CN115873873A - 一种紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因及在制备岩白菜素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因及在制备岩白菜素中的应用，属于生物技术领域。该紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长1353bp；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了451个氨基酸残基。本发明紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因可作为岩白菜素的生物合成调控基因，并应用于制备岩白菜素，应用前景显著，易于推广应用。

Description

一种紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因及在制备岩白菜素中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因及在制备岩白菜素中的应用。

背景技术

紫金牛(Ardisia japonica)为紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(Ardisia)植物。紫金牛全株及根供药用，所含药用成分较多，岩白菜素是主要有效成分之一，岩白菜素具有镇咳、抗炎、抗焦虑、抗氧化、免疫调节和神经保护等多种功效(Shihao Xiang,.BergeninExerts Hepatoprotective Effects by Inhibiti ng the Release of InflammatoryFactors,Apoptosis and Autophagy via the PPAR-γPathway.Drug Des DevelTher.2020；14:129-143.)。国内外学者还发现其与吗啡类抑制中枢止咳药不同，岩白菜素对咳嗽中枢具有选择性抑制作用，对其它神经中枢无抑制作用，且毒副作用小、不良反应少、连续使用不产生耐药性等特点(王进，岩白菜素的人体与动物药代动力学及对IGABA的作用研究.山东大学，2010.)。

岩白菜素属异香豆素类化合物，前人研究岩白菜素生物合成前体为2-葡萄糖-4-甲氧基没食子酸经由分子内脱水后重排(rearrangement after intramolecul ardehydration)或在未知脱水酶(dehydratase)的作用下闭环生成(GanB.Bajracharya.Diversity,pharmacology and synthesis of bergenin and its derivatives:potential materials for therapeutic usages.Fitoterapia.2015；101:133-52.)；2-葡萄糖-4-甲氧基没食子酸由4-甲氧基没食子酸在碳糖基转移酶(CGT，C-glucosyltransferase)的催化下以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)为糖基供体在2位连接葡萄糖生成。但是到目前为止，岩白菜素生物合成还未见有人报道，因此，挖掘能够催化4-甲氧基没食子酸的碳糖基转移酶对于岩白菜素生物合成调控研究具有重要意义。

开展岩白菜素生物合成途径研究，可为紫金牛人工栽培措施以及提高药效成分含量提供基础。同时，岩白菜素提取原材料的种植周期长，并且对种植地块和种植技术要求较高。因此，如何去高效地获得这些有用的次生代谢物，一直都是科研究人员思考和研究的问题。对于高附加值的天然产物，采用现代生物技术建立同源或异源表达系统高效生产药用活性成分，已被广泛认为是解决今后药用资源短缺的重要技术手段。但是，要搞清这些活性成分的生物合成途径，必需鉴定这些途径中相关的关键基因，发掘这些催化酶基因成为研究植物代谢产物生物合成途径的关键环节。当前，4-甲氧基没食子酸在C-2位发生糖基化反应催化形成2-葡萄糖-4-甲氧基没食子酸的合成路径并不清晰，负责糖基化的碳糖基转移酶的功能尚未得到验证，影响了岩白菜素生物合成工作的推进。因此如何克服现有技术的不足是目前生物技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种紫金牛葡萄糖基转移酶AjCGT1，可作为岩白菜素的生物合成调控基因以及应用于制备岩白菜素。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因，紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长1353bp。

本发明第二方面提供上述紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了451个氨基酸残基。

本发明第三方面提供含有上述紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因的重组质粒。

进一步，优选的是，将紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因与pET28a载体同源重组，获得pET28a-AjCGT1重组质粒。

本发明第四方面提供一种转基因工程菌，含有上述重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因。

进一步，优选的是，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

本发明第五方面提供上述紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因编码得到的紫金牛葡萄糖基转移酶AjCGT1。

本发明第六方面提供上述紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因在制备岩白菜素中的应用。

进一步，优选的是，以4-甲氧基没食子酸作为底物，以尿苷二磷酸葡萄糖作为糖供体，在由所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因编码得到的紫金牛葡萄糖基转移酶AjCGT1的催化下在4-甲氧基没食子酸的C-2位进行碳糖基化反应，在分子内脱水后重排的作用下闭环生成岩白菜素。

本发明通过重组质粒，在体外表达后获得目标蛋白，经进一步对底物4-甲氧基没食子酸进行催化，直接生成岩白菜素。

本发明所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因，是从紫金牛的植株中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的；采用RNA试剂盒提取紫金牛全株的RNA，并反转录成cDNA后进行PCR扩增获得。所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因的扩增引物如下所示：

5'F：atgtctaacaccggcaacc；(SEQ ID NO.3)

3'R：ctaatttttcttcaccgtagtaattaaatcagataaagc。(SEQ ID NO.4)

此外，与载体pET28a进行同源重组时，BpOMT1基因则需要使用用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：

上游同源臂引物：5'F：gtggacagcaaatgggtcgcggatccatgtctaacaccggcaacc(SEQID NO.5)。

下游同源臂引物：3'R：：tgtcgacggagctcgaattcggatccctaatttttcttcaccgtagtaattaaatcagataaagc(SEQ ID NO.6所示)。

从紫金牛中分离并鉴定的转移酶AjCGT1基因，可作为紫金牛的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产岩白菜素的重要候选基因。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因可作为岩白菜素的生物合成调控基因，并应用于制备岩白菜素。

(1)随着生物信息学技术的飞速发展，极大地推进了岩白菜素生物合成路径关键酶基因的挖掘，本发明中岩白菜素的生物合成调控基因即碳糖基转移酶AjCGT1基因，是首次鉴定并成功验证，开辟了一种生产岩白菜素的生物合成新方法。本发明通过大肠杆菌异源表达蛋白并在体外进行酶催化的方式来获得目标产物，采用体外生物合成，进行定向生产，具有副产物少等优点。

(2)本发明提供了含有该碳糖基转移酶AjCGT1基因的重组质粒、基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成岩白菜素，进一步为构建产岩白菜素的细胞工厂研究奠定基础。

(3)通过体外生物合成岩白菜素，可控性强，可以减少对原料种植的需求，生产产物单一，便于后期岩白菜素的分离和纯化；还可减少化学合成困难，合成路径复杂等问题。所述岩白菜碳糖基转移酶AjCGT1基因作为岩白菜素生物合成的关键基因，还可用紫金牛等富含岩白菜素植物的育种研究。

附图说明

图1为岩白菜素推导的合成路径示意图；

图2为重组表达质粒Pet28a-AjCGT1的构建示意图；

图3为紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因重组后的电泳检测结果。其中，M为核酸Mar，1为阳性单菌落检测结果；

图4为紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1的SDS-PAGE蛋白电泳检测图。其中，M：蛋白质分子质量标准；泳道1、2、3、4、5、6、7依次分别为沉淀、流穿洗脱液、20mmol/L咪唑洗脱液、40mmol/L咪唑洗脱液、60mmol/L咪唑洗脱液、80mmol/L咪唑洗脱液、250mmol/L咪唑洗脱液下蛋白；

图5为HPLC检测碳糖基转移酶AjCGT1对4-甲氧基没食子酸的糖基化作用；横坐标是时间，单位min；纵坐标是响应值，单位是mAU；其中，CK：对照组(4-甲氧基没食子酸+尿苷二磷酸葡萄糖+灭活的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1)酶灭活的酶活反应结果；标品：4-甲氧基没食子酸标准品+岩白菜素标准品；AjCGT1：实验组(4-甲氧基没食子酸+尿苷二磷酸葡萄糖+紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1)的酶活反应结果；

图6为标准品的质谱分析(LC/MS/MS)图谱，其中，A为标准品4-甲氧基没食子酸的保留时间22.59分钟；B为标准品岩白菜素的保留时间21.56分钟；

图7为酶活性验证反应产物的质谱分析(LC/MS/MS)图谱，其中，图A为底物4-甲氧基没食子酸的保留时间22.58分钟；图B为反应产物岩白菜素的保留时间21.48分钟；

图8为标准品岩白菜素的碎片离子图(理论分子量328)(LC/MS/MS)；

图9为反应产物岩白菜素的碎片离子图(理论分子量328)(LC/MS/MS)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

基于紫金牛转录组Unigene基本功能注释信息，在测序注释结果中进行筛选CGT候选基因，同时，以植物中鉴定的碳糖基转移酶(CGT)，通过序列本地BLAST分析，然后对筛选结果进行整理分析，最后发现1个碳糖基转移酶(CGT)基因。之后进行cDNA的制备、候选基因的扩增及回收、同源重组、蛋白表达、体外酶活反应，以及HPLC及LC/MS检测等一系列工作后，最终鉴定出可以催化4-甲氧基没食子酸的糖基化反应生成岩白菜素的目标候选碳糖基转移酶AjCGT1基因(图1)。岩白菜素合成的各阶段操作步骤如下(以下实施所用试剂、原料、仪器设备等均为市售)：

(1)cDNA模板的制备

取紫金牛的鲜样，切片后液氮速冻，进行RNA提取。总RNA提取采用Magen(广州美基生物科技有限公司)的HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒。按试剂盒的操作步骤提取RNA，经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒，将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

(2)基因扩增及回收

利用引物设计软件(CE Design)v1.04，设计扩增紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因的引物，所述引物由引物F(SEQ ID NO.3)和引物R(SEQ ID NO.4)组成，按Q5 Mix DNA聚合酶使用说明书操作，采用Q5 Mix DNA聚合酶以岩白菜cDNA为模板进行基因扩增扩增体系(50μL)：Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 25μL，正向、反向引物(10mmol)各2.5μL，cDNA模板1μL，双蒸水19μL。PCR反应程序为：98℃30s；98℃15s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用，获得紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因片段，经测序其核酸序列如SEQID NO.1所示。

5'F：atgtctaacaccggcaacc；(SEQ ID NO.3)

3'R：ctaatttttcttcaccgtagtaattaaatcagataaagc。(SEQ ID NO.4)

此外，带载体同源臂的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因片段与载体pET28a进行同源重组时(同源臂为大肠杆菌pET28a)，紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因则需要使用带同源壁的引物(即同源臂引物)进行扩增及回收以紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因不带同源臂胶回收产物为模板，按Q5 Mix DNA聚合酶使用说明书操作，扩增体系(50μL)：Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 25μL，正向、反向引物(10mmol)各2.5μL，cDNA模板1μL，双蒸水19μL。PCR反应程序为：98℃30s；98℃15s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min，所述同源臂引物由上游同源臂引物(序列表中SEQ ID NO.5所示)和下游同源臂引物(序列表中SEQ ID NO.6所示)组成。获得带载体同源臂的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因片段。

上游同源臂引物：5'F：gtggacagcaaatgggtcgcggatccATGTCTAACACCGGCAACC(SEQID NO.5)。

下游同源臂引物：3'R：：tgtcgacggagctcgaattcggatccCTAATTTTTCTTCACCGTAGTAATTAAATCAGATAAAGC(SEQ ID NO.6所示)。

上述上游同源臂引物(SEQ ID NO.5)和下游同源臂引物(SEQ ID NO.6所示)中小写字母代表pET28a同源臂，大写字母代表扩增紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因引物序列。

(3)基因重组载体的构建与鉴定

同源重组的示意图详见图2(用于表达碳糖基基转移酶AjCGT1基因)。首先对载体pET28a进行线性化，使用NEB BamHI-HF(星选酶)进行单酶切获得线性化载体，酶切体系(50μL)环状pET28a载体1μg，10×NEBuffer 5μL，Restriction Enzyme 1μL，双蒸水补足至总体系50μL，将反应液放置在37℃温育15min，获得线性化载体pET28a。同源重组时则按照同源重组酶的操作说明进行组装，然后根据插入带载体同源臂的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因片段和pET28a载体的浓度，并按照重组说明计算各组分用量；最后在冰上将各组分加入到PCR反应管中，如表1。将紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因与pET28a载体同源重组获得重组质粒，命名为pET28a-BpOMT1。组装后对结果检测并送公司测序，组装后的电泳检测结果见图3，表明组装成功。按以下过程重组操作：

表1候选基因重组反应体系

组分	重组反应μL
		线化化pET28a	X
插入基因片段	Y
		5×CE II Buffer	4
Exnase II	2
		ddH2O	to 20μL

其中，X＝(0.02×pET28a碱基对数)ng/线化化pET28a浓度ng/μL；Y＝(0.02×pET28a碱基对数)ng/紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1回收浓度ng/μL，插入基因片段是插入带载体同源臂的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因片段。

(4)SDS-PAGE蛋白电泳检测

经蛋白表达小试后确定AjCGT1的蛋白诱导条件为：16℃、0.1mM的IPTG、220r/min，诱导12h；然后进行大摇，并使用大型离心机50000r/min收菌20min，超声破碎仪破壁10min，经高速离心(12000r/min)1h后获得蛋白上清，将上清缓慢倒入Ni-NTA琼脂糖亲和柱，静置5分钟，待上清自然滴落完，使用5个柱体积的50mM Tris-HCl(pH 8.0)对其进行除杂，然后依次使用含有20mM咪唑、40mM咪唑、60mM咪唑、80mM咪唑、250mM咪唑的50mM Tris-HC(pH 8.0)对其洗脱2个柱体积，并分开收集。不同咪唑浓度下的蛋白再采用SDS-PAGE蛋白电泳和检测。检测结果见图4，图4表明AjCGT1蛋白在250mmol/L咪唑洗脱液下可以洗脱纯化。

(5)酶活反应

紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因的酶活性是通过发生糖基化反应合成岩白菜素来确定的，在1.5mL离心管中进行。实验样品反应体系中混合物包含：100mM尿苷二磷酸葡萄糖2微升、100mM 4-甲氧基没食子酸2微升、40μg纯化的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1蛋白，加入50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)至总体积100μL，反应体系总体积为100μL。在32℃下保温2小时后，等体积1M盐酸终止，12000r/min离心15min，取上清。最后通过HPLC和LC-MS/MS分析，进行反应产物检测。

对照组(CK)反应体系：100mM 4-甲氧基没食子酸2微升、100mM尿苷二磷酸葡萄糖2微升、40μg灭活的纯化的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1蛋白，加入50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)至总体积100μL，反应体系总体积为100μL。

标品：10mM4-甲氧基没食子酸50微升、10Mm岩白菜素50微升。

(6)产物检测

HPLC检测条件如下：

HPLC检测所用仪器为安捷伦1290超高效液相色谱仪。色谱柱为XBridge ShieldRP18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：30℃；测定岩白菜素流动相为0.01％v/v甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～8min，1％～5％B；8～13min，5％～10％B；13～20min，10％～20％B；20～25min，20％～45％B；25～35min，45％～90％B；35～38min，90％～90％B；38～45min，90％～100％B；洗脱时采用的流动相A+B总计100％；采用线性梯度洗脱；洗脱时间：45min；进样量：10微升；流速：0.6ml/min；检测波长270nm，检测器为二极管阵列检测器。检测结果见图5，表明实验样品在紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1的催化下有岩白菜素的产生。

LC-MS/MS检测条件如下：

为了进一步确认HPLC所检测到的反应产物，采用Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF液相色谱质谱联用仪(LC/MS/MS)进行检测：质谱条件：离子源采用的是负离子模式，电压：3500V；碎裂电压：135V；锥孔电压：60V；射频电压：750V，扫描范围：100-1000m/z，扫描方式：SRM。色谱条件：色谱柱为XBridge Shield RP18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：32℃，测定岩白菜素流动相为0.01％v/v甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～8min，1％～5％B；8～13min，5％～10％B；13～20min，10％～20％B；20～25min，20％～45％B；25～35min，45％～90％B；35～38min，90％～90％B；38～45min，90％～100％B；洗脱时采用的流动相A+B总计100％；采用线性梯度洗脱；洗脱时间：45min；进样量：10微升；流速：0.6ml/min；检测波长270nm，检测器为二极管阵列检测器。检测结果见图6～图9，从结果中可以看出，产物的出峰时间及特征碎离子均与标准品岩白菜素相吻合，确认反应产物为岩白菜素。最终得出碳糖基转移酶AjCGT1具有催化4-甲氧基没食子酸的糖基化的能力，生成岩白菜素。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

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Claims (9)

1.一种紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因，其特征在于，紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的含有紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因的重组质粒，其特征在于，将紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因与pET28a载体同源重组，获得pET28a-AjCGT1重组质粒。

5.一种转基因工程菌，含有权利要求3所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因。

6.根据权利要求5所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21DE3。

7.权利要求1所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因编码得到的紫金牛葡萄糖基转移酶AjCGT1。

8.权利要求1所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因在制备岩白菜素中的应用。

9.根据权利要求8所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因在制备岩白菜素中的应用，其特征在于：以4-甲氧基没食子酸作为底物，以尿苷二磷酸葡萄糖作为糖供体，在由所述的紫金牛碳糖基转移酶AjCGT1基因编码得到的紫金牛葡萄糖基转移酶AjCGT1的催化下在4-甲氧基没食子酸的C-2位进行碳糖基化反应，在分子内脱水后重排的作用下闭环生成岩白菜素。

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