KR101569832B1 - 시료 중의 게놈 ｄｎａ 및 플라스미드 ｄｎａ를 서로 분리하는 방법 및 그를 위한 키트 - Google Patents

시료 중의 게놈 ｄｎａ 및 플라스미드 ｄｎａ를 서로 분리하는 방법 및 그를 위한 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명의 하나 이상의 예시적 구체예는 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염을 포함하는 결합 버퍼를 이용하여 시료 중의 게놈 DNA 및 플라스미드 DNA를 서로 분리하는 방법 및 그를 위한 키트를 제공한다.
게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염

Description

시료 중의 게놈 ＤＮＡ 및 플라스미드 ＤＮＡ를 서로 분리하는 방법 및 그를 위한 키트{Method for separating genomic DNA and plasmid DNA from each other and kit for same}
본 발명의 하나 이상의 예시적 구체예는 시료 중의 게놈 DNA 및 플라스미드 DNA를 서로 분리하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
시료 특히, 생물학적 시료로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 것은 PCR, 서열분석, 클로닝 및 형질전환 등과 같은 분자 생물학적 분석에서 선결 과정이다. 최근에는 플라스미드 DNA (이하 pDNA라고도 함)가 백신 및 유전자 치료 등에 치료제로서도 다양하게 응용되고 있다. 따라서, 플라스미드 DNA의 분리는 분자 생물학 및 생명공학 분야에서 연구용으로뿐만 아니라, 진단, 치료 및 의약 분야에서도 중요하게 되었다.
종래 pDNA를 분리하는 방법은, 먼저 세포를 알칼리 조건에서 파쇄하고, 세포 파쇄물에 산을 가하여 약산성으로 만들고, 여기에 에탄올을 첨가한 후 얻어진 용액을 고속 원심분리하여 게놈 DNA (이하 gDNA라고도 함)를 침전물로 하여 pDNA로부터 분리하는 것이 알려져 있다. 이 경우, 상기 고속 원심분리는 통상 13,000rpm (약 17,900g) 내지 14,000rpm (약 20,000g) 이상의 조건에서 이루어지는 것이다. 또한, 상업적으로 이용가능한 키트로서, QIAgen MiniPrep DNA (QIAgen 사)가 알려져 있으나, 이 방법 역시 고속 원심분리 과정이 포함되어 있다.
미세유동장치는 고용량 고효율로 생물학적 시료를 분석할 수 있는 장치로서 최근 널리 개발되고 있다. 이러한 장치에 사용되는 모터는 밸브와 같은 정밀한 작동이 요구되는 요소를 제어하기 적합한 모터가 사용된다. 예를 들면, 서보모터 (servo motor)는 정밀한 위치 제어를 위하여 사용된다. 그러한, 정밀한 위치 제어를 위하여 사용되는 모터는 고속의 원심분리에 필요한 원심력을 제공하기에 충분하지 않은 단점이 있다.
따라서, 상기한 방법에 의하더라도 효율적으로 시료 중의 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 분리하는 대안적인 방법이 요구되고 있다. 특히, 고속 원심분리를 사용하지 않고 시료 중의 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 분리하는 대안적인 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 일 예시적 구체예는, 시료 중의 gDNA와 pDNA를 효율적으로 분리할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 예시적 구체예는, 시료 중의 gDNA와 pDNA를 효율적으로 분리할 수 있는 키트를 제공한다.
본 발명의 일 예시적 구체예는 gDNA와 pDNA를 포함하는 시료를 코스모트로픽 염과 카오트로픽 염을 포함하는 용액과 혼합하여, pH 3 내지 5의 혼합물을 얻는 단계; 및 상기 혼합물로부터 gDNA와 pDNA를 분리하는 단계를 포함하는, 시료 중의 gDNA와 pDNA를 분리하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 gDNA와 pDNA를 포함하는 시료를 코스모트로픽 염과 카오트로픽 염을 포함하는 용액과 혼합하여, pH 3 내지 5의 혼합물을 얻는 단계를 포함한다.
본 명세서에 있어서, "게놈 DNA (genomic DNA)"는 원핵 세포 또는 진핵 세포의 게놈을 포함한다. 본 명세서에 있어서, "플라스미드 DNA (plasmid DNA)"는 염색체 외에서 자체 복제 능력이 있는 원형의 DNA를 의미한다. 상기 gDNA는 박테리아 게놈이고, 상기 pDNA 박테리아 세포 유래의 플라스미드일 수 있다.
상기 시료는 gDNA와 pDNA를 포함하는 시료를 포함하는 것이면, 어느 것이나 될 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 파괴된 생물학적 시료인 것일 수 있다. 상기 파괴된 생물학적 시료는 원핵 세포, 진핵 세포 파쇄물 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 파괴된 생물학적 시료는 박테리아 세포 파쇄물, 곰팡이 세포 파쇄물, 식물 세포 파쇄물, 및 동물의 세포 파쇄물로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 상기 파괴된 생물학적 시료는 알려진 방법, 예를 들면, 초음파, 열처리, 압력 처리, 효소 처리, 및 화학적 처리 (예, 알칼리 처리)에 의하여 생물학 시료를 처리하여 얻어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 박테리아 세포 파쇄를 pH 12 내지 13의 조건으로 처리하여 얻어지는 세포 파쇄물일 수 있다.
본 명세서에 있어서, "코스모트로픽 염 (kosmotropic salts)" 및 "카오트로픽 염 (chaotropic salts)"이란 단백질 및/또는 핵산의 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 변화시키지만, 1차 구조는 그대로 유지시키는 물질로서, 대상물질을 안정화시키거나 (코스모트로픽 염) 불안정화시키는 (카오트로픽 염) 물질을 의미한다. 이러한 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염은, 주어진 용액에서 단백질의 용해도에 영향을 미치는 정도에 대한 호프마이스터 계열 (Hofmeister series)과 관련된다. 호프마이스터 계열은 물 구조를 변화시킬 수 있는 능력의 순서로 이온을 분류한다. 음이온 계열은 다음과 같다: SO4 2-<HPO4 2-<OH-<F-<HCOO-<CH3COO-<Cl-<Br-<NO3 -<I-<SCN-<ClO4 -. 양이온 계열은 다음과 같다: NH4 +, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Ca2+, Mg2+, 및 Ba2+. 상기 코스모트로픽 염은 호프마이스터 계열에서 물 구조를 안정화시키는 음이온과 그의 카운터 양이온으로 구성된 것일 수 있다. 상기 카운터 양이온은 상기 호프마이스터 계열의 양이온 계열일 수 있다. 상기 코스모트로픽 염의 예에는 설페이트 (SO4 2-), 포스페이트 (HPO4 2-), 히드록사이드 (OH-), 플루오라이드 (F-), 포르메이트 (HCOO-), 또는 아세테이트 (CH3COO-) 등과 양이온으로 이루어진 염일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 코스모트로픽 염은 호프마이스터 계열에 따라, 단백질 결정화를 유도하고, 소수성 입자에 대한 염석 (salting-out) 이온으로서 작용하며, 물 구조를 만드는 역할을 한다. 상기 코스모트로픽 염은 아세테이트, 포스페이트, 설페이트, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상의 음이온을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 코스모트로픽 염은 포타슘 아세테이트 또는 소듐 아세테이트인 것일 수 있다. 상기 코스모트로픽 염의 농도는 0.3 내지 3M인 것일 수 있다.
상기 카오트로픽 염은 호프마이스터 계열에서 물 구조를 불안정화시키는 음이온과 그의 카운터 양이온으로 구성된 것일 수 있다. 상기 카운터 양이온은 상기 호프마이스터 계열의 양이온 계열일 수 있다. 상기 카오트로픽 염은 Cl-,Br-, NO3 -, I-, SCN- 또는 ClO4 -과 그의 카운터 양이온으로 구성되는 염일 수 있다. 상기 카오트로픽 염의 예는 구아니딘 히드로클로라이드, 구아니딘 이소티오시아네이트, 소듐 이오디드 또는 구아니딘 티오시아네이트인 것일 수 있다. 상기 카오트로픽 염의 농도는 3 내지 6M인 것일 수 있다.
그러나, 상기 코스모트로픽 염과 카오트로픽 염은 반드시 호프마이스터 계열의 음이온과 그의 양이온으로 구성되는 것은 아니며, 단백질 및/또는 핵산의 구조를 안정화시키는 물질과 불안정화시키는 물질이면 어느 것이나 포함될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 코스모트로픽 염 : 카오트로픽 염의 농도 비는 1: 2 내지 1: 14인 것일 수 있다. 상기 코스모트로픽 염과 카오트로픽 염을 포함하는 용액은 각각 pH 3 내지 5의 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 코스모트로픽 염과 카오트로픽 염을 포함하는 용액은 상기 코스모트로픽 염의 농도는 0.3 내지 3M이고, 상기 카오트로픽 염의 농도는 3 내지 6M이고, 상기 코스모트로픽 염 : 카오트로픽 염의 농도 비는 1: 2 내지 1: 14인 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 혼합물로부터 gDNA와 pDNA를 분리하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 있어서, "gDNA와 pDNA를 분리"한다는 것은 gDNA와 pDNA 중 어느 하나 를 더 선택적으로 분리하는 것을 의도한 것이다. 여기서, 분리한 gDNA와 pDNA를 서로 순수 정제하는 것뿐만 아니라, 어느 하나의 농도가 초기 시료 중의 상대적 농도에 비하여 상대적으로 더 높게 하도록 하는 것을 포함한다. 즉, 상기 분리는 gDNA와 pDNA 중 어느 하나를 정제 및 농축하는 것을 포함한다. 상기 농축은 gDNA와 pDNA 중 어느 하나를 초기 농도에 비하여, 몰 농도 기준으로 50%, 70%, 또는 90% 이상 증가시키는 것일 수 있다.
상기 분리하는 단계는 상기 혼합물을 고체 지지체와 접촉시킨 후 상기 고체 지지체를 용액으로부터 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 고체 지지체는 pH 3 내지 5의 조건에 DNA에 결합하는 활성이 있는 알려진 고체 지지체일 수 있다. 예를 들면, 상기 고체 지지체는 이관능성 물질, 소수성 물질 및 CST 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 이관능성 물질은 제1 pH에서 양전하를 띠고, 제2 pH에서 음전하를 갖는 이관능성 물질 또는 이들이 고체 지지체에 고정화되어 있는 것으로서, 제1 pH에서는 핵산에 결합하는 특성을 가지고 있고 제2 pH에서는 핵산을 방출하는 특성을 가진 물질을 의미한다. 상기 제1 pH는 pH 2 내지 5의 pH, 예를 들면, pH 2이상 5미만, 3 내지 4.5 또는 3.5 내지 4.5의 pH일 수 있으며, 제2 pH는 7 내지 12의 pH, 예를 들면, pH 7 내지 11, pH 8 내지 11, pH 8 내지 10인 것일 수 있다.
상기 이관능성 물질은 예를 들면, 제1 pH에서 양전하를 띠고, 제2 pH에서 음 전하를 갖는 이관능성 물질로서 하기 식 I로 표시되는 화합물일 수 있다.
Figure 112008079873804-pat00001
(식 I)
식 중 Q 또는 Q1은 -X1-R1-Y1로 표시되는 기로서, X1는 R2가 수소, 및 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬로부터 선택되는 기인 -NR2-, -O- 또는 -S-이고, R1은 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, Y1는
Figure 112008079873804-pat00002
로 표시되는 기로서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이거나 또는 R3 및 R4는 서로 연결되어 지환족 (alicyclic) 또는 방향족 고리를 형성하는 것이고, 또는 Y1는
Figure 112008079873804-pat00003
로 표시되는 4원 내지 8원 지환족 고리 (alicyclic ring) 또는 6원 내지 8원 방향족 고리를 갖는 기로서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 할로겐 (단, R6은 할로겐이 아님), 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, Q 및 Q1 중 하나 이상은 1차 또는 2차 아미노기를 포함 하는 것이고,
X는
Figure 112008079873804-pat00004
,
Figure 112008079873804-pat00005
, L이 결합, -O-, -CO-, -S-, -SO2-, -CH2-, -C(CH3)2- 또는 -C(CF3)2-인
Figure 112008079873804-pat00006
,
Figure 112008079873804-pat00007
(식 중 카르보닐기와 카르복실기의 치환 위치는 환 연결부를 제외하고는 임의의 위치의 탄소일 수 있다),
Figure 112008079873804-pat00008
, 또는
Figure 112008079873804-pat00009
이다.
상기 식 I의 화합물에 있어서, Q 또는 Q1은 -X1-R1-Y1로 표시되는 기로서, X1는 R2가 수소, 및 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬로부터 선택되는 기인 -NR2-, -O- 또는 -S-이다. 여기서, C1-C10의 알킬에는 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 등이 포함된다. 상기 치환기에는 할로겐이 포함된다. -NR2-의 예에는, -NH-, -N(CH3)-, -N(CH2CH3)- 등이 포함된다. Q 및 Q1 하나 이상은 1차 및 2차 아미노 기 중 하나 이상을 포함하는 것이다.
R1은 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 치환기에는 할로겐, -COOH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -H2PO4, -HPO4 -,및 -PO4 2- 포함된다. 상기 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로틸, 부틸, 이소부틸이 포함되고, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸이 포함된다. 상기 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐에는 에테닐, 프로페닐, 및 부테닐이 포함된다. 또한, 상기 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐에는 에티닐, 프로피닐, 부티닐 기 등이 포함된다.
Y1는
Figure 112008079873804-pat00010
로 표시되는 기로서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이거나 또는 R3 및 R4는 서로 연결되어 지환족 또는 방향족 고리를 형성하는 것일 수 있다. 상기 치환기에는 할로겐, 1차, 2차 또는 3차 아미노기가 포함된다. 상기 지환족 고리 (alicyclic ring)에는, 3 내지 8원의 시클로알킬 또는 시클로알켄일 수 있다. 상기 방항족 고리에는 4원 내지 8원의 방향족 고리가 포함된다. Y1의 예에는 -NH2, -NH(CH3),-NH(CH2CH3) 등이 포함된다.
또한, Y1는
Figure 112008079873804-pat00011
로 표시되는 3원 내지 8원 지환족 고리 또는 4원 내지 8원 방향족 고리를 갖는 기로서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 할로겐 (단, R6는 할로겐이 아님), 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 친화기에는 할로겐이 포함된다. Y1의 예에는
Figure 112008079873804-pat00012
,
Figure 112008079873804-pat00013
,
Figure 112008079873804-pat00014
,
Figure 112008079873804-pat00015
,
Figure 112008079873804-pat00016
등이 포함된다.
식 I의 화합물에 있어서, 상기 Q 또는 Q1은 R1이 -COOH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -H2PO4, -HPO4 -,및 -PO4 2- 중 하나 이상의 기로 치환된, C1-C10의 알킬, C3-C10의 시클로알킬, C2-C10의 알케닐, 및 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
식 I의 화합물에 있어서, 상기 Q 또는 Q1은
Figure 112008079873804-pat00017
,
Figure 112008079873804-pat00018
,
Figure 112008079873804-pat00019
및
Figure 112008079873804-pat00020
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 화학식 I의 화합물은, 예를 들면, 이무수물 (예,
Figure 112008079873804-pat00021
)에 이수물과 반응할 수 있는 관능기 (예를 들면, 아미노기)를 가진 화합물 (예, 에틸렌디아 민, 또는 1-(3-아미노프로필)이미다졸)를 반응시킴으로써 얻어질 수 있다.
또한, 상기 이관능성 물질의 예는, 하기 화학식 MO, M1, M2 및 M3로 이루어진 군으로 선택된 1 이상의 단량체가 결합되어 있고, A를 가진 단량체 및 B를 가진 단량체는 1 이상 포함되어 있는, 이관능성 화합물일 수 있다.
Figure 112008079873804-pat00022
(식 M0),
Figure 112008079873804-pat00023
(식 M1),
Figure 112008079873804-pat00024
(식 M2),
Figure 112008079873804-pat00025
(식 M3)
상기 식 중 A는 -OH 또는 -X2-R11-Y2로 표시되는 기로서, X2는 R12가 수소, 및 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬로부터 선택되는 기인 -NR12-, -O- 또는 -S-이고, R11은 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, Y2는 -COOH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -H2PO4, -HPO4 -,또 는 -PO4 2-이고,
B는 -X3-R13-Y3로 표시되는 기로서, X3는 R14가 수소, 및 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬로부터 선택되는 기인 -NR14-, -O- 또는 -S-이고, R13은 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, Y3는
Figure 112008079873804-pat00026
로 표시되는 기로서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이거나 또는 R3 및 R4는 서로 연결되어 지환족 또는 방향족 고리를 형성하는 것이고, 또는 Y3는
Figure 112008079873804-pat00027
로 표시되는 4원 내지 8원 지환족 고리 또는 6원 내지 8원 방향족 고리를 갖는 기로서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 할로겐 (단, R6은 할로겐이 아님), 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, R8은 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선 택되는, R9 및 R10은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 중합도는 2 내지 30,000인 화합물일 수 있다.
상기 식 중 A는 -OH 또는 -X2-R11-Y2로 표시되는 기로서, X2는 R12가 수소 및 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬로부터 선택되는 기인 -NR12-, -O- 또는 -S-이다. 여기서, C1-C10의 알킬에는 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 등이 포함된다. 상기 치환기에는 할로겐이 포함된다. -NR12-의 예에는, -NH-, -N(CH3)-, -N(CH2CH3)- 등이 포함된다.
R11은 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 치환기에는 할로겐, -COOH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -H2PO4, -HPO4 -,및 -PO4 2- 포함된다. 상기 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로틸, 부틸, 이소부틸이 포함되고, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸이 포함된다. 상기 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐에는 에테닐, 프로페닐, 및 부테닐이 포함된다. 또한, 상기 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐에는 에티닐, 프로피닐, 부티닐 기 등이 포함된다.
Y2의 예는 -COOH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -H2PO4, -HPO4 -,또는 -PO4 2-이다.
B는 -X3-R13-Y3로 표시되는 기로서, X3는 R14가 수소 및 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬로부터 선택되는 기인 -NR14-, -O- 또는 -S-이다. 여기서, C1-C10의 알킬에는 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 등이 포함된다. 상기 치환기에는 할로겐이 포함된다. -NR14-의 예에는, -NH-, -N(CH3)-, -N(CH2CH3)- 등이 포함된다.
R13은 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 치환기에는 할로겐, -COOH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -H2PO4, -HPO4 -,및 -PO4 2-가 포함된다. 상기 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로틸, 부틸, 이소부틸이 포함되고, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸이 포함된다. 상기 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐에는 에테닐, 프로페닐, 및 부테닐이 포함된다. 또한, 상기 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐에는 에티닐, 프로피닐, 부티닐 기 등이 포함된다.
Y3는
Figure 112008079873804-pat00028
로 표시되는 기로서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이거나 또는 R3 및 R4는 서로 연결되어 지환족 고리 (alicyclic ring) 또는 방향족 고리를 형성하는 것일 수 있다. 상기 치환기에는 할로겐, 1차, 2차, 또는 3차 아미노기가 포함된다. 상기 치환족 고리에는, 3 내지 8원의 시클로알킬 또는 시클로알켄일 수 있다. 상기 방항족 고리에는 4원 내지 8원의 방향족 고리가 포함된다. Y3의 예에는 -NH2, -NH(CH3),-NH(CH2CH3) 등이 포함된다.
또한, Y3는
Figure 112008079873804-pat00029
로 표시되는 4원 내지 8원 지환족 고리 또는 6원 내지 8원 방향족 고리를 갖는 기로서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 할로겐 (단, R6은 할로겐이 아님), 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 친화기에는 할로겐이 포함된다. Y1의 예에는
Figure 112008079873804-pat00030
,
Figure 112008079873804-pat00031
,
Figure 112008079873804-pat00032
,
Figure 112008079873804-pat00033
,
Figure 112008079873804-pat00034
등이 포함된다.
R8은 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 여기서, 상기 치환기에는 할로겐이 포함된다.
R9 및 R10은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비치환 C1-C10의 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C10의 시클로알킬, 치환 또는 비치환 C2-C10의 알케닐, 및 치환 또는 비치환 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 치환기의 예에는 할로겐이 포함된다.
상기 A와 B를 포함하는 화합물은 중합도는 2 내지 30,000인 화합물이다.
상기 A 및 B를 포함하는 화합물의 일 구체예는, 상기 B는 R14은 -COOH, -SO3H, -SO2H, -SOH, -H2PO4, -HPO4 -,및 -PO4 2- 중 하나 이상의 기로 치환된, C1-C10의 알킬, C3-C10의 시클로알킬, C2-C10의 알케닐, 및 C2-C10의 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물일 수 있다.
상기 A 및 B를 포함하는 화합물에 있어서, 상기 B는
Figure 112008079873804-pat00035
,
Figure 112008079873804-pat00036
Figure 112008079873804-pat00037
및
Figure 112008079873804-pat00038
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기한 A 및 B를 포함하는 화합물은 예를 들면, 폴리무수물 (예, 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물) (poly(ethylene-alt-maleic anhydride) (분자량 100,000-500,000)을 가수분해시켜 카르복실기를 노출시키고, 상기 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드 및 1,[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드와 같은 물질과 반응시켜 에스테르 결합에 의하여 상기 카르복실기를 활성화시키고, 여기에 상기 A (예, H2O) 또는 B (예, 1-(3-아미노프로필)이미다졸)을 커플링 반응시킴으로써, 본 발명의 예시적 구체예에 따른 A 및 B를 포함하는 화합물을 제조할 수 있다. 또한, 폴리무수물 (예, 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물) (poly(ethylene-alt-maleic anhydride) (분자량 100,000-500,000)을 A를 가진 반응물 (예, H2O) 및 B를 가진 반응물 (예, 1-(3-(아미노프로필)이미다졸)과 직접 반응시킴으로써, A 및 B를 포함하는 화합물을 제조할 수 있다. 상기 A 및 B를 포함하는 화합물의 순 전하는 A 또는 B를 반응 중에 적절한 비율로 포함시킴으로써 조절할 수 있다.
또한, 상기 소수성 물질은 표면의 물 접촉각이 70 내지 90인 것을 의미한다. 상기 소수성 물질의 예는 표면이 옥타데실트리클로로실란(OTS), 트리데카플루오로테트라히드로옥틸 트리메톡시실란(DTS), 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 클로라이드(OTC), 폴리에틸렌이민트리메톡시실란(PEIM) 등의 물질로 이루어질 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, "수접촉각（water contact angle）"은 Kruss Drop Shape Analysis System type DSA 10 Mk2에 의하여 측정된 수접촉각을 나타낸다. 1.5μl의 증류수 방울을 시료 상에 자동적으로 위치시켰다. 상기 수적을 CCD 카메라에 의하여 2초마다 10초 동안 모니터링하여, Drop Shape Analysis software(DSA version 1.7,Kruss)에 분석하였다. 상기 수적의 완전한 프로필은 탄젠트 방법에 의하여 일반적 원형절편의 방정식(conic section equation)에 대하여 핏팅하였다(fitted）. 상기 각은 우측 및 좌측 모두에 대하여 결정하였다. 각 수적에 대한 평균치를 측정하고, 시료 당 전부 5개 수적을 측정하였다. 상기 5개 방울의 평균을 수접촉각으로 하였다.
상기 CST 물질은 고체상이 시료 중의 핵산에 가역적으로 결합하는 방법에 사용하기 위한 고체상을 포함하는 물질 (product)로서. 상기 물질은 복수의 양으로 이온화가능한 기 (positively ionizable groups)를 포함하고, 상기 이온화가능한 기는 상기 고체상에 고정화되어 있고 상기 이온화가능한 기가 양전하로 하전된 제1 pH에서 시료 중에 존재하는 핵산에 결합하는데 효과적이고 상기 이온화가능한 기상의 상기 전하가 음, 중성 또는 덜 양전하를 띠는 제2의 더 높은 pH에서 상기 핵산을 방출하는데 효과적이고, 상기 이온화가능한 기는 생물학적 버퍼, 폴리히드록실화된 아민, 히스티딘 및 폴리히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학종에 의하여 공급되고, 상기 복수개의 양으로 이온화가능한 기는 4.5 내지 8.5의 pKa를 갖는 것인 물질 것을 의미한다. 상기 CST 물질의 예에는, N-2-아세트아미도-2-아미 노에탄술폰산 (ACES); N-2-아세트아미도-2-이미노디아세트산 (ADA); N,N-bis2-히드록시에틸-2-아미노에탄술폰산 (BES); N,N-bis-2-히드록시에틸글리신 (BICINE); bis-2-히드록시에틸이미노트리스히드록시메틸메탄 (Bis-Tris); 1,3-bis트리스히드록시메틸메틸아미노프로판 (Bis-Tris 프로판); 3-N,N-bis-2-히드록시에틸아미노-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO); -2-히드록시에틸피페라진-N-3-프로판술폰산 (EPPS); -2-히드록시에틸피페라진-N-4-부탄술폰산 (HEPBS); -2-히드록시에틸피페라진-N-2-에탄술폰산 (HEPES); -2-히드록시에틸피페라진-N-2-프로판술폰산 (HEPPSO); 2-N-모르폴리노에탄술폰산 (MES); 4-N--모르폴리노부탄술폰산 (MOBS); 3-N-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS); 3-N-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO); 피페라진-N-N-bis-2-에탄술폰산 (PIPES); 피페라진-N-N-bis-2-히드록시프로판술폰산 (POPSO); N-트리스히드록시메틸-메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS); 3-N-트리스히드록시메틸-메틸아미노-2-히드록시프로판술폰산 (TAPSO); N-트리스히드록시메틸-메틸-2-아미노에탄술폰산 (TES); N-트리스히드록시메틸메틸글리신 (TRICINE); 트리스히드록시메틸아미노메탄 (Tris); 폴리히드록실화된 이미다졸; 및 트리에탄올아민 다이머 및 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 버퍼가 포함된다.
상기 고체 지지체는, 비드, 원형, 평판, 기둥, 체 또는 필터, 겔, 막, 섬유, 튜브, 웰 및 미세유동장치의 채널 등의 형상을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 고체 지지체는 자성을 갖는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들면, 유리, 실리카, 라텍스 또는 중합체성 물질로 제조될 수 있다.
상기 고체 지지체를 용액으로부터 분리하는 것은 알려진 방법에 의할 수 있다. 예를 들면, 원심분리 또는 상기 고체 지지체가 자성을 가지고 있는 경우 자력을 이용하는 것일 수 있다. 상기 원심분리는 저원심력 조건에서 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 원심분리는 1,500 내지 6,000g에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 분리된 고체 지지체로부터 gDNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 고체 지지체로부터 gDNA의 분리는, 특정한 버퍼 조건에서 gDNA에 보다 더 특이적으로 결합하는 특성을 가진 고체 지지체와 접촉시켜, gDNA-고체 지지체의 복합체를 형성하고, 상기 복합체로부터 gDNA를 용출함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 gDNA의 분리는 상기 용액을 이관능성 물질, CST 또는 소수성 물질로 코팅된 고체지지체와 접촉시킨 후, 상기 이관능성 물질, CST 또는 소수성 물질을 상기 용액으로부터 분리하고, 분리된 상기 이관능성 물질, CST 또는 소수성 물질로부터 gDNA를 용출하는 것일 수 있다. 상기 접촉은 0.3 내지 3M의 코스모트로픽 염 및 3 내지 6M의 카오트로픽 염를 포함하고, pH 3 내지 5인 용액 중에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 이관능성 물질, CST 또는 소수성 물질의 용액으로부터의 분리는, 중력 또는 원심분리에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 원심분리는, 예를 들면, 1,500 내지 6,000g에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 용출은 25-70℃ 온도 범위에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 용출은 65℃, 10mM Tris HCl 및 pH 8.9의 조건에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 고체 지지체가 제거된 용액으로부터 pDNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 pDNA 분리는 상기 용액을 DNA에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체와 접촉시켜, DNA-고체 지지체의 복합체를 형성하고, 상기 복합체로부터 DNA를 용출함으로써 이루어질 수 있다. 상기 고체 지지체에는 금속 산화물 예를 들면, 알루미나, 티타늄옥사이드 및 SiO2 분자구조를 갖는 물질 (예, 실리카)이 포함된다. 예를 들면, 상기 pDNA 분리는 상기 용액을 실리카와 접촉시킨 후, 상기 실리카를 상기 용액으로부터 분리하고, 분리된 상기 실리카로부터 pDNA를 용출하는 것일 수 있다. 상기 접촉은 0.3 내지 3M의 코스모트로픽 염 및 3 내지 6M의 카오트로픽 염를 포함하고, pH 3 내지 5인 용액 중에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 실리카의 용액으로부터의 분리는, 중력 또는 원심분리에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 원심분리는, 예를 들면, 1,500 내지 6,000g에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 용출은 25℃ 내지 70℃ 온도 범위에서 이루어지는것일 수 있다. 예를 들면, 상기 용출은 65℃, 10mM Tris HCl 및 pH 8.9의 조건에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 분리하는 단계는 상기 혼합물을 원심분리하여 침전물과 상등액으로 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 원심분리는 예를 들면, 1,500 내지 6,000g에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 침전물은 세포 파괴물의 침전물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 분리하는 단계는 상기 침전물로부터 gDNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 침전물로부터 gDNA를 분리하는 것은 상기 침전물을 적절한 매질 중에 현탁시킨 후, 상기 현탁액을 gDNA에 결합하는 고체 지지체와 접촉시킨 후, 상기 gDNA-고체 지지체로부터 gDNA를 분리하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 분리하는 단계는 상기 상등액으로부터 pDNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 pDNA를 분리하는 것은, DNA에 결합하는 특성을 가진 고체 지지체를 상기 상등액과 접촉시켜, DNA를 고체 지지체에 결합시키고, DNA-고체 지지체의 해리 조건 (예를 들면, pH의 알칼리 조건으로 변화 등)에서 DNA를 상기 고체 지지체로부터 용출함으로써 이루어질 수 있다. 상기 고체 지지체에는 금속 산화물 예를 들면, 알루미나, 티타늄옥사이드 및 SiO2 분자구조를 갖는 물질 (예, 실리카)이 포함된다. 예를 들면, 상기 pDNA를 분리하는 것은, 상기 상등액과 실리카를 접촉시킨 후, 상기 실리카를 상기 상등액으로부터 분리하고, 분리된 상기 실리카로부터 pDNA를 용출하는 것일 수 있다. 상기 접촉은 0.3 내지 3M의 코스모트로픽 염 및 3 내지 6M의 카오트로픽 염를 포함하고, pH 3 내지 5인 용액 중에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 실리카를 용액으로부터 분리하는 것은, 중력 또는 원심분리에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 원심분리는, 예를 들면, 1,500 내지 6,000g에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 용출은 25℃ 내지 70℃ 온도 범위에서 이루어지는것일 수 있다. 예를 들면, 상기 용출은 65℃, 10mM Tris HCl 및 pH 8.9의 조건에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 예시적 구체예는, 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염 및 pH 3 내지 5의 범위에서 DNA에 결합하는 특성을 가진 물질을 포함하는 시료 중의 gDNA와 pDNA를 분리하기 위한 분석용 물질을 제공한다.
상기 분석용 물질의 예에는 키트가 포함된다. 상기 코스모트로픽 염은 시료와 혼합된 경우, 0.3M 이상의 농도이 되도록 하는 농도일 수 있다. 상기 코스모트로픽 염의 농도는 0.3M 이상, 예를 들면, 상기 코스모트로픽 염은 0.3 내지 3M의 농도일 수 있다.
상기 카오트로픽 염은 시료와 혼합된 경우, 3M 이상의 농도이 되도록 하는 농도일 수 있다. 상기 카오트로픽 염의 농도는 3M 이상, 예를 들면, 상기 카오트로픽 염은 3 내지 6M의 농도일 수 있다.
상기 분석용 물질의 일 구체예에서, 상기 코스모트로픽 염은 0.3 내지 3M의 농도로 사용되고, 카오트로픽 염은 3 내지 6M의 농도로 반응 용액 중에서 사용되는 것일 수 있다.
그 외의 상기 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 분석용 물질에 있어서, 상기 물질은 이관능성 물질, 소수성 물질 및 CST 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 이관능성 물질, 소 수성 물질 및 CST 물질에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 분석용 물질은 시료 중의 gDNA와 pDNA를 서로 분리하기 위한 과정이 기재되어 있는 설명서를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 설명서에는 상기한 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 예시적 구체예에 따른 방법에 의하여 gDNA와 pDNA를 서로 분리하는 방법이 설명되어 있는 것일 수 있다.
상기 분석용 물질은, 금속 산화물 예를 들면, 알루미나, 티타늄옥사이드 및 SiO2 분자구조를 갖는 물질 (예, 실리카)을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 금속 산화물, 예를 들면, 실리카 물질에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 금속 산화물, 예를 들면, 상기 실리카는 상기한 pH 3 내지 5의 범위에서 DNA에 결합하는 특성을 가진 물질에 gDNA를 선택적으로 결합시키고, 상등액에 선택적으로 남아 있는 pDNA를 분리하는 데 사용될 수 있다. 상기 금속 산화물, 예를 들면, 상기 실리카의 용도에 대하여는, 상기한 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 예시적 구체예에 따른 방법에 의하여 gDNA와 pDNA를 서로 분리하는 방법이 설명되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 예시적 구체예에 따른 시료 중의 gDNA와 pDNA를 분리하는 방법에 따르면, gDNA와 pDNA를 원심분리를 사용하지 않고 또는 저속 원심분리만을 사용하여 효율적으로 분리할 수 있다.
본 발명의 다른 예시적 구체예에 따른 시료 중의 gDNA와 pDNA를 분리하기 위 한 키트에 따르면, gDNA와 pDNA를 원심분리를 사용하지 않고 효율적으로 분리하는데 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 고농도 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염, 이관능성 물질 및 실리카 비드를 사용한 gDNA 및 pDNA 분리
본 실시예에서는 박테리아 파쇄물로부터 pDNA와 gDNA를 서로 분리하여, 최종적으로 서로 분리된 gDNA 및 pDNA를 각각 얻었다.
먼저, pET-21b 플라스미드(4.5kb, Novagen)로 형질전환된 대장균을 50㎍/㎕ 농도의 암피실린 항생제를 포함하는 LB 배지에서 37℃, 200rpm으로 흔들면서 (shaking) 16시간 동안 배양한 후, 배양액 (OD600 =1.0)을 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여, 대장균 펠렛을 얻었다. 상기 펠렛을 포함하는 튜브에 재현탁 버퍼 250㎕ (50mM Tris HCl, 10mM EDTA, 100μg/ml RNaseA; pH 8.0)를 첨가하여, 대장균 펠렛을 재현탁시켰다.
상기 대장균 현탁액에 파쇄 버퍼 250㎕ (200mM NaOH 1% SDS (w/v): pH 12 내지 12.5)를 첨가하여, 세포를 파쇄하였다. 다음으로, 얻어진 세포 파쇄물에 결합 버퍼 100㎕ (0.9M 포타슘 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드; pH 3.4 내지 4.5)를 첨가하였다.
다음으로, 상기 얻어진 혼합물에 이관능성 물질 비드 0.015g를 첨가하고, 실온에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 이관능성 물질 비드에 결합시킨 후, 상기 비드를 3,000rpm, 3분 동안 원심분리하여 상층액으로부터 분리하였다. 상기 이관능성 물질 비드가 제거된 상층액에 실리카 비드 (SUNSIL-130, 평균 직경: 15.0㎛, 선진화학) 0.015g을 첨가하고 실온에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 실리카 비드에 결합시켰다.
마지막으로, 상기 실리카 비드에 용출 버퍼 100㎕ (10mM Tris HCl, pH 8.5)를 첨가하고, 65℃에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 용출시켰다. 또한, 상기 이관능성 물질 비드에 용출 버퍼 100㎕ (10mM Tris HCl, pH 8.9)를 첨가하고, 65℃에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 용출시켰다. 얻어진 용액 중의 핵산을 0.8% 아가로즈에서 전기영동을 이용하여 확인하였다.
대조군 1로서, 상업적으로 이용가능한 박테리아 게놈 DNA 분리 키트인 QiAamp DNA Mini Kt (Qiagen 사, 카타로그 번호 51304)를 사용하였으며, DNA 분리 과정은 제조사의 사용 설명서 (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook, 2nd edition, November 2007)에 따랐다.
대조군 2로서, 염의 농도를 달리한 결합 버퍼, 및 이관능성 물질 비드를 사용하여 DNA를 분리하였다. 구체적으로, 상기 실험군에서 얻어진 대장균 현탁액에 파쇄 버퍼 250㎕ (200mM NaOH 1% SDS (w/v): pH 12 내지 12.5)를 첨가하여, 세포를 파쇄하였다. 다음으로, 얻어진 세포 파쇄물에 결합 버퍼 1ml (100mM 소듐 아세테이트 버퍼, pH 4)를 첨가하였다.
다음으로, 상기 얻어진 혼합물에 이관능성 물질 비드 0.015g를 첨가한 후, 실온에서 3 내지 5 분 동안 둔 후, 3,000rpm으로 3분 동안 원심분리하여 상층액으로부터 분리하였다. 분리된 이관능성 물질 비드를 10mM Tris-HCl 버퍼, pH 7에 현탁한 후, 3,000rpm으로 3분 동안 원심분리하여 이관능성 물질 비드를 세척하였다. 세척된 상기 이관능성 물질 비드를 100mM Tris-HCl 버퍼, pH 9에 현탁하고, 65℃에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 용출시켰다. 다음으로, 3,000rpm으로 3분 동안 원심분리하여 상기 이관능성 물질 비드를 용액으로부터 분리한 후, DNA을 포함하는 상층액을 얻었다. 얻어진 용액 중의 핵산을 0.8% 아가로즈에서 전기영동을 이용하여 확인하였다.
본 실시예에서 사용된 이관능성 물질 비드는 다음의 과정에 의하여 제조된 것을 사용하였다. 상기 제조 과정은 먼저, 아미노기로 코팅된 자성 비드 (Invitrogen Dyanl AS 사, 카탈로그 번호 161-02, Dynabeads® M-270 Amine, 2x109 beads/ml, 직경 2.8㎛)에 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)(poly(ethylene-alt-maleic anhydride) (평균 분자량 100,000-500,000; n=900-4,000)를 고정화시키고, 여기에 1-(3-아미노프로필)이미다졸을 반응시켜, 카르복실 기와 이미다졸 기를 갖는 제1 pH에서 양전하 및 제2 pH에서 음전하를 띠는 물질을 제조하였다. 여기서, 상기 제1 pH는 2 내지 5이고, 제2 pH는 7 내지 12일 수 있다.
구체적으로, 아미노기로 코팅된 상기 자성 비드를 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중의 반복단위 에틸렌-말레산 무수물 기준으로 200mM의 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물) (poly(ethylene-alt-maleic anhydride) (평균 분자량 100,000-500,000, n= 900-4,000)에 침지시켜, 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 그 결과, 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물) (poly(ethylene-alt-maleic anhydride)을 상기 자성비드상의 아미노 기와 반응시켜, 기판상에 고정시켰다. 상기 반응 후, 에탄올을 사용하여 상기 자성 비드를 세척한 후, 건조시켰다.
다음으로, 상기 폴리무수물 (폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)이 고정화된 자성 비드를 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중의 1-(3-아미노프로필)이미다졸 400mM과 물 600mM 용액 중에 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 배양시킨 다음, 에탄올로 세척하였다. 그 결과, 카르복실 기와 이미다졸 기를 갖는 제1 pH에서 양전하 및 제2 pH에서 음전하를 띠는 물질을 제조하였다. 얻어진 화합물을 에탄올로 세척하고, 건조하였다.
얻어진 화합물은 하기 화학식 MO, M1, M2 및 M3로 이루어진 군으로 선택된 1 이상의 단량체가 결합되어 있고, A를 가진 단량체 및 B를 가진 단량체는 1 이상 포함되어 있는, 이관능성 화합물로서,
Figure 112008079873804-pat00039
(식 M0),
Figure 112008079873804-pat00040
(식 M1),
Figure 112008079873804-pat00041
(식 M2),
Figure 112008079873804-pat00042
(식 M3)
상기 식 중 A는 -OH이고, B는
Figure 112008079873804-pat00043
이고, R8은 에틸이고, R9 및 R10은 수소인 화합물이다.
상기 얻어진 화합물이 고정되어 있는 비드 표면에 대하여 실시예1에 기재된 바와 같이, XPS 분석과 TOF-SIMS 분석을 수행하였다. 그 결과, XPS 분석에서 상기 화합물이 카르보닐 기를 갖고 있으며, 상기 카르보닐 기는 -OH 기를 포함하는 카르보닐 기를 포함하는 것을 확인하였다. 또한, TOF-SIMS 분석에서, 이미다졸릴 기가 존재하는 것을 확인하였다.
도 1은 실시예 1에서 대조군 1 및 2에서 분리된 DNA를 나타내는 도면이다. 도 1에서 레인 1: DNA 래더 (25/100bp 혼합 DNA 래더, Bioneer, 한국, 카탈로그 번호 D-1020), 레인 2: 대조군 1, 레인 3: 대조군 2의 결과를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군 1 및 2에 의하면, gDNA 및 pDNA가 최종 용출 용액 중에 전기영동 사진에서 육안으로 확인할 수 있을 정도의 양으로 모두 존재하였다. 따라서, gDNA와 pDNA의 분리효율이 높지 않았다.
도 2는 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염을 포함하는 결합 버퍼를 이용한 gDNA 및 pDNA를 분리한 예를 나타내는 도면이다. 도 2에서, 레인 1: DNA 래더 (25/100bp 혼합 DNA 래더, Bioneer, 한국, 카탈로그 번호 D-1020), 레인 2: 대조군 1, 레인 3 및 4: 본 실시예에서 상기 이관능성 물질 비드로부터 50μl (레인 3) 및 100μl (레인 4) 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA, 레인 5 및 6: 본 실시예에서 상기 실리카 비드로부터 50μl (레인 5) 및 100μl (레인 6) 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA의 결과를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이관능성 물질 비드로부터 용출된 용액 중에는 실질적으로 gDNA만이 존재하고, 실리카 비드로부터 용출된 용액 중에는 실질적으로 pDNA만이 존재하였다. 따라서, 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염을 포함하는 결합 버퍼, 이관능성 물질, 및 실리카 비드를 이용하여 gDNA 및 pDNA를 효율적으로 분리할 수 있었다.
본 실시예의 결과에 따르면, 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염을 포함하는 결합 버퍼 중에서 gDNA는 pDNA에 비하여 더 잘 이관능성 물질에 결합하여, gDNA를 gDNA-이관능성 물질 복합체의 형태로 pDNA로부터 분리한 후, gDNA와 pDNA가 상기 이관능성 물질 및 이관능성 물질이 제거된 용액으로부터 각각 분리되는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명의 범위가 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.
실시예 2: 고농도 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염, 저속도 원심분리 및 실 리카 비드를 사용한 gDNA 및 pDNA 분리
본 실시예에서는 박테리아 파쇄물로부터 pDNA와 gDNA를 서로 분리하여, 최종적으로 서로 분리된 gDNA 및 pDNA를 각각 얻었다. 분리 과정은 실시예 1에서, 이관능성 물질을 사용하는 대신에 저속 원심분리를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 수행되었다. 구체적 과정은 다음과 같다.
먼저, pET-21b 플라스미드(5.4kb, Novagen)로 형질전환된 대장균을 50㎍/㎕ 농도의 암피실린 항생제를 포함하는 LB 배지에서 37℃, 200rpm으로 흔들면서 16시간 동안 배양한 후, 배양액 (OD600 =1.0)을 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여, 대장균 펠렛을 얻었다. 상기 펠렛을 포함하는 튜브에 재현탁 버퍼 250μl (50mM Tris HCl, 10mM EDTA, 100μg/ml RNaseA; pH 8.0)를 첨가하여, 대장균 펠렛을 재현탁시켰다.
상기 대장균 현탁액에 파쇄 버퍼 250μl (200mM NaOH 1% SDS (w/v): pH 12 내지 12.5)를 첨가하여, 세포를 파쇄하였다. 다음으로, 얻어진 세포 파쇄물에 결합 버퍼 100μl (0.9M 포타슘 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드; pH 3.4 내지 4.5)를 첨가하였다.
다음으로, 상기 얻어진 혼합물을 원심분리기에서 4,000 내지 5,000rpm으로 5 분 동안 원심분리하여, 세포 파쇄물의 조 침전물과 상층액으로 분리하였다. 상기 조 침전물이 제거된 상층액에 실리카 비드 (SUNSIL-130, 평균 직경: 15.0㎛ , 선진화학) 0.015g을 첨가하고 실온에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 실리카 비드에 결 합시켰다.
다음으로, 상기 실리카 비드에 용출 버퍼 100μl (10mM Tris HCl, pH 8.5)를 첨가하고, 65℃에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 용출시켰다. 얻어진 용액 중의 핵산을 0.8% 아가로즈에서 전기영동을 이용하여 확인하였다.
대조군 1로서, 상업적으로 이용가능한 박테리아 게놈 DNA 분리 키트인 QiAamp DNA Mini Kt (Qiagen 사, 카타로그 번호 51304)를 사용하였으며, DNA 분리 과정은 제조사의 사용 설명서 (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook, 2nd edition, November 2007)에 따랐다.
대조군 2로서, 상기 실험군의 실험과정에서 원심분리 과정을 거치지 않고 결합 버퍼에 현택된 세포 파쇄물에 실리카 비드 (SUNSIL-130, 평균 직경: 15.0㎛, 선진화학) 0.015g을 첨가하고 실온에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 실리카 비드에 결합시켰다. 용출 과정은 실험군과 동일하다.
도 3은 실시예 2에서 대조군 1 및 2에서 분리된 DNA를 나타내는 도면이다. 도 3에서 레인 1: DNA 래더 (25/100bp 혼합 DNA 래더, Bioneer, 한국, 카탈로그 번호 D-1020), 레인 2: 대조군 1, 레인 3: 대조군 2 (원심분리 없음)의 결과를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군 1 및 2에 의하면, gDNA 및 pDNA가 최종 용출 용액 중에 전기영동 사진에서 육안으로 확인할 수 있을 정도의 양으로 모두 존재하였다. 따라서, gDNA와 pDNA의 분리효율이 높지 않았다.
도 2의 레인 7 및 8는 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염을 포함하는 결합 버퍼 및 저속 원심분리를 이용한 gDNA 및 pDNA를 분리한 예를 나타내는 도면이다. 레인 7 및 8은 본 실시예에서 4000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 조 침전물을 제거한 후 얻어진, 상층액으로부터 50μl (레인 7) 및 100μl (레인 8) 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA의 결과를 나타낸다. 도 2의 레인 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 저속 원심분리 후 실리카 비드로부터 용출된 용액 중에는 실질적으로 pDNA만이 존재하였다. 따라서, 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염을 포함하는 결합 버퍼, 저속 원심분리, 및 실리카 비드를 이용하여 gDNA 및 pDNA를 효율적으로 분리할 수 있었다.
실시예 3: 고농도 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염, 소수성 물질 및 실리카 비드를 사용한 gDNA 및 pDNA 분리
본 실시예에서는 박테리아 파쇄물로부터 pDNA와 gDNA를 서로 분리하여, 최종적으로 서로 분리된 gDNA 및 pDNA를 각각 얻었다. 분리 과정은 실시예 1에서, 이관능성 물질을 사용하는 대신에 소수성 물질을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 수행되었다. 구체적 과정은 다음과 같다.
먼저, pET-21b 플라스미드(4.5kb, Novagen)로 형질전환된 대장균을 50㎍/㎕ 농도의 암피실린 항생제를 포함하는 LB 배지에서 37℃, 200rpm으로 흔들면서 (shaking) 16시간 동안 배양한 후, 배양액 (OD600 =1.0)을 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여, 대장균 펠렛을 얻었다. 상기 펠렛을 포함하는 튜브에 재현탁 버퍼 250㎕ (50mM Tris HCl, 10mM EDTA, 100μg/ml RNaseA; pH 8.0)를 첨가하여, 대장균 펠렛을 재현탁시켰다.
상기 대장균 현탁액에 파쇄 버퍼 250㎕ (200mM NaOH 1% SDS (w/v): pH 12 내지 12.5)를 첨가하여, 세포를 파쇄하였다. 다음으로, 얻어진 세포 파쇄물에 결합 버퍼 100㎕ (0.9M 포타슘 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드; pH 3.4 내지 4.5)를 첨가하였다.
다음으로, 상기 얻어진 혼합물에 소수성 표면을 갖는 비드 (DTS가 SAM 코팅된 실리카 비드, 물 접촉각 85도인 비드, 평균 직경 15㎛) 0.015g를 첨가하고, 실온에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 상기 소수성 표면을 갖는 비드에 결합시킨 후, 상기 비드를 3,000rpm으로 3분 동안 원심분리하여 상층액으로부터 분리하였다. 상기 소수성 표면을 갖는 비드가 제거된 상층액에 실리카 비드 (SUNSIL-130, 평균 직경: 15.0㎛, 선진화학) 0.015g을 첨가하고 실온에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 실리카 비드에 결합시켰다.
다음으로, 상기 실리카 비드를 3,000rpm으로 3분 동안 원심분리하여 상층액으로부터 분리한 후, 상기 실리카 비드에 용출 버퍼 100㎕ (10mM Tris HCl, pH 8.5)를 첨가하고, 65℃에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 용출시켰다. 또한, 상기 소수성 표면을 갖는 비드에 용출 버퍼 100㎕ (100mM Tris HCl, pH 8.9)를 첨가하 고, 65℃에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 용출시켰다. 얻어진 용액 중의 핵산을 0.8% 아가로즈에서 전기영동을 이용하여 확인하였다.
대조군 1로서, 상업적으로 이용가능한 박테리아 게놈 DNA 분리 키트인 QiAamp DNA Mini Kt (Qiagen 사, 카타로그 번호 51304)를 사용하였으며, DNA 분리 과정은 제조사의 사용 설명서 (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook, 2nd edition, November 2007)에 따랐다.
대조군 2로서, 상업적으로 이용가능한 박테리아 플라스미드 DNA 분리 키트인 QIAprep Spin MiniPrep KitTM (Qiagen 사, 카타로그 번호 27104)를 사용하였으며, DNA 분리 과정은 제조사의 사용 설명서(QIAprep Miniprep Handbook, 2nd edition, December 2006)에 따랐다.
본 실시예에서 사용된 상기 소수성 표면을 갖는 실리카 비드 (평균 직경 15㎛)는 고체 지지체 상에 SAM (self assembled monolayer) 방법을 이용하여 다음의 과정을 통하여 제조된 것을 사용하였다. 먼저, Piranah 용액에 실리카 비드를 2 시간 이상 침지시킨 후, 세정하여 건조시켰다. 최종 농도가 각각 100mM이 되도록 상기 트리데카플루오로테트라히드로옥틸 트리메톡시실란(DTS)을 톨루엔과 혼합한 후, 1시간 동안 교반하였다. 상기 건조된 실리카 비드를 상기 톨루엔 중의 DTS 용액 중에 넣고, 4 시간 동안 침지하였다. 상기 침지된 실리카 비드를 EtOH로 각각 10분씩 3회 세정한 후, 진공 건조시켰다. 상기 건조된 실리카 비드를 120℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이렇게 제조된 DTS가 SAM 코팅된 실리카 비드를 실험에 사용 하였다.
도 4는 실시예 3에서, 고농도의 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염, 및 소수성 표면을 갖는 물질을 이용하여 분리된 DNA를 나타내는 도면이다. 도 4에서 레인 1: DNA 래더 (25/100bp 혼합 DNA 래더, Bioneer, 한국, 카탈로그 번호 D-1020), 레인 2: 대조군 1, 레인 3 및 4: 실시예 3에서 상기 소수성 표면을 갖는 자성 비드로부터 100μl 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA, 레인 5 및 6: 실시예 3에서 상기 실리카 비드로부터 100μl 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA의 결과를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 소수성 표면을 갖는 자성 비드로부터 용출된 용액 중에는 gDNA가 대부분을 차지하고 pDNA는 아주 미미하게 존재하고, 실리카 비드로부터 용출된 용액 중에는 실질적으로 pDNA만이 존재하였다. 따라서, 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염을 포함하는 결합 버퍼, 소수성 표면을 갖는 물질, 및 실리카 비드를 이용하여 gDNA 및 pDNA를 효율적으로 분리할 수 있었다.
도 5는 실시예 3에서 대조군1 및 2의 결과를 나타내는 도면이다. 도 5에서, 레인 1: DNA 래더 (25/100bp 혼합 DNA 래더, Bioneer, 한국, 카탈로그 번호 D-1020), 레인 2: 대조군 1, 레인 3: 대조군 2에 따라 용출된 DNA의 결과를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상업적으로 이용가능한 플라스미드 DNA 분리 키트에 의하여 분리된 플라스미드의 순도는, 실시예 3에 따른 방법에 의하여 분리된 플라스미드 순도보다 낮았다.
실시예 4: 고농도 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염, CST 물질 및 실리카 비드를 사용한 gDNA 및 pDNA 분리
본 실시예에서는 박테리아 파쇄물로부터 pDNA와 gDNA를 서로 분리하여, 최종적으로 서로 분리된 gDNA 및 pDNA를 각각 얻었다. 분리 과정은 실시예 1에서, CSR 물질을 사용하는 대신에 CST 물질을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 수행되었다. 구체적 과정은 다음과 같다.
먼저, pET-21b 플라스미드(4.5kb, Novagen)로 형질전환된 대장균을 50㎍/㎕ 농도의 암피실린 항생제를 포함하는 LB 배지에서 37℃, 200rpm으로 흔들면서 (shaking) 16시간 동안 배양한 후, 배양액 (OD600 =1.0)을 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여, 대장균 펠렛을 얻었다. 상기 펠렛을 포함하는 튜브에 재현탁 버퍼 250㎕ (50mM Tris HCl, 10mM EDTA, 100μg/ml RNaseA; pH 8.0)를 첨가하여, 대장균 펠렛을 재현탁시켰다.
상기 대장균 현탁액에 파쇄 버퍼 250㎕ (200mM NaOH 1% SDS (w/v): pH 12 내지 12.5)를 첨가하여, 세포를 파쇄하였다. 다음으로, 얻어진 세포 파쇄물에 결합 버퍼 100㎕ (0.9M 포타슘 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드; pH 3.4 내지 4.5)를 첨가하였다.
다음으로, 상기 얻어진 혼합물에 CST 자성 비드 (직경 <1㎛, 농도 25mg/ml, 저장 버퍼 10mM MES, pH 5.0, 10mM NaCl, 0.1% Tween 20) (Invitrogen 사, ChargeSwitch gDNA Blood Kits; Cat. No. CS11000에 포함되어 있는 것을 사용함) 20㎕를 첨가하고, 실온에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 상기 CST 비드에 결합시킨 후, 상기 비드를 자력을 이용하여 상층액으로부터 분리하였다. 상기 CST 비드가 제거된 상층액에 실리카 비드 (SUNSIL-130, 평균 직경: 15.0㎛, 선진화학) 0.015g을 첨가하고 실온에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 실리카 비드에 결합시켰다.
다음으로, 상기 실리카 비드를 3,000rpm으로 3분 동안 원심분리하여 상층액으로부터 분리한 후, 상기 실리카 비드에 용출 버퍼 100㎕ (10mM Tris HCl, pH 8.5)를 첨가하고, 65℃에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 용출시켰다. 또한, 상기 CST 자성 비드에 용출 버퍼 100㎕ (100mM Tris HCl, pH 8.9)를 첨가하고, 65℃에서 3 내지 5 분 동안 두어 DNA를 용출시켰다. 얻어진 용액 중의 핵산을 0.8% 아가로즈에서 전기영동을 이용하여 확인하였다.
도 6은 실시예 4에서, 고농도의 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염, 및 CST 물질을 이용하여 분리된 DNA를 나타내는 도면이다. 도 6에서 레인 1: DNA 래더 (1kb DNA 래더, NEB, 카탈로그 번호 N-3232S), 레인 2: gDNA 및 pDNA 대조군 (실시예 3의 대조군 1 및 2의 방법에 따라 분리된 gDNA 및 pDNA), 레인 3 및 4: 실시예 4에서 상기 CST 비드로부터 100μl 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA, 레인 5 및 6: 실시예 4에서 상기 실리카 비드로부터 100μl 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA의 결과를 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 CST 비드로부터 용출된 용액 중에는 실질적으로 gDNA만이 존재하고, 실리카 비드로부터 용출된 용액 중에는 실질적으로 pDNA만이 존재하였다. 따라서, 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염 을 포함하는 결합 버퍼, CST 물질, 및 실리카 비드를 이용하여 gDNA 및 pDNA를 효율적으로 분리할 수 있었다.
실시예 5 : gDNA 및 pDNA의 분리에 미치는 코스모트로픽 염의 영향
본 실시예에서는 코스모트로픽 염의 종류가 gDNA 및 pDNA의 분리에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 결합 버퍼로서 0.9M 포타슘 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드 대신에 0.9M 소듐 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 하여 실험하였다.
도 7은 코스모트로픽 염의 종류가 gDNA 및 pDNA의 분리에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 도 7에서, 레인 1: DNA 래더 (1kb DNA 래더, NEB, 카탈로그 번호 N-3232S), 레인 2: gDNA 및 pDNA 대조군 (실시예 3의 대조군 1 및 2의 방법에 따라 분리된 gDNA 및 pDNA), 레인 3 및 4: 결합 버퍼로서 0.9M 포타슘 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드 경우, 상기 이관능성 물질로부터 100μl 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA, 레인 5: 결합 버퍼로서 0.9M 소듐 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드 경우, 상기 이관능성 물질로부터 100μl 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA, 레인 6 및 7: 결합 버퍼로서 0.9M 포타슘 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드 경우, 실리카 비드로부터 100μl 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA, 레인 8: 결합 버퍼로서 0.9M 소듐 아세테이트 및 4.2M 구아니딘 히드로클로라이드 경우, 실리카 비드로부터 100μl 용출 버퍼를 사용하여 용출된 DNA의 결과를 나타낸다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 포타슘 아세테이트를 소듐 아세테이트로 바꾼 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
도 1은 실시예 1에서대조군 1 및 2에서 분리된 DNA를 나타내는 도면이다.
도 2는 고농도의 코스모트로픽 염 및 카오트로픽 염을 포함하는 결합 버퍼를 이용한 gDNA 및 pDNA를 분리한 예를 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 대조군 1 및 2에서 분리된 DNA를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 3에서, 고농도의 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염, 및 소수성 표면을 갖는 물질을 이용하여 분리된 DNA를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 3에서 대조군1 및 2의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 4에서, 고농도의 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염, 및 CST 물질을 이용하여 분리된 DNA를 나타내는 도면이다.
도 7은 코스모트로픽 염의 종류가 gDNA 및 pDNA의 분리에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.

Claims (19)

  1. 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 포함하는 시료를 코스모트로픽 염과 카오트로픽 염을 포함하는 용액과 혼합하여, pH 3 내지 5의 혼합물을 얻는 단계; 및
    상기 혼합물로부터 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 분리하는 단계를 포함하는, 시료 중의 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 서로 분리하는 방법으로서, 상기 분리하는 단계는 상기 혼합물을 고체 지지체와 접촉시킨 후 상기 고체 지지체를 용액으로부터 분리하는 단계; 및
    상기 고체 지지체가 제거된 용액으로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 고체 지지체는 이관능성 물질, 소수성 물질 및 전하 전환 (charge switching: CS) 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 상기 이관능성 물질은 pH 2 내지 5의 제1 pH에서 양전하를 띠고, pH 7 내지 12의 제2 pH에서 음전하를 갖는 물질로서, 제1 pH에서는 핵산에 결합하고, 제2 pH에서 핵산을 방출하는 물질이고, 상기 소수성 물질은 표면의 물 접촉각이 70˚ 내지 90˚인 물질이고, 상기 전하 전환 물질은 고체상이 시료 중의 핵산에 가역적으로 결합하는 방법에 사용하기 위한 고체상을 포함하는 물질 (product)로서, 상기 물질은 복수의 양으로 이온화가능한 기 (positively ionizable groups)를 포함하고, 상기 이온화가능한 기는 상기 고체상에 고정화되어 있고 상기 이온화가능한 기가 양전하로 하전된 제1 pH에서 시료 중에 존재하는 핵산에 결합하는데 효과적이고 상기 이온화가능한 기상의 상기 전하가 음, 중성 또는 덜 양전하를 띠는 제2의 더 높은 pH에서 상기 핵산을 방출하는데 효과적이고, 상기 이온화가능한 기는 생물학적 버퍼, 폴리히드록실화된 아민, 히스티딘 및 폴리히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학종에 의하여 공급되고, 상기 복수개의 양으로 이온화가능한 기는 4.5 내지 8.5의 pKa를 갖는 것으로서,
    상기 전하 전환 물질은 N-2-아세트아미도-2-아미노에탄술폰산 (ACES); N-2-아세트아미도-2-이미노디아세트산 (ADA); N,N-bis2-히드록시에틸-2-아미노에탄술폰산 (BES); N,N-bis-2-히드록시에틸글리신 (BICINE); bis-2-히드록시에틸이미노트리스히드록시메틸메탄 (Bis-Tris); 1,3-bis트리스히드록시메틸메틸아미노프로판 (Bis-Tris 프로판); 3-N,N-bis-2-히드록시에틸아미노-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO); -2-히드록시에틸피페라진-N-3-프로판술폰산 (EPPS); -2-히드록시에틸피페라진-N-4-부탄술폰산 (HEPBS); -2-히드록시에틸피페라진-N-2-에탄술폰산 (HEPES); -2-히드록시에틸피페라진-N-2-프로판술폰산 (HEPPSO); 2-N-모르폴리노에탄술폰산 (MES); 4-N--모르폴리노부탄술폰산 (MOBS); 3-N-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS); 3-N-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO); 피페라진-N-N-bis-2-에탄술폰산 (PIPES); 피페라진-N-N-bis-2-히드록시프로판술폰산 (POPSO); N-트리스히드록시메틸-메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS); 3-N-트리스히드록시메틸-메틸아미노-2-히드록시프로판술폰산 (TAPSO); N-트리스히드록시메틸-메틸-2-아미노에탄술폰산 (TES); N-트리스히드록시메틸메틸글리신 (TRICINE); 트리스히드록시메틸아미노메탄 (Tris); 폴리히드록실화된 이미다졸; 트리에탄올아민 다이머 및 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 버퍼인 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료는 파괴된 생물학적 시료인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 코스모트로픽 염의 농도는 0.3 내지 3M 범위이고, 상기 카오트로픽 염의 농도는 3 내지 6M 범위인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코스모트로픽 염은 아세테이트, 포스페이트, 설페이트, 또는 시트레이트와 그의 카운터 양이온으로 구성되는 염인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 카오트로픽 염은 Br-, NO3 -, I-, SCN- 또는 ClO4 -과 그의 카운터 양이온으로 구성되는 염인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 코스모트로픽 염 : 카오트로픽 염의 농도 비는 몰 농 도를 기준으로 1: 14 내지 1: 2 범위인 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 분리된 고체 지지체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA 분리는 상기 용액을 금속 산화물과 접촉시킨 후, 상기 금속 산화물을 상기 용액으로부터 분리하고, 분리된 상기 금속 산화물로부터 플라스미드 DNA를 용출하는 것인 방법.
  11. 금속 산화물이 포함되지 않은 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 포함하는 시료를 코스모트로픽 염과 카오트로픽 염을 포함하는 용액과 혼합하여, pH 3 내지 5의 혼합물을 얻는 단계; 및
    상기 혼합물로부터 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 분리하는 단계를 포함하는, 시료 중의 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 서로 분리하는 방법으로서,
    상기 분리하는 단계는 상기 혼합물을 원심분리하여 침전물과 상등액으로 분리하는 단계로서, 상기 원심분리는 1,500 내지 6,000g에서 이루어지는 것인 단계; 및
    상기 상등액으로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 침전물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 상등액으로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 단계는, 상기 상등액과 금속 산화물을 접촉시킨 후, 상기 금속 산화물을 상기 상등액으로부터 분리하고, 분리된 상기 금속 산화물로부터 플라스미드 DNA를 용출하는 것인 방법.
  15. 코스모트로픽 염, 카오트로픽 염 및 pH 3 내지 5의 범위에서 DNA에 결합하는 특성을 가진 물질을 포함하는 시료 중의 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 서로 분리하기 위한 분석용 조성물로서, 상기 물질은 이관능성 물질, 소수성 물질 및 전하 전환 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고,
    상기 이관능성 물질은 pH 2 내지 5의 제1 pH에서 양전하를 띠고, pH 7 내지 12의 제2 pH에서 음전하를 갖는 물질로서, 상기 제1 pH에서는 핵산에 결합하고, 상기 제2 pH에서 핵산을 방출하는 물질이고, 상기 소수성 물질은 표면의 물 접촉각이 70˚ 내지 90˚인 물질이고, 상기 전하 전환 물질은 고체상이 시료 중의 핵산에 가역적으로 결합하는 방법에 사용하기 위한 고체상을 포함하는 물질 (product)로서, 상기 물질은 복수의 양으로 이온화가능한 기 (positively ionizable groups)를 포함하고, 상기 이온화가능한 기는 상기 고체상에 고정화되어 있고 상기 이온화가능한 기가 양전하로 하전된 상기 제1 pH에서 시료 중에 존재하는 핵산에 결합하는데 효과적이고 상기 이온화가능한 기상에 존재하는 상기 전하가 음, 중성 또는 덜 양전하를 띠는 상기 제2 pH에서 상기 핵산을 방출하는데 효과적이고, 상기 이온화가능한 기는 생물학적 버퍼, 폴리히드록실화된 아민, 히스티딘 및 폴리히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학종에 의하여 공급되고, 상기 복수개의 양으로 이온화가능한 기는 4.5 내지 8.5의 pKa를 갖는 것으로서, 상기 전하 전환 물질은 N-2-아세트아미도-2-아미노에탄술폰산 (ACES); N-2-아세트아미도-2-이미노디아세트산 (ADA); N,N-bis2-히드록시에틸-2-아미노에탄술폰산 (BES); N,N-bis-2-히드록시에틸글리신 (BICINE); bis-2-히드록시에틸이미노트리스히드록시메틸메탄 (Bis-Tris); 1,3-bis트리스히드록시메틸메틸아미노프로판 (Bis-Tris 프로판); 3-N,N-bis-2-히드록시에틸아미노-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO); -2-히드록시에틸피페라진-N-3-프로판술폰산 (EPPS); -2-히드록시에틸피페라진-N-4-부탄술폰산 (HEPBS); -2-히드록시에틸피페라진-N-2-에탄술폰산 (HEPES); -2-히드록시에틸피페라진-N-2-프로판술폰산 (HEPPSO); 2-N-모르폴리노에탄술폰산 (MES); 4-N--모르폴리노부탄술폰산 (MOBS); 3-N-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS); 3-N-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO); 피페라진-N-N-bis-2-에탄술폰산 (PIPES); 피페라진-N-N-bis-2-히드록시프로판술폰산 (POPSO); N-트리스히드록시메틸-메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS); 3-N-트리스히드록시메틸-메틸아미노-2-히드록시프로판술폰산 (TAPSO); N-트리스히드록시메틸-메틸-2-아미노에탄술폰산 (TES); N-트리스히드록시메틸메틸글리신 (TRICINE); 트리스히드록시메틸아미노메탄 (Tris); 폴리히드록실화된 이미다졸; 트리에탄올아민 다이머 및 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 버퍼인 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 코스모트로픽 염은 0.3 내지 3M의 농도로 최종 용액 중에 사용되고, 카오트로픽 염은 3 내지 6M의 농도로 최종 용액 중에서 사용되는 것인 분석용 조성물.
  17. 삭제
  18. 제15항에 있어서, 시료 중의 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 서로 분리하기 위한 과정이 기재되어 있는 설명서를 더 포함하는 것인 분석용 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 실리카 물질을 더 포함하는 것인 분석용 조성물.
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