CN116179536A - 一种mRNA纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种mRNA纯化方法。所述mRNA纯化方法包括：将待纯化mRNA与硫酸铵混合，收集沉淀，得到纯化mRNA。本发明创造性地利用硫酸铵沉淀方法对mRNA进行纯化，纯化条件范围广，纯化过程稳定，易于放大到工业化规模生产中，同时安全性高且得到的mRNA收率高。
Description
技术领域
本发明属于核糖核酸分离纯化技术领域，涉及一种mRNA纯化方法。
背景技术
随着mRNA疫苗对流感病毒、寨卡病毒和狂犬病毒的有效免疫，特别是在SARSCoV-2的mRNA疫苗研究之后，mRNA成为目前研究重点。非复制性信使RNA大规模生产主要以线性化的质粒DNA为模板，NTP为原料，在镁离子和亚精胺的辅助下，通过RNA聚合酶进行体外酶促转录反应合成目标mRNA，但mRNA极易发生降解，为了提高其稳定性和翻译效率，需要对转录得到的mRNA进行5’端加帽和3’端加尾。
目前常用的mRNA纯化方法包括沉淀法、色谱法和膜过滤法。常用的色谱法包括离子交换、OligodT亲和层析，纤维素层析，反相离子对色谱层析等。其分离精度高，但需要mRNA与其他杂质在电荷、尺寸等方面存在一定差异，才具有纯化的可能性，而且对于不同序列、长度的mRNA，需要探索不同的层析原理，往往需要多种层析模式的组合，操作时间长。此外，介质的价格成本较高，尤其是dT亲和介质，不仅载量有限，配基价格也较高，更适合于后面的精纯步骤。膜分离法虽然分离速度快，但强烈的剪切容易导致产物被破坏，分离精度也有限。
与层析分离和膜分离相比，沉淀分离具有操作简便，易于规模放大，收率高的优势，而且mRNA产物在沉淀中更为稳定，还可以作为中间产物储存起来，对于大规模生产过程更有优势。目前实验室常用于mRNA沉淀的沉淀剂包括氯化锂、醋酸铵/醋酸钠、氯仿-异丙醇法等，在对mRNA进行粗纯的同时可以对mRNA进行浓缩。氯化锂沉淀是实验室规模最常用的沉淀方法，但是氯化锂沉淀法需要在-20oC低温下进行操作，能耗高；此外，氯化锂属于低毒类试剂对眼睛和粘膜有刺激和腐蚀作用，样品中残留的锂盐对人来中枢系统产生危害，因此这种方法在使用中存在局限性。醋酸铵和醋酸钠等沉淀法也需在低温下进行。氯仿-异丙醇法沉淀使用大量有机试剂，同样对后续研究会产生生物危害性。
CN115287282A公开了一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用，所述方法包括：将mRNAIVT反应液依次进行亲和层析和疏水层析处理，得到纯化的mRNA。此方法将亲和层析和疏水层析两步法纯化工艺用于mRNA产品的纯化，操作易放大，提高了纯化mRNA的总回收率。但此方法存在溶剂耗费量大，价格成本高等问题。
CN114907430A公开了一种mRNA的分离纯化方法，所述方法包括：(1)将待分离纯化的mRNA原料进样至疏水层析柱中，用平衡缓冲液冲洗疏水层析柱，收集穿透组分，吸附组分弃去或重复利用；(2)将穿透组分进样至疏水层析柱中，用平衡缓冲液冲洗疏水层析柱，后用流动相进行洗脱，根据260nm处的紫外吸收信号，收集mRNA组分。此方法得到的mRNA回收率高，纯度高，能在室温下进行操作，易于放大到工业化规模生产。但此方法对mRNA的性质要求高，适用性局限，操作复杂。
综上所述，目前mRNA纯化方法存在操作复杂，成本高，会产生生物危害性等问题。如何提供一种安全性高、可常温进行、高收率的mRNA纯化方法，已成为目前核糖核酸分离纯化技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种mRNA纯化方法，解决了目前mRNA纯化方法操作复杂、安全性低和成本高等问题，实现了简单、高效地获得高纯度和高收率的mRNA，易于规模放大应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种mRNA纯化方法，所述mRNA纯化方法包括：
将待纯化mRNA与硫酸铵混合，收集沉淀，得到纯化mRNA。
本发明创造性地利用硫酸铵沉淀方法对mRNA进行纯化，纯化条件范围广，纯化过程稳定，易于放大到工业化规模生产中，同时安全性高且得到的mRNA收率高。
优选地，所述mRNA来源于真菌、细菌、植物或者动物的mRNA中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述mRNA来源于体外转录混合体系。
优选地，所述体外转录体系包括转录后加尾和/或加帽的混合物。
优选地，所述体外转录体系还包括DNA模板、T7聚合酶、NTP和盐。
优选地，所述mRNA纯化方法包括如下步骤：
(1)将含有硫酸铵的沉淀剂溶液与待纯化mRNA混合，收集沉淀；
(2)将所述沉淀与复溶溶液混合，得到纯化mRNA。
优选地，步骤(1)中所述含有硫酸铵的沉淀剂溶液的pH为3-10。
上述3-10中的具体点值可以选择3、4、5、6、7、8、9、10等。
优选地，步骤(1)中所述混合的温度为0-40℃。
上述0-40中的具体点值可以选择0、10、15、20、25、30、35、36、37、38、39、40等。
优选地，步骤(1)中所述混合的时间为0.5-10h。
上述0.5-10中的具体点值可以选择0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。
优选地，所述含有硫酸铵的沉淀剂溶液中硫酸铵的终浓度为0.5-4M。
上述0.5-4中的具体点值可以选择0.5、1、2、2.5、3、3.5、3.8、4等。
优选地，步骤(1)还包括对所述沉淀进行洗涤的步骤。
优选地，所述洗涤的溶液包括乙醇。
优选地，所述乙醇包括冷乙醇。
优选地，所述乙醇浓度为70-80％。
优选地，所述含有硫酸铵的沉淀剂溶液中还含有无机盐缓冲液。
优选地，所述无机盐缓冲液包括Tris-HCl、柠檬酸、醋酸盐、磷酸盐或HEPES中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述醋酸盐包括醋酸铵、醋酸钠、或醋酸钾中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、或磷酸二氢钾中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述无机盐缓冲液浓度为0.01-1M。
上述0.01-1中的具体点值可以选择0.01、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选地，所述复溶溶液包括无菌无酶水和/或缓冲溶液。
优选地，所述缓冲溶液包括Tris-HCl、柠檬酸、醋酸盐、磷酸盐或HEPES中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾、或醋酸铵中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、或磷酸二氢钾中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明创造性地调节沉淀溶液的pH、硫酸铵浓度、沉淀时间和沉淀温度，利用硫酸铵沉淀方法对mRNA进行纯化，操作简单，纯化条件范围广，纯化过程稳定，易于放大到工业化规模生产中，同时安全性高且得到的mRNA收率高。
附图说明
图1为氯化锂沉淀(对比例1)和硫酸铵沉淀(实施例1)从体外转录产物中纯化的mRNA的HPLC图；
图2为氯化锂沉淀(对比例1)和硫酸铵沉淀(实施例1)从体外转录产物中纯化的mRNA的琼脂糖凝胶图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
制备例1
本制备例提供一种mRNA转录体系(反应体系100μL)，其制备方法如下：
(1)配制10×TranscriptionBuffer(转录缓冲液)：400mMpH8.0的Tris-HCl、60mMKCl、10mMMgCl2、20mMDTT(二硫苏糖醇)；
(2)将所需T7RNAPolymerase、RNaseinhibitor和焦磷酸酶置于冰上。ATP、CTP、GTP、UTP混匀置于冰上，无菌无酶水、DNA模板、10×Transcription Buffer置于室温备用；
(3)无菌无酶离心管中加入10×TranscriptionBuffer10μL、RNaseFreeWater41.5μL、NTP(核苷三磷酸)8μL、DNA模板30μL、T75μL、RNaseinhibitor(RNA酶抑制剂)4μL和焦磷酸酶1.5μL，轻轻混匀各组分，37℃孵育3h；
(4)在每个离心管中加入5μL的DNaseI(DNA酶I)，37℃孵育15min，消化转录的DNA模板。
制备例2
本制备例提供一种mRNA加帽体系，其制备方法如下：
(1)10×CappingBuffer(加帽缓冲液)的配方如下：500mMTris-HCl(25℃下pH为8.0)，60mMMgCl2，100mMDTT，100mMKCl，20mMspermidine(亚精胺)；
(2)加帽反应操作步骤(反应体系100μL)
取50μgmRNA样品，并于65℃加热10min进行变性处理，结束后冰上放置5min，依次向其中加入10×CappingBuffer10μL、GTP10μL、SAM2.5μL、RNAinhibitor2.5μL、mRNACap2′-O-甲基转移酶4μL和牛痘病毒加帽酶4μL，并加入无菌无酶水补足至100μL，混匀各组过分后于37℃孵育30min。
实施例1
本实施例提供一种mRNA的沉淀和纯化方法，具体步骤如下：
取50μL绿色荧光蛋白mRNA转录混合物，加入缓冲液B1(20mMTris-HCl，pH7.0)36μL，加入缓冲液B2(20mMTris-HCl，3.5M硫酸铵，pH7.0)114μL(硫酸铵终浓度为2M)，将样品混合均匀，混合物放置在25℃水浴锅中静置孵育1h，然后将混合物使用离心机在20℃以12000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀中加200μL无菌无酶水溶解；
沉淀率计算方法：(1-(上清mRNA含量/转录混合物中mRNA含量))*100％；
沉淀收率计算方法：硫酸铵沉淀复溶物mRNA含量/转录混合物中mRNA含量*100％。
实施例2
本实施例提供一种mRNA的沉淀和纯化方法，具体步骤如下：
取50μL绿色荧光蛋白mRNA转录混合物，加入缓冲液B1(20mMTris-HCl，pH5.0)36μL，加入缓冲液B2(20mMTris-HCl，3.5M硫酸铵，pH5.0)114μL(硫酸铵终浓度为2M)。将样品混合均匀，混合物放置在20℃水浴锅中静置孵育1h，然后将混合物使用离心机在20℃以12000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀中加200μL无菌无酶水溶解。
实施例3
本实施例提供一种mRNA的沉淀和纯化方法，具体步骤如下：
取50μL绿色荧光蛋白mRNA转录混合物，加入缓冲液B1(20mMTris-HCl，pH7.0)64μL，加入缓冲液B2(20mMTris-HCl，3.5M硫酸铵，pH7.0)86μL(硫酸铵终浓度为1.5M)，将样品混合均匀，混合物放置在20℃水浴锅中静置孵育1h，然后将混合物使用离心机在20℃以12000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀中加200μL无菌无酶水溶解。
实施例4
本实施例提供一种mRNA的沉淀和纯化方法，具体步骤如下
取50μL绿色荧光蛋白mRNA转录混合物，加入缓冲液B1(20mMTris-HCl，pH7.0)36μL，加入缓冲液B2(20mMTris-HCl，3.5M硫酸铵，pH7.0)114μL(硫酸铵终浓度为2M)，将样品混合均匀，混合物放置在20℃水浴锅中静置孵育1h，然后将混合物使用离心机在25℃以12000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀中加200μL无菌无酶水溶解。
实施例5
本实施例提供一种mRNA的沉淀和纯化方法，具体步骤如下
取50μL绿色荧光蛋白mRNA转录混合物，加入缓冲液B1(20mMTris-HCl，3.5M硫酸铵，pH7.0)36μL，加入缓冲液B2(20mMTris-HCl，3.5M硫酸铵，pH7.0)114μL(硫酸铵终浓度为2M)，将样品混合均匀，混合物放置在20℃水浴锅中静置孵育2h，然后将混合物使用离心机在25℃以12000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀中加200μL无菌无酶水溶解。
实施例6
本实施例提供一种mRNA的沉淀和纯化方法，具体步骤如下：
取加帽后的50μL绿色荧光蛋白mRNA转录混合物，加入缓冲液B1(20mM Tris-HCl，pH7.0)36μL，加入缓冲液B2(20mMTris-HCl，3.5M硫酸铵，pH7.0)114μL(硫酸铵终浓度为2M)，将样品混合均匀，混合物放置在20℃水浴锅中静置孵育2h，然后将混合物使用离心机在20℃以12000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀中加200μL无菌无酶水溶解。
实施例7
本实施例提供一种mRNA的沉淀和纯化方法，具体步骤如下：
取50μLDNaseI处理的绿色荧光蛋白mRNA转录混合物，加入缓冲液B1(20mMTris-HCl，pH7.0)36μL，加入缓冲液B2(20mMTris-HCl，3.5M硫酸铵，pH7.0)114μL(硫酸铵终浓度为2M)，将样品混合均匀，混合物放置在20℃水浴锅中静置孵育2h，然后将混合物使用离心机在20℃以12000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀中加200μL无菌无酶水溶解。
对比例1
本对比例采用氯化锂沉淀法纯化转录体系中的mRNA，其与实施例1的区别在于，沉淀剂不同，沉淀缓冲液为7.5MLiCl缓冲液。
取50μL绿色荧光蛋白mRNA转录混合物，mRNA的浓度为1000μg/μL，向其中加入83.3μL的无菌无酶水和66.7μL的7.5MLiCl缓冲液，LiCl的终浓度为2.5M，混合物放置在-20℃静置孵育1h，然后将混合物使用离心机在4℃以12000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀中加入70％的乙醇洗涤三次，使用离心机在4℃以12000rpm离心5min分离上清和沉淀，沉淀中加200μL无菌无酶水溶解。
测试例1
采用SDS-PAGE测定T7酶的残留，采用HPLC定量检测DNA模板的残留，琼脂糖凝胶电泳和高效液相色谱法测定样品中mRNA的含量和纯度，计算各实施例、对比例的方法获得的mRNA的收率和杂质去除率，结果列于表1。
DNA去除率：(1-mRNA样品中的DNA/总的DNA)*100％
T7酶去除率：(1-mRNA样品中的T7酶/总的T7酶)*100％
表1
由结果可知：利用本发明硫酸铵沉淀方法对mRNA进行纯化可得到较高的mRNA沉淀率和收率，DNA、T7聚合酶和NTP这些杂质的去除效果很好，此外由对比例可以看出利用本发明硫酸铵沉淀方法对mRNA进行纯化相比传统氯化锂沉淀法可获得mRNA收率显著提高，表明本发明硫酸铵沉淀方法对mRNA进行纯化，纯化条件范围广，得到的mRNA收率显著提高。
测试例2
对实施例1和对比例1进行HPLC测试，LiCl沉淀复溶物和(NH4)2SO4沉淀复溶物均稀释4倍，测试方法为：各个样品的HPLC分析采用SEC-1000(Sepax,300×7.8mm)分析柱，通过WatersArcHPLC系列进行分析，紫外检测波长为260nm和280nm。在每次操作中，100μL的样品注入，用含50mM PB+100mMNa2SO4(pH7.0)缓冲液以0.6mL/min的流速洗脱30min。结果如图1所示。
结果表明：通过硫酸铵沉淀后，DNA模板、NTP、转录酶等杂质基本去除，能够得到高纯度的mRNA，且mRNA的产量优于氯化锂沉淀法。
测试例3
对实施例1和对比例1进行琼脂糖凝胶电泳测试，测试方法为：制备浓度为1.5％的琼脂糖凝胶，取5μL转录后的样品加入5μL无菌无酶水以及2μL的6×的RNAloadingBuffer混合，上样10μL，进行琼脂糖凝胶电泳。其中，1为氯化锂沉淀，2为硫酸铵沉淀，结果如图2所示。
结果表明：经硫酸铵沉淀后得到的mRNA纯度与LiCl沉淀样品无明显差异，充分说明了硫酸铵沉淀可获得高纯度的mRNA。
综上所述，本发明创造性地调节沉淀溶液的pH、硫酸铵浓度、沉淀时间和沉淀温度，利用硫酸铵沉淀方法对mRNA进行纯化，纯化条件范围广，纯化过程稳定，易于放大到工业化规模生产中，同时安全性高且得到的mRNA收率高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种mRNA纯化方法，其特征在于，所述mRNA纯化方法包括：
将待纯化mRNA与硫酸铵混合，收集沉淀，得到纯化mRNA。
2.根据权利要求1所述的mRNA纯化方法，其特征在于，所述mRNA来源于真菌、细菌、植物或者动物的mRNA中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述mRNA来源于体外转录混合体系；
优选地，所述体外转录体系包括转录后加尾和/或加帽的混合物；
优选地，所述体外转录体系还包括DNA模板、T7聚合酶、NTP和盐。
3.根据权利要求1或2所述的mRNA纯化方法，其特征在于，所述mRNA纯化方法包括如下步骤：
(1)将含有硫酸铵的沉淀剂溶液与待纯化mRNA混合，收集沉淀；
(2)将所述沉淀与复溶溶液混合，得到纯化mRNA。
4.根据权利要求3所述的mRNA纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述含有硫酸铵的沉淀剂溶液的pH为3-10。
5.根据权利要求3或4所述的mRNA纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合的温度为0-40℃。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的mRNA纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合的时间为0.5-10h。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的mRNA纯化方法，其特征在于，所述含有硫酸铵的沉淀剂溶液中硫酸铵的终浓度为0.5-4M。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的mRNA纯化方法，其特征在于，步骤(1)还包括对所述沉淀进行洗涤的步骤；
优选地，所述洗涤的溶液包括乙醇；
优选地，所述乙醇包括冷乙醇；
优选地，所述乙醇浓度为70-80％。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的mRNA纯化方法，其特征在于，所述含有硫酸铵的沉淀剂溶液中还含有无机盐缓冲液；
优选地，所述无机盐缓冲液包括Tris-HCl、柠檬酸、醋酸盐、磷酸盐或HEPES中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸铵、或醋酸钾中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、或磷酸二氢钾中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述无机盐缓冲液浓度为0.01-1M。
10.根据权利要求3-9任一项所述的mRNA纯化方法，其特征在于，所述复溶溶液包括无菌无酶水和/或缓冲溶液；
优选地，所述缓冲溶液包括Tris-HCl、柠檬酸、醋酸盐、磷酸盐或HEPES中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸铵、或醋酸钾中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、或磷酸二氢钾中的任意一种或至少两种的组合。
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