WO2006019127A1 - ２価金属イオンを用いた核酸捕捉方法 - Google Patents

Abstract

　核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、核酸を含有するｐＨ１２以上の試料を２価金属イオンを固定化した固相基材表面に対して接触させる工程を含む方法、及び核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、核酸及びマグネシウム化合物を含みｐＨが１２以上に調節された試料を固相基材表面に対して接触させる工程を含む方法。                                                                                 

Description

明 細 書

2価金属イオンを用レ、た核酸捕捉方法

技術分野

[0001] 本発明は、 2価金属イオンを介した核酸会合体や 2価金属イオン固定ィ匕基材などを 用いた核酸捕捉方法に関する。

背景技術

[0002] 核酸を含有する試料力 の核酸の調製は、バイオテクノロジーや臨床診断等の分 野にお 、て重要な技術である。例えば遺伝子組み替え技術ではベクター DNAゃク ローンィ匕しょうとする DNAの両方を単離することが必要であり、遺伝病や癌遺伝子に ついて遺伝子検査を行うには、血液中の白血球細胞等から核酸を抽出することが必 要である。

[0003] 一般的に、核酸は遊離の分子としては存在せず、例えば細菌、細胞、ウィルス粒子 中などに存在し、たんぱく質、脂質、及び糖からなる細胞膜や細胞壁で覆われている 。また、核酸自身はヒストンタンパク質等と複合体を形成している。このような状態で存 在する核酸を抽出するには、核酸を覆う細胞膜や細胞壁を破壊し、前記複合体のた んぱく質を変性又は分解して可溶化し、核酸を遊離させ、遊離した核酸を抽出する 操作が必要である。

[0004] 核酸を細胞から調製する方法としては、細胞を含む試料を SDSや ProteinaseKで 処理して可溶化した後、フエノールで蛋白質を変性除去して核酸を精製する方法が 一般的である（Molecular Cloning 2nd Edition, 9. 16— 9. 23、 Cold Sprin g Harbor Laboratory Press、 1989)。しかし、この方法は手間と時間が力かる ことから、より簡便な方法が求められている。

[0005] 核酸を単離するためのより簡便な方法としては、例えばシリカを用いる方法が W09 9Z22021に開示されている。この方法では、まず細胞をカオトロピック性試薬で処 理して細胞を溶解し、核酸を遊離させる。次に、シリカ又はその誘導体力 なる核酸 結合性坦体に核酸を吸着させて、この坦体をカオトロピック性試薬や有機溶媒で遠 心洗浄する。最後に、低塩のバッファーで核酸を溶出する。この方法はフエノール法 に比較すると簡便であるものの、まだ多くの工程を含み、遠心操作が必要であるとい う欠点を有している。また、 PCRなどの酵素反応を強く阻害するカオトロピック塩ゃェ タノールを使用するので、これらの物質を完全に除く必要がある、そのため操作が煩 雑になり時間が力かるなどの欠点がある。

[0006] 白血球分離フィルターのような細胞吸着性繊維集合体を用いて末梢血白血球から 核酸を調製する方法が特公平 8— 24583号公報ゃ特開平 8— 280384号公報に開 示されている。特公平 8— 24583号公報に記載された方法では、まず白血球分離フ ィルターに血液を通して、血液中の白血球をフィルターに吸着させ、血液の他の成分 と分離する。このフィルターに TE (10mM Tris ; ImM EDTA; pH7. 6)を通し て洗浄し、ヘモグロビン等の蛋白質を除去する。こうして分離洗浄された白血球をフ ィルターごと例えば 80°Cで凍結した後、室温で放置して白血球を解凍する。それ から繊維状物質に TE—mix(TE、 10mM NaCl、 1. 5mM MgCl、 pH7. 5)を

2

カロえて、フィルターの繊維状物質に吸着されていた白血球を繊維状物質から回収す る。し力しながら、特公平 8— 24583号公報には、回収された白血球力もゲノム DNA を抽出する操作を従来の技術 (フエノール処理）に従って行って 、ることが示されて いる。すなわち、白血球に 10% 硫酸ドデシルナトリウム（SDS)などの界面活性剤と 蛋白分解酵素（ProteinaseK)を加えて、 65°Cで 15時間インキュベートし、これに R NA分解酵素（RNaseA)をカ卩えて 37°Cで 1時間インキュベートした後、これをフエノ ール試薬で処理し、 DNAをエタノールで沈澱させて精製する方法が示されて ヽる。

[0007] 特開平 8— 280384号公報には、有核細胞を吸着した後、有核細胞中の核酸又は 蛋白質を取り出す方法が開示されて 、る。核酸又は蛋白質を取り出す方法としては 、極細繊維集合体に細胞を結合したまま細胞溶解液を通液して溶解する力、あるい は破砕などを行う方法が示されている。この方法の利点は、吸着した細胞をそのまま 破砕、溶解処理することが可能なことである。吸着した細胞を脱着することなぐ吸着 した細胞を破砕し、又は溶解することから、吸着した細胞を脱着する方法よりも容易 に実施が可能である。しかしながら、この公報においても、細胞溶解後の核酸精製に ついては従来の技術をそのまま用いており、新しい方法は開示されていない。すな わち、まず細胞を吸着した極細繊維集合体を精製水や界面活性剤で処理し、極細 繊維集合体を通過した細胞溶解液力 通常のフエノール'クロ口ホルム法で核酸を精 製している。

[0008] 以上のように、末梢血白血球から核酸を調製する方法において白血球分離フィル ターのような細胞吸着性繊維集合体を用いることは従来知られていた力 上記の方 法は白血球の分離や核酸抽出のステップまでをフィルターを用いて行う方法にすぎ ず、その後の核酸精製工程は既存の核酸精製法を用いるものである。従って、核酸 の精製工程が複雑になり時間と手間が力かるという欠点があった。

[0009] さらに簡便な方法として、フィルターを用いて細胞力 核酸を直接精製する方法が WOOOZ21973に開示されている。この方法は以下の工程を含んでいる。（1)まず 、細胞を含む試料をフィルターにかけて細胞をフィルターに吸着させる。（2)次にフィ ルターに吸着された細胞を溶解し、（3)フィルターで濾過する。（4)フィルターに吸着 された核酸を洗浄する。（5)最後に、核酸をフィルタ一力ゝら溶出する。吸着した核酸 は 40°Cから 125°Cに加温すると溶出され、溶出バッファーの pHは 5から 11の範囲で 、塩濃度は高くても低くてもよい。精製された核酸の A /A は 1. 8であり、 PCRの

260 280

铸型として使用可能である。 WOOOZ21973には、核酸を精製する目的に使用可 能なフィルターの例として Whatman GF/D variant filtersが挙げられており、 一方、使用不可能な例として Whatman GF/C filtersが挙げられている力 該方 法に適したフィルタ一は、精製 DNAをフィルターに通しても精製 DNAを捕捉しな ヽ ことが必須である。また、この方法において、細胞を溶解して力もフィルターにかける と DNAの収率が 80%低下してしまうので実用的ではない。さらに、この方法を用い て血液から核酸を調製する場合、実験者は白血球を溶解する前に赤血球を溶血さ せる必要がある。加えて、上記のように細胞をフィルターに吸着させて力も精製する 方法では、細胞の種類に応じてフィルターを選択しなければならな ヽと 、う欠点があ る。

[0010] これらの欠点を克服したさらに簡便な方法として、不織布を用いて核酸を分離、増 幅、及び検出する方法が WO03Z006650に開示されている。この方法は、まず細 胞抽出液を不織布に接触させて、細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させ、次に 該不織布に核酸を増幅するための溶液を加えて、該不織布に吸着された核酸を铸 型として核酸を増幅する工程を含んで ヽる。この方法では特別な試薬を一切用いる ことなく不織布に試料中の核酸を接触させるという非常に簡便な方法により、核酸を 不織布上に精製することが可能である。また不織布上に精製した核酸は核酸合成反 応液に接触させることにより、そのまま増幅反応が可能であり、核酸の検出が簡便で ある。しかしながら、この方法では比較的低濃度（lpgZmL〜： LOOpgZmL)の核酸 を捕捉する場合に試料中に共存するタンパク質、例えばアルブミンやグロブリンなど の影響で捕捉率が大幅に低下する欠点がある。

[0011] 一方、核酸を単離するための方法として 2価金属イオンを使用している例としては、 例えばシリカを用いる方法 (WO99Z22021)が知られている。この方法では、まず 細胞をカオトロピック性試薬で処理して細胞を溶解し、核酸を遊離させる。次に、シリ 力又はその誘導体力 なる核酸結合性坦体に核酸を吸着させて、この坦体を力オト 口ピック性試薬や有機溶媒で遠心洗浄する。最後に、低塩のバッファーで核酸を溶 出する。この方法において、核酸の担体への吸着時に核酸の固定ィ匕を維持するため に溶液への添加物としてマグネシウムを含む各種の塩類を用いて 、る。

[0012] この方法では、マグネシウムイオンを基材側に固定ィ匕して液相側の核酸を捕捉する ための手段として用いているのではなぐまた、マグネシウムイオンを核酸単離のため の手段として主体的に用いて 、るのではな!/、。マグネシウム塩を用いて 2本鎖核酸を タンパク質力も分離する方法が特願平 5— 164841号公報に開示されている。この方 法では pK9未満の水酸基で置換された芳香族部分を含むポリマーを基材として用い 、該基材に ΡΗ7〜： LOで一価又は多価の陽イオンを共存させて核酸及びタンパク質 を含む液相を接触させることによりタンパク質及び 1本鎖核酸を基材に結合させ、液 相から基材に結合しなかった 2本鎖核酸を分離する。この方法は試料を ρΗ12以上 の高アルカリ条件下で変性させる工程を含んでおらず、またマグネシウムを核酸捕捉 剤として積極的に基材に固定ィ匕しているわけではない。さらに、この方法はマグネシ ゥムイオンを ρΗ12以上の高アルカリ条件下で核酸と共存させて基材に結合させてい るわけではない。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0013] 本発明の課題は、核酸を含む試料から従来の方法よりも簡便かつ高収率に核酸を 捕捉して回収する方法を提供することにある。さらに本発明の課題は、従来の核酸増 幅技術に使用可能な迅速かつ簡便な核酸調製法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0014] 本発明者らは鋭意検討の結果、試料に塩ィ匕マグネシウムなどのマグネシウム化合 物を添加した後、水酸ィ匕ナトリウムなどの塩基をカ卩えることにより pHを 14付近にまで 高めると、タンパク質が共存する試料においても核酸の不織布に対する捕捉効率が 劇的に回復することを見出した。さらに検討を進めた結果、驚くべきことに高アルカリ 条件下において核酸は 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンの特異的作用 により会合体を形成すること、及びこの会合体の形成により核酸の見かけのサイズが 大きくなつてフィルターへの捕捉効率が高まり、タンパク質を含む試料力 高収率で 核酸を捕捉することができることを見出した。

また本発明者らは核酸を含む試料に水酸ィ匕ナトリウムを加えて pHを 14付近にまで 高めた試料を調製し、この試料をマグネシウムを固定ィ匕した不織布に対して通水させ ると、驚くべきことに、タンパク質が共存する試料において核酸の不織布に対する捕 捉効率が劇的に高まることを見出した。本発明者らはさらに検討を続けた結果、高ァ ルカリ条件下において 1本鎖に変性させた核酸ではマグネシウムとの結合力が非常 に高まっており、液相の核酸が容易に固相のマグネシウムに捕捉されることを見出し た。本発明はこれらの知見を基にして完成された。

すなわち、本発明により、

試料中の核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、

該試料を pH 12以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：

固相基材表面に固定ィ匕した少なくとも 1種の 2価金属イオンと該試料中の核酸とを結 合させて核酸を捕捉する工程、又は

少なくとも 1種の 2価金属イオンと該試料中の核酸とを結合させた後に該核酸を固相 基材表面に接触させて捕捉する工程

とを含む方法、及び

試料中の核酸を検出する方法であって、 試料を pH 12以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：

該試料を pH 12以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：

固相基材表面に固定ィ匕した少なくとも 1種の 2価金属イオンと該試料中の核酸とを結 合させて核酸を捕捉する工程、又は

少なくとも 1種の 2価金属イオンと該試料中の核酸とを結合させた後に該核酸を固相 基材表面に接触させて捕捉する工程

とを含み、さらに該捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列の核酸を増幅させて 検出する工程

を含む方法が提供される。これらの方法において、少なくとも 1種の 2価金属イオンが マグネシウムイオンであることが好まし 、。

[0015] 以下、上記の本発明を 3つの形態に大別して説明する。

[0016] 第 1の形態により、核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、核酸及び 2価金 属化合物好ましくはマグネシウム化合物を含み pHが 12以上に調節された試料を固 相基材表面に対して接触させる工程を含む方法が提供される。

この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：

(a)核酸を含有する試料に 2価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を添加する 工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に塩基を添カ卩して試料の pHを 12以上に調整し、試料中 の核酸の会合体を形成する工程;及び

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸を捕 捉する工程

を含む方法が提供される。

また、別の典型的な方法では、少なくとも下記の工程：

(a)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に 2価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を添加し て、試料中の核酸の会合体を形成する工程;及び

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸を捕 捉する工程 を含む。

別の観点からは、核酸を検出する方法であって、核酸及び 2価金属化合物好ましく はマグネシウム化合物を含み pHが 12以上に調節された試料を固相基材表面に対し て接触させ、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列の核酸を 増幅させて検出する工程を含む方法が提供される。

この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：

(a)核酸を含有する試料に 2価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を添加する 工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に塩基を添カ卩して試料の pHを 12以上に調整し、試料中 の核酸の会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸を捕 捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して特定塩基配列を増幅することができるォ リゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を 接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有する 核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程

を含む。

また、別の典型的な態様では、少なくとも

(a)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に 2価金属化合物好ましくはマグネシウム化合物を添加し て、試料中の核酸の会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸を捕 捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して特定塩基配列を増幅することができるォ リゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を 接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有する 核酸を増幅する工程;及び (e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程

を含む。

[0018] さらに別の態様では、上記工程 (d)及び (e)は、以下の工程で置き換えることができる

(d')工程 (c)で得られた固相基材表面カゝら核酸を溶出させ、得られた溶出液に特定塩 基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、 及び核酸合成酵素を含む溶液を加えて、該溶出液中の核酸を铸型として特定塩基 配列を有する核酸を増幅する工程;及び

(e')工程 ( で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程

を含む。上記の溶出工程において、好ましくは、熱溶出、界面活性剤溶出、又は ED

TA溶出を行うことができる。

上記の各発明の好ましい態様によれば、濾過により固相基材表面に核酸の会合体 を捕捉する上記の方法;及び固相基材がフィルターである上記の方法が提供される

[0019] 第 2の形態により、核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、核酸と 2価金属 化合物及び 2価金属イオンに親和性を有する高分子化合物とを含み pHが 12以上に 調整された試料を固相基材表面に対して接触させる工程を含む方法が提供される。 この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：

(a)核酸を含有する試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物及び該少なくとも 1種の 2 価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料の pHを 12以上に調整し、試料中の核酸と少なくとも 1種の 2価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程;及び

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸の会 合体を捕捉する工程

を含む。

また、別の典型的な態様では、少なくとも

(a)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物及び該少なくとも 1種の 2価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加し、試料中の核酸と少なくとも

1種の 2価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程;及び

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸の会 合体を捕捉する工程

を含む。

さらに別の態様によれば、核酸を検出する方法であって、核酸と 2価金属化合物及 び 2価金属イオンに親和性を有する高分子化合物とを含み pHが 12以上に調整され た試料を固相基材表面に対して接触させ、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸 型として特定塩基配列の核酸を増幅させて検出する工程を含む方法が提供される。 この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：

(a)核酸を含有する試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物及び該少なくとも 1種の 2 価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料の pHを 12以上に調整し、試料中の核酸と少なくとも 1種の 2価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸の会 合体を捕捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適した オリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液 を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有す る核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程

を含む。

また、別の典型的な態様では、少なくとも

(a)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物及び該少なくとも 1種の 2価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加し、試料中の核酸と少なくとも 1種の 2価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に核酸の会 合体を捕捉する工程；

(d)工程 (C)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適した オリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液 を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有す る核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程

を含む。

[0020] 第 3の形態では、核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、核酸を含有する p H12以上の試料を 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定ィ匕した固相 基材表面に対して接触させる工程を含む方法が提供される。

この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：

(a)固相基材表面に 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定ィ匕する工程

(b)核酸を含有する試料を pH 12以上に調整する工程;及び

(c)工程 (a)で得られた固相基材表面に工程 (b)で得られた試料を接触させて、固相基 材表面に核酸を捕捉する工程

を含む。

[0021] 別の観点からは、核酸を検出する方法であって、核酸を含有する pH 12以上の試 料を 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定ィ匕した固相基材表面に対 して接触させた後、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列の 核酸を増幅させて検出する工程を含む方法が提供される。

この方法は、典型的には、少なくとも下記の工程：

(a)固相基材表面に 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定ィ匕する工程

(b)核酸を含有する試料を pH 12以上に調整する工程；

(c)工程 (a)で得られた固相基材表面に工程 (b)で得られた試料を接触させて、固相基 材表面に核酸を捕捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して特定塩基配列を増幅することができるォ リゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液を 接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有する 核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程

を含む。また、別の典型的な態様では、少なくとも下記の工程：

(a)固相基材表面に 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定ィ匕する工程

(b)核酸を含有する試料を pH 12以上に調整する工程；

(c)工程 (a)で得られた固相基材表面に工程 (b)で得られた試料を接触させて、固相基 材表面に核酸を捕捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面カゝら核酸を溶出させ、得られた溶出液に特定塩 基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、 及び核酸合成酵素を含む溶液を加えて、該溶出液中の核酸を铸型として特定塩基 配列を有する核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程

を含む。上記の溶出工程において、好ましくは、熱溶出、界面活性剤溶出、又は ED TA溶出を行うことができる。

[0022] 上記の各発明の好ましい態様によれば、濾過により固相基材表面に核酸を捕捉す る上記の方法；固相基材がフィルターである上記の方法；固相基材が 2価金属イオン 、好ましくはマグネシウムイオンを固定ィ匕可能な残基を有する高分子を含む上記の 方法； 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを固定ィ匕可能な残基がカルボン 酸基である上記の方法;及び固相基材が 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムィ オンを固定ィ匕した固相基材層を多層化した固相基材である上記の方法が提供される

[0023] さらに別の観点からは、本発明により、核酸の捕捉用具であって、その表面に 2価 金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンが固定化された固相基材カもなる用具;及 び核酸の捕捉用具であって、その表面に 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムィ オンを固定化可能な残基を有する固相基材からなる用具が提供される。 また、核酸の検出キットであって、（a)その表面に 2価金属イオン、好ましくはマグネ シゥムイオンが固定化された固相基材;及び (b)特定塩基配列を増幅することができる オリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素のうち少なく とも 1つを含むキットが本発明により提供される。

発明の効果

[0024] 本発明の方法では、核酸の捕捉、濃縮、及び分離精製に特別な装置は不要であり 、簡便に核酸を捕捉し、捕捉した核酸を増幅して検出することができる。 2価金属ィォ ン、好ましくはマグネシウムイオンにより固相基材表面に捕捉された核酸は、そのまま 核酸合成反応の铸型として用いることができ、さらに界面活性剤、熱、又はキレート剤 などの作用により容易に固相基材表面力 溶出させることが可能であることから、核 酸を含む溶出液を得て核酸合成及び検出反応を簡便に行なうことも可能である。ま た、 2価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオンを介して会合体を形成することによ り固相基材表面に捕捉された核酸は、そのまま核酸合成反応の铸型として用いること ができ、さらに界面活性剤、熱、又はキレート剤などの作用により容易に固相基材表 面力 溶出させることが可能であることから、核酸を含む溶出液を得て核酸合成及び 検出反応を簡便に行なうことも可能である。

図面の簡単な説明

[0025] [図 1]図 1は実施例で用いた不織布を固定ィ匕したカラムの構造を示した図である。

[図 2]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較結果を示した図である。縦軸は 濁度 0. 1となるまでの経過時間を示す。

[図 3]マグネシウムイオン固定ィ匕不織布での核酸捕捉効果 (不織布表面の蛍光強度） を示した図である。

[図 4]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較（ポリマーコート不織布へのマグ ネシゥム吸着と多層化フィルターの効果)を示した図である。縦軸は濁度 0. 1となるま での経過時間を示し、（1)な 、し (5)は不織布の状態を表す。

[図 5]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較 (試料のアルカリ処理有無の比 較)を示した図である。縦軸は濁度 0. 1となるまでの経過時間を示し、（1)及び (2)は不 織布の状態を表す。 圆 6]例 5で得た不織布表面の蛍光強度を測定した結果を示した図である (生理食塩 水試料)。図中の数字は蛍光強度を示し、（1)ないし (3)は不織布に吸引した試料番号 を示す。

[図 7]例 6で得た不織布表面の蛍光強度を測定した結果を示した図である (NaOH処 理試料)。図中の数字は蛍光強度を示し、（1)ないし (4)は不織布に吸引した試料番号 を示す。

[図 8]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図であ る（塩ィ匕マグネシウムの添カ卩による効果の確認)。縦軸は LAMP増幅反応においてピ 口リン酸マグネシウム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの 時間を示し、（1)ないし (3)は不織布に吸引した試料番号を示す。

[図 9]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図であ る（塩ィ匕マグネシウムの添加濃度の検討)。縦軸は LAMP増幅反応においてピロリン 酸マグネシウム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時間を 示す。

[図 10]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図で ある (試料 pHの影響の検討)。縦軸は LAMP増幅反応にぉ 、てピロリン酸マグネシ ゥム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時間を示す。

[図 11]例 10におけるアルカリ条件下でのァガロースゲル電気泳動の結果を示した図 である（マグネシウムの添カ卩効果）。レーン 1 DNAレーン 2 1 DNA+0. 3%BS Aレーン 3 I DNA+ lmM MgClレーン 4 λ DNA+0. 3%BSA+ ImM Mg

2

CIレーン 5 1 DNA+0. 3%BSA+ lmM MgCl + ImM EDTA

2 2

[図 12]例 11におけるアルカリ条件下でのァガロースゲル電気泳動の結果を示した図 である（マグネシウムの添加濃度の影響)。 5%ァガロース、 0. 05N NaOHレーン 1 1 DNA+0. ImM MgClレーン 2 1 DNA+0. 2mM MgClレーン 3 λ ΌΝ

2 2

Α+0. 3mM MgClレーン 4 λ ϋΝΑ+0. 4mM MgClレーン 5 λ ϋΝΑ+Ο.

2 2

5mM MgCl

2

[図 13]例 11における pH8条件下でのァガロースゲル電気泳動の結果を示した図で ある（マグネシウムの添カ卩効果）。レーン 1 DNAレーン 2 1 DNA+0. 3%BSA レーン 3 I DNA+ lmM MgClレーン 4 λ DNA+0. 3%BSA+ ImM MgCl

2

レーン 5 I DNA+O. 3%BSA+ lmM MgCl + ImM EDTA

2 2

[図 14]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図で ある（各種二価金属イオンを固定ィ匕した不織布の比較)。縦軸は LAMP増幅反応に おいてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1にな るまでの時間を示す。

[図 15]不織布上に捕捉した DNAの PCR増幅産物のァガロースゲル電気泳動の結 果を示した図である（1%ァガロース)。レーン 1〜4は使用した不織布に対するマグネ シゥムイオン固定ィ匕の有無、及び吸引したサンプルの順に示す。レーン 1 未固定化 、 BCG菌ゲノム 200pgZ生理食塩水 ZO. 2N NaOHレーン 2 未固定化、 BCG菌 ゲノム 200pg + 0. 3%HSAZ生理食塩水 ZO. 2Ν NaOHレーン 3 マグネシウム 固定化、 BCG菌ゲノム 200pgZ生理食塩水 ZO. 2N NaOHレーン 4 マグネシゥ ム固定化、 BCG菌ゲノム 200pg + 0. 3%HSAZ生理食塩水 ZO. 2Ν NaOH [図 16]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図で ある（EDTA及びストロンチウムの添加効果)。縦軸は LAMP増幅反応にぉ 、てピロ リン酸マグネシウム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時 間を示す。（1)ないし (5)は不織布に吸引した各試料を示す。

[図 17]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図で ある (尿試料に対するマグネシウム固定ィ匕不織布の核酸捕捉効果)。縦軸は LAMP 増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（650應における吸光度） が 0. 1になるまでの時間を示す。横軸は不織布に吸引した各試料を示す。図中左の 青斜線のカラムは未処理の不織布、右の赤 、カラムはマグネシウムを固定ィ匕した不 織布を示す。

[図 18]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図で ある (核酸捕捉後の不織布に対する BSA含有洗浄液の効果)。縦軸は LAMP増幅 反応においてピロリン酸マグネシウム生成に伴う濁度（650應における吸光度）が 0. 1になるまでの時間を示す。横軸は洗浄液に含まれる BSAの濃度を示す。

[図 19]不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較を行なった結果を示した図で ある (金属イオン親和性高分子の添加効果)。縦軸は LAMP増幅反応にぉ 、てピロ リン酸マグネシウム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時 間を示す。（1)ないし (4)は不織布に吸引した各試料を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0026] 本発明にお 、て、核酸を含有する試料としては、例えば、細胞を含む試料から細胞 を破壊して調製された細胞抽出液が挙げられる。本明細書において、細胞とは真核 細胞、原核細胞、又はウィルスを意味しており、特にヒト体細胞、ヒト末梢血白血球、 感染症の原因となる真菌、細菌、又はウィルスを含む。試料の種類は特に限定され ず、例えば、血液、尿、髄液、喀痰、体液、細胞浮遊液、又は細胞培養液など細胞を 含むものであればその種類は特に限定されない。また、試料は何らかの処理をほど こした処理液であってもよい。処理の方法としては、例えば、喀痰のような粘性の高い 試料を喀痰処理剤により溶解するなどの方法が挙げられる。

[0027] 細胞抽出液とは、細胞を破壊して得られる細胞の構成成分を含む混合物のことで ある。細胞抽出液は、一般的には、細胞を含む試料に細胞溶解液を作用させて調製 することができる。細胞溶解液とは、細胞を破壊して核酸を抽出するために用いられ る溶液のことであり、必要により界面活性剤や酵素などを含むが、これらをの一部又 は全てを含む必要はない。酵素としては、蛋白質分解酵素、例えば ProteinaseKな どを用いることができる力 細胞種によってはリゾチーム、リゾスタフイン (スタフイロコッ カス属）、 β ΐ , 3—ダルカナーゼ、マンナーゼ、キチナーゼ (真菌類)なども用いられ る。 RNAを除いた方が好ましい場合には、 RNaseAのような RNA分解酵素をカ卩えれ ばよい。また、上記のような酵素を含まなくともよい。動物細胞では低張液に接触させ るだけで細胞を破裂させることも可能である。また細胞抽出液は、細胞を含む試料に 超音波をかけたり、ホモジナイザーで破砕するなど物理的な力を加えて作製すること も可能である。

[0028] 2価金属化合物は溶液中の核酸に 2価金属イオンを供給できる物質であればその 種類は特に限定されるものではな 、。例えば 2価金属塩又は 2価金属高分子錯体な どが適当である。 2価金属塩としては、例えば、塩化物、硫酸化物、又は硝酸化物な どが好ましい。 2価金属としては、例えば、亜鉛、マンガン、マグネシウムなどが好まし いが、最も好ましいのはマグネシウムである。 2価金属化合物は pHを 12以上に調整 する前に細胞溶解液などの試料に加えておいてもよぐあるいは試料を PH12以上 に調整した後、試料をフィルターなどの固相基材表面に接触させる前に加えてもよい 。核酸の会合を促進する 2価金属化合物の濃度範囲は特に限定されないが、例えば O.lmM以上が望ましい。

[0029] 本発明において試料を pH12以上に調整するための試薬は特に限定されないが、 例えば、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウムなどの強塩基が適当である。この強塩基の 水溶液を適宜の量添加することにより、試料の pHを 12以上に調整することができる。

[0030] 核酸を含む試料を固相基材表面に接触させるための手段としては、例えば、試料 溶液を固相基材表面上に流すか、あるいは試料溶液を固相基材表面に吸引もしくは 加圧などにより透過させ、又は試料溶液に固相基材を浸漬するなどの手段を挙げる ことができる。

[0031] 固相基材の材質及び形状は特に限定されないが、例えば、多孔質のシート状基材 を用いることができ、好ましくはフィルターを用いることができる。フィルターの形状及 び素材は限定されないが、例えば不織布、織布、メンブレンフィルター、中空糸フィ ルター、焼結フィルター、ガラス繊維フィルターなどを例示できる。好ましくは不織布 力もなるフィルターを固相基材として用いることができる。不織布とは短繊維又はフィ ラメントを、機械的、熱的、化学的な手段を用いて接着又は交絡させて作るシート状 又はウェブ状の構造体である (第 2版 繊維便覧 繊維学会編 丸善)。不織布はさま ざまな方法で生産することができる力 基本的な工程はウェブ (繊維の方向がある程 度揃った繊維塊のシート状のもの）の形成工程と、ウェブの接着工程、それに仕上げ 工程を含む。不織布としては天然繊維から化学繊維まで種々の繊維が用いられて 、 る力 一般的に用いられているのは綿、レーヨン、ポリエステル、ポリプロピレン、又は ナイロンなどであり、その他の繊維としてアクリル、ビニロン、ガラス繊維、パルプ、又 は炭素繊維なども使用される。好ましくはポリエチレンテレフタレートからなる不織布 を用いることができる。ウェブを形成する方式は、一般的には、湿式、乾式、及び直接 式に大別される。直接式は紡糸直結式ともいわれる方法で、溶融高分子溶液から紡 糸された繊維^^めて直接ウェブとする工程を含む。直接式に含まれる方法としては 、スパンレース法、スパンボンド法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、ステッチボン ド法などを挙げることができる力 本発明にはメルトブロー法でつくられた超極細繊維 不織布が最も適している。

[0032] 2価金属イオンを固相基材表面に固定ィ匕する手段は特に限定されないが、例えば 、 2価金属イオンと錯体を形成する配位基を有する固相基材表面に対して 2価金属ィ オンを固定ィ匕する手段を挙げることができる。一般的に 2価金属と錯体を形成可能な 配位基としてはアルコール、フエノール、ェノール、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、 キノン、エーテル、エステル、アミド、ニトロソ化合物、ニトロ化合物、 N—ォキシド、ス ルホン酸、次亜燐酸、亜燐酸、アルソン酸、第一アミン、第二アミン、第三アミン、ァゾ 化合物、シッフ塩基、ォキシム、ィミン、又はェナミンなどが例示でき、これらの配位基 の 1種又は 2種以上を組み合わせて 2価金属イオンを固定ィ匕することができる。これら の配位基を有する固相基材としては有機若しくは無機合成高分子、天然高分子、又 はこれらをィ匕学修飾した高分子、あるいはこれらの基を有する高分子をコーティング した固相基材などが挙げられる。

[0033] 固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列の核酸を増幅させるこ とにより、その特定塩基配列を有する核酸が試料中に存在しているか否かを判定す ることができ、これにより試料中に含まれる特定塩基配列を有する核酸の検出を行な うことができる。核酸の増幅には、 PCRに代表される特定の標的核酸配列を増幅させ る方法を用いることができ、 PCR以外に Ligase Chain Reaction (LCR)、 Transc ription- Mediated Amplification (TMA)ゝ Branched DNA (bDNA) Assa y、 Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)、 Strand Dis placement Amplification (S DA)、 Cycling Probe Technology (CPT)、 Q — Beta Replicase Amplification Technology^ Rolling ircle Amplificat ion Technology (RC AT)、 Loop— Mediated Isothermal Amplification (L AMP)、 Isothermal and Cnimeric primer― initiated Amplification of Nucleic acids (ICAN)などの方法を用いてもよい。もっとも、核酸の増幅方法はこ れらに限定されるものではない。 Q-Beta Replicase, RCAT、 NASBA, SDA、 TMA、 LAMP, ICANなどは Isothermal (—定温度）で増幅反応を行い、その他の PCR、 LCRなどは Thermal Cycling (温度サイクリング）で増幅反応を行うことがで きる。

[0034] 核酸の増幅に用いる核酸合成反応とは、 DNA依存性 DNAポリメラーゼ、 DNA依 存性 RNAポリメラーゼ、 RNA依存性 RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、鎖置換型 DN Aポリメラーゼなどを用いてプライマー特異的に起こす 5，→3， DNA又は RNA合成 反応のことである。本明細書において、核酸とは DNA及び RNAのほ力、非天然型 の核酸塩基を含む DN A及び RNAを含む概念である。 DN Aポリメラーゼとしては、 K lenow Fragment, T4 DNAポリメラーゼ、 Taq DNAポリメラーゼなどが挙げら れるが、これらに限定されるものではない。またプライマーと DNAポリメラーゼによる 核酸伸長反応で特定の塩基配列を検出する方法には、例えば前述の SNPsタイピン グ技術の Pyrosequencing法、 Primer Extenion法、 LAMP法などがある。

[0035] 増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する方法としては、例えば、核酸の 合成反応に伴って生じるピロリン酸とマグネシウムの反応物の沈殿を波長 650nmの 光の透過度、つまり濁度の変化によって検出する方法、又はインターカレーター性蛍 光色素を含む反応液において増幅された核酸へのインターカレーシヨンに伴う蛍光 強度変化によって検出する方法などがある。インターカレーター性蛍光色素としては 、例えば、ェチジゥムブロマイド、アタリジンオレンジ、ビスベンチミド、ジァミノフエ-ル インドール、ァクチノマイシン、チアゾール、又はクロモマイシン、あるいはこれらの誘 導体などが挙げられる。

[0036] 2価金属に親和性を有する高分子としては、例えば、側鎖に 2価金属イオンと錯体 を形成することが可能な配位基を有する高分子を用いることができる。一般的に、 2 価金属と錯体を形成可能な配位基としては、アルコール、フエノール、ェノール、カル ボン酸、アルデヒド、ケトン、キノン、エーテル、エステル、アミド、ニトロソ化合物、 -ト 口化合物、 N—ォキシド、スルホン酸、次亜燐酸、亜燐酸、アルソン酸、第一アミン、 第二アミン、第三アミン、ァゾィ匕合物、シッフ塩基、ォキシム、ィミン、又はェナミンなど が例示できる。 2価金属に親和性を有する高分子は、これらの配位基を 2種以上有し て!、てもよ 、。これらの配位基を有する高分子としては有機若しくは無機合成高分子 、又は天然高分子、あるいはこれらをィ匕学修飾した高分子などが挙げられる。 [0037] 以下、上記の本発明の 3つの形態のそれぞれについてより具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記の説明の特定の部分に限定されることはない。

従来法としてフィルターに不織布（ポリエチレンテレフタレート（PET)不織布、 A040 C01旭化成株式会社)を使用し、核酸の不織布に対する捕捉効率を観測すると、試 料が適当な塩を含む精製ゲノム DNA溶液のみの時では非常に高いが、試料中にタ ンパク質を共存させると極端に低下する。これに対して、同じ試料に 2価金属化合物 である塩ィ匕マグネシウムを添加した後、水酸ィ匕ナトリウムをカ卩えることにより試料の pH を 12以上に高めると、核酸の不織布に対する捕捉効率が劇的に回復する。同様な 検討を不織布上に捕捉した核酸にっ 、て LAMP増幅反応を行わせ、その反応時間 で比較すると、アルカリ条件下でマグネシウム化合物を共存させることにより核酸の増 幅反応時間が大幅に短縮され、増幅の铸型となる核酸力 Sフィルター上に効率的に捕 捉されることが示された。

[0038] 本発明の方法における特徴の 1つは、カオトロピック塩やエタノール、フエノール、ク ロロホルムなどの有機溶媒を使わず、 2価金属化合物及びアルカリ溶液と ヽぅ非常に 安価で一般的な試薬を添加することにより、簡便、迅速、且つ効率的にタンパク質な どを含んだ試料カゝら核酸を捕捉することができる点にある。

[0039] またもう 1つの特徴はアルカリ条件下において、 2価金属化合物を添加した試料に 含まれる核酸を固相基材表面に捕捉した後、その核酸を溶出することなく直接 PCR などの核酸合成反応や、あるいはそれに続く特定の核酸塩基配列の検出を行うこと ができる点にある。すなわち、核酸の抽出及び精製から核酸合成、あるいは核酸の 抽出及び精製力 特定の核酸塩基配列の検出までを同一フィルター上で実現でき る。この特徴により、試料中の核酸の抽出から検査に至る全工程が著しく単純ィ匕され 、さらに溶出操作が不要なため処理時間も著しく短縮することができる。また固相基 材としての不織布をアレイ状に配置し、あるいは同一の不織布上にアレイ状に核酸を スポットすることにより、多項目検出を簡単に行うことも可能である。

[0040] 2価金属化合物の添加量としては多いほうが望ましいが、一般的にアルカリ条件下 では 2価金属イオンは水酸化物を形成する。例えばマグネシウム水酸ィ匕物の水への 溶解度は非常に低ぐ ImM以下程度であることが知られている。 2価金属化合物の 添加量は水酸ィ匕物の溶解度を勘案して適宜決定すべきである。例えばマグネシウム 化合物の添カ卩量が ImM以上になると、固相基材としてフィルターを用いて試料を吸 引する際に、水酸ィ匕物の目詰まりによって吸引抵抗が高くなり、フィルター上への核 酸捕捉が困難になることがある。もっとも吸引抵抗の度合いについてはフィルターの 孔径を大きくすることで対応が可能である。そのためマグネシウム化合物の添加量の 上限はこの限りではない。一方、本発明の特徴として、非常に低濃度の 2価金属化合 物の添カ卩によりフィルターへの核酸捕捉効率の向上が達成できる点が挙げられる。こ れは水酸ィ匕物沈殿によるフィルターの目詰まりを避ける上で非常に好都合である。例 えば添加するマグネシウム化合物の濃度としては 0. OlmM以上、より好ましくは 0. 1 mM以上である。

[0041] また本発明のもう 1つの特徴である試料の高 pH条件については、 2価金属化合物 の添カ卩による核酸の捕捉効率向上効果は PH12以上の場合に達成できることが示さ れた。例えば、試料に水酸ィ匕ナトリウムなどの強塩基を添加して pH14程度に調製す ることが望ま U、。水酸ィ匕ナトリウムなどの塩基の濃度にっ 、ては捕捉するフィルター などの固相基材の耐アルカリ強度にもよる力 例えば 50mM以上 1M以下であること が望ましい。核酸捕捉後のフィルタ一は中性条件の緩衝液で洗浄することにより、フ ィルター表面及び内部の pHを低下させることができ、捕捉された核酸を各種酵素反 応などに供することも可能となる。

[0042] 2価金属イオンと核酸との相互作用については多くの研究がなされている力 ほと んどの金属イオンは高 pH下で水酸ィ匕物となり沈殿を形成してしまうため高 pH条件下 で核酸と金属イオンの相互作用を検討した例はな 、。本発明にお 、てはマグネシゥ ム化合物の添カ卩により、アルカリゲル電気泳動において極端に泳動度が低下するほ ど核酸の大きさ、形が変化することが示唆された。高 pH条件下ではマグネシウムィォ ンを介して核酸が会合するため見かけ上の分子量が増大しており、フィルターなどの 固相基材を濾過材として用いた場合に核酸の捕捉効率が高まるものと考えられる。 上記の効果は PH11以下では実質的に観測されない。核酸とマグネシウムとの相互 作用については一般的に 2本鎖核酸の燐酸基への結合が知られているが、高 pH条 件下、水酸化物沈殿を形成しな ヽ程度の濃度にぉ ヽてマグネシウムイオンが核酸同 士を会合させる現象にっ ヽては未だ報告はな 、。またこのように会合した核酸をフィ ルターなどの固相基材に捕捉した例も未だな 、。

[0043] また、高 pH条件下において 2価金属イオンにより形成される核酸の会合体につい ては、 EDTAをカ卩えることにより会合が阻害されることが判明した。会合の形成は ED TAなどのキレート剤添カ卩により容易に阻害され、又は会合体が破壊されて捕捉効率 が低下する。試料によっては生体由来成分中に各種の有機酸類などの金属イオン に対するキレート能を有する成分が含まれることがある。この問題点については高 _PH において水酸ィ匕物の溶解度が高い金属化合物を過剰に添加することにより回避する ことが可能である。高 pHにおいて水酸ィ匕物の溶解度が高い金属としては、アルカリ 金属又はアルカリ土類金属が挙げられる。例えば 0. ImMのマグネシウム化合物を 含む試料に対して ImMの EDTAを添カ卩した後、 lOmMのストロンチウム化合物を添 加すると pHを 12以上に調整した試料力も効率的に核酸を捕捉できることが示された

[0044] さらに本発明の方法における特徴の 1つとして、 2価金属イオンにより形成される核 酸の会合体は、その形成が 2価金属イオンに親和性を有する高分子の添加により促 進することが挙げられる。例えば血清などの高濃度のタンパク質 (7%程度)を含む試 料にぉ 、ては 2価金属イオンと核酸の会合体の形成効率が低下し、固相基材への核 酸の捕捉率の低下が見られる。該試料に 2価金属イオンに親和性を有する高分子を 添加すると 2価金属イオンと核酸の会合体の形成効率が上昇し、固相基材への核酸 の捕捉率が向上することが示された。

[0045] 一般に細胞抽出液には核酸の他に生体試料由来のタンパクを含んでいる。試料中 に ProteinaseK (終濃度 0. lmgZml)を添カ卩することにより、タンパクの除去も可 能である力 試料の処理工程が増えるため一般的には望ましくない。本発明の方法 では、タンパク共存下で核酸を効率的に固相基材上に捕捉することが可能であること から、核酸捕捉の前に試料を ProteinaseKで処理する工程は通常は不要である。も つとも、高濃度のタンパクを含む試料、例えば血液などの場合には固相基材として PE T不織布力 なるフィルターを用いると目詰まりを起こす可能性が高いので、より安全 に吸引するためには ProteinaseKを添加することが望ま 、場合もある。本発明に お!ヽては 2価金属イオンを介して核酸の会合体が形成され、該会合体のサイズが大 きくなるので、核酸の捕捉に用いるフィルターの孔径を大きくすることも可能である。 従って、より孔径の大き 、フィルターを用いて目詰まりを減らすことも可能である。

[0046] また本発明の方法のさらに別の特徴は、細胞から核酸を遊離させて溶液状態で固 相基材表面に接触させることから、どのような種類の細胞にも応用できる汎用性の高 い方法であるという点にある。前述したように、細胞としてはヒト白血球のような真核細 胞、大腸菌のような原核細胞、あるいはウィルスなど力 の核酸の捕捉に用いること ができる。細胞を直接フィルターなどの固相基材に捕捉して溶解する方法では、細胞 の種類に応じてフィルターの特性や吸着条件を至適化する必要がある。また細胞を 破壊することなくフィルターに結合させなければならないので濾過の流速に制限があ り、通常はフィルターをゆっくり通す必要がある。本発明の方法において固相基材と してフィルターを用いる場合には、細胞抽出液などの試料を溶液状態としてフィルタ 一に通すことから、流速を早くすることが可能である。

[0047] また本発明の方法において、固相基材として不織布力もなるフィルターを用いる場 合には、アルカリ条件下において 2価金属イオンを介して形成された核酸の会合体 は、試料溶液をフィルターに通過させるだけで容易にフィルター上に捕捉される。フィ ルターの会合体保持能力の範囲内であれば、試料中に含まれる細胞数や試料容量 に制限はない。一方、 FTA™のような細胞溶液を基材にしみ込ませてカゝら細胞を溶 解する方法では、基材が吸収できる試料容量が処理量の上限となるので、大容量の 試料力 核酸を抽出する目的にはあまり適さない。例えば、細胞濃度が低い大容量 の試料から、試料中に含まれる全細胞の核酸を回収したい場合は、遠心など他の手 段であらかじめ細胞を濃縮する必要がある。本発明の方法において固相基材として フィルターを用いる場合には、このような試料容量に関する制限はない。また不織布 は単位面積当たり多数の細胞あるいは大容量の試料を処理できるので、容易に単位 面積当たりの核酸固定量 (核酸密度)を増加することができる。従って、不織布からな るフィルタ一は本発明の方法に最も好適に用いることができる。フィルターへの核酸 固定量が多くなれば検出も容易になるので、核酸増幅反応による感染症診断のよう に高い感度が要求される場合、又は核酸増幅が好ましくないような検査において、試 料の入手が比較的容易であり、かつ大量の試料をフィルターで処理する場合などに は、本発明の方法は特に有用である。

[0048] また、試料中の核酸が分解しない限り、任意の手段で保存された試料を用いて本 発明の方法を行うことができる。例えば、細胞を含む試料としては、採取又は調製直 後のものを用いてもよぐあるいは凍結保存した試料を用いてもよい。血液の場合、 新鮮血又は凍結保存血の!/ヽずれを用いても核酸を捕捉及び検出できる。

[0049] 本発明のさらに別の態様によれば、不織布力 なるフィルターに対して低濃度 (0.

ImM程度)塩ィ匕マグネシウムの 1N水酸ィ匕ナトリウム溶液をあら力じめ不織布に通水 した後、水酸ィ匕ナトリウムで処理したタンパクを含む核酸試料を該不織布に通水させ ると、核酸の不織布に対する捕捉率が劇的に回復する。一方、同濃度の塩化マグネ シゥム水溶液をあら力じめ不織布に通水させても核酸の捕捉率は回復しな 、。つまり 、これはマグネシウムが不織布に対して吸着するにはアルカリ条件が必要であること を示す。

[0050] 一般に PET不織布は高 pH条件下では加水分解を受けやすぐ加水分解を受けた PET表面にはカルボキシル基、水酸基などの存在割合が増している。 2価金属ィォ ンは PET不織布上でこのようなキレート能を持った官能基に配位して不織布上に固 定化されているものと推定され、従って、本発明の方法では、固相上に固定化された 2価金属イオンが試料液相中の核酸を捕捉する主体的な役割を担って 、る。例えば 、不織布力もなるフィルターを 0. 125Nの水酸ィ匕ナトリウム溶液で加水分解した後、 マグネシウム、亜鉛、マンガンなどの 2価金属化合物水溶液に浸漬してこれらの 2価 金属イオンをフィルター上に固定化した不織布においても pH 12以上に調製したタン パク質を含む核酸試料を該不織布に通水させると、核酸の不織布に対する捕捉効 率が劇的に向上する。さらに別の形態では、キレート能を有するカルボキシル基を多 く持つ Poly— L— Glutamic acidを不織布にコーティングし、 2価金属イオンを含む 水溶液を通水させることによつても 2価金属イオンを固定ィ匕したフィルターを作製する ことができる。また該フィルターを 2枚な 、し 4枚積層した多層化フィルターを調製する ことにより固相基材上に固定ィ匕される 2価金属イオンの量が増大し、それに比例して 核酸の捕捉効率を高めることができる。 [0051] 一方、 2価金属イオンを固定ィ匕した不織布を用いても、アルカリ処理をして ヽな ヽ試 料に対してはタンパク質共存下で核酸を効率的に不織布に捕捉することはできない 。これは固相基材上に固定化された 2価金属イオンが液相中の核酸と結合するため には核酸がアルカリ条件下で変性して 、ることが必要であることを示して 、る。これら のことから 2価金属イオンと核酸とは高 pH条件下で結合力が非常に高まることが示さ れた。

[0052] 本発明の方法では 2価金属イオンを固定ィ匕した不織布などの固相基材に対して p Hを高めてアルカリ変性させた核酸を接触させることを特徴としており、この手段によ りタンパク質を含む試料においても非常に高い捕捉率を実現することが可能となる。 さらにアルカリ条件下で変性させた核酸を不織布に通水させ、不織布に捕捉した核 酸にっ 、て LAMP増幅反応を行わせると、 2価金属イオンを固定ィ匕させた不織布は、 2価金属イオンを固定ィ匕させていない不織布に比較して、核酸の増幅反応時間が大 幅に短縮されており、増幅の铸型となる核酸が不織布上に効率的に捕捉されている ことが示された。また核酸の捕捉後、フィルターを中性条件の緩衝液等で洗浄するこ とにより、フィルター近傍の pHを下げて捕捉された核酸を各種の酵素反応に供する ことも可能である。

[0053] また、不織布をはじめとする固相基材としてフィルタ一類を核酸の増幅反応溶液に 浸漬して増幅反応を行わせた場合、核酸の増幅酵素等がフィルター上に吸着するこ とによりある一定の割合で反応効率が低下する場合がある。あらかじめ核酸を捕捉し たフィルターに酵素吸着抑制剤をコーティングすることにより、核酸増幅酵素等がフィ ルターに吸着することによって生ずる反応効率の低下を抑えることが可能である。酵 素吸着抑制剤としてはゥシ血清アルブミンなどが挙げられる。

実施例

[0054] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例は 説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。

例 1：不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較 (マグネシウム吸着条件） 不織布を直径 5mmの円盤状に切り抜き二個のイェローチップ（QSP Pipet Tip Yellow 1 200 L)を切断し、その間に不織布を挟み込むことにより、不織布を 先端に固定ィ匕したカラムを作製した。不織布としては旭化成株式会社の製品 A040 C01を使用した (以下、「不織布固定ィ匕カラム」という。 ) oカラムの構造を図 1に示す。 試料は淋菌由来精製ゲノム DNA (ATCC700825) 20pgを生理食塩水あるいは 0. 3%BSA(SIGMA-A2153)生理食塩水溶液 lmLに溶解させた。アルカリ処理は 該試料に 8N NaOHを 150 /z L添カ卩し最終濃度を 1Nとした。不織布固定ィ匕カラム に 10mLのテルモシリンジを接続して各サンプルを全量吸引した。図 2中、（3)及び (4) の実験については塩化マグネシウム（WAKO) O. ImMの IN NaOH溶液あるいは 水溶液をそれぞれ lmLずつ試料吸引する前に不織布固定ィ匕カラムに通水した。試 料を吸引した後、さらに TBS バッファー（10mM Tris-HCl pH8.0、 150mM NaCl) lmLを吸引して洗浄をおこなった。

LAMP反応は次のように行った。 LAMP反応に用いるインナープライマーとは FIP プライマーと BIPプライマーとを示す。 FIPプライマーは、 5'側にターゲット核酸配列 の表鎖に相同的な Flcと呼ばれる配列、及び 3'側にターゲット核酸配列の裏鎖に相 補的な F2と呼ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドであり、 BIPプライマーは、 5'側 にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的な Blcと呼ばれる配列、及び 3'側にターゲット 核酸配列の表鎖に相補的な B2と呼ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドである。ァ ウタ一プライマーとは、 F3プライマーと B3プライマーを示し、 F3プライマーはターゲッ ト核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、 B3プライマーはターゲット核酸の 表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、 FLプライマーと BL プライマーを示し、 LAMPによる核酸の増幅反応を促進する。 FLプライマーは F2配 列に相補的な F2c配列と Flc配列の間の配列に相補的な配列、 BLプライマーは B2 配列に相補的な B2c配列と Blc配列の間の配列に相補的な配列とを有するオリゴヌ クレオチドである。これらのインナープライマー、アウタープライマー、及び、ループプ ライマーの設計方法は、 Webサイト http:ZZwww. eiken. co. jpZに公開されて いる。核酸を増幅する LAMP反応のターゲット配列として淋菌の ORF1 (Genebank accession No. S86113)遺伝子を選択し、 LAMP反応の増幅オリゴヌクレオチ ドプライマ一をデザインした。配列番号 1の FIPプライマー、配列番号 2の BIPプライ マー、配列番号 3の F3プライマー、配列番号 4の B3プライマー、配列番号 5の Floop プライマー、配列番号 6の Bloopプライマーをデザインして、 日本バイオサービス社に 依頼して化学的に合成した。

[0056] LAMP増幅の反応液には、 F3プライマーと B3プライマーをそれぞれ 2. 5 M、 FI Pプライマーと BIPプライマーをそれぞれ 20 μ M、 FLプライマーと BLプライマーをそ れぞれ 30 Μ、 1. 4mM dNTPsゝ 0. 8M trimethylglycineゝ 20mM Tris—H Cl(pH8. 8)、 lOmM KC1、 lOmM (NH ) SO、 0. 1% Tween20、 6. 4 uni

4 2 4

tsの Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs)を含 み、 MgSO濃度が 8mMになるようにカ卩えた。洗浄後の不織布固定ィ匕カラムを上記 L

4

AMP増幅の反応液 50 Lを入れた Loopamp Reaction Tube (栄研化学）に 不織布部分が反応液に浸るようにセットした。不織布固定ィ匕カラムと LAMP反応液が 入った Loopamp Reaction Tubeをプチはち（トミー工業）にて 5秒間、軽く遠心処 理した後、 Loop Ampリアルタイム濁度計 LA— 200 (テラメッタス）にセットして 64°C、 1時間反応を行 、ながら濁度変化を測定した。 LAMP増幅反応にぉ 、てピロリン酸 マグネシウム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時間を縦 軸として比較をおこなった。

[0057] 結果を図 2に示す。 BSAを含むサンプルでは不織布上の核酸における増幅時間 が遅い、つまり核酸の捕捉率が低いことが分かる。一方、塩化マグネシウムの NaOH 溶液を事前に吸引すると BSAを含まないサンプルと同等に増幅時間が短ぐ核酸の 捕捉率が高 、ことが示された。し力しこの効果は塩ィ匕マグネシウム水溶液では見られ なかった。図 2中、（1)ないし (4)は不織布に吸引した試料、 1試料につき N = 3回ずつ 吸弓 I及び測定を行なつた結果を示す。

(1)淋菌精製ゲノム DNA20pgZ生理食塩水 ZlN NaOH

(2)淋菌精製ゲノム DNA20pg + 0. 3%BSAZ生理食塩水 ZlN NaOH

(3) 0. ImM MgCl ZlN NaOHを吸引後、淋菌精製ゲノム DNA20pg + 0. 3%

2

BSAZ生理食塩水 ZlN NaOH

(4) 0. ImM MgCl Z生理食塩水を吸引後、淋菌精製ゲノム DNA+0. 3%BSA

2

Z生理食塩水 ZlN NaOH

[0058] 例 2：マグネシウム吸着不織布への核酸捕捉効率 0. 1 %Poly - L - Glutamic acid (SIGMA、以下 PLG)の水溶液に不織布（AO 40C01)を室温条件下で一晚浸漬した後、乾燥させてコーティングをおこなった。 Cy 3蛍光ラベノレ (Mirus)した λ DNA (TAKARA) 20ng/ μ Lを 4 μ L (80ng) 0. 3% BSA生理食塩水溶液 lmLに溶解した。アルカリ処理は該試料に 8N NaOHを 75 L添加し最終 0. 5N NaOH溶液とした。 DNAのラベル化は Mirus Label IT Cy 3 Labeling Kit添付プロトコルに沿っておこなった。不織布を固定ィ匕したカラムに 10mLのテルモシリンジを接続して各サンプルを全量吸引した。実験は各サンプル にっき、 2回ずつおこなった。図 3中、（2)については 0. 1%PLGコートした不織布に 試料吸引前にあらかじめ lOOmM MgCl水溶液 lmLを吸引しておいた。全サンプ

2

ル吸引後、カラムを分解して不織布を取り出し蛍光測定用スライドガラス (MATSUN AMI)の裏面カゝらメンデイングテープを用いて貼り付けた。不織布を貼り付けたスライ ドガラスをマイクロアレイスキャナ（GSI LUMONICS ScanArrayLite)にセットし 、蛍光イメージ及び蛍光強度の測定を行った。

[0059] 結果を図 3に示す。不織布に BSAを含む試料を直接通水したものは不織布上への 核酸捕捉がほとんど観測されず、不織布上への DNAの捕捉効率が共存するタンパ ク質の影響により著しく低下していることが示された。一方、 PLGコートした不織布に マグネシウムを吸着させたものについては BSAを含むサンプルにおいても不織布上 に核酸が効率的に捕捉されていることが示された。図 3中の数字は蛍光強度を示し、 (1)及び (2)は不織布の種類を示し、 1種類につき 2スポット (N= 2)とした。

[0060] 例 3 :不織布上 DNAの LAMP増幅反応時間の比較（ポリマーコート不織布と多層化 フィルターの効果）

試料として淋菌由来精製ゲノム DNA (ATCC700825) 20pgを生理食塩水ある!/ヽ は 0. 3 % BS A ( SIGM A— A2153)生理食塩水溶液 1 mLに溶解させたものを用い た。 PLGポリマーの不織布へのコーティングは例 2と同様である。 PLGコートした不 織布を 2枚又は 4枚積層し、例 1の図 1のようにイェローチップに挟み込んで多層化フ ィルターを作製した。ポジティブコントロール以外の実験については例 2と同様に試 料吸引前にあらかじめ lOOmM MgCl水溶液 lmLを吸引しておいた。不織布固定

2

化カラムに 10mLのテルモシリンジを接続して各サンプルを全量吸引した。 LAMP増 幅反応液の調製及び不織布固定ィ匕カラムの増幅反応の濁度測定は全て例 1と同様 である。

[0061] 結果を図 4に示す。縦軸は LAMP増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成 に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時間である。マグネシウム 溶液を接触させた不織布同士では PLGコートしたものの方が核酸の捕捉効率が高 まっており、マグネシウムの吸着にカルボキシル基が有用であることが示唆された。ま たフィルターを多層化することにより核酸の捕捉率は高まることが判明した。図 4中、 ( 1)な！、し (5)につ 、て N = 3回ずつ吸引及び測定を行なった。

(1)不織布（1枚 ·未処理）、淋菌精製ゲノム DNA20pg/生理食塩水/ IN NaOH[ ポジティブコントローノレ]

(2)不織布（1枚 ·未処理）、 lOOmM MgCl水溶液を吸引後、淋菌精製ゲノム DNA

2

20pg + 0. 3%BSAZ生理食塩水 ZlN NaOH

(3)不織布（1枚 ·0· 1 %Poly - L - Glutamic acidコート）、 lOOmM MgCl水溶

2 液を吸引後、淋菌精製ゲノム DNA20pg + 0. 3%BSAZ生理食塩水 ZlN

(4)不織布（2枚 ·0. 1 %Poly - L - Glutamic acidコート）、 lOOmM MgCl水溶

2 液を吸引後、淋菌精製ゲノム DNA20pg + 0. 3%BSAZ生理食塩水 ZlN NaO H

(5)不織布（4枚 ·0. 1 %Polv - L - Glutamic acidコート）、 lOOmM MgCl水溶

2 液を吸引後、淋菌精製ゲノム DNA20pg + 0. 3%BSAZ生理食塩水 ZlN NaO H

[0062] 例 4：マグネシウム吸着不織布上の核酸増幅効率 (試料のアルカリ処理有無の影響） 試料として、淋菌由来精製ゲノム DNA(ATCC700825) 20pgを 0. 3%BSA(SI GMA-A2153)生理食塩水溶液 lmLに溶解したものを用いた。アルカリ処理を行 う場合には該試料に 8N NaOHを 150 L添カロし最終濃度を 1Nとした。例 2と同様 に PLGコートした不織布に対して試料吸引前にあらかじめ lOOmM MgCl水溶液

2 lmLを吸引してぉ 、た。不織布固定ィ匕カラムに 1 OmLのテノレモシリンジを接続して 各サンプルを全量吸引した。 LAMP増幅反応液の調製及び不織布固定ィ匕カラムの 増幅反応の濁度測定は全て例 1と同様である。 [0063] 結果を図 5に示す。縦軸は LAMP増幅反応においてピロリン酸マグネシウム生成 に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時間である。マグネシウムを 吸着させた PLGコート不織布において、タンパクを含む試料カゝら核酸を捕捉するた めには試料をアルカリ処理することが必要であることが示された。図 5中、左の白い力 ラムは生理食塩水、右の着色カラムは IN NaOHの結果を示す。 1条件につき N = 3回ずつ吸引及び測定を行なった。

[0064] 例 5：タンパク含有試料における不織布の核酸捕捉効率

不織布を直径 5mmの円盤状に切り抜き二個のイェローチップ（QSP Pipet Tip Yellow 1 200 L)を切断し、その間に不織布を挟み込むことにより、不織布を 先端に固定ィ匕したカラムを作製した。不織布としては旭化成株式会社の製品 A040 C01を使用した (以下、「不織布固定ィ匕カラム」という。 ) oカラムの構造を図 1に示す。 Cy 3蛍光ラベル（Mirus)した λ DNA (TAKARA) lOng/ μ Lを 4 μ L (40ng)を生 理食塩水又は 0. 3%BSA生理食塩水溶液 lmLに溶解した。ネガティブコントロール の際は純水を 4 ;z L添カ卩した。 DNAのラベル化は Mirus Label IT Cy3 Labeli ng Kit添付プロトコルに従っておこなった。不織布を固定化したカラムに lOmLのテ ルモシリンジを接続して各試料を全量吸引した。実験は各試料につき 2回ずつおこな つた。吸引後、カラムを分解して不織布を取り出し蛍光測定用スライドガラス (MATS UNAMI)の裏面からメンデイングテープを用いて貼り付けた。不織布を貼り付けたス ライドガラスをマイクロアレイスキャナ（GSI LUMONICS ScanArrayLite)にセッ トし、蛍光イメージ及び蛍光強度の測定を行った

[0065] 結果を図 6に示す。 0. 3%のゥシ血清アルブミン（SIGMA— A2153)以下 BSA、 を含む試料では含まな 、試料に比べて極端に蛍光強度が低下して 、た。つまり不織 布上への DNAの捕捉効率が共存するタンパク質の影響により著しく低下しているこ とが示された。図中、

(1) λ ϋΝΑ+0. 3%BSAZ生理食塩水

(2)生理食塩水 [ネガティブコントロール]

(3) λ DNAZ生理食塩水 [ポジティブコントロール]

を示す。 [0066] 例 6：マグネシウム ZNaOH処理試料における不織布の核酸捕捉効率 例 1で使用した Cy 3蛍光ラベル化 λ DNAlOng/ μ Lを 4 μ Lを生理食塩水ある!/ヽ は 0. 3%BSA生理食塩水溶液 lmLに溶解させた。マグネシウムを添加する場合は 該試料 lmLに対し lOOmM塩化マグネシウム（WAKO)を 1 μ L添加し、最終濃度を 0. ImMとした。その後、該試料に 8N NaOHを 75 μ L添加し最終 0. 5Ν NaOH溶 液とした。不織布固定ィ匕カラムで各試料を例 1と同様に吸引し、スライドガラスに不織 布を貼付した後、例 1と同様に蛍光イメージを測定した。実験は各試料につき 2回ず つおこなった。

[0067] 結果を図 7に示す。 NaOH処理した溶液においても 0. 3%BSAを含む試料では不 織布上への DNAの捕捉率が低下していた。しかし BSAを含む試料でも 0. ImMの 塩ィ匕マグネシウムを添加した試料にっ ヽては BSAを含まな 、ものと同等の捕捉率が 観測された。図中、

(1) λ ϋΝΑ+0. 3%BSA+0. ImM MgCl /生理食塩水 /0. 5N NaOH

2

(2) λ ϋΝΑ+0. 3%BSAZ生理食塩水 Ζθ. 5Ν NaOH

(3)生理食塩水 Ζθ. 5Ν NaOH [ネガティブコントロール]

(4) DNAZ生理食塩水 Ζθ. 5Ν NaOH [ポジティブコントロール]

を示す。

[0068] 例 7：マグネシウム ZNaOH処理試料における不織布上の捕捉核酸の増幅効率 淋菌由来精製ゲノム DNA(ATCC700825) 20pgを生理食塩水あるいは 0. 3%B SA生理食塩水溶液 lmLに溶解させた。マグネシウムを添加する場合は該試料 lm Lに対し、 lOOmM塩化マグネシウムを 1 L添カ卩し最終濃度 0. ImMとした。アル力 リ処理は該試料に 8N NaOHを 150 L添カ卩し最終濃度を 1Nとした。これら DNA を含む試料全量を不織布固定ィ匕カラムで吸引し、さらに TBS ノ ッファー（10mM Tris-HCl pH8.0、 150mM NaCl) lmLを吸引して洗浄をおこなった。

[0069] LAMP反応は次のように行った。 LAMP反応に用いるインナープライマーとは FIP プライマーと BIPプライマーとを示す。 FIPプライマーは、 5'側にターゲット核酸配列 の表鎖に相同的な Flcと呼ばれる配列、及び 3'側にターゲット核酸配列の裏鎖に相 補的な F2と呼ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドであり、 BIPプライマーは、 5'側 にターゲット核酸配列の裏鎖に相同的な Blcと呼ばれる配列、及び 3'側にターゲット 核酸配列の表鎖に相補的な B2と呼ばれる配列を有するオリゴヌクレオチドである。ァ ウタ一プライマーとは、 F3プライマーと B3プライマーを示し、 F3プライマーはターゲッ ト核酸配列の裏鎖に相補的なオリゴヌクレオチド、 B3プライマーはターゲット核酸の 表鎖に相補的なオリゴヌクレオチドである。ループプライマーは、 FLプライマーと BL プライマーを示し、 LAMPによる核酸の増幅反応を促進する。 FLプライマーは F2配 列に相補的な F2c配列と Flc配列の間の配列に相補的な配列、 BLプライマーは B2 配列に相補的な B2c配列と Blc配列の間の配列に相補的な配列とを有するオリゴヌ クレオチドである。これらのインナープライマー、アウタープライマー、及び、ループプ ライマーの設計方法は、 Webサイト http : ZZwww. eiken. co. jpZに公開されて いる。核酸を増幅する LAMP反応のターゲット配列として淋菌の ORF1 (Genebank accession No. S86113)遺伝子を選択し、 LAMP反応の増幅オリゴヌクレオチ ドプライマ一をデザインした。配列番号 1の FIPプライマー、配列番号 2の BIPプライ マー、配列番号 3の F3プライマー、配列番号 4の B3プライマー、配列番号 5の Floop プライマー、配列番号 6の Bloopプライマーをデザインして、 日本バイオサービス社に 依頼して化学的に合成した。

LAMP増幅の反応液には、 F3プライマーと B3プライマーをそれぞれ 2. 5 M、 FI Pプライマーと BIPプライマーをそれぞれ 20 μ M、 FLプライマーと BLプライマーをそ れぞれ 30 Μ、 1. 4mM dNTPsゝ 0. 8M trimethylglycineゝ 20mM Tris—H Cl(pH8. 8)、 lOmM KC1、 lOmM (NH ) SO、 0. 1% Tween20、 6. 4 uni

4 2 4

tsの Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs)を含 み、 MgSO濃度が 8mMになるようにカ卩えた。洗浄後の不織布固定ィ匕カラムを上記 L

4

AMP増幅の反応液 50 Lを入れた Loopamp Reaction Tube (栄研化学）に 不織布部分が反応液に浸るようにセットした。不織布固定ィ匕カラムと LAMP反応液が 入った Loopamp Reaction Tubeをプチはち（トミー工業）にて 5秒間、軽く遠心処 理した後、 Loop Ampリアルタイム濁度計 LA— 200 (テラメッタス）にセットして 64°C、 1時間反応を行 、ながら濁度変化を測定した。 LAMP増幅反応にぉ 、てピロリン酸 マグネシウム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時間を縦 軸として比較をおこなった。

[0071] 結果を図 8に示す。 BSAを含む試料では不織布上の核酸における増幅時間が遅 い、つまり核酸の捕捉率が低いが、マグネシウムを添カ卩した系では BSAを含まない 試料と同等に増幅時間が短ぐ核酸の捕捉率が高いことが示された。図中、 1試料に つき N = 3回ずつ吸引及び測定を行なった結果を示し、

(1)淋菌精製ゲノム DNAZ生理食塩水 ZlN NaOH

(2)淋菌精製ゲノム DNA+0. 3%BSAZ生理食塩水 ZlN NaOH

(3)淋菌精製ゲノム DNA+0. 3%BSA+0. ImM MgCl Z生理食塩水 ZlN N

2

aOH

を示す。

[0072] 例 8：不織布上の捕捉核酸の増幅効率におけるマグネシウム濃度の影響

淋菌精製ゲノム DNA(ATCC700825) 20pgを 0. 3%BSA生理食塩水溶液 lmL に溶解させた。該試料に 1M MgClを 10 /z L (最終濃度約 10mM)、 5 L (同 5m

2

M)、 lOOmM MgClを 10 L (同 ImM)、 5 （同0. 5mM)、 1 （同0. ImM

2

)と添カ卩した。アルカリ処理は該試料に 8N NaOHを 150 μ L添加し最終濃度を IN とした。これら DNAを含む試料全量を不織布固定ィ匕カラムで吸引し、さら〖こ TBS バ ッファー（10mM Tris-HCl pH8.0、 150mM NaCl) lmLを吸引して洗浄をお こなった。 LAMP増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応の濁度測 定は全て例 7と同様である。結果を図 9に示す。 ImMまでの濃度のマグネシウムの 添加では BSA共存下でも核酸の高 ヽ捕捉率が達成されて!ヽることが示された。

[0073] 例 9：不織布上の捕捉核酸の増幅効率における pHの影響

淋菌精製ゲノム DNA(ATCC700825) 20pgを 0. 6%BSA生理食塩水 500 μ L に溶解させた。次に各 1Mのバッファー溶液 (Tris— HClpH7. 0、 8. 0、 9. 0、炭酸 バッファー ρΗΙΟ. 0、 11. 0)あるいは IN NaOHをカ卩えて lmL試料とした。これら DN Aを含む試料全量を不織布固定化カラムで吸引し、さら〖こ TBSバッファー ( 1 Om M Tris— HCl pH8.0、 150mM NaCl) lmLを吸引して洗浄をおこなった。 LAM P増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応の濁度測定は全て例 7と 同様である。結果を図 10に示す。図中の結果は 1試料について N = 3回ずつ吸引及 び測定を行なった結果を示し、縦軸は LAMP増幅反応にぉ 、てピロリン酸マグネシ ゥム生成に伴う濁度（650nmにおける吸光度）が 0. 1になるまでの時間である。 pHl 4付近、つまり強アルカリ処理の試料においてマグネシウムの添加効果ははつきりと 示された。

[0074] 例 10：アルカリゲル電気泳動でのマグネシウム添加効果

ァガロース（GibcoBRL Ultra Pure)を 0. 05N NaOHに溶解させて 0. 5%ァ ガロースゲルを調製した。 え DNAlOOng/ μ Lを 3 μ L (300ng)、これに BSAを添カロ する場合は 1%BSAを 3 μ L、 MgClを添カ卩する場合は 10mM MgClを 1 L、最

2 2

後に全ての試料に対して 0. 5N NaOHを 1 L加えて各々全量 10 Lに純水でメ スアップした。試料 10 μ Lあたり 2 μ Lの 4 Xローデイングバッファー（52%シユークロ ース、 0. 1%ブロモクレゾールグリーン、 0. 168%キシレンシァノール、 200mM N aOH)を加えて全量を各レーンにアプライした。泳動バッファ一として 0. 05N NaO H液にゲルを浸漬して電気泳動を 50V、 3時間おこなった後、中和バッファー（1M Tris-HCl pH8. 0、 1. 5M NaCl)に 30分浸漬して中和した。中和バッファーに 溶解させたェチジゥムブロマイドで 30分染色して Biolmage Gel Print2000i/VG Aで撮影した。結果を図 11に示す。核酸とマグネシウムイオンが共存した試料につい て EDTAをカ卩えた時を除いて、泳動度が極端に低下していた。このことカゝらアルカリ 条件下、核酸とマグネシウムが共存することにより核酸の会合が生じて核酸のみかけ サイズが増大して!/ヽること、及び EDTAの存在下にお ヽては会合が生じな ヽことが示 された。

[0075] 例 11：アルカリゲル電気泳動でのマグネシウム添加濃度の影響

使用したァガロースゲル及び泳動バッファ一は例 10と同じである。 λ DNAlOOng/ μ Lを 3 μ L (300ng)、 ImM MgCl水溶液を各々 1、 2、 3、 4、 5 L添加して各々

2

全量 10 μ Lに純水でメスアップした。試料 10 μ Lあたり 2 μ Lの 4 Xローデイングバッ ファー（52%シユークロース、 0. 1%ブロモクレゾールグリーン、 0. 168%キシレンシ ァノール、 200mM NaOH)をカ卩えて全量を各レーンにアプライした。泳動バッファ 一として 0. 05N NaOH液にゲルを浸漬して電気泳動を 50V、 3時間おこなった後 、中和バッファー（1M Tris-HCl pH8. 0、 1. 5M NaCl)に 30分浸漬して中和 した。中和バッファーに溶解させたェチジゥムブロマイドで 30分染色して Biolmage Gel Print2000i/VGAで撮影した。結果を図 12に示す。共存するマグネシウムィ オンの濃度が上昇するのに伴って泳動可能な大きさの核酸が減少し、泳動度が低 、 大きな核酸成分が増大して ヽることが示された。

[0076] 例 12 :pH8条件におけるゲル泳動でのマグネシウム添加効果

ァガロース（GibcoBRL Ultra Pure)を 40mM Tris—酢酸バッファーに溶解さ せて 0. 5%ァガロースゲルを調製した。 λ DNAlOOng/ μ Lを 3 μ L (300ng)、これ に BSAを添カ卩する場合は 1%BSAを 3 μ L、 MgClを添カ卩する場合は 10mM Mg

2

CIを 1 μ L加えて、各々全量 10 μ Lに純水でメスアップした。試料 10 μ Lあたり 2 μ L

2

の 4 Xローデイングバッファー（52%シユークロース、 0. 1%ブロモクレゾールグリーン 、 0. 168%キシレンシァノール）をカ卩えて全量を各レーンにアプライした。 40mM T ris—酢酸バッファーにゲルを浸漬して電気泳動を 50V、 30分おこなった後、ェチジ ゥムブロマイドで染色して Biolmage Gel Print2000i/VGAで撮影した。結果を 図 13に示す。核酸とマグネシウムイオンの相互作用による泳動度低下は中性条件で は観察されず、アルカリ条件下に特有の現象であることが示された。

[0077] 例 13：不織布上の捕捉核酸の増幅効率における各種 2価金属イオン固定ィヒ不織布 の比較

3 X 3cmシート状にカットした不織布を 0. 25N NaOHとァセトニトリルの 1： 1混合 液力 なる加水分解処理液 5mLに浸漬し、 60°Cで 1時間、揺らしながらインキュベー トした。その後、純水に浸漬して 10分間揺らしながらの洗浄を 2回繰り返した。 10m Mの 2価金属塩化物（塩化亜鉛、塩化マグネシウム、塩ィ匕マンガン）の水溶液に加水 分解処理した不織布を浸漬し、室温で一晩放置した後、純水に浸漬して 10分間揺ら しながらの洗浄を 2回繰り返し、その後、室温で一晩乾燥させて各種 2価金属イオン を固定ィ匕した不織布を作製した。試料は BCG菌由来の精製ゲノム DNA20pgを生 理食塩水又は 0. 3%のヒト血清アルブミン（以下 HSA) (SIGMA)生理食塩水溶液 lmLに溶解させた。該サンプルに 8N NaOHを 30 /z L添カ卩し最終濃度を 0. 2Nとし た。これら DN Aを含む試料全量を各種不織布で吸引した後、 TBS BufferlmLを 吸引して洗浄をおこなった。洗浄後の不織布固定ィ匕カラムの LAMP増幅についてプ ライマーセット以外は LAMP増幅反応液の調製及び不織布固定ィ匕カラムの増幅反 応は例 7と同様である。プライマーセットについては核酸を増幅する LAMP反応のタ 一ゲット配列として結核菌群の 16S Ribosomal RNA遺伝子の配列（GeneBank

Accession No. NC— 000962、 X58890、 X55588、 AF480605)遺伝子を選 択し、 LAMP反応の増幅オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。配列番号 7の FIPプライマー、配列番号 8の BIPプライマー、配列番号 9の F3プライマー、配列番 号 10の B3プライマー、配列番号 11の Floopプライマー、配列番号 12の Bloopプラ イマ一をデザインして、 日本バイオサービス社に依頼して化学的に合成した。

結果を図 14に示す。マグネシウムを固定ィ匕した不織布以外にも亜鉛、マンガンを 固定ィ匕した不織布においてもタンパク含有試料中の核酸の捕捉率が高いことが示さ れた。図中 (1)ないし (5)は使用した不織布に固定ィ匕した金属イオン種、吸引した Sam pieの順に示し、各試料について N = 3回ずつ吸引及び測定を行なった結果を示す

(1)未固定化、淋菌精製ゲノム DNA20pgZ生理食塩水 Z0. 2N NaOH [試料— 1]

(2)未固定化、淋菌精製ゲノム DNA20pg + 0. 3%HSAZ生理食塩水 Ζθ. 2Ν Ν &0 試料ー2]

(3)亜鉛、試料— 2

(4)マグネシウム、試料 2

(5)マンガン、試料 2

を示す。

例 14：不織布上に捕捉した核酸の PCR増幅反応

試料は BCG菌由来の精製ゲノム DNA200pgを生理食塩水又は 0. 3%HSA (SI GMA)生理食塩水溶液 lmLに溶解させた。該サンプルに 8N NaOHを 30 μ L添 加し最終濃度を 0. 2Νとした。これら DNAを含む試料全量を未処理あるいはマグネ シゥムイオンを固定ィ匕した不織布で吸引した後、 TBS BufferlmLを吸引して洗浄 をおこなった。マグネシウムを固定ィ匕した不織布の作製法は例 13と同様である。 PC Rのプライマーについては結核菌群の 16S Ribosomal RNA遺伝子の配列を選 択し、増幅産物のサイズが lkbpとなるようにデザインした配列番号 13、 14を、 日本 ノィォサービス社に依頼して化学的に合成した。洗浄後の不織布固定ィ匕カラムを 0. 2mM dNTPs、上記プライマー各 0. 5 M、 3% Tween20及び Ex Taq Hot St art Version (TAKARA)キットより付属の Bufferゝ Ex Taq Polymerase 1. 25unit sからなる 50 μ Lの PCR反応液に浸漬した。これを DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)で 95。C 5分、 lCycle : 95。C 20秒、 55。C 20秒、 72。C 20秒、 30Cycle ; 72°C 7分 反応させた。それぞれの PCR反応終了後、各反応液 9 /z Lに 10 X Loa ding Bufferを 1 μ L加えて混和し、全量を 1%のァガロースで電気泳動にかけた。 電気泳動を 100V、 30分おこなった後、ェチジゥムブロマイドで染色して Biolmage Gel Print2000i/VGAで撮影した。

[0079] 結果を図 15に示す。 HS Aを含んだ試料を吸引した不織布の中でマグネシウムを 固定化した不織布では PCRの増幅産物のバンドが確認できた力 マグネシウムを固 定ィ匕していない不織布では増幅産物が確認できず、铸型となる試料中の核酸が不 織布に捕捉されな力つたことが示唆された。以上力もマグネシウムを固定ィ匕した不織 布により、タンパク含有試料中の核酸が捕捉可能で、かつ該不織布上に捕捉された 核酸が PCR増幅反応にも適用可能であることが示された。

[0080] 例 15 :EDTA及び 2価金属イオン共存試料における不織布上捕捉核酸の増幅効率 試料は BCG菌由来の精製ゲノム DNA20pgを生理食塩水又は 0. 3%HSA (SIG MA)生理食塩水溶液 lmLに溶解させた。該サンプルに EDTAをカロえる場合は lm M、塩化ストロンチウムをカ卩える場合は 10mM、塩ィ匕マグネシウムをカ卩える場合は 0. ImMを添カ卩し、各サンプルにそれぞれ 8N NaOHを 30 μ L添加し最終濃度を 0. 2 Νとした。 LAMP増幅反応液の調製及び不織布固定ィ匕カラムの増幅反応は例 13と 同様である。

[0081] 結果を図 16に示す。 EDTAによるマグネシウムと核酸との会合体形成の阻害がスト ロンチウムの添カ卩により抑制され、 EDTAのようなキレート成分の存在下でもタンパク 含有試料中の核酸の捕捉が可能であることが示された。図中 (1)ないし (5)は不織布に 吸引した試料を示し、縦軸は濁度 0. 1となるまでの経過時間を示す。

各試料につき N= 3回ずつ吸引、測定した。

(l)BCG菌精製ゲノム DNA20pgZ生理食塩水 Z0. 2N NaOH [ポジティブコント口 ール、試料— 1]

(2) BCG菌精製ゲノム DNA20pg + 0. 3%HSAZ生理食塩水 Z〇. 2N NaOH (試 料 2)

(3)試料 2 + 0. ImM MgCl

2

(4)試料 2+ ImM EDTA+0. ImM MgCl

2

(5)試料 2+ lmM EDTA+ lOmM SrCl +0. ImM MgCl

2 2

を示す。

[0082] 例 16：尿試料における不織布上捕捉核酸の増幅効率

淋菌（ATCC700825)をチョコレート寒天培地上で 2日間培養し、回収した菌の縣 濁液を生理食塩水により 100万倍に希釈した。希釈した菌液 10 Lを生理食塩水あ るいは健常人の尿 500 μ Lにそれぞれ添加した。該サンプルに 8Ν NaOHを 75 μ L添加し最終濃度を INとした。例 2と同様に未処理の不織布及び PLGをコーティン グした不織布にマグネシウムを通水したマグネシウム固定化不織布の 2種類を用意し て、該尿試料をそれぞれの不織布で全量吸引した後、 TBS BufferlmLを吸引し て洗浄した。 LAMP増幅反応液の調製及び不織布固定化カラムの増幅反応は例 7 と同様である。

結果を図 17に示す。 PLGをコーティングした不織布にマグネシウムを固定ィ匕した力 ラムの方が明らかに未処理の不織布カラムに比べて不織布上捕捉核酸の増幅時間 が短ぐ尿試料中の核酸の捕捉効率が高いことが示された。

[0083] 例 17： BS A含有洗浄液を使用した不織布上の捕捉核酸の増幅効率

試料は BCG菌由来の精製ゲノム DNA20pgを 0. 3%HSA (SIGMA)生理食塩水 溶液 lmLに溶解させた。該サンプルに 8N NaOHを 30 L添カ卩し最終濃度を 0. 2 Nとした。例 13と同様にマグネシウムを固定ィ匕した不織布を作製し、上記試料の全量 を吸引した後、 0%、 0. 3%、 1%の BSAの TBS Buffer溶液 lmLを吸引して洗浄 した。洗浄後の不織布固定ィ匕カラムを例 13と同様に LAMP増幅反応にかけた。 結果を図 18に示す。洗浄液に BSAが含まれているほど LAMP増幅反応時間が短 縮されることから、核酸を捕捉した不織布を BSAでコーティングすることにより核酸の 増幅反応が早まることが示された。 [0084] 例 20 :金属イオン親和性高分子を添加した試料における不織布上の核酸増幅効率 試料は淋菌由来の精製ゲノム DNAlOOpgを生理食塩水あるいは 7%HSA (SIG MA)生理食塩水溶液 250 μ Lに溶解させた。該サンプルに塩ィ匕マグネシウムを添カロ する場合は 0. 5mM加えた。該サンプルに金属イオン親和性高分子を加える場合は 分子量 8000のポリエチレングリコール（以下 PEG) (SIGMA) 20%水溶液を該サン プルに 50 μ L添カ卩した。各サンプルにそれぞれ 8Ν NaOHを 7. 5 μ L添加し最終 濃度を 0. 2Νとした。不織布固定ィ匕カラムで上記試料の全量を吸引した後、 TBS Β ufferlmLで洗浄した。 LAMP増幅反応液の調製及び不織布固定ィ匕カラムの増幅 反応は例 7と同様である。

結果を図 19に示す。 7%という高濃度のタンパク中ではマグネシウムを添加するだ けでは核酸の捕捉率は高くはなぐ LAMP増幅反応時間が長い。マグネシウムと金 属イオン親和性高分子を共存させることにより、 LAMP増幅反応時間が短くなり、核 酸の捕捉率が高まることが示唆された。以上力 金属イオン親和性高分子はマグネ シゥムと核酸との会合体形成作用を促進することが示された。

図中 (1)ないし (4)は吸引した試料を示し、各試料につき N= 3回ずつ吸引、測定した

(1)淋菌精製ゲノム DNAZ生理食塩水 Ζθ. 2Ν NaOH (ポジティブコントロール、 試料— 1)

(2)淋菌精製ゲノム DNA+ 7%HSAZ生理食塩水 Z0. 2N NaOH (試料— 2)

(3)試料 2 + 0. 5mM MgCl

2

(4)試料 2 + 3. 3% PEG (8K) +0. 5mM MgCl

2

産業上の利用可能性

[0085] 本発明の方法によれば、核酸を含む試料から従来の方法よりも簡便かつ高収率に 核酸を捕捉して回収することができる。また、本発明の方法は、従来の核酸増幅技術 に使用可能な迅速かつ簡便な核酸調製法として利用できる。

Claims

請求の範囲

[1] 試料中の核酸を固相基材表面に捕捉する方法であって、

該試料を pH 12以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：

固相基材表面に固定ィ匕した少なくとも 1種の 2価金属イオンと該試料中の核酸とを結 合させて核酸を捕捉する工程、又は

少なくとも 1種の 2価金属イオンと該試料中の核酸とを結合させた後に該核酸を固相 基材表面に接触させて捕捉する工程

とを含む方法。

[2] 試料中の核酸を検出する方法であって、

試料を pH 12以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：

該試料を pH 12以上に調整する工程と、下記のいずれかの工程：

固相基材表面に固定ィ匕した少なくとも 1種の 2価金属イオンと該試料中の核酸とを結 合させて核酸を捕捉する工程、又は

少なくとも 1種の 2価金属イオンと該試料中の核酸とを結合させた後に該核酸を固相 基材表面に接触させて捕捉する工程

とを含み、さらに該捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列の核酸を増幅させて 検出する工程

を含む方法。

[3] 少なくとも 1種の 2価金属イオンがマグネシウムイオンである請求項 1又は 2に記載の 方法

[4] pH12以上において少なくとも 1種の 2価金属イオンと結合しており固相基材表面に 捕捉された核酸。

[5] 少なくとも下記の工程を含む請求項 1に記載の方法。

(a)核酸を含有する試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物を添加する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料の pHを 12以上に調整し、試料中の核酸と少なくとも 1種の 2価金属イオンとの会合体を形成する工程;及び

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会 合体を捕捉する工程。

[6] 少なくとも下記の工程を含む請求項 1に記載の方法。

(a)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物を添加し、試料中の核 酸と少なくとも 1種の 2価金属イオンとの会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会 合体を捕捉する工程。

[7] 少なくとも下記の工程を含む請求項 2に記載の方法。

(a)核酸を含有する試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物を添加する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料の pHを 12以上に調整し、試料中の核酸と少なくとも 1種の 2価金属イオンとの会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会 合体を捕捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適した オリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液 を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有す る核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。

[8] 少なくとも下記の工程を含む請求項 2に記載の方法。

(a)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物を添加し、試料中の核 酸と少なくとも 1種の 2価金属イオンとの会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会 合体を捕捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適した オリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液 を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有す る核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。

[9] 濾過により固相基材表面に上記の会合体を捕捉する請求項 5から 8のいずれ力 1項 に記載の方法。

[10] 固相基材がフィルターである請求項 5から 9の 、ずれか 1項に記載の方法。

[11] 固相基材が不織布力もなるフィルターである請求項 5から 9のいずれか 1項に記載の 方法。

[12] 少なくとも 1種の 2価金属がマグネシウムである請求項 5から 11のいずれか 1項に記 載の方法。

[13] 核酸を含有する試料に pH12以上で溶解度が 0. 2mM以上の金属イオンを添加する 工程を含む請求項 12に記載の方法。

[14] 試料中の核酸を捕捉するためのキット又は試料中の核酸を捕捉及び検出するため のキットであって、

該試料カゝら核酸を抽出するための試薬；

該試料を pH 12以上にするための試薬；

少なくとも 1種の 2価金属化合物；

固相基材;及び

特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3 燐酸、及び核酸合成酵素

力 なる群力も選ばれる要素のうち少なくとも 2つの要素を含むキット。

[15] pH12以上において少なくとも 1種の 2価金属イオンと結合することにより会合体を形 成しており、かつ固相基材表面に捕捉された核酸。

[16] 少なくとも下記の工程を含む請求項 1に記載の方法。

(a)核酸を含有する試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物及び該少なくとも 1種の 2 価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料の pHを 12以上に調整し、試料中の核酸と少なくとも 1種の 2価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程;及び

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会 合体を捕捉する工程。

[17] 少なくとも下記の工程を含む請求項 1に記載の方法。 (a)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物及び該少なくとも 1種の 2価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加し、試料中の核酸と少なくとも 1種の 2価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程;及び

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会 合体を捕捉する工程。

[18] 少なくとも下記の工程を含む請求項 2に記載の方法。

(a)核酸を含有する試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物及び該少なくとも 1種の 2 価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料の pHを 12以上に調整し、試料中の核酸と少なくとも 1種の 2価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会 合体を捕捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適した オリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液 を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有す る核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。

[19] 少なくとも下記の工程を含む請求項 2に記載の方法。

(a)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(b)工程 (a)で得られた試料に少なくとも 1種の 2価金属化合物及び少なくとも 1種の 2 価金属イオンに親和性を有する高分子化合物を添加し、試料中の核酸と少なくとも 1 種の 2価金属イオン及び高分子化合物との会合体を形成する工程；

(c)工程 (b)で得られた試料を固相基材表面に接触させて固相基材表面に上記の会 合体を捕捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適した オリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液 を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有す る核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。

[20] 濾過により固相基材表面に上記の会合体を捕捉する請求項 16から 19のいずれか 1 項に記載の方法。

[21] 固相基材がフィルターである請求項 16から 20のいずれか 1項に記載の方法。

[22] 固相基材が不織布力もなるフィルターである請求項 16から 21のいずれか 1項に記載 の方法。

[23] 少なくとも 1種の 2価金属がマグネシウムである請求項 16から 22のいずれ力 1項に記 載の方法。

[24] 核酸を含有する試料に pH12以上で溶解度が 0. 2mM以上の金属イオンを添加す ることを特徴とする請求項 23に記載の方法。

[25] 試料中の核酸を捕捉するためのキット又は試料中の核酸を捕捉及び検出するため のキットであって、

該試料カゝら核酸を抽出するための試薬；

該試料を pH 12以上にするための試薬；

少なくとも 1種の 2価金属化合物；

少なくとも 1種の 2価金属イオンに親和性を有する高分子化合物；

固相基材；

特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3 燐酸、及び核酸合成酵素

力 なる群力も選ばれる要素のうち少なくとも 2つの要素を含むキット。

[26] pH12以上において少なくとも 1種の 2価金属イオン及び該 2価金属イオンに親和性 を有する高分子化合物と結合することにより会合体を形成しており、かつ固相基材表 面に捕捉された核酸。

[27] 少なくとも下記の工程を含む請求項 1に記載の方法。

(a)少なくとも 1種の 2価金属イオンを固相基材表面に固定ィ匕する工程；

(b)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程;及び

(c)工程 (a)で得られた固相基材表面に工程 (b)で得られた試料を接触させて、固相基 材表面に核酸を捕捉する工程。

[28] 少なくとも下記の工程を含む請求項 2に記載の方法。

(a)少なくとも 1種の 2価金属イオンを固相基材表面に固定ィ匕する工程；

(b)核酸を含有する試料の pHを 12以上に調整する工程；

(c)工程 (a)で得られた固相基材表面に工程 (b)で得られた試料を接触させて、固相基 材表面に核酸を捕捉する工程；

(d)工程 (c)で得られた固相基材表面に対して、特定塩基配列を増幅するのに適した オリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3燐酸、及び核酸合成酵素を含む溶液 を接触させて、該固相基材表面に捕捉された核酸を铸型として特定塩基配列を有す る核酸を増幅する工程;及び

(e)工程 (d)で増幅された特定塩基配列を有する核酸を検出する工程。

[29] 濾過により固相基材表面に核酸を捕捉する請求項 27又は 28に記載の方法。

[30] 固相基材がフィルターである請求項 27から 29の 、ずれか 1項に記載の方法。

[31] 固相基材が不織布力もなるフィルターである請求項 27から 30のいずれか 1項に記載 の方法。

[32] 固相基材が少なくとも 1種の 2価金属イオンを固定ィヒ可能な残基を有する高分子化 合物を含む請求項 27から 31のいずれか 1項に記載の方法。

[33] 少なくとも 1種の 2価金属イオンを固定ィ匕可能な残基力 Sカルボン酸基である請求項 3

2に記載の方法。

[34] 固相基材が少なくとも 1種の 2価金属イオンを固定ィ匕可能な固相基材層を多層化し た固相基材である請求項 27から 33のいずれ力 1項に記載の方法。

[35] 少なくとも 1種の 2価金属がマグネシウムである請求項 27から 34のいずれ力 1項に記 載の方法。

[36] 固相基材が少なくとも 1種の 2価金属イオンに親和性を有する高分子化合物をコーテ イングした固相基材である請求項 27から 31のいずれか 1項に記載の方法。

[37] 核酸を含有する試料に pH12以上で溶解度が 0. 2mM以上の金属イオンを添加する 工程を含む請求項 35に記載の方法。

[38] 試料中の核酸を捕捉するためのキット又は試料中の核酸を捕捉及び検出するため のキットであって、

該試料カゝら核酸を抽出するための試薬；

該試料を pH 12以上にするための試薬；

少なくとも 1種の 2価金属化合物；

少なくとも 1種の 2価金属イオンを固定ィ匕可能な固相基材；

少なくとも 1種の 2価金属イオンを固定ィ匕した固相基材；

特定塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド 3 燐酸、及び核酸合成酵素

力 なる群力も選ばれる要素のうち少なくとも 2つの要素を含むキット。

[39] pH12以上において固相基材表面に固定ィ匕された少なくとも 1種の 2価金属イオンと 結合することにより該固相基材表面に捕捉された核酸。

[40] 固相基材が酵素吸着抑制剤をコーティングした固相基材である請求項 2、 7、 8、 18

、 19、又は 28のいずれ力 1項に記載の方法。

[41] 酵素吸着抑制剤が牛血清アルブミンである請求項 40に記載の方法。