CN117603958A - 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用 - Google Patents
一种纯化体外转录mRNA的方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117603958A CN117603958A CN202311569051.1A CN202311569051A CN117603958A CN 117603958 A CN117603958 A CN 117603958A CN 202311569051 A CN202311569051 A CN 202311569051A CN 117603958 A CN117603958 A CN 117603958A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mrna
- nacl
- dsrna
- chromatography
- ivt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 110
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 55
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 53
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 27
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 24
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 34
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 7
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- -1 DEAE anion Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 32
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108091005685 RIG-I-like receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000834 2-5A-dependent ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100027962 2-5A-dependent ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011082 depyrogenation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种纯化体外转录（IVT）mRNA的方法及应用。所述方法具体采用氯化锂沉淀法、Oligo dT亲和层析、DEAE离子交换层析的依次联合使用，并对亲和层析的NaCl梯度洗脱进行筛选优化，以及对DEAE离子交换层析和疏水层析进行了比较，选择dsRNA去除效果更好的DEAE离子交换层析。本发明的方法逐步去除mRNA IVT原液中的游离核苷酸、小分子核苷酸片段、蛋白质和dsRNA等杂质，来实现高纯度mRNA样品的制备。本发明方法获得的mRNA纯度可达97%以上，同时还可达到特异性去除dsRNA的效果。通过本发明的方法省时、节约原料，可高效制备高纯度科研级、药用级mRNA制品。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种mRNA，特别是IVT mRNA的纯化方法。
背景技术
体外转录（In vitro transcription，IVT）是一种DNA模板化过程，用于合成长RNA转录本，包括mRNA。在工艺生产中，以线性化质粒DNA为模板、T7 RNA聚合酶（T7 RNApolymerase）为工具，通过体外IVT反应合成mRNA。IVT反应的其他必须组分包括游离核苷酸(NTP)、转录buffer、聚合酶辅因子镁离子、抗氧化剂、亚精胺等。移除IVT反应产生的具有免疫原性的副产物才能确保mRNA药物的高效性和安全性。
利用T7 RNA聚合酶体外转录（IVT）制备mRNA的过程，同时会产生短链RNA、双链RNA（dsRNA, double-stranded RNA）等副产物，其中dsRNA可被RIG-I样受体（RIG-Ilikereceptors，RLRs）识别，继而触发机体的天然免疫反应；另外，dsRNA可激活寡聚腺苷酸合成酶（OSA, oligoadenylates synthesis），从而结合并激活RNase L，导致mRNA发生降解。以上生理机制提示dsRNA的残留量是mRNA药物的关键质量属性，IVT制备mRNA时，需尽可能去除dsRNA，以获得免疫原性较低的功能性mRNA。
现有技术公开了多种mRNA的纯化方法，但仍然存在不同的缺陷。例如专利文献1（CN101563457A，公开日期2009年10月21日）公开了用于制备型纯化RNA的方法，该方法的特征在于使用多孔反相作为固定相利用HPLC来纯化RNA，该发明的一个重要因素是使用多孔反相。然而色谱虽然是使用最为广泛的方法，常常需要加入离子对，该方法的载量低，并需要使用易燃、有毒的溶剂。
专利文献2（CN113166790A，公开日期2021年07月23日）公开了用于纯化mRNA的方法，其涉及通过在包含变性盐与还原剂组合的缓冲液中沉淀体外转录过程(IVT)合成的mRNA，然后捕获沉淀的mRNA以及将捕获的mRNA溶解在溶液中以获得纯化的mRNA，从通过大规模IVT合成的信使RNA制备物中去除杂质。然而该专利方法涉及变性盐和还原剂的使用，且并没有公开获得纯化的mRNA的纯度。
专利文献3（CN115287282A，公开日期2022年11月04日）公开了一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用，所述mRNA工业化分离纯化方法包括以下步骤：将mRNA IVT反应液依次进行亲和层析和疏水层析处理，得到纯化的mRNA。mRNA IVT反应液最初纯度为69％，经第一步亲和层析纯化回收率达到87.1-88.3％，纯度达到89.9-93％，第二步疏水纯化UniHRPhenyl-30L 回收率达89.5-92％，纯度到达94.3-96.5％。采用UniHR Butyl 30L疏水层析填料，去除dsRNA和未加帽RNA；去除RNA二级结构杂质。该专利方法虽然记载采用疏水层析UniHRButyl去除dsRNA，但是其仅是泛泛提及，并没有给出其去除dsRNA的比例的具体实验数据。虽然纯化后纯度可达94.3-96.5％，但是并不能证明其达到特异性去除dsRNA的效果。
可见，虽然现有技术已有mRNA纯化方法，但在提高目标mRNA纯度等各个方面均有待提高，且鉴于目前体外生产mRNA的大量需求，mRNA生产领域亟需同时兼顾产物纯度和特异性去除dsRNA的mRNA纯化方法。
发明内容
针对现有mRNA纯化方法的不足，本发明提供一种高效纯化体外转录（IVT）mRNA的方法及应用。所述方法具体通过氯化锂沉淀法、Oligo dT亲和层析、DEAE离子交换层析的联合使用，并对亲和层析的NaCl梯度洗脱进行筛选优化，以及对DEAE离子交换层析和疏水层析进行了比较，选择采用dsRNA去除效果更好的DEAE离子交换层析。本发明的方法逐步去除mRNAIVT原液中的游离核苷酸、小分子核苷酸片段、蛋白质和双链RNA等杂质，来实现高纯度mRNA样品的制备。
本发明的一方面提供一种纯化体外转录（IVT）mRNA的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
（1）氯化锂沉淀法富集体外转录的mRNA产物；
（2）Oligo dT亲和层析二次纯化mRNA：将所述步骤（1）获得的粗纯mRNA样品载样至Oligo dT柱，采用0.5 M NaCl、0.1 MNaCl逐级梯度洗脱，获得包含mRNA的样品；
（3）DEAE离子交换层析三次纯化mRNA：将所述步骤（2）获得的包含mRNA的样品载样至DEAE阴离子柱，通过淋洗液（wash buffer）洗去未结合的杂质，然后经过洗脱液（elutionbuffer）进行pH梯度洗脱，所述pH梯度为pH 7.2-pH 11，进一步去除mRNA中包含dsRNA的杂质核酸分子，收获体外转录mRNA产品。
进一步地，所述步骤（3）中的所述淋洗液（wash buffer）为50 mM Tris，3 M 氯化钠，20 mM EDTA，所述洗脱液（elution buffer）为20 mM Tris，20 mMBTP，50 mM NaCl，20mM甘氨酸，其中BTP为1,3-双（（三羟甲基）甲基氨基）丙烷。
进一步地，所述步骤（1）包含将体外转录合成的mRNA，利用LiCl沉淀法进行富集，去除反应体系中包含原料的杂质，得到粗纯mRNA样品。
进一步地，所述步骤（1）包含将IVT mRNA合成原液与1.5倍体积的RNase free 水和1.5倍体积的7.5 M氯化锂充分混匀，置于-20℃ 放置40-45 min，然后离心15-20min，去上清，之后用70％的乙醇洗涤沉淀，去乙醇，室温干燥，然后加入合适体积的RNase free水重悬。
进一步地，所述步骤（1）中所述放置的时间为45 min，所述离心的时间为15 min，所述离心的离心力为17900 g。
进一步地，所述步骤（2）包含将步骤（1）得到的粗纯mRNA样品以1：9比例加入高盐上样缓冲液中，载样至Oligo dT柱，之后采用0.5 M NaCl、0.1 MNaCl逐级梯度洗脱，最后经10 mM TE缓冲液洗脱mRNA，获得包含mRNA的样品。
进一步地，所述高盐上样缓冲液为10 mM TE缓冲液加上0.5 M NaCl，所述TE缓冲液包含Tris-HCl和EDTA，具体TE缓冲液为10 mM Tris-HCl+1 mM EDTA。
进一步地，所述步骤（3）最终获得的体外转录mRNA产品纯度大于97%，dsRNA残留率小于8‰（万分之八）。
本发明的另一方面提供纯化体外转录（IVT）mRNA的方法在mRNA制备领域的应用。
进一步地，所述mRNA制备领域为科研级和/或药用级mRNA制备领域。
本发明的纯化体外转录mRNA的方法具有如下有益的技术效果：
1. 本发明的方法具体通过氯化锂沉淀法、Oligo dT亲和层析、DEAE离子交换层析的联合使用，实现了科研级和/或药用级mRNA的制备。
2. 通过本发明的三步纯化方法，最终获得的体外转录mRNA产品纯度大于97%，dsRNA残留率小于8‰。
3.对于步骤（2）的Oligo dT亲和层析，设置了4组不同的NaCl梯度洗脱，通过优化筛选，选择了效率最高的NaCl洗脱方式（0.5 M NaCl-0.1 M NaCl），节约了流动相等试剂并节省了整个亲和层析的时间。
4. 通过Oligo dT纯化后的DEAE步骤，可有效去除dsRNA，Oligo dT纯化样品中dsRNA占比为0.090 ng/µg，DEAE纯化样品中dsRNA占比为0.071 ng/µg。相对OligodT样品，DEAE纯化样品dsRNA去除率为21.43%。
5. 为了比较步骤（3）纯化采用不同种类层析的技术效果，为DEAE离子交换层析步骤设置了对照例，即疏水层析butyl层析，检测其对于dsRNA的去除效果。实验结果表明，DEAE离子交换层析对于dsRNA的去除率为21.4%，疏水层析butyl层析对于dsRNA的去除率为7.89%。本发明优选的步骤（3）采用的DEAE离子交换层析对于dsRNA的去除效果明显优于疏水层析butyl层析。
附图说明
图1为本发明第1组NaCl梯度（0.5 M NaCl-0.4 M NaCl-0.3 M NaCl-0.2 M NaCl-0.1 M NaCl逐级洗脱）OligodT亲和层析结果图。
图2为本发明第2组NaCl梯度（0.5 M NaCl-0.3 M NaCl-0.2 M NaCl-0.1 M NaCl逐级洗脱）Oligo dT亲和层析结果图。
图3为本发明第3组NaCl梯度（0.5 M NaCl-0.2 M NaCl-0.1 M NaCl逐级洗脱）Oligo dT亲和层析结果图。
图4为本发明第4组NaCl梯度（0.5 M NaCl-0.1 M NaCl逐级洗脱）Oligo dT亲和层析结果图。
图5为本发明4组不同梯度洗脱后获得的样品的电泳图；其中从左至右，第1泳道RL6000为标准分子量，第2泳道0.4M NaCl洗杂为本发明第1组NaCl梯度洗脱样品，第3泳道0.3M NaCl洗杂为本发明第2组NaCl梯度洗脱样品，第4泳道0.2M NaCl洗杂为本发明第3组NaCl梯度洗脱样品，第5泳道0.1M NaCl洗杂为本发明第4组NaCl梯度洗脱样品，第6泳道mRNA eGFP原样为本发明实施例1纯化后获得的mRNA样品。
图6为本发明实施例3的DEAE离子交换层析纯化mRNA色谱图。
图7为本发明实施例3 的DEAE离子交换层析法纯化获得mRNA样品的HPLC检测结果。
图8为本发明实施例4的DEAE离子交换层析纯化mRNA色谱图。
图9为本发明实施例4的疏水层析butyl层析纯化mRNA色谱图。
图10为本发明实施例4的DEAE离子交换层析洗脱后获得的样品的电泳图；其中从左至右，第1泳道RL6000为标准分子量，第2泳道为dsRNA+mRNA原样，第3泳道Elu3为洗脱阶段的第一个峰（富集dsRNA）, 第4泳道Elu8为洗脱阶段的第二个峰（目的峰），第5泳道洗杂为淋洗阶段的收集峰，第6泳道CIP为CIP阶段（系统清洁、除热原、对设备和层析柱清洁以及再生的阶段）的收集峰。
图11为本发明实施例4的疏水层析butyl层析洗脱后获得的样品的电泳图；其中从左至右，第1泳道为RNA Marker，第2泳道为dsRNA+mRNA原样，第3泳道流穿峰1为流穿阶段的第一个峰, 第4泳道流穿峰2为流穿阶段的第二个峰，第5泳道洗脱峰1为洗脱阶段的第一个峰，第6泳道洗脱峰2为洗脱阶段的第二个峰（目的峰）。
具体实施方式
下面结合附图和实施案例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施案例中主要采用常规的基因工程分子生物学方法、层析介质等，这些方法是本领域普通生物技术人员所熟知的。
本发明实施例采用的试剂和仪器均是本领域商业可售，均可购买获得。
实施例1 LiCl沉淀法纯化IVT合成的mRNA-eGFP反应原液
向待纯化IVT mRNA-eGFP反应原液（以mRNA-eGFP为示例，不限于此，可用于任意目标基因的mRNA IVI反应原液），此反应原液为IVT反应后的添加DNaseI去除了DNA的混合液，在原液中加入1.5倍体积的RNase free 水和1.5倍体积的 7.5M氯化锂，充分混匀，置于-20℃冰箱45 min。以最大离心力，17900g，离心15min，去上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，去乙醇，室温干燥，加入合适体积的RNase free 水重悬，-20℃冻存或直接进行后续纯化。
实施例2 Oligo dT亲和层析法洗脱梯度优化纯化mRNA
将实施例1纯化后获得的mRNA样品以1：9比例加入高盐（10 mM TE + 0.5 M NaCl）上样缓冲液中，载样至Oligo dT柱（厂家：纳微），设置4个不同的梯度洗脱优化筛选，第1组为0.5 M NaCl-0.4 M NaCl-0.3 M NaCl-0.2 M NaCl-0.1 M NaCl逐级洗脱。第2组为0.5 MNaCl-0.3 MNaCl-0.2 M NaCl-0.1 M NaCl逐级洗脱，即去掉0.4 M NaCl梯度。第3组为0.5M NaCl-0.2 M NaCl-0.1 M NaCl逐级洗脱，即去掉0.4 M NaCl、0.3 M NaCl梯度。第4组为0.5 M NaCl-0.1 M NaCl逐级洗脱，即去掉0.4 MNaCl、0.3 M NaCl、0.2 M NaCl梯度。
NaCl洗脱去除蛋白质和小分子核酸片段，最后经10 mM TE洗脱, 收集洗脱峰得到纯度较高mRNA-eGFP样品，-20℃冻存或直接进行后续纯化。
对于4组不同的NaCl梯度洗脱，第1组、第2组、第3组、第4组层析结果分别如图1、图2、图3、图4所示，4组梯度洗脱后获得的样品采用电泳检测，结果如图5所示。结果表明：这4组不同的NaCl梯度洗脱具有相似的洗脱效果，层析结果和电泳结果均表明，4组不同NaCl梯度洗脱获得的mRNA样品纯度相似。因此选择第4组的梯度洗脱（0.5 M NaCl-0.1 M NaCl）用于后续实施例的实验。通过本实施例的优化筛选，选择了效率最高的NaCl洗脱方式（0.5 MNaCl-0.1 M NaCl），节约了流动相等试剂并节省了整个亲和层析的时间。
实施例3 DEAE离子交换层析法纯化mRNA样品
将实施例2 Oligo dT（采用第4组NaCl梯度洗脱）纯化得到的mRNA-eGFP样品载样至DEAE阴离子柱（厂家：纳微），之后通过wash buffer（50 mM Tris, 3 M氯化钠，20 mMEDTA）洗去未结合的杂质，然后经过elutionbuffer（20 mM Tris, 20mM BTP, 50 mM NaCl,20 mM甘氨酸）连续pH梯度洗脱（pH 7.2-pH 11）, 该步骤层析图如图6所示。最后收获高纯度mRNA制品， HPLC检测结果如图7所示，经计算mRNA纯度为97.63%。
此外，将实施例2的Oligo dT纯化后的样品与Oligo dT后再经过DEAE纯化的样品进行去除dsRNA效果的比较，检测结果如下表1。
表1 Oligo dT 与DEAE纯化样品检测结果
由此可见，通过Oligo dT纯化后的DEAE步骤，可有效去除dsRNA，Oligo dT纯化样品中dsRNA占比为0.090 ng/µg，DEAE纯化样品中dsRNA占比为0.071 ng/µg。相对Oligo dT样品，DEAE纯化样品dsRNA去除率为21.43%。采用dsRNA（修饰）定量检测试剂盒（酶联免疫法）（厂家诺唯赞，产品编号DD3508），检测获得DEAE步骤后的dsRNA残余量，其小于万分之八。
综上，通过本发明三步纯化，即LiCl沉淀、Oligo dT、DEAE离子交换层析依次纯化后，获得的mRNA样品纯度为可达97.63%，dsRNA残余量小于8‰。
DEAE纯化得到的mRNA样品溶液经超滤浓缩换液后溶解于RNase free水，-20℃冻存，可用于后续应用。
实施例4针对dsRNA去除的疏水层析butyl层析对照例
为了比较第三步纯化采用不同种类层析的技术效果，为DEAE离子交换层析步骤设置了对照例，即疏水层析butyl层析，检测其对于dsRNA的去除效果。将实施例2 Oligo dT层析获得的mRNA样品，添加样品中dsRNA占比1/3，整体浓度4.9mg/ml的eGFP mRNA（dsRNA-mRNA 混合物），额外添加dsRNA的目的是提高浓度和总量，便于dsRNA检测和对比。分别用实施例3中的DEAE离子交换层析步骤，疏水层析butyl层析来纯化，其中疏水层析butyl层析具体采用100% 20mM TE+1.5M（NH4）2SO4梯度至100% 20mM TE来洗脱纯化。
结果：添加dsRNA的mRNA样品纯化后，DEAE离子交换层析纯化mRNA色谱图如图8所示，疏水层析butyl层析纯化mRNA色谱图如图9所示。DEAE离子交换层析纯化后的样品，进行电泳检测，结果如图10所示。疏水层析butyl层析纯化后的样品，进行电泳检测，结果如图11所示。
结果表明：图10表明，对于dsRNA主要条带（3000分子量），DEAE离子交换层析的Elu8洗脱，可明显去除dsRNA。图11表明，对于dsRNA主要条带（3000分子量），butyl层析洗脱峰2仍然残留较明显条带，未被有效去除。进一步琼脂糖凝胶电泳和ELISA法检测计算，DEAE离子交换层析对于dsRNA的去除率为21.4%，疏水层析butyl层析对于dsRNA的去除率为7.89%。可见，第三步骤采用的DEAE离子交换层析对于dsRNA的去除效果明显优于疏水层析butyl层析。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纯化体外转录（IVT）mRNA的方法，其特征在于，所述方法依次包含如下步骤：
（1）氯化锂沉淀法富集体外转录的mRNA产物；
（2）Oligo dT亲和层析二次纯化mRNA：将所述步骤（1）获得的粗纯mRNA样品载样至Oligo dT柱，采用0.5 M NaCl、0.1 M NaCl逐级梯度洗脱，获得包含mRNA的样品；
（3）DEAE离子交换层析三次纯化mRNA：将所述步骤（2）获得的包含mRNA的样品载样至DEAE阴离子柱，通过淋洗液洗去未结合的杂质，然后经过洗脱液进行pH梯度洗脱，所述pH梯度为pH 7.2-pH 11，进一步去除mRNA中包含dsRNA的杂质核酸分子，收获体外转录mRNA产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的所述淋洗液为50 mMTris，3 M 氯化钠，20 mM EDTA，所述洗脱液为20 mM Tris，20 mM BTP，50 mM NaCl，20 mM甘氨酸，其中所述BTP为1,3-双（（三羟甲基）甲基氨基）丙烷。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）采用将体外转录合成的mRNA利用LiCl沉淀法进行富集，去除反应体系中包含原料的杂质，得到粗纯mRNA样品。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）采用将IVT mRNA合成原液与1.5倍体积的RNase free 水和1.5倍体积的7.5 M氯化锂充分混匀，置于-20℃ 放置40-45min，然后离心15-20 min, 去上清，之后用70％的乙醇洗涤沉淀，去乙醇，室温干燥，然后加入合适体积的RNase free水重悬。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述放置的时间为45min，所述离心的时间为15 min，所述离心的离心力为17900 g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）包含将步骤（1）得到的粗纯mRNA样品以1：9比例加入高盐上样缓冲液中，载样至Oligo dT柱，之后采用0.5 M NaCl、0.1M NaCl逐级梯度洗脱，最后经10 mM TE缓冲液洗脱mRNA，获得包含mRNA的样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述高盐上样缓冲液为10 mM TE缓冲液加上0.5 M NaCl，所述TE缓冲液包含Tris-HCl和EDTA，其中Tris-HCl浓度10 mM，EDTA 浓度为1 mM。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）最终获得的体外转录mRNA产品纯度大于97%，dsRNA残留率小于8‱。
9.权利要求1-8任一项所述纯化体外转录（IVT）mRNA的方法在mRNA制备领域的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述mRNA制备领域为科研级和/或药用级mRNA制备领域。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311569051.1A CN117603958A (zh) | 2023-11-23 | 2023-11-23 | 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311569051.1A CN117603958A (zh) | 2023-11-23 | 2023-11-23 | 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117603958A true CN117603958A (zh) | 2024-02-27 |
Family
ID=89959046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311569051.1A Pending CN117603958A (zh) | 2023-11-23 | 2023-11-23 | 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117603958A (zh) |
-
2023
- 2023-11-23 CN CN202311569051.1A patent/CN117603958A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11866696B2 (en) | Analytical HPLC methods | |
| EP2588609B1 (en) | Method and kit for sequential isolation of nucleotide species from a sample | |
| EP1994142B1 (en) | Methods and compositions for the rapid isolation of small rna molecules | |
| US6812341B1 (en) | High efficiency mRNA isolation methods and compositions | |
| US20100221788A1 (en) | Method for recovering short rna, and kit therefor | |
| EP2066792B1 (en) | Nucleic acid purification method using anion exchange | |
| EP3578652A1 (en) | Ribonucleic acid purification | |
| CN111235198B (zh) | 规模化合成长链rna的方法及其定点修饰的方法 | |
| WO2022266389A1 (en) | Alternative rna purification strategies | |
| WO2023018923A1 (en) | Multicolumn chromatography mrna purification | |
| US20230193239A1 (en) | Polynucleotide purification with monolith columns | |
| Freitas et al. | Plasmid purification by hydrophobic interaction chromatography using sodium citrate in the mobile phase | |
| AU2021377284A1 (en) | Methods of oligonucleotide-based affinity chromatography | |
| CN117603958A (zh) | 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用 | |
| Cheng et al. | Methods for isolation of messenger RNA from biological samples | |
| US20070275920A1 (en) | Method for Chromatographic Separation of a Nucleic Acid Mixture | |
| EP2250182B1 (en) | Isolation of dna, rna and protein from a single sample | |
| CN114907430A (zh) | 一种mRNA的分离纯化方法 | |
| Paredes et al. | SMB operation for three-fraction separations: purification of plasmid DNA | |
| CN114540344B (zh) | 一种筛选适配体的方法 | |
| US20220364078A1 (en) | Mrna large scale synthesis and purification | |
| US20060199203A1 (en) | Extraction of high-purity DNA and RNA | |
| WO2022214066A1 (zh) | 纤维素色谱纯化rna的方法 | |
| EP4257685A1 (en) | Methods for the removal of double- and/or multi-stranded nucleic acid impurities from rna preparations by low ph treatment | |
| CN116287123A (zh) | 一种制备长单链dna的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |