JPH0678769A - 核酸精製のための方法および材料 - Google Patents
核酸精製のための方法および材料Info
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- JPH0678769A JPH0678769A JP5164841A JP16484193A JPH0678769A JP H0678769 A JPH0678769 A JP H0678769A JP 5164841 A JP5164841 A JP 5164841A JP 16484193 A JP16484193 A JP 16484193A JP H0678769 A JPH0678769 A JP H0678769A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 タンパク質と核酸とを被覆された基材に接着
および結合させるための組成物および方法を提供する。 【構成】 ９より小さいｐＫをもつ少なくともひとつの
水酸基で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の非
−タンパク質様ポリマーから成る接着性組成物を基材に
適用して、引き続きタンパク質および／または核酸で被
覆する。 【効果】 接着性組成物が適用された基材は、核酸を精
製および酵素的に操作するために使用できる。
および結合させるための組成物および方法を提供する。 【構成】 ９より小さいｐＫをもつ少なくともひとつの
水酸基で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の非
−タンパク質様ポリマーから成る接着性組成物を基材に
適用して、引き続きタンパク質および／または核酸で被
覆する。 【効果】 接着性組成物が適用された基材は、核酸を精
製および酵素的に操作するために使用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の精製および操作
の技術分野に関する。
の技術分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸の精製法としてさまざまな異なる方
法が記述されてきた。続くＤＮＡ分析または操作を干渉
するかもしれない蛋白質および他の物質を抽出するため
にフェノールがしばしば使用される［カービー（Kirb
y）、Progr.Nucl.Acid Res.Mol.Biol.vol.3,p.1,1964]。
しかしながら、フェノールはいくつかの、安全性と健康
に関する危険性を有するため、職業上の安全性に関して
好ましくない。クロロホルムも、フェノールと混合して
ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に通常使用される［マニアテ
ィス（Maniatis)ら、Molecular Cloning,A Laboratory
Manual,Cold SpringHarbor Laboratory，コールドスプ
リングハーバー、ニューヨーク、1982，pp.458-460］。
クロロホルムは癌原性であり、またそのことから、作業
場からなくすべきものである。
法が記述されてきた。続くＤＮＡ分析または操作を干渉
するかもしれない蛋白質および他の物質を抽出するため
にフェノールがしばしば使用される［カービー（Kirb
y）、Progr.Nucl.Acid Res.Mol.Biol.vol.3,p.1,1964]。
しかしながら、フェノールはいくつかの、安全性と健康
に関する危険性を有するため、職業上の安全性に関して
好ましくない。クロロホルムも、フェノールと混合して
ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に通常使用される［マニアテ
ィス（Maniatis)ら、Molecular Cloning,A Laboratory
Manual,Cold SpringHarbor Laboratory，コールドスプ
リングハーバー、ニューヨーク、1982，pp.458-460］。
クロロホルムは癌原性であり、またそのことから、作業
場からなくすべきものである。
【０００３】マコーマック（McCormack）の米国特許第
4,923,978号には、大きな表面領域を有する固相材料、
および高濃度の弱酸性（mildly acidic）ヒドロキシ
ル、例えばシリカを核酸からの蛋白質の分離に使用する
方法が教示されている。スベック（Svec）の米国特許出
願第4,889,632号および第4,923,610号には、ビニルモノ
マー（他のものでは、ヒドロキシスチレンでよい）とジ
ビニルモノマーのコポリマーから作られたマクロポーラ
スなポリマー膜の使用法が教示されている。これらは蛋
白質の分離に有用であることが証明されている。
4,923,978号には、大きな表面領域を有する固相材料、
および高濃度の弱酸性（mildly acidic）ヒドロキシ
ル、例えばシリカを核酸からの蛋白質の分離に使用する
方法が教示されている。スベック（Svec）の米国特許出
願第4,889,632号および第4,923,610号には、ビニルモノ
マー（他のものでは、ヒドロキシスチレンでよい）とジ
ビニルモノマーのコポリマーから作られたマクロポーラ
スなポリマー膜の使用法が教示されている。これらは蛋
白質の分離に有用であることが証明されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】遺伝子工学の急速な発
展のために、核酸を精製および操作するための安全で迅
速な方法が引き続き要求されている。
展のために、核酸を精製および操作するための安全で迅
速な方法が引き続き要求されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、核酸、
特にＤＮＡおよびＲＮＡを単離するための方法を提供す
ることである。
特にＤＮＡおよびＲＮＡを単離するための方法を提供す
ることである。
【０００６】本発明の目的は、固相材料を使用した核酸
の酵素学的操作法を提供することである。
の酵素学的操作法を提供することである。
【０００７】本発明のさらなる他の目的は、核酸精製の
ための組成物を提供することである。
ための組成物を提供することである。
【０００８】これらおよび他の本発明の目的は、以下の
ひとつまたは複数の態様により提供される。
ひとつまたは複数の態様により提供される。
【０００９】本発明の一つの態様においては、核酸から
の蛋白質の分離法が提供される。蛋白質が結合して核酸
が結合しない条件下で組成物を基材に接触させる。この
ような条件とはpH２から11および0.1mMを越える塩であ
る。非結合成分を基材から除去することにより実質的に
蛋白質を含まない核酸調製物が生成される。該基材は、
接着性配合物を基材に適用する工程により作られるが、
その際、該接着性配合物はｐＫ９未満の少なくとも一つ
の水酸基で置換された芳香性部分からなるモノマー単位
の非蛋白質ポリマーからなる。
の蛋白質の分離法が提供される。蛋白質が結合して核酸
が結合しない条件下で組成物を基材に接触させる。この
ような条件とはpH２から11および0.1mMを越える塩であ
る。非結合成分を基材から除去することにより実質的に
蛋白質を含まない核酸調製物が生成される。該基材は、
接着性配合物を基材に適用する工程により作られるが、
その際、該接着性配合物はｐＫ９未満の少なくとも一つ
の水酸基で置換された芳香性部分からなるモノマー単位
の非蛋白質ポリマーからなる。
【００１０】本発明の他の態様においては、蛋白質およ
び核酸の両方を基材に結合させて核酸のみを選択的に溶
出する。該基材は、接着性配合物を基材に適用する工程
により作られるが、その際、該接着性配合物はpK９未満
の少なくとも一つの水酸基で置換された芳香性部分から
なるモノマー単位の非蛋白質ポリマーからなる。結合工
程はpH２から11および0.1mMを越える塩において実施さ
れる。上記溶出はpH４から11の緩衝液を用いる。
び核酸の両方を基材に結合させて核酸のみを選択的に溶
出する。該基材は、接着性配合物を基材に適用する工程
により作られるが、その際、該接着性配合物はpK９未満
の少なくとも一つの水酸基で置換された芳香性部分から
なるモノマー単位の非蛋白質ポリマーからなる。結合工
程はpH２から11および0.1mMを越える塩において実施さ
れる。上記溶出はpH４から11の緩衝液を用いる。
【００１１】本発明のさらに他の態様においては、蛋白
質および一本鎖核酸から二本鎖核酸を精製する。pH７か
ら10において、1mMを越える一価の陽イオンおよび／ま
たは0.1mMを越える多価の陽イオンを接触させた場合、
蛋白質と一本鎖核酸は以下の工程により作られた基材に
結合するが、その工程とは：接着性配合物を基材に適用
し、その際、該接着性配合物はpＫ９未満の少なくとも
一つの水酸基で置換された芳香性部分からなるモノマー
単位の非蛋白質ポリマーからなる。これらの条件下で
は、二本鎖核酸は優位に結合せず、そして単に基材から
非結合成分を分離することにより精製された形態を回収
できる。
質および一本鎖核酸から二本鎖核酸を精製する。pH７か
ら10において、1mMを越える一価の陽イオンおよび／ま
たは0.1mMを越える多価の陽イオンを接触させた場合、
蛋白質と一本鎖核酸は以下の工程により作られた基材に
結合するが、その工程とは：接着性配合物を基材に適用
し、その際、該接着性配合物はpＫ９未満の少なくとも
一つの水酸基で置換された芳香性部分からなるモノマー
単位の非蛋白質ポリマーからなる。これらの条件下で
は、二本鎖核酸は優位に結合せず、そして単に基材から
非結合成分を分離することにより精製された形態を回収
できる。
【００１２】本発明のさらに他の態様においては、二本
鎖核酸から一本鎖核酸を単離するが、該単離はpH７から
10において、1mMを越える一価の陽イオンおよび／また
は0.1mMを越える多価の陽イオンの条件下で基材に組成
物を接触させることによる。該基材は接着性配合物を基
材に適用する工程により作られるが、その際、該接着性
配合物はpK９未満の少なくとも一つの水酸基で置換され
た芳香性部分からなるモノマー単位の非蛋白質ポリマー
からなる。このような条件下では一本鎖核酸は結合する
が二本鎖核酸は結合しない。非結合成分は、単に基材か
らそれらを分離することにより得ることができる。
鎖核酸から一本鎖核酸を単離するが、該単離はpH７から
10において、1mMを越える一価の陽イオンおよび／また
は0.1mMを越える多価の陽イオンの条件下で基材に組成
物を接触させることによる。該基材は接着性配合物を基
材に適用する工程により作られるが、その際、該接着性
配合物はpK９未満の少なくとも一つの水酸基で置換され
た芳香性部分からなるモノマー単位の非蛋白質ポリマー
からなる。このような条件下では一本鎖核酸は結合する
が二本鎖核酸は結合しない。非結合成分は、単に基材か
らそれらを分離することにより得ることができる。
【００１３】本発明のさらに他の態様においては、pK９
未満の少なくとも一つの水酸基で置換された芳香性部分
からなるモノマー単位の非蛋白質ポリマーからなる接着
性配合物を基材に適用する工程により作られる基材に酵
素を結合させる。該酵素は基材として核酸を使用する。
核酸が結合せず酵素が触媒的に活性を有す条件下で、核
酸を基材結合酵素に加える。所望の程度で反応を終えた
後、核酸は単なる相分離による基材から単離できる。活
性に関する変化を最小にする条件下で酵素を基材に結合
させる。可能な条件の範囲はpH２から11、および0.1mM
塩を越える条件を含む。酵素反応はpH４から11の範囲で
触媒活性に関する適切な条件で起こる。
未満の少なくとも一つの水酸基で置換された芳香性部分
からなるモノマー単位の非蛋白質ポリマーからなる接着
性配合物を基材に適用する工程により作られる基材に酵
素を結合させる。該酵素は基材として核酸を使用する。
核酸が結合せず酵素が触媒的に活性を有す条件下で、核
酸を基材結合酵素に加える。所望の程度で反応を終えた
後、核酸は単なる相分離による基材から単離できる。活
性に関する変化を最小にする条件下で酵素を基材に結合
させる。可能な条件の範囲はpH２から11、および0.1mM
塩を越える条件を含む。酵素反応はpH４から11の範囲で
触媒活性に関する適切な条件で起こる。
【００１４】本発明のさらに他の態様においては、pK９
未満の少なくとも一つの水酸基で置換された芳香性部分
からなるモノマー単位の非蛋白質ポリマーからなる接着
性配合物で被覆された基材からなる組成物を提供する。
未満の少なくとも一つの水酸基で置換された芳香性部分
からなるモノマー単位の非蛋白質ポリマーからなる接着
性配合物で被覆された基材からなる組成物を提供する。
【００１５】これらおよび他の態様は以下においてより
詳細に説明されるが、核酸を精製および操作するための
迅速で安全な手段を提供する。
詳細に説明されるが、核酸を精製および操作するための
迅速で安全な手段を提供する。
【００１６】固体または半固体状態で特異的に蛋白質に
結合する非蛋白様ポリマーが今、発見された。このよう
なポリマーは、少なくともひとつの水酸基を有する芳香
性部分で置換された芳香性モノマー単位の好適な調和を
提供する。水酸基のpKは９未満である。蛋白質結合のた
めのこのような固体または半固体の発見は、核酸の精製
および核酸の酵素による修飾に関して適用性を有する。
結合する非蛋白様ポリマーが今、発見された。このよう
なポリマーは、少なくともひとつの水酸基を有する芳香
性部分で置換された芳香性モノマー単位の好適な調和を
提供する。水酸基のpKは９未満である。蛋白質結合のた
めのこのような固体または半固体の発見は、核酸の精製
および核酸の酵素による修飾に関して適用性を有する。
【００１７】本発明による芳香性モノマー単位は、共鳴
が安定し、結合された環状システムを有する化学構造で
ある。これらは、炭化水素、有機または無機複素環、お
よび元素が純粋な無機化合物を含む。この共鳴が安定し
た結合環構造は好ましい平面である。上記のとおり、環
構造はpK９未満の水酸基を少なくともひとつ有する。該
環システムまたはポリマーバックボーン上の他の置換も
用いてよい。あるものは蛋白質のためのポリマーの親和
性を修飾してよい。あるものはポリマーが架橋結合して
いてもよい。他のものは蛋白質に対して不可逆的化学結
合のために使用されてよい。
が安定し、結合された環状システムを有する化学構造で
ある。これらは、炭化水素、有機または無機複素環、お
よび元素が純粋な無機化合物を含む。この共鳴が安定し
た結合環構造は好ましい平面である。上記のとおり、環
構造はpK９未満の水酸基を少なくともひとつ有する。該
環システムまたはポリマーバックボーン上の他の置換も
用いてよい。あるものは蛋白質のためのポリマーの親和
性を修飾してよい。あるものはポリマーが架橋結合して
いてもよい。他のものは蛋白質に対して不可逆的化学結
合のために使用されてよい。
【００１８】上記ポリマーはランダムコポリマー、ブロ
ックコポリマーまたはグラフトコポリマーであってよ
い。この芳香性部分はフェニル基が好ましい。ポリマー
形成のための適切な芳香性モノマー単位はヒドロキシフ
ェニルエチル含有基、特にパラ−ヒドロキシフェニルエ
チル基を含む。環またはポリマー骨格は他の置換基を含
んでよい。該ポリマーは非蛋白質、即ち、天然に存在し
ない蛋白質、半合成蛋白質または合成蛋白質である。該
ポリマーのバックボーンはペプチド結合を形成しない。
典型的には、芳香性モノマー単位はアミノ酸でない。
ックコポリマーまたはグラフトコポリマーであってよ
い。この芳香性部分はフェニル基が好ましい。ポリマー
形成のための適切な芳香性モノマー単位はヒドロキシフ
ェニルエチル含有基、特にパラ−ヒドロキシフェニルエ
チル基を含む。環またはポリマー骨格は他の置換基を含
んでよい。該ポリマーは非蛋白質、即ち、天然に存在し
ない蛋白質、半合成蛋白質または合成蛋白質である。該
ポリマーのバックボーンはペプチド結合を形成しない。
典型的には、芳香性モノマー単位はアミノ酸でない。
【００１９】さまざまな置換体、芳香性モノマー単位の
調和、および共鳴安定結合環システムは、それらを含む
配合物を表面に接触させ、過剰の接触を除去し、必要な
らば、処理された表面を蛋白質の溶液、懸濁液、粉末ま
たはエアロゾルに接触させ、過剰の蛋白質を除去し、必
要ならば、次に、表面に結合している蛋白質または上記
溶液、懸濁液等から除去された蛋白質の量を測定するこ
とにより、本発明の使用法に関して容易に試験できる。
このような測定は染料結合、スペクトロスコープ、放射
性標識の場合はシンチレーションカウンティング、酵素
活性、抗体結合、または処理された表面の容量の直接測
定であってよく、所望の応用が実行される。
調和、および共鳴安定結合環システムは、それらを含む
配合物を表面に接触させ、過剰の接触を除去し、必要な
らば、処理された表面を蛋白質の溶液、懸濁液、粉末ま
たはエアロゾルに接触させ、過剰の蛋白質を除去し、必
要ならば、次に、表面に結合している蛋白質または上記
溶液、懸濁液等から除去された蛋白質の量を測定するこ
とにより、本発明の使用法に関して容易に試験できる。
このような測定は染料結合、スペクトロスコープ、放射
性標識の場合はシンチレーションカウンティング、酵素
活性、抗体結合、または処理された表面の容量の直接測
定であってよく、所望の応用が実行される。
【００２０】上記ポリマーは接着性として配合でき、あ
るいはビーズのような形態の固体として使用できる。好
ましくは、該接着は基材への被覆として核酸の精製のた
めの装置を形成するように使用できる。本発明による接
着性配合物はその活性成分として上記の芳香性ヒドロキ
シル化ポリマーを含む。ひとつ以上の希釈剤、硬化剤、
散布剤、染料、または表面コンディショニング剤を有し
てよい。典型的には、接着性配合物は水性溶液または極
性有機溶剤中に調製される。適切な溶剤は、エタノー
ル、エチレングリコールジアセテート、エチルアセテー
ト、アセトンおよびジメチルスルフォキシドを含む。ビ
ーズは蛍光体または吸着性染料、または磁石粒子または
パラマグネット粒子をしみこませてよい。
るいはビーズのような形態の固体として使用できる。好
ましくは、該接着は基材への被覆として核酸の精製のた
めの装置を形成するように使用できる。本発明による接
着性配合物はその活性成分として上記の芳香性ヒドロキ
シル化ポリマーを含む。ひとつ以上の希釈剤、硬化剤、
散布剤、染料、または表面コンディショニング剤を有し
てよい。典型的には、接着性配合物は水性溶液または極
性有機溶剤中に調製される。適切な溶剤は、エタノー
ル、エチレングリコールジアセテート、エチルアセテー
ト、アセトンおよびジメチルスルフォキシドを含む。ビ
ーズは蛍光体または吸着性染料、または磁石粒子または
パラマグネット粒子をしみこませてよい。
【００２１】本発明による蛋白質または蛋白質含有組成
物は蛋白質の精製および粗精製調製物、例えば、細胞溶
解物を含む。本発明による核酸は精製されたものと並ん
で粗精製調製物、例えば、された溶解物を含み、一本鎖
並びに二本鎖も含み、そして合成ポリマー並びに天然ポ
リマーを含む。
物は蛋白質の精製および粗精製調製物、例えば、細胞溶
解物を含む。本発明による核酸は精製されたものと並ん
で粗精製調製物、例えば、された溶解物を含み、一本鎖
並びに二本鎖も含み、そして合成ポリマー並びに天然ポ
リマーを含む。
【００２２】基材は本発明の接着性配合物で被覆されて
いてよく、プラスチック、天然または合成ファイバー、
膜または紙、金属、ガラス、およびセラミックを含む。
適切なプラスチックは置換されたポリアルケン、ポリア
ミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリスルフォン、
フェノール樹脂、エポキシ樹脂、および置換されたセル
ロースを含む。これらは、当業界において公知のあらゆ
る手段で被覆または部分被覆でき、スプレー（sprayin
g）、浸漬（dipping）、ブラッシング（Brushing）、ス
タンプ（stamping）、溶出（extruding)、または灌流（p
erfusing)を含む。本発明の被覆された基材はあらゆる
形態をとってよい。これらは、ビーズ、ストリップ、マ
ルチウエルプレートのウエル、ストリップまたは個々の
単位、チューブ、メッシュ、連続気泡フォーム、膜、
紙、針、ファイバー、プレート、スライドおよび細胞培
養容器を含む。
いてよく、プラスチック、天然または合成ファイバー、
膜または紙、金属、ガラス、およびセラミックを含む。
適切なプラスチックは置換されたポリアルケン、ポリア
ミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリスルフォン、
フェノール樹脂、エポキシ樹脂、および置換されたセル
ロースを含む。これらは、当業界において公知のあらゆ
る手段で被覆または部分被覆でき、スプレー（sprayin
g）、浸漬（dipping）、ブラッシング（Brushing）、ス
タンプ（stamping）、溶出（extruding)、または灌流（p
erfusing)を含む。本発明の被覆された基材はあらゆる
形態をとってよい。これらは、ビーズ、ストリップ、マ
ルチウエルプレートのウエル、ストリップまたは個々の
単位、チューブ、メッシュ、連続気泡フォーム、膜、
紙、針、ファイバー、プレート、スライドおよび細胞培
養容器を含む。
【００２３】蛋白質は広範囲の条件下で本発明の被覆さ
れた基材に結合する。pHの増加と共に通常結合は減少す
る。ｐＨ２から１１の条件を用いてよいが、pH４から10
が好ましい範囲である。一定pHにおいては、陽イオン濃
度の増加と共に蛋白質の結合は増加する。0.1mMより高
い多価陽イオン濃度および1mMより高い一価陽イオン濃
度を使用してよい。効果を奏するのに必要な最小限の陽
イオン濃度はｐＨおよび緩衝液の函数として変化する。
通常、pHが低ければ低いほど、結合を促進するのに必要
な最小陽イオン濃度は低くなる。即ち、一定量の蛋白質
結合を生じるのに必要な陽イオン濃度はpH７のときより
pH10のときの方が顕著に高くなる。有用な無機多価陽イ
オンの例としては、マグネシウム、銅およびランタニウ
ムを含む。有用な無機一価陽イオンの例としては、ナト
リウム、カリウムおよびリチウムを含む。1Mより高い陽
イオン濃度はpH4から10の範囲での蛋白質結合を実質的
に増加させない。（陽イオン濃度を2倍の2Mにすると通
常は15％未満蛋白質結合が増加する。）結合を促進する
のには一価陽イオンよりも多価陽イオンの方がより効果
的であり、塩素は酢酸およびトリクロロ酢酸よりも結合
を促進するのにより効果的な対イオンである。カオトロ
ピックな有機陽イオンは蛋白質の結合の促進に関しては
効果的でない傾向がある。他の有機陽イオン、特に一次
アミンを含むものは、通常無機陽イオンよりも効果的で
ない。ｐＨの低下に関連した蛋白質結合の増加は通常、
陽イオンの効果とは独立である。即ち、蛋白質結合の最
大量はｐＨの函数として変化する。同じことが核酸の基
材への結合にも当てはまる。
れた基材に結合する。pHの増加と共に通常結合は減少す
る。ｐＨ２から１１の条件を用いてよいが、pH４から10
が好ましい範囲である。一定pHにおいては、陽イオン濃
度の増加と共に蛋白質の結合は増加する。0.1mMより高
い多価陽イオン濃度および1mMより高い一価陽イオン濃
度を使用してよい。効果を奏するのに必要な最小限の陽
イオン濃度はｐＨおよび緩衝液の函数として変化する。
通常、pHが低ければ低いほど、結合を促進するのに必要
な最小陽イオン濃度は低くなる。即ち、一定量の蛋白質
結合を生じるのに必要な陽イオン濃度はpH７のときより
pH10のときの方が顕著に高くなる。有用な無機多価陽イ
オンの例としては、マグネシウム、銅およびランタニウ
ムを含む。有用な無機一価陽イオンの例としては、ナト
リウム、カリウムおよびリチウムを含む。1Mより高い陽
イオン濃度はpH4から10の範囲での蛋白質結合を実質的
に増加させない。（陽イオン濃度を2倍の2Mにすると通
常は15％未満蛋白質結合が増加する。）結合を促進する
のには一価陽イオンよりも多価陽イオンの方がより効果
的であり、塩素は酢酸およびトリクロロ酢酸よりも結合
を促進するのにより効果的な対イオンである。カオトロ
ピックな有機陽イオンは蛋白質の結合の促進に関しては
効果的でない傾向がある。他の有機陽イオン、特に一次
アミンを含むものは、通常無機陽イオンよりも効果的で
ない。ｐＨの低下に関連した蛋白質結合の増加は通常、
陽イオンの効果とは独立である。即ち、蛋白質結合の最
大量はｐＨの函数として変化する。同じことが核酸の基
材への結合にも当てはまる。
【００２４】二本鎖ＤＮＡはｐＨの低下と共に、被覆さ
れた基材への結合が良好になる。pH2から11の条件を使
用して良いが、pH4から10が好ましい。一定のpHにおい
ては、陽イオン濃度の増加と共に、通常は核酸の結合が
増加する。陽イオン存在下の二本鎖核酸の結合は陽イオ
ンの原子価状態（valence state）および濃度に依存し
やすい。高い原子価状態は低い原子価状態に比してより
効果的に結合を促進する。異なる陽イオン原子価状態の
相対的効果は＋３＞＋２＞＋１である。特に、Ｌａ+3＞
＞Ｃａ+2＞Ｍｇ+2＝Ｃｕ+2＞Ｋ+＝Ｎａ+である。0.01M
より高い一価陽イオンの濃度を使用してよいが、0.1Mよ
り高い濃度が好ましい。高い原子価状態に対して、一価
の陽イオンにより結合を促進するためのpHの範囲は2か
ら7に限られ、4から7が好ましい。蛋白質結合と同様
に、1Mより高い濃度は基材に結合するＤＮＡ量を実質的
に増加させない。（陽イオン濃度を2倍の2Mにすると通
常は15％未満蛋白質結合が増加する。）二価の陽イオン
は一価の陽イオンよりも効果的に結合を増加させる。他
にこれらは、遷移金属陽イオン、例えば銅、およびアル
カリ土類陽イオン、例えばカルシウムおよびマグネシウ
ムを含む。二価陽イオンについては1mMより高い濃度を
使用してよく、10mMより高い濃度が好ましい。高い原子
価状態のランタニウムのような陽イオンについては、0.
1mMより高い濃度を使用してよい。1Mより高い濃度の多
価陽イオンは実質的にＤＮＡ結合を増加させる。しかし
ながら、1Mより高い濃度におけるＤＮＡ結合のわずかな
増加は90％より高い結合効率を達成する場合に重要であ
るかもしれない。
れた基材への結合が良好になる。pH2から11の条件を使
用して良いが、pH4から10が好ましい。一定のpHにおい
ては、陽イオン濃度の増加と共に、通常は核酸の結合が
増加する。陽イオン存在下の二本鎖核酸の結合は陽イオ
ンの原子価状態（valence state）および濃度に依存し
やすい。高い原子価状態は低い原子価状態に比してより
効果的に結合を促進する。異なる陽イオン原子価状態の
相対的効果は＋３＞＋２＞＋１である。特に、Ｌａ+3＞
＞Ｃａ+2＞Ｍｇ+2＝Ｃｕ+2＞Ｋ+＝Ｎａ+である。0.01M
より高い一価陽イオンの濃度を使用してよいが、0.1Mよ
り高い濃度が好ましい。高い原子価状態に対して、一価
の陽イオンにより結合を促進するためのpHの範囲は2か
ら7に限られ、4から7が好ましい。蛋白質結合と同様
に、1Mより高い濃度は基材に結合するＤＮＡ量を実質的
に増加させない。（陽イオン濃度を2倍の2Mにすると通
常は15％未満蛋白質結合が増加する。）二価の陽イオン
は一価の陽イオンよりも効果的に結合を増加させる。他
にこれらは、遷移金属陽イオン、例えば銅、およびアル
カリ土類陽イオン、例えばカルシウムおよびマグネシウ
ムを含む。二価陽イオンについては1mMより高い濃度を
使用してよく、10mMより高い濃度が好ましい。高い原子
価状態のランタニウムのような陽イオンについては、0.
1mMより高い濃度を使用してよい。1Mより高い濃度の多
価陽イオンは実質的にＤＮＡ結合を増加させる。しかし
ながら、1Mより高い濃度におけるＤＮＡ結合のわずかな
増加は90％より高い結合効率を達成する場合に重要であ
るかもしれない。
【００２５】一本鎖ＤＮＡも、本発明の被覆された基材
に結合する。通常、pHの低下と共に結合は増加する。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、あらゆるpHおよびpH7から1
0の範囲の陽イオン濃度においてＲＮＡよりも良好に本
発明の被覆された基材に結合する傾向がある。一本鎖核
酸は、ｐＨおよび一価または二価陽イオンの影響に対し
て二本鎖ＤＮＡよりも感受性が高い。しかしながら、2
以上の原子価状態を有する陽イオン、例えばランタニウ
ムに関しては、本発明の基材への二本鎖核酸と一本鎖核
酸の結合は同様である。一価の陽イオンは１ｍＭより高
い濃度において一本鎖の結合を増加させる。多価陽イオ
ンも結合を促進し、そして通常より効果的である。0.1m
Mより高い濃度を使用することができる。効果を奏する
のに必要な最小の陽イオン濃度はpHおよび緩衝液の函数
として変化する。通常、pHが低ければ低いほど結合を促
進するのに必要な陽イオンの最小濃度は低くなる。塩素
対イオンは酢酸よりも効果的に結合を促進する。
に結合する。通常、pHの低下と共に結合は増加する。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、あらゆるpHおよびpH7から1
0の範囲の陽イオン濃度においてＲＮＡよりも良好に本
発明の被覆された基材に結合する傾向がある。一本鎖核
酸は、ｐＨおよび一価または二価陽イオンの影響に対し
て二本鎖ＤＮＡよりも感受性が高い。しかしながら、2
以上の原子価状態を有する陽イオン、例えばランタニウ
ムに関しては、本発明の基材への二本鎖核酸と一本鎖核
酸の結合は同様である。一価の陽イオンは１ｍＭより高
い濃度において一本鎖の結合を増加させる。多価陽イオ
ンも結合を促進し、そして通常より効果的である。0.1m
Mより高い濃度を使用することができる。効果を奏する
のに必要な最小の陽イオン濃度はpHおよび緩衝液の函数
として変化する。通常、pHが低ければ低いほど結合を促
進するのに必要な陽イオンの最小濃度は低くなる。塩素
対イオンは酢酸よりも効果的に結合を促進する。
【００２６】一本鎖核酸からの二本鎖核酸の分離は、本
発明の被覆された基材への核酸の結合における、対イオ
ンの結合の函数としての顕著な量的差異のため、可能で
ある。弱塩基のｐＨ（７−１０）は二本鎖核酸と一本鎖
核酸の分離に最適である。このpH範囲においては、1Mま
たはより良好な濃度でさえも一価陽イオンはＤＮＡ結合
に対してほとんどまたはまったく効果をもたないが、一
本鎖ＤＮＡの結合はこれらの条件下で促進される。この
pH範囲において二本鎖ＤＮＡの結合を促進するのに必要
な二価陽イオンの濃度は同じレベルの一本鎖核酸の結合
を促進するのに必要な値より100倍以上高い。マグネシ
ウム塩はこの点で特に好ましい。核酸結合に対する塩の
効果への二本鎖ＤＮＡの低い感受性のために、酸性ｐＨ
においても一本鎖と二本鎖核酸のいくらかの分離は生じ
る。しかしながら、ＤＮＡが制限酵素HindIIIにより生
じる一本鎖突出部分を含む場合は、二本鎖ＤＮＡの特に
強い結合のために、この分離の効果を生じるのは通常困
難である。
発明の被覆された基材への核酸の結合における、対イオ
ンの結合の函数としての顕著な量的差異のため、可能で
ある。弱塩基のｐＨ（７−１０）は二本鎖核酸と一本鎖
核酸の分離に最適である。このpH範囲においては、1Mま
たはより良好な濃度でさえも一価陽イオンはＤＮＡ結合
に対してほとんどまたはまったく効果をもたないが、一
本鎖ＤＮＡの結合はこれらの条件下で促進される。この
pH範囲において二本鎖ＤＮＡの結合を促進するのに必要
な二価陽イオンの濃度は同じレベルの一本鎖核酸の結合
を促進するのに必要な値より100倍以上高い。マグネシ
ウム塩はこの点で特に好ましい。核酸結合に対する塩の
効果への二本鎖ＤＮＡの低い感受性のために、酸性ｐＨ
においても一本鎖と二本鎖核酸のいくらかの分離は生じ
る。しかしながら、ＤＮＡが制限酵素HindIIIにより生
じる一本鎖突出部分を含む場合は、二本鎖ＤＮＡの特に
強い結合のために、この分離の効果を生じるのは通常困
難である。
【００２７】結合には好ましくないpHおよび／または陽
イオン濃度にシフトすることにより、即ち、pHの増加お
よび／または陽イオン濃度の低下により、核酸は被覆さ
れた基材から溶出する。通常、結合条件と溶出条件の差
が大きければ大きいほど核酸の溶出には効果的である。
核酸の溶出に好適な条件は、上記核酸の結合が起きない
pHおよび陽イオン濃度である。例えば、pH7.5において1
0mMのMgCl2存在下で、被覆された基材に結合したＤＮＡ
オリゴヌクレオチドは同じpHにおいて5mMのMgCl2存在下
で基材から溶出できる。pHを9に増加させ、そしてMgCl2
濃度を1mMに低下させれば、核酸はより効果的に溶出す
る。効率におけるこの増加は通常利益をもたらすが、そ
れは、実質的に小さい容量の溶出体積をもたらすからで
ある。基材への核酸の結合に多価陽イオンを使用するな
らば、キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸
（EDTA）を加えることができる。通常、キレート剤は、
基材へのＤＮＡの結合に使用される多価陽イオンをキレ
ートするのに十分な量で使用される。しかしながら、基
材へのＤＮＡの結合に一価陽イオンを使用した場合であ
っても、EDTAは特に基材からの核酸の解離を高める。こ
の効果は核酸および蛋白質結合に対する酢酸カウンター
イオンの有害な作用に関連するのかもしれない。pH4か
ら11の範囲は二本鎖または一本鎖核酸の溶出に使用でき
るが、6から10のpHが好ましい。通常、4から8のpHの範
囲は二本鎖核酸の溶出により効果的に使用できるが、そ
れは、基材への一本鎖核酸の結合は、多価陽イオンの不
在および低濃度の一価陽イオン（0.01M）の存在下でもp
H4から8において明らかだからである。しかしながら、
一本鎖核酸の溶出はこのｐＨ範囲において可能である
が、非効率的である。二本鎖核酸に関しては、1M未満の
一価陽イオン濃度および0.1Ｍ未満の二価陽イオン濃度
を使用してよいが、一価陽イオンに関しては0.1M未満、
二価陽イオンに関しては0.01Ｍ未満が好ましい。4から1
1の範囲のpHを使用してよいが、6から10が好ましい範囲
である。一本鎖核酸に関しては、0.5M未満の一価陽イオ
ン濃度および10mM未満の二価陽イオン濃度を使用してよ
いが、一価陽イオンに関しては0.05M未満、二価陽イオ
ンに関しては１ｍＭ未満が好ましい。酢酸対イオンは塩
素よりも好ましい。7以上のpHおよび1Mより高い塩濃度
を使用してよいが、0.1M未満の塩濃度が好ましい。一本
鎖核酸に関しては、溶出のためのpHの範囲は7から11で
あり、pH8から10が好ましい。
イオン濃度にシフトすることにより、即ち、pHの増加お
よび／または陽イオン濃度の低下により、核酸は被覆さ
れた基材から溶出する。通常、結合条件と溶出条件の差
が大きければ大きいほど核酸の溶出には効果的である。
核酸の溶出に好適な条件は、上記核酸の結合が起きない
pHおよび陽イオン濃度である。例えば、pH7.5において1
0mMのMgCl2存在下で、被覆された基材に結合したＤＮＡ
オリゴヌクレオチドは同じpHにおいて5mMのMgCl2存在下
で基材から溶出できる。pHを9に増加させ、そしてMgCl2
濃度を1mMに低下させれば、核酸はより効果的に溶出す
る。効率におけるこの増加は通常利益をもたらすが、そ
れは、実質的に小さい容量の溶出体積をもたらすからで
ある。基材への核酸の結合に多価陽イオンを使用するな
らば、キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸
（EDTA）を加えることができる。通常、キレート剤は、
基材へのＤＮＡの結合に使用される多価陽イオンをキレ
ートするのに十分な量で使用される。しかしながら、基
材へのＤＮＡの結合に一価陽イオンを使用した場合であ
っても、EDTAは特に基材からの核酸の解離を高める。こ
の効果は核酸および蛋白質結合に対する酢酸カウンター
イオンの有害な作用に関連するのかもしれない。pH4か
ら11の範囲は二本鎖または一本鎖核酸の溶出に使用でき
るが、6から10のpHが好ましい。通常、4から8のpHの範
囲は二本鎖核酸の溶出により効果的に使用できるが、そ
れは、基材への一本鎖核酸の結合は、多価陽イオンの不
在および低濃度の一価陽イオン（0.01M）の存在下でもp
H4から8において明らかだからである。しかしながら、
一本鎖核酸の溶出はこのｐＨ範囲において可能である
が、非効率的である。二本鎖核酸に関しては、1M未満の
一価陽イオン濃度および0.1Ｍ未満の二価陽イオン濃度
を使用してよいが、一価陽イオンに関しては0.1M未満、
二価陽イオンに関しては0.01Ｍ未満が好ましい。4から1
1の範囲のpHを使用してよいが、6から10が好ましい範囲
である。一本鎖核酸に関しては、0.5M未満の一価陽イオ
ン濃度および10mM未満の二価陽イオン濃度を使用してよ
いが、一価陽イオンに関しては0.05M未満、二価陽イオ
ンに関しては１ｍＭ未満が好ましい。酢酸対イオンは塩
素よりも好ましい。7以上のpHおよび1Mより高い塩濃度
を使用してよいが、0.1M未満の塩濃度が好ましい。一本
鎖核酸に関しては、溶出のためのpHの範囲は7から11で
あり、pH8から10が好ましい。
【００２８】本発明の方法によれば、核酸または蛋白質
含有組成物を本発明の被覆された基材に接触させる。蛋
白質または核酸は非共有結合により接着していても、あ
るいは共有結合により接着性配合物と架橋結合していて
もよい。上記のとおり、基材への蛋白質および核酸の相
互作用はpHおよび塩により影響される。pHの低下または
イオン強度の増加は蛋白質および核酸の接着の増加をも
たらす。この効果に対する蛋白質および核酸の相対的感
受性は、蛋白質＞一本鎖核酸＞二本鎖核酸である。蛋白
質および核酸の両方が存在する場合、蛋白質はＤＮＡよ
り効果的に結合部位に関して競争する。接着が非共有結
合による場合の条件下では、pHの増加および塩濃度の低
下した組成物に基材を接触させることにより蛋白質およ
び核酸を基材から解離できる。相対的感受性は、二本鎖
核酸＞一本鎖核酸＞＞蛋白質である。上記のとおり、陽
イオンは、本発明の基材への蛋白質および核酸の結合を
高める。したがって、ほとんどの条件下で、塩濃度を低
くすればするほど結合した核酸の溶出がより効果的にな
る。しかしながら、極めて低いイオン強度においては蛋
白質も基材から解離するかもしれない。即ち、蛋白質お
よび核酸の両方を含む基材から核酸を解離するための塩
濃度の選択は、基材からの核酸の解離に関して前に記載
したのと同じ範囲であるが、所望の物質を溶出する間、
結合した蛋白質を残す必要性により影響される。基材か
らの蛋白質の解離はほとんどの条件下で十分に遅く、解
離条件下で基材に接着した蛋白質の量が、同じ条件下で
溶液から基材へ移すことができる最大量より大きくて
も、pHを増加させて塩濃度を低下させた場合に、基材か
らほとんどまたはまったく蛋白質が失われない。しかし
ながら、最初の結合条件が飽和であるかまたは飽和に近
くても、顕著な量の蛋白質が基材から解離するかもしれ
ない。
含有組成物を本発明の被覆された基材に接触させる。蛋
白質または核酸は非共有結合により接着していても、あ
るいは共有結合により接着性配合物と架橋結合していて
もよい。上記のとおり、基材への蛋白質および核酸の相
互作用はpHおよび塩により影響される。pHの低下または
イオン強度の増加は蛋白質および核酸の接着の増加をも
たらす。この効果に対する蛋白質および核酸の相対的感
受性は、蛋白質＞一本鎖核酸＞二本鎖核酸である。蛋白
質および核酸の両方が存在する場合、蛋白質はＤＮＡよ
り効果的に結合部位に関して競争する。接着が非共有結
合による場合の条件下では、pHの増加および塩濃度の低
下した組成物に基材を接触させることにより蛋白質およ
び核酸を基材から解離できる。相対的感受性は、二本鎖
核酸＞一本鎖核酸＞＞蛋白質である。上記のとおり、陽
イオンは、本発明の基材への蛋白質および核酸の結合を
高める。したがって、ほとんどの条件下で、塩濃度を低
くすればするほど結合した核酸の溶出がより効果的にな
る。しかしながら、極めて低いイオン強度においては蛋
白質も基材から解離するかもしれない。即ち、蛋白質お
よび核酸の両方を含む基材から核酸を解離するための塩
濃度の選択は、基材からの核酸の解離に関して前に記載
したのと同じ範囲であるが、所望の物質を溶出する間、
結合した蛋白質を残す必要性により影響される。基材か
らの蛋白質の解離はほとんどの条件下で十分に遅く、解
離条件下で基材に接着した蛋白質の量が、同じ条件下で
溶液から基材へ移すことができる最大量より大きくて
も、pHを増加させて塩濃度を低下させた場合に、基材か
らほとんどまたはまったく蛋白質が失われない。しかし
ながら、最初の結合条件が飽和であるかまたは飽和に近
くても、顕著な量の蛋白質が基材から解離するかもしれ
ない。
【００２９】多価陽イオンを用いて蛋白質および核酸を
接着させた場合、金属イオンキレート剤、例えば、EDTA
の添加により基材から接着物質も解離させることができ
る。これらの試薬に対する相対的感受性は、二本鎖核酸
＞一本鎖核酸＞＞蛋白質である。結合した蛋白質の放出
は、pHを調節しただけの溶液よりもＥＤＴＡのようなキ
レート剤を含む溶液中で生じやすい。これらのｐＨおよ
び塩依存性の差異の正味の効果は、一本鎖物質および蛋
白質を基材に結合させ、そして二本鎖物質を通過させる
ことにより、弱塩基pHにおいて一本鎖核酸および／また
は蛋白質から二本鎖核酸（主にＤＮＡ）が分離できるこ
とである。さらに、上記アプローチに従い、次にｐＨを
ぞかさせて塩濃度を低下させ、そして／または、キレー
ト剤を加えることにより二本鎖核酸から一本鎖核酸を分
離できる。陽イオン濃度および／またはpHの有用な範囲
は上記のとおりである。特定のプロトコルに関するpH、
陽イオン、および陽イオン濃度の選択はさまざまなパラ
メーターにより調節され、該パラメーターには核酸結合
の範囲および感受性、溶出物質の次の操作における塩ま
たはpHの有用性または起こりうる干渉、結合または溶出
されなければならない蛋白質および／または核酸の量、
および核酸の組成（例えば、長さ、一本鎖か二本鎖か、
ＲＮＡかＤＮＡか）が含まれる。
接着させた場合、金属イオンキレート剤、例えば、EDTA
の添加により基材から接着物質も解離させることができ
る。これらの試薬に対する相対的感受性は、二本鎖核酸
＞一本鎖核酸＞＞蛋白質である。結合した蛋白質の放出
は、pHを調節しただけの溶液よりもＥＤＴＡのようなキ
レート剤を含む溶液中で生じやすい。これらのｐＨおよ
び塩依存性の差異の正味の効果は、一本鎖物質および蛋
白質を基材に結合させ、そして二本鎖物質を通過させる
ことにより、弱塩基pHにおいて一本鎖核酸および／また
は蛋白質から二本鎖核酸（主にＤＮＡ）が分離できるこ
とである。さらに、上記アプローチに従い、次にｐＨを
ぞかさせて塩濃度を低下させ、そして／または、キレー
ト剤を加えることにより二本鎖核酸から一本鎖核酸を分
離できる。陽イオン濃度および／またはpHの有用な範囲
は上記のとおりである。特定のプロトコルに関するpH、
陽イオン、および陽イオン濃度の選択はさまざまなパラ
メーターにより調節され、該パラメーターには核酸結合
の範囲および感受性、溶出物質の次の操作における塩ま
たはpHの有用性または起こりうる干渉、結合または溶出
されなければならない蛋白質および／または核酸の量、
および核酸の組成（例えば、長さ、一本鎖か二本鎖か、
ＲＮＡかＤＮＡか）が含まれる。
【００３０】本発明の接着性被覆基材およびポリマービ
ーズを用いることができる、多数の特定の使用法が存在
する。上記のとおり、それらを使用して試料、例えば細
胞溶解液または制限酵素分解物中の核酸から蛋白質を除
去できる。それらを使用して、基材への核酸の親和性を
選択的に高める条件を用いるか、または基材からの核酸
の解離を選択的に高める条件を用いことにより、複合組
成物から一本鎖および二本鎖核酸を分離および単離でき
る。この例として、ポリメラーゼチェインリアクション
法（PCR）によるＤＮＡの増幅産物の精製が挙げられ
る。
ーズを用いることができる、多数の特定の使用法が存在
する。上記のとおり、それらを使用して試料、例えば細
胞溶解液または制限酵素分解物中の核酸から蛋白質を除
去できる。それらを使用して、基材への核酸の親和性を
選択的に高める条件を用いるか、または基材からの核酸
の解離を選択的に高める条件を用いことにより、複合組
成物から一本鎖および二本鎖核酸を分離および単離でき
る。この例として、ポリメラーゼチェインリアクション
法（PCR）によるＤＮＡの増幅産物の精製が挙げられ
る。
【００３１】接着性被覆基材を使用して固相酵素反応を
実施できるが、該反応は、酵素活性を有する蛋白質が基
材に結合しており、そして核酸は基材に接触した組成物
の溶液中にある。それらを使用して、酵素反応の範囲を
変えることができるが、該反応においては、反応物は二
本鎖核酸であり、そして産物は一本鎖核酸である。これ
らの特徴をさまざまな組み合わせで用いて塩基配列決定
のような目的のために核酸を迅速に加工および操作する
ためのシステムが提供できる。
実施できるが、該反応は、酵素活性を有する蛋白質が基
材に結合しており、そして核酸は基材に接触した組成物
の溶液中にある。それらを使用して、酵素反応の範囲を
変えることができるが、該反応においては、反応物は二
本鎖核酸であり、そして産物は一本鎖核酸である。これ
らの特徴をさまざまな組み合わせで用いて塩基配列決定
のような目的のために核酸を迅速に加工および操作する
ためのシステムが提供できる。
【００３２】上記のとおり、蛋白質、二本鎖および一本
鎖核酸の異なる結合に基づき、さまざまな実験的応用が
実行できる。一つのそのような応用において、被覆され
た基材を用いてポリメラーゼチェインリアクションの増
幅二本鎖産物を、反応に必要な蛋白質およびプライマー
から精製できる。pH7.0から10および1mMより高い多価陽
イオン濃度において、本発明の被覆基材に反応混合物を
接触させるならば、蛋白質とプライマーは結合し、二本
鎖産物は結合しない。この精製を実施するための２つの
特定の適切な緩衝液（塩基配列決定のような次の操作に
おけるそれらの利用性による）は0.02M Tris-HCl,0.05M
KClまたはNaCl、10mM MgCl2,pH7.5,および0.01M Tris-H
Cl,0.05M KCl,15mM MgCl2,pH8.3である。
鎖核酸の異なる結合に基づき、さまざまな実験的応用が
実行できる。一つのそのような応用において、被覆され
た基材を用いてポリメラーゼチェインリアクションの増
幅二本鎖産物を、反応に必要な蛋白質およびプライマー
から精製できる。pH7.0から10および1mMより高い多価陽
イオン濃度において、本発明の被覆基材に反応混合物を
接触させるならば、蛋白質とプライマーは結合し、二本
鎖産物は結合しない。この精製を実施するための２つの
特定の適切な緩衝液（塩基配列決定のような次の操作に
おけるそれらの利用性による）は0.02M Tris-HCl,0.05M
KClまたはNaCl、10mM MgCl2,pH7.5,および0.01M Tris-H
Cl,0.05M KCl,15mM MgCl2,pH8.3である。
【００３３】被覆された基材の他の実験的応用はバクテ
リア細胞からのプラスミドＤＮＡの精製である。簡単に
言えば、プラスミド含有バクテリア沈殿物を10mM Tris-
HCl,1mM EDTA,5%グリセロール，pH8.0(TE)または好まし
くは5%グリセロールに、ＲＮａｓｅＡ存在下または不在
下で懸濁される。溶解緩衝液（0．2-0.4N NaOH,0.5-1%
SDS）を加える。少なくとも10秒後、中和緩衝液を加え
る（1-2M KCl,0.1-0.5MHCl,0.05-0.5M緩衝液［pK4-1
0］，0-0.2M多価塩）。混合物を渦巻き撹拌し、被覆さ
れた基材を含むカートリッジにのせる。（カートリッジ
に関して記載されている実施例10を参照せよ。）試料を
マトリックスにはじいた（wicked)後、1M KClおよびキ
ャリアーを含む溶液を加える。溶出物を受けのチューブ
に中で遠心分離し、そして2容量のエタノールを加えて
ＤＮＡを沈殿させる。沈殿物を2分間、10,000×g以上遠
心分離してＤＮＡを沈殿させる。別法として、2容量の
エタノール中で＞10,000×gで2分間、直接溶出物を遠心
分離することによりＤＮＡを沈殿させることができる。
沈澱したＤＮＡは70%エタノールで洗浄し、乾燥し、そ
してＴＥに溶解する。
リア細胞からのプラスミドＤＮＡの精製である。簡単に
言えば、プラスミド含有バクテリア沈殿物を10mM Tris-
HCl,1mM EDTA,5%グリセロール，pH8.0(TE)または好まし
くは5%グリセロールに、ＲＮａｓｅＡ存在下または不在
下で懸濁される。溶解緩衝液（0．2-0.4N NaOH,0.5-1%
SDS）を加える。少なくとも10秒後、中和緩衝液を加え
る（1-2M KCl,0.1-0.5MHCl,0.05-0.5M緩衝液［pK4-1
0］，0-0.2M多価塩）。混合物を渦巻き撹拌し、被覆さ
れた基材を含むカートリッジにのせる。（カートリッジ
に関して記載されている実施例10を参照せよ。）試料を
マトリックスにはじいた（wicked)後、1M KClおよびキ
ャリアーを含む溶液を加える。溶出物を受けのチューブ
に中で遠心分離し、そして2容量のエタノールを加えて
ＤＮＡを沈殿させる。沈殿物を2分間、10,000×g以上遠
心分離してＤＮＡを沈殿させる。別法として、2容量の
エタノール中で＞10,000×gで2分間、直接溶出物を遠心
分離することによりＤＮＡを沈殿させることができる。
沈澱したＤＮＡは70%エタノールで洗浄し、乾燥し、そ
してＴＥに溶解する。
【００３４】
【００３５】
【実施例１】この実施例では、制限酵素を用いた制限酵
素消化DNAの精製を示す。本発明の被覆された膜基材に
対して、酵素は結合するがDNAは通過した。
素消化DNAの精製を示す。本発明の被覆された膜基材に
対して、酵素は結合するがDNAは通過した。
【００３６】3.3 μgのHind III制限酵素処理λ DNA
（0.6 mlに0.100 A260単位）を、50 mM Tris-HCl, pH
7.5 （37℃測定時）, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM
メルカプトエタノール, 50 U Hind IIIを含む 50 μlの
バッファーに加えた。２μlの0.5 M EDTAをバッファー
に加え、溶液をDNA精製カートリッジに入れた。カート
リッジ本体は一端を開放し、他端はポリ-4-ヒドロキシ
スチレン（PHS）で被覆された多孔性ポリエチレンディ
スク（通常ポアサイズ15〜30μ）を支えるポリプロピレ
ングリッドで物理的に制限され、その上にPHS被覆され
たニトロセルロース膜（被覆前のポアサイズ0.1μ）を
置いた。被覆処理は、膜あるいは多孔性ポリエチレンを
濃度50 mg/mlのPHS （100,000 MW）の50%エタノール水
溶液に浸漬、余分なポリマ−の除去、室温の濾過空気流
中での膜あるいは多孔性ポリエチレンの乾燥から構成さ
れた。ディスク及び膜はテフロンスリーブでカートリッ
ジの定位置に固定され、膜の端からサンプルが漏れるこ
とを防いだ。1.5 mlのマイクロ遠心チューブにカートリ
ッジを入れて支え、精製DNAを受けるチューブとした。D
NAと酵素を含む溶液を、カートリッジの制限端にある膜
に均等に分散させた。カートリッジの開放側にきっちり
と合って取り付けられるキャップを定位置に押し込ん
だ。キャップを定位置に押し込むことによってカートリ
ッジ内が加圧され、それによってDNAを含む溶液が膜や
多孔性ポリエチレンフリット、ポリプロピレングリッド
を通して受容用1.5 mlマイクロ遠心チューブ側に移動し
た。チューブとカートリッジを一緒にマイクロ遠心機の
最高速度で５秒間遠心し、溶液の最大回収を確実にし
た。溶液の回収量は47μlであった。未回収物（5μl）
を回収するため、10μlの蒸留脱イオン水をカートリッ
ジに加え、膜に分散させ、カートリッジの端を閉め、カ
ートリッジと受容チューブをマイクロ遠心機で５秒間の
遠心を行った。溶出液に回収されたDNA量は添加量と比
較して97%だった（260 nmの分光測定法で決定）。カー
トリッジ溶出液をpUC19 DNAと一晩（16時間）反応させ
ても、制限酵素活性の残存は認められなかった。カート
リッジを通した制限酵素バッファーでは、組成の有為な
変化あるいは制限酵素を加えた際の活性阻害は認められ
なかった。
（0.6 mlに0.100 A260単位）を、50 mM Tris-HCl, pH
7.5 （37℃測定時）, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM
メルカプトエタノール, 50 U Hind IIIを含む 50 μlの
バッファーに加えた。２μlの0.5 M EDTAをバッファー
に加え、溶液をDNA精製カートリッジに入れた。カート
リッジ本体は一端を開放し、他端はポリ-4-ヒドロキシ
スチレン（PHS）で被覆された多孔性ポリエチレンディ
スク（通常ポアサイズ15〜30μ）を支えるポリプロピレ
ングリッドで物理的に制限され、その上にPHS被覆され
たニトロセルロース膜（被覆前のポアサイズ0.1μ）を
置いた。被覆処理は、膜あるいは多孔性ポリエチレンを
濃度50 mg/mlのPHS （100,000 MW）の50%エタノール水
溶液に浸漬、余分なポリマ−の除去、室温の濾過空気流
中での膜あるいは多孔性ポリエチレンの乾燥から構成さ
れた。ディスク及び膜はテフロンスリーブでカートリッ
ジの定位置に固定され、膜の端からサンプルが漏れるこ
とを防いだ。1.5 mlのマイクロ遠心チューブにカートリ
ッジを入れて支え、精製DNAを受けるチューブとした。D
NAと酵素を含む溶液を、カートリッジの制限端にある膜
に均等に分散させた。カートリッジの開放側にきっちり
と合って取り付けられるキャップを定位置に押し込ん
だ。キャップを定位置に押し込むことによってカートリ
ッジ内が加圧され、それによってDNAを含む溶液が膜や
多孔性ポリエチレンフリット、ポリプロピレングリッド
を通して受容用1.5 mlマイクロ遠心チューブ側に移動し
た。チューブとカートリッジを一緒にマイクロ遠心機の
最高速度で５秒間遠心し、溶液の最大回収を確実にし
た。溶液の回収量は47μlであった。未回収物（5μl）
を回収するため、10μlの蒸留脱イオン水をカートリッ
ジに加え、膜に分散させ、カートリッジの端を閉め、カ
ートリッジと受容チューブをマイクロ遠心機で５秒間の
遠心を行った。溶出液に回収されたDNA量は添加量と比
較して97%だった（260 nmの分光測定法で決定）。カー
トリッジ溶出液をpUC19 DNAと一晩（16時間）反応させ
ても、制限酵素活性の残存は認められなかった。カート
リッジを通した制限酵素バッファーでは、組成の有為な
変化あるいは制限酵素を加えた際の活性阻害は認められ
なかった。
【００３７】
【実施例２】この実施例では、本発明の被覆された基材
の高い結合能力を示す。
の高い結合能力を示す。
【００３８】50μlの50 mM Tris-HCl, pH 7.5（37℃測
定時）,10 mM MgCl2, 100 mM NaCl,1 mMジチオエリトリ
トールを含むバッファーに10、20、30、40 μgのBSAを
加え、実施例１に述べられているカートリッジに添加
し、実施例１に述べられている様に抽出した。溶出液に
検出されたタンパク質量は、10、20、30 μgの添加時で
0 μg、40 μg添加時に0.1 μgであった。
定時）,10 mM MgCl2, 100 mM NaCl,1 mMジチオエリトリ
トールを含むバッファーに10、20、30、40 μgのBSAを
加え、実施例１に述べられているカートリッジに添加
し、実施例１に述べられている様に抽出した。溶出液に
検出されたタンパク質量は、10、20、30 μgの添加時で
0 μg、40 μg添加時に0.1 μgであった。
【００３９】
【実施例３】この実施例では、本発明の被覆された基材
に対して一本鎖RNAの結合がpH依存性であることを示
す。
に対して一本鎖RNAの結合がpH依存性であることを示
す。
【００４０】MS2バクテリオファージRNA （3.2μg）
を、実施例１に述べられているカートリッジに添加し、
実施例１に述べられている様に処理を行った。バッファ
ーとしては100μlの1 M KClと0.1 M Tris-HCl （pH 7.0
から8.5まで0.5間隔で作成）を使用した。溶出液に回収
されたRNA量は260 nmの分光測定法で決定した。RNAの回
収率はpH 7.0で24%、pH 7.5で42%、pH 8.0で60%、pH 8.
5で85%を示した。
を、実施例１に述べられているカートリッジに添加し、
実施例１に述べられている様に処理を行った。バッファ
ーとしては100μlの1 M KClと0.1 M Tris-HCl （pH 7.0
から8.5まで0.5間隔で作成）を使用した。溶出液に回収
されたRNA量は260 nmの分光測定法で決定した。RNAの回
収率はpH 7.0で24%、pH 7.5で42%、pH 8.0で60%、pH 8.
5で85%を示した。
【００４１】
【実施例４】この実施例では、本発明の被覆された基材
に対して二本鎖DNAの結合がpH依存性であることを示
す。pH 7.0以上では、実質的にDNAは結合しない。
に対して二本鎖DNAの結合がpH依存性であることを示
す。pH 7.0以上では、実質的にDNAは結合しない。
【００４２】Hae IIIで消化されたφX174 DNA （3.3μ
g）を、実施例１に述べられているカートリッジに添加
し、実施例１に述べられている様に処理を行った。バッ
ファーのpHは7.0から8.5まで0.5間隔で作成した。DNAの
回収率は260 nmの分光測定法で決定した。RNAの回収率
はpH 7.0で96%、pH 7.5で100%、pH 8.0で100%、pH 8.5
で96%を示した。
g）を、実施例１に述べられているカートリッジに添加
し、実施例１に述べられている様に処理を行った。バッ
ファーのpHは7.0から8.5まで0.5間隔で作成した。DNAの
回収率は260 nmの分光測定法で決定した。RNAの回収率
はpH 7.0で96%、pH 7.5で100%、pH 8.0で100%、pH 8.5
で96%を示した。
【００４３】
【実施例５】この実施例では、本発明の被覆された基材
に対してpH 7.5での一本鎖オリゴマーの結合が塩濃度依
存性であることを示す。
に対してpH 7.5での一本鎖オリゴマーの結合が塩濃度依
存性であることを示す。
【００４４】5'-GGAAACAGCTATGACCATGA-3'の塩基配列を
持つ２μgの20塩基長オリゴマー（0.6 mlに0.100 A260
単位）を、実施例１に述べられている様にカートリッジ
を通過させ処理を行った。MgCl2の濃度を1、3、5、10 m
Mに変えた0.01 M Tris-HCl,pH 7.5, 0.05 M KClバッフ
ァーを用いた。オリゴマーの回収率は1 mM MgCl2で35
%、3 mM MgCl2で11%、5 mM MgCl2で3%、10 mM MgCl2で0
%を示した。
持つ２μgの20塩基長オリゴマー（0.6 mlに0.100 A260
単位）を、実施例１に述べられている様にカートリッジ
を通過させ処理を行った。MgCl2の濃度を1、3、5、10 m
Mに変えた0.01 M Tris-HCl,pH 7.5, 0.05 M KClバッフ
ァーを用いた。オリゴマーの回収率は1 mM MgCl2で35
%、3 mM MgCl2で11%、5 mM MgCl2で3%、10 mM MgCl2で0
%を示した。
【００４５】
【実施例６】この実施例では、本発明の被覆された基材
に対してpH 7.5での二本鎖DNAの結合が塩濃度依存性で
あることを示す。
に対してpH 7.5での二本鎖DNAの結合が塩濃度依存性で
あることを示す。
【００４６】3.3μgのφX174 DNAを、実施例５に述べら
れている様に処理を行った。DNAの回収率は1 mM MgCl2
で91%、3 mM MgCl2で91%、5 mM MgCl2で90%、10 mM MgC
l2で87%を示した。
れている様に処理を行った。DNAの回収率は1 mM MgCl2
で91%、3 mM MgCl2で91%、5 mM MgCl2で90%、10 mM MgC
l2で87%を示した。
【００４７】
【実施例７】この実施例では、本発明の被覆された基材
に対して二本鎖DNAが連続的に結合、および溶出するこ
とを示す。pH 4.0, 1.9 M MgCl2では90%のDNAが結合し
た。pH 8.5, 20mM Tris-HCl, 20 mM EDTAでは約80%程度
が溶出した。
に対して二本鎖DNAが連続的に結合、および溶出するこ
とを示す。pH 4.0, 1.9 M MgCl2では90%のDNAが結合し
た。pH 8.5, 20mM Tris-HCl, 20 mM EDTAでは約80%程度
が溶出した。
【００４８】3.3 μgのφX174 DNAを、実施例１に述べ
られているカートリッジに添加し、実施例１に述べられ
ている様に処理を行った。0.02 M 酢酸ナトリウム pH
4.8と1.9 M MgCl2を含むバッファーを使用した。溶出液
のDNA量は10%であった。100μlのH2Oをカートリッジに
加え、リッドを閉めた後にカートリッジを短時間遠心し
洗浄水を回収した。次に0.02 M Tris-HCl, 0.02 M EDTA
pH 8.5を含む溶液を加え、DNAを溶出した。リッドを指
で閉じた後に２回目の軽い５秒間の遠心を行い、溶出液
を集めた。溶出液のDNAの回収量は、添加量に対して79%
であった。
られているカートリッジに添加し、実施例１に述べられ
ている様に処理を行った。0.02 M 酢酸ナトリウム pH
4.8と1.9 M MgCl2を含むバッファーを使用した。溶出液
のDNA量は10%であった。100μlのH2Oをカートリッジに
加え、リッドを閉めた後にカートリッジを短時間遠心し
洗浄水を回収した。次に0.02 M Tris-HCl, 0.02 M EDTA
pH 8.5を含む溶液を加え、DNAを溶出した。リッドを指
で閉じた後に２回目の軽い５秒間の遠心を行い、溶出液
を集めた。溶出液のDNAの回収量は、添加量に対して79%
であった。
【００４９】
【実施例８】この実施例では、実質的に全タンパク質が
結合したままほとんど全てのDNAを溶出させる、本発明
の被覆された基材を使用した条件（pH 8.5, 20 mM Tris
-HCl, 20 mM EDTA）を示す。
結合したままほとんど全てのDNAを溶出させる、本発明
の被覆された基材を使用した条件（pH 8.5, 20 mM Tris
-HCl, 20 mM EDTA）を示す。
【００５０】実施例７に述べられている様に、20 μgの
BSAをカートリッジに通過させ処理を行った。サンプル
溶出液や洗浄水、pH 8.5の溶出液には、タンパク質は全
く検出されなかった。
BSAをカートリッジに通過させ処理を行った。サンプル
溶出液や洗浄水、pH 8.5の溶出液には、タンパク質は全
く検出されなかった。
【００５１】
【実施例９】この実施例では、ヒトリンパ球の粗溶解物
からタンパク質を含まない高品質なRNAが回収できるこ
とを示す。
からタンパク質を含まない高品質なRNAが回収できるこ
とを示す。
【００５２】健康な男性の提供者から５×106個のヒト
リンパ球を単離し、100 μg/mlのプロティナーゼKと10
mMのバナジウムリボヌクレオシド複合体を含む0.01 M T
ris-HCl, pH 8.5で平衡化された0.5% SDS溶液を300 μl
用いて溶解した。等量の2 MKClを直後に加え、激しく攪
拌した。実施例１で述べられた方法に以下の変更点を加
え、得られた溶解液をカートリッジに添加した。PHS被
覆された多孔性ポリエチレンフリット及びニトロセルロ
ース膜を、３ccの注射器の胴体部先端に設置した。１）
ポリプロピレングリッド（膜と接触する）の底板と、
２）1.5 cmまで圧縮された３cmの円筒状の軸方向に揃え
られたPHS被覆された（実施例１に従って被覆された）
ポリエステルファイバーを使って、フリットと膜をカー
トリッジの外側の縁に固定した。Sorvall GLC遠心機を
使って、注射器の胴体部を使ったカートリッジを２分間
3,000 rpmで遠心を行った。エタノールで溶出物を沈殿
させ、沈殿物の電気泳動をアガロースゲルで行った。ゲ
ル上のリボソームRNAのバンドと、標品にはタンパク質
が検出されなかったことから、得られたRNA標品は高品
質であることが証明された。
リンパ球を単離し、100 μg/mlのプロティナーゼKと10
mMのバナジウムリボヌクレオシド複合体を含む0.01 M T
ris-HCl, pH 8.5で平衡化された0.5% SDS溶液を300 μl
用いて溶解した。等量の2 MKClを直後に加え、激しく攪
拌した。実施例１で述べられた方法に以下の変更点を加
え、得られた溶解液をカートリッジに添加した。PHS被
覆された多孔性ポリエチレンフリット及びニトロセルロ
ース膜を、３ccの注射器の胴体部先端に設置した。１）
ポリプロピレングリッド（膜と接触する）の底板と、
２）1.5 cmまで圧縮された３cmの円筒状の軸方向に揃え
られたPHS被覆された（実施例１に従って被覆された）
ポリエステルファイバーを使って、フリットと膜をカー
トリッジの外側の縁に固定した。Sorvall GLC遠心機を
使って、注射器の胴体部を使ったカートリッジを２分間
3,000 rpmで遠心を行った。エタノールで溶出物を沈殿
させ、沈殿物の電気泳動をアガロースゲルで行った。ゲ
ル上のリボソームRNAのバンドと、標品にはタンパク質
が検出されなかったことから、得られたRNA標品は高品
質であることが証明された。
【００５３】
【実施例１０】この実施例では、本発明の被覆された基
材の使用し、プラスミドDNAを急速溶解液から精製する
方法を示す。
材の使用し、プラスミドDNAを急速溶解液から精製する
方法を示す。
【００５４】アンピシリン耐性のプラスミドpUC19を感
染させたE. coliの培養を、Luria培地を使って37℃で激
しく攪拌しながら一晩飽和するまで行った。マイクロ遠
心機を使って13,000 x gで20秒間遠心し、1.5 mlのバク
テリア懸濁液を沈殿させた。透明な上清を吸引し、60
μlの1 μg RNase Aを含む10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA,
pH 8.0を沈殿物に加えて激しく攪拌し懸濁した。1%ド
デシル硫酸ナトリウムを含む60 μlの0.3 N NaOH溶液を
加え、細胞懸濁物を溶解した。1.9 M KCl, 0.1 MTris,
0.36 M HClを含む60 μlの溶液を細胞溶解液に加え、激
しく攪拌した。実施例１で述べられた物と同等のカート
リッジに得られた懸濁液を移した。異なった点は、1.3
cmに切り取られたPHS被覆され軸方向に揃えられたポリ
エステルファイバーの円筒状の束を加えたことである。
ファイバー束にサンプルを染み込ませた後に、DNA沈殿
のためのキャリアーを含んだ100 μlの1 M KCl溶液でチ
ェイスを行った（chased)。0.5 mlのエタノールを入れ
た2 mlのマイクロ遠心チューブにカートリッジを置き、
最高速度（13,000 x g）で２分間遠心を行った。2mlの
受容用マイクロ遠心チューブに回収された沈殿物を70%
エタノールで洗浄し、TEバッファーに溶解し、1%アガロ
ースゲルで電気泳動を行った。標準のアルカリ溶解ミニ
プレップ法（Birnboim and Doly, Nucl. Acids Res.,
1, 1513-23, 1979）と比較した場合、検出されるような
タンパク質を含まず、より良いプラスミドDNAの回収を
この結果は示した。
染させたE. coliの培養を、Luria培地を使って37℃で激
しく攪拌しながら一晩飽和するまで行った。マイクロ遠
心機を使って13,000 x gで20秒間遠心し、1.5 mlのバク
テリア懸濁液を沈殿させた。透明な上清を吸引し、60
μlの1 μg RNase Aを含む10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA,
pH 8.0を沈殿物に加えて激しく攪拌し懸濁した。1%ド
デシル硫酸ナトリウムを含む60 μlの0.3 N NaOH溶液を
加え、細胞懸濁物を溶解した。1.9 M KCl, 0.1 MTris,
0.36 M HClを含む60 μlの溶液を細胞溶解液に加え、激
しく攪拌した。実施例１で述べられた物と同等のカート
リッジに得られた懸濁液を移した。異なった点は、1.3
cmに切り取られたPHS被覆され軸方向に揃えられたポリ
エステルファイバーの円筒状の束を加えたことである。
ファイバー束にサンプルを染み込ませた後に、DNA沈殿
のためのキャリアーを含んだ100 μlの1 M KCl溶液でチ
ェイスを行った（chased)。0.5 mlのエタノールを入れ
た2 mlのマイクロ遠心チューブにカートリッジを置き、
最高速度（13,000 x g）で２分間遠心を行った。2mlの
受容用マイクロ遠心チューブに回収された沈殿物を70%
エタノールで洗浄し、TEバッファーに溶解し、1%アガロ
ースゲルで電気泳動を行った。標準のアルカリ溶解ミニ
プレップ法（Birnboim and Doly, Nucl. Acids Res.,
1, 1513-23, 1979）と比較した場合、検出されるような
タンパク質を含まず、より良いプラスミドDNAの回収を
この結果は示した。
【００５５】
【実施例１１】この実施例では、プラスミドDNAを精製
するための別の方法を示す。
するための別の方法を示す。
【００５６】アンピシリン耐性のプラスミドpUC19を感
染させたE. coliのカルチャーを、Luria培地を使って37
℃で激しく攪拌しながら一晩飽和するまで行った。マイ
クロ遠心機を使って13,000 x gで20秒間遠心し、1.5 ml
のバクテリア懸濁液を沈殿させた。透明な上清を吸引
し、60 μlのH2Oを沈殿物に加えて激しく攪拌し懸濁し
た。1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む60 μlの0.3 N Na
OH溶液を加え、細胞懸濁物を溶解した。1.5 M KCl, 0.1
M MOPS, 0.05 M MgCl2, 0.28 M HClを含む60 μlの溶
液を細胞溶解液に加え、激しく攪拌した。実施例１で述
べられた物と同等のカートリッジに得られた懸濁液を移
した。相違点は、1.3 cmに切り取られたPHS被覆され軸
方向に揃えられたポリエステルファイバーの円筒状の束
を加えたことである。ファイバー束にサンプルを染み込
ませた後、120 μlの1 M KCl溶液でチェイスを行った。
0.5 mlのエタノールを入れた2 mlの受容用マイクロ遠心
チューブにカートリッジを置き、最高速度（13,000 x
g）で２分間遠心を行った。2mlのマイクロ遠心チューブ
に回収された沈殿物を70%エタノールで洗浄し、TEバッ
ファーに溶解した。
染させたE. coliのカルチャーを、Luria培地を使って37
℃で激しく攪拌しながら一晩飽和するまで行った。マイ
クロ遠心機を使って13,000 x gで20秒間遠心し、1.5 ml
のバクテリア懸濁液を沈殿させた。透明な上清を吸引
し、60 μlのH2Oを沈殿物に加えて激しく攪拌し懸濁し
た。1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む60 μlの0.3 N Na
OH溶液を加え、細胞懸濁物を溶解した。1.5 M KCl, 0.1
M MOPS, 0.05 M MgCl2, 0.28 M HClを含む60 μlの溶
液を細胞溶解液に加え、激しく攪拌した。実施例１で述
べられた物と同等のカートリッジに得られた懸濁液を移
した。相違点は、1.3 cmに切り取られたPHS被覆され軸
方向に揃えられたポリエステルファイバーの円筒状の束
を加えたことである。ファイバー束にサンプルを染み込
ませた後、120 μlの1 M KCl溶液でチェイスを行った。
0.5 mlのエタノールを入れた2 mlの受容用マイクロ遠心
チューブにカートリッジを置き、最高速度（13,000 x
g）で２分間遠心を行った。2mlのマイクロ遠心チューブ
に回収された沈殿物を70%エタノールで洗浄し、TEバッ
ファーに溶解した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン・シード アメリカ合衆国メリーランド州21043，エ リコット・シティー，ハーストン・ロード 3222 (72)発明者 ブライアン・シード アメリカ合衆国マサチューセッツ州02114, ボストン，ジョイ・ストリート 47エイ
Claims (23)
- 【請求項１】 少なくともひとつのpKが9未満の水酸基
で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の非−タン
パク質様ポリマーを含む接着性配合物を、基材に適用す
ること、 から成る工程により形成された基材と、タンパク質と核
酸とを含む液相組成物を接触させ、タンパク質が該基材
に結合するが核酸は該基材には 結合しないように該
接触はpH 2から11、かつ0.1mMより大きい陽イオン
濃度で起こり、 液相を基材から分離する、工程から成るタンパク質から
核酸を精製する方法。 - 【請求項２】 少なくともひとつのpKが9未満の水酸基
で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の非−タン
パク質様ポリマーを含む接着性配合物を、基材に適用す
ること、 から成る工程により形成された基材と、タンパク質と核
酸を含む液相組成物を接触させ、タンパク質が該基材に
結合するが核酸は該基材には結 合しないように該接
触はpH2から11、かつ0.1mMより大きい陽イオン濃度
で起こり、 核酸を基材からpHが4から11の緩衝液で選択的に分離す
る、工程から成るタンパク質から核酸を精製する方法。 - 【請求項３】 少なくともひとつのpKが9未満の水酸基
で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の非−タン
パク質様ポリマーを含む接着性配合物を、基材に適用す
ること、 から成る工程により形成された基材と、タンパク質と二
本鎖および一本鎖核酸を含む液相組成物を接触させ、タ
ンパク質と一本鎖核酸が該基材 に結合するが二本鎖
核酸は該基材には結合しないように該接触はpH 7
から10、かつ1mMより多い一価の陽イオンおよび0.1mMよ
り多い多価の陽 イオンの一方または両方が存在で
起こり、 液相を基材から分離する、工程から成るタンパク質と一
本鎖核酸の両方から二本鎖核酸を精製する方法。 - 【請求項４】 少なくともひとつのpKが9未満の水酸基
で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の非−タン
パク質様ポリマーを含む接着性配合物を、基材に適用す
ること、 から成る工程により形成された基材と、二本鎖および一
本鎖核酸を含む液相組成物を接触させ、一本鎖核酸が該
基材に結合するが二本鎖核酸は 該基材には結合しな
いように該接触はpH7から10、かつ1mMより多い一価
の陽イオンおよび0.1mMより多い多価の陽イオンの一方
または両方の存在で起こり、 液相を基材から分離する、工程から成る二本鎖核酸の両
方から一本鎖核酸を精製する方法。 - 【請求項５】 上記液相が4から10のpHを有する請求項
１に記載の方法。 - 【請求項６】 上記接触が7.5から11のpH、かつ0.01か
ら1Mの陽イオン濃度で起こる請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 上記液相が6から10のpHを有する請求項
１に記載の方法。 - 【請求項８】 上記液相が多価陽イオンを含み、上記溶
出液用緩衝液が、すべての該多価陽イオンに結合するに
十分な錯化剤を含有する請求項２に記載の方法。 - 【請求項９】 上記接触工程が2から7のpH、かつ10mMか
ら1Mの陽イオン濃度で起こる請求項２に記載の方法。 - 【請求項１０】 溶出した核酸が二本鎖、ならびに該選
択的溶出が６から10のpHで、ならびに0.1Mより少ない一
価陽イオン、かつ0.01Mより少ない多価イオンである、
請求項２に記載の方法。 - 【請求項１１】 溶出した核酸が一本鎖、ならびに該選
択的溶出が8から10のpHで、ならびに0.5Mより少ない陽
イオンである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１２】 上記液相が10mM MgCl2, pH 7.5；およ
び15mM MgCl2, pH8.3 から成る群から選択される請求項
２に記載の方法。 - 【請求項１３】 上記接触が8.5未満のpH、かつ0.5Mよ
り大きい陽イオンでおこる、請求項３に記載の方法。 - 【請求項１４】 上記接触工程が8から10のpH、ならび
に0.1M未満の一価イオンかつ0.01M未満の多価イオンで
起こる、請求項４に記載の方法。 - 【請求項１５】 少なくともひとつのpKが9未満の水酸
基で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の非−タ
ンパク質様ポリマーを含む接着性配合物を、固体基材に
適用すること、 から成る工程により形成された固体基材と、核酸を修飾
する酵素を該酵素が該固体基材に結合するように接触さ
せ；該固体基材−結合酵素と核酸とを該酵素が触媒的に
活性となる適当な条件下で接触させて、該条件はpHが4
から11の範囲内にあり、0.1mM 陽イオンより多く;核酸
を固体基材から分離して酵素的に修飾された核酸を産す
る、工程から成る核酸を修飾するための酵素的反応を行
う方法。 - 【請求項１６】 上記接触の第一工程が4から10の間のp
Hで起こる請求項15に記載の方法。 - 【請求項１７】 少なくともひとつのpKが9未満の水酸
基で置換された芳香族部分を含むモノマー単位の非−タ
ンパク質様ポリマーを含む接着性配合物で被覆した基
材；を含む核酸を精製するためのデバイス。 - 【請求項１８】 芳香族部分がフェニル基である請求項
１７に記載のデバイス。 - 【請求項１９】 上記水酸基はポリマー骨格に対する該
芳香族部分の結合部位についてパラ水酸基である請求項
１７に記載のデバイス。 - 【請求項２０】 基材が膜である、請求項１７に記載の
デバイス。 - 【請求項２１】 基材がプラスチックを含む、請求項１
７に記載のデバイス。 - 【請求項２２】 プラスチックが置換ポリアルケン、ポ
リアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリスルフォ
ネート、フェノール性樹脂、エポキシ樹脂、および置換
セルロースから成る群から選択される請求項２１に記載
のデバイス。 - 【請求項２３】 プラスチックがビーズの形態である請
求項２１に記載のデバイス。
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|---|---|---|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005176716A (ja) * | 2003-12-19 | 2005-07-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 核酸の分離精製方法 |
| WO2006019127A1 (ja) * | 2004-08-20 | 2006-02-23 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | ２価金属イオンを用いた核酸捕捉方法 |
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