CN118291497A - 一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因及应用 - Google Patents
一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因及其在制备川续断皂苷Ⅵ的中间体HN saponin F中的应用。本发明以崴岩仙皂苷A和尿苷二磷酸‑葡萄糖为原料，在由川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因编码得到的川续断葡萄糖基转移酶的催化下，在崴岩仙皂苷A的C‑28位上进行糖基化反应，生成HN saponin F。从川续断中分离并鉴定的基因DaUGT012可为工厂化生产HN saponin F和川续断皂苷VI生物合成途径解析奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因及其在制药中的应用。
背景技术
UGT,全称为尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphateglycosyltransferase,UGT)，是催化糖基化反应的一类酶，这一类酶具有相似的PSPGBoxes结构域，PSPG由44个氨基酸组成，可以与糖分子的UDP部分结合，供体分子主要包括UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-鼠李糖和UDP-木糖等。UGT以基因家族的形式存在于植物体内，能催化糖供体和糖受体之间形成糖苷键，进而调节植物体的生命活动和次生代谢。参与植物次生代谢的糖基转移酶主要分布在GT1家族中。所有三萜皂苷的合成都离不开糖基转移酶的参与，如人参皂苷Rh2，黄芪皂苷，人参皂苷R0等。
HN Saponin F是续断中的三萜皂苷类成分，属于齐墩果烷型五环三萜皂苷，前人研究中发现HN Saponin F在中药的补肾助阳药物中具有类雄激素活性，而且其制备过程复杂，含量低，在植物体内很少能提取到。
川续断皂苷Ⅵ，属于齐墩果烷型皂苷，其生物合成涉及三步糖基化反应，其中Cauloside A和其C-28位葡萄糖基化产物HN saponin F是川续断皂苷VI生物合成的关键中间体，同属于齐墩果烷型三萜皂苷。在前人的研究研究中，齐墩果烷型皂苷生物合成涉及的糖基转移酶家族主要是UGT73家族，目前已经有许多UGT73家族的基因功能被鉴定出来，例如来自苜蓿MtUGT73F3催化常春藤皂苷元或齐墩果酸的C-28位发生葡萄糖基化]，来自大豆的GmUGT73F4可以催化大豆皂苷A的C-22位发生木糖基化，来自山芥的BvUGT73C11催化齐墩果酸的C-3位葡萄糖基化等，但目前尚未有关于催化Cauloside A和其C-28位葡萄糖基化生成HN saponin F的糖基转移酶的报道。负责第一步糖基化反应的糖基转移酶课题组前期已经完成鉴定，而本发明得到的DaUGT012基因得到的蛋白为Cauloside A生成HN saponin F的糖基转移酶，为HN saponin F和川续断皂苷VI的生物合成奠定基础。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因，所述川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因所编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种含有所述川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因的重组质粒。
所述的川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因与pET28a载体同源重组获得，命名为pET28a-DaUGT012。
本发明还提供了一种转基因工程菌，含有所述的重组质粒，或所述基因工程菌的基因组中整合有外源的所述的川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因。
所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
本发明还提供了一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因在制备HN saponin F中的应用。
同时提供了一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因在制备中药的补肾助阳药物中具有类雄激素中的应用，所述川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因通过制备得到HNsaponin F从而实现类雄激素的药理活性。
以及，HN saponin F在制备中药的补肾助阳药物中(具有类雄激素)中的应用。
本发明另外还提供了一种用于合成所述HN saponin F的制备方法，包括以下步骤：以崴岩仙皂苷A和尿苷二磷酸-葡萄糖为原料，在由川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因编码得到的川续断葡萄糖基转移酶的催化下，在崴岩仙皂苷A的C-28位上进行糖基化反应，生成HN saponin F。
优选的，制备方法包括以下步骤：
(1)cDNA模板的制备；
(2)基因扩增及回收；
(3)基因重组载体的构建与鉴定；
(4)候选基因DaUGT12的蛋白表达和纯化；
(5)酶活反应。
优选的，所述步骤(1)中cDNA模板的制备方法包括以下步骤：取川续断的新鲜根、茎、叶，切片后液氮速冻，进行RNA提取，使用TAKARA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用；
所述步骤(2)中基因扩增及回收包括以下步骤：以所述的反转录成cDNA为模板，采用DNA聚合酶进行基因扩增，加入cDNA 2μl，2x phantaMax Master mix25μl，上、下游引物各2μl，ddH2O补足至50μl，扩增体系为：95℃、3min，95℃、15s，55℃、15s，72℃、1min，36个循环；72℃、5min；利用试剂盒回收目的基因，在-20℃冰箱中保存备用；
所述步骤(3)中基因重组载体的构建与鉴定包括以下步骤：载体线性化、基因重组和菌水检测；所述载体线性化是利用核酸内切酶BamHⅠ对pET-28a进行单酶切得到线性化载体pET-28a，使用试剂盒进行纯化回收，测定其浓度后存-20℃冰箱中备用；所述基因重组是将试剂盒扩增得到的目的基因和与线性化的pET-28a载体连接，转化菌株为E.coli BL21(DE3)感受态；所述菌水检测中PCR扩增时，PCR程序为95℃、3min，95℃、30s，55℃、15s，72℃、30/kb，35个循环；72℃、5min；得到菌液；
所述步骤(4)中蛋白表达：取所述菌液，在37℃，220rpm/min条件下复苏，接种至卡那霉素LB液体培养基扩大培养，加入IPTG在低温条件下进行蛋白诱导表达；蛋白纯化：诱导表达结束后，离心收集菌体，缓冲液重悬菌体，破菌，高速离心，取上清液加载到Ni-NTA琼脂糖亲和柱上，利用不同浓度的咪唑过柱洗脱并收集滤液，将洗脱液与沉淀用SDS-PAGE蛋白电泳检测结果；
所述步骤(5)中酶活反应包括以下步骤：将底物和糖供体混合，加入酶和Tris–HCl缓冲液进行反应。
本发明具有以下有益效果：
以崴岩仙皂苷A和尿苷二磷酸-葡萄糖为原料，在由川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因编码得到的川续断葡萄糖基转移酶的催化下，在崴岩仙皂苷A的C-28位上进行糖基化反应，生成HN saponin F。
本发明通过重组质粒，在体外表达后获得目标蛋白，经进一步对底物崴岩仙皂苷A进行催化，生成HN saponin F。
本发明川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因，是从川续断的根中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的；采用RNA试剂后提取川续断根的RNA，并反转成cDNA后进行PCR扩增获得。川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因的扩增引物如下所示：
DaUGT012
5'F：ATGGCTTCCAAAACCCAAAA
3'R：TACGACTTTAAAATGTGACT
此外，与载体pET28a进行同源重组时，DaUGT012基因则需要使用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：
DaUGT012
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3'R：agcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgGTGTAAAATTTCAGCATTCTCAAC
从川续断中分离并鉴定的基因，DaUGT12可作为川续断的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产川续断皂苷VI的重要候选基因。
附图说明
图1中A为DaUGT012的酶活产物的LC-MS分析,B,C是崴岩仙皂苷A和HN saponin F真实标品和DaUGT012酶活产物的质谱；D是基于DaUGT012的功能构建的HN saponin F的生物合成路径；
图2为重组表达质粒pET28a-DaUGT012的构建示意图(用于表达编码川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因)；
图3为川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012重组后的电泳检测结果；
图4为川续断葡萄糖基转移酶DaUGT12的SDS-PAGE蛋白电泳检测图(M：蛋白质分子质量标准)。
具体实施方式
下面结合对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本发明通过本地BLAST对转录组数据及其KEGG蛋白数据库注释结果的搜索，获得与川续断皂苷VI合成路径相关的候选基因，并从转录组数据中找出FPKM值，利用FPKM值对这些基因进行差异表达分析，并将差异基因表达量利用TBtool制作热图，分别比较相关基因在川续断根、茎、叶中的表达量，对候选DaUGT012/120进行功能鉴定使用在线工具ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)识别DaUGT012/120的开放阅读框(ORF)和氨基酸序列。来自其他物种的UGT基因的氨基酸序列可从现有的数据库下载，并由ClustalW跟候选基因进行比对，通过MEGA-X在默认参数条件下用邻接法(neighborjoining method)构建系统进化树。之后进行cDNA的制备、候选基因的扩增及回收、同源重组、蛋白表达、体外酶活反应，以及HPLC及LC/MS检测等一系列工作后，最终鉴定出可以在崴岩仙皂苷A的C-28位上进行糖基化反应生成HN saponin F的DaUGT012。各阶段操作步骤如下：
(1)cDNA模板的制备
取川续断的新鲜根、茎、叶，切片后液氮速冻，进行RNA提取。总RNA提取采用广州美基生物科技有限公司的HiPure HP Plant RNA Mini Kit试剂盒。按试剂盒说明书的操作步骤提取RNA，经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。
(2)基因扩增及回收
利用NCBI在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)找出川续断的13个候选DaOSC基因的ORF(开放阅读框)。然后用SnapGene软件设计基因编码区的全长序列的特异性引物，设计的引物带有大肠杆菌表达载体pET28a-DaUGT012的同源臂，
pET28a-DaUGT012载体通用引物的上引是：5'F：gcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccATGGCTTCCAAAACCCAAAAC；下引是3'R：agcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgGTGTAAAATTTCAGCATTCTCAAC。
以之前反转录得到的cDNA为模板，采用DNA聚合酶(phanta酶)进行基因扩增。扩增体系为,：cDNA 2μl，2x phantaMax Master mix25μl，上、下游引物各2μl，ddH2O补足至50μl，扩增体系为：95℃、3min，95℃、15s，55℃、15s，72℃、1min，36个循环；72℃、5min。PCR扩增程序结束后，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的基因条带与目的基因条带长度是否一致。如果长度相近可利用GenStar公司的试剂盒回收目的基因。并在NanoDrop2000中测定回收浓度，最后在-20℃冰箱中保存
(3)基因重组载体的构建与鉴定
A载体线性化：利用核酸内切酶BamHⅠ对pET-28a进行单酶切得到线性化载体pET-28a。使用omega公司的Cycle Pure Kit试剂盒进行纯化回收，测定其浓度后存-20℃冰箱中备用。
B基因重组：将使用生工生物工程(上海)股份有限公司的即用型无缝克隆酶试剂盒扩增得到的的目的基因和与线性化的pET-28a载体连接，连接方法与转化方式见图2，转化菌株为E.coli BL21(DE3)感受态。
C菌水检测：在超净工作台上从转化培养基上随机挑选出8个菌落于20μl ddH2O中，取3μl进行PCR扩增，PCR反应体系采用的是南京诺唯赞生物科技有限公司的2x TaqMaster Mix酶反应体系，PCR程序为95℃,3min，95℃,30s，55℃,15s，72℃,30/kb，35个循环；72℃、5min反应程序结束后，用1％琼脂糖检测PCR产物的长度大小。如果PCR产物的长度与目的片段相似，则为阳性。说明组装成功可送测序。测序成功后，用50％甘油与菌液按体积比1∶1的方法进行保种。如图3所示。
(4)候选基因DaUGT012/120的蛋白表达和纯化
蛋白表达：取先前保存好的菌液，在37℃，220r/min条件下复苏，待菌液充分混浊后，接种至的300mL的卡那霉素(100μg/mL)LB液体培养基扩大培养，待菌液OD值增长到0.6-0.8范围时，加入0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在低温条件下进行蛋白诱导表达12-16h。
蛋白纯化：诱导表达结束后，利用大型高速冷冻离心机在4℃,5000rpm/min条件下离心20min收集菌体。用20mL的50mMTris,200mMNaCl,Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液重悬菌体，结束后采用高压低温破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)进行破菌1～2次，然后在4℃、12000rpm/min条件下高速离心30min，取上清液加载到Ni-NTA琼脂糖亲和柱上，利用不同浓度的咪唑(20mM、50mM、60mM、200mM)过柱洗脱并收集滤液，将洗脱液与沉淀用SDS-PAGE蛋白电泳检测结果。如图4所示。
(5)酶活反应
体外酶活反应在100μl混合体系中进行，底物100mM(威岩仙皂苷A)，糖供体100mM(UDP-葡萄糖)，酶10μg/μl，Tris–HCl缓冲液(50mM，PH＝8.0)，30℃反应2h，通过加入适量甲醇来终止反应，12000g下离心20min，吸取上清，将产物溶解在甲醇中，最后通过HPLC和LC-MS分析，进行反应产物检测。
(6)产物检测
LC-MS检测条件如下：
酶活结果采用Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF液相色谱质谱联用仪(LC/MS)进行检测：质谱条件：离子源采用的是负离子模式，电压：3500V；碎裂电压：135V；锥孔电压：60V；射频电压：750V，扫描范围：100-1000m/z，扫描方式：SRM。色谱条件：色谱柱为AgilentExtend-C18(250mm x 4.6mm,5μm)，柱温：30℃，测定产物流动相为0.01％v/v甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～3min，85％～60％A；3～7min，60％～35％A；7～9.5min，35％～12％A；9.5～25minA。洗脱时间：25min；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；检测波长210nm。LC-MS检测结果如图1所示，负离子模式下，当在实验组、对照组和标品组中提取EIC(717、879.43)时，DaUGT012实验组与对照组相比，出现了一个新的离子特征峰(图1中A)，新峰出峰时间与HN saponin F真实标准品的出峰时间一致，进一步分析发现新峰的质谱特征与HNsaponin F真实标品一致，二者都具有765.44[M-H]-，811.45[M+HCOO]-,879.43[M-CF3COO](图1中B、C)，由此可以判断DaUGT012在UDP-Glc作为糖供体的情况下，可以催化CaulosideA生成HN saponin F(图1中D)。
以上结合对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因，其特征在于，所述川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因所编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种含有权利要求1所述的川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因的重组质粒，所述重组质粒由川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因与pET28a载体同源重组获得，命名为pET28a-DaUGT012。
4.一种转基因工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的重组质粒，或所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21（DE3）菌株。
5.权利要求1所述的一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因在制备HN saponin F中的应用。
6.权利要求1所述的一种川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因在制备补肾助阳中药中的应用，其特征在于，所述川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因通过制备得到HN saponinF从而实现在补肾助阳药物中具有类雄激素的药理活性。
7.HN saponin F在在制备补肾助阳中药中的应用。
8.一种制备HN saponin F的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：以崴岩仙皂苷A和尿苷二磷酸-葡萄糖为原料，在由川续断葡萄糖基转移酶DaUGT012基因编码得到的川续断葡萄糖基转移酶的催化下，在崴岩仙皂苷A的C-28位上进行糖基化反应，生成HN saponinF。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）cDNA模板的制备；
（2）基因扩增及回收；
（3）基因重组载体的构建与鉴定；
（4）候选基因DaUGT012的蛋白表达和纯化；
（5）酶活反应。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中cDNA模板的制备方法包括以下步骤：取川续断的新鲜根、茎、叶，切片后液氮速冻，进行RNA提取，使用TAKARA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，-20ºC保存备用；
所述步骤（2）中基因扩增及回收包括以下步骤：以所述的反转录成cDNA为模板，采用DNA聚合酶进行基因扩增，加入cDNA 2μl，2 x phantaMax Master mix25μl，上、下游引物各2μl，ddH2O补足至50μl，扩增体系为：95ºC、3min，95ºC、15s，55ºC、15s，72ºC、1min，36个循环；72ºC、5min；利用试剂盒回收目的基因，在-20℃冰箱中保存备用；
所述步骤（3）中基因重组载体的构建与鉴定包括以下步骤：载体线性化、基因重组和菌水检测；所述载体线性化是利用核酸内切酶BamHⅠ对pET-28a进行单酶切得到线性化载体pET-28a，使用试剂盒进行纯化回收，测定其浓度后存-20℃冰箱中备用；所述基因重组是将试剂盒扩增得到的目的基因和与线性化的pET-28a载体连接，转化菌株为E.coli BL21（DE3）感受态；所述菌水检测中PCR扩增时，PCR程序为95℃、3min，95℃、30s，55℃、15s，72℃、30/kb，35个循环；72℃、5min；得到菌液；
所述步骤（4）中蛋白表达：取所述菌液，在37℃，220rpm/min条件下复苏，接种至卡那霉素LB液体培养基扩大培养，加入IPTG在低温条件下进行蛋白诱导表达； 蛋白纯化：诱导表达结束后，离心收集菌体，缓冲液重悬菌体，破菌，高速离心，取上清液加载到Ni-NTA琼脂糖亲和柱上，利用不同浓度的咪唑过柱洗脱并收集滤液，将洗脱液与沉淀用SDS-PAGE蛋白电泳检测结果；
所述步骤（5）中酶活反应包括以下步骤：将底物和糖供体混合，加入酶和Tris–HCl缓冲液进行反应。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118291497A true CN118291497A (zh) | 2024-07-05 |
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