KR100337046B1 - 연속원심분리기로의 ｄｎａ 의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염색체외 DNA 및 또 다른 세포 성분 함유액을 일정한 조건하에서 연속원심분리기를 통과시켜 다른 세포 성분들로 부터 염색체외 DNA를 분리하여 정제된 염색체외 DNA를 수득하는 염색체외 DNA 의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 클로닝, 형질전환, 트랜스펙션, 세포로의 미세주입, 유전자 요법의 용도, DNA 백신화 또는/및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 위한 정제된 염색체외 DNA 의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염색체외 DNA를 정제하기 위한 연속원심분리기의 용도에 관한 것이다.

Description

연속원심분리기로의 ＤＮＡ 의 정제 방법{METHOD OF PURIFYING DNA IN A CROSS-FLOW CENTRIFUGE}

핵산 및 특히 플라스미드 DNA 의 분리는 분자생물학 및 현대 의학에 있어서 매우 중요하다. 플라스미드 DNA 는 통상 1 kb 내지 200 kb 미만의 크기를 가지며 숙주세포내에 1 내지 수백 카피가 존재하는 염색체외 DNA 두 가닥 사슬 분자를 일컫는다. 플라스미드 DNA 는 통상적으로 세포, 예를 들어, 그람-음성 박테리아, 특히 E. coli 내에서 증폭된다. 이후 세포를 용균시키고 이로 부터 플라스미드 DNA 를 단리한다. 그런 다음, 단리된 플라스미드 DNA 를 분자생물학 분야 또는 의학 분야에 사용하는데, 예를 들어, 클로닝 벡터를 구축하고, 원핵세포를 형질전환하고 진핵세포를 트랜스펙션시킨다. 세포를 용균시켜 플라스미드 DNA 를 단리하는 각종 방법들이 공지되어 있다 (참고, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

세포로 부터 플라스미드 DNA 를 단리하기 위한 Birnboim & Doly 에 의해 개발된 방법에 있어서 [Birnboim & Doly, Nucl. Acid Res. 7 (1979) 1513-1523], 바이오매스(biomass)를 NaOH/세제 용액으로 용균시킨 다음 pH 값을 K 아세테이트로 약 5.0 으로 조정한다. 상기 공정중에 게놈 DNA 및 세포벽 단편들을 주로 함유하는 침전물이 형성된다. 상기 불순물을 제거하기 위해서, 현탁액을 원심분리기 버킷으로 옮긴다. 침전물을 버킷 원심분리기로 원심분리하여 플라스미드 DNA 를 함유하는 상청액을 수득한다.

원심분리기는 또한 예를 들어 세포 및 세포 단편들로 부터 발효 상청액을 분리하기 위해서 발효 공정중에 통상적으로 사용된다. 이를 위해 스크린 원심분리기 및 고정벽 원심분리기가 통상적으로 사용된다 (참고, Gerhartz W., Enzymes in industry: production and applications, 1990, VCH, Weinheim, Germany, chapter 3.2.1).

보편적인 실험실용 원심분리기로 조작될 수 있는 부피는 로터 및 로터 버킷의 부피로 인해 10 리터 미만으로 제한된다 (예를 들어, Sorvall centrifuge, GSA 로터, 6 ×250 ml). 그러므로 상기 방법은 소량의 플라스미드 DNA 를 단리하는데에만 사용될 수 있다. 대규모 공정에 대한 본 방법의 이용은 제한된 원심분리기의 부피로 인해 매우 문제가 있다.

부피가 큰 경우에는 연속원심분리기에 의해 조작될 수 있다. WO92/12780 호에는 연속원심분리기의 기술적 디자인 및 거대분자 혼합물을 분리하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 상기 방법으로 4 개의 표준 단백질은 예를 들어 단백질들의 각각의 분배계수에 따라 최대 1000 rpm 에서 2 개의 수성상 시스템으로 분리된다. 혼합물의 성분들은 용출 시간의 차이로 인해 서로 분리되어 수득된다.

그러나, 연구 및 의약에 있어서 분석 및 치료 용도로서 정제된 플라스미드 DNA 의 수요가 분자생물학적 방법의 사용이 확대되므로 인해 증가되고 있다. 그러므로, 본 발명의 목적은 대량의 플라스미드 DNA 를 효율적이고도 신속하게 정제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 연속원심분리기를 이용한 염색체외 DNA 를 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 첫 번째 목적은, 불용성 세포 성분들로 부터 염색체외 DNA 의 분리를 유도하는 조건하에서 염색체외 DNA 및 기타 세포 성분들을 함유하는 액체를 연속원심분리를 통과시켜 정제된 염색체외 DNA 를 단리시키는 것을 특징으로 하는 염색체외 DNA 의 정제 방법에 관한 것이다.

선행 기술에 있어서, 연속원심분리기는 이전에 세포 분리를 위해서만 사용되어 왔다. 이제 놀랍게도 연속원심분리기가 원심분리로 인해 생긴 전단력으로 인한 염색체외 DNA에 손상을 주지않고 염색체외 DNA를 대량으로 정제하는데도 또한 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 용균된 세포의 현탁액중 존재하는 염색체 DNA가 연속원심분리중에 단편화되지 않으므로 염색체외 DNA 로부터 정량적으로 분리될 수 있다는 것도 또한 놀랄만하다.

본 발명에 따른 방법에 의해 정제된 염색체외 DNA 는 선상 또는 환상, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 상기 DNA 는 바람직하게는 환상인 이중가닥 플라스미드 DNA 이다. 염색체외 DNA를 함유하는 세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있고; 바람직하게는 박테리아 세포 및 특히 E. coli 세포와 같은 그람-음성 세포이다. 경우에 따라, 염색체외 DNA로서 인공 염색체를 함유하는 세포가 사용될 수 있다. 인공 염색체는 일반적으로 YAC (yeast artificail chromosome; 효모 인공 염색체) 이라 불리고 효모 세포내에서 증폭되는 선상 이중가닥 DNA 분자이다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 염색체외 DNA를 함유하는 액체는 바람직하게는 세포 용해질이다. 세포 용해질은 염색체외 DNA를 함유하는 세포를 알칼리 용균시킨 다음 산성화 처리하므로써 제조되는 것이 특히 바람직하다. 그러나, 이는 또한 효소 (리소자임) 및 열 처리법의 조합과 같은 다른 통상적인 세포 용균 방법을 이용하는 것도 가능하다.

세포 바이오매스의 어떠한 요구량도 본 발명에 따른 방법을 위해 출발물질로서 사용될 수 있다. 바람직하게는 배치당 100 g ∼ 50 kg 의 바이오매스가 용균된다.

염색체외 DNA를 함유하는 액체는 통상적으로 농도구배 또는/및 펌프에 의해 연속원심분리기를 통과한다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 연속원심분리기는 용균 제조에 적합한 부피로 사용된다. 적어도 0.1 ∼ 50 리터의 부피가 바람직하게 사용되고 0.2 ∼ 4 리터의 부피가 특히 바람직하게 사용된다. 원심분리 용기는 원통형이 바람직하다. 연속원심분리기는 적합한 g 값, 바람직하게는 10,000 내지 40,000 ×g 으로 작동된다. 시판되는 연속원심분리기의 예로는 현재 9,000 l/h 미만의 용량을 갖는 CEPA 고속 원심분리기 또는 고성능 원심분리기 [Carr Co. (USA) 사제] 가 있다.

본 발명에 따른 방법은 일반적으로 연속적으로 수행된다. 용균된 바이오매스의 현탁액을 하기와 같이 연속원심분리기를 통과시킨다. 원심분리 용기의 회전(10,000 - 40,000 ×g)의 결과로, 세포벽 성분 및 거기에 붙어있는 게놈 DNA 와 같은 고형 성분들이 원심분리 용기의 벽에 침적된다. 염색체외 DNA를 함유하는 용액이 측면, 바닥 또는 다른 위치로 흘러내리는 것을 또한 생각할 수는 있으나, 정제된 염색체외 DNA를 함유하는 용액은 대체적으로 연속원심분리기의 상부를 통과한다.

연속원심분리기는 상이한 온도에서 작동할 수 있고; 이 방법은 바람직하게는 4 ℃ 내지 실온에서 수행된다.

본 방법에 있어서, 상이한 크기의 염색체외 DNA를 정제하는 것이 가능한데; 바람직하게는 크기가 1 kbp ∼ 200 kbp 인 염색체외 DNA가 정제된다. 염색체외 DNA는 바람직하게는 선상, 환상 또는 초나선 플라스미드 DNA 이다.

원심분리기로 부터 꺼낸 후, 염색체외 DNA는 더 정제될 수 있다. 따라서, 용액으로 부터 RNA 를 제거하기 위해 경우에 따라 RNase 처리를 수행한다. 또한, 음이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 또는 히드록실아파타이트 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 정제 단계들을 수행할 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피을 위한 적합한 물질의 예는, 표면상에 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 디메틸아미노에틸(DMAE) 기와 같은 양전하기가 결합되어 있는, 폴리메트아크릴레이트 (Macroprep-Biorad, Germany), 폴리스티렌-디비닐벤젠 (Poros-Perseptive, HyperD-Biosepra, Source Pharmacia) 또는 실리카겔과 같은 유기 또는 무기 중합체 및 공중합체이다. 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 특히 바람직한 물질은 Q-세파로스이다. 친화 크로마토그래피를 위한 특히 바람직한 물질은 히드록실아파타이트이다.

또한, 수득된 DNA 용액은 추가적인 정제, 농축 또는/및 재완충을 위해 교차-유동 (cross-flow) 여과될 수 있다. 상기 교차-유동 여과법에 있어서, DNA 제조물로 부터 엔도톡신의 실질적인 제거를 수행하는 것이 가능하다. 이를 위해서, DNA 용액을 배출 크기가 선택된 하나 또는 수개의 반투막을 접촉하여 통과시키므로써 DNA 분자는 막에 남아있고 저분자량의 물질은 막을 통과하므로서 엔도톡신-유리 DNA 용액을 수득한다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 염색체외 DNA 는 본질적으로 손상되지 않고 단일가닥 또는 이중가닥 절단이 없다. 특히 본 발명에 따라 정제된 플라스미드 DNA 는 겔 전기영동에 의해 분리된 후, '공유결합 폐쇄 환상(covalently closed circle)' 형태에 상응하는 단 하나의 우성 밴드를 나타낸다. 더욱이, 개환상 및 선환상 형태에 상응하는 밴드와 떨어져있는 또 다른 밴드는 없다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 DNA 는 클로닝, 형질전환, 트랜스펙션, 미세주입, 유전자 요법의 용도, DNA 백신화 또는/및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 일반적인 분자생물학 및 의학 용도를 위해 직접적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 면은 염색체외 DNA를 정제하기 위한 연속원심분리기의 용도에 관한 것이다.

실험에서 스테인레스 스틸(1.4571, V4A)로 제조된 정화 실린더가 장착된CEPA 실험실용 원심분리기 LE (오픈 디자인) 가 사용된다. 약 2000 g 바이오매스는 알칼리 용균 방법(Birnboim & Doly에 따른 변형된 방법; Birnboim & Doly, Nucl.Acid Res. 7 (1979) 1513-1523)에 의해 용균된다.

1. E. coli 바이오매스의 용균

발효기로 부터 젖은 E. coli 바이오매스 2000 g 을 디피로겐화된 (depyrogenized) 비이커에 채운다. 22.5 l 의 재현탁 완충액 (50 mmol/l 트리스-HCl, 10 mmol/l EDTA-Na₂, pH 8 ±0.2) 을 첨가하고 상기 바이오매스가 완전히 현탁될 때 까지 5 ±4 ℃ 에서 적어도 24 시간 동안 천천히 교반시킨다 (약 35 rpm). 이어서, 현탁액 온도를 25 ℃ 로 천천히 증가시킨다. 22.5 l 의 0.2 mol/l NaOH, 1 % SDS 를 현탁액에 약 80 rpm 으로 교반하면서 첨가하고 25 ℃ 에서 5 분간 항온배양시킨다. 22.5 l 의 아세트산칼륨 완충액 (3 mol/l 아세트산칼륨 완충액, pH 5.5) 을 교반하에 첨가하고 바이오매스의 온도를 가능한한 급속하게 4 ℃ 로 저하시킨다. 수득된 용균물을 연속적인 병류 (flow-through) 방식으로 연속원심분리기에 의해 여과 제거한다.

2. 연속원심분리

점성의 현탁액을 주입 개구부를 통해 연속원심분리기로 펌프공급한다. 그 동안에 원심분리기를 10,000 ∼ 18,000 ×g 의 g 값으로 작동시킨다. 유출된 액체가 탁해지자마자 침전물을 실린더로 부터 제거해야 하고, 깨끗한 실린더에 삽입한 후 원심분리를 계속한다. 세포성 불순물이 제거된 깨끗한 플라스미드 DNA 용액이 연속원심분리기의 상부에 나타나고, 이를 용기에 수합한다.

3. 추가적인 정제 단계:

Q-세파로스 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 교차-유동 여과

다음 단계로, Q-세파로스 및 히드록시아파타이트상에서의 크로마토그래피를 수행한다. 따라낸 원심분리 상청액을 TE 완충액 (10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA pH 8.5 ±0.2) 를 첨가하여 전도도을 49-50 mS/cm 로 조정하고 5 ±4 ℃ 로 냉각시킨다. 전체 크로마토그래피를 상기 온도에서 수행한다. 원심분리 상청액을 평형화된 컬럼상에 흡수시킨다. 다음으로 컬럼을 약 8 CV 10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA, 0.65 mol/l NaCl pH8.5 ±0.2 로 세척한다.

용출을 위해 농도구배 (5 CV 완충액 A (10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA, 0.65 mmol/l NaCl, pH 8.0 ±2), 5 CV 완충액 B (10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA, 0.85 mol/l NaCl pH 8.0 ±0.2)) 를 컬럼에 적용하여 용출물을 분획화하고, 254 nm 에서 검출을 수행한다. 상승 측면으로 부터 출발하여 주요 피크를 별도의 용기에 수합하므로써 예비피크 (불순물) 을 주요 피크 (플라스미드 DNA)와 분리한다.

다음으로, 히드록시아파타이트 (HA 세라믹)상에서의 크로마토그래피를 5 ±4 ℃ 에서 수행한다.

평형 완충액: 0.1 mol/l 인산칼륨, 6 mol/l 우레아 pH 7.0 ±0.2.

세정 완충액 1: 0.15 mol/l 인산칼륨, 6 mol/l 우레아 pH 7.0 ±0.2.

세정 완충액 2: 0.02 mol/l 인산칼륨 완충액 pH 7.0 ±0.2.

용출 완충액: 0.5 mol/l 인산칼륨 pH 7.0 ±0.2.

검출은 UV 검출기/기록기 장치를 이용하여 254 nm 에서 수행한다. 1 % 생성물 용액 (플라스미드 DNA) 를 보정된 광도계로 측정된 검정 용액으로 사용한다.

Q-세파로스 풀(pool)을 1.1 mmol/l 염화칼슘의 최종 농도로 조정하고 평형화된 컬럼에 흡수시킨다.

이어서 컬럼을 하기와 같이 순차적으로 세정한다:

1. 흡광도가 검출기에서 더 이상 검출될 수 없을 때 까지 0.1 mol/l 인산칼륨, 6 mol/l 우레아 pH 7.0 ±0.2

2. 2-4 CV, 0.15 mmol/l 인산칼륨, 6 mol/l 우레아 pH 7.0 ±0.2

3. 5 CV, 0.02 mol/l 인산칼륨 pH 7.0 ±0.2.

세정 단계후, 5 - 6 CV/h 의 유속의 0.5 mol/l 인산칼륨 완충액 pH 7.0 ±0.1 로 용출시킨다.

피크를 합하여 교차-유동 여과하여 약 50 ml 로 농축시킨다. CFF 를 투석유물 유속 100-200 l/h·m², 약 0.8 바의 막횡단압력 및 약 1.2 바의 교차-유동 압력으로 수행한다. 투석유물은 이어서 TE 완충액 (10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA, pH 8.0) 에 대해 pH 값과 투석유물 및 TE 완충액의 전도도가 일치할 때 까지 플로우 투석여과(diafiltration)한다. 투석여과 공정의 완료 후, 투석유물을 투석여과 완충액으로 희석하여 1 mg/ml 의 플라스미드 DNA 농도로 조정한다.

4. 겔 전기영동

수득된 플라스미드 DNA 의 보존도를 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인한다.

이를 위해서, 플라스미드 DNA 분주를 각종 농도로 아가로스 겔에 적용한다. 예시된 아가로스 겔에서 레인 1 과 10 은 DNA 길이 스탠다드 No. II (단편 크기: 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp) 을 나타내고, 레인 2 및 9 는 DNA 길이 스탠다드 No. III (단편 크기: 125, 564, 831, 947, 1375, 1584, 1904, 2027, 3530, 4268, 4973, 5148, 21226 bp) 를 나타낸다. 통상적인 세슘 클로라이드 농도구배 방법으로 정제된 pBR322 (4162 bp) 를 레인 3 에 대조 플라스미드로 적용한다. 상기 방법으로 정제된 플라스미드 DNA 는 공유결합 폐쇄 환상 형태 (우성 초나선 밴드)에 해당하는 플라스미드 DNA 를 주로 함유한다. 본 발명에 따른 방법으로 정제된 플라스미드 DNA (pCMV-CAT) 를 레인 4, 5 및 6 에 상이한 양으로 적용한다.

본 플라스미드 DNA 는 Q-세파로스 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 교차-유동 여과법에 의해서 본 발명에 따른 방법후에 더 정제된다.

범례:

1 % 아가로스 겔

레인 1 : DNA 길이 스탠다드 II (Boehringer Mannheim GmbH; Cat. No. 236250)

레인 2 : DNA 길이 스탠다드 III (Boehringer Mannheim GmbH; Cat. No. 528552)

레인 3 : pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 481238) (0.4 ㎍)

레인 4 : CFF 후 pCMV-CAT, 0.19 ㎍ (벌크 활성 물질 용액)

레인 5 : CFF 후 pCMV-CAT, 0.45 ㎍ (벌크 활성 물질 용액)

레인 6 : CFF 후 pCMV-CAT, 0.71 ㎍ (벌크 활성 물질 용액)

레인 7 : TE 완충액

레인 8 : pBR322 (Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 481238) (0.4 ㎍)

레인 9 : DNA 길이 스탠다드 III (Boehringer Mannheim GmbH; Cat. No. 528552)

레인 10 : DNA 길이 스탠다드 II (Boehringer Mannheim GmbH; Cat. No. 236250)

본 발명에 따라 정제된 플라스미드 DNA 는, 대조 플라스미드 DNA (레인 3) 과 같이, 주로 우성인 밴드를 나타낸다. 이는 본 발명에 따라 단리된 플라스미드 DNA 는 손상되지 않고 본래 형태를 유지한다는 것으로 나타낸다. 또한, 아가로스 겔중 추가적인 밴드가 없다는 것은 용균된 세포 현탁액에 함유된 크로모좀 DNA 가 연속원심분리중에 단편화되지 않고 플라스미드 DNA 로 부터 침전된 거대분자로서 완전히 분리될 수 있다는 것을 나타낸다.

Claims (17)

1. 염색체외 DNA 및 기타 세포 성분들을 함유하는, 세포 용균물인, 액체를 사전 원심분리 단계없이 연속적인 공정으로 10,000 내지 40,000 ×g 의 가속으로 작동하는 연속원심분리기에 통과시키고, 불용성 세포 성분들로 부터 염색체외 DNA 를 분리하도록 하는 조건을 고수하고, 정제된 염색체외 DNA 가 단리되는 것을 특징으로 하는 염색체외 DNA 의 정제 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 용균이 알칼리 용균인 정제 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염색체외 DNA 를 함유하는 세포가 박테리아 세포인 정제 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 원심분리기를 통과하는 액체가 100 g - 50 kg 바이오매스를 용균시키므로서 수득되는 정제 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염색체외 DNA 를 함유하는 액체가 농도구배 또는/및 펌프에 의해 연속원심분리기를 통과하는 정제 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 원심분리 용기가 적어도 0.1 - 50 l 의 부피인 연속원심분리기가 사용되는 정제 방법.
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 원심분리 용기가 0.2 - 4 l 의 부피인 연속원심분리기가 사용되는 정제 방법.
8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염색체외 DNA 의 크기가 1 kbp - 200 kbp 인 정제 방법.
9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염색체외 DNA 가 선상, 환상 또는 초나선 플라스미드 DNA 인 정제 방법.
10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 정제된 염색체외 DNA 를 함유하는 용액이 더 정제될 수 있는 정제 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 추가적인 정제가 음이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, RNase 처리법 또는/및 교차-유동 여과법으로 이루어지는 정제 방법.
12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염색체외 DNA 가 본질적으로 가닥 절단 없이 단리되는 정제 방법.
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15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염색체외 DNA 를 함유하는 세포가 E. coli 세포인 정제 방법.
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