KR100622606B1 - 단일공정에 의한 플라스미드 ｄｎａ 정제용 조성물과 그를이용하여 플라스미드 ｄｎａ를 정제하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물로부터 플라스미드 DNA를 정제하기 위한 플라스미드 DNA 정제용 조성물에 관한 것으로서, chaotropic 염과 계면활성제를 함유하는 양이온 염의 완충용액으로 이루어진 플라스미드 DNA 정제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에 의하면, 미생물 세포의 분산 및 용해, 플라스미드 DNA를 제외한 세포 오염물질의 불활성화, 그리고 플라스미드 DNA와 실리카 담체간의 결합이 모두 단일 세포 용해 용액에서 단일공정으로 이루어지므로 비용과 시간의 측면에서 플라스미드 DNA를 경제적으로 정제할 수 있다.

플라스미드, DNA, 대장균, 정제, 세포 용해 용액

Description

단일공정에 의한 플라스미드 ＤＮＡ 정제용 조성물과 그를 이용하여 플라스미드 ＤＮＡ를 정제하는 방법{Composition for the purification of plasmid DNA by One Step and Rapid Purification Method Thereof}

도 1은 플라스미드 DNA 정제용 조성물의 조성이 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 효과를 나타낸 도이다.

도 2는 세포 용해 과정 중 세포 용해 시간이 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 효과를 나타낸 도이다.

도 3은 세포 용해 과정 중 효소 등의 첨가가 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 효과를 나타낸 도이다.

도 4는 세척 용액에 함유된 에틸알코올의 농도 및 세척 용액의 pH가 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 효과를 나타낸 도이다.

도 5는 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법과 종래의 알카리 용해법 중 알콜 침전법 및 정제 키트를 이용한 방법에서 플라스미드 DNA의 정제 수율을 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 6은 본 발명의 플라스미드 DNA정제 방법을 이용하였을 경우에 정제가 가능한 최대 수율을 대장균 배양 부피 단위로 표시하여 나타낸 도이다.

도 7은 본 발명의 플라스미드 DNA정제 방법을 이용하여 얻은 DNA를 제한효소 절단 후 아가로즈겔 전기영동 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 8은 본 발명의 플라스미드 DNA정제 방법을 이용하여 다양한 크기와 종류의 플라스미드 DNA를 정제한 결과를 나타낸 도이다.

도 9는 본 발명의 플라스미드 DNA정제 방법을 이용함에 있어서 DNA결합 담체로 실리카 콜로이드 또는 마그네틱 실리카 콜로이드의 사용 효율성을 알아본 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 미생물로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 데 사용되는 플라스미드 DNA 정제용 조성물과 본 발명에 의한 조성물을 이용하여 보다 간편하게 플라스미드 DNA를 고효율, 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 플라스미드 DNA는 이중나선구조의 supercoiled DNA(이하 플라스미드 DNA)를 의미한다.

플라스미드 DNA의 정제는 생명공학, 의학, 약학 및 생물산업 분야에서 필수적으로 요구되는 기술이다. 미생물에서 플라스미드 DNA를 정제하는 방법은 1980년대 이후 지금까지 3가지 종류 이상의 시약을 순차적으로 첨가함으로써 세포를 용해하고 각종 오염물질을 침전방식으로 제거한 후 상층액에 존재하는 플라스미드 DNA만을 알코올 침전법이나 이온교환 담체와의 결합, 용출을 통해 회수하는 알카리 용 해 방법이 주로 사용되어 왔다(Sambook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). 현재 세계적으로도 플라스미드 DNA 정제 키트로 판매되고 있는 모든 제품들은 종래의 알카리 용해 방법을 이용하고 있다.

알카리 용해 방법은 다음과 같은 네 단계의 처리과정을 핵심으로 하고 있으며, 사용하는 용액의 조성 차이는 사용자에 따라 일부 달라질 수 있으나 기본적인 원리에는 변함이 없다(Birnboim H. C. & Doly J., 1979, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res 7(6), 1513~1523).

1) 세포괴의 분산 : 중성 완충액을 사용하여 미생물의 세포괴를 분산시키는 과정이며 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA, pH 8.0의 용액이 일반적으로 사용된다.

2) 세포 용해 : 0.2N NaOH, 1% SDS(Sodium Dodesyl Sulfate)와 같은 알카리 용액을 처리하여 세포막을 용해하여 세포 구성물을 용출시키는(세포 용해) 단계이며, 이 단계에서 미생물의 유전체 DNA 또한 높은 pH 영역에서 비가역적으로 변성(denaturation)되어 불활성화된다.

3) 세포 구성물의 제거 : 고농도의 초산칼륨 산성 완충 용액(3M potassium acetate, pH 5.5)을 사용하여 중화함으로써 거대분자인 불활성 유전체 DNA와 단백질/SDS의 복합체를 침전시켜 원심분리나 여과 등의 방법으로 제거하고 플라스미드 DNA가 녹아 있는 상층액 부분만을 세포 침전물로부터 분리하는 단계이다.

4) 플라스미드 DNA의 분리, 정제 : 상기 3)의 단계에서 분리한 플라스미드 DNA가 녹아 있는 상층액으로부터 순수한 플라스미드 DNA를 분리, 정제하는 단계로 페놀 추출법(phenol extraction), 알콜 침전법(alcohol precipitation), 이온교환(ion exchange) 담체법, 세슘 농도구배 원심분리법(cesium gradient centrifugation) 등을 이용한다.

상기의 알카리 용해 방법은 3가지 종류의 서로 다른 용액을 순차적으로 처리하고 반응시켜야 하는 번거로움이 있고 또한 세포 침전물을 제거하기 위하여 원심분리나 투과막을 이용한 여과 등의 복잡한 과정을 반드시 거쳐야 하는 문제점이 있다.

보다 간편한 방법으로 알려진 보일링 방법(boiling method)이나 크래킹 방법(cracking method), 또는 페놀 추출법(phenol extraction) 등이 일부 사용되기도 하지만, 플라스미드 DNA가 유전체 DNA, RNA, 단백질 등으로 오염된 형태로 회수되어 보다 정교한 실험에는 사용할 수 없고 단지 플라스미드 DNA의 존재 여부를 아가로즈겔 전기영동법으로 간단히 확인하는 용도로만 이용되었다. 또한 상기한 방법들은 종래의 알카리 용해 방법에 비해 시간적으로 빠르다는 것을 제외하고는 세포괴의 분산, 세포의 용해, 세포 침전물의 제거로 구성되는 기본적인 단계를 모두 포함하고 있다.

정제한 플라스미드 DNA는 제한효소분석, 클로닝, 염기서열분석, PCR 등과 같 은 보다 정교한 분자생물학적 실험에 이용되기 때문에 정제 방법의 수율적 측면은 물론 정제한 플라스미드 DNA의 순도 측면에서도 심각하게 고려해 보아야 한다.

플라스미드 DNA의 정제 기술과 관련하여서는 이미 많은 기술들이 공지되어 있으나 모두가 대장균 세포의 알카리 용해 그리고 세포 침전물의 제거라는 기본 틀은 동일한 채 세포침전물을 제거한 상층 용액으로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 신규한 이온교환담체나 분리 방법 및 장치에 관해 공지한 내용들이 전부였다.

미국특허 6821757은 세포 침전물을 제거하는 과정이 없는 플라스미드 DNA를 정제하는 기술에 대해 처음으로 공지하고 있다. chaotropic염인 소튬티오시아네이트가 7M 이상의 고농도로 존재하는 알카리 용액에서 실리카를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하는 방법에 대한 내용으로, 세포 침전물의 제거를 위한 여과나 원심분리 단계는 불필요하게 되었으나, 역시 종래의 알카리 용해 방법과 같이 세포 용해에 있어서 세 종류의 서로 다른 용액을 순차적으로 처리하는 과정을 모두 포함하고 있다.

핵산 정제와 관련된 제품의 세계시장은 유전자 증폭효소와 함께 단일 품목으로는 가장 큰 시장을 형성하고 있으며 그 사용빈도는 유전자 치료제의 개발 및 재조합 기술의 발전과 더불어 년간 10%씩 계속 늘어가고 있는 추세이다. 더욱이 생명공학의 발전과 더불어 다량, 다수원칙의 요구에 따라 플라스미드 DNA의 정제는 대형화, 고속화, 다량화되고 있는 추세이다. 그러나 종래에 공지된 방법들에 따라서는 비용적인 측면이나 시간적인 측면에서 비효율적인 속성을 벗어날 수가 없다. 따라서 종래 방법의 단점을 보완하여 경제적이면서 대형화, 고속화, 다량화의 요구 를 만족시켜줄 수 있는 새로운 정제 기술의 개발이 절실히 요구된다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 세포괴의 분산, 세포의 용해, 대장균 유전체 DNA 및 단백질 등 오염물질의 불활성화, 플라스미드 DNA의 분리를 단일 용매에서 동시에 진행할 수 있게 하는 플라스미드 DNA 정제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 미생물로부터 플라스미드 DNA를 고순도로 정제하는 효율적인 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기의 조성물과 플라스미드 DNA 정제 방법을 이용한 플라스미드 DNA 정제 용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, chaotropic 염과 계면활성제(detergent)를 함유하는 양이온 염의 완충용액으로 pH가 10~13인 플라스미드 DNA 정제용 조성물에 관한 것이다.

상기 세포 용해 용액 조성물의 완충 용액으로는 Na⁺와 K⁺의 일가 양이온을 가지는 초산나트륨(sodium acetate), 탄산나트륨(sodium carbonate), 인산나트륨 (sodium phosphate), 초산칼륨(potassium acetate), 탄산칼륨(potassium carbonate), 인산칼륨(potassium phosphate)염으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염을 사용하여 제조된 것을 특징으로 한다. 이때, 양이온 염의 농도는 50mM이상 2M 이하인 것이 바람직하다. 이보다 낮은 농도의 경우 양이온 염 첨가의 효과가 미흡하게 되며 높은 농도의 조작의 어려움과 사이드 이펙트(부적합 부수효과)의 발생이 나타나게 된다.

상기 완충용액의 pH를 조절하기 위해서는, 완충용액의 양이온과 일치하는 양이온을 갖는 염기를 이용하여 원하는 pH가 되도록 조절할 수 있다. Na⁺를 갖는 완충용액의 경우에는 수산화나트륨(NaOH)이나 탄산나트륨 또는 중조(sodium bicarbonate)와 같은 염기를 사용할 수 있으며, K⁺의 경우에는 수산화칼륨(KOH)이나 탄산칼륨 등의 염기를 사용하여 pH를 조절할 수 있다. 상기 완충용액의 pH는 10~13 범위인 것이 바람직하며, 11~13인 것이 더욱 바람직하다. pH가 10이하인 경우에는 플라스미드 DNA의 분리 시, 유전체 DNA나 저분자량의 RNA 또는 supercoil 이외 형태의 플라스미드 DNA가 같이 회수되어 목적하는 supercoiled 플라스미드 DNA의 순도가 낮아질 수 있다. 반면 플라스미드 DNA를 담체에 결합시켜 분리할 때 pH가 너무 높으면 담체와의 결합력이 약해지므로 플라스미드 DNA의 수율이 감소할 우려가 있다.

본 발명에서 chaotropic 염은 분자간의 이온결합이나 소수성결합을 파괴하여 분자결합에 영향을 주는 물질을 의미한다. 상기 chaotropic 염은 DNA와 담체간의 결합을 형성해 주는 역할과 함께 세포 구성물의 불활성화, 특히 단백질의 불활성화와 세포막의 용해에 영향을 미친다. Chaotropic 염으로는 상기의 작용을 할 수 있는 염은 무엇이든 사용이 가능하며 구아니딘티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 소듐티오시아네이트(sodium thiocyanate), 구아니딘염산염(guanidine HCl), 요오드화나트륨(sodium iodide), 소듐퍼크로레이트(sodium perchlorate) 등을 예로 들 수 있다. 상기 chaotropic 염은 단일 염으로 사용할 수도 있고, 두 개 이상 염의 혼합물을 사용하여도 무방하며, 특히 용해 작용이 뛰어나고 단백질 불활성화 효과가 큰 티오시아네이트 잔기를 갖는 chaotropic 염을 사용하는 것이 보다 바람직하다. chaotropic 염의 농도가 1M 이하인 경우에는 세포를 충분히 용해 시킬 수 없어 플라스미드 DNA의 정제 수율이 낮아진다. 반면에 chaotropic 염의 농도가 너무 높을 경우엔 RNA와 같은 오염물질이 담체에 함께 결합하여 석출되거나 외부에서 첨가해 주는 RNase의 불활성화를 유도할 수 있으므로 chaotropic 염의 농도는 1M 이상 6M이하인 것이 바람직하다.

본 발명에서 플라스미드 DNA를 정제하는 목적으로 사용하는 용액은 담체에 DNA가 결합하는데 기여하는 구성 성분인 일가 양이온 염과 chaotropic 염의 합산농도가 1 M이상의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 계면활성제는 세포를 용해하기 위한 보조 목적일 뿐 플라스미드 DNA가 담체에 결합하는 데는 어떤 영향도 주지 않기 때문에 계면활성제로 이용될 수 있는 것이라면 어떠한 종류를 사용하여도 무방하며, 단일 물질을 사용하거나 두 가지 이상의 계면활성제를 혼합하여 함께 사용하여도 된다. 본 발명의 실시예에서는 계면 활성제로 SDS와 트윈 10, 트리톤 X-100을 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 계면활성제의 농도가 너무 낮을 경우엔 효과적인 세포의 용해가 어렵고 너무 높은 농도에서는 점도의 상승 등으로 인하여 조성물을 사용한 정제 과정에 심각한 영향을 초래할 수 있으므로 농도(w/v)가 1% 이상 5%이하인 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 세포 용해 용액 조성물을 이용하여 (A) 세포의 용해 단계; (B) 플라스미드 DNA와 담체의 결합 단계; (C) 불순물 제거 단계; (D) 플라스미드 DNA의 회수 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 미생물로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 미생물의 일 예로 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 정제, 분리하는 방법에 대하여 기재하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 동일한 방법에 의해 다른 미생물로부터도 플라스미드 DNA를 정제할 수 있음은 당업자에게는 당연한 것이다.

상기 (A)단계에서는 알카리 용해 방법의 (1) 내지 (3) 단계에 해당하는 것을 본 발명의 조성물에 의한 단일 용매를 사용하여 단일 공정으로 진행하므로 플라스미드 DNA를 시간과 비용의 측면에서 모두 효율적으로 정제할 수 있다. 상기 (B) 내지 (D)단계는 전술한 알카리 용해 방법의 (4) 단계인 플라스미드 DNA의 분리, 정제 단계 중 담체를 이용한 방법을 보다 상세하게 단계적으로 풀어서 기재한 것이다. 이하 각 단계별로 상세하게 설명한다.

(A) 세포의 용해 단계

미생물 배양액을 본 발명에 의한 플라스미드 DNA 정제용 조성물 0.08~2배(배 양액의 O.D. 값이 2일 경우)로 처리하여 용해시키는 과정이다. 종래의 알카리 용해 방법에서는 단계별로 세 가지의 다른 용매를 순차적으로 사용하여 진행하였던, 1) 세포괴 분산, 2) 세포의 용해, 3) 대장균 유전체 DNA와 단백질의 불활성화의 모든 공정이 본 발명에서는 미생물을 본 발명의 세포 용해용 단일 조성물에 용해시키는 본 단계의 단일 단계 작업으로 완료된다. 또한 본 발명의 상기 조성물의 pH 10-13 범위에서는 불활성화된 세포의 구성물들이 모두 용액에 녹아있는 상태이므로 종래의 방법에서처럼 용해 혼합물로부터 불활성화된 대장균 유전체 DNA 및 단백질 등 오염원을 원심분리를 이용한 침전이나 투과막 여과 등의 방법으로 제거하는 과정을 필요로 하지 않는다.

또한 본발명의 상기 조성물을 이용한 세포 용해 시의 온도 범위는 0℃에서 35℃인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 4~25℃인 것이 좋다. 세포 용해 시의 온도가 너무 낮을 경우에는 세포괴의 분산과 용해가 효과적으로 이루어지지 않을 수 있으며, 온도가 너무 높으면 온도에 의한 pH 감소로 플라스미드 DNA의 정제 수율이 감소하게 된다.

세포 용해는 실시예에서 확인할 수 있듯이 1분 이내에 플라스미드의 정제에 필요한 모든 과정이 완결되고, 시간이 길어지면 플라스미드 정제수율이 감소하므로 0.5∼10분 정도 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 플라스미드 DNA를 정제하는 방법에 있어서 완충액의 pH를 조정함으로써 플라스미드 DNA와 RNA의 미세한 결합력 차이를 이용해 오염원인 RNA를 효과적으로 제거할 수 있기 때문에 RNase의 사용이 반드시 필요한 것은 아니다. 다만 큰 크기의 RNA를 담체와의 결합력이 낮은 미세크기의 RNA로 절단하기 위해 RNase를 일정량으로 사용할 수도 있다.

(B) 플라스미드 DNA와 담체의 결합 단계

상기 (A) 단계에서 본 발명의 조성물에 미생물을 처리하여 제조한 세포 용해 혼합물에 담체를 가하여, 플라스미드 DNA가 녹아 있는 세포 용해 혼합물에서 양이온 염과 chaotropic염에 의해 매개되는 이온 결합 반응을 통해 플라스미드 DNA만을 선택적으로 담체에 결합시키는 단계이다.

상기 담체로는 음이온성 실리카 계열의 실리카다이옥사이드, 실리카섬유, 실리카 다공막, 실리카 입자, 실리카 자성입자를 포함하는 실리카 담체 뿐만 아니라,본 발명의 구성 상 사용 가능한 DNA 결합 담체로서 다른 종류의 이온교환 담체도 사용 가능한 것은 당업자에겐 당연하다.

(C) 불순물 제거 단계

상기 플라스미드 DNA가 결합된 담체를 세포 용해 용액으로부터 분리하고 세척 용액을 이용하여 세척하여 세포용해 혼합물에 포함된 불활성화된 대장균 유전체 DNA, RNA, 단백질, 지질 등의 오염물질을 제거하는 단계이다.

상기 세척 용액으로는 pH 7~13 범위의 완충액에 메탄올, 에탄올 및 프로판올의 저급 알콜이 함유된 세척 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 담체에 오염원으로 결합되어 있는 미량의 RNA를 효과적으로 제거하기 위해서는 상기 완충액의 pH가 12~13 범위인 것이 보다 바람직하다.

상기 저급 알콜의 함유량은 40~90%인 것이 바람직하며 알콜 농도가 적을 경 우에는 플라스미드 DNA의 회수율이 저하되고, RNA에 의한 오염이 증가하므로 60~90%인 것이 더욱 바람직하다.

또한 상기 세척용액에는 완충효과를 유지하기 위하여 10~50mM의 트리스하이드로클로라이드와 플라스미드 DNA와 담체간의 결합을 지속시키는 염으로 50~60mM의 초산나트륨이 포함되는 것이 바람직하다.

(D) 플라스미드 DNA의 회수 단계

실리카 담체로부터 정제수나 10~50mM 트리스하이드로클로라이드 완충용액 등의 용출용매를 이용하여 플라스미드 DNA를 용출시켜 회수하는 과정으로 이루어진다. 용출 시의 온도는 15~55℃인 것이 바람직하며, 용출 시간은 1분 이상, 더욱 바람직하게는 5분 이상인 것이 좋다.

또한 본 발명은 상기의 조성물과 플라스미드 DNA 정제 방법을 이용한 플라스미드 DNA 정제 용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 플라스미드 DNA 정제용 조성물과 그를 이용한 플라스미드 DNA 정제 방법을 이용하여 1) 상기 플라스미드 DNA 정제용 조성물; 2) 미생물을 상기 조성물로 용해시킨 후 플라스미드 DNA와 선택적으로 결합시킬 수 있는 담체; 3) 상기 플라스미드가 결합된 담체로부터 오염물질을 제거할 때 사용되어지는 상기 세척용액이 각각의 독립된 공간에 담겨있고, 미생물로부터 플라스미드 DNA 정제 시 단계적으로 분리하여 사용할 수 있도록 구성된 간단한 구성의 키트를 제조할 수 있다. 본 발명의 키트를 사용하면, 단순한 조작으로도 고순도의 플라스미드 DNA를 효율적으로 정제할 수 있다.

이하 본 발명을 실시 예를 통해 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1 : 플라스미드 DNA 정제 프로토콜

모든 시약은 시그마-알드리치 또는 덕산화학으로부터 구입하여 사용하였다.

대상 미생물로는 엠피실린 내성 유전자를 갖는 pBluscript기원의 5 kbp 크기의 플라스미드 DNA가 형질 전환된 대장균 DH5a(프로메가사의 형질전환용 세포주)를 선정하여 100㎍/ml의 앰피실린이 포함된 1L의 LB 배양액(LB broth, 10g 트립톤, 5g 이스트 추출물, 10g 염화나트륨)에 종균한 후 37℃의 온도에서 OD값이 2가 될 때까지 진탕 배양하였다. 상기 대장균 진탕 배양액 1.5ml 씩을 1.5ml 튜브에 각각 분주하여 원심분리하여 침전시켜 세포괴 상태로 -70℃에 보관하면서 필요한 경우 꺼내 사용하였다.

상기의 방법으로 분주된 배양 세포괴에 각 실험의 목적에 적합하도록 제조된 세포 용해 용액 500μl를 넣고 볼택싱(vortexing)으로 3분간 교반하여 세포를 완전히 용해시켰다. 세포용해 혼합물을 엠바이오텍으로부터 구입한 실리카 섬유막으로 이루어진 DNA 정제키트의 스핀 타입의 컬럼에 로딩하여 실리카 담체와 결합시킨 후 상온에서 1분간 13,000rpm으로 원심 분리하여 불순물을 제거하고, 700 μl의 세 척 용액을 컬럼에 로딩하고 원심분리하여 세척하였다. 세척 용액으로는 별도의 언급이 없는 경우에는, 50mM 초산나트륨, 50mM 트리스하이드로클로라이드, 80% 에틸알콜이 포함된 용액을 2N 수산화 나트륨으로 pH를 8.0으로 조절하여 사용하였다. 플라스미드 DNA의 용출은 50 μl의 pH 8.0인 50mM 트리스하이드로클로라이드을 용출 용액을 넣어주고 1분간 상온에 두었다가 1분간의 원심분리를 통해 용출을 수행하였다.

용출된 플라스미드 DNA 용액 중 2μl를 취하여 0.7% 아가로즈 겔을 이용하여 0.5x TAE 완충용액 내에서 종래의 방법에 따라 전기영동 분석법으로 분리하였으며, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 자외선 조사방법으로 확인하였다.

실시예 2 : 세포 용해 용액의 조성 변화가 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 영향

1) 세포 용해 용액의 pH 변화

용액 중 농도가 0.1M 초산나트륨, 2M 구아니딘티오시아네이트, 2% 트리톤 X-100이 되도록 초산나트륨과 구아니딘티오시아네이트 및 트리톤 X-100을 합하여 증류수에 완전히 용해시킨 용액을 제조하여 10ml씩 12개로 분주하였다. 각 용액에 2N 수산화나트륨(NaOH)을 넣어주면서 pH가 각각 7.0, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0이 되도록 조절하였다.

상기의 각 용액을 세포 용해 용액으로 사용하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하고 분석하였다. 정제과정에서, pH 변화에 따른 영향(도 1에서 (a)), 양이온 염의 종류에 따른 영향(도 1에서 (b)), chaotropic 염의 종류에 따른 영향(도 1에서 (c)), 양이온 염인 소듐아세테이트의 농도에 따른 영향(도 1에서 (d)), chaotropic 염인 구아니딘티오시아네이트의 농도 변화에 따른 영향(도 1에서 (e))을 도 1에 도시하였다.

도 1(a)는 세포 용해 용액의 pH 변화에 따라 대장균의 플라스미드 DNA 정제에 미치는 영향을 나타낸 도이다. pH 8 이상에서는 유의할 만한 세포침전이 되고 있진 않아 이를 별도로 제거해 주는 공정을 필요로 하지 않았지만, 도 1(a)에서 볼 수 있듯이 pH 10 이하의 pH 범위에서는 대장균의 유전체 DNA는 물론 다양한 형태의 불활성 플라스미드 DNA, 및 low weight RNA가 같이 다량 용출되는 것을 알 수 있었다. 그러나 세포 용해 용액의 pH가 11.0~13.0인 경우에는 대장균 유전체 DNA나 저분자량 RNA, nick 또는 open circular 플라스미드 DNA가 회수되지 않고 supercoil 형태의 플라스미드 DNA만 특이적으로 실리카 담체에 결합되어 회수되는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명자들은 이를 핫죤(hot zone)으로 명명하였다.

핫죤으로 명명된 pH 범위의 세포 용해 용액을 사용하면 플라스미드 DNA를 순수하게 분리할 수 있음을 확인할 수 있었으나, 플라스미드 DNA가 실리카 담체에 붙는 결합력 또한 pH가 증가함에 따라 약해지는 사실을 발견하고 이를 해결하기 위해 DNA가 실리카 담체에 결합하는 데 가장 큰 영향을 주는 일가 이온 염의 농도와 chaotropic 염의 농도를 조절하면서 최적의 조건을 탐색하였다.

2) 세포 용해 용액 중 양이온 염의 종류

용액 중 농도가 0.1M 양이온성 염, 2M 구아니딘티오시아네이트, 2% 트리톤 X-100이 되도록 양이온성 염과 구아니딘티오시아네이트 및 트리톤 X-100을 합하여 증류수에 완전히 용해시킨 용액으로 양이온성 염의 종류를 각각 달리하여 제조하였다. 각 용액을 2N 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH가 12가 되도록 조절하였다. 양이온성 염으로는 초산나트륨, 초산칼륨, 탄산나트륨 또는 인산나트륨을 각각 사용하였다.

상기의 각 용액을 세포 용해 용액으로 사용하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하고 분석하여 도 1(b)에 나타내었다. 도 1(b)에 보여주는 것과 같이 사용한 양이온성 염의 종류에 따라 플라스미드 DNA의 정제 수율과 순도가 크게 영향을 받는 것을 알 수 있었으며, 초산염인 경우, 특히 초산 나트륨의 경우 정제 효율이 좋은 것을 확인할 수 있었다.

3) 세포 용해 용액 중 chaotropic 염의 종류

용액 중 농도가 0.1M 초산나트륨, 2M chaotropic 염, 2% 트리톤 X-100이 되도록 초산나트륨과 chaotropic 염 및 트리톤 X-100을 합하여 증류수에 완전히 용해시킨 용액으로 chaotropic 염의 종류를 각각 달리하여 제조하였다. 각 용액을 2N 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH가 12가 되도록 조절하였다. chaotropic 염으로는 소듐티오시아네이트, 구아니딘티오시아네이트, 구아니딘하이드로클로라이드 또 는 소듐아이오다이드를 각각 사용하였다.

상기의 각 용액을 세포 용해 용액으로 사용하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하고 분석하여 도 1(c)에 나타내었다. 도 1(c)에 나타낸 바와 같이 사용한 chaotropic 염의 종류에 따라 플라스미드 DNA의 정제 수율과 순도가 영향을 받는 것을 알 수 있었으며, 특히 티오시아네이트를 잔기로 가지는 chaotropic 염이 다른 염보다 세포 용해가 용이하고, 또한 정제되어 회수되는 플라스미드 DNA의 양이 많은 것을 알 수 있다. 따라서 chaotropic염은 소듐티오시아네이트 > 구아니딘티오시아네이트 > 소듐아이오다이드 > 구아니딘하이드로클로라이드의 순서로 플라스미드 DNA의 정제 수율이 높은 것을 확인할 수 있다.

또한 0.75M 초산나트륨, 4M chaotropic 염, 2% 트리톤 X-100이 되도록 제조한 용액으로 chaotropic 염의 종류를 각각 달리한 세포 용해 용액의 pH 별 플라스미드 DNA의 정제 수율과 순도를 확인한 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 chaotropic염의 종류에 따라 플라스미드 DNA의 정제 수율이 가장 높은 고유한 최적의 pH 영역을 가지고 있음을 알 수 있었다(세부 결과 미기재).

Chaotropic salt	Optimal pH
Gu-SCN	11.7
Na-SCN	11.2
NaI	11.5
GuHCl	12.1

4) 세포 용해 용액 중 양이온 염의 농도

초산나트륨의 농도가 각각 0.1, 0.5, 1.5M, 구아니딘티오시아네이트 2M, 트리톤 X-100 2%이 되도록 초산나트륨과 구아니딘티오시아네이트 및 트리톤 X-100을 합하여 증류수에 완전히 용해시킨 용액을 초산나트륨의 농도에 따라 각각 제조하였다. 초산나트륨의 농도가 상이한 각 용액을 2N 수산화나트륨으로 pH가 12.0이 되도록 조절하였다.

상기의 각 용액을 세포 용해 용액으로 사용하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하고 분석하여 도 1(d)에 도시하였으며, 초산나트륨의 농도가 증가함에 따라 정제되어 회수되는 플라스미드 DNA의 양이 많아짐을 알 수 있었다.

5) 세포 용해 용액 중 chaotropic 염의 농도

초산나트륨의 농도가 0.1M, 구아니딘티오시아네이트의 농도가 각각 1, 2, 4, 6M, 트리톤 X-100 2%이 되도록 초산나트륨과 구아니딘티오시아네이트 및 트리?? X-100을 합하여 증류수에 완전히 용해시킨 용액을 구아니딘티오시아네이트의 농도에 따라 각각 제조하였다. 구아니딘티오시아네이트의 농도가 상이한 각 용액을 2N 수산화나트륨으로 pH가 12.0이 되도록 조절하였다.

상기의 각 용액을 세포 용해 용액으로 사용하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하고 분석하여 도 1(e)에 도시하였다.

도 1(e)에 나타낸 결과에 따르면 구아닌딘티오시아네이트는 1M 농도를 제외한 모든 경우에서 비슷한 정제 수율을 보여주고 있으며 이는 1M 이하의 농도에서는 구아니딘티오시아네이트가 대장균 세포를 효율적으로 용해시키지 못했기 때문으로 사료된다.

또한 표 2에 나타낸 바와 같이 chaotropic 염의 종류와 농도 차이, 초산나트륨 농도 차이, 세포 용해 용액의 pH 차이에 따른 플라스미드 DNA의 정제 수율과 순도를 확인한 결과, chaotropic 염의 종류와 농도, 초산나트륨의 농도에 따라 최적의 플랏그미드 DNA 정제 수율을 보이는 최적의 pH가 변화함을 알 수 있었다(세부 결과 미기재).

Chaotropic salt(conc)	Na-acetate(conc)	Optimal pH
Gu-SCN (2M)	0.75M	11.8
	1.5M	11.4
Gu-SCN (4M)	0.75M	11.7
	1.5M	11.2
Na-SCN (2M)	0.75M	11.5
	1.5M	11.3
Na-SCN (4M)	0.75M	11.2
	1.5M	11.0

본 실시 예를 통하여 정제한 플라스미드 DNA의 수율이나 정제 순도를 결정하는 최적의 조건이 사용하는 양이온염의 종류와 농도, chaotropic 염의 종류와 농도 및 미세한 pH차이에 의해 변할 수 있음을 알 수 있었다. 그러나, 본 발명에서 사용하는 세포 용해 용액은 pH 10-13의 영역에서 어떠한 조합의 이온 염들을 사용하더라도 본 발명의 목적인 플라스미드 DNA의 정제가 가능하였다.

실시예 3 : 세포 용해 시간이 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 영향

실시예 2에서 얻은 결과에 근거하여 용액 중 농도가 0.75M 초산나트륨, 4M 구아니딘티오시아네이트, 2% 트리톤 X-100이 되도록 초산나트륨과 구아니딘티오시아네이트 및 트리톤 X-100을 합하여 증류수에 완전히 용해시킨 후 2N 수산화나트륨을 사용하여 pH가 11.7이 되도록 조절하였다.

상기의 용액을 세포 용해 용액으로 사용하여 볼텍스 교반 시간을 각각 1분, 3분, 5분 및 7분으로 조절하고 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하고 분석하여 도 2에 도시하였다.

도 2는 세포 용해 용액을 1분간 볼텍스 교반한 실험군의 정제 수율이 7분간 교반한 실험군보다 높음을 나타내고 있다. 이는 1분 이내에 플라스미드의 정제에 필요한 모든 과정이 이루어지며, 세포 용해 시간이 길어짐에 따라 높은 pH에서는 대장균의 유전체 DNA뿐만 아니라 플라스미드 DNA도 비가역적으로 불활성화되었기 때문으로 판단된다. 따라서, 플라스미드 DNA를 고수율로 정제하기 위해서는 적절한 세포 용해 시간을 선정해야 한다는 것을 알 수 있었다.

본 실시 예에 따르면 종래의 방법에서처럼 장시간 그리고 다단계의 세포용해 과정을 거치지 않아도 초고속으로 세포를 용해하여 플라스미드 DNA를 고수율로 정제할 수 있음을 확인할 수 있있다.

실시예 4 : Lysozyme, RNaseA, SDS의 첨가가 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 영향

실시예 2에서 얻은 결과에 근거하여 세포 용해액의 조성을 0.75M 소듐아세테이트, 4M 구아니딘티오시아네이트, 2% 트리톤 X-100, pH 11.7으로 결정하고 실시예 1의 프로토콜에 따라 종래의 방법에서 흔히 첨가되는 lysozyme, RNaseA, 그리고 SDS의 첨가 유무가 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 효과를 조사하여 도 3에 도시하였다. 도 3에서 (a)는 라이소자임(lysozyme)과 RNaseA를, (b)는 소듐도데실설페이트(SDS)를 첨가한 경우이다.

Lysozyme은 최종 100㎍/ml의 농도로 RNaseA는 최종 200㎍/ml의 농도로 세포 용해액에 첨가하였으며 SDS는 최종 0.05%로 첨가하였다. SDS는 고농도의 염이 포함된 용액에서는 침전되어 석출되는 현상을 보이므로 본 발명에서는 석출되지 않는 최저 농도를 결정하여 사용하였다.

도 3(a)와 (b)에 나타낸 결과는 RNaseA나 lysozyme 또는 SDS의 처리가 DNA의 정제효율성에는 어떤 영향도 주지 않음을 나타낸다.

도 3(a)에 나타낸 바와 같이 RNaseA를 처리하지 않은 실험군에서도 유의할만한 RNA가 함께 정제되지 않는 것은 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법이 RNaseA처리를 반드시 필요로 하지 않음을 잘 보여주고 있다. 마찬가지로 lysozyme이나 SDS도 본 발명에 의한 플라스미드 DNA 정제에는 필수적이지 않음을 알 수 있었다.

실시예 5 : 세척 용액의 조성과 pH가 플라스미드DNA의 정제에 미치는 영향

DNA와 실리카 담체의 결합은 RNA와 실리카 담체의 결합보다 강하다는 것은 공지의 사실이다. 따라서 낮은 염 농도의 세척용액에서 알콜 농도와 용액의 pH 변화에 따라 RNA의 제거 효율을 조사해 보았다.

실시예 2에서 얻은 결과에 근거하여 용액 중 농도가 0.75M 초산나트륨, 4M 구아니딘티오시아네이트, 2% 트리톤 X-100이 되도록 초산나트륨과 구아니딘티오시아네이트 및 트리톤 X-100을 합하여 증류수에 완전히 용해시킨 후 2N 수산화나트륨을 사용하여 pH가 10.5가 되도록 조절하였다. 상기의 pH 10.5의 영역을 선정한 이유는 RNA가 보다 많이 오염되어 있지만 또한 플라스미드 DNA의 회수율이 가장 높게 나오는 pH 영역을 선정하여야 세척 용액의 영향을 보다 명확하게 판단할 수 있기 때문이다.

상기의 용액을 세포 용해 용액으로 사용하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하고 분석하였다. 이 때 세척액의 알콜 함량이 플라스미드 DNA의 정제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각 30%, 40% 및 80% 알콜에 초산나트륨 50mM과 트리스하이드로클로라이드 50mM이 함유되도록 제조한 후 2N 수산화나트륨을 이용하여 pH를 12.5로 조절하여 세척 용액으로 각각 사용하였다. 또한 pH에 따른 세척 효과를 조사하기 위하여 상기의 80% 에탄올 용액을 별도로 제조하여 pH를 7.5로 조절하여 사용하였다.

도 4는 플라스미드 DNA의 정제 수율과 순도에 미치는 세척 용액의 조성(a)과 pH의 영향(b)을 조사한 결과를 나타내고 있다. 도 4에서 (a)는 낮은 알코올농도가 오히려 플라스미드 DNA의 회수율을 저하시키며 또한 RNA의 오염도 증가시키는 결과를 보여주고 있다. 또한, 도 4에서 (b)를 검토하면 pH 12.5인 세척 용액은 pH 7.5인 세척 용액에 비해 효율적으로 RNA를 제거하는 것을 알 수 있었다.

본 실 시예를 통하여 세포 용해 용액의 pH는 물론 세척 용액의 pH를 조정하여 오염되는 RNA의 양을 검출한계 미만으로 줄일 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6 : 플라스미드 DNA정제의 수율 및 순도 비교 분석

1) 종래 방법과의 비교

실시예 2에서 얻은 결과에 근거하여 세포 용해 용액의 조성을 0.75M 소듐아세테이트, 4M 구아니딘티오시아네이트, 2% 트리톤 X-100, pH 11.7으로 결정하고, 세척 용액은 80% 알콜에 초산나트륨 50mM과 트리스하이드로클로라이드 50mM이 함유되도록 제조한 후 2N 수산화나트륨을 이용하여 pH를 12.5로 조절하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하여 정제 수율과 순도를 종래의 방법과 비교하였다.

도 5에서 1번 레인은 종래의 알카리 용해 방법으로 세포를 용해한 후 세포 침전물을 제거하고 상층액을 페놀층분리 방법과 알코올침전법(Sambook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)으로 얻은 플라스미드 DNA 를 아가로즈겔 전기영동 분석한 것이다. 도 5에서 2번 레인은 종래의 알카리 용해 방법을 이용하는 키트(Qiagen mini-prep kit, Cat No. 27104)를 구입하여 사용한 후 얻은 플라스미드 DNA 를 전기영동 분석한 것이다. 도 5에서 3번 레인은 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법을 이용하여 얻은 DNA를 전기영동하여 얻은 결과를 나타내고 있다. 도 5는 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법이 종래의 방법에 비해 수율적인 측면에서 보다 우수함을 보여주고 있다.

기존에 알려져 있는 자외선흡광계수기(UV spectrophotometor)를 이용한 흡광법을 이용하여 정제된 플라스미드 DNA의 정제 순도를 측정하였다. 일반적으로 (260nm에서의 흡광도)/(280nm에서의 흡광도)가 1.8이상이고 (260nm에서의 흡광도)/(230nm의 흡광도)가 1.7이상이면 고순도인 것은 잘 알려진 내용이다.

표 3은 종래의 방법과 본 발명의 플라스미드 DNA 정제방법으로 얻은 플라스미드 DNA의 순도를 나타낸 표이다. 표 3에서 각 값은 20회 이상 실시한 실험에서 얻은 평균한 값이다. 표3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 플라스미드 정제 방법은 종래의 알카리 용해 방법에 비해 순도가 결코 떨어지지 않음을 알 수 있다.

플라스미드 DNA 정제 방법
Alkali lysis Phenol/chlorofom 추출	1.64±0.12	1.68±0.13
Alkali lysis Qiagen mini-prep kit	1.87±0.13	1.84±0.03
본발명에 의한 정제	1.93±0.11	1.71±0.21

플라스미드 DNA의 정제 수율은 260nm파장에서의 흡광계수를 구한 후 산출된 값에 50을 곱하여 수율을 산출하였다.

도 6은 본 발명의 플라스미드 DNA정제 방법을 이용하였을 경우 세포 배양액의 단위 부피를 기준으로 얻을 수 있는 최대 정제 수율을 나타내고 있다. 본 실시 예는 500 μl의 세포 용해 용액에 세포배양액 단위 부피 최고 6ml의 단위 부피당 6ml의 배양 대장균 세포를 용해할 수 있으며, 배양액 1ml 당 평균 2~6μg의 플라스미드 DNA 수득율을 보여주고 있으며 최고 26μg/6ml의 수득률을 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 세포 배양부피와 적용하는 세포 용해액의 부피를 늘림으로써 플라스미드 DNA의 정제 규모를 대용량화 할 수 있음을 강력히 시사하고 있다.

2) 제한 효소 분석

DNA의 제한효소 절단실험은 프로메가 사에서 구입한 EcoRI, BamHI, HindIII를 이용하였으며 제조사의 사용설명서에 따라 정제한 플라스미드 DNA를 처리하고 아가로즈겔 전기영동법으로 분석하였다.

도 7은 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법을 이용하여 얻은 DNA를 제한효소 분석한 결과를 나타낸 도이다. 정제한 플라스미드 DNA는 5kb의 크기의 DNA이며 제한효소 처리하지 않은 DNA(intact)와 제한효소 EcoRI를 처리한 DNA(single cut, 5kb DNA band), 제한효소 BamHI를 처리한 DNA(double cut, 2kb,3kb 두 개의 DNA bands), 제한효소 HindIII를 처리한 DNA(single cut, 5kb DNA band)로서 제한효소에 의하여 절단이 잘 이루어지는 것을 보여주고 있다. M은 1kb DNA size marker(엘피스바이오텍 EBM 1001)이다.

상기의 DNA 염기서열분석을 염기서열 서비스업체에 의뢰하여 수행하였다. 염기서열 분석 결과 종래의 방법을 이용한 경우와 비교하였을 때 동일한 결과를 얻었다(세부 결과 미기재).

실시예 7 : 플라스미드 DNA 정제 효율 확인

본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법이 다양한 크기의 플라스미드 DNA 정제에도 유용한 지 확인하여 보았다. 기존에 크기 및 특성이 잘 알려진 3kb(pBluescript II), 4kb(pGemT + 1kb insert), 5kb (pRS313), 6kb (pBI-L), 8kb(pRsmad3) 5종류의 플라스미드 DNA가 들어있는 대장균 배양액으로부터 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법을 이용하여 얻은 DNA를 아가로즈겔 전기영동법으로 분석하였다. 도 8은 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법을 이용하여 다양한 크기의 플라스미드 DNA에 적용하였을 경우에도 효과적으로 정제됨을 나타낸 도이다.

실시예 8 : 다양한 담체를 활용한 플라스미드 DNA 정제

담체로서 실리카 콜로이드(50% w/w)와 마그네틱 실리카 콜로이드(10% w/w)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 세포 용해 용액과 세척 용액을 사용하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 정제하였다. 실리카 콜로이드와 마그네틱 실리카 콜로이드는 시그마 사로부터 구입하여 사용하였다.

도 9는 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 정제할 경우에 실리카 미세막을 이용한 스핀 타입 방법뿐만 아니라 실리카 콜로이드(glass milk), 마그네틱 실리카 콜로이드(magnet bead) 등 다양한 담체를 이용한 방법에서도 효율적인 결과를 나타낸 도이다. 특히 도 9는 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법을 다량 시료를 대상으로 하여 적용(high throughput)하였을 때 종래의 방법에서처럼 세포 침전물을 제거하는 과정이나 또는 시약을 단계적으로 처리하는 과정이 없어 공정의 단축은 물론 플라스미드 DNA정제 비용의 획기적 절감을 이룰 수 있음을 또한 강력하게 시사해 주고 있다.

본 발명의 세포 용해 용액 조성물은 세포의 분산, 세포의 용해, 미생물 유전체 DNA 및 단백질의 불활성화, plasmid DNA의 담체흡착을 단일 용액에서 수행할 수 있도록 하기 때문에 플라스미드 DNA의 정제에 필요한 소요시간의 절대적인 감축은 물론 소모품의 획기적인 절감으로 비용적인 측면과 효율적인 측면에서 높은 효율성을 기대할 수 있는 효과가 있다.

또한 본 발명의 상기 조성물을 이용한 플라스미드 DNA의 정제 방법은 단일 용매를 사용하며 세포침전물을 제거하는 과정이 없기 때문에, 종래에 공지된 방법에 비해 간단한 조작만으로도 미생물, 특히 대장균으로부터 고수율, 고순도의 supercoiled 플라스미드 DNA를 얻을 수 있는 효과가 있다. 특히 수백, 수천개의 시료를 동시에 처리해야 하는 High throughput 연구에 응용될 경우 높은 효율성을 얻을 수 있다.

또한 본 발명의 미생물로부터 플라스미드 DNA만을 순수 정제하는 방법을 이용하였을 경우 미량의 플라스미드 DNA 정제에 뿐만 아니라 규모를 확대하여 의학적으로 중요한 DNA의 분리 및 산업 원료 DNA의 정제에도 활용될 수 있다.

또한 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법은 유전자 치료제를 생산하는 과정에서 문제가 발생하는 외부 RNase를 사용하지 않아도 되는 장점이 있어 유전자치료제의 품질향상에도 크게 기여하는 효과가 있다.

또한 본 발명의 플라스미드 DNA 정제 방법은 플라스미드 DNA의 supercoiled plasmid DNA만을 특이적으로 순수하게 정제할 수 있기 때문에, 기존 방법들이 가지 고 있는 대장균 유전체 DNA의 오염, nick 또는 open circular 플라스미드 DNA의 오염, low molecular RNA의 오염을 대부분 줄일 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 단일 용액을 이용하여 미생물로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 방법은 유전체 및 유전체 기능 연구 분야에 있어서는 물론 생물산업분야에서 획기적인 발전에 공헌할 것으로 기대할 수 있다.

Claims (11)

1. 플라스미드 DNA 정제용 조성물에 있어서,

   chaotropic 염과 계면활성제를 함유하는 양이온 염의 완충용액으로 이루어진 pH 10~13인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 정제용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 양이온 염은 Na+와 K+의 일가 양이온을 가지는 염 중에서 선택된 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 정제용 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 양이온 염의 농도가 50mM이상 2M 이하인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 정제용 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 chaotropic 염은 구아니딘티오시아네이트, 소듐티오시아네이트, 구아니딘하이드로클로라이드, 요오드화 나트륨, 소듐퍼크로레이트로 이루어진 군에서 선 택된 하나 이상의 염인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 정제용 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 chaotropic 염의 농도는 1M이상 6M이하인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 정제용 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 계면활성제는 트윈 또는 트리톤 X계열의 물질 중 선택된 한 종인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 정제용 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,

   상기 계면활성제의 농도(w/v)는 1% 이상이고 5% 이하인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 정제용 조성물.
8. (A) 플라스미드 DNA를 분리하고자 하는 미생물에 제 1 항 내지 제 7 항의 플라스미드 DNA 정제용 조성물을 투입하여 세포를 용해시키는 단계;

   (B) 상기 용해된 세포 용액에 담체를 투입하여 플라스미드 DNA와 담체를 결합시키는 단계;

   (C) 상기 플라스미드 DNA가 결합된 담체를 분리하고, 세척하여 불순물을 제거하는 단계;

   (D) 상기 플라스미드가 결합된 담체로부터 플라스미드 DNA를 회수하는 단계로 이루어는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA의 정제 방법.
9. 제 8 항에 있어서,

   상기 (B) 단계의 담체는 실리카다이옥사이드, 실리카섬유, 실리카 다공막, 실리카 입자, 실리카 자성입자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 담체인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA의 정제 방법.
10. 제 8 항에 있어서,

    상기 (C)단계는 pH 7∼13 범위의 완충액에 60∼90%의 C1~C3의 저급 알코올이 함유된 용액을 세척용액으로 사용하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA의 정제 방법.
11. (1) 제 1 항에 의한 플라스미드 DNA 정제용 조성물;

    (2) 실리카다이옥사이드, 실리카섬유, 실리카 다공막, 실리카 입자, 실리카 자성입자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 담체;

    (3) pH 7∼13 범위의 완충액에 60∼90%의 C1~C3의 저급 알코올이 함유된 세척용액;

    이 각각의 고립된 공간에 담겨있고, 플라스미드 DNA 정제 시 단계적으로 사용할 수 있도록 구성된 플라스미드 DNA 정제용 키트.

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