CN105247045A - 催化多酚糖基化的酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及催化多酚，特别是黄酮类化合物、苯甲酸衍生物、芪类化合物、查尔酮类化合物、色酮类化合物和香豆素衍生物糖基化的酶。在一个方面，本发明提供了一种催化多酚糖基化的酶，其中所述酶a)包含SEQ？ID？NO：7-12的序列之一的氨基酸序列；或b)由包含SEQ？ID？NO：1-6的序列之一的核苷酸序列的核酸编码；或c)与上述a)或b)限定的酶之一同源；或d)由一个核酸编码，所述核酸在严格条件下与互补于包含SEQ？ID？NO：1-6的序列之一的核苷酸序列的核酸杂交。

Description

催化多酚糖基化的酶

本发明涉及催化多酚，特别是黄酮类化合物、苯甲酸衍生物、芪类化合物、查尔酮类化合物、色酮类化合物和香豆素衍生物糖基化的酶。

多酚是通过莽草酸和苯丙烷途径生物合成的植物次生代谢产物。它们是在它们的环系统具有羟基的芳族化合物或其衍生物。黄酮类化合物和苯甲酸衍生物是多酚的例子。经由环系统中的羟基的二次修饰，形成这些化合物的多种天然衍生物。糖修饰在自然界中经常发生，因为它们对化合物的溶解度和功能可能有显著影响。多酚化合物是水果和蔬菜形式的我们日常营养中的一部分，并且已知对人类健康具有积极的影响。除了抗氧化和自由基清除功能外，它们能够发挥例如抗过敏、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、镇痛以及甚至癌保护(21)作用。由于这些广泛影响，在化妆品工业、制药工业和营养制品工业中对多酚类物质如具体的黄酮类化合物的需求日益增长(22-24)。满足这一需求的主要问题来自它们的可利用性有限。例如，黄酮类化合物仅仅以低水平在植物中产生。提取与大量溶剂的使用有关，且由于它们相当复杂的结构化学修饰不容易实现(25)。

由于定向化学修饰大多失败，多酚如黄酮类化合物的区域专一性修饰仍然很困难。因此，酶已经获得了关注，因为它们能够介导多酚的区域修饰和立体化学修饰(26)。特别是，研究集中于特定的糖基化，作为修饰影响多酚例如黄酮类化合物的水溶性和生物利用率(27,28)。催化反应的酶是糖基转移酶(GT)。通常，GT介导糖残基从供体底物到受体分子的转移。基于它们的序列相似性，GT目前分类为94个家族(29)。GT家族1(GT1)包括催化亲脂性小分子糖基化的酶(30)。使用核苷酸活化的供体的这些酶(EC2.4.1.x)属于UDP-糖基转移酶(UGT)超家族，并且也被称为Leloir酶(31，32)。作用于黄酮类化合物的糖基转移酶也属于GT1(33)。GT1的酶具有GT-B折叠结构并呈现出关于转移的糖部分的键合的反相反应机理(34)。EP2128265A1描述了真菌来源即来自木霉属(Trichoderma)的糖基转移酶，用于糖基化黄酮类化合物。EP1985704A1公开了也作用于黄酮类化合物的来自玫瑰植物的糖基转移酶。迄今为止，已经鉴定并且详细表征了极少数的原核来源的黄酮类化合物-作用GTl。目前已知的来源于革兰氏阳性细菌的接受黄酮化合物的UGT都属于甘露糖苷(macroside)糖基转移酶(MGT)亚族，且来源于杆菌(Bacilli)和链霉菌(Streptomycetes)(35-37；另见EP1867729A1和WO2009/015268A1)。此外，来源于革兰氏阴性黄单胞菌(Xanthomonascampestris)的单个黄酮类化合物作用UGT是已知的(38)。

因此，仍需要用于修饰如黄酮类化合物、色酮类化合物等多酚的方法。因此，本发明的一个目的是提供这样的方法。该目的通过独立权利要求的主题来解决。本发明的有利实施方案具体陈述在从属权利要求中。

在第一方面，本发明提供了催化多酚，例如酚酸衍生物、查尔酮类化合物、色酮类化合物、香豆素衍生物、黄酮类化合物和芪类化合物糖基化的酶，其中所述酶：

a)包含SEQIDNO：7-12的序列之一的氨基酸序列；或

b)由包含SEQIDNO：1-6的序列之一的核苷酸序列的核酸编码；或

c)与上述a)或b)限定的酶之一同源；或

d)由一个核酸编码，所述核酸在严格条件下与互补于包含SEQIDNO：1-6的序列之一的核苷酸序列的序列的核酸杂交。

本文所描述的新酶表示为GtfC、MgtB、MgtC、MgtS、MgtT和MgtW，其属于GT1家族并且对黄酮类化合物和类似分子等这样的多酚具有高度活性。

本文中的术语“包含”涵盖术语“具有”，即不被解释为：除了明确提及的要素外的其它要素一定存在于实施方案中。例如，术语“包含SEQIDNO：X的氨基酸序列的酶”也涵盖具有SEQIDNO：X的氨基酸序列的酶，在这种语境中，“具有”意指仅由SEQIDNO：X中的氨基酸组成。

在提及核酸、蛋白或肽时本文所用的术语“同源性”是指，一个核酸与另一核酸在其核苷酸序列上实质相同或相似，或蛋白或肽与另一种蛋白或肽在其氨基酸序列上实质相同或相似，但与相比较的核酸或蛋白或肽并不完全相同。两个核酸或蛋白或肽之间的同源性的存在可以通过以下方式来确定：比较第一序列中的位置与第二序列中的对应位置，从而确定在该位置是否存在相同或相似的残基。当存在某一最小百分比的相同或相似的核苷酸或氨基酸时，两条比较的序列彼此同源。同一性表示在等同位置比较两条序列时，存在相同的核苷酸或氨基酸。任选地，可能有必要考虑序列空位以便产生可能的最佳比对。相似的氨基酸是具有相同或同等化学和/或物理性质的非相同氨基酸。用具有相同或同等化学和/或物理性质的另一氨基酸替换氨基酸被称为“保守取代”。氨基酸的物理化学性质的实例是疏水性或电荷。就核酸而言，当编码序列中密码子内的一个核苷酸被替换为另一核苷酸时，其称为相似核苷酸或保守取代，新密码子例如由于遗传密码的简并性，仍然编码相同或相似的氨基酸。本领域技术人员知晓哪些核苷酸或氨基酸取代是保守取代。为了确定两个核酸之间的相似性或同一性程度，优选采用最小长度为60个核苷酸或碱基对，优选最小长度为70、80、90、100、110、120、140、160、180、200、250、300、350或400个核苷酸或碱基对，或各自核苷酸序列中至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％或99.5％的核苷酸的长度。对于蛋白/肽，优选采用最小长度为20，优选的最小长度为25、30、35、40、45、50、60、80或100，更优选的最小长度为120、140、160、180或200个氨基酸，或最小长度为比较的各个氨基酸序列的25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％或99.5％的氨基酸。特别优选各个蛋白或核酸的全长用于比较。两条序列的相似性或同一性程度可以例如通过使用计算机程序BLAST(19)使用标准参数测定，参见例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。同源性的确定依赖于比较的序列的长度。对于本发明的目的的两个核酸，其中较短的核酸包含至少100个核苷酸，当至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.2％或99.5％的核苷酸相同和/或相似(BLAST的“同一性(identities)”或“相似性(positives)”)，优选是相同时，将被认为是同源的。在序列长度为50-99个核苷酸的情况下，当至少80％、优选至少85％、86％、87％、88％、89％或90％的核苷酸相同和/或相似时，两个核酸被认为是同源的。在序列长度为15-49个核苷酸的情况下，当至少90％、优选至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％或99.5％的核苷酸相同和/或相似时，两个核酸被认为是同源的。在编码蛋白质或肽的核酸的情况下，如果翻译的氨基酸序列是同源的，则认为存在同源性。基于缩写为BLAST的计算机程序“BasicLocalAlignmentSearchTool(基本局部比对搜索工具)”(19)(例如见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，使用BLOSUM62取代矩阵(Henikoff,SandHenikoff,J.Aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks.ProcNatl.Acad.Sci.USA89:10915-10919,1992)，由于考虑了相似的氨基酸特别是那些不相同的氨基酸，其被指定为“相似(positive)”，即在BLOSUM62取代矩阵中具有相似性得分(positivescore)。对于本发明的目的，如果至少55％、优选至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.2％或至少99.5％的氨基酸相同或相似，优选相同，则认为两条氨基酸序列之间存在同源性。特别是，两条序列之间的同源性被假设为存在的时候，当使用采用标准参数的计算机程序BLAST(19)；参见例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/和BLOSUM62取代矩阵(20)时，获得至少55％、优选至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.2％或至少99.5％的同一性或相似性(“相似”)，优选同一性。本领域技术人员使用他的专业知识应容易地确定哪个可用的BLAST程序例如egBLASTp或PLASTn适合于测定同源性。此外，本领域技术人员知晓在必要时他可以使用的评估同源性的其它程序。这类程序例如可从欧洲生物信息研究所(EMBL)的网站(参见例如http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html)上获得。在本文中使用“x％同源性”或“x％的同源”等这类术语的情况下，这被解释为两个蛋白或核酸被认为是同源的，并具有x％例如80％的序列相似性或同一性，优选同一性。

在提到互补核酸的配对时，本文使用了术语“杂交”。杂交和杂交的强度(即，核酸之间的关联强度)受到以下因素的影响，如核酸之间的互补程度，涉及的条件的严格性，形成的杂交体的核酸的Tm(“熔解温度”)，和核酸内的G:C比)。

术语“在严格条件下杂交”指的是，在温度、离子强度以及其它化合物如有机溶剂的存在方面的高严格条件，在该条件下进行核酸杂交。在“高严格”条件下，仅在具有高频互补碱基序列的核酸之间发生核酸碱基配对。严格杂交条件是本领域技术人员已知的(例如参见GreenM.R.,Sambrook,J.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress；第4版，2012)。严格杂交条件的一个例子是，当使用约500个核苷酸长度的探针时，在42℃在由5×SSPE(43.8g/lNaCl，6.9g/lNaH₂PO₄H₂O和1.85g/lEDTA，pH值用NaOH调节至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt’s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中杂交，随后在42℃用含有0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液洗涤。

术语“糖基化”涉及碳水化合物作为糖基供体被连接至另一个分子(糖基受体)的羟基或其它官能团的反应。

术语“糖基供体”涉及一种碳水化合物，如单糖或低聚糖，其与合适的受体化合物反应以形成新的糖苷键。

术语“碳水化合物”包括碳的水合物，即具有化学计量公式C_n(H₂O)_n的化合物。通用术语包括单糖、低聚糖和多糖，以及通过还原羰基(糖醇)、通过一个或多个末端基团氧化为羧酸或通过用氢原子、氨基、硫醇基或类似基团替代一个或多个羟基基团而从单糖衍生的物质。它也包括这些化合物的衍生物。参见IUPAC，CompendiumofChemicalTerminology(化学术语纲要)，第2版("GoldBook")，由A.D.McNaughtandA.Wilkinson编译，Blackwell科学出版社，牛津大学(1997)，XML的在线修正版本：http://goldbook.iupac.org(2006-)，由M.Nic,J.Jirat,B.Kosata创建；由A.Jenkins更新编译，ISBN0-9678550-9-8.doi:10.1351/goldbook.最后更新:2014-02-24；版本:2.3.3；doi:10.1351/goldbook.C00820。

术语“多酚”涉及次级植物代谢产物，它们经由莽草酸和苯丙烷途径生物合成的，且它们是具有一个、两个或更多个羟基直接键合到它们的环系统的芳族化合物或它们的衍生物。

多酚的例子是黄酮类化合物、苯甲酸衍生物、芪类化合物、查耳酮类化合物、色酮类化合物和香豆素衍生物。

术语“黄酮类化合物”涉及一组化合物，包括由2-苯基苯并吡喃-4-酮(2-苯基-1,4-苯并吡喃酮)(例如槲皮素，芦丁)衍生的黄酮类化合物，由3-苯基苯并吡喃-4-酮(3-苯基-1,4-苯并吡喃酮)衍生的异黄酮类化合物，由4-苯基香豆素(4-苯基-1,2-苯并吡喃酮)衍生的新黄酮类化合物。该术语包括如黄酮类化合物(如木犀草素，芹菜素)，黄烷酮类化合物(如橙皮素，柚皮素，圣草酚)，黄酮醇类化合物(如桑色素，槲皮素，芦丁，山奈酚，杨梅素，异鼠李素，非瑟酮)，黄烷醇类化合物(如儿茶素，没食子儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶素酸盐)，黄烷酮醇(如黄杉素)，查耳酮类化合物(查耳酮衍生物，如异甘草素，根皮素，黄腐酚)，异黄酮类化合物(如木黄酮，黄豆苷元，甘草西定)，色酮类化合物，即色酮的衍生物(1,4-苯并吡喃酮，苯并吡喃-4-酮)，特别是羟基色酮衍生物(如去甲丁香色原酮)，花色素(如矢车菊，翠雀，二甲花翠素，花葵素，芍药色素，牵牛花色素)和橙酮类化合物(如金鱼草素)，和前述化合物类的酰化、糖基化、甲氧基化和磺化衍生物。另参见IUPAC，CompendiumofChemicalTerminology(化学术语纲要)，第2版("GoldBook")，由A.D.McNaughtandA.Wilkinson编译，Blackwell科学出版社，牛津大学(1997)，XML的在线修正版本：http://goldbook.iupac.org(2006-)，由M.Nic,J.Jirat,B.Kosata创建；由A.Jenkins更新编译，ISBN0-9678550-9-8.doi:10.1351/goldbook.最后更新:2014-02-24；版本:2.3.3；doi:10.1351/goldbook.F02424。

术语“芪类”涉及芪的羟基化衍生物，以及它们的衍生物，一个例子是白藜芦醇。

术语“香豆素”涉及香豆素(2H-色烯-2-酮，1-苯并吡喃-2-酮)的衍生物，特别是羟基化衍生物，例如7-羟基-4-甲基香豆素(4-MU，4-甲基伞形酮)。另参见IUPAC，CompendiumofChemicalTerminology(化学术语纲要)，第2版("GoldBook")，由A.D.McNaughtandA.Wilkinson编译，Blackwell科学出版社，牛津大学(1997)，XML的在线修正版本：http://goldbook.iupac.org(2006-)，由M.Nic,J.Jirat,B.Kosata创建；由A.Jenkins更新编译，ISBN0-9678550-9-8.doi:10.1351/goldbook.最后更新:2014-02-24；版本:2.3.3；doi:10.1351/goldbook.CO1369。

术语“苯甲酸衍生物”涉及苯甲酸的衍生物，特别是羟基化衍生物。

在优选实施方案中，与本发明的酶同源的酶与上述a)或b)限定的酶至少75％、更优选至少80％或85％、最优选至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、或至少99.5％同源。

在特别优选的实施方案中，本发明的酶包含或具有SEQIDNO：7的氨基酸序列，或由包含或具有SEQIDNO：1的核苷酸序列的核酸编码，或是与包含或具有SEQIDNO：7的氨基酸序列或被包含或具有SEQIDNO：1的核苷酸序列的核酸编码的酶具有至少75％、更优选至少80％或85％、最优选至少90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同源性的酶。

在第二个方面，本发明还涉及第一方面的酶的片段，其中所述片段包含所述酶的至少60、优选至少65、70、75、80、85、90、100、110或至少120个连续氨基酸，并且其中所述片段催化多酚的糖基化。

在第三个方面，本发明涉及编码本发明第一方面的酶或本发明第二方面的片段的核酸。优选地，所述核酸：

a)包含SEQIDNO：1-6的核苷酸序列之一或其片段，或

b)与上述a)限定的核酸之一同源，或

c)在严格条件与互补于上述a)限定的核酸的核酸杂交。

在本发明涉及核酸的片段或酶的片段的情况下，应当理解的是，在核酸的情况下，所述片段编码肽催化多酚糖基化的肽，或者在肽的情况下，所述片段催化多酚的糖基化。

核酸或其片段可被并入载体如质粒中，作为将核酸引入宿主细胞，例如真菌、细菌或植物细胞的方法。为了实现核酸或片段在细胞中的表达，可以将核酸功能性地连接到合适的启动子和/或其它调控序列。用于将这些载体引入宿主细胞的广泛的多种合适的载体和方法是本领域技术人员已知的。

在第四个方面，本发明涉及本发明第一方面的酶或第二个方面的片段用于多酚的糖基化的用途，所述多酚优选酚酸衍生物、黄酮类化合物、苯甲酸衍生物、芪类化合物、查尔酮类化合物、色酮类化合物和香豆素衍生物。

在第五个方面，本发明涉及一种用于制备多酚的糖苷方法，所述多酚优选酚酸衍生物、黄酮类化合物、苯甲酸衍生物、芪类化合物、查尔酮类化合物、色酮类化合物和香豆素衍生物，所述方法包括，在适于酶促反应的条件下，使多酚和糖基供体与权利要求1-3中任一项所述的酶或权利要求4所述的其片段进行反应，从而发生将糖基供体转移到多酚的羟基或其它官能团的步骤。

用于酶促糖基化反应的合适条件是本领域技术人员公知的，并且也可以从以下实施例和本文引用的现有技术文献推得。

现在，本发明通过以下实施例来描述，仅用于说明的目的。

细菌菌株、质粒和化学试剂

目前的工作中所用的细菌菌株和质粒列于表S1，引物列于下面的表S2中。

表S1所用的细菌菌株、载体和构建体

表S2用于基因扩增和序列分析的寡核苷酸和引物。

限制性内切核酸酶的识别位点用下划线标出(ID＝SEQIDNO:。

如果没有另外说明，在37℃在补充有合适的抗生素的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl)中生长大肠杆菌(Escherichiacoli)。在30℃在相同的培养基中生长芽孢杆菌(Bacillus)。所有使用的化学试剂均为分析纯实验级。多酚类物质是从设立在德国的以下公司购买：MerckKGaA,Darmstadt；CarlRothGmbH,Karlsruhe；Sigma-Aldrich,Heidelberg和ApplichemGmbH,Darmstadt。其他黄酮类化合物购自Extrasynthese(法国里昂)。多酚的储备溶液在100mM浓度的DMSO中制备。

DNA的分离和福斯粘粒文库构建

菌株芽孢杆菌HH1500最初分离自汉堡大学的植物园土壤样品。使用peqGOLD细菌DNA试剂盒(PEQLABBiotechnologie有限公司，德国埃尔兰根)按照制造商的流程分离来自芽孢杆菌HH1500的DNA。用于构建大象粪便文库的样品来源于哈根贝动物园(德国汉堡)。取得健康的命名为康提的六岁雌性亚洲象(Elephasmaximus)的新鲜粪便并储存在-20℃下含有30v/v％甘油的TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8)(体积/体积)中，直到DNA提取。对于DNA的提取，使用QIAamp粪便迷你试剂盒(QIAampDNAStoolMiniKit，Qiagen公司，希尔登，德国)。根据制造商流程使用该试剂盒。如同所建议的，将ASL缓冲液的孵育温度提高到95℃。用来自退潮时Glückstadt(德国)(53°44'40"N,009°,26′I4"E)附近的易北河的滩涂区的沉积物样品从易北河河流沉积物中分离DNA。使用由周和同事发表的基于SDS的DNA提取方法提取环境DNA(39)。

使用对先前公布稍作修改的版本(40)，根据制造商的流程用CopyControl^TM福斯粘粒文库制备试剂盒(CopyControl^TMFosmidLibraryProductionKit,EpicentreBiotechnologies,Madison,USA)实现携带福斯粘粒pCClFOS的大肠杆菌EPI300细胞中基因组文库和宏基因组文库的构建。将克隆转移到含有150μL的具有12.5μg/mL氯霉素的液体LB培养基的96孔微量滴定板中并使之生长过夜。将100μL86％的甘油加入每个微量孔后，文库贮存于-70℃。芽孢杆菌HH1500的基因组福斯粘粒文库包括1,920个克隆；对于易北河沉积物文库而言，共获得35000个克隆，大象粪便文库包括总计20000个克隆。所有的文库都包含平均插入物大小为35kb的福斯粘粒。

分子克隆策略

按照福斯粘粒克隆pFOS4B2和pFOS144C11的限制，使用HindIII将pCClFOS福斯粘粒的片段亚克隆到pBluescriptIISK+载体中。将所得的质粒分别命名为pSK4B2和pSK144C11。在pTZ19R-Cm中用限制酶EcoRI和PstI实现pSK144C11衍生片段的进一步亚克隆。得到的克隆分别命名为pTΖ144Ε和pTΖ144Ρ。通过热休g用质粒转化大肠杆菌DH5α，生长过夜后，在含有10μΜ5-溴-4-氯吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)和400μΜ异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB琼脂平板上通过蓝白斑筛选鉴定携带亚克隆的质粒。通过质粒纯化分析不同克隆，随后为酶促消化和琼脂糖凝胶电泳和/或DNA测序。

用福斯粘粒DNA作为模板进行可读框(ORF)的PCR扩增。反应进行30个循环。为了扩增mgtB，使用mgtl-XhoI正向引物和mgtl-XhoI位-反向引物，插入ORF的XhoI核酸内切酶限制性位点5'和3'(见表S2)。对于gtfC的克隆，使用引物对gtf-Nde-正向引物和gtf-Bam-反向引物，插入包括起始密码子5'的NdeI位点和ORF的BamHI位点3'(表S2)。使用QIAGENPCR克隆试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)将PCR片段连接到pDrive，并克隆到大肠杆菌DH5α。所得克隆分别被命名为pDmgtB和pDgtfC，分析其在生物转化中的活性，并通过DNA测序分析正确的插入物。使用每个ORF的插入的核酸内切酶限制性位点，将mgtB和gtfC连接到表达载体pET19b(Novagen公司，达姆施塔特，德国)。含有正确插入物的质粒分别被命名为pETl9mgtB和pET19gtfC。通分别使用T7终止子引物和mgtl-XhoI-正向引物确认mgtB并且使用T7终止子引物和gtf-Nde-正向引物确认gtfC，通过直接菌落PCR，检测携带所需质粒的大肠杆菌DH5α克隆。此外，使用T7启动子引物和T7终止子引物(表S2)对pETl9mgtB和pET19gtfC的插入物进行测序以验证构建体。

酶的过度生产和纯化

为了过度产生deca-组氨酸(His_10-)标记的蛋白，用pET19b构建体转化大肠杆菌BL21(DE3)。通过离心收获过夜预培养物，并且1％用于接种表达培养物。在22℃使携带pET19mgtB的细胞生长，直到OD₆₀₀为0.7。将培养物转移到17℃，用100μΜIPTG诱导。16小时后，于4℃通过7.500g离心来收获培养物。将细胞重悬浮于有0.3MNaCl且pH7.4的50mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并用UP200S(Hielscher，Teltow，德国)的S2超声波发生器，以0.5的周期和75％的振幅，通过超声破坏。

在37℃下，以OD₆₀₀为0.6，用100μΜIPTG诱导deca-组氨酸标记的GtfC的过度生产。然后将细胞孵育四小时，收获并裂解如上述用于MgtB。

在4℃以15.000g离心粗细胞提取物以沉淀细胞碎片。使用AKTAprimeplus系统(GEHealthcare)将澄清的提取物加载在1mL的HisTrapFF粗柱上。根据制造商的流程纯化酶，用于His-标记的蛋白的梯度洗脱。在4℃用0.3MNaCl将洗脱的蛋白质溶液针对1000体积pH7.4的50mMPBS两次透析。在12％SDS-PAGE上分析纯化。蛋白的浓度使用Roti-Quant(CarlRothGmbH,Karlsruhe,Germany)通过Bradford法测定。

生物转化和生物催化

为了在细菌中检测黄酮类化合物的修饰，使用生物转化方法。使培养物在有适当抗生素的LB培养基中生长过夜。如上所述制备表达培养物用于酶的过度生产。将细胞通过在4500g离心沉淀并重悬浮于补充有1w/v％α-D-葡萄糖的pH7的50mM磷酸钠缓冲液中。将由100mM在DMSO中的储备溶液接种的、黄酮类化合物终浓度为100μΜ即0.1％的生物转化物，于30℃和175rpm下在锥形瓶中孵育长达24小时。取出4mL样品并用100μL1MH₃PO₄水溶液酸化，用于在2mL乙酸乙酯中萃取。将它们振摇1分钟，通过在4℃和2000g离心进行相分离。将上清液应用于TLC分析中。为了进行定量，取出100μL样品并按1/10溶解在乙酸乙酯/乙酸3：1中。这些酸化乙酸乙酯样品在10,000g离心。上清液用于如下所述的定量TLC分析。

使福斯粘粒克隆在96深孔板中生长过夜。加入克隆，每个库(pool)96、48、8或6个克隆。通过在4500g离心收获库并重悬浮于含12.5μg/mL氯霉素、CopyControl^TM自动诱导溶液(Epicentre,Madison,WI)(5mM的L-阿拉伯糖终浓度)和100μΜ黄酮类化合物的50mLLB培养基中，用于生物转化。可替换地对于深孔板，在琼脂平板上预培养克隆。孵育过夜后，将菌落用50mMpH7的磷酸钠缓冲液洗掉，通过离心收获并如上概述进行重悬浮。在30℃在300ml锥形瓶中培养生物转化物，同时175rpm振荡。类似地测试单个克隆，但在5mlLB中预培养并重悬浮于100mL烧瓶中的20mL生物转化介质中。用40μLHCl水溶液酸化16、24和48小时后从反应物取出4mL样品，并如上所述制备用于TLC分析。在第二生物转化中验证阳性库，然后系统地小型化以检测较小的池中对应的命中(hit)，直到鉴定出负责的单个克隆。

1mL生物催化反应物含有5μg纯化的His标记的酶并在37℃下在50mMpH7的磷酸钠缓冲液中进行反应。在50mMpH7的磷酸钠缓冲液中，加入UDP-α-D-葡萄糖或UDP-α-D半乳糖，到最终浓度500μΜ，作为来自50mM储备溶液的供体底物。受体底物以100μΜ的浓度使用，并且从100mM在DMSO的储备溶液加入，从而导致在反应混合物中的终浓度为0.1％。将100μL反应混合物按1/10溶解在乙酸乙酯/乙酸3：1中，停止反应。这些样品直接用于定量TLC分析。

TLC分析

转移到HPLC平底小瓶的上清液用于TLC分析。将20μL的样品和200pmol参考黄酮类化合物施加于20×10cm²(HP)TLC硅胶60F254板(MerckKGaA，达姆施塔特，德国)。为避免物质的残留，即防止假阳性，通过ATS4.将样品点样，同时在中间进行双针管冲洗。取样TLC板用乙酸乙酯/乙酸/甲酸/水100：11：11：27(‘UniversalPflanzenlaufmittel’)显影(41)。分离后，在烘箱中在80℃将TLC板干燥5分钟。根据所施加的离析物在285-370纳米的最大吸光度，使用氘灯，在TLC扫描仪3(CAMAG，瑞士Muttenz)中，以光密度测定法测定分离条带的吸光度。随后，对显影的TLC板上的物质衍生化，即通过使用色谱浸没设备(CAMAG，瑞士Muttenz)将板浸渍在1％(w/v)二苯基硼酸β氨基乙基酯(DPBA)的甲醇溶液中一秒(42)，接着用风扇在热风中干燥TLC板。两分钟后，用UV手灯在365nm下使条带可视化并拍照。可替代地，通过TLC扫描仪3以光密度测定法确定条带的荧光，这取决于施加的物质在320至370纳米的最大吸光度。

通过TLC定量黄酮类化合物

为了量化生物转化和生物催化反应中的黄酮类化合物，将样品在乙酸乙酯/乙酸3:1中按1/10稀释以停止反应。通过的ATS4(CAMAG，瑞士Muttenz)将20μL样品和不同量的各自标准离析物和产物喷雾至HPTLC硅胶60F254板(MerckKGaA，达姆施塔特，德国)上。如上所述，对TLC板显影，干燥，衍生化和分析。从所施加的参考物质的峰面积计算回归曲线，以确定产生的黄酮类化合物和残留的黄酮类化合物的量。

HPLC-ESI-MS分析

用Rheos2000泵(FluxInstruments,Suisse)，且压力设定范围最小0巴、最大400巴，在PurospherStarRP-18e125-4柱(Merck,Darmstadt,Germany)上进行HPLC，粒径为3μm，。用溶剂A即补充有0.1％TFA的水；和溶剂B即含0.1％TFA梯度的乙腈，在以下梯度HPLC条件中：从0分钟，0.6mL/分钟90％A，10％B；从14分钟，0.6mL/分钟75％A，25％B；从18分钟，0.6mL/分钟5％A，B＝95％；从22分钟，0.6mL/分钟5％A，95％B；从22.1分钟，0.6mL/分钟，90％A，10％B；和从28.1分钟，0.6mL/分钟90％A，10％B，分离10μL进样体积。用Finnigan测量PDA检测器监测洗脱，通过HTCPAL自动进样器(CTCAnalytics)收集级分。在具有ESI接口的ThermoLCQDecaXPPlus上以阳离子化反应执行质谱(MS)。

序列分析和基因库登记

使用ABI377和染料终止子化学，按照制造商的说明书，进行小插入质粒的DNA自动测序。通过454测序技术确立大的福斯粘粒序列。通过使用Gap4软件组装所述序列。用Clonemanager9Professional软件进行ORF发现。这里提到的所有序列都保存在GenBank中，但优先权日之前没有公开。芽孢杆菌HH150016SrRNA基因的DNA序列的GenBank登录号为KC145729。在亚克隆pSK4B2上鉴定的来自芽孢杆菌HH1500的福斯粘粒衍生基因是bspA(JX157885)、mgtB(JX157886，SEQIDNO：2)和bspC(JX157887)。易北河沉积物宏基因组衍生的福斯粘粒亚克隆pSK144C11包括esmA(JX157626)、gtfC(AGH18139,SEQIDNO:1)、esmB(JX157628)和esmC(JX157629)。

结果

筛选方法：设置基于TLC的筛选方法，用于检测修饰黄酮类化合物的酶克隆。

“NaturstoffreagenzA”。因为已知的是蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)编码介导黄酮类化合物糖基化的糖基转移酶(36)，最初测试了来自申请人的菌株采集物的几个单细菌分离物的黄酮类化合物修饰活性。使用野生型分离物的全细胞进行的生物转化证实，菌株之一存在黄酮类化合物修饰酶。该菌株最初分离自汉堡植物园的土壤样品，并被命名为芽孢杆菌HH1500。16SrRNA基因(GenBank登记号为KC145729)的序列分析显示与蜡样芽孢杆菌组成员的同一性为100％(数据未示出)。为了使用该菌株作为阳性对照，在pCC1FOS中构建其基因组DNA的福斯粘粒文库。得到的文库包含1,920个克隆，平均插入物大小为35kb。因此，该文库包含大约67Mb克隆的gDNA，因此覆盖来自芽孢杆菌组成员的基因组的平均大小约十倍(43)。另外，使用异槲皮苷即3-O-β-D-葡糖苷槲皮素的连续稀释，通过在TLC板上喷洒10μL0.78μΜ至高达100μΜ的异槲皮苷溶液，并测量365nm下的吸光度，来验证基于(HP)TLC测定的灵敏度(表3)。此外，在10μM浓度测定10μL其它糖基化的黄酮类化合物，并且可以在吸光度色谱上检测为清晰的峰(表3，数据未示出)。

根据观察到的敏感性，设计系统的筛选方案。最初在37℃下在深孔微量滴定板中使96个福斯粘粒克隆生长过夜。然后合并培养物，并且该步骤之，将细胞通过离心沉淀，并重悬浮于含有适当的抗生素和100μM槲皮素作为受体底物的新鲜LB培养基中。在30℃下孵育16、24和48小时后，取出4mL合并的培养物样品并用一半体积的乙酸乙酯提取。将这些提取物的20μL施加在TLC硅胶板上，并使用“UniversalPflanzenlaufmittel'作为溶剂分离。在365nm处，以光密度测定法确定显影的样品泳道的吸光度。此外，底物和修饰的黄酮类化合物的条带通过用‘NaturstoffreagenzA’(42)，其含有二苯基硼酸β-氨基乙酯在甲醇中的1％溶液；和聚乙二醇4000在乙醇中的5％溶液(可从CarlRothGmbH,Karlsruhe,Germany获得)染色来可视化。在我们手中，测定的灵敏度是足够高，能检测96个克隆混合物中的单个修饰黄酮化合物的酶克隆。在检测到阳性信号后，将96个福斯粘粒克隆分为48个库以定位得到的两半个微量滴定板中一个的相同峰。在该步骤之后，将48个克隆分六次八个克隆，最后分析八个单独的克隆。这个策略成功地用来鉴定芽孢杆菌HH1500福斯粘粒文库中6个重叠的阳性克隆，测试了所有20个微量滴定板，总计1,920个克隆。

在这6个福斯粘粒克隆中，使用pBluescriptIISK+载体的HindIII限制性位点亚克隆大约46kb的一个克隆pFOS4B2。使用上述的TLC筛选技术分析所获得的亚克隆。由此，鉴定了被命名为pSK4B2的阳性亚克隆并对其完全测序(GenBank登记号JX157885-JX157887)。亚克隆pSK4B2携带3225bp的插入物并编码被命名为mgtB的基因，其编码402个氨基酸的蛋白质。亚克隆所鉴定的ORF，产生质粒pDmgtB，并再次测定活性。同样，TLC分析也清楚地证实了该构建体中MgtB酶的糖基化活性。MgtB的推导氨基酸序列(SEQIDNO：8)与预测的苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)甘露糖苷糖基转移酶(表1)高度相似。

表1：在衍生自活性芽孢杆菌HH1500福斯粘粒克隆的亚克隆pSK4B2和衍生自易北河沉积物活性福斯粘粒克隆的亚克隆pSK144C11上鉴定的可读框(ORF)。

在质粒pSK4B2中mgtB周围的DNA序列表示两个截短的基因，其与来自苏云金芽孢杆菌的基因几乎始终相同(表1)。此系统发育关系是根据芽孢杆菌HH1500的16SrRNA基因的初步序列分析(见上文)。

这些试验表明，该筛选方法适于大型插入宏基因组文库的功能性筛选。对于宏基因组的基于功能的筛选，这一方法被称为META即宏基因组提取物TLC分析。虽然其不是完全自动化的高通量筛选(HTS)技术，但META允许48小时内每TLC板筛选约1200个克隆，用于预培养、生物转化和分析。如果筛选是由单人完成，则这个数量的克隆似乎是可行的。通常，每小时由ATS4对约1TLC板的采样是该方法的时间限制步骤。但是，这仍然允许一天对几个板进行汇集筛选并且因此通过META一天高通量筛选数以千计个克隆。

从宏基因组文库鉴定新的糖基转移酶

为进一步应用筛选用于在宏基因组文库中发现酶，对申请人的实验室构建的两个福斯粘粒文库进行了测试。一个文库由分离自易北河沉淀物的DNA构建，另一个文库由从新鲜的大象粪便分离的DNA构建。两个文库总共包含大约50,000个克隆，插入物平均大小为35kb。使用槲皮素作为底物筛选这两个文库。使用所描述的策略，发现了易北河沉积物文库中的一个阳性微滴定板库。对这个库的进一步筛选导致被命名为pFOS144C11的单个阳性福斯粘粒克隆的鉴定。用48个克隆库对槲皮素(Q)的生物转化通过TLC分离呈现出一个产物峰(P2)，其具有与槲皮苷即槲皮素-3-O-β-L-鼠李糖苷相当的Rf值。在分别用6个克隆池和单个福斯粘粒克隆的转化中，观察到第二峰(P3)，其具有比可用参考槲皮素苷元更高的Rf值。克隆pFOS144C11携带大约40kb的福斯粘粒。随后用HindⅢ向pBluescriptIISK+的后续限制性片段亚克隆导致在阳性大肠杆菌DH5α亚克隆pSK144C11的鉴定。然而，用pSK144C11进行的生物转化显示两个产物峰，一个主峰(P2)，其Rf值与槲皮苷的Rf值相当，一个类似于异槲皮苷的小峰(P1)。亚克隆pSK144C11仍有约8.5kb大小的插入物。pSK144C11的进一步测序和亚克隆最后鉴定出推定负责修饰的基因，其被命名为gtfC。相应酶的推导的459个氨基酸序列(参见SEQIDNO：7)显示与UDP-葡萄糖醛酸/UDP-糖基转移酶的基序相似性。GtfC(SEQIDNO：7)显示出与覆盖92％的蛋白的革兰氏阴性细菌Fibrisomalimi的推定糖基转移酶71％的相似性(表1)。将gtfCORF进一步克隆到pDrive载体和用携带各自的构建体pDgtfC的大肠杆菌DH5α的生物转化，证实了GtfC的黄酮类化合物修饰活性。

总之，这些结果表明，开发的筛选程序META足够敏感，允许从显示黄酮类化合物修饰活性的个别细菌基因组(即芽孢杆菌HH1500)和复杂的宏基因组文库(即易北河沉积物文库)鉴定大插入克隆。

MgtB和GtfC的基于序列的分类

为了分析MgtB和GTFC紧密关系，使用MEGA版本5软件(44)计算系统发育树。通过ClustalW比对MgtB的氨基酸(aa)序列(SEQIDNO：8)和GtfC的氨基酸序列(SEQIDNO：7)，和由pBLAST确定的它们最亲近的基于序列的亲属的氨基酸序列。此外，对实际上公布的原核生物黄酮类化合物活性GT的序列进行比对，最后作为外部组的2个真核生物酶，即来自蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的黄酮类化合物糖基转移酶UGT85H2和来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的黄酮类化合物鼠李糖基转移酶UGT78D1(45-46，53)。用100个引导程序计算邻接树。正如预期的，来自芽孢杆菌HH1500的MgtB与来自蜡样芽胞杆菌群的其它MGTs聚类。在写该申请的时候，苏云金芽孢杆菌IBL200的MGT和蜡样芽孢杆菌G9842的MGT竟然是最接近的亲属，各自与MgtB的同一性为98％。两个MGT都被标注为预测酶但没有可用的底物数据。据报道，MGT聚簇的5种其它酶介导黄酮类化合物的糖基化。其中的三个即BcGT-1、BcGT-4和BcGT-3都源自蜡样芽孢杆菌ATCC10987(47-49)，据报道BcGT-1为与黄酮类化合物活性最接近的亲属。另一黄酮类化合物活性MGT被命名为BsGT-3，其来源于枯草芽孢杆菌菌株168(36)。其余的黄酮类化合物活性MGT是来自抗生链霉菌(Streptomycesantibioticus)的充分研究的OleD(50,51)。GtfC位于UGT的不同聚簇，并且似乎与来自噬纤维菌科(Cytophagaceae)细菌的假定酶即Dyadobacterfermentans和Fibrisomalimi多少相关。在这个聚簇内，已知仅UGTXcGT-2接受黄酮类化合物底物(38)。有趣的是，像来自拟杆菌(Bacteroidessp.)116的BSIG4748和来自鸟型分支杆菌(Mycobacteriumavium)的RtfA的鼠李糖基转移酶在系统发育上也显示出与这一聚簇紧密关系，但形成了一个独立的分支。

为了进一步表征鉴定的宏基因组衍生的GT，将C末端供体结合区域的氨基酸残基与最亲近亲属和已知的黄酮类化合物活性GT的基序进行比较。在这里，定位了Rossmann折叠α/β/α子域即UGT的保守的供体结合区域(52)。像UGT85H2和UGT78D1的植物UDP-糖基转移酶在这一地区中显示了高度保守基序，该基序被称为(植物次级产物糖基转移酶)PSPG(PlantSecondaryProductGlycosyltransferase)基序(45，53-54)。通过比对，可以鉴定出已知对NDP-糖结合重要的关键氨基酸。虽然MgtB透露了明确的UDP己糖结合基序由用于核糖结合的高度保守的Gln289和Glu310残基和保守的DQ组成，但是GtfC缺乏这个基序(45，55，56)。相反，GtfC呈现出用于脱氧核糖核苷酸利用(57)的典型的残基Phe336和Leu357。而且，可以鉴定出在MgtB氨基酸序列中的焦磷酸结合位点。然而，GtfC并不具备这些保守的磷酸盐结合残基，这表明GtfC和相关的酶具有另一供体结合模式。在此背景下，GTFC似乎属于强调低水平的序列同源性的新酶。

MgtB和GtfC的过表达和糖基化模式

为了进一步表征新酶并验证它们的功能，在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达MgtB和GtfC，并将其纯化为His-标记的蛋白。将两种基因mgtB和gtfC连接到表达载体pET19b中。在天然条件下通过镍亲和层析和梯度洗脱纯化含N末端His₁₀-标签的重组酶。可用纯化MgtB，每g细胞团(湿重)超过5mg。GtfC的最大产率是3mg/g细胞团。根据Laemmli在变性条件下通过SDS-PAGE分析验证蛋白的分子量。考马斯亮蓝染色后，在12％的SDS-PAGE上可见单条带形式的His₁₀-MgtB，其MW为50kDa。这与所计算的51.2kDa的分子量(MW)一致，包括N-末端His标签。His₁₀-GtfC揭示了在12％的SDS-PAGE上约55kDa的MW，这与所计算的54.7kDa的分子量(MW)一致，包括N-末端His标签。虽然用纯化的重组MgtB蛋白在SDS-PAGE上几乎没有额外的条带可见，但在加载有纯化GtfC的SDS-PAGE上仍然可见一些轻微污染的条带。总之，两种蛋白质都可被纯化以允许进一步的生化表征。

纯化的His₁₀-MgtB蛋白能够使用UDP-α-D-葡萄糖作为供体底物。重组酶催化α-D-葡萄糖残基转移到各种多酚。用500μM的UDP-α-D-葡萄糖作为供体和100μM受体底物进行生物催化反应。下面的黄酮类化合物充当受体底物并被修饰为具有高收率：木犀草素、槲皮素、山萘酚、银椴苷、柚皮素、染料木素(表2)。

表2：在生物测定中用重组MgtB转化的黄酮类化合物底物。在37℃下，用500μMUDP-葡萄糖、100μM各自的黄酮类化合物和5μg/mL纯化和重组的MgtB一式三份进行1mL的反应2小时。

^a粗体的Rf值和产物表示生物催化反应的主要产物。

^b由于不可用的参考物导致没有详细说明用“-”表示的产物。

因此黄酮醇被证明是最好的受体分子。通常，在两小时的测定过程中的转化范围为从柚皮素的52％到槲皮素和山奈酚的100％。有趣的是，在槲皮素和山萘酚的存在下，HPTLC分析监控到没有残留离析物。具体离析物和它们的所观察到的生物催化反应的苷元连同各自的Rf值总结在表2中。如果像在黄酮醇苷元槲皮素和山奈酚一样是可及的，MgtB偏爱在C3羟基处糖基化。此外，C7-OH被经证明用于黄酮木犀草素以及黄烷酮柚皮素和异黄酮染料木素的酶攻击并糖基化(表2)。如果之前C7-OH被糖基化，则MgtB糖基化还在C3’羟基处形成木犀草素的3’,7-二-O-葡萄糖苷。MgtB还催化了山奈酚衍生物银椴苷即山奈酚-3-O-6”-香豆基葡萄糖苷的转化。检测出一种Rf值为0.54的糖基化产物。在生物转化反应中用表达mgtB的大肠杆菌测试查耳酮黄腐酚和茋叔白藜芦醇，但是转化率没有量化(数据未显示)。黄腐酚产生了三种可检测的产物，而叔白藜芦醇的生物转化产生了1种通过吸收可观察到的产物。

TLC分析

使用UDP-α-D-葡萄糖和UDP-α-D-半乳糖和槲皮素作为受体分子，用重组且纯化的GtfC的试验表明，通过这种酶转移了dTDP活化的糖部分。生物转化试验的HPLC-ESI-MS分析进行证实了这一发现(见下面的段落)。不幸的是，脱氧核糖核苷酸活化的己糖如dTDP鼠李糖苷在商业上不可用于进一步更详细地分析获得的反应产物(58)。

用表达GtfC的大肠杆菌菌株以及使用各种多酚作为底物的生物转化，得到转化范围为从黄腐酚的52％到测试的大部分黄酮醇高达几乎100％周转(表3)。

表3：黄酮类化合物底物和用重组GtfC进行的生物转化试验的产物。如本文所述进行反应的定量。在30℃下，在含有1％(w/v)葡萄糖和200μM黄酮类化合物的50mMpH7.0的磷酸钠缓冲液(PB)中一式三份进行50mL反应。

^a粗体的Rf值和产物表示生物催化反应的主要产物。

^b由于不可用的参考物导致没有详细说明用“-”表示的产物是。

经过四小时的生物转化后槲皮素几乎被完全转化，并产生了三种可检测到的产物(P1-P3)。为了进一步表征这些产物，记录UV吸收光谱，并与槲皮素异槲皮苷和槲皮苷(59)的参考苷元比较。P1显示了与异槲皮苷的值相同的Rf值。而且，P1的UV吸收光谱与异槲皮苷的频谱匹配。P2显示了与一种已知槲皮苷的值相同的Rf值。P2也显示出与槲皮苷相同的UV吸收光谱。P3显示Rf值为0.82，这明显不同于已知的和可用的槲皮素苷元的RF值。相较于异槲皮苷，P3显示了波段I(bandI)与363nm的λ_最大类似的蓝移；但它显示了波段II仅5nm至272nm的较小蓝移，在280nm处有肩。还值得注意的是，槲皮素的生物转化产物的HPLC-ESI-MS分析一致鉴定了三种不同的反应产物。P1在HPLC分析中具有17.93分钟的RT，并显示了464u的分子质量，这相当于异槲皮苷。P2显示了18.06分钟的RT并具有448u的分子质量。该质量与槲皮苷的分子质量充分对应。最后，P3具有18.31分钟的RT并显示了446u的分子质量，这表明形成新的未进一步表征的槲皮素糖苷。

GtfC的槲皮素糖基化模式表明优先作用于介导不同的糖残基转移的C3羟基。但是如果C3OH-基团不存在，则GtfC会有效地催化其它位置的糖基化。根据其他羟基的可用性，转化C3处缺少羟基功能的黄酮。弱转化仅具有单个游离C7-羟基的车轴草醇并产生了一个可检测的产物。此外，3',4'-二羟基黄酮的生物转化产生了三种可检测的苷元，5-甲氧基-泽兰黄素的生物转化产生了两种产物(数据未显示)；单4'-羟基黄烷酮的生物转化产生了一种糖基化产物，柚皮素的糖基化产生了两种产物。柚皮素的主要生物转化产物显示与樱桃苷即柚皮素-7-O-葡萄糖苷相同的Rf值和吸收光谱(表3)。由于缺乏市售的参考物质不能进一步详细说明第二柚皮素苷元。总之，这些结果表明GtfC作用于黄酮类化合物母核的C3、C3'、C4'和C7羟基。

总之，这些数据证明，MgtB和GtfC具有感兴趣的生物催化性质。虽然MgtB专门介导葡萄糖残基的转移，但GtfC转移不同的己糖部分。MgtB能够催化已被糖基化的黄酮类化合物的糖基化以形成二苷(例如形成木犀草素-3'，7-二-O-葡萄糖苷)，甚至银椴苷以生成不能从天然资源获得的新糖苷。与此相反，GtfC的糖基化模式表明单个糖残基仅转移到糖苷配基黄酮类化合物形式。有趣的是，GtfC在黄酮类化合物母核的各个位置处的活性似乎有很大变化。这可能导致不能天然获得的真正的新黄酮类化合物的形成。因此，这两种酶可能会有助于生成新的天然化合物。

使用新的筛选技术，已经从土壤分离物(即芽孢杆菌HH1500)鉴定出甘露糖苷糖基转移酶MgtB。用来自该菌株的DNA建立的福斯粘粒文库(该菌株从当地的植物园分离)，仅最近才首先用于开发并验证概述的筛选技术；并且使用新的筛选技术，从近2000个克隆的库中很快鉴定出MgtB。重组MgtB的分离和纯化揭示了新的MGT。MgtB与来自蜡样芽胞杆菌ATCC10987的BcGT-1共享89％的氨基酸同一性，BcGT-1是公布的作用于黄酮类化合物的最近的亲属。据报道，BcGT-1催化黄酮、黄酮醇、黄烷酮和异黄酮(47)的糖基化。BcGT-1作用于黄酮醇的C3-、C7-和C4'-羟基，生成山奈酚(48)的三葡糖苷。相比之下，用MgtB生物催化山柰酚，只产生了两种可检测的糖基化产物。与槲皮素的替换反应产生了三种可检测的苷元。这些数据表明MgtB作用在C3'OH基。这一假设也得到以下观察资料的支持，即重组MgtB将木犀草素转化为-3',7-二-O-葡糖苷作为副产物。这些结果是与BcGT-3即来自蜡样芽孢杆菌ATCC10987(49)的另一MGT的糖基化模式一致。有趣的是，BcGT-3与MgtB共享仅40％的氨基酸同一性，但这两种酶作用于相同的黄酮类化合物，即在相同的位置从黄酮和黄酮醇形成二苷以及从柚皮素仅形成单葡糖苷。观察到的MgtB的最惊人的转化是银椴苷的转化。如果考虑MgtB的糖基化模式，该产物可能是7-O-葡糖苷。银椴苷在科学文献中还没有报道。这提出了产生新的天然化合物的可能性。还没有报道芽孢杆菌MGT的天然底物。其它MGT像OleD通常给甘露糖苷抗生素解毒，但往往具有广泛的受体耐受性(35，60)。

宏基因组衍生的GtfC被证明是全新的酶。到目前为止只报道了源自五种不同的原核生物(35，36，38，47，49)的七种黄酮类化合物活性UGT。在没有来自革兰氏阴性十字花科黑富病菌(X.campestris)ATCC33913的XcGT-2的情况下，所有剩余的均为来自革兰氏阳性杆菌和链霉菌的MGT酶。MGT在原核生物的异生防御机制中发挥重要作用，并因此表现出广泛的受体特异性(55，60)。这也适用于指向解毒的生物学原理(61)的真核UGT。据我们所知，GtfC是作用于黄酮类化合物的第一个宏基因组衍生的GT。此外，相较于通常严格的供体特异性像GtfS(57)，它也是报道的将各种dTDP活化的己糖转移至多酚的第一种细菌酶(见下文)。关于这样的概念，即原核生物中的许多NDP-糖是dTDP而不是UDP活化的，GtfC可能是糖基多样化途径中有希望的生物催化剂(58,62,63)。GtfC类似于来自噬纤维细菌科(Cytophagaceae)细菌的预测的GT(64-66)。这些革兰氏阴性菌有暗示广泛的次级代谢途径的大基因组，且众所周知它们存在针对抗生素如甲氧苄啶和万古霉素的抗性机制(67，68)。广为所知的是，外源化学物质的糖基化是在所有生命界普遍存在的解毒过程。噬纤维细菌科的系统发育上各种的成员只是最近才成为研究的对象，关于这个家族的系统发育广度的详细估计和精确的分类排名仍不清楚(65，69)。因此，宏基因组衍生的GtfC和其部分特征的鉴定表明，这组微生物可能是新GT以及其它酶的极有希望的资源。

GtfC的供体结合区域的ClustalW比对表明，活化的供体底物来源于脱氧胸腺嘧啶核苷。GtfC具有典型的用于胸腺嘧啶碱基堆积的氨基酸残基Phe336和用于脱氧核糖装配(57)的疏水Leu357。关于GT的供体结合，GtfC似乎没有表现出已知的用于焦磷酸结合的氨基酸残基。GtfC在氨基酸位置349含有ASn，而不是在迄今为止解决的蛋白质结构中的保守残基His/Arg(52，70)。这也适用于最近的GtfC亲属Dfer1940、F.limiBUZ3和Slin3970的UGT以及NGTRebG和BSIG4748。此外，GtfC未显示负责α-磷酸盐结合的保守Ser/Thr残基。相反，Gly354似乎对于类似于OleD转移酶(55)的α-磷酸盐结合是重要的。

的dTDP活化GtfC使用的共底物的假设得到以下观察结果的支持，即使用完整的大肠杆菌细胞，在生物转化中，GtfC转移葡萄糖、鼠李糖和分子量为446的第三糖残基。此外，用纯化的GtfC和使用UDP-α-D-葡萄糖或-半乳糖作为供体底物的生物催化方法失败。在细菌中，活化的糖即DTDP-α-D-葡萄糖、-4-酮-6-脱氧-α-D-葡萄糖或-4-酮-β-L-鼠李糖和-β-L-鼠李糖是dTDP糖生物合成途径的一部分，并且存在于大肠杆菌(71)中。此外，dTDP-糖的水平通过RmlA(72)的活性由dTDP-鼠李糖的水平进行变构调节。

鉴定了四种额外的糖基转移酶并被命名为MgtT、MgtC、MGTS和MgtW。

MgtT：

397个氨基酸(SEQIDNO：11)，基因1194碱基对(SEQIDNO：5)，来自芽孢杆菌BCHH1500；

与来自蜡样芽孢杆菌B4264(YP002367512)的MGT具有99％的氨基酸同一性；

用证明用于例如4-甲基伞形酮(4-MU,7-羟基-4-甲基香豆素)、根皮素、homoeriodytiol、柚皮素等的大肠杆菌DH5αpDrive::mgtT进行生物转化(全细胞催化)反应。

MgtC：

402个氨基酸(SEQIDNO：9)，基因1209碱基对(SEQIDNO：3)，来自芽孢杆菌BCG+1；

与MGTaus蜡样芽孢杆菌ATCC10987(NP978481)具有95％的氨基酸同一性；

用证明用于芹菜素、木犀草素、槲皮素、柚皮素、homoeriodytiol、根皮素、去甲丁香色原酮等的大肠杆菌DH5αpDrive::mgtC进行生物转化(全细胞催化)反应。

示例性反应式：

UDP-α-D-葡萄糖+黄酮->黄酮-β-D-葡糖苷+UDP

MgtS：

392个氨基酸(SEQIDNO：10)，基因1179碱基对(SEQIDNO：4)，来自枯草芽孢杆菌BSHH14；

与zuMGTYjiCaus枯草芽孢杆菌(YP007533161)具有99％的氨基酸同一性；

在用大肠杆菌BL21(DE3)::pET19bmgtS进行生物转化(全细胞催化剂)反应和用证明用于根皮素、homoeriodytiol、柚皮素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、4-甲基伞形酮、去甲丁香色原酮等的酶进行生物催化。

示例性反应式：

UDP-α-D-葡萄糖+多酚->多酚-β-D-葡糖苷+UDP

MgtW：

402个氨基酸(SEQIDNO：12)，基因1209碱基对(SEQIDNO：6)，来自芽孢杆菌BCHH03；

与来自韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)KBAB4(YP001644794)的MGT具有99％的氨基酸同一性；

用证明用于槲皮素、根皮素、homoeriodyctiol等的大肠杆菌DH5αpDrive::mgtW进行生物转化(全细胞催化剂)反应。

示例性反应式：

UDP-α-D-葡萄糖+槲皮素->槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷+UDP

序列概述(aa＝氨基酸数，bp＝碱基对数，PRT＝蛋白质，nt＝核苷酸)：

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Claims (9)

1.催化多酚糖基化的酶，其中所述酶：

a)包含SEQIDNO：7-12的序列之一的氨基酸序列；或

b)由包含SEQIDNO：1-6的序列之一的核苷酸序列的核酸编码；或

c)与上述a)或b)限定的酶之一同源；或

d)由一个核酸编码，所述核酸在严格条件下与互补于包含SEQIDNO：1-6的序列之一的核苷酸序列的序列的核酸杂交。

2.如权利要求1所述的酶，其中所述酶与上述a)或b)限定的酶至少75％、更优选至少80％或85％、最优选至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％或99.5％同源。

3.如权利要求1或2所述的酶，其具有SEQIDNO：7的氨基酸序列，或由具有SEQIDNO：1的核苷酸序列的核酸编码，或是与具有SEQIDNO：7的氨基酸序列或被具有SEQIDNO：1的核苷酸序列的核酸编码的酶具有至少75％、更优选至少80％或85％、最优选至少90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同源性的酶。

4.权利要求1-3中任一项所述酶的片段，其中所述片段包含所述酶的至少60，优选至少65、70、75、80、85、90、100、110或至少120个连续氨基酸，并且其中所述片段催化多酚的糖基化。

5.编码权利要求1-3中任一项所述的酶或权利要求4所述的片段的核酸。

6.如权利要求5所述的核酸，其中所述核酸：

a)包含SEQIDNO：1-6的核苷酸序列之一或其片段，或

b)与上述a)限定的核酸之一同源，或

c)在严格条件与互补于上述a)限定的所述核酸的核酸杂交。

7.权利要求1-3中任一项所述的酶或权利要求4所述的片段用于多酚的糖基化的用途，所述多酚优选为酚酸衍生物、黄酮类化合物、苯甲酸衍生物、芪类化合物、查尔酮类化合物、色酮类化合物和香豆素衍生物。

8.用于制备多酚的糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：在适于酶促反应的条件下，使多酚和糖基供体与权利要求1-3中任一项所述的酶或权利要求4所述的其片段进行反应，从而将糖基供体转移到所述多酚的羟基或其它官能团。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述多酚是酚酸衍生物、黄酮类化合物、苯甲酸衍生物、芪类化合物、查尔酮类化合物、色酮类化合物和香豆素衍生物。