CN114907430A - 一种mRNA的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种mRNA的分离纯化方法，所述mRNA的分离纯化方法包括将待分离纯化的mRNA原料经过两次疏水层析进行分离纯化。利用本发明方法得到的mRNA回收率高，纯度高；避免使用价格昂贵的层析介质，成本相对较低；操作简单并且能在室温下进行操作，并且无需有毒试剂，易于放大到工业化规模生产。总之，本发明提供了一种简便、成本低、易于放大的分离纯化获得高收率、高纯度的mRNA的方法，具有很好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于本发明属于核糖核酸分离纯化技术领域，涉及一种mRNA的分离纯化方法。
背景技术
核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)在生物学、医学和纳米技术等领域中有着广泛的应用。其中，信使RNA(Messenger RNA，mRNA)在蛋白质的合成中主要作为编码遗传信息的载体而发挥作用，天然mRNA具有单链结构，由5`端结合的7-甲基鸟苷残基(5`-cap)和3`端poly A尾组成。5`端的7-甲基鸟苷帽子结构以及3`端的poly A尾巴不仅对于mRNA的结构起着稳定作用而且对于mRNA在细胞质中的翻译效率也有着很大的影响。
基于mRNA的疗法近年来受到广泛关注，因为mRNA只需要到达细胞的细胞质进行翻译便可以产生目标蛋白，极大提高了治疗效率，同时mRNA不会插入到宿主细胞的基因组中，极大程度地降低了插入所产生的突变风险，提高了mRNA治疗的安全性。除此之外用于治疗的mRNA只产生瞬时翻译并通过生理途径完全降解。目前，mRNA已被用于疫苗、肿瘤治疗和基因编辑等领域的研究中。
获得高纯度的mRNA是保证mRNA相关疗法的安全性和有效性的关键。目前，治疗用的mRNA是在T7聚合酶的作用下，以线性化的质粒为模板通过体外转录合成。转录后的mRNA中主要存在转录相关的RNA聚合酶、DNA模板、核苷三磷酸(NTPs)底物、以及转录副产物(dsRNA，短转录物)等杂质组分；这些杂质不仅会对mRNA后续加帽过程的效率产生影响，更会影响到最终产品的安全性，例如双链RNA的存在会引起I型干扰素上升，进而引起先天免疫激活反应。此外，与未纯化转录本相比，经过纯化之后，mRNA疫苗有蛋白表达率提高1000倍，因此需要对这些杂质进行去除。
RNA常用的纯化的方法包括沉淀法、溶剂法、超速离心法、聚丙烯酰胺法、膜分离法和色谱纯化法。其中，色谱法是目前工业生产中最常用的纯化方法，纯化mRNA常用的方法包括：凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析、反相离子对色谱层析、纤维素色谱层析、反相色谱层析、羟基磷灰石层析等方法；这些方法均有各自的优缺点，例如oligo(dT)亲和层析尽管具有较高的特异性，与oligo dT的杂交亲和性可用于捕获，但它具有一些局限性，其载量低、成本高，它无法区分ssRNA和dsRNA，也无法根据大小对mRNA进行分级分离，完整的产品、不完整的转录体、寡聚体、片段、聚体，任何具有可结合poly-A尾巴的物质都会与所有其他物种一起洗脱；凝胶过滤层析无法去除分子量相近的异常mRNA，如ds RNA；阴离子交换无法分辨mRNA和DNA模板；而反相离子对色谱和反相色谱则需使用有机溶剂。因此，难以经过一步纯化获得较纯的mRNA，需要多种方法进行组合，常采用亲和粗纯加精纯组合进行纯化。此外，上述部分方法需要采用高温纯化来提高分辨率和纯化效率，这进一步增加了纯化的复杂性和成本。
因此，提供一种简单高效的纯化方法对于mRNA的研究和应用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种mRNA的分离纯化方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种mRNA的分离纯化方法，所述mRNA的分离纯化方法包括将待分离纯化的mRNA原料经过两次疏水层析进行分离纯化。
优选地，所述待分离纯化的mRNA原料由DNA转录得到，所述转录后还任选地包括加帽和/或加尾。
优选地，所述待分离纯化的mRNA原料是在T7聚合酶的作用下，以线性化的质粒为模板通过体外转录获得，所述转录后还任选地包括加帽和/或加尾。
优选地，所述mRNA的分离纯化方法包括如下步骤：
(1)将待分离纯化的mRNA原料进样至疏水层析柱中，用平衡缓冲液冲洗疏水层析柱，收集穿透组分，吸附组分弃去或重复利用；
(2)将穿透组分进样至疏水层析柱中，用平衡缓冲液冲洗疏水层析柱，后用流动相进行洗脱，根据260nm处的紫外吸收信号，收集mRNA组分。
优选地，步骤(1)和步骤(2)所述疏水层析柱中层析介质各自独立地包括琼脂糖凝胶类、琼脂糖凝胶类、葡聚糖凝胶类、硅胶微球类、聚甲基丙烯酸酯微球类、聚乙烯-二乙烯基苯微球类或其他聚合物类，配基各自独立地包括丁基、苯基、辛基或丁基硫中的任意一种。
优选地，步骤(1)中疏水层析柱所用配基为丁基，步骤(2)中疏水层析柱所用配基为丁基或辛基。
优选地，步骤(1)和步骤(2)所述进样前还包括利用平衡缓冲液平衡疏水层析柱。
优选地，若步骤(1)所用的疏水层析柱需要在步骤(2)继续使用，则步骤(2)所述进样前还包括利用氢氧化钠清洗疏水层析柱，后利用平衡缓冲液平衡疏水层析柱。
优选地，所述洗脱中，流动相包括A相和B相，A相为平衡缓冲液，B相为洗脱液。
优选地，所述洗脱的方式包括梯度洗脱。
优选地，所述梯度洗脱的方式包括线性梯度洗脱或阶梯梯度洗脱。
优选地，所述洗脱是指洗脱10-50个柱体积。
上述10-50中的具体数值例如10、15、20、25、30、35、40、45、50等。
优选地，步骤(1)所述平衡缓冲液为添加有0.3-1.2M无机盐的缓冲溶液，步骤(2)所述平衡缓冲液为添加有1.3-3M无机盐的缓冲溶液，所述无机盐包括氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁或硫酸铵中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如氯化钠和硫酸钠的组合、硫酸铵和氯化钠的组合、硫酸铵和氯化钾的组合等，其他任意的组合方式均可。
所述缓冲溶液包括柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液或碳酸盐缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
上述0.3-1.2M中的具体数值例如0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M等。
上述1.3-3M中的具体数值例如1.3M、1.6M、1.8M、2.0M、2.2M、2.4M、2.6M、2.8M、3.0M等。
优选地，步骤(1)和步骤(2)所述进样前还包括向待分离纯化的mRNA原料及穿透组分中添加与平衡缓冲液中相同且等浓度的无机盐，所述无机盐包括氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁或硫酸铵中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述缓冲溶液的浓度为5-50mM，例如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM等。
优选地，所述平衡缓冲液的pH值为6.0-8.0，例如6.0、6.2、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4、7.8、8.0等。
优选地，所述洗脱液包括水或缓冲溶液，所述缓冲溶液包括柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液或碳酸盐缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述缓冲溶液的浓度为5-50mM，例如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM等。
优选地，所述洗脱液的pH值为6.0-8.0，例如6.0、6.2、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4、7.8、8.0等。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明充分利用疏水层析的特点，将两步疏水层析进行组合对mRNA进行纯化，区别于现有的亲和捕获、吸附式疏水层析精纯的工艺，利用mRNA和转录产物中的杂质疏水性的差异，创新性的引入穿透式和吸附式疏水色谱组合的工艺，将疏水层析既用于粗纯，也用于精纯。首先，第一步疏水层析利用在无机盐浓度为0.3-1.2M时，合成mRNA的体外转录体系中的大部分杂质，包括RNA聚合酶、焦磷酸酶、以及模板DNA与疏水介质结合保留在色谱柱中，而mRNA、NTPs(核苷三磷酸)、双链RNA以及不完整的转录体在该条件下无法和疏水介质结合从色谱柱中穿透；第二步疏水层析调整盐浓度为1.3-3M，从第一步中穿透出的mRNA和双链RNA与疏水介质结合，而NTPs在该条件下无法和疏水介质结合从色谱柱中穿透，进一步通过设置不同盐浓度的条件，将mRNA和双链RNA分别洗脱，从而得到高纯度的mRNA。
利用本发明方法得到的mRNA回收率高，纯度高(酶、转录不完全的mRNA、DNA模板、双链RNA、核苷三磷酸等杂质的去除率高)；避免使用oligo(dT)等价格昂贵的介质，成本相对较低；操作简单并且能在室温下进行操作，并且无需有毒试剂，易于放大到工业化规模生产。总之，本发明提供了一种简便、成本低、易于放大的分离纯化获得高收率、高纯度的mRNA的方法，具有很好的实际应用价值。
附图说明
图1是下述实施例中mRNA的分离纯化方法的流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
制备例1
本制备例提供一种mRNA转录体系，其制备方法如下：
1.配制10×Transcription Buffer(转录缓冲液)：500mM pH 8.0的Tris-HCl、50mM KCl、10mM MgCl2、10mM DTT(二硫苏糖醇)。
2.将T7RNA Polymerase Mix(聚合酶混合物)，置于冰上。解冻核苷三磷酸(ATP、CTP、GTP、UTP)，混匀并离心至管底，10×Transcription Buffer置于室温，4种核苷三磷酸置于冰上，备用。
3.依次加入10×Transcription Buffer 180μL、RNase Free Water(无RNA酶水)710μL、NTP(核苷三磷酸)144μL、DNA模板630μL、T7 90μL、RNase inhibitor(RNA酶抑制剂)45μL和焦磷酸酶1.8μL，用移液器轻轻混匀各组分，37℃孵育5h。
4.在每个离心管中加入90μL的DNase I(DNA酶I)，37℃孵育25min，消化转录的DNA模板(此步骤可选择性采用，不影响本发明的mRNA纯化效果)。
制备例2
本制备例提供一种mRNA加帽体系，其制备方法如下：
1.10×Capping Buffer(加帽缓冲液)的配方如下：400mM Tris-HCl(25℃下pH为7.9)，60mM MgCl2，100mM DTT，100mM NaCl，20mM spermidine(亚精胺)。
2.加帽反应操作步骤(反应体系100μL)
以50μg mRNA的加帽反应为例，本领域技术人员可以根据实际实验需要放大。
1)用RNase-free water将适量mRNA稀释至67μL；
2)将mRNA置于65℃加热10min，结束后冰上放置5min；
3)依次加入以下各组分：RNA 67μL、10×Capping Buffer 10μL、GTP(10mM)10μL、SAM(20mM，S-腺苷甲硫氨酸)2.5μL、RNA酶抑制剂(40U/μL)2.5μL、mRNA Cap 2′-O-甲基转移酶(100U/μL)4μL和牛痘病毒加帽酶(10U/μL)4μL。
4)37℃反应30min。mRNA加帽完成。
实施例1
本实施例提供一种mRNA的分离纯化方法，具体步骤如下：
平衡缓冲液A1(第一步疏水用)：50mM磷酸钠缓冲液，1.0M硫酸铵，5mM EDTA，pH7.0
平衡缓冲液A2(第二步疏水用)：50mM磷酸钠缓冲液，2.0M硫酸铵，5mM EDTA，pH7.0
洗脱缓冲液B：50mM磷酸钠缓冲液，5mM EDTA，pH 7.0
第一步疏水层析：取1mL经过DNA酶处理的绿色荧光蛋白mRNA转录液(由绿色荧光蛋白DNA转录得到，转录方法参照制备例1中步骤1-4)，mRNA含量为300μg/mL，使用离心机在4℃下将转录液以12000转离心2分钟后收集上清组分。加入硫酸铵粉末调节调节上清中硫酸铵浓度为1.0M，进样至用平衡缓冲液A1平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内介质体积为0.5mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A1继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，收集穿透组分1.2mL。层析介质用0.5M NaOH清洗5CV(柱体积)后再用纯水清洗5CV。
第二步疏水层析：加入硫酸铵粉末调节疏水层析穿透组分中硫酸铵终浓度为2.0M，进样至用平衡缓冲液A2平衡好的上述Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，介质体积为0.5mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A2继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液A2作为A相，用洗脱缓冲液B作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％B相至100％B相，梯度洗脱为20个柱体积，分步收集洗脱组分，最后一个洗脱组分即为纯化后的mRNA。
实施例2
本实施例提供一种mRNA纯化方法，具体步骤如下：
平衡缓冲液A1(第一步疏水)：20mM Tris-HCl缓冲液，1.0M硫酸铵，2mM EDTA，pH7.4
平衡缓冲液A2(第二步疏水)：20mM Tris-HCl缓冲液，2.0M硫酸铵，2mM EDTA，pH7.4
洗脱缓冲液B：20mM Tris-HCl缓冲液，2mM EDTA，pH 7.4
第一步疏水层析：取1mL经过DNA酶处理的绿色荧光蛋白mRNA转录液，mRNA含量为300μg/mL，使用离心机在4℃下将转录液以12000转离心2分钟后收集上清，加入硫酸铵粉末调节上清中硫酸铵浓度为1.0M，进样至用平衡缓冲液A1平衡好的Capto phenyl疏水层析柱中，柱内介质体积为0.5mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A1继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，收集穿透组分。
第二步疏水层析：加入硫酸铵粉末调节疏水层析穿透组分中硫酸铵终浓度为2.0M，进样至用平衡缓冲液A2平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，介质体积为0.5mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A2继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液A2作为A相，用洗脱缓冲液B作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％B相至100％B相，梯度洗脱为30个柱体积，分步收集洗脱组分。
实施例3
平衡缓冲液A1(第一步疏水)：20mM HEPES缓冲液，1.2M氯化钠，2mM EDTA，pH 7.2
平衡缓冲液A2(第二步疏水)：20mM HEPES缓冲液，1.8M氯化钠，2mM EDTA，pH 7.2
洗脱缓冲液B：20mM HEPES缓冲液，2mM EDTA，pH 7.2
第一步疏水层析：取3mL经过DNA酶处理的绿色荧光蛋白mRNA转录液，mRNA含量为300μg/mL，使用离心机在4℃下将转录液以12000转离心2分钟后收集上清组分。加入氯化钠粉末调节上清中氯化钠浓度为1.2M，进样至用平衡缓冲液A1平衡好的Octyl疏水层析柱中，柱内介质体积为1.0mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A1继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，收集穿透组分。
第二步疏水层析：加入氯化钠粉末调节疏水层析穿透组分中氯化钠终浓度为1.8M，进样至用平衡缓冲液A2平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，介质体积为1mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A2继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液A2作为A相，用洗脱缓冲液B作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％B相至100％B相，梯度洗脱为50个柱体积，分步收集洗脱组分并检测。
实施例4
平衡缓冲液A1(第一步疏水)：50mM醋酸钠缓冲液，1.0M硫酸钠，2mM EDTA，pH 6.0
平衡缓冲液A2(第二步疏水)：50mM醋酸钠缓冲液，2.2M氯化钾，2mM EDTA，pH 6.0
洗脱缓冲液B：无菌无酶水，pH 7.2
第一步疏水层析：取1mL经过DNA酶处理的绿色荧光蛋白mRNA转录液，mRNA含量为500μg/mL，使用离心机在4℃下将转录液以10000转离心3分钟后收集上清。加入硫酸钠粉末调节上清中硫酸钠浓度为1.0M，进样至用平衡缓冲液A1平衡好的大孔Butyl-S疏水层析柱中，柱内介质体积为1.0mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A1继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，收集穿透组分。
第二步疏水层析：加入氯化钾粉末调节疏水层析穿透组分中氯化钾终浓度为2.2M，进样至用平衡缓冲液A2平衡好的Phenyl(high sub)疏水层析柱中，介质体积为1mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A2继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液A2作为A相，用洗脱缓冲液B作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％B相至100％B相，梯度洗脱为10个柱体积，分步收集洗脱组分并检测。
实施例5
平衡缓冲液A1(第一步疏水)：30mM磷酸钠缓冲液，1.0M硫酸铵，2mM EDTA，pH 7.1
平衡缓冲液A2(第二步疏水)：30mM磷酸钠缓冲液，2.0M硫酸铵，2mM EDTA，pH 7.1
洗脱缓冲液B：30mM磷酸钠缓冲液，2mM EDTA，pH 7.1
第一步疏水层析：取1mL未经过DNA酶处理的流感mRNA转录液(由流感DNA转录得到，转录方法参照制备例1中步骤1-3)，mRNA含量为600μg/mL，使用离心机在4℃下将上述转录液以10000转离心2分钟后收集上清。加入硫酸铵粉末调节上清中硫酸铵浓度为1.0M，进样至用平衡缓冲液A1平衡好的大孔Octyl疏水层析柱中，柱内介质体积为1.0mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A1继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，收集穿透组分。
第二步疏水层析：加入硫酸铵粉末调节疏水层析穿透组分中硫酸铵终浓度为2.0M，进样至用平衡缓冲液A2平衡好的Butyl疏水层析柱中，介质体积为1mL，层析设备为GEAKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A2继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液A2作为A相，用洗脱缓冲液B作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％B相至100％B相，梯度洗脱为50个柱体积，分步收集洗脱组分并检测。
实施例6
平衡缓冲液A1(第一步疏水)：20mM磷酸钠缓冲液，1.0M硫酸钾，2mM EDTA，pH 7.2
平衡缓冲液A2(第二步疏水)：20mM磷酸钠缓冲液，2.5M硫酸铵，2mM EDTA，pH 7.2
洗脱缓冲液B：20mM磷酸钠缓冲液，2mM EDTA，pH 7.2
第一步疏水层析：取1mL转录并完成加帽的流感mRNA体系(由流感DNA转录、加帽得到，转录方法参照制备例1，加帽方法参照制备例2)，mRNA含量为400μg/mL，使用离心机在4℃下10000转离心2分钟后收集上清组分。调节上清中硫酸钾浓度为1.0M，进样至用平衡缓冲液A1平衡好的大孔Butyl-S疏水层析柱中，柱内介质体积为1.0mL，层析设备为GE AKTAExplorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A1继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，收集穿透组分。
第二步疏水层析：加入硫酸铵粉末调节疏水层析穿透组分中硫酸铵终浓度为2.5M，进样至用平衡缓冲液A2平衡好的Phenyl(low sub)疏水层析柱中，介质体积为1mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A2继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液A2作为A相，用洗脱缓冲液B作为B相进行洗脱，洗脱梯度初始为70％B相，之后70％B相至100％B相采用线性洗脱的方式，洗脱为20个柱体积，分步收集洗脱组分并检测。
实施例7
平衡缓冲液A1(第一步疏水)：20mM HEPES缓冲液，0.8M硫酸铵，2mM EDTA，pH 7.2
平衡缓冲液A2(第二步疏水)：20mM HEPES缓冲液，1.8M氯化钠，2mM EDTA，pH 7.2
洗脱缓冲液B：20mM HEPES缓冲液，2mM EDTA，pH 7.2
第一步疏水层析：取3mL经过DNA酶处理的绿色荧光蛋白mRNA转录液，mRNA含量为300μg/mL，使用离心机在4℃下将转录液以12000转离心2分钟后收集上清组分。加入硫酸铵粉末调节上清中硫酸铵浓度为0.8M，进样至用平衡缓冲液A1平衡好的Butyl Sepharose4FF疏水层析柱中，柱内介质体积为1.0mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A1继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，收集穿透组分。
第二步疏水层析：加入氯化钠粉末调节疏水层析穿透液中氯化钠终浓度为1.8M，进样至用平衡缓冲液A2平衡好的Octyl疏水层析柱中，介质体积为1mL，层析设备为GE AKTAExplorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液A2继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液A2作为A相，用洗脱缓冲液B作为B相进行阶梯梯度洗脱，洗脱梯度为0％B相、10％B相、20％B相、30％B相、40％B相、50％B相、60％B相、70％B相、80％B相、90％B相、100％B相，每个梯度洗脱2个柱体积至基线走平，分步收集洗脱组分并检测。
对比例1
本对比例采用一步穿透式疏水法对转录体系里的mRNA进行纯化，其与实施例1的区别仅在于，省略第二步疏水层析，其他条件不变，具体步骤如下：
平衡缓冲液：50mM磷酸钠缓冲液，1.0M硫酸铵，5mM EDTA，pH 7.0(即实施例1中的平衡缓冲液A1)
取1mL经过DNA酶处理的绿色荧光蛋白mRNA转录液，mRNA含量为300μg/mL，使用离心机在4℃下将转录液以12000转离心2分钟后收集上清组分，弃去沉淀。调节上清中硫酸铵浓度为1.0M，进样至用平衡缓冲液平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内介质体积为0.5mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，收集穿透组分并检测。层析介质用0.5M NaOH清洗5CV后再用纯水清洗5CV。
对比例2
本对比例采用一步吸附式疏水法对转录体系里的mRNA进行纯化，其与实施例1的区别仅在于，省略第一步疏水层析，其他条件不变，具体步骤如下：
平衡缓冲液：50mM磷酸钠缓冲液，2.0M硫酸铵，5mM EDTA，pH 7.0(即实施例1中的平衡缓冲液A2)
洗脱缓冲液：50mM磷酸钠缓冲液，5mM EDTA，pH 7.0(即实施例3中的洗脱缓冲液B)
取1mL经过DNA酶处理的绿色荧光蛋白mRNA转录液，mRNA含量为300μg/mL，使用离心机在4℃下将转录液以12000转离心2分钟后收集上清组分，弃去沉淀。加入硫酸铵粉末调节上清液中硫酸铵终浓度为2.0M，进样至用平衡缓冲液平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，介质体积为0.5mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液作为A相，用洗脱缓冲液作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％B至100％B，梯度洗脱为20个柱体积，分步收集洗脱组分并进行检测。
对比例3
本对比例采用oligo(dT)亲和捕获和吸附式疏水法精纯的工艺(现有技术中常规工艺)对转录体系里的mRNA进行纯化
平衡缓冲液(亲和)：50mM磷酸钠缓冲液，2.5M氯化钠，2mM EDTA，pH 7.0
洗脱缓冲液(亲和)：50mM磷酸钠缓冲液，2mM EDTA，pH 7.0
平衡缓冲液2(疏水)：50mM磷酸钠缓冲液，1.8M氯化钠，2mM EDTA，pH 7.0
洗脱缓冲液2(疏水)：50mM磷酸钠缓冲液，2mM EDTA，pH 7.0
第一步亲和层析：利用高盐上样(盐离子屏蔽Oligo dT带负电荷骨架与mRNA的静电排斥作用)通过结合poly A尾巴高效捕获mRNA，过程中未反应的核苷酸、部分转录物、DNA、酶等杂质则被流穿。上样：取1mL经过DNA酶处理的绿色荧光蛋白mRNA转录液，mRNA浓度为300μg/mL，加入氯化钠粉末调节终浓度为2.5M，进样至用平衡缓冲液平衡好的oligo dT亲和介质中，介质体积为0.5mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液作为A相，用洗脱缓冲液作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％B至100％B，梯度洗脱为20个柱体积，分步收集洗脱组分。
第二步疏水层析：取上步收集的含mRNA的亲和洗脱组分，调节氯化钠终浓度为1.8M，进样至用平衡缓冲液2平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，介质体积为0.5mL，层析设备为GE AKTA Explorer 100，紫外260nm波长吸收检测，流速1mL/min，上样完毕后用平衡缓冲液2继续冲洗至260nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液2作为A相，用洗脱缓冲液2作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％B至100％B，梯度洗脱为20个柱体积，分步收集洗脱组分并进行检测。
测试例
采用BCA法测定样品的总蛋白浓度，Quant-iTTM 
ssDNA定量检测ssDNA的浓度，Quant-iTTM 
RNA定量检测RNA的浓度，凝胶高效液相色谱法测定样品中mRNA的含量和纯度，采用琼脂糖电泳测定mRNA的纯度，计算各实施例、对比例的方法获得的mRNA的收率和杂质去除率，结果列于表1。
表1
结果显示：各实施例提供的简便、成本低的mRNA纯化方法在mRNA收率及杂质(包括DNA、蛋白质、杂质RNA和NTP)去除率的综合效果方面，略好于或等于现有技术采用昂贵的oligo(dT)介质的方法，成功实现了既简便又高效的目的。
其中，实施例1和实施例7的方法的综合效果最好。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种mRNA的分离纯化方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种mRNA的分离纯化方法，其特征在于，所述mRNA的分离纯化方法包括将待分离纯化的mRNA原料经过两次疏水层析进行分离纯化。
2.如权利要求1所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，所述待分离纯化的mRNA原料由DNA转录得到，所述转录后还任选地包括加帽和/或加尾。
3.如权利要求1或2所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，所述mRNA的分离纯化方法包括如下步骤：
(1)将待分离纯化的mRNA原料进样至疏水层析柱中，用平衡缓冲液冲洗疏水层析柱，收集穿透组分，吸附组分弃去或重复利用；
(2)将穿透组分进样至疏水层析柱中，用平衡缓冲液冲洗疏水层析柱，后用流动相进行洗脱，根据260nm处的紫外吸收信号，收集mRNA组分。
4.如权利要求3所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述疏水层析柱中层析介质的配基各自独立地包括丁基、苯基、辛基或丁基硫中的任意一种；
优选地，步骤(1)中疏水层析柱所用配基为丁基，步骤(2)中疏水层析柱所用配基为丁基或辛基。
5.如权利要求3或4所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述进样前还包括利用平衡缓冲液平衡疏水层析柱。
6.如权利要求3-5中任一项所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱中，流动相包括A相和B相，A相为平衡缓冲液，B相为洗脱液。
7.如权利要求3-6中任一项所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱的方式包括梯度洗脱；
优选地，所述梯度洗脱的方式包括线性梯度洗脱或阶梯梯度洗脱。
8.如权利要求3-7中任一项所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱是指洗脱10-50个柱体积。
9.如权利要求3-8中任一项所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述平衡缓冲液为添加有0.3-1.2M无机盐的缓冲溶液，步骤(2)所述平衡缓冲液为添加有1.3-3M无机盐的缓冲溶液，所述无机盐包括氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁或硫酸铵中的任意一种或至少两种的组合；
所述缓冲溶液包括柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液或碳酸盐缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述缓冲溶液的浓度为5-50mM；
优选地，步骤(1)和步骤(2)所述进样前还包括向待分离纯化的mRNA原料及穿透组分中添加与平衡缓冲液中相同且等浓度的无机盐，所述无机盐包括氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁或硫酸铵中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述平衡缓冲液的pH值为6.0-8.0。
10.如权利要求6-9中任一项所述的mRNA的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱液包括水或缓冲溶液，所述缓冲溶液包括柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液或碳酸盐缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述缓冲溶液的浓度为5-50mM；
优选地，所述洗脱液的pH值为6.0-8.0。
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