CN114836398B

CN114836398B - 糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用

Info

Publication number: CN114836398B
Application number: CN202210627522.9A
Authority: CN
Inventors: 何冰芳; 徐晓丽; 储建林; 赵璐; 钦松; 高振; 吴斌
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-06-06
Also published as: CN114836398A

Abstract

本发明涉及糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用。所述突变体为将糖基转移酶BcGT1的氨基酸序列中第18位、第133位氨基酸残基中一个或多个突变为另一种氨基酸残基得到；所述糖基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。以本发明构建的糖基转移酶突变体与蔗糖合成酶AtSuSy双酶偶联催化体系，可实现一步法直接定向合成非天然人参皂苷12‑O‑β‑Glc‑PPT或12‑O‑β‑Glc‑PPD，简化非天然人参皂苷的制备过程；且产物较为单一，有助于减少后续的分离步骤，精简产物提纯过程。非天然人参皂苷具有比天然人参皂苷Rg3、Rh2等有更强的抑制肺癌细胞增殖作用，因此在新药的开发上有很大的前景。

Description

糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用

技术领域

本发明属于中医药的生物制药技术领域，具体涉及一种蜡样芽孢杆菌来源的糖基转移酶BcGT1突变体在酶法制备非天然人参皂苷中的应用。

背景技术

人参(Panax ginsengC.A.Mayer)为五加科多年生草本植物，是我国传统的名贵中药。中药人参具有广泛的抗癌、抗疲劳、提高免疫力、保护心脑血管等药理活性。中药人参中含有的主要药用成分——人参皂苷，是一类四环三萜类化合物。迄今为止，已经从17种人参属植物中鉴定出了180种人参皂苷，大多为四环的达玛烷型结构。达玛烷型人参皂苷可进一步分为原人参二醇(PPD)、原人参三醇(PPT)等类型。在自然界中，PPD的糖基化位点通常是C-3和C-20的羟基，生成人参皂苷Rh2、Rg3、化合物K、Rb2、Rb3、Rd等产物。而PPT的糖基化位点通常为C-6和C-20的羟基，形成人参皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、F1等产物，PPT的C-3、C-12位羟基不被糖基化修饰。因此，PPT的C-3、C-12位糖基化修饰后获得的产物被称为非天然人参皂苷，例如：原人参三醇-12-O-β-葡萄糖苷(12-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol，简写为12-O-β-Glc-PPT)、原人参二醇-12-O-β-葡萄糖苷(12-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，简写为12-O-β-Glc-PPD)属于非天然人参皂苷，其结构式分别如下。

有研究表明，一些非天然人参皂苷(单糖苷产物12-O-β-Glc-PPD)对肺癌细胞的抑制作用明显强于天然人参皂苷Rg3、Rh2等(Atopkina L N,et al；Planta Medica,1999,65(1):30-34)。因此，通过糖基化反应作用对原人参三醇、原人参二醇的非天然糖基化位点(C-12)进行糖基化修饰，将能合成具有独特生理和药理活性的新型人参皂苷产物。

在人参植物中，数量丰富的糖基转移酶类(UGTs)可催化PPT的糖基化修饰，该步骤是人参皂苷生物合成途径的最后一步，也是最为关键的一步，决定了最终生成的人参皂苷产物种类，进而影响其生物活性及功能用途。糖基转移酶通常需要使用“活化糖”作为糖基供体如：UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖醛酸等。药理研究表明，人参皂苷苷元糖基化和修饰方式不同，形成的不同类型人参皂苷发挥不同的药理作用。在非天然人参皂苷生物法制备方面，有报道将糖基转移酶BsUGT1等多种酶基因导入细胞，先生物合成3,12-Di-O-Glc-PPT(PPT的双糖基化产物)，再进一步利用含有水解酶LXXL-P1-2的全细胞催化PPT的双糖基化产物特异性水解获得非天然人参皂苷12-O-β-Glc-PPT(杨金玲等；CN 109666747 A)；该制备方法增加了细胞催化制备非天然人参皂苷的步骤，多酶体系组成复杂，并且细胞内代谢副产物众多，不利于非天然人参皂苷12-β-O-Glc-PPT分离工艺的简化。还有报道以糖基糖基转移酶为催化剂，如：枯草芽孢杆菌来源的糖基转移酶Bs-YjiC能催化合成人参皂苷Rh1和3-β-O-Glc-PPT等两种单糖基化产物(孙媛霞等，CN109796516 A；Dai L H et al,J.Agric.Food Chem.2018,66,943-949)；该酶还能进一步以人参皂苷Rh1或和3-β-O-Glc-PPT为底物发生糖基化获得4种非天然PPT型人参皂苷(均为双糖基化产物)，说明天然糖基转移酶在生物合成非天然人参皂苷产物方面的选择性不尽人意(孙媛霞等，CN 109796516 A；Dai LH et al,J.Agric.Food Chem.2018,66,943-949)；受限于酶自身催化反应的选择性，难以定向制备PPT的单糖基化产物或其单一的产物。此外，鲜见有以糖基转移酶一步法直接制备单糖苷的非天然人参皂苷(12-O-β-Glc-PPT)产物的报道。

目前，利用糖基转移酶催化的转糖基化反应主要有三种方式：第一是在体外以高能活化糖为糖基供体进行糖基转移酶催化。为达到较高的底物糖基化转化率，往往需要加入过量的活化糖供体，但高能活化糖的价格高昂，所需反应成本较高，难以大规模应用；第二是在含有糖基转移酶的重组菌体内进行全细胞转化。虽然体内反应可以显著降低反应成本但是底物需要跨膜进入细胞，甚至有些底物对细胞有较强的毒性，摄入后会严重抑制细胞活性，导致糖基化反应产率大幅度下降；第三是在体外通过引入蔗糖合成酶构建糖基转移酶-蔗糖合成酶偶联催化体系，以尿苷二磷酸二钠(UDP)及蔗糖为底物，蔗糖合成酶实现反应体系中UDP-G(尿苷二磷酸葡萄糖)的循环再生，UDP-G被糖基转移酶作为糖基供体催化糖基化反应同时释放UDP。使用双酶偶联催化反应既可以实现UDP-G的循环再生，同时循环体系所需的极少量的UDP也可以消除糖基转移酶催化过程中产生的大量副产物UDP对糖基转移酶本身活性的抑制，从而实现糖苷类产物的低成本高效合成。

发明内容

针对糖基转移酶表达差、底物浓度低、反应选择性差等问题，本发明提供了糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用，该糖基转移酶突变体在酶法制备非天然人参皂苷体系中选择性好、稳定性好、表达量高。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用，所述糖基转移酶突变体为将糖基转移酶BcGT1的氨基酸序列中第18位、第133位氨基酸残基中一个或多个突变为另一种氨基酸残基得到；

所述糖基转移酶BcGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述糖基转移酶BcGT1可以从蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体重分离获得，也可以人工合成获得。

作为一种优选的实施方式，所述糖基转移酶BcGT1的第18位脯氨酸残基突变为丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸其中的任意一种。

作为一种优选的实施方式，所述糖基转移酶BcGT1的第133位苯丙氨酸残基突变为丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸其中的任意一种。

作为一种优选的实施方式，所述糖基转移酶BcGT1的突变体为F133Y突变体、F133S突变体、P18F/F133Y突变体、P18M/F133Y突变体或P18D/F133Y突变体。

作为一种优选的实施方式，所述非天然人参皂苷为原人参三醇-12-O-β-葡萄糖苷、原人参二醇-12-O-β-葡萄糖苷或原人参三醇-3-O-β-葡萄糖苷。

作为一种优选的实施方式，利用双酶偶联催化底物合成所述非天然人参皂苷；

双酶偶联催化体系包括所述糖基转移酶、拟南芥来源的蔗糖合成酶AtSuSy、原人参三醇/原人参二醇、蔗糖和尿苷二磷酸二钠UDP。

作为一种优选的实施方式，双酶偶联催化体系中所述糖基转移酶的用量为40mU/mL—320mU/mL，优选200mU/mL；蔗糖合成酶的量为50mU/mL—300mU/mL，优选120mU/mL。

作为一种优选的实施方式，双酶偶联催化体系中所述原人参三醇/原人参二醇的浓度为0.1mM-30mM，优选20mM；尿苷二磷酸浓度为0.1mM-0.8mM，优选0.4mM。

作为一种优选的实施方式，双酶偶联催化体系中还添加二甲亚枫DMSO和吐温80；DMSO添加浓度为0～20％(V/V)，优选5％(V/V)；吐温80添加浓度为0～5％(V/V)，优选1％。

作为一种优选的实施方式，所述双酶偶联催化体系反应温度为20～45℃，优选30℃；初始pH为6.5～10.5，优选7.5。

本发明以蜡样芽孢杆菌来源的糖基转移酶BcGT1基因，通过丙氨酸扫描、饱和突变、迭代饱和突变等半理性设计的酶工程改造技术对糖基转移酶BcGT1进行突变改造，使其能够以原人参三醇(PPT)或原人参二醇(PPD)为底物，一步法定向合成单糖苷的非天然人参皂苷12-O-β-Glc-PPT或12-O-β-Glc-PPD；无需经历先生物合成原人参三醇的二糖苷产物，再次由生物酶法水解等额外步骤，具有反应选择性高、反应体系简单、制备方法简便的优点。本发明所述的一步法双酶偶联催化直接制备非天然人参皂苷12-O-β-Glc-PPT(单糖苷产物)，可极大的提高生产效率以及产量，与蔗糖合酶偶联，以廉价的蔗糖作为糖基供体，极大的降低了生产成本；糖基化反应的选择性高，产物较为单一，有助于减少后续的分离步骤、精简产物提纯过程；从而为所述非天然人参皂苷的医药应用奠定基础。

附图说明

图1为糖基转移酶BcGT1及其融合表达的SDS-PAGE电泳分析图。

图2为糖基转移酶BcGT1催化PPT糖基化反应产物HPLC分析图。

图3为不同温度对糖基转移酶BcGT1反应活性的影响。

图4为不同pH对糖基转移酶BcGT1反应活性的影响。

图5为蔗糖合成酶AtSuSy表达的SDS-PAGE分析图。

图6为糖基转移酶BcGT1或其突变体和蔗糖合成酶AtSuSy偶联催化合成12-O-β-Glc-PPT的反应示意图。

图7为糖基转移酶突变体P18M-F133Y催化PPT糖基化反应产物HPLC分析图。

具体实施方式

实施例1：本实施例说明糖基转移酶BcGT1的克隆

微生物菌株基因组提取：以标准菌株：蜡样芽孢杆菌ATCC14579为出发菌株，参照微生物基因组提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KitVer.3.0)提取方法提取目标基因组，经过琼脂糖凝胶电泳检测后，短期保存于-20℃备用。

参照NCBI数据库中蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus NC7401)的基因组信息中目标糖基转移酶的基因作为模板，设计克隆引物。以提取到的蜡样芽孢杆菌基因组为模板，用相应的克隆引物经PCR扩增获得目标糖基转移酶基因片段BcGT1。将PCR扩增获得的目的糖基转移酶基因片段BcGT1经琼脂糖凝胶电泳验证后，参照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒方法对目的基因片段进行纯化回收，短期保存于-20℃冰箱内。糖基转移酶BcGT1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2：本实施例说明糖基转移酶基因表达载体的构建

为实现糖基转移酶的高效表达，在基因表达载体构建时，设计加入SUMO促溶标签和内含肽NHT内含肽NHT基因序列为SEQ ID NO：3，SUMO基因序列为SEQ ID NO：4。

SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。内含肽NHT与宿主蛋白基因存在于同一开放阅读框架(open reading frame，ORF)内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体后，内含肽NHT自我剪切融合蛋白，实现SUMO促溶标签融合的糖基转移酶BcGT1剪切为独自的结构域，从而促进成熟的蛋白的形成，保持糖基转移酶BcGT1较高的酶活性。

先将内含肽NHT基因用双酶切的方法插入至载体pET-28a-SUMO中，构建新载体pET-28a-SUMO-NHT。再将糖基转移酶BcGT1基因插入新载体，构建糖基转移酶的重组表达质粒pET-28a-SUMO-NHT-BcGT1。

表1 BcGT1融合表达引物设计

双酶切体系如下表所示。酶切体系在37℃下保温过夜。酶切后，载体片段和目的基因的酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳及Axygen DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

表2 双酶切反应体系

用T4 DNA连接酶进行连接反应，连接反应体系下表所示。16℃连接过夜。进而采用热休克法将重组连接反应液导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内。采用菌落PCR对平板上的菌落进行挑选。呈阳性的克隆送至公司进行测序验证。测序正确的菌株作为表达目的糖基转移酶的工程菌菌株，获得重组糖基转移酶BcGT1的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-SUMO-NHT-BcGT1。

表3 基因片段的连接反应体系

实施例3：本实施例说明糖基转移酶BcGT1的定点突变

以swiss-model在线服务器建立糖基转移酶BcGT1的三维结构模型，hotspotwizard在线软件进行热点扫描预测，将预测的活性中心周围氨基酸残基分别突变为丙氨酸，糖基转移酶BcGT1中突变为丙氨酸的位点分别为P18A、L59A、S60A、I64A、H80A、E86A、N108A、F133A、E142A、N181A、T325A、G326A。糖基转移酶BcGT1的突变体分别进行诱导表达，制备获得其突变体。以野生型糖基转移酶BcGT1或其突变体催化合成非天然人参皂苷，高效液相色谱检测产物，计算突变体催化底物的转化率和产物选择性。选出两个转化率和选择性相较野生型都提高的突变体P18A、F133A进行饱和突变；

将糖基转移酶BcGT1的饱和突变点中底物转化率和选择性提高的点作为迭代突变的候选点。糖基转移酶BcGT1序列中的第18位脯氨酸(P)突变为另外一种氨基酸残基选自下述的丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)；糖基转移酶BcGT1序列中的第133位苯丙氨酸(F)突变为另外一种氨基酸残基选自下述的丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)。

具体方法如下：

利用Agilent-quikchange primer design软件设计引物，蜡样芽胞杆菌来源的糖基转移酶BCGT1或其突变体质粒为模板，然后进行全质粒PCR定点突变。

表4 几种突变体的引物

表5 突变体全质粒扩增的PCR体系

表6 突变体全质粒扩增的PCR反应体系

模板消化：在50μL体系中加入1μL DpnI、5μL buffer，37℃保温45min-60min，冷却至4℃保存。琼脂糖凝胶电泳验证。

将上述突变后的PCR产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑选单克隆子，采用T7通用引物进行菌落PCR验证(T7：5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'，T7-Term：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')，挑选阳性的克隆子送公司进行DNA测序。挑取测序验证成功的阳性菌落接种于新鲜的含有卡那霉素的LB培养基内培养12h，冻存于-80℃冰箱内备用。

实施例4：本实施例说明糖基转移酶BcGT1及其突变体的诱导表达

将实施例3中所得的突变体，接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养12h，获得种子液。按2％(v/v)的接种量接入含有卡那霉素的新鲜LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养1～2h，当培养基OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导，20℃培养24h。

将发酵液离心收集菌体，用pH 7.4的磷酸缓冲洗涤两次并悬浮细胞。超声破碎，离心收集上清液，即得粗酶液。上清液作为菌体细胞内可溶蛋白待测样品，除去上清后剩余部分用1mL磷酸缓冲液重悬后作为胞内不可溶蛋白待测样品。蛋白表达情况，采用SDS-PAGE凝胶电泳分析。

结果表明：重组糖基转移酶BcGT1的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-SUMO-NHT-BcGT1进行诱导表达后，对重组糖基转移酶BcGT1进行电泳分析(图1)。利用标签蛋白SUMO、内含肽NHT融合设计，有助于糖基转移酶BcGT1的可溶性表达，并且大幅度地提高其异源表达水平；通过融合蛋白的内含肽NHT自剪切作用，获得较大量的具有独立功能域的重组糖基转移酶BcGT1，有利于保持糖基转移酶BcGT1的催化活性。

实施例5：本实施例说明糖基转移酶BcGT1及其突变体蛋白的分离纯化

通过His-Tag标签对目的蛋白进行纯化。首先通过1L摇瓶培养实现目的蛋白的大量表达，诱导表达结束后，合并收集菌液，在4℃、8000rpm条件下离心15min收集菌体。菌体用少量磷酸缓冲重悬，重悬菌液进行超声破碎处理。破碎后12000转/分钟离心10分钟，取上清液作为待分离母液。将Ni-NTA亲和层析树脂装入层析柱，按照Ni-NTA使用手册和依次用去离子水、MCAC-50缓冲液分别冲洗2个柱体积。将待分离母液转入层析柱，以0.5mL/min流速的MCAC-50缓冲液冲洗基线稳定，以除去未吸附的杂蛋白。随后提高咪唑浓度至10％，用MCAC-100缓冲液冲洗，除去结合力较弱的蛋白。随后，改用20％-50％咪唑的MCAC-150缓冲液冲洗，洗脱目的蛋白。收集目的蛋白洗脱液，SDS-PAGE凝胶电泳验证，将分子量正确的蛋白洗脱液透析，以除去体系中的咪唑。最后用50mM的磷酸缓冲(pH 7.38)缓冲体系保存纯化后的蛋白。

实施例6：本实施例说明糖基转移酶BcGT1催化反应条件的优化程序

通过Ni-NTA金属螯合柱层析技术实现了糖基转移酶BcGT1的纯化，进一步对糖基转移酶BcGT1的催化原人参三醇/原人参二醇的糖基化反应条件进行了测试。

HPLC检测分析程序：

仪器：戴安(DIONEX)P680高效液相色谱仪；分析柱：Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长：203nm；进样20微升；检测温度：30℃；流动相：甲醇-水＝65:35(v/v)，1mL/min。

结果显示：蜡样芽胞杆菌来源的糖基转移酶BcGT1有良好的合成非天然人参皂苷的能力(图2)，糖基转移酶BcGT1可以催化原人参三醇的糖基化反应，利用LC-MS和NMR对该产物进行分析，确证糖基转移酶BcGT1不仅可以合成人参皂苷Rh1，还可以合成原人参三醇-12-O-β-葡萄糖苷(12-O-β-Glc-PPT)和原人参三醇-3-O-β-葡萄糖苷(3-O-β-Glc-PPT)。

结果显示：糖基转移酶BcGT1可以催化原人参二醇的糖基化反应，利用LC-MS和NMR对该产物进行分析，确证糖基转移酶BcGT1不仅可以合成人参皂苷Rh2，还可以合成原人参二醇-12-O-β-葡萄糖苷(12-O-β-Glc-PPD)

通过Ni-NTA金属螯合柱层析技术实现了糖基转移酶BcGT1的纯化，在此基础上，进一步对糖基转移酶BcGT1的催化反应条件进行了研究，为后续应用于非天然人参皂苷的高效合成奠定基础。

不同温度对糖基转移酶BcGT1活性的影响(图3)：将反应体系分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下测定糖基转移酶的酶活。反应体系包含20mM原人参三醇(PPT)，0.5mM的UDP-Glc，5％(v/v)DMSO，1％(v/v)吐温80，200mU/mL纯化后的糖基转移酶BcGT1蛋白，50mM的磷酸缓冲(pH 7.4)，反应时间2h。

不同pH对糖基转移酶BcGT1活性的影响(图4)：在不同pH缓冲体系中测量糖基转移酶的反应活性，分别为50mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲(pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)，50mM的Tris-HCl缓冲(pH 7.5，8.0，8.5，8.9)，50mM的Gly-NaOH缓冲(pH 8.5，9.0，9.5，10.0，10.5)。反应体系包含20mM的原人参三醇(PPT)/原人参二醇(PPD)，0.5mM的UDP-Glc，5％(v/v)DMSO，1％(v/v)吐温80，200mU/mL纯化后的糖基转移酶BcGT1蛋白，在最适温度下反应时间2h。

糖基转移酶BcGT1的酶活测定方法：以原人参三醇(PPT)作为底物，反应体系包含0.2mmol/L磷酸缓冲液，0.1mmol/L的原人参三醇(PPT)，1mmol/L的UDP-Glc和待测定的糖基转移酶。反应置于30℃，200rpm条件下进行。反应1h后取100μL反应样品溶液并加入900μL甲醇终止反应，经过离心过滤处理后通过HPLC检测PPT的剩余量。酶活单位(U)定义为单位时间内(min)底物PPT的转化量(μmol)。

实施例7：本实施例说明糖基转移酶BcGT1突变体与蔗糖合成酶双酶催化合成非天然人参皂苷中的应用

本反应需要蔗糖合酶AtSuSy，根据Genbank注册号：AED92895.1，合成AtSuSy全长基因，并将其与克隆载体pET-28a连接，连接产物直接转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内，挑取单菌落进行PCR验证。将测序正确的菌株发酵，离心破碎后即得蔗糖合酶AtSuSy粗酶液，SDS-PAGE分析表达情况(图5)。

双酶偶联催化反应体系(图6)：以pH 7.5磷酸缓冲液为反应介质。反应总体积为300微升，其中含有20mM的原人参三醇(PPT)或原人参二醇(PPD)，400mM蔗糖，1％(v/v)吐温80，2％(v/v)DMSO，120mU/mL的AtSuSy酶液，200mU/mL的糖基转移酶BcGT1突变体酶液。30℃，600rpm在涡旋振荡器中反应24h，加入等体积甲醇终止反应。样品过膜处理后用高效液相色谱法(HPLC)检测目标产物。

结果表明(表7)：以原人参三醇(PPT)为底物，糖基转移酶BcGT1的突变体P18M/F133Y进行催化实验中，检测到Rt为42min的PPT底物峰(摘要附图)；在Rt为14min有明显的产物峰，其紫外吸收与底物一致。利用LC-MS和NMR对该产物进行分析，确证该产物为原人参三醇-12-O-β-葡萄糖苷(12-O-β-Glc-PPT)。

表7 糖基转移酶BcGT1及其部分突变体催化合成12-O-β-Glc-PPT的选择性及转化率

结果表明(表8)：以原人参二醇(PPD)为底物，糖基转移酶BcGT1的突变体有良好的合成非天然人参皂苷的能力，其中突变体F133S的合成效果最佳，转化率达85％以上，且选择性大于91％。表明该突变体能专一性的产生单糖基化产物12-O-β-Glc-PPD，选择性较高。利用糖基转移酶突变体和蔗糖合成酶构成的双酶偶联反应，可实现一步法直接制备非天然人参皂苷12-O-β-Glc-PPD产物，简化制备过程，可以大大降低生产成本，在生物制药工业中具有广阔的应用前景。

表8 糖基转移酶BcGT1及其部分突变体催化合成12-O-β-Glc-PPD的选择性及转化率

结果表明：糖基转移酶BcGT1的突变体有良好的合成非天然人参皂苷的能力，其中突变体F133S的合成效果最佳，转化率达85％以上和选择性大于91％。表明该突变体能专一性的产生单糖基化产物12-O-β-Glc-PPD，选择性较强。利用糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应，可实现一步法直接制备非天然人参皂苷12-O-β-Glc-PPD产物，简化制备过程，可以大大降低生产成本，在生物制药工业中具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用

<130> xb22060601

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatggcaa acgtactcgt aataaatttc cctggagaag gtcatataaa tccgacttta 60

gctattgtaa gtgagttaat tcggcgaggg gagacagttg tttcgtattg tattgaagat 120

tttagaaaga agattgaagc aacaggtgca gaattccgag agtttgagaa ttttctctct 180

caaattaata ttatggagcg agtaaatgaa ggtgggagtc ctttgacgat gctatctcat 240

atgattggag catcagagcg tattgttacc caaattgtag aagaaacaaa aggagaacag 300

tacgattact tactatacga taatcatttt ccagtaggac gtattatagc gaatgtttta 360

caattaccta gcgtttcgtc ttgtacaacg tttgctttta atcagtacat tacttttaac 420

gatgaacaag aatcgagaga agtagatgaa acgaatccat tatatcaatc ttgtttagcg 480

ggaatagaaa agtggaatag gaagtatgga atgaagtgta atagtatgta tgatattatg 540

aatcatcctg gtgatattac gattgtgtat acttcaaagg aatatcagcc gcgttcagat 600

gtattcgatg aatcgtataa gtttgtcggt tcatcaattg ctactcgaaa agaagtagat 660

agctttccta tggaagattt aaaaggtgaa aaattgattt tcatttctat gggaaccgtt 720

tttaatgaac aacctgagct atatgaaaaa tgttttgaag cttttaaaga tgtagaagcg 780

acagttgtat tagttgttgg taagaagata aatataagtc aatttgaaaa cattccggat 840

aactttaagt tgtataatta tgtgccacaa ttagaagtat tacagcatgc tgatgtattc 900

gtgacacacg gtggtatgaa tagttcgagt gaagcactct attacggtgt cccgttagtt 960

gtaattccgg taacaggaga tcagccttta gttgcgaaac gagtgaatga agtaggggca 1020

ggaataagac ttaaccgtaa agaattaact tctgaattgt tacgtgagac tgtaaagaaa 1080

gtaatgtatg atgtaacatt taaggaaaat agtcgtaaag ttggagcatc acttcgaaat 1140

gctggtggat ataaaagggc agttgatgaa atatttaaaa tgaaaatgaa ttcgtacttg 1200

aaacttaaat aa 1212

<210> 2

<211> 403

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Ala Asn Val Leu Val Ile Asn Phe Pro Gly Glu Gly His Ile

1 5 10 15

Asn Pro Thr Leu Ala Ile Val Ser Glu Leu Ile Arg Arg Gly Glu Thr

20 25 30

Val Val Ser Tyr Cys Ile Glu Asp Phe Arg Lys Lys Ile Glu Ala Thr

35 40 45

Gly Ala Glu Phe Arg Glu Phe Glu Asn Phe Leu Ser Gln Ile Asn Ile

50 55 60

Met Glu Arg Val Asn Glu Gly Gly Ser Pro Leu Thr Met Leu Ser His

65 70 75 80

Met Ile Gly Ala Ser Glu Arg Ile Val Thr Gln Ile Val Glu Glu Thr

85 90 95

Lys Gly Glu Gln Tyr Asp Tyr Leu Leu Tyr Asp Asn His Phe Pro Val

100 105 110

Gly Arg Ile Ile Ala Asn Val Leu Gln Leu Pro Ser Val Ser Ser Cys

115 120 125

Thr Thr Phe Ala Phe Asn Gln Tyr Ile Thr Phe Asn Asp Glu Gln Glu

130 135 140

Ser Arg Glu Val Asp Glu Thr Asn Pro Leu Tyr Gln Ser Cys Leu Ala

145 150 155 160

Gly Ile Glu Lys Trp Asn Arg Lys Tyr Gly Met Lys Cys Asn Ser Met

165 170 175

Tyr Asp Ile Met Asn His Pro Gly Asp Ile Thr Ile Val Tyr Thr Ser

180 185 190

Lys Glu Tyr Gln Pro Arg Ser Asp Val Phe Asp Glu Ser Tyr Lys Phe

195 200 205

Val Gly Ser Ser Ile Ala Thr Arg Lys Glu Val Asp Ser Phe Pro Met

210 215 220

Glu Asp Leu Lys Gly Glu Lys Leu Ile Phe Ile Ser Met Gly Thr Val

225 230 235 240

Phe Asn Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Glu Lys Cys Phe Glu Ala Phe Lys

245 250 255

Asp Val Glu Ala Thr Val Val Leu Val Val Gly Lys Lys Ile Asn Ile

260 265 270

Ser Gln Phe Glu Asn Ile Pro Asp Asn Phe Lys Leu Tyr Asn Tyr Val

275 280 285

Pro Gln Leu Glu Val Leu Gln His Ala Asp Val Phe Val Thr His Gly

290 295 300

Gly Met Asn Ser Ser Ser Glu Ala Leu Tyr Tyr Gly Val Pro Leu Val

305 310 315 320

Val Ile Pro Val Thr Gly Asp Gln Pro Leu Val Ala Lys Arg Val Asn

325 330 335

Glu Val Gly Ala Gly Ile Arg Leu Asn Arg Lys Glu Leu Thr Ser Glu

340 345 350

Leu Leu Arg Glu Thr Val Lys Lys Val Met Tyr Asp Val Thr Phe Lys

355 360 365

Glu Asn Ser Arg Lys Val Gly Ala Ser Leu Arg Asn Ala Gly Gly Tyr

370 375 380

Lys Arg Ala Val Asp Glu Ile Phe Lys Met Lys Met Asn Ser Tyr Leu

385 390 395 400

Lys Leu Lys

<210> 3

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actagtgctc tggctgaagg tacccgtatc ttcgacccgg ttaccggtac cacccaccgt 60

atcgaagacg ttgttggtgg tcgtaaaccg atccacgttg ttgctgctgc taaagacggt 120

accctgcacg ctcgtccggt tgtttcttgg ttcgaccagg gtacccgtga cgttatcggt 180

ctgcgtatcg ctggtggtgc tatcctgtgg gctaccccgg accacaaagt tctgaccgaa 240

tacggttggc gtgctgctgg tgaactgcgt aaaggtgacc gtgttgctca gccgcgtcgt 300

ttcgacggtt tcggtgactc tgctccgatc ccggctcgtg ttcaggctct ggctgacgct 360

ctggacgaca aattcctgca cgacatgctg gctgaagaac tgcgttactc tgttatccgt 420

gaagttctgc cgacccgtcg tgctcgtacc ttcggtctgg aagttgaaga actgcacacc 480

ctggttgctg aaggtgttgt tgttcacaac atg 513

<210> 4

<211> 290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggctagca tgtcggactc agaagtcaat caagaagcta agccagaggt caagccagaa 60

gtcaagcctg agactcacat caatttaaag gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc 120

aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt 180

aaggaaatgg actccttaag attcttgtac gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc 240

cctgaagatt tggacatgga ggataacgat attattgagg ctcacagaga 290

Claims

1.糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用，其特征在于，所述突变体为将糖基转移酶BcGT1的氨基酸序列中第18位、第133位氨基酸残基中一个或多个突变为另一种氨基酸残基得到；

所述糖基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述糖基转移酶BcGT1的第18位脯氨酸残基突变为丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸其中的任意一种；所述糖基转移酶BcGT1的第133位苯丙氨酸残基突变为丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸其中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖基转移酶BcGT1的突变体为F133Y突变体、F133S突变体、P18F/F133Y突变体、P18M/F133Y突变体或P18D/F133Y突变体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非天然人参皂苷为原人参三醇-12-O-β-葡萄糖苷、原人参二醇-12-O-β-葡萄糖苷或原人参三醇-3-O-β-葡萄糖苷。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用双酶偶联催化底物合成所述非天然人参皂苷；

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，双酶偶联催化体系中所述糖基转移酶的用量为40 mU/mL—320 mU/mL；蔗糖合成酶的量为50 mU/mL—300 mU/mL。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，双酶偶联催化体系中所述糖基转移酶的用量为200 mU /mL；蔗糖合成酶的量为120 mU /mL。

7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，双酶偶联催化体系中所述原人参三醇/原人参二醇的浓度为0.1 mM-30 mM；尿苷二磷酸浓度为0.1 mM-0.8 mM。

8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，双酶偶联催化体系中所述原人参三醇/原人参二醇的浓度为20 mM；尿苷二磷酸浓度为0.4 mM。

9. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，双酶偶联催化体系中还添加二甲亚枫DMSO和吐温80；DMSO添加浓度为5% V/V；吐温80添加浓度为1% V/V。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述双酶偶联催化体系反应温度为20~45℃；初始pH为6.5~10.5。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述双酶偶联催化体系反应温度为30℃；初始pH为7.5。