 제거하는데 유리하다.

더욱이, 정제될 침전된 mRNA 분자가 3' 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는 경우, mRNA 분자는 바람직하게는 적어도 100개의 A 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 120개의 A 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 240개의 A 뉴클레오티드로 이루어지는 폴리(A) 꼬리로 효소적으로 폴리아데닐화된다. 임의로, 부가될 폴리(A) 꼬리는 비-A 뉴클레오티드, 바람직하게는 폴리(A) 꼬리 서열 내에 및/또는 폴리(A) 꼬리의 한쪽 말단에 G 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 말단은 정제될 mRNA 분자의 3' 말단에 부가되지 않아야 한다. mRNA 분자에 폴리(A) 꼬리를 부가하는 것은 상기 mRNA 분자의 작용 지속기간을 연장하고 따라서 원하는 수준의 번역을 수득하는데 유리한 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 mRNA 분자를 정제하는 방법은 mRNA 분자를 탈인산화하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 방법은 mRNA 분자를 폴리아데닐화하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 mRNA 분자를 후-캡핑하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 mRNA 분자를 정제하는 방법은 mRNA 분자를 적어도 탈인산화 및 폴리아데닐화하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 mRNA 분자를 정제하는 방법은 mRNA 분자를 적어도 탈인산화 및 후-캡핑하는 것을 포함하며, 여기서 mRNA 분자를 탈인산화하는 것은 mRNA 분자를 후-캡핑한 후에 수행된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, mRNA 분자를 정제하는 방법은 단계 (Ib)로부터 수득된 mRNA 분자를 탈인산화하는 것, 이어서 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 수행하는 것, 이어서 수득된 mRNA 분자를 폴리아데닐화하는 것, 이어서 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 다시 수행하는 것이며, 여기서 후자의 단계 (Ia)는 바람직하게는 20℃ 내지 30℃, 바람직하게는 23℃ 내지 27℃, 보다 바람직하게는 25℃의 온도에서 수행되는 것, 임의로 이어서 mRNA 분자를 포함하는 수득된 보유물을 여과하는 것을 포함한다. 따라서, mRNA 분자 프로세싱의 비용 및 시간 효율성을 최대화하기 위해, mRNA 분자를 정제하는 방법은 mRNA 분자를 탈인산화하는 단계 및 폴리아데닐화하는 단계를 추가로 포함한다. 특히, 탈인산화 및 폴리아데닐화 동안 도입된 성분을 또한 제거하기 위해 mRNA 분자를 정제하는 부가의 단계와 함께 후자의 두 단계를 혼입하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다.

따라서, 특히 정제될 mRNA 분자가 공동-전사적으로 부가된 5' 캡 또는 5' 캡 유사체를 포함하는 경우, mRNA 분자를 정제하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다. 먼저, 침전된 mRNA 분자는 단계 (Ia)에서 바람직하게는 암모늄 아세테이트를 포함하는 제1 용액을 사용하여 상기 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 정제된다. 이어서, 정제된 침전된 mRNA 분자를 단계 (Ib)에서, 예를 들어 단백질, 염 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제거하기 위해 제2 용액, 바람직하게는 물을 사용하여 세척하고 용해시킨다. 이어서, 용해된 mRNA 분자는 캡핑되지 않았을 수 있는 RNA 분자로부터 5' 모노-, 디-, 및 트리포스페이트를 제거하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 탈인산화된다. 탈인산화된 mRNA 분자는 추가 단계 (Ia)에서 바람직하게는 암모늄 아세테이트를 포함하는 제1 용액을 사용하여 정제되고, 후속적으로 추가 단계 (Ib)에서 바람직하게는 물인 제2 용액을 사용하여 세척된다. 이와 같이 수득된 mRNA 분자는 부전 mRNA 분자 및 가수분해 산물을 제거하기 위해, 0 내지 8의 pH, 보다 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 pH에서 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA, 및 바람직하게는 MOPS를 포함하는 제3 용액을 사용하여 단계 (IIa)에서 추가로 정제된다. 이어서, 제4 용액을 사용하여 단계 (IIb)에서 세척 단계를 수행함으로써 제3 용액을 제거한다. 폴리아데닐화 단계가 필요하지 않은 경우, 예를 들어 폴리(A) 꼬리를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 주형이 시험관내 전사에 사용되었기 때문에, 수득된 정제된 mRNA 분자는 바람직하게는 시트레이트 및/또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 제4 용액을 사용하여 단계 (IIb)에서 세척되고, 상기 단계 (IIb)에 이어 임의로, 예를 들어 0.3 μm 미만의 공극 크기를 갖는 필터 막을 사용하는 부가의 여과 단계가 수행된다. 폴리아데닐화 단계가 유리한 경우, 예를 들어 폴리(A) 꼬리를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 DNA 주형이 시험관내 전사에 사용되었기 때문에, 수득된 정제된 mRNA 분자는 제4 용액, 바람직하게는 물을 사용하여 단계 (IIb)에서 세척되고, 그 다음 mRNA 분자의 작용 연장을 보장하기 위한 일상적인 실험실 프로토콜을 사용하여 3' 폴리(A) 꼬리를 효소적으로 부가함으로써, 예를 들어 폴리(A) 폴리머라제를 부가함으로써 신장될 수 있다. 이어서, mRNA 분자는, 예를 들어 부가된 폴리(A) 폴리머라제를 제거하기 위해, 단계 (Ia)가 바람직하게는 20℃ 내지 30℃, 바람직하게는 23℃ 내지 27℃, 보다 바람직하게는 25℃의 온도에서 수행된다는 점을 제외하고는, 그리고 단계 (IIb)에서 사용된 제4 용액이 바람직하게는 시트레이트 및/또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 것을 제외하고는 앞서 기재된 바와 같이 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 거쳐, 5' 캡 또는 5' 캡 유사체 및 3' 폴리(A) 꼬리를 포함하는 정제된 mRNA 분자를 수득한다. 임의로, 수득된 정제된 mRNA 분자는 예를 들어 0.3 μm 미만의 공극 크기를 갖는 필터 막을 사용하여 부가의 여과 단계를 거칠 수 있다.

정제될 mRNA 분자가 공동-전사적으로 부가된 5' 캡 또는 5' 캡 유사체를 포함하지 않는 경우, 본 발명에 따라 mRNA 분자를 정제하는 방법은 상기 기재된 절차와 비교하여 5' 캡 또는 5' 캡 유사체를 바람직하게는 효소적으로, 전사 후에 부가하는 부가의 단계를 포함할 수 있다. 따라서, mRNA 분자를 정제하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다. 먼저, 침전된 mRNA 분자는 단계 (Ia)에서 바람직하게는 암모늄 아세테이트를 포함하는 제1 용액을 사용하여 상기 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 정제된다. 이어서, 정제된 침전된 mRNA 분자를 단계 (Ib)에서, 예를 들어 단백질, 염 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제거하기 위해, 제2 용액, 바람직하게는 물을 사용하여 세척하고 용해시킨다. 그 다음, 상기 방법은 단계 (Ib)로부터 수득된 mRNA 분자를 캡핑하는 것, 이어서 단계 (Ia) 및 (Ib)를 수행하는 것, 수득된 mRNA 분자를 탈인산화하는 것, 이어서 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 수행하는 것을 추가로 포함한다. 폴리아데닐화 단계가 필요하지 않은 경우, 예를 들어 폴리(A) 꼬리를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 주형이 시험관내 전사에 사용되었기 때문에, 수득된 정제된 mRNA 분자는 바람직하게는 시트레이트 및/또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 제4 용액을 사용하여 단계 (IIb)에서 세척되고, 상기 단계 (IIb)에 이어 임의로 예를 들어 0.3 μm 미만의 공극 크기를 갖는 필터 막을 사용하는 부가의 여과 단계가 수행된다. 폴리아데닐화 단계가 유리한 경우, 예를 들어 폴리(A) 꼬리를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 DNA 주형이 시험관내 전사에 사용되었기 때문에, 수득된 정제된 mRNA 분자는 제4 용액, 바람직하게는 물을 사용하여 단계 (IIb)에서 세척되고, 그 다음 mRNA 분자의 작용 연장을 보장하기 위한 일상적인 실험실 프로토콜을 사용하여 3' 폴리(A) 꼬리를 효소적으로 부가함으로써, 예를 들어 폴리(A) 폴리머라제를 부가함으로써 신장될 수 있다. 이어서, mRNA 분자는, 예를 들어 부가된 폴리(A) 폴리머라제를 제거하기 위해, 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 거치며, 여기서 단계 (Ia)는 바람직하게는 20℃ 내지 30℃, 바람직하게는 23℃ 내지 27℃, 보다 바람직하게는 25℃의 온도에서 수행되고, 여기서 단계 (IIb)는 바람직하게는 시트레이트 및/또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 제4 용액을 사용하고, 임의로 이어서 mRNA 분자를 포함하는 수득된 보유물을 여과함으로써 수행된다.

따라서, 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 바람직하게는 mRNA 분자의 임의의 연장 예컨대 3' 폴리아데닐화 및 임의로 5' 캡핑을 수행하기 전에 수행된다. 특히, 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 mRNA 분자의 3' 폴리아데닐화 전에 수행되는 것이 바람직하고, 단계 (Ia) 내지 (Ib)는 5' 캡핑 전에 수행되는 것이 바람직하다. 이것은 상기 기재된 4가지 모든 실시양태, 즉 각각 공동-전사적으로 및 전사 후에 5' 캡핑되는 mRNA 분자의 정제에 적용된다.

추가로, 상기 기재된 4가지 모든 실시양태에서, mRNA 분자를 탈인산화하는 단계에 이어 단계 (Ia) 및 (Ib)를 수행하는 것은 임의적일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태는 mRNA 분자를 탈인산화하는 단계에 이어 단계 (Ia) 및 (Ib)를 수행하는 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같은 4가지 실시양태에 상응한다.

TFF는 캡슐, 카세트 및 카세트 홀더 또는 중공 섬유 모듈을 필터 장치로서 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 중공 섬유 모듈은 멸균 프로세싱을 가능하게 하고 필터 막을 패키징하는 비용 효율적인 방법을 제공하는 완전하게 사전 어셈블리되고 사전 멸균된 일회용 유동 경로를 허용한다.

mRNA 분자 정제에 사용되는 필터 막은 mRNA 분자 정제에 적합한 임의의 유형의 재료일 수 있으므로, 정제될 mRNA 분자와 상호작용하지 않는다. 필터 막 재료의 예는 비변형된 폴리에테르술폰 (PES), 변형된 폴리에테르술폰 (mPES), mPES 중공 섬유 막, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 혼합 셀룰로스 에스테르 (ME), 초고 MW 폴리에틸렌 (UPE), 폴리플루오로테트라에틸렌 (PTFE), 나일론, 폴리술폰 (PS), 폴리아크릴로니트릴, 폴리프로필렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF), 및 그의 조합을 포함한다.

필터 막은 90%가 막에 의해 유지되는 입자의 가장 낮은 분자량 (달톤)을 지칭하는 분자량 컷-오프 (MWCO) 값을 특징으로 한다. 바람직하게는, 필터 막은 MWCO 및 그에 따른 공극 크기보다 더 작은 크기의 성분이 투과물로서 필터 막을 통과할 수 있도록 하면서 mRNA 분자를 보유하기에 적절한 공극 크기를 갖는다. 상이한 크기의 상이한 성분을 제거해야 하기 때문에, 필터 막 공극 크기를 본 발명에 따른 방법의 각각의 단계에서 제거될 성분의 크기로 조정하는 것이 유리하다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 단계 (Ia)의 경우 300 kDa 내지 0.65 μm, 바람직하게는 500 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막이 TFF에 사용되고/거나, 여기서 단계 (Ib) 및 (IIb)의 경우 1 kDa 내지 0.65 μm, 바람직하게는 1 kDa 내지 300 kDa, 보다 바람직하게는 1 kDa 내지 50 kDa, 보다 더 바람직하게는 50 kDa, 70 kDa 및/또는 100 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막이 사용되고/거나, 여기서 단계 (IIa)의 경우 적어도 50 kDa, 바람직하게는 적어도 70 kDa, 보다 바람직하게는 70 kDa 또는 100 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막이 사용된다. 필터 막의 공극 크기가, 필터 막을 통과할 수 있으므로 투과물에 포함되는 입자 예컨대 mRNA 분자 및 성분의 크기를 결정하기 때문에, TFF에 사용되는 필터 막이 결정적이다.

따라서, 필터 막의 MWCO는 바람직하게는 단계 (Ia)의 경우 적어도 300 kDa 또는 0.065 μm이다. 바람직하게는, MWCO는 300 kDa, 500 kDa, 750 kDa, 0.05 μm, 0.1 μm, 0.2 μm, 0.45 μm, 0.5 μm, 0.65 μm로 이루어진 군으로부터 선택되며, 500 kDa의 MWCO가 특히 바람직하다. 이것은 예를 들어 정제될 mRNA 분자를 수득하기 위해 용해된 세포에 포함된 효소 및 단백질을 제거하거나 또는 시험관내 전사된 mRNA 분자의 경우에는 시험관내 전사 반응 혼합물에 포함된 효소, 변형된 및 비변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트, 5' 캡, 5' 캡 유사체 및 완충제 성분을 제거하면서 침전된 mRNA 분자를 유지하는데 유리하다. 따라서, 적절한 MWCO 값은 예를 들어 프리프로세싱 단계, 예컨대 정제될 mRNA 분자의 시험관내 전사에서 사용되었고 단계(Ia)에서 TFF에 의해 제거되어야 하는 효소의 크기를 고려하여 선택될 수 있다. T7RNA 폴리머라제는 100 kDa 미만의 MWCO를 갖는 필터 막을 사용하는 경우에 효율적으로 제거되지 않는, 관련 기술분야에 널리 공지된 효소이다. 단계 (Ia)에서 1 kDa 내지 750 kDa 범위의 MWCO를 적용할 때, TFF는 한외여과로서 지칭될 수 있는 반면, 0.05 μm 내지 0.65 μm 범위의 MWCO를 적용하는 경우에는 TFF가 정밀여과로서 지칭될 수 있다.

단계 (Ib) 및 (IIb)의 경우, MWCO는 바람직하게는 적어도 1 kDa, 바람직하게는 1 kDa 내지 50 kDa, 보다 바람직하게는 적어도 50 kDa, 보다 더 바람직하게는 적어도 70 kDa이다. 바람직하게는, MWCO는 1 kDa, 3 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 50 kDa, 70 kDa, 100 kDa, 300 kDa, 0.05 μm, 0.1 μm, 0.2 μm, 0.45 μm, 0.5 μm, 및 0.65 μm으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 50 kDa, 70 kDa, 또는 100 kDa의 MWCO가 특히 바람직하다. 이것은 각각의 용액에 포함된 염 및 다른 성분, 예컨대 암모늄 아세테이트, 킬레이트제 예컨대 EDTA, 완충제 예컨대 MOPS, 부전 mRNA 분자 및/또는 가수분해 산물을 효율적으로 제거하면서 mRNA 분자를 정제하는데 유리하다. 비교적 큰 mRNA 분자의 경우 300 kDa 초과의 MWCO가 또한 고려될 수 있다.

단계 (IIa)의 경우, MWCO는 바람직하게는 적어도 50 kDa, 보다 바람직하게는 적어도 70 kDa, 보다 더 바람직하게는 70 kDa 또는 100 kDa이다. 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 MOPS-EDTA 완충제를 사용할 때, 100 kDa의 MWCO가 특히 바람직하다. 다른 강력한 킬레이트제 또는 다른 강력한 킬레이트제 - 완충제 조합이 적용되는 경우, 심지어 100 kDa 이상의 MWCO가 비교적 큰 mRNA 분자의 정제를 위해 고려될 수 있다.

TFF를 사용하는 프로세스는 더욱이 상이한 변수의 관점에서 명확히 규명될 수 있으며, 가장 중요한 변수 중 2가지는 막횡단 압력과 유속이다.

"막횡단 압력" (TMP)은 필터 막을 통해 성분을 구동시키는 구동력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 압력은 단계 (Ia) 및 (Ib)의 경우에, 예를 들어 전형적인 경우에서의 500 mg mRNA의 실험실 규모에서, 100 mbar 내지 500 mbar, 바람직하게는 200 mbar 내지 400 mbar이고, 단계 (IIa) 및 (IIb)의 경우에는 2 mbar 내지 20 mbar, 바람직하게는 5 mbar 내지 15 mbar이다.

용어 "유동"은 TFF 시스템을 통해 특히 필터 막 영역에서 유동하는 용액의 용적을 지칭하며, "유속"은 주어진 시간 동안 상기 시스템을 통해 유동하는 용액 용적을 지칭한다. 따라서 유속 또는 직교류 속도는 필터 막을 가로지르는 용액 유동 속도를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단계 (Ia) 및 (Ib)의 경우 유속은, 예를 들어 전형적인 경우에서의 500 mg mRNA의 실험실 규모에서, 1.5 L/min 내지 2.5 L/min, 바람직하게는 1.6 L/min 내지 1.9 L/min이고, 단계 (IIa) 및 (IIb)의 경우에는 0.2 L/min 내지 0.6 L/min, 바람직하게는 0.35 L/min 내지 0.45 L/min이다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, mRNA 분자를 정제하는 방법은 연속 TFF를 사용하여 수행된다. 연속 TFF는 보유물을 또 다른 라운드의 TFF에 대한 공급물로서 사용하는 TFF 시스템을 지칭한다. 본원에서, 용어 "공급물"은 정제될 mRNA 분자를 포함하는 용액 또는 현탁액을 지칭한다. 따라서, mRNA 분자를 포함하는 초기 공급물은 TFF를 사용하는 제1 라운드의 여과를 거치며, mRNA 분자를 포함하는 수득된 보유물은 적어도 mRNA 분자를 순환시킴으로써 또 다른 라운드의 TFF를 위한 공급물로서 다시 사용된다. 이는 시스템 간의 이동으로 인한 mRNA 분자 손실 위험을 저하시키면서 자동화 방식으로 반복되는 정제 단계로 인한 정제 수준을 증강시키는데 유리하다.

따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, mRNA 분자는 접선 유동 여과 후 보유물, 바람직하게는 적어도 단계 (Ia) 내지 (IIa)에 의해 수득된 보유물에 포함된다. 단계 (IIb)의 경우, mRNA 분자는 보유물 또는 투과물에 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, mRNA 분자는 단계 (Ia) 내지 단계 (IIb)에 의해 수득된 보유물에 포함된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 단계 (Ia)에서 수득된 보유물은 단계 (Ib)에서 접선 유동 여과를 위한 공급 용액으로서 사용되고, 단계 (Ib)로부터 수득된 보유물은 단계 (IIa)에서 공급 용액으로서 사용되고, 단계 (IIa)로부터 수득된 보유물은 단계 (IIb)에서 공급 용액으로서 사용된다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 적어도 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 수행하기 위해 연속 TFF를 사용하여 수행된다. 보다 구체적으로, mRNA 분자는 바람직하게는 본 발명에 따른 정제를 위한 연속 TFF 시스템에서 순환한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 적어도 단계 (Ia) 내지 (IIa), 바람직하게는 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 연속 TFF를 사용하여 수행된다.

TFF 시스템의 추가의 이점은 투석여과, 특히 연속 투석여과에 용이하게 사용될 수 있다는 것이다. 투석여과를 통해, 용액 또는 현탁액의 일부를 또 다른 것으로써 교환할 수 있다. 예를 들어, 불연속 투석여과에서는, 용액을 먼저 희석한 다음 다시 출발 용적이 되도록 농축시킨다. 그러나, 이것은 정제될 mRNA 분자의 기능성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 정제될 mRNA 분자는 일정 용적 투석여과를 사용하여 상기 기재된 방법에 따른 정제를 위한 연속 TFF 시스템에서 적어도 단계 (Ia) 내지 (IIb) 동안 순환되고 있다. 일정 용적 또는 연속 투석여과는 일정 용적이 여과 시스템에 유지되는 여과 프로세스를 지칭한다. 따라서, 필터 막을 투과물로서 통과하는 용액 또는 현탁액의 용적과 동일한 양의 용액 또는 현탁액이 부가된다. 따라서, 보유물의 용적은 초기에 TFF 시스템에 공급되는 용적, 즉 공급물 용적과 동일하고, 세척 용적, 즉 투석여과 용적은 투과물의 용적과 동일한 용적이다. 연속 TFF와 연속 투석여과의 조합은 그들의 기능을 보존하기 위해 일정 용적에서 TFF 시스템의 순환 부분에서 정제될 mRNA 분자를 유지하면서 투과물로서 오염물질을 제거하는데 유리하다.

따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서 적어도 단계 (Ia) 내지 (IIa), 바람직하게는 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 투석여과, 바람직하게는 연속 투석여과를 사용하여 수행된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 용액 중 임의의 것의 투석여과 용적은 단계 (Ia)의 현탁액의 용적의 적어도 1배이고, 예를 들어 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 바람직하게는 적어도 10배이다. 상기 투석여과 용적을 결정하는 것은 시간 및 비용 효율성과 달성될 정제 수준 간의 최적의 트레이드-오프의 관점에서 특히 관심이 있다. 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 용액 중 임의의 것의 투석여과 용적은 단계 (Ia)의 현탁액의 용적의 적어도 1배, 바람직하게는 적어도 10배인 것으로 밝혀졌다. 이것은 고처리량 프로세싱을 허용하고, 이에 따라 대규모로 mRNA 분자 정제를 가능하게 하면서 성분의 실질적인 제거를 보장하는데 유리하다.

일부 실시양태에서, 투석여과 용적은 단계 (Ia)의 현탁액의 용적, 따라서 단계 (Ia)에서 초기에 TFF 시스템에 공급된 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액의 용적의 1배이다.

일부 실시양태에서, 투석여과 용적은 현탁액 용적의 2배이다.

일부 실시양태에서, 투석여과 용적은 현탁액 용적의 3배이다.

일부 실시양태에서, 투석여과 용적은 현탁액 용적의 4배이다.

일부 실시양태에서, 투석여과 용적은 현탁액 용적의 5배이다.

또한 일부 실시양태에서, 투석여과 용적은 단계 (Ia)의 현탁액 용적의 적어도 5배이다.

일부 실시양태에서, 투석여과 용적은 단계 (Ia)의 현탁액의 용적, 따라서 단계 (Ia)에서 초기에 TFF 시스템에 공급된 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액의 용적의 적어도 10배이다. TFF 시스템에 초기에 공급되는 용적의 적어도 10배의 투석여과 용적을 사용하는 것이 상기 기재된 바와 같은 각각의 단계를 목표로 하는 성분을 실질적으로 제거하는데 유리한 것으로 밝혀졌다.

따라서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 용액 중 임의의 것의 투석여과 용적이 단계 (Ia)의 현탁액의 용적의 적어도 10배인 것이 바람직하다. 제3 및 제4 용액의 적어도 투석여과 용적이 단계 (Ia)의 현탁액의 용적의 적어도 10배인 것이 보다 더 바람직하다.

일부 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 용액의 투석여과 용적은 단계 (Ia)의 현탁액의 용적의 적어도 10배이다.

본 발명의 방법에 따라 정제된 mRNA 분자를 수득하기 위한 완전 자동화된 폐쇄 시스템이 도 2에 예시적으로 제시되어 있다. 상기 시스템은 바람직하게는 제1 밸브를 통해, mRNA 생산 시스템과 유체 연결되는 도 1에 제시된 연속 TFF 시스템을 포함한다. 주목할 만하게, 본원에 사용된 용어 "밸브"는 밸브, (예를 들어 2 방향 및/또는 3 방향) 스톱콕, 클램프 및 MPC 커넥터; 바람직하게는 밸브 및/또는 MPC 커넥터를 포괄한다. 더욱이, 클램프와 조합하여 MPC 커넥터를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 두 가지 요소, 예를 들어 두 개의 튜빙은 일회용을 허용하고/거나, 다양한 시스템과의 호환성, 예를 들어 튜빙 중 하나에서의 고압 및/또는 압력 변화에 대항한 안정성, 및/또는 저렴한 비용을 보장하는 방식으로 연결될 수 있다.

mRNA 생산 시스템은 반응 용기 및 적어도 하나의 추가 용기를 포함할 수 있다. 반응 용기 및 적어도 하나의 추가 용기는 바람직하게는 서로 유체 연결되어 있고 연결 튜빙를 통해 TFF 시스템과 유체 연결되어 있다. 제1 밸브는 mRNA 생산 시스템의 연결 튜빙과 TFF 시스템의 튜빙, 바람직하게는 공급물이 저장소로부터 필터 장치로 순환하는 튜빙 사이에 위치된다. 또 다른 한편으론, mRNA 생산 시스템은 보유물이 필터 장치로부터 저장소로 순환하는 튜빙과 유체 연결되거나, 또는 저장소와 유체 연결될 수 있다. 주목할 만하게, 본원에 사용된 용어 "튜빙"은 튜빙, 튜브, 파이프 또는 그의 조합을 지칭할 수 있다. 더욱이, mRNA 생산 시스템의 연결 튜빙은 보조 펌프를 포함할 수 있다. 보조 펌프는 연결 튜빙을 통해 전달되는 유체의 속도를 자동으로 조정하는데 유리하다.

본 발명의 방법에 따라 정제될 mRNA 분자는, 예를 들어, 세포성 mRNA 분자 증폭을 위해 세포를 배양함으로써, 또는 바람직하게는 시험관내 전사 (IVT)에 의해 수득될 수 있다. mRNA 분자가 세포로부터 수득되는 경우, 세포 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포는 mRNA 분자 생산에 적합한 세포 특이적 배양 조건 하에 발효기에서 배양될 수 있다. 상기 배양 조건의 파라미터는 바람직하게는, 예를 들어, 배양 배지, 기체 및/또는 완충제의 각각의 양을 제공함으로써 자동으로 조절된다. 따라서, mRNA 생산 시스템은 반응 용기 및 적어도 하나의 추가 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 반응 용기는 발효기이고 적어도 하나의 추가 용기는 예를 들어 각각의 배양 배지, 기체 및/또는 완충 용액을 포함한다. 또 다른 한편으론, 정제될 mRNA 분자가 IVT에 의해 수득되는 경우에는, IVT 주형, 예를 들어 정제될 표적 mRNA 분자의 IVT를 위한 각각의 DNA 주형, 및 IVT 시약 예컨대 IVT를 위한 효소, 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제, 및 NTP의 혼합물이 필요하다. 따라서, mRNA 생산 시스템은 반응 용기 및 적어도 하나의 추가 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 추가 용기는 상기 IVT 시약 중 적어도 하나를 포함한다.

따라서, 반응 용기는 바람직하게는 적어도 추가 용기, 바람직하게는 적어도 제1 추가 용기 및 제2 추가 용기와 유체 연결되어 있다.

제1 추가 용기는 상기 IVT 시약 중 적어도 하나를 포함할 수 있고 바람직하게는 연결 튜빙 및 제2 및 제3 밸브를 통해 반응 용기와 유체 연결되어 있다. 제2 밸브는 바람직하게는 반응 용기와 연결 튜빙 사이에 위치되고, 제3 밸브는 연결 튜빙과 제1 추가 용기 사이에 위치된다. 제1 밸브를 폐쇄하고 제2 및 제3 밸브를 개방함으로써, mRNA 분자는 바람직하게는 반응 용기 내에서, 예를 들어 IVT에 의해 생산될 수 있다. 제3 밸브를 폐쇄하고 제1 및 제2 밸브를 개방함으로써, 생산된 mRNA 분자는 mRNA 생산 시스템으로부터 TFF 시스템으로 전달될 수 있다.

제2 추가 용기는 mRNA 분자를 침전시키기 위한 용액을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 용액은 바람직하게는 암모늄 아세테이트 (NH₄OAc), 예를 들어 5 M NH₄OAc를 포함한다. 바람직하게는, 제2 추가 용기는 제4 밸브를 통해 연결 튜빙과 유체 연결되어 있다. 제2 및 제4 밸브를 개방하고 제1 및 제3 밸브를 폐쇄함으로써, 표적 분자는 바람직하게는 반응 용기에서, 또는 반응 용기가 발효기인 경우에는 제2 추가 용기에서 침전될 수 있다. 이어서 제1 밸브를 개방하면, 현탁액 중의 침전된 mRNA 분자는 본 발명의 방법에 따른 mRNA 분자 정제를 위해 mRNA 생산 시스템에서 TFF 시스템으로 전달될 수 있다.

따라서, 도 2에 제시된 시스템은 저장소가 있는 TFF 시스템, 바람직하게는 연속 투석여과 시스템을 포함한다. 바람직하게는, 저장소는 각각 적어도 제5, 제6 및 제7 밸브를 통해, 적어도 3개의 추가 용기, 즉 적어도 제3 추가 용기, 제4 추가 용기 및 제5 추가 용기와 유체 연결되어 있다. 제3 추가 용기는 본 발명에 따른 제1 용액을 포함할 수 있고, 제4 추가 용기는 제2 용액을 포함할 수 있으며, 제5 추가 용기는 제3 용액을 포함할 수 있다. 제2 용액과 제4 용액이 서로 상이한 경우, 저장소는 바람직하게는, 예를 들어, 제8 밸브를 통해 제4 용액을 포함하는 제6 추가 용기와 유체 연결되어 있다. 따라서, 제3 추가 용기가 제1 용액을 포함하며, 여기서 제1 용액은 침전된 mRNA 분자를 정제하기 위한 NH4OAc, 예를 들어 2.5 M NH4OAc를 포함하고, 제4 추가 용기가 제2 용액으로서 물, 예를 들어 주사용수 (WFI)를 포함하고, 제5 추가 용기가 제3 용액을 포함하며, 여기서 제3 용액은 킬레이트제로서의 EDTA 및 임의로 MOPS를 포함하는 것이 바람직하다. 제4 용액이 물이 아닌 경우, 제6 추가 용기는 바람직하게는 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트를 포함한다. 더욱이, 상기 적어도 3개의 추가 용기 중 임의의 것으로부터 저장소로 전달되는 유체의 속도를 자동으로 조정하기 위한 보조 펌프가 존재할 수 있다.

따라서, 저장소는 바람직하게는 미리 결정된 시간 동안 제1 밸브를 개방함으로써 제1 밸브를 통해 mRNA 생산 시스템으로부터 전달된 현탁액 중의 침전된 mRNA 분자를 포함한다. 미리 결정된 시간 동안 제5 밸브를 개방함으로써, 제1 용액이 현탁액 중의 침전된 mRNA 분자에 부가될 수 있고, 이어서 혼합물은 연속 TFF의 적어도 한 라운드 동안 필터 장치로 전달될 수 있으며, 여기서 필터 막은 바람직하게는 300 kDa 내지 0.65 μm의 분자량 컷-오프를 갖는다. 따라서, 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액은, 예를 들어, 본원에 개시된 방법의 단계 (Ia)에 따른 IVT 혼합물로부터의 성분 예컨대 단백질, 염 및/또는 NTP부터 정제될 수 있다. 정제된 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액은 바람직하게는 보유물로서 저장소로 다시 전달된다. 단계 (Ib)를 수행하고 이에 따라 단계 (Ia)로부터 수득된 정제된 침전된 mRNA 분자를 세척하고 용해시키기 위해, 제6 밸브를 미리 결정된 시간 동안 개방한다. 따라서, 제2 용액은 저장소에 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액에 부가될 수 있다. 바람직하게는 1 kDa 내지 0.65 μm의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막을 갖는 필터 장치를 사용하여 연속 TFF의 적어도 한 라운드를 수행함으로써, 예를 들어, 제1 용액에 포함된 NH₄OAc를 제거할 수 있다. 미리 결정된 시간 동안 제7 밸브를 개방함으로써, 제3 용액을 저장소 내의 세척되고 용해된 mRNA 분자에 부가할 수 있다. 필터 막이 바람직하게는 50 kDa, 보다 바람직하게는 100 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 장치를 사용하여 연속 TFF의 적어도 한 라운드를 수행함으로써, 부전 mRNA 분자 및 mRNA 분자 가수분해 산물은 본원에 개시된 방법의 단계 (IIa)에 따라 효율적으로 제거될 수 있다. 단계 (IIa)로부터 수득된 정제된 mRNA 분자를 세척하기 위해, 예를 들어 제3 용액의 성분을 제거함으로써, 단계 (IIb)가 이어서 수행될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 50 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막을 포함하는 필터 장치를 사용하여 연속 TFF의 적어도 한 라운드 동안 정제된 mRNA 분자에 물을 부가하거나 또는 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트를 포함하는 제4 용액을 부가하기 위해 제6 또는 제8 밸브를 미리 결정된 시간 동안 개방한다.

임의로, 단계 (Ib)와 (IIa) 사이에 추가 단계가 수행된다. 따라서, TFF 시스템은 바람직하게는 제9 밸브를 통해, 예를 들어 저장소와 유체 연결되는 제7 추가 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제7 추가 용기는 제5 용액을 포함할 수 있으며, 여기서 제5 용액은 바람직하게는 적어도 제3 용액의 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 상기 제3 용액으로서 더 높은 농도로 포함한다. 단계 (Ib)를 수행한 후 미리 결정된 시간 동안 제9 밸브를 개방함으로써, 제5 용액은 제2 용액에 용해된 mRNA 분자에 부가될 수 있다. 이것은 TFF 시스템에서 적어도 킬레이트제의 농도를 제3 용액에 대해 본원에 명시된 바와 같은 각각의 농도로 조정하는데 필요한 시간을 단축시킴으로써 본 발명의 방법의 처리량 및 재현성이 증가될 수 있다는 이점을 갖는다. 더욱이, 보조 펌프는 제7 추가 용기로부터 저장소로 전달되는 유체의 속도를 자동으로 조정하기 위해 존재할 수 있다 (제시되지 않음).

임의로, mRNA 분자 생산 시스템은 바람직하게는 중간 밸브를 통해, mRNA 분자 생산 시스템의 연결 튜빙과 유체 연결되는 중간 용기를 추가로 포함할 수 있다. 중간 용기는 바람직하게는 멸균 백일 수 있다. 미리 결정된 시간 동안 제1 밸브 및 중간 밸브를 개방함으로써, mRNA 분자를 포함하는 현탁액 또는 용액의 적어도 특정 분획이 TFF 시스템으로부터 mRNA 분자 생산 시스템으로 전달될 수 있고/거나 mRNA 분자 생산 시스템으로부터 TFF 시스템으로 전달될 수 있다. 이는 바람직하게는 미리 결정된 시간 동안 상기 현탁액 또는 용액의 적어도 특정 분획을 저장하는데 유리할 수 있다. 따라서, 상기 현탁액 또는 용액의 적어도 상기 분획은 추가 라운드의 정제, 예를 들어 단계 (Ia) 및 (Ib), 단계 (IIa) 및 (IIb), 및/또는 그의 조합에 이의를 제기할 수 있다. 더욱이, 중간 용기에서 현탁액 또는 용액의 적어도 특정 분획을 저장하는 동안, TFF 시스템 및/또는 mRNA 분자 생산 시스템을 클리닝하고, 물 및/또는 완충제로 세척하고/거나 멸균할 수 있다. 임의로 또는 또 다른 한편으론, 중간 용기는 이러한 중간 용기에 포함된 용액 또는 현탁액, 바람직하게는 정제된 mRNA 분자를 포함하는 용액 또는 현탁액의 적어도 특정 분획을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 임의로, 시스템은 추가 여과 단계를 위한 필터를 추가로 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 상기 필터는 최종 여과 단계를 위하여 0.3 μm 미만, 예를 들어 0.22 μm의 공극 크기를 갖는 필터 막을 포함할 수 있으므로, 중간 용기로부터 수득된 바와 같은 정제된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액의 최종 여과에 유용할 수 있다.

예를 들어, 탈인산화하고, 5' 캡 및/또는 3' 폴리(A) 꼬리를 부가함으로써, 정제될 mRNA 분자를 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 특히, 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 mRNA 분자의 3' 폴리아데닐화 전에 적어도 한 번 수행되는 것이 바람직하고, 단계 (Ia) 내지 (Ib)는 5' 캡핑 전에 적어도 한 번 수행되는 것이 바람직하다. 임의로, 수득된 mRNA 분자는 적어도 제1 단계 (Ia) 및 적어도 제1 단계 (Ib) 후에 탈인산화된 다음, 적어도 제2 단계 (Ia) 및 적어도 제2 단계 (Ib) 후에 탈인산화될 수 있다. 따라서, 시스템은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다 (도시되지 않음): 바람직하게는 캡핑에 필요한 시약을 포함하고 바람직하게는 제4' 밸브를 통해 mRNA 생산 시스템의 연결 튜빙과 유체 연결되는 제2' 추가 용기; 바람직하게는 탈인산화에 필요한 시약을 포함하고 바람직하게는 제4" 밸브를 통해 mRNA 생산 시스템의 연결 튜빙과 유체 연결되는 제2" 추가 용기; 및 바람직하게는 폴리(A) 꼬리, 예를 들어 적어도 폴리(A) 폴리머라제를 효소적으로 부가하는데 필요한 시약을 포함하고, 바람직하게는 제4"' 밸브를 통해 mRNA 생산 시스템의 연결 튜빙과 유체 연결되는 제2"' 추가 용기. 미리 결정된 시간 동안 제1 밸브 및 중간 밸브를 개방함으로써, 정제될 mRNA 분자를 포함하는 각각의 현탁액의 적어도 특정 분획이 TFF 시스템으로부터 mRNA 생산 시스템의 중간 용기로 전달될 수 있다. 제1 밸브를 폐쇄하고 제4', 4" 및/또는 4"' 밸브를 개방함으로써, mRNA 분자의 캡핑, 탈인산화 및/또는 폴리아데닐화가 바람직하게는 중간 용기에서 수행될 수 있다. 또 다른 한편으론 또는 부가적으로, 반응 용기가 발효기가 아닌 경우, 중간 용기 대신 반응 용기를 사용할 수 있으므로, 중간 밸브 대신 제2 밸브가 개방된다. 제4', 제4" 및/또는 제4"' 밸브를 폐쇄하고 제1 밸브를 개방함으로써, 변형된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액이 mRNA 분자 생산 시스템으로부터 TFF 시스템으로 전달될 수 있다.

주목할 만하게, 필터 장치는 자동으로 교환될 수 있는 1개 초과의 필터 막을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 필터 장치는, 예를 들어 각각 필터 칼럼을 포함하는 1개 초과의 필터 장치 유닛을 포함하고, mRNA 분자는 연속 TFF를 위해 각각의 방법 단계에 대해 상기 명시된 바와 같은 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막을 갖는 유닛 중 적어도 하나로 전달된다.

더욱이, 도 2에 제시된 바와 같이, 시스템은 출력, 예를 들어, 제10 밸브를 통해 저장소와 유체 연결되는 출력 용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 출력 용기는 정제된 mRNA 분자를 포함하는 용액 또는 현탁액의 적어도 특정 분획을 저장하기 위한 멸균, 바람직하게는 일회용 백을 지칭하거나 또는 이와 유체 연결되어 있다. 제10 밸브를 개방함으로써, 정제된 mRNA 분자를 수득할 수 있다. 또 다른 한편으론, (마지막으로 수행된) 단계 (IIb)에서, 정제된 mRNA 분자는 보유물보다는 투과물에 포함될 수 있다. 임의로, 시스템은 추가 여과 단계를 위한 필터를 추가로 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 상기 필터는 최종 여과 단계를 위해, 0.3 μm 미만, 예를 들어 0.22 μm의 공극 크기를 갖는 필터 막을 포함할 수 있고, 이에 따라 정제된 mRNA 분자, 예를 들어 투과물을 포함하거나 또는 출력 용기로부터 수득된 바와 같은 현탁액의 최종 여과에 유용할 수 있다. 더욱이, 보조 펌프는 저장소로부터 출력으로 전달되는 유체의 속도를 자동으로 조정하기 위해 존재할 수 있다 (제시되지 않음).

시스템은 바람직하게는 자동 조절되는 냉각 및/또는 가열 요소를 추가로 포함할 수 있다 (제시되지 않음). 상기 냉각 및/또는 가열 요소는 튜빙, 용기 (예를 들어 반응 용기, 중간 용기, 추가 용기 및/또는 저장소), 및/또는 필터 장치 중 하나 이상 주위에 적어도 부분적으로 위치할 수 있다. 바람직하게는, 냉각 요소는 저장소 및/또는 필터 장치 주위에 적어도 부분적으로 위치된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 각각의 냉각 및/또는 가열 요소를 제어함으로써 0℃ 내지 25℃, 바람직하게는 대부분의 단계에 대해 2℃ 내지 8℃의 온도에서 수행될 수 있다. 따라서 다량의 정제된 mRNA 분자를 수득할 수 있다.

바람직하게는, 시스템은 pH 조절을 위한, 바람직하게는 자동 조절되는 요소를 추가로 포함할 수 있다 (제시되지 않음). 상기 요소는 용액 및/또는 현탁액의 pH를 측정하기 위한 장치, 예컨대 pH 측정기, 및 임의로 pH 조절 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 후자는 바람직하게는 용기 (예를 들어 반응 용기, 중간 용기, 추가 용기 및/또는 저장소) 중 적어도 하나와 유체 연결되어 있다. 따라서, 각각의 용기에서의 용액 또는 현탁액의 pH를 측정 및/또는 제어할 수 있다. 부가적으로 또는 또 다른 한편으론, 투과물의 pH는 바람직하게는 연속적으로 측정될 수 있다. 따라서 mRNA 정제 프로세스를 모니터링하고 품질을 검사할 수 있다.

더욱이, 핵산 농도 및/또는 순도는 바람직하게는 투과물을 사용하여 측정될 수 있다. 이는 예를 들어 약 260 및 280 nm에서의 UV 범위에서 mRNA 분자를 포함한 분자의 흡광도를 측정함으로써 광도 측정으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 약 260 nm에서 수득된 값 대 약 280 nm에서 수득된 값의 몫은 용액 또는 현탁액 중의 각각의 핵산의 순도를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 약 1.8 내지 약 2.0의 비율은 고 순도의 DNA 또는 RNA 분자를 나타낼 수 있는 반면, 예를 들어 1.8 미만의 비율은, 예를 들어 단백질에 의한 불순물을 나타낼 수 있다. 따라서, mRNA 분자 농도를 포함하여, 예를 들어 투과물의 조성에 관한 정보를 수득할 수 있다. 임의로 또는 또 다른 한편으론, mRNA 분자 농도는 바람직하게는 연속적인 전도도 측정에 기초하여 결정될 수 있다. 따라서, 시스템은 바람직하게는 자동으로 조절되는, 핵산 정량화를 위한 요소 (제시되지 않음) 예컨대 분광계 및/또는 분광 광도계, 예를 들어 나노드롭, 및/또는 전도도 측정을 수행하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.

용기 (예를 들어 반응 용기, 중간 용기, 추가 용기 및/또는 저장소) 중 어느 하나 또는 모든 용기를 각각의 저울 위에 위치시킬 수 있다. 따라서, 각각의 용기의 중량이 측정될 수 있고, 각각의 용기에서 정제되거나 또는 정제될 mRNA 분자를 포함하는 용액 또는 현탁액의 중량이 결정될 수 있으며, 각각의 용액 또는 성분, 예를 들어 제1, 제2, 제3, 제4, 및/또는 제5 용액, 및/또는 IVT 시약의 적절한 양이 부가될 수 있다. 따라서, mRNA 생산 및/또는 정제 프로세스를 최적화하고 자동화할 수 있다.

mRNA 생산 및/또는 정제 프로세스의 자동 조절을 보장하기 위해, 시스템은 바람직하게는 상기 언급된 수단을 제어하도록 적응된 제어 수단, 예를 들어 밸브, (보조) 펌프, 가열 및/또는 냉각 요소, pH 조절을 위한 요소, 핵산 정량화를 위한 요소, 전도도 측정을 수행하기 위한 수단, 및/또는 저울을 포함한다. 본원에서, 용어 "시스템"은 장치로서 이해되어야 하며, 그와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

mRNA 분자 생산 시스템의 연결 튜빙과 관련하여, 상기 연결 튜빙은, 예를 들어 반응 용기와 추가 용기를 일련으로 유체적으로 연결하는, 도 2에 제시된 바와 같은 연결 튜빙일 수 있다. 또 다른 한편으론, 연결 튜빙은 각각의 용기를 연결하는 2개 이상의 튜빙을 지칭할 수 있다. 따라서, 연결 튜빙은, 예를 들어, 적어도 반응 용기와 제1 추가 용기를 유체적으로 연결하는 제1 투빙 및 반응 용기와 제2 추가 용기를 유체적으로 연결하는 제2 튜빙을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 상기 2개 이상의 튜빙 중 1개 이상은 각각의 용기와 임의로 보조 펌프 사이에 밸브를 포함한다.

상기 기재된 시스템의 성분 중 어느 하나는 일회용 성분일 수 있다. 바람직하게는, 용기 (예를 들어 중간, 반응 및/또는 추가 용기) 중 하나 이상 및/또는 (중간) 밸브 중 하나 이상은 각각의 일회용 용기 및 밸브일 수 있다. 바람직하게는, 중간 용기 및/또는 반응 용기는 각각의 일회용 용기이다. 임의로, 전체 시스템은, 예를 들어 특이적 mRNA 분자의 생산 및 정제를 위한 일회용 시스템일 수 있다. 이것은 각각의 mRNA 분자가 오염의 위험을 저하시키기 위해 필요한 시간 및 비용 소모적 세척, 클리닝 및/또는 멸균 단계를 피하면서 멸균 조건 하에서 생산 및 정제될 수 있다는 이점을 갖는다. 따라서, 바람직하게는 상기 기재된 시스템의 하나 이상의 성분은 각각의 일회용 성분이다.

도 2에 예시적으로 제시된 바와 같은 시스템은 몇 가지 이점을 갖는다. 이러한 폐쇄형 시스템에서는, 예를 들어 RNase에 의한 오염의 위험이 최소화되는 것과 동시에, 연속 TFF를 사용하여 필터 막의 막힘을 피할 수 있으므로 처리량이 증가될 수 있다. 더욱이, 그러한 시스템은, 예를 들어 펌프 조절된 유체 전달을 통해 다루기가 쉽고, 예를 들어 (보조) 펌프 및/또는 밸브를 자동으로 조절함으로써 심지어 완전히 자동화할 수도 있다. 더욱이, 고객의 특이적 요구 사항에 따라 쉽게 확장가능하고 잘 조정할 수 있다. 따라서, mRNA 분자의 고처리량 정제는 도 2에 제시된 바와 같은 시스템을 사용하여 개시된 방법에 따라 매우 효율적이고 자동화된 방식으로 수행될 수 있다.

본 발명은 추가로 (a) 상기 기재된 mRNA 분자를 정제하는 방법에 따라 mRNA 분자를 정제하는 단계, 및 (b) 이와 같이 수득된 mRNA 분자를 제약 조성물로 제형화하는 단계를 포함하는, 제약 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이것은 그의 결핍 또는 결함이 질환과 관련되고/거나 그의 존재가 세포에 필요하거나 유익한 단백질의 합성을 허용하기 위한 mRNA 분자의 투여와 같은 제약 맥락에서 정제된 mRNA 분자의 적용에 특히 관심이 있다.

바람직하게는, 세포 또는 세포 부근에서 본 발명에 따라 정제된 mRNA 분자로부터 번역될 수 있는 아미노산 서열, 예를 들어 그의 결여 또는 결함있는 형태가 질환 또는 질병에 대한 촉발제이고, 그의 제공이 질환 또는 질병을 완화하거나 예방할 수 있는 아미노산 서열, 또는 세포 또는 그의 주변에서 신체에 유익한 프로세스를 촉진시킬 수 있는 아미노산 서열의 기능이 필요하거나 유익하다. 코딩된 아미노산 서열은 완전한 아미노산 서열 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 추가로, 코딩된 아미노산 서열은 인자, 유도인자, 조절인자, 자극인자 또는 효소, 또는 그의 기능적 단편으로서 작용할 수 있으며, 여기서 이러한 아미노산 서열은 그의 기능이 장애, 특히 대사 장애를 치료하기 위해 또는 생체내 프로세스 예컨대 새로운 혈관, 조직 등의 형성을 개시하기 위해 필요한 것이다. 여기에서, 기능적 변이체는 세포 내에서의 기능이 필요하거나 또는 그의 결여 또는 결함있는 형태가 병원성인 아미노산 서열의 기능을 세포 내에서 수행할 수 있는 단편을 의미하는 것으로 이해된다.

바람직하게는, 이러한 아미노산 서열은 최적 이하의 아미노산 서열 생합성에 의해 야기되는 생리적 기능을 생성 또는 재생하고 따라서 질환의 경과에 직접 또는 간접적으로 유리하게 영향을 미치기 위한 보충 또는 의학적 목적에서의 적용과 관련하여 유리하다. 공지된 유전적 기반을 가진 장애는, 예를 들어 낭포성 섬유증, 혈우병, 고혈압, 콜레스테롤 수치 상승, 암, 신경퇴행성 장애, 정신 질병 등이다. 현재 22,993개의 인간 유전자 및 유전 장애 항목이 각각의 유전자와 표현형에 대한 설명이 포함된 온라인 카탈로그는 ONIM (인간의 온라인 멘델식 유전) 웹 페이지 (http://onim.org)에서 이용가능하며; 각각의 서열은 유니프로트(Uniprot) 데이터베이스 (http://www.uniprot.org)로부터 이용가능하다. 비제한적인 예로서, 하기 표 2는 일부 선천성 질환 및 상응하는 유전자(들)를 열거한다. 세포성 신호전달 경로의 높은 정도의 상호작용으로 인해, 특정 유전자의 돌연변이는 여러 병원성 증상을 유발하며, 그 중 특징적인 증상만 표 2에 열거되어 있다.

단백질은 또한, 예를 들어 항원으로서 작용하는 면역원성 반응을 유도할 잠재력을 가질 수 있다. 이러한 단백질은 백신 접종을 포함한 보충 또는 의학적 목적의 적용에 적합하다.

표 2

mRNA 분자를 정제하는 단계와 관련하여, 본 발명에 따라 mRNA 분자를 정제하는 방법과 연계해서 상기 기재된 바와 동일하게 적용되며, 여기서 상기 방법은 (Ia) 제1 용액을 사용하여 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 침전된 mRNA 분자를 정제하는 단계, (Ib) 제2 용액을 사용하여 단계 (Ia)로부터 수득된 정제된 침전된 mRNA 분자를 세척하고 용해시키는 단계, (IIa) 킬레이트제 예컨대 EDTA를 포함하는 제3 용액을 사용하여 단계 (Ib)로부터 수득된 용해된 mRNA 분자로부터 mRNA 분자를 정제하는 단계, 이어서 (IIb) 제4 용액을 사용하여 단계 (IIa)로부터 수득된 정제된 mRNA 분자를 세척하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 접선 유동 여과를 사용하여 수행된다.

이와 같이 수득된 정제된 mRNA 분자를 제약 조성물로 제형화하는 단계와 관련하여, 상기 단계는 단계 (IIb) 및 1회 초과의 단계 (IIb)의 경우에는 마지막 단계 (IIb)에서 각각 사용된 제4 용액으로서 물을 사용하여 mRNA 분자를 정제하는 경우에는 나트륨 클로라이드 또는 시트레이트를 부가하는 것을 포함할 수 있다. 이는 정제된 mRNA 분자가 이미 나트륨 클로라이드 또는 시트레이트를 포함하는 용액에서 수득되지 않거나 또는 정제된 mRNA 분자가 이미 나트륨 클로라이드 또는 시트레이트를 함유하지만 투여에 원하는 것보다 또 다른 농도로 함유된 용액에서 수득되는 경우에 유리하다. 후자의 경우, 방법은 각각의 농도를 결정하는 단계 및 필요에 따라 이를 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 정제된 mRNA 분자는 상기 기재된 mRNA 분자를 정제하는 방법의 (마지막) 단계 (IIb)에서, pH가 3 내지 6, 바람직하게는 4 내지 5인 각각의 농도로 상기 나트륨 클로라이드 또는 시트레이트를 포함하는 제4 용액을 사용함으로써 투여에 유리한 농도의 나트륨 클로라이드 또는 시트레이트를 추가로 포함하는 용액에 포함된다.

수득된 정제된 mRNA 분자를 제약 조성물로 제형화하는 것은 제약상 허용되는 담체를 부가하는 단계를 포함할 수 있다. 정제된 mRNA 분자는 바람직하게는 유효량, 즉 제약 조성물이 투여될 대상체에서 검출가능한 치료 반응을 유도하기에 충분한 양으로 포함된다. 정제된 mRNA 분자 및/또는 제약 조성물은 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼 뿐만 아니라 크림 및 좌제일 수 있지만, 또한 분말, 정제 또는 에어로졸의 형태를 가질 수 있다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 건전한 의학적 판단 범위 내에서 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 것으로 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화학적 화합물, 물질, 성분 및/또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 제약상 허용되는 담체는 투여량, 흡수, 용해도 또는 약동학적 고려 사항의 관점에서 취급을 용이하게 하기 위해 제약상 활성 물질과 함께 제형화된 불활성 물질이다.

적합한 제약상 허용되는 담체의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 인산염 완충 식염수 용액, 완충제, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제 및 멸균 용액을 포함한다. 특히, 수성 담체는 식염수 및 완충 매질을 포함한, 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레이트이다. 제약상 허용되는 담체의 추가 예는 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액, 시트레이트, 인산염 및 다른 유기 산; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨 및 칼륨; 저분자량 (> 10개 아미노산 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 또는 젤라틴; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 히스티딘, 글루타민, 리신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 글리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 탄수화물; 모노사카라이드; 디사카라이드; 다른 당, 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 상표명 트윈(Tween)으로 시판되는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 프로필렌 글리콜, 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜; 메티오닌, 아스코르브산 및 토코페롤을 포함한 항산화제; 및/또는 보존제, 예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 제약상 허용되는 담체 및 그의 제형은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co]에 상세히 기재되어 있다. 더욱이, 보존제, 안정화제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체, 나노시스템 또는 리포좀 등이 또한 존재할 수 있다.

본 발명은 추가로 본원에 개시된 각각의 방법 중 임의의 것에 따라 정제되고 상기 기재된 방법에 따라 제조된 mRNA 분자를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 제약 조성물은 이러한 제약 조성물이 투여되는 대상체의 세포에서 아미노산 서열 예컨대 단백질의 번역을 조정 및/또는 증강시키는데 유리하며, 여기서 상기 아미노산 서열 예컨대 단백질의 존재는 유익하고/거나, 예를 들어 질환의 맥락에서 대상체에게 필요하다.

제약 조성물과 관련하여, mRNA 분자, 이들의 정제 및 제약 조성물의 제형화는 상기 기재된 각각의 실시양태의 맥락에서 언급된 특징 및 이점을 포함하여 상기 언급된 바와 동일하게 적용된다.

본 발명의 제약 조성물은 통상의 기술자에게 공지된 광범위한 부류의 투여 형태 및 투여 경로, 예컨대 바늘 주사, 흡입기, 분무기, 크림, 폼, 젤, 로션 및 연고의 사용을 통해 투여될 수 있다. 용량 및 작용 지속기간은 상기 정제된 mRNA 분자가 수행해야 하는 기능에 따라 다르며 각각의 경우에 의도적으로 조정되어야 한다. 예를 들어, 상기 정제된 mRNA 분자가 유전자 결손으로 인한 질환의 만성 요법에 사용되는 경우, 작용 지속기간은 가능한 한 길 것이지만, 다른 적응증의 경우에는 특이적 기간대로 조정될 수 있다. 더욱이, 적합한 제약 조성물로 제형화된 상기 정제된 mRNA 분자의 전신 투여가 가능하다.

도 1: 개시된 방법에 따라 순환 mRNA 분자를 사용하는 연속 접선 유동 여과 (TFF) 시스템의 개요. mRNA 분자는 단계 (Ia)에서 현탁 상태에 있고, 단계 (Ib)에서 용해되며, 단계 (IIa) 및 (IIb)의 경우 각각 용액 상태이다.

도 2: 개시된 방법에 따라 mRNA 분자를 정제하기 위한 예시적인 시스템의 개요 (밸브, (보조) 펌프 및/또는 (추가) 용기의 위치가 예시적으로 도시됨).

도 3: 실온에서 단계 (Ia) 및 (Ib)에 따라 각각의 시험관내 전사 (IVT) 믹스를 정제한 후 mRNA 분자를 코딩하는 비변형된 tdTomato를 포함하는 TFF 보유물의 콜로이드성 쿠마시 염색이 뒤따르는 SDS-PAGE. 레인 1: 대조군으로서 암모늄 아세테이트 (NH₄OAc) 중의 효소 믹스; 레인 2: TFF 시스템 프라이밍 후 효소 믹스; 레인 3: 뉴클레아제 무함유 물 중의 TFF 후 효소 믹스; 레인 4: IVT 믹스; 레인 5: TFF 시스템 프라이밍 후 IVT 믹스; 레인 6: 뉴클레아제 무함유 물 중의 TFF 후 IVT 믹스; 레인 7: 대조군으로서 뉴클레아제 무함유 물 중의 효소 믹스. 효소 믹스는 RNase 억제제, T7 RNA 폴리머라제, 무기 피로포스파타제 및 DNase I로 구성되었다.

도 4: 실온에서 단계 (Ia) 및 (b)에 따라 각각의 시험관내 전사 (IVT) 믹스를 정제한 후 mRNA 분자를 코딩하는 비변형된 tdTomato를 포함하는 TFF 보유물의 콜로이드성 쿠마시 염색이 뒤따르는 SDS-PAGE. 레인 1: 대조군으로서 뉴클레아제 무함유 물 중의 효소 믹스; 레인 2: TFF 전 IVT 믹스; 레인 3: TFF 시스템 프라이밍 후 IVT 믹스; 레인 4: 뉴클레아제 무함유 물 중의 TFF 후 IVT 믹스; 레인 5: 뉴클레아제 무함유 물 중의 TFF 후 IVT 믹스 (2.5 M 암모늄 아세테이트 및 뉴클레아제 무함유 물로 투석여과 후, 각각의 믹스는 단백질 제거를 효율적으로 검출하기 위해 2.5배 농축됨). 효소 믹스는 RNase 억제제, T7 RNA 폴리머라제, 무기 피로포스파타제 및 DNase I로 구성되었다.

도 5: 4℃에서 단계 (Ia) 및 (b)에 따라 각각의 시험관내 전사 (IVT) 믹스를 정제한 후 mRNA 분자를 코딩하는 비변형된 tdTomato를 포함하는 TFF 보유물의 콜로이드성 쿠마시 염색이 뒤따르는 SDS-PAGE. 레인 1: 대조군으로서 뉴클레아제 무함유 물 중의 효소 믹스; 레인 2: TFF 전 IVT 믹스; 레인 3: 1회 세척 용적 (초기 공급물 용적과 동일) 후 IVT 믹스; 레인 4: 뉴클레아제 무함유 물 중의 TFF 후 IVT 믹스; 레인 5: 뉴클레아제 무함유 물 중의 TFF 후 IVT 믹스 (2.5 M 암모늄 아세테이트 및 뉴클레아제 무함유 물로 투석여과 후, 각각의 믹스는 단백질 제거를 효율적으로 검출하기 위해 2.5배 농축됨). 효소 믹스는 RNase 억제제, T7 RNA 폴리머라제, 무기 피로포스파타제 및 DNase I로 구성되었다.

도 6: A) 리포펙타민 메신저 맥스를 사용하여 제형화된, TFF 정제된 hCFTR mRNA 및 암모늄 아세테이트 침전에 이어 에탄올 70% 세척에 의해 정제된 hCFTR mRNA로 형질감염된 후 HEK293 세포에서 번역된 hCFTR 단백질의 웨스턴 블롯. 하우스 키퍼로서 Hsp90 단백질 밴드가 제시된다. 비형질감염된 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. B) 발현된 hCFTR은 이미지 랩 소프트웨어를 사용하여 농도측정 분석에 의해 정량화되고 HSP90 단백질로 정규화되었다. 비형질감염된 세포 (UT)를 음성 대조군으로서 사용하였다.

도 7: 세척 용적을 백분율로 변화시킨 후 hCFTR 표적 mRNA 분자의 양과 비교하여 hCFTR이 아닌 mRNA 분자에 스파이킹된 상이한 잔류량. 접선 유동 여과는 실온에서 수행되었다.

도 8: 세척 용적을 백분율로 변화시킨 후 hCFTR 표적 mRNA 분자의 양과 비교하여 hCFTR이 아닌 mRNA 분자에 스파이킹된 상이한 잔류량. 접선 유동 여과는 4℃에서 수행되었다.

도 9: 단편 분석기를 사용한 모세관 겔 전기영동은 4℃에서 TFF 정제 전 (A) 및 후 (B) 25 nt 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드를 함유하는 상이한 DNA 올리고뉴클레오티드 (15 nt, 25 nt 및 120 nt)로 스파이킹된 tdTomato mRNA로부터 수행되었다. 하단 마커는 각각의 모세관 실행에서 피크의 체류 시간을 정규화하기 위해 단편 분석기의 시약 키트에 제공된 내부 표준이다 (15 nt 길이 RNA 올리고뉴클레오티드).

도 10: 대표적으로, 투과물 플럭스는 상이한 막횡단 압력 설정점에서 측정되었다.

도 11: 단편 분석기를 사용한 모세관 겔 전기영동은 실온에서 접근법 1에 따른 정제 전 (A), 단계 (Ib) 후 (B), 단계 (IIa) 후 (C), 및 단계 (IIb) 후 (D) 25 nt 및 120 nt 길이 DNA 올리고뉴클레오티드 및 256 nt 길이 GLP-1 mRNA 분자로 스파이킹된 hCFTR mRNA로부터 수행되었다. 하단 마커는 각각의 모세관 실행에서 피크의 체류 시간을 정규화하기 위해 단편 분석기의 시약 키트에 제공된 내부 표준이다 (15 nt 길이 RNA 올리고뉴클레오티드).

도 12: 단편 분석기를 사용한 모세관 겔 전기영동은 실온에서 접근법 2에 따른 정제 전 (A) 및 후 (B) 25 nt 및 120 nt 길이 DNA 올리고뉴클레오티드 및 256 nt 길이 GLP-1 mRNA 분자로 스파이킹된 hCFTR mRNA로부터 수행되었다. 하단 마커는 각각의 모세관 실행에서 피크의 체류 시간을 정규화하기 위해 단편 분석기의 시약 키트에 제공된 내부 표준이다 (15 nt 길이 RNA 올리고뉴클레오티드).

본 발명의 다른 측면 및 이점은 제한이 아닌 예시의 목적으로 제공되는 하기 실시예에서 설명될 것이다. 본 출원에 인용된 각각의 간행물, 특허, 특허 출원 또는 다른 문서는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

실시예

방법 및 재료는 본 개시내용에서 사용하기 위해 본원에 기재되어 있고; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.

본원에 사용된 약어 및 그의 각각의 설명이 표 3에 열거되어 있다.

표 3

재료 및 방법

사용된 재료, 장치, 소프트웨어, 및 시험 시스템

재료가 표 4에 열거되어 있다.

표 4

장치가 표 5에 열거되어 있다.

표 5

소프트웨어가 표 6에 열거되어 있다.

표 6

시험 시스템이 표 7에 열거되어 있다.

표 7

TFF를 통한 IVT 믹스의 정제 - 단계 (Ia) 및 (Ib)

하기에서, 1644개의 뉴클레오티드 (nt) 길이를 갖는 비변형된 시험관내 전사된 비변형된 tdTomato 표적 mRNA 분자를 포함하는 시험관내 전사 (IVT) 믹스를 사용하였다. 더욱이, T7 RNA 폴리머라제, 무기 피로포스파타제, RNAse 억제제, 및 DNase I을 포함하는 효소 믹스를 사용하였다.

RNA 침전

IVT 믹스 및 효소 믹스를 각각 pH 7의 빙냉 5 M NH₄OAc의 동일한 양으로 최종 농도 2.5 M NH₄OAc가 되도록 침전시키고 얼음 위에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하였다. TFF 전에, 각각의 믹스를 2.5 M NH₄OAc pH 7로 1:1 희석하여 믹스에서 약 0.5 mg/ml mRNA의 최종 농도로 희석하였다. IVT 또는 효소 믹스를 TFF 시스템에 연결하고, 투과물 클램프를 폐쇄한 상태에서 IVT 믹스를 50 ml/min으로 순환시킴으로써 초기에 10분 동안 프라이밍하였다.

단계 (Ia): 단백질, 뉴클레오티드 및 염의 제거

500 kDa MWCO mPES 필터 칼럼을 사용하여 약 200-300 mbar의 일정한 TMP에서 각각의 믹스의 투석여과를 50 ml/min으로 수행하였다. 각각의 믹스를 10 세척 용적의 2.5 M NH₄OAc pH 7로 투석여과하였다. 이러한 단계는 시험관내 전사로부터 완충제 성분 뿐만 아니라 효소, 뉴클레오티드를 효율적으로 제거하였다. 단계 (Ia)는 임의의 다른 중간 생산 단계 (예를 들어 탈인산화, 후-캡핑, 폴리아데닐화,...)로부터 임의의 다른 단백질 및/또는 효소를 제거하는데 사용될 수 있다. 일부 효소 (예를 들어 관심 mRNA 분자와 높은 친화도로 결합하는 폴리(A) 폴리머라제)의 경우, 세제 (예를 들어 SDS, LDS,...)를 암모늄아세테이트 완충제 pH 7에 부가할 수 있다. 폴리(A) 폴리머라제가 폴리아데닐화에 사용되는 경우, 후속 단계 (Ia)는 바람직하게는 20℃ 내지 30℃, 바람직하게는 23℃ 내지 27℃, 보다 바람직하게는 25℃의 온도에서 수행된다. 이러한 온도는 효율적인 폴리(A) 폴리머라제 제거에 유리하다.

단계 (Ib): 단계 (Ia)로부터 NH ₄ OAc의 제거

NH₄OAc를 제거하고 mRNA 분자를 분리하기 위해, 100 kDA MWCO mPES 필터 칼럼을 50 ml/min의 유속 및 약 200-300 mbar의 TMP에서 뉴클레아제 무함유 물을 사용하여 10 세척 용적으로 투석여과하는데 사용하였다. 또 다른 한편으론, mRNA 분자의 크기에 따라 50 kDa MWCO mPES 필터 칼럼을 사용할 수 있다.

단계 (Ia) 및 (Ib)의 정제 효율을 조사하기 위해, mRNA 분자를 포함하는 TFF 보유물을 TFF 전 및 후 (즉, 단계 (Ib))에 샘플링하고, 예를 들어 UV-측정, 단편 분석기, 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 이어 예를 들어 콜로이드성 쿠마시 염색을 사용하여 분석할 수 있다.

도 3 내지 5에 제시된 바와 같이, 상기 기재된 바와 같이 단계 (Ia) 및 (Ib)를 적용함으로써 mRNA 분자로부터 효소를 효율적으로 제거할 수 있다. 이로써 mRNA 분자는 TFF 칼럼에 의해 유지되는 반면, 효소 및/또는 단백질은 효율적으로 제거되었다. 도말표본 피크 분석 결과, 도말표본 프리-피크는 TFF 정제 전 4.7%였고, 4℃에서 TFF 정제 시 +1.3%, 실온에서 수행된 TFF 정제 후 +1.8%의 편차를 보였다. 따라서 mRNA의 분해는 관찰될 수 없었다.

TFF를 통한 침전된 및 용해된 mRNA의 정제 - 단계 (IIa) 및 (IIb)의 개발

하기에서는, 침전 및 용해된 mRNA를 추가 정제에 사용하였다.

상이한 여과 막 및 mRNA 전달에 대한 EDTA의 효과를 시험함

뉴클레아제 무함유 물 단독을 사용하거나 또는 뉴클레아제 무함유 물을 부가의 10 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)과 함께 사용하여 mRNA 분자의 전달과 관련하여 다양한 공극 크기를 갖는 상이한 필터 막을 시험하였다. 각각 500 kDa, 300 kDa, 100 kDa 및 50 kDa의 분자량 컷-오프 (MWCO)를 갖는 4개의 mPES 칼럼을 시험하였다. TFF 시스템 상의 보유물 클램프를 사용하여 막횡단 압력 (TMP)을 조정하고, 각각 500 kDa 및 50 kDa의 MWCO를 갖는 칼럼의 경우에는 40 mbar로 유지하고, 각각 100 kDa 및 300 kDa의 MWCO를 갖는 칼럼의 경우에는 100 mbar로 유지하였다. 메인 펌프는 15 ml/min의 유속으로 설정되었고 TFF는 실온에서 수행되었다. 공급물 중의 초기 mRNA 분자 농도는 0.1 mg/ml이었고 보유물 및 투과물 중의 mRNA 분자 농도는 UV 측정을 사용하여 측정되었다. 각각의 칼럼은 원래 샘플 용적의 10x 세척 용적으로 시험되었다.

EDTA를 사용하지 않으면, mRNA 분자는 500 kDa의 MWCO를 갖는 시험된 칼럼에 의해 유지되었다. 더 작은 공극 크기 (즉, 300 kDa, 100 kDa 및 50 kDa)는 mRNA 분자의 통과를 허용하지 않을 것이며 따라서 EDTA가 없으면 더 이상 시험되지 않는다고 추정되었다.

EDTA를 사용하면, mRNA 분자는 놀랍게도 500 kDa MWCO 필터 막의 공극을 통해 이동하였으며, 300 kDa MWCO 필터 막을 사용하여 또한 부분적으로 손실되었다. 그러나, mRNA 분자는 10 mM EDTA의 존재하에 100 및 50 kDa MWCO 필터 막을 사용하여 성공적으로 유지될 수 있었다. 따라서, 하기에 제시된 실험에서 mRNA 분자의 여과를 위해 100 kDa MWCO 칼럼이 선택되었다.

10 mM EDTA로 여과한 후 일부 경우에 mRNA 분자의 산발적인 침전이 관찰되었다는 점에 유의해야 한다. 그러나, 이러한 침전은 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA를 포함하는 완충제를 사용함으로써 효율적으로 방지될 수 있었다.

40 mM MOPS 및 10 mM EDTA 투석여과 완충제의 제조

1 M 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS) 완충제를 제조하였으며, 여기서 MOPS는 뉴클레아제 무함유 물에 용해되었다. 이어서, 1 M MOPS 완충제의 pH를 32% NaOH를 사용하여 pH 7로 조정하였다. 수득된 pH 7의 1 M MOPS 완충제를 0.5 M EDTA 및 뉴클레아제 무함유 물과 혼합하여 최종적으로 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA를 포함하는 투석여과 완충제를 수득하였다.

핵산 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위한 세척 완충제 용적의 결정

TFF 프로세스의 효율성, 즉 부전 전사체 및/또는 가수분해 산물을 나타내는 핵산 올리고뉴클레오티드와 같은 불순물을 완전히 제거하는데 필요한 최소 수의 세척 주기는 막 필터에 의한 분자의 거부 및 그의 공극 크기에 크게 좌우된다. 따라서, 세척 완충제 용적의 각각의 효과를 조사하여 관심 mRNA 분자를 포함하는 침전 및 용해된 mRNA로부터 스파이킹된 핵산 올리고뉴클레오티드를 제거하는데 필요한 세척 주기의 수를 결정하였다.

이러한 실험을 위해, TFF 유속은 15 ml/min으로 설정되었고 TMP는 100 kDa MWCO mPES 필터 칼럼을 사용하여 약 40 mbar에서 일정하게 유지되었다. 총 공급물 용적 5 ml에서, 500 μL의 mRNA 분자에 표적 mRNA 분자 (m/m)의 2.5%를 나타내는 10 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드, 표적 mRNA 분자 (m/m)의 2.5%를 나타내는 50 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드 및 표적 mRNA 분자 (m/m)의 5%를 나타내는 120 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드를 스파이킹하였다. 역상 HPLC 분석을 위한 샘플은 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA를 포함하는 투석여과 완충제를 사용하여 원래 공급물 용적의 5x, 10x, 15x 및 20x 세척 용적 후에 채취하였다. 샘플을 채취하기 전에, 투과물 클램프를 폐쇄하고 보유물 밸브를 개방하여 5분 동안 50 ml/min로 보유물을 순환시켰다. 각각의 세척 주기에 대해 100 μL 샘플을 멸균 주사기를 사용하여 채취하고, 분석할 때까지 샘플을 얼음 위에 유지시켰다. TFF를 실온에서 수행하였다. 역상 HPLC 분석을 사용하여 샘플을 조사하였으며, 260 nm에서 검출된 영역이 샘플 중의 DNA 올리고뉴클레오티드의 상대적인 양을 대표한다. TFF 전의 상응하는 영역 (대조군)은 100% 올리고뉴클레오티드로 설정되었다.

모든 경우에, 5x, 10x, 15x 및 20x 세척 용적을 공급물 용적에 각각 적용한 후 핵산 올리고뉴클레오티드가 검출되지 않았다. 따라서, 그 결과는 이미 세척 완충제를 사용한 5x 세척 용적 후에 보유물에서 더 이상 핵산 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 없음을 제시하였다. 세척 완충제를 사용한 최소 10x 세척 용적은 mRNA 분자로부터 핵산 올리고뉴클레오티드를 제거하기에 충분한 것으로 결정되었다.

EDTA의 제거를 위해 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 세척 용적의 결정

TFF에 의한 DNA 올리고뉴클레오티드의 제거는 세척 완충제, 즉 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA를 포함하는 투석여과 완충제를 사용하여 수행되기 때문에, 후속 여과 단계는 세척 완충제를 뉴클레아제 무함유 물로 교환하는데 유리하다. 따라서, mRNA 분자로부터 세척 완충제를 제거하는데 필요한 세척 주기의 양을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 이전 실험으로부터, mRNA 분자를 포함하고 20x 세척 용적의 투석여과 완충제로 이전에 여과된 약 5 ml의 총 용적을 갖는 공급 용액을, 100 kDA MWCO mPES 필터 칼럼을 사용하여 40 mbar의 일정한 TMP 및 15 ml/min의 유속에서 뉴클레아제 무함유 물로 투석여과하였다. 역상 HPLC 분석을 위한 샘플은 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 원래 공급물 용적의 5x, 10x, 15x 및 20x 세척 용적 후에 취하였다. 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 각각의 세척 주기 후 잔류 EDTA의 양을 정량화하기 위해, 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA를 포함하는 투석여과 완충제를 적정하고 보정 표준 곡선을 기록하였다 (표 6 참조; MOPS-EDTA 보정 표준 곡선: log(y) =0.6467 log(x)+1.9128; r = 0,99462; r² = 0.99877; 곡선 모델: log/log). MOPS 완충제 단독은 260 nm에서 흡수 신호를 나타내지 않기 때문에, 표 8 및 표 9에 명시된 농도는 EDTA의 농도에 상응한다. 실험은 22℃ 실온에서 수행되었다. 표 9에는 각각의 세척 주기 후 EDTA 제거 후 데이터가 제시되어 있다.

표 9에 제시된 바와 같이, 세척 용적을 증가시킨 후 260 nm에서 역상 HPLC에 의해 검출된 피크 면적에 따른 EDTA의 감소량은 잔류 EDTA를 부분적으로 제거하기 위해 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 최소 10x 세척 용적이 필요하다는 것을 밝혀내었다.

표 8

표 9

결정된 파라미터의 시험

실온에서 수행된 이전 실험에서는, 단계 (IIa)에서 DNA 올리고뉴클레오티드를 제거하는데 필요한 투석여과 완충제를 사용한 세척 주기의 최소 수 뿐만 아니라 단계 (IIb)에서 잔류 EDTA를 제거하는데 필요한 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 세척 주기의 최소 수가 결정되었다. 결정된 파라미터를 시험하기 위해, 500 μg의 mRNA에 5 ml의 총 공급물 용적 중에서 표적 mRNA 분자 용적의 2.5%를 나타내는 10 nt 길이의 핵산 올리고뉴클레오티드, 표적 mRNA 분자 용적의 2.5%를 나타내는 50 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드, 및 표적 mRNA 분자 용적의 5%를 나타내는 120 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드를 스파이킹하였다 (표 8 및 표 9에서 "TFF 전"으로서 지칭됨).

하기 기재된 실험을 위해, 달리 명시되지 않은 경우 하기 설정이 사용되었다: 0.1 mg/ml mRNA 분자를 포함하는 공급 용액을 15 ml/min의 유속 및 약 40 mbar의 TMP에서 100 kDa MWCO mPES 필터 칼럼을 사용하여 투석여과하였다. 적용된 세척 용적은 두 경우 모두에서 10x, 즉 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA를 포함하는 투석여과 완충제를 사용한 10x 세척 용적에 이어 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 10x 세척 용적이었다 (표 8 및 표 9에서 "TFF 후"로서 지칭됨). mRNA 분자는 특히 고온에서 가수분해에 의해 분해되기 쉽기 때문에, mRNA 분자 가수분해를 최소로 유지하기 위해 4℃, 즉 얼음 물을 사용하여 실험을 수행하였다.

이러한 설정은 역상 HPLC를 사용하여 결정된 바와 같이 시험된 3가지 길이 모두의 DNA 올리고뉴클레오티드 (표 10) 뿐만 아니라 잔류 투석여과 완충제 (표 11)의 효율적인 제거를 초래하였다. 더욱이, 도말표본 피크 분석은 정제 전 및 후에 단편 분석기를 사용하여 모세관 겔 전기영동 후에 수행되었다 (표 12). 도말표본 피크 분석은 mRNA 무결성이 TFF 정제로 인해 변하지 않았으므로, 본 방법의 영향을 받지 않았다는 것을 나타낸다.

표 10

표 11

표 12

정제된 mRNA 분자의 번역 효율의 결정

더욱이, 수득된 정제된 mRNA 분자의 번역 효율을 결정하는 것이 매우 흥미로웠다. 따라서, 1.4x10⁶개의 HEK293 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 각각 표준 절차에 따라 상기 기재된 바와 같이 정제된 3.75 μg mRNA 분자로 형질감염시켰다. 메신저맥스 (1:15)를 사용하여 형질감염을 수행하였다. 24시간 후, 세포를 용해시키고 각각 50 μg 세포 용해물을 사용하여 SDS-page 및 웨스턴 블롯을 사용하여 조사하였다.

도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 웨스턴 블롯을 사용하여 거의 동등한 양의 mRNA 분자를 검출하고 (A) 정량화하였다 (B).

상이한 길이를 갖는 mRNA의 제거를 위한 한계치의 결정

총 300 μg의 mRNA 표적 hCFTR mRNA에 총 5 ml의 용적을 사용하여 길이가 다양한 상이한 mRNA 분자를 스파이킹하였다. 특히, 6가지 상이한 유형의 mRNA 분자가 표적 mRNA 분자 용적의 16.7%를 나타내는 각각의 유형으로 스파이킹에 사용되었다. 3가지 유형의 mRNA 분자는 캡 및 폴리(A) 꼬리를 나타내었고 총 길이는 각각 3,632 nt, 1,864 nt, 및 1,111 nt였다. 2가지 유형은 캡이나 폴리(A) 꼬리가 없었으며 총 길이는 각각 494 nt 및 256 nt였다. 마지막 유형은 양성 대조군으로서 작용한 120 nt DNA 길이의 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.

스파이킹된 mRNA 분자 포함 용액을 각각 실온 (도 7) 및 4℃ (도 8)에서 상기 기재된 바와 같이 여과하였다. TFF 전 (샘플 제조 직후), 상기 기재된 투석여과 완충제를 사용하여 원래 샘플 용적의 5x, 10x, 15x 및 20x 세척 용적 후, 및 10x 세척 용적의 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 부가의 세척 후에 샘플을 채취하였다. 각각의 세척 주기에 대해, 멸균 주사기를 사용하여 100 μl 샘플을 채취하고 분석할 때까지 얼음 위에 유지시켰다. 필터 공극을 통한 분자의 전달은 단편 분석기를 사용하여 모세관 겔 전기영동을 통해 평가되었다.

도 7 및 도 8에 제시된 바와 같이, 100 kDa mPES 칼럼을 사용하여 적어도 951 nt 길이를 갖는 mRNA 분자에 대한 컷-오프를 관찰할 수 있었다. 951 nt 미만의 길이를 갖는 mRNA 분자의 경우, MWCO가 더 낮은 칼럼, 예컨대 예를 들어 50 kDa 또는 70 kDa mPES 칼럼이 유리할 수 있다.

mRNA 분자 농도를 0.1 mg/ml에서 1 mg/ml로 증가시키는 것

하기 실험의 최종 세트 (도 9)에서, 하기에 기재된 필터링 절차는 표적 mRNA 분자로서 비변형된, 1644 nt 길이 비변형된 tdTomato mRNA를 포함하는 용액에 적용되었다. 특히, 총 5 mg의 mRNA 분자에 상응하는, 1 mg/ml의 mRNA 분자를 포함하는 총 5 ml의 공급 용액 뿐만 아니라 표적 mRNA 분자 (m/m)의 2.5%를 나타내는 15 nt DNA 올리고뉴클레오티드 및 안티센스 25 nt 길이의 올리고뉴클레오티드 - 관심 mRNA 분자와 상보적으로 결합함 - 및 표적 mRNA 분자 (m/m)의 5%를 나타내는 120 nt 길이의 올리고뉴클레오티드를 분석하였다. 이러한 스파이킹된 공급 용액을 15 ml/min의 유속 및 약 40 mbar의 TMP에서 100 kDa MWCO mPES 필터 칼럼을 사용하여 4℃에서 투석여과하였다. 적용된 세척 용적은 i) 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 10x 세척 용적, 이어서 ii) 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA를 포함하는 투석여과 완충제를 사용한 10x 세척 용적, 이어서 iii) 뉴클레아제 무함유 물을 사용한 10x 세척 용적이었다.

도말표본 값은 mRNA 무결성에 대한 지표로서 조사되었다. 특히, 하기 도말표본 값이 수득되었다: TFF 전 6.4%의 도말표본 프리-피크 뿐만 아니라 TFF 후 5.9%의 도말표본 프리-피크. 도말표본 프리-피크 면적은 mRNA 관련 가수분해된 산물의 비율을 반영한다. 따라서, 단편 분석기 분석에 의해 가수분해 산물을 측정할 수 없으며, TFF 정제가 mRNA 무결성에 영향을 미치지 않는다는 것으로 제시될 수 있다.

일상적인 조치를 적용하는 최적의 TFF 파라미터의 결정을 위한 예시적인 개요

하기는 통상의 기술자가 일상적인 조치를 적용함으로써 상기 기재된 TFF 방법을 최적화할 수 있는 방법에 대한 간략한 설명이다.

단계 (Ia)

TFF 유속은 침전된 mRNA 분자를 TFF 시스템을 통해 재순환시키고 침전된 mRNA 분자를 필터 표면으로부터 쓸어버리기 위해 충분한 전단 속도를 달성하도록 조정될 수 있다. 투과물 클램프를 개방함으로써, 충분한 투과물 플럭스를 달성할 수 있다. 효소 제거는, 예를 들어 SDS-Page 분석에 의해 결정될 수 있고, 필요한 세척 용적은 일상적인 조치에 의해 조정될 수 있다 (바람직하게는 1-20 세척 용적; 보다 바람직하게는 5-15; 가장 바람직하게는 9-11). 1 세척 용적은 초기 공급물 용적 중 투석여과 매질, 예를 들어 pH 7의 암모늄 아세테이트 완충제의 동일한 용적으로서 정의된다.

단계 (Ib)

단계 (Ia)에 기재된 바와 동일한 파라미터가 적용될 수 있다. 이로써 완충제는, 예를 들어, mRNA 분자를 분해하고 완충제 (예를 들어 암모늄 아세테이트)를 제거하기 위해 뉴클레아제 무함유 물로 교환될 수 있다. 완충제 제거는, 예를 들어 전도도, UV 측정에 의해 결정될 수 있고, 필요한 세척 용적은 일상적인 조치에 의해 조정될 수 있다 (바람직하게는 1-20 세척 용적; 보다 바람직하게는 5-15; 가장 바람직하게는 9-11). 1 세척 용적은 초기 공급물 용적 중 투석여과 매질, 예를 들어 뉴클레아제 무함유 물의 동일한 용적으로서 정의된다.

단계 (IIa)

TFF 유속은 mRNA 분자를 TFF 시스템을 통해 재순환시키고 mRNA 분자를 필터 표면으로부터 쓸어버리기 위해 충분한 전단 속도를 달성하도록 조정될 수 있다. 투과물 클램프를 개방함으로써 충분한 투과물 플럭스를 달성할 수 있다. 관심 mRNA의 손실은, 예를 들어 투과물 라인에서 UV 측정에 의해 모니터링될 수 있다 (예를 들어 온라인/오프라인 측정). 관심 mRNA의 손실이 관찰되면, 관심 mRNA의 추가 손실이 관찰되지 않을 때까지 일상적인 조치에 의해 유속 및/또는 TMP를 조정할 수 있다. 필요한 세척 용적은 불순물 (예를 들어 부전 전사체, 및/또는 가수분해 산물)의 양에 따라 일상적인 조치에 의해 조정될 수 있다; (바람직하게는 1-20 세척 용적; 보다 바람직하게는 5-15, 가장 바람직하게는 9-11). 1 세척 용적은 초기 공급물 용적 중 투석여과 매질, 예를 들어 pH 7의 MOPS-EDTA의 동일한 용적으로서 정의된다.

단계 (IIb)

단계 (IIa)에 기재된 바와 동일한 파라미터가 적용될 수 있다. 이로써 완충제는, 예를 들어, 완충제, 예를 들어 MOPS-EDTA를 제거하기 위해 뉴클레아제 무함유 물로 교환될 수 있다. 완충제 제거는, 예를 들어 전도도, UV 측정에 의해 결정될 수 있고, 필요한 세척 용적은 일상적인 조치에 의해 조정될 수 있다 (바람직하게는 1-20 세척 용적; 보다 바람직하게는 5-15; 가장 바람직하게는 9-11). 1 세척 용적은 초기 공급물 용적 중 투석여과 매질, 예를 들어 뉴클레아제 무함유 물의 동일한 용적으로서 정의된다.

TMP 편위 실험은 mRNA 분자 정제를 위한 최적의 조건을 결정하는데 도움이 될 수 있다. 예시적으로, 상기 기재된 바와 같이 단계 (IIa)에서 사용된 투석여과 완충제에서 1.0 mg/ml의 표적 mRNA 분자 농도를 포함하는 총 5 ml의 공급 용액을, 100 kDa MWCO mPES 필터 칼럼 및 15 ml/min의 유속을 사용하여 투석여과하였다. 투과물 플럭스는 약 50 mbar 내지 약 150 mbar 범위의 6가지 상이한 TMP 값에서 ml/min으로 측정되었다. tdTomato mRNA의 경우 도 10에서 볼 수 있듯이, 최적의 TMP는 15 ml/min의 유속에서 약 50 mbar인 것으로 결정되었지만 이는 실험 설정에 따라 다를 수 있다.

비교 실시예

하기에는, 본원에 개시된 방법 (접근법 1)과 WO 2015/164773 A1에 개시된 방법 (접근법 2)에 의해 수득된 결과를 비교하기 위해 수행된 예가 기재된다.

접근법 1

시험관내 전사된 비변형된 hCFTR mRNA (US 9713626 B2 참조; 5 mg 펠릿)에 25개 뉴클레오티드 (nt) 및 120 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 256 nt 길이의 글루카곤 유사 펩티드 1 분자 [GLP-1 mRNA 분자 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)]를 스파이킹하였다. 25 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 총량 (μg)을 참조하여 2.5%의 비율로 mRNA에 스파이킹되었다. 120 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 총량 (μg)을 참조하여 5.0%의 비율로 mRNA에 스파이킹되었다. 256 nt 길이의 GLP-1 mRNA 분자는 mRNA의 총량 (μg)을 참조하여 16%의 비율로 mRNA에 스파이킹되었다.

이와 같이 스파이킹된 mRNA 분자는 2.5 M NH₄OAc (pH 7)를 사용하여 침전시켰다.

단백질, 염 및 부전 전사체를 제거하기 위해, 단계(Ia)는 50 mL/min 유속, 및 ~200-300 mbar TMP로 500 kDa MWCO mPES를 사용하여 10x 세척 용적의 2.5 M NH₄OAc로 수행되었다 (mRNA 농도: 0.5 mg/mL).

NH₄OAc의 제거 및 mRNA 분자의 분해를 위해, 단계 (Ib)는 50 mL/min 유속, 및 ~200-300 mbar TMP로 50 kDa MWCO mPES를 사용하여 10x 세척 용적의 뉴클레아제-무함유 물로 수행되었다 (mRNA 농도: 0.5 mg/mL).

2가 양이온, 부전 전사체 및/또는 가수분해 산물을 제거하기 위해, 단계 (IIa)는 15 mL/min 유속 및 ~20 mbar TMP로 100 kDa MWCO mPES를 사용하여 10x 세척 용적의 40 mM MOPS 및 10 mM EDTA로 수행되었다 (mRNA 농도: 1.0 mg/mL).

MOPS-EDTA 투석여과 완충제를 제거하기 위해, 단계 (IIb)는 15 mL/min 유속 및 ~20 mbar TMP로 100 kDa MWCO mPES를 사용하여 10x 세척 용적의 뉴클레아제-무함유 물로 수행되었다 (mRNA 농도: 1.0 mg/mL).

수득된 mRNA 분자는 스파이킹된 올리고뉴클레오티드의 제거의 관점에서 단편 분석기/역상 HPLC, 및 mRNA 분자 회수의 결정을 위한 나노드롭을 사용하여 조사하였다.

접근법 2 (WO 2015/164773 A1에 기재된 바와 같음)

시험관내 전사된 비변형된 hCFTR mRNA (US 9713626 B2 참조; 10.26 mg 펠렛)에 25개 뉴클레오티드 (nt) 및 120 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 256 nt 길이의 GLP-1 mRNA 분자 (서열식별번호: 1)를 스파이킹하였다. 25 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 총량 (μg)을 참조하여 2.5%의 비율로 mRNA에 스파이킹되었다. 120 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 총량 (μg)을 참조하여 5.0%의 비율로 mRNA에 스파이킹되었다. 256 nt 길이의 GLP-1 mRNA 분자는 mRNA의 총량 (μg)을 참조하여 16%의 비율로 mRNA에 스파이킹되었다.

이와 같이 스파이킹된 mRNA 분자는 i) 구아니디늄 티오시아네이트; 나트륨 라우릴 사르코실, 및 시트르산나트륨을 사용하여, 2.09 M 구아니디늄 티오시아네이트; 0.26% 나트륨 라우릴 사르코실, 및 13.0 mM 시트르산나트륨의 최종 농도가 되도록 침전시키고, ii) 절대 에탄올을 사용하여 ~38% EtOH의 최종 농도가 되도록 침전시키며, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다.

부하는 500 kDa MWCO mPES를 사용하여 ~6 mL/min의 유속으로 ~ 22 mL 침전된 mRNA를 사용하여 수행되었다 (mRNA 농도: 0.52 mg/mL).

세척은 500 kDa MWCO mPES를 사용하여 ~6 mL/min 유속으로 5회 초과하여 하기 두 단계를 반복함으로써 수행되었다 (mRNA 농도: 0.52 mg/mL): 단계 a) 5 mL의 2.09 M 구아니디늄 티오시아네이트; 0.26% 나트륨 라우릴 사르코실; 13.0 mM 시트르산나트륨; ~38% EtOH를 사용한 세척, 및 단계 b) 5 mL 80% 에탄올을 사용한 세척.

수득된 고체 mRNA를 5 mL 뉴클레아제-무함유 물로 처리하고 5-10분 동안 재순환시킴으로써 (투과물 폐쇄됨) 용출 (단계 C)을 수행하여 용해를 보장하였다. ~6 mL/min 유속 및 500 kDa MWCO mPES를 사용하여 mRNA 분자가 더 이상 회수되지 않을 때까지 이러한 절차를 반복하였다 (mRNA 농도: 0.52 mg/mL).

투석 (단계 D)은 1 mM 시트르산나트륨 (pH 6.4), ~6 mL/min 유속 및 100 kDa MWCO mPES로 ~5 세척 용적을 사용하여 수행되었다 (mRNA 농도: 0.52 mg/mL).

수득된 mRNA 분자는 스파이킹된 올리고뉴클레오티드의 제거의 관점에서 단편 분석기/역상 HPLC, 및 mRNA 분자 회수의 결정을 위한 나노드롭을 사용하여 조사하였다.

주목할 만하게, WO 2015/164773 A1에 기재된 방법과 비교하여 상기 기재된 접근법 2의 경우에 하기 변화가 수행되었다: 필터 칼럼 상에서의 전단 속도를 일정하게 유지하기 위한 선형 축소 후, 초기에 계획된 유속은 6 mL/min이었다. 그러나, 이러한 유속으로 인해 TMP가 매우 낮아졌으며, 즉 유효 투과물 유속은 0 mL/min이었고 투석여과가 불가능하였다. 따라서, 충분한 TMP가 관찰되어 상당한 투과물 플럭스가 나타날 때까지 유속을 단계적으로 증가시켰다. 따라서, 단계 a) 내지 d)에 사용된 최종 유속은 20-24 mL/min의 범위였다 (투과물 유속은 1.1 내지 1.25 mL/min임).

표 13에 제시된 결과는 비정제된 및 정제된 hCFTR mRNA 샘플에 대해 수행된 단편 분석기 분석에 의해 수득되었다. 각각의 전기영동도는 접근법 1의 경우에는 도 11에 제시되고, 접근법 2의 경우에는 도 12에 제시되어 있다.

표 13

접근법 1의 경우, 스파이킹된 DNA 올리고뉴클레오티드 (25 nt 및 120 nt)의 제거는 주로 단계 (Ia)/(Ib)에 의해 달성되었다. 단계 (IIa)는 더 긴 가수분해 산물을 나타내는 256 nt mRNA를 제거하는데 필요하였다. 단계 (IIb)는 256 nt mRNA를 추가로 제거하지 않았으며, 이는 가수분해 산물 및 부전 서열의 제거를 위해 강력한 킬레이트제 예컨대 EDTA를 사용하는 단계 (IIa)가 필수적임을 제시한다.

접근법 2의 경우, 스파이킹된 DNA 올리고뉴클레오티드 (25 nt 및 120 nt)의 제거는 단계 A 내지 C에 의해 부분적으로만 달성되었다. 단계 D는 120 nt DNA 올리고뉴클레오티드를 완전히 제거하지 못하였다. 더 긴 가수분해 산물을 나타내는 256 nt mRNA는 TFF 정제 후 샘플에 거의 완전히 남아 있었다. 따라서, 1 mM 시트르산나트륨을 사용하여 투석을 수행하는 것 (단계 D)은 부전 mRNA 분자를 나타내는 120 nt 길이의 DNA 올리고뉴클레오티드, 및 특히 더 긴 가수분해 산물을 나타내는 256 nt 길이의 mRNA의 추가 제거에 강한 영향을 미치지 않았다.

하기에서, 본원에 사용된 256 nt 길이의 mRNA 서열이 추가로 상세히 기재된다.

서열식별번호: 1

코돈 최적화된 GLP-1 서열

_{T7 프로모터의 일부}, C: 에트리스(Ethris) 최소 5'UTR에 이어, 부가의 U 뉴클레오티드, TISU 5'UTR , 시작 코돈, 코돈 최적화된 GLP-1 mRNA 서열, 정지 코돈 , ^{EcoR I 제한 부위의 일부}

비-폴리아데닐화된 mRNA가 스파이킹 실험에 사용되었다.

SEQUENCE LISTING <110> ethris GmbH <120> mRNA purification by tangential flow filtration <130> AB2994 PCT S3 <140> EP PCT/2020/053453 <141> 2020-02-11 <150> EP 19 15 6522.5 <151> 2019-02-11 <160> 1 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 256 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized GLP-1 sequence <400> 1 gggagacugc caagaugaag aucauccugu ggcugugcgu guucggccug uuccuggcca 60 cccuguuccc caucagcugg cagaugccug uggaaagcgg ccugagcagc gaggauagcg 120 ccagcagcga gagcuucgcc aagcggauca agagacacgg cgagggcacc uucaccagcg 180 acguguccag cuaccuggaa ggccaggccg ccaaagaguu uaucgccugg cucgugaagg 240 gcagaggcug agaauu 256

Claims (15)

1. 하기 단계를 포함하는, mRNA 분자를 정제하는 방법으로서,
   (Ia) 제1 용액을 사용하여 침전된 mRNA 분자를 포함하는 현탁액으로부터 침전된 mRNA 분자를 정제하는 단계,
   (Ib) 제2 용액을 사용하여 단계 (Ia)로부터 수득된 정제된 침전된 mRNA 분자를 세척하고 용해시키는 단계,
   (IIa) 킬레이트제를 포함하는 제3 용액을 사용하여 단계 (Ib)로부터 수득된 용해된 mRNA 분자로부터 mRNA 분자를 정제하는 단계, 이어서
   (IIb) 제4 용액을 사용하여 단계 (IIa)로부터 수득된 정제된 mRNA 분자를 세척하는 단계,
   여기서 단계 (Ia) 내지 (IIb)는 접선 유동 여과를 사용하여 수행되는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 킬레이트제가 EDTA인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제3 용액이 1 내지 10의 pH를 갖는 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 용액이 MOPS 완충제를 포함하는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (Ia) 내지 (IIb)가 0℃ 내지 25℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (Ia) 전에, 상기 현탁액이 mRNA 분자를 침전시키기 위해 암모늄 아세테이트를 사용하여 수득되고, 제1 용액이 암모늄 아세테이트를 함유하는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용액이 물이고/거나, 제4 용액이 물이거나 또는 나트륨 클로라이드 및/또는 시트레이트를 포함하는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 분자가 접선 유동 여과 후 보유물에 포함되는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 단계 (Ia)에서 수득된 보유물이 단계 (Ib)에서 접선 유동 여과를 위한 공급 용액으로서 사용되고, 단계 (Ib)로부터 수득된 보유물이 단계 (IIa)에서 공급 용액으로서 사용되고, 단계 (IIa)로부터 수득된 보유물이 단계 (IIb)에서 공급 용액으로서 사용되는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁액에 포함된 mRNA 분자가 시험관내 전사에 의해 수득되는 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 mRNA 분자를 탈인산화 및/또는 폴리아데닐화 및/또는 후-캡핑하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 방법이 단계 (Ib)로부터 수득된 mRNA 분자를 탈인산화하고, 이어서 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 수행하고, 이어서 수득된 mRNA 분자를 폴리아데닐화하고, 이어서 단계 (Ia) 내지 (IIb)를 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (Ia)의 경우에는 300 kDa 내지 0.65 μm의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막이 접선 유동 여과에 사용되고/거나, 단계 (Ib) 및 (IIb)의 경우에는 1 kDa 내지 0.65 μm의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막이 사용되고/거나, 단계 (IIa)의 경우에는 적어도 70 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 필터 막이 사용되는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 용액 중 임의의 것의 투석여과 용적이 단계 (Ia)의 현탁액의 용적의 적어도 1배인 방법.
15. 하기 단계를 포함하는, 제약 조성물을 생산하는 방법:
    (a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 mRNA 분자를 정제하는 단계, 및
    (b) 이와 같이 수득된 mRNA 분자를 제약 조성물로 제형화하는 단계.

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