CN102549155A

CN102549155A - 新型糖基转移酶、新型糖基转移酶基因和新型糖供体化合物

Info

Publication number: CN102549155A
Application number: CN2010800436082A
Authority: CN
Inventors: 小关良宏; 佐佐木伸大; 长泽和夫; 寺正行; 松叶由纪; 中村晴香; 阿部裕
Original assignee: Tokyo University of Agriculture
Current assignee: Tokyo University of Agriculture
Priority date: 2009-08-07
Filing date: 2010-01-21
Publication date: 2012-07-04
Also published as: US8722868B2; EP2463366A1; EP2463366A4; JP5761718B2; EP2463366A9; JPWO2011016260A1; WO2011016260A1; EP2463366B1; US20120135469A1

Abstract

本发明的目的是提供包含除了糖核苷酸以外的糖供体化合物的糖供体试剂和能够使用除了糖核苷酸以外的糖供体化合物催化糖基转移反应的酶。本发明提供了以下：包含式(a)化合物的糖供体试剂：

其中，r¹独立地选自氢、或c_1-6烷基、c_2-6烯基和c_2-6炔基，其中每一个基团是未取代的或被选自oh、f、cl、br、i、cn、no₂和so₂的一个或多个基团取代，n为0、1、2、3、4或5，m为0或1，且x代表由其异头碳原子上的β-键结合的单糖；能够使用所述糖供体催化糖基转移反应的糖基转移酶；和包含编码所述糖基转移酶的dna的糖基转移酶基因。

Description

新型糖基转移酶、新型糖基转移酶基因和新型糖供体化合物

技术领域

本发明涉及新型糖基转移酶、包括编码所述糖基转移酶的DNA的糖基转移酶基因和其用途。另外，本发明涉及用于糖基转移反应的新型糖供体化合物。

背景技术

通常，与相应的未糖基化的化合物相比，通过糖基化特定化合物获得的糖基化化合物可能具有提高的稳定性和溶解性。因此，已对用于糖基化多种化合物的糖基转移反应进行了积极的研究。另外，糖基转移反应可应用于糖链合成。因此，糖基转移反应是突出的研究主题之一。

在自然界中有观察到的已知的糖基转移反应，其参与了植物花瓣或果实的颜色形成。例如，专利文献1描述了一种方法，其包括将来自牵牛花的基因整合到不同的植物上以将葡萄糖转移到在3位具有糖的类黄酮的糖部分上，从而提供具有与天然植物不同的颜色的花瓣。

有许多已知的糖基转移反应，其中糖核苷酸例如UDP-葡萄糖用作糖供体。例如，非专利文献1描述了使用UDP-葡萄糖作为糖供体，来源于日本罗勒、马鞭草或类似植物的UDP-葡萄糖：花色素5-糖基转移酶催化将糖转移至花色素的5位的羟基上的反应。非专利文献2描述了使用UDP-葡萄糖作为糖供体，来自日本罗勒、玉米(Zea mays)、龙胆、葡萄或类似植物的UDP-葡萄糖：类黄酮3-糖基转移酶催化将糖转移至类黄酮或花色素的3位的羟基上的反应。专利文献2描述了使用UDP-葡萄糖作为糖供体，来源于金鱼草属(antirrhinum)的酶催化将糖转移至查尔酮的4’位的羟基上的反应。另外，专利文献1描述了使用UDP-葡萄糖作为糖供体，由其中整合的基因编码的糖基转移酶催化转移葡萄糖的反应(见专利文献1中的实施例4)。

引用列表

专利文献

专利文献1：日本专利公布(Kokai)号2003-289884A

专利文献2：WO2005/059141

非专利文献

非专利文献1：J.Biol.Chem.，第274卷，第11期(1999)7405-7411页

非专利文献2：J.Biol.Chem.，第276卷，第6期(2001)4338-4343页

发明概述

如上所述，有许多已知的用糖核苷酸作为糖供体的糖基转移反应。然而，有很少已知的用除了糖核苷酸以外的化合物作为糖供体的糖基转移反应。例如，在植物色素的研究中为检验糖基转移酶的功能，将糖核苷酸用作糖供体是必要的。但是，糖核苷酸在化学上是不稳定的且因此难以分离。所以，糖核苷酸是相对昂贵的试剂且在某些情况下难以获得。由于这些原因，需要能起糖供体作用的除了糖核苷酸以外的化合物。

本发明人在研究康乃馨花瓣色素的过程中发现了在康乃馨中起糖供体作用的化合物。以前未知这种化合物是否会起糖供体作用。

康乃馨花瓣包含多种色素。色素的主要实例是通过花色素(且特别是天竺葵色素或矢车菊色素)的3或5位的糖基化形成的花色苷。但是，本发明人聚焦在：取决于康乃馨的品种，存在不具有其中花色素的5位被糖基化的花色苷的康乃馨的事实。本发明人预测到：康乃馨具有将糖转移到花色素的5位上的糖基转移酶。进一步地，本发明人假设糖基转移酶使用的糖供体积累在不具有其中花色素的5位被糖基化的花色苷的康乃馨中。因此，本发明人研究了不具有在5位被糖基化的花色苷的康乃馨花瓣的提取物，并由此在提取物中发现了起糖供体作用的化合物。进一步地，本发明人在康乃馨花瓣提取物中和飞燕草花瓣提取物中发现了使用这种新型糖供体催化糖基转移反应的新型糖基转移酶，从而鉴定了包括编码该糖基转移酶的DNA的糖基转移酶基因。

根据本发明，在以上发现的基础上提供了新型糖基转移酶、包括编码该糖基转移酶的DNA的糖基转移酶基因和其用途。进一步地，提供了包含新型糖供体化合物的糖供体试剂和使用所述糖供体试剂的用于糖基化多酚的新方法和多酚糖基化试剂盒。

本发明概述如下。

(1)一种蛋白质，是以下(a)或(b)：

(a)包含SEQ ID NO：1或3中提供的氨基酸序列的蛋白质；

(b)包含通过缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸而来源于SEQ ID NO：1或3中示出的氨基酸序列的氨基酸序列并具有糖基转移酶活性的蛋白质。

(2)一种糖基转移酶基因，包含编码根据(1)所述的蛋白质的DNA。

(3)一种糖基转移酶基因，包含以下(c)至(e)之一的DNA：

(c)包含SEQ ID NO：2或4中示出的核苷酸序列的DNA；

(d)在严格条件下与包含与SEQ ID NO：2或4中提供的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交且编码具有糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；或

(e)包含SEQ ID NO：2或4中提供的核苷酸序列的简并异构体的DNA。

(4)一种重组载体，包含根据(2)或(3)所述的糖基转移酶基因。

(5)一种转化子，通过使用根据(4)所述的重组载体转化宿主细胞获得。

(6)一种转染了根据(2)或(3)所述的糖基转移酶基因的植物或具有与所述植物相同的特征的所述植物的后代。

(7)一种用于产生根据(1)所述的糖基转移酶的方法，包括培养根据(5)所述的转化子。

(8)一种包含式(A)化合物的糖供体试剂：

其中

R¹和R²独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基和C_2-6炔基，其中每一个基团未被取代或被选自OH、F、Cl、Br、I、CN、NO₂和SO₂的一个或多个基团取代；n为0、1、2、3、4或5；m为0或1；且X代表由其异头碳原子上的β-键结合的单糖。

(9)根据(8)所述的糖供体试剂，其中R¹独立地选自氢或未被取代或被选自OH、F、Cl、Br和I的一个或多个基团取代的C_1-6烷基。

(10)根据(9)所述的糖供体试剂，其中X选自由葡萄糖、葡糖醛酸、半乳糖、木糖、芹菜糖、阿洛糖、鼠李糖、阿拉伯呋喃糖和甘露糖组成的组。

(11)根据(10)所述的糖供体试剂，其中式(I)或(II)化合物为1-O-β-香兰基葡萄糖、1-O-β-异香兰基葡萄糖、1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖、1-O-β-对香豆基葡萄糖、1-O-β-咖啡基葡萄糖、1-O-β-阿魏酰葡萄糖、或1-O-β-芥子酰葡萄糖。

(12)一种用于糖基化多酚的方法，包括将多酚与根据(8)至(11)任一项所述的糖供体试剂和糖基转移酶反应。

(13)根据(12)所述的糖基化方法，其中所述多酚为类黄酮。

(14)根据(12)或(13)所述的糖基化方法，其中所述糖基转移酶来源于具有非红色花瓣的康乃馨或来源于飞燕草。

(15)根据(12)或(13)所述的糖基化方法，其中所述糖基转移酶是根据(1)所述的蛋白质。

(16)一种多酚糖基化试剂盒，包括根据(8)至(11)任一项所述的糖供体试剂和根据(1)所述的糖基转移酶。

使用本发明的糖供体试剂使得无糖核苷酸例如UDP-葡萄糖的糖供体反应能够进行。另外，使用本发明的糖基转移酶和糖基转移酶基因可提供能够使用除了糖核苷酸以外的糖供体催化糖基转移反应的酶。

本说明书包含本申请的优先权文件：日本专利申请第2009-011253号和第2009-184030号的说明书、权利要求书、和/或附图中公开的部分或全部内容。

附图简述

图1示出了表示由于将1-O-β-香兰基葡萄糖用作糖供体的糖基转移反应，由矢车菊色素3-O-β-葡糖苷产生矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷的HPLC分析结果。

图2示出了通过以SDS-PAGE分离从康乃馨纯化的糖基转移酶并通过银染色法可视化糖基转移酶获得的结果。

图3示出了预测是来源于康乃馨的糖基转移酶的cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)和预测的由该核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)。

图4示出了表示由于使用从转化了来源于康乃馨的糖基转移酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)获得的粗制酶液的糖基转移反应，由矢车菊色素3-O-β-葡糖苷产生矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷的HPLC分析结果。

图5示出了预测是来源于飞燕草的糖基转移酶的cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)和预测的由该核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：3)。

图6示出了表示由于使用从转化了来源于飞燕草的糖基转移酶基因的大肠杆菌获得的粗制酶液的糖基转移反应，由矢车菊色素3-O-β-葡糖苷产生除了矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷以外的产物的HPLC分析结果。

图7示出了在四个不同发育阶段的康乃馨花瓣(A)，在茎、叶和在四个不同发育阶段的花瓣中糖基转移酶活性的水平和积累的花色苷的量的分析结果(B)，和编码糖基转移酶的基因在茎、叶和在四个不同发育阶段的花瓣中的表达水平(C)。

图8示出了表示由于使用香兰酸作为底物并使用UDP-葡萄糖作为糖供体的糖基转移酶反应，产生1-O-β-香兰基葡萄糖的HPLC分析结果。

图9示出了表示由于使用对羟基苯甲酸作为底物和使用UDP-葡萄糖作为糖供体的糖基转移反应，产生推测为1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖的反应产物的HPLC分析结果。

图10示出了表示由于在从康乃馨花瓣获得的粗制酶液的存在下诱发的使用1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖作为糖供体的糖基转移反应，由矢车菊色素3-O-β-葡糖苷产生矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷的HPLC分析结果。

图11示出了表示由于在从飞燕草花瓣获得的粗制酶液的存在下诱发的使用1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖作为糖供体的糖基转移反应，由矢车菊色素3-O-β-葡糖苷产生矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷的HPLC分析结果。

图12示出了由于使用重组的来源于飞燕草的糖基转移酶的反应，产生的花色苷的NOE差光谱。

实施方案说明

[1]糖供体化合物

本发明的新型糖供体化合物具有由以下式(A)表示的结构：

在式(A)中，R¹选自氢、C_1-6烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基(且同样适用于下文的C_1-6烷基))、C_2-6烯基(例如，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1，1-二甲基-2-丁烯基或2-甲基-3-戊烯基(且同样适用于下文的C_2-6烯基))、和C_2-6炔基(例如，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、1，1-二甲基-2-丁炔基或2-甲基-3-戊炔基(且同样适用于下文的C_2-6炔基))。此处，C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br、I、CN、NO₂、SO₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基、和C_2-6炔基组成的组的至少一个成员取代。优选地，R¹选自氢或C_1-6烷基(条件是C_1-6烷基可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br和I组成的组的至少一个成员取代)。更优选地，R¹选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基(其中每一个可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br和I组成的组的至少一个成员取代)。特别优选地，R¹选自氢或甲基。在式(A)中，n为0、1、2、3、4或5，优选0、1、2、3或4，且特别优选1、2或3。在式(A)中，m为0或1。

如果式(A)中m为0，本发明的新型糖供体化合物优选地具有由以下式(I)或(II)表示的结构：

在式(I)和(II)中，R¹和R²独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基和C_2-6炔基。此处，C_1-6烷基、C_2-6烯基和C_2-6炔基的每一个可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br、I、CN、NO₂、SO₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基和C_2-6炔基组成的组的至少一个成员取代。优选地，R¹和R²独立地选自氢和C_1-6烷基(条件是C_1-6烷基可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br和I组成的组的至少一个成员取代)。更优选地，R¹和R²选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基(其中每一个可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br和I组成的组的至少一个成员取代)。特别优选地，R¹和R²的每一个选自氢或甲基。在式(I)中，R¹为甲基且R²为氢或R¹为氢且R²为甲基是最优选的。在式(II)中，最优选R¹为氢。

如果在式(A)中m为1，本发明的新型糖供体化合物优选地具有由下式(III)、(IV)或(V)表示的结构：

在式(III)、(IV)和(V)中，R¹、R²和R³独立地选自氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基和C_2-6炔基。此处，C_1-6烷基、C_2-6烯基和C_2-6炔基的每一个可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br、I、CN、NO₂、SO₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基和C_2-6炔基组成的组的至少一个成员取代。优选地，R¹和R²的每一个独立地选自氢或C_1-6烷基(条件是C_1-6烷基可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br和I组成的组的至少一个成员取代)。更优选地，R¹、R²和R³的任一个选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基(其中每一个可被或可不被选自由OH、F、Cl、Br和I组成的组的至少一个成员取代)。特别优选地，R¹、R²和R³的每一个选自氢或甲基。在式(III)中，R¹为氢是最优选的。在式(IV)中，R¹为氢且R²为甲基是最优选的。在式(V)中，R¹为氢且R²和R³的每一个都为甲基是最优选的。

另外，在式(A)和式(I)至式(V)中，X代表由其异头碳原子上的β-键结合的单糖。本文所用的表述“由其异头碳原子上的β-键结合的糖”是指这种情况：其中以使得非糖部分(糖苷配基)定位在糖X的β位上的方式由醚键将该部分与该糖的异头碳原子上的羟基键合。单糖的实例包括：己糖例如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖或塔罗糖；戊糖例如核糖、阿拉伯糖、木糖或来苏糖；丁糖例如赤藓糖或苏糖；和丙糖例如甘油醛。另外，本文所用的糖包括其衍生物。糖衍生物的实例包括：还原衍生物例如糖醇、脱氧糖和烯糖；氧化衍生物例如醛糖酸、糖醛酸、和醛糖二酸；脱水衍生物例如反烯糖和脱水糖；磷酸酯化产物；醋酸酯化产物；氨基糖；硫糖；糖蛋白；糖酯；和糖醚。优选地，单糖选自葡萄糖、葡糖醛酸、半乳糖、木糖、芹菜糖、阿洛糖、鼠李糖、阿拉伯呋喃糖和甘露糖。更优选地，单糖选自葡萄糖、葡糖醛酸、半乳糖、木糖、芹菜糖和阿洛糖。最优选地，单糖是葡萄糖。进一步地，单糖可以是右旋或左旋形式但优选右旋形式。

式(I)化合物的特别优选的实例是下式的1-O-β-香兰基葡萄糖：

例如，可用以下方式制备1-O-β-香兰基葡萄糖。对康乃馨花瓣(根据日本园艺植物颜色标准带有红色且特别优选带有与亮红色(0406)相似的颜色)进行使用有机溶剂例如醇(例如甲醇、乙醇或丙醇)或乙腈、其水溶液或通过向该有机溶剂或其水溶液中加入有机酸(例如甲酸或三氟乙酸)获得的溶液萃取。然后，使用反相柱例如ODS柱通过HPLC纯化萃取物。除了上述以外，为上述1-O-β-香兰基葡萄糖的异构体的由下式表示的1-O-β-异香兰基葡萄糖，是式(I)化合物的特别优选的实例：

包括1-O-β-香兰基葡萄糖和1-O-β-异香兰基葡萄糖的式(I)化合物可从天然产品提取，或可选地，可通过常规已知的方法使用商业上可利用的试剂合成。进一步地，其可通过使用已知的糖基转移酶将糖转移至相应的芳香族羧酸上来合成。

式(II)化合物的特别优选的实例是由下式表示的1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖：

另外，包括1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖的式(II)化合物可从天然产品提取，或可选地，可通过常规已知的方法使用商业上可利用的试剂合成。进一步地，其可通过使用已知的糖基转移酶将糖转移至相应的芳香族羧酸上来合成。

式(III)化合物的特别优选的实例是由下式表示的1-O-β-对香豆基葡萄糖：

式(IV)化合物的特别优选的实例是由下式表示的1-O-β-咖啡基葡萄糖：

式(IV)化合物的特别优选的实例是由下式表示的1-O-β-阿魏酰葡萄糖：

式(V)化合物的特别优选的实例是由下式表示的1-O-β-芥子酰葡萄糖：

另外，包括1-O-β-对香豆基葡萄糖、1-O-β-咖啡基葡萄糖、1-O-β-阿魏酰葡萄糖或1-O-β-芥子酰葡萄糖的式(III)至(V)化合物的任何一种可从天然产品提取，或可选地，可通过常规已知的方法使用商业上可利用的试剂合成。另外，例如，其可通过Matsuba Y等人，Plant Biotechnology第25卷，第4期(2008)，369-375页中所述的酶学方法合成。

[2]糖供体试剂

本发明涉及包含式(A)化合物的糖供体试剂。本文所用的术语“糖供体试剂”是指当与糖基转移酶组合使用时能够糖基化任意化合物的试剂。

使用本发明的糖供体试剂可糖基化任何化合物。然而，本发明的糖供体试剂特别适合于多酚糖基化。多酚的实例包括：基于类黄酮的多酚；基于绿原酸的多酚例如绿原酸；基于苯基羧酸的多酚例如单宁酸；基于鞣花酸的多酚例如鞣花酸；基于木酚素的多酚例如芝麻素；基于姜黄素的多酚例如姜黄素；和基于香豆素的多酚例如香豆素。

本发明的糖供体试剂适合于糖基化多酚，且特别是类黄酮。术语“类黄酮”总体是指各具有1，3-二苯基丙烷作为其基本骨架的一组化合物。已知类黄酮是导致多种色调在植物中表现的主要色素化合物。类黄酮的实例包括查尔酮、黄酮、黄酮醇、黄烷、黄烷酮、黄烷醇、二氢黄酮醇、异黄酮和花色素。

本发明的糖供体试剂适合于糖基化类黄酮，且特别是花色素和花色素衍生物。花色素是被糖基化形成花色苷的化合物，花色苷是广泛发现于植物中的色素。取决于取代基例如-OH或-OMe位置的不同，有多种类型的花色素。可被本发明的糖供体试剂糖基化的花色素并无特别限制。然而，花色素的优选实例包括天竺葵色素、矢车菊色素、翠雀色素、橙花苷(aurantinidin)、木犀草啶、芍药花青素、锦葵色素、牵牛花色素、蓝雪花色素(europinidin)、玫瑰色素(rosinidin)和选自以上实例的衍生物的任何化合物。花色素的特别优选的实例包括矢车菊色素或天竺葵色素和其衍生物。矢车菊色素和天竺葵色素是被以下示出的式结构上表征的化合物：

矢车菊色素

天竺葵色素

当使用本发明的糖供体试剂糖基化花色素或其衍生物时，发生糖基化的位置可以是任何位置，只要可以在该位置将糖键合到花色素或其衍生物上。然而，本发明的糖供体试剂在3、5或7位糖基化花色素或其衍生物方面，且尤其是在5或7位糖基化(优选用葡萄糖)矢车菊色素、天竺葵色素或其任何一种的衍生物方面是卓越的。

本文所用的术语“花色素衍生物”是指有至少一个羟基已由醚键与单糖、寡糖或多糖键合的花色素、或是有至少一个氢原子或羟基被取代基例如卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、环烷基、羰基、酯基、醚基、酰胺基、氨基、氰基、硝基、磺酰基、或亚硫酰基取代的花色素。

[3]用于糖基化的方法和糖基化试剂盒

另一方面，本发明涉及用于糖基化多酚的方法，其包括允许多酚与包含式(A)化合物的糖供体试剂和糖基转移酶反应。多酚的实例包括：基于类黄酮的多酚、基于绿原酸的多酚例如绿原酸、基于苯基羧酸的多酚例如单宁酸、基于鞣花酸的多酚例如鞣花酸、基于木酚素的多酚例如芝麻素、基于姜黄素的多酚例如姜黄素、和基于香豆素的多酚例如香豆素。

本发明的用于糖基化的方法适合于糖基化多酚，且特别是类黄酮。类黄酮的实例包括查尔酮、黄酮、黄酮醇、黄烷、黄烷酮、黄烷醇、二氢黄酮醇、异黄酮和花色素。

本发明的用于糖基化的方法适合于糖基化类黄酮，且特别是花色素或花色素衍生物。可通过本发明的糖基化方法糖基化的花色素的实例并无特别限制。然而，花色素的优选实例包括天竺葵色素、矢车菊色素、翠雀色素、橙花苷、木犀草啶、芍药花青素、锦葵色素、牵牛花色素、蓝雪花色素、玫瑰色素和选自以上实例的衍生物的任何花色素。花色素的特别优选的实例包括矢车菊色素或天竺葵色素和其衍生物。

当通过本发明的糖基化方法糖基化花色素或其衍生物时，发生糖基化的位置可以是任何位置，只要可以在该位置将糖键合到花色素或其衍生物上。然而，本发明的糖基化方法在3、5或7位糖基化花色素或其衍生物方面，且尤其是在5或7位糖基化(优选用葡萄糖)矢车菊色素、天竺葵色素或其任何一种的衍生物方面是卓越的。

本发明的糖基化方法中使用的糖基转移酶并无特别限制，只要其是能够使用式(A)化合物作为糖供体催化糖基转移反应的酶。然而，可优选使用来源于康乃馨的酶。康乃馨(学名：香石竹(Dianthus caryophyllus))是属于石竹目(Caryophyllales)石竹科(Caryophyllaceae)石竹属(Dianthus)的一种植物，且其作为观赏植物已广泛分布。特别优选从康乃馨花瓣提取的糖基转移酶用于本发明的糖基化方法中。例如可通过包括将粉末(通过在液氮中研磨花瓣获得)溶解在磷酸钾缓冲液中并向其中加入硫酸铵溶液以沉淀蛋白的方法提取糖基转移酶。根据需要由此提取的糖基转移酶可在经过透析或HPLC纯化后使用。例如，可用以下方式进行纯化：在约5.6至7.2的pH下通过阴离子交换剂(例如，Resouce Q(GE Healthcare)或DEAE琼脂糖凝胶(GE Healthcare))吸附提取的糖基转移酶，然后根据线性浓度梯度洗脱法用NaCl水溶液洗脱。可选地，使用磷酸缓冲液(pH 7.2)通过苄脒-琼脂糖凝胶载体(苄脒琼脂糖凝胶；GE Healthcare)，一种亲和层析载体，吸附提取的糖基转移酶，然后根据线性浓度梯度洗脱法用4-氨基苄脒洗脱。

存在许多类型的康乃馨，且其花瓣颜色随类型而各异。然而用于本发明的糖基化方法中的糖基转移酶优选从具有除了红色(且特别是根据日本园艺植物颜色标准的类似于亮红色(0406)的红色)以外的颜色例如白色、黄色、粉红色或紫色且特别是粉红色(具体地，根据日本园艺植物颜色标准的类似于鲜艳的红宝石(0107)的颜色)或紫色(具体地，根据日本园艺植物颜色标准的类似于鲜艳的紫红色(9207)的颜色)的康乃馨花瓣提取。任何康乃馨品种可用于本发明，只要花瓣颜色符合以上颜色中的任一种。如上所述，康乃馨花瓣的颜色是根据日本园艺植物颜色标准(由日本颜色研究所出版)确定的。特别优选地，用于本发明的糖基化方法中的糖基转移酶是从具有粉红色(具体地，根据日本园艺植物颜色标准的类似于鲜艳的红宝石(0107)的颜色)的康乃馨花瓣提取的。具有这种粉红色花瓣的康乃馨品种的实例包括“微笑樱桃(Beam Cherry)”、“灰姑娘(Cinderella)”和“喇叭口(Bell mouth)”。用于本发明的糖基化方法中的糖基转移酶的最优选的实例是具有通过SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析确定的约55kDa的分子量和5.0至5.5的最适反应pH的糖基转移酶，其选自从具有如上所述的粉红色的康乃馨花瓣提取的糖基转移酶。

另外，可优选来源于飞燕草的酶用作本发明的糖基化方法中的糖基转移酶。飞燕草(学名：大花翠雀(Delphinium grandiflorum L.)；日本名：Oohienso)是属于毛莨科(Ranunculaceae)翠雀属(Delphinium)的一种植物。特别优选使用从飞燕草花瓣提取的酶作为用于本发明的糖基化方法中的糖基转移酶。可通过用于从康乃馨花瓣提取糖基转移酶的前述方法提取糖基转移酶。

另一方面，本发明涉及包括上述的糖供体试剂和糖基转移酶的多酚糖基化试剂盒。

[4]糖基转移酶

本发明的糖基转移酶是上述的来源于康乃馨或来源于飞燕草的糖基转移酶。本发明的糖基转移酶的实例是包括SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的蛋白质。本发明的糖基转移酶包括与包括SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的蛋白质功能上相当的蛋白质。所以，本发明的糖基转移酶包括包含通过缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸来自于SEQ ID NO：1或3中提供的氨基酸序列的氨基酸序列且具有糖基转移酶活性的蛋白质。

此处，术语“多个氨基酸”是指2至5个且优选2至3个氨基酸。关于相关序列号的氨基酸序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代可通过用常规技术例如位点特异性诱变(例如，见Zoller等人，Nucleic AcidsRes.10 6478-6500，1982)修饰编码包含每个序列号的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列进行。此处，优选氨基酸残基的取代是保守取代。已知保守取代可发生在以下氨基酸残基之间：甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)、甘氨酸和丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)和苏氨酸(Thr)、苏氨酸和丝氨酸(Ser)或丙氨酸、和赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)。

另外，本发明的糖基转移酶包括具有糖基转移酶活性并包含与SEQ IDNO：1或3的氨基酸序列具有80％或更大的同一性、优选90％或更大的同一性、更优选95％或更大的同一性和进一步优选98％或更大的同一性的氨基酸序列的蛋白质。

优选被本发明的糖基转移酶用作糖供体的化合物是具有式(A)结构的上述糖供体化合物。在式(A)化合物的实例中，特别优选使用式(I)至(V)化合物作为糖供体化合物。另外，尤其优选使用1-O-β-香兰基葡萄糖、1-O-β-异香兰基葡萄糖、1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖、1-O-β-对香豆基葡萄糖、1-O-β-咖啡基葡萄糖、1-O-β-阿魏酰葡萄糖和1-O-β-芥子酰葡萄糖作为糖供体化合物。以上描述了关于式(A)化合物的细节。

本发明的糖基转移酶适合于糖基化多酚。本发明的糖基转移酶适合于糖基化多酚，优选类黄酮，且特别优选花色素或花色素衍生物。特别地，本发明的糖基转移酶适合于糖基化矢车菊色素或天竺葵色素和其衍生物。更特别地，本发明的糖基转移酶适合于在花色素或其衍生物的3、5或7位，且特别是矢车菊色素、天竺葵色素或其任何一种的衍生物的5或7位糖基化(优选用葡萄糖)。以上描述了这些多酚的细节。

[5]糖基转移酶基因

本发明的糖基转移酶基因是编码具有导致糖从上述糖基转移酶(即，糖供体)转移到任意化合物(即，任意化合物的糖基化)的活性的蛋白质的基因。特别地，本发明的糖基转移酶基因是包含编码上述糖基转移酶的DNA的糖基转移酶基因。本发明的糖基转移酶基因的具体实例包括包含具有SEQ ID NO：2或4的核苷酸序列的DNA的基因。

本发明的糖基转移酶基因包括与包含具有SEQ ID NO：2或4的核苷酸序列的DNA的基因功能上相当的基因。此处，表述“功能上相当的基因”是指其中由目的基因编码的蛋白质具有与由本发明的糖基转移酶基因编码的蛋白质的那些生物和生化功能相当的生物和生化功能的情形。本领域技术人员已知的用于制备与特定基因功能上相当的基因的方法的实例是使用杂交技术(例如，见Sambrook，J等人，Molecular Cloning(分子克隆)第二版，9.47-9.58，Cold Spring Harbor Lab.press(1989))的方法。因此，本发明的糖基转移酶基因包括包含在严格条件下与包含与SEQ ID NO：2或4的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交并编码具有糖基转移酶活性的蛋白质的DNA的基因。

此处，术语“严格条件”是指：即，形成特异性杂合子，但不形成非特异性杂合子的条件。这些条件包括低严格条件和高严格条件。但是，优选高严格条件。低严格条件包括例如杂交后在42℃下，5×SSC和0.1％SDS洗涤且优选在50℃下，5×SSC和0.1％SDS洗涤。高严格条件包括例如杂交后在65℃下，0.1×SSC和0.1％SDS洗涤。包括与SEQ ID NO：2或4的核苷酸序列高度同源(即，具有80％或更大、优选90％或更大、更优选95％或更大、且进一步优选98％或更大的同源性或具有80％或更大、优选90％或更大、更优选95％或更大、且进一步优选98％或更大的同一性)的核苷酸序列的DNA可在上述严格条件下与包括与该DNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交。

另外，本发明的糖基转移酶基因包括包含具有SEQ ID NO：2或4的核苷酸序列的DNA的基因的简并异构体。此处，术语“简并异构体”是指能够编码与由上述基因编码的蛋白质相同的蛋白质但是具有简并密码子的DNA。例如，包含SEQ ID NO：2或4的核苷酸序列的DNA的简并异构体具有与该序列的氨基酸对应的简并密码子。更特别地，可以说在简并异构体中，对应于Asn的密码子(AAC)已被其简并密码子(例如AAT)代替。

[6]包含糖基转移酶基因的重组载体

进一步地，本发明涉及包含上述糖基转移酶基因的重组载体。可通过将上述糖基转移酶基因引入到合适的载体上来构建本发明的重组载体。载体的类型无特别限制。可使用的载体的实例包括pBI、pPZP、pSMA、pUC、pBR、pBluescript、pET、pGEM、pKS1和pTriEXTM载体(TAKARA)；和pTrcHis2-TOPO载体(Invitrogen)。另外，可使用病毒载体例如花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆金色花叶病毒(BGMV)和烟草花叶病毒(TMV)。可选地，可使用pBI双元载体。

例如，为了将基因插入载体，可使用包括使用合适的限制性内切酶裂解待插入的分离的DNA且然后在合适载体DNA的限制性内切酶位点或多克隆位点插入DNA片段以连接到载体DNA上的方法。

以允许基因在其中发挥作用的方式将上述基因整合到载体上是必要的。为了这一目的，允许载体在基因内部、上游或下游包含例如启动子、内含子、增强子、翻译终止密码子、终止子、多聚腺苷酸添加信号和5′-非翻译区序列的元件。另外，载体可包含选择标记基因。常规已知的载体元件可以以合适的方式组合使用。

能够在植物细胞中发挥作用的启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂碱合酶基因启动子(Pnos)、来源于玉米(Zeamays)的泛素启动子、来源于水稻的肌动蛋白启动子、来源于烟草的PR蛋白启动子、来源于矮牵牛的EPSP合酶启动子和chsA启动子。在这些中，已知花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子是系统表达的启动子。另外，已知来源于矮牵牛的EPSP合酶启动子或chsA启动子在花瓣中发挥作用。

能够在细菌细胞中发挥作用的启动子的实例包括：嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的生麦芽糖淀粉酶基因启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的α淀粉酶基因启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的BAN淀粉酶基因启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的碱性蛋白酶基因启动子和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的木糖苷酶基因启动子；噬菌体λ的PR或PL启动子，和大肠杆菌的lac、trp或tac启动子。

能够在酵母宿主细胞中发挥作用的启动子的实例包括来源于酵母糖酵解系统的基因的启动子、醇脱氢酶基因启动子、TPI1启动子和ADH2-4c启动子。能够在真菌中发挥作用的启动子的实例包括ADH3启动子和tpiA启动子。能够在昆虫细胞中发挥作用的启动子的实例包括多角体蛋白启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒蛋白启动子、杆状病毒极早期基因1启动子和杆状病毒39K迟早期基因启动子。能够在哺乳动物中发挥作用的启动子的实例包括SV40启动子、MT-1启动子、CMV启动子和腺病毒-2主要晚期启动子。

另外，使用用土壤杆菌(Agrobacterium)异戊烯基转移酶(ipt)基因获得的启动子或胭脂碱合酶(nos)基因启动子、从用作转化宿主的植物的基因组获得的高表达基因的启动子或类似启动子是可能的(Genschik等人，Gene，148，195-202(1994))。进一步地，使用包含多个上述启动子的组合并具有明显增加的启动子活性的嵌合启动子也是可能的(Plant J.，7，661-676(1995))。

可使用的增强子的实例包括来源于病毒的翻译增强子和来源于植物的翻译增强子。来源于病毒的翻译增强子的实例包括烟草花叶病毒、苜蓿花叶病毒RNA4、雀麦草花叶病毒RNA3、马铃薯病毒X和烟草H病毒的序列(Gallie等人，Nuc.Acids Res.，15，8693-8711(1987))。另外，来源于植物的翻译增强子的实例包括来源于大豆β-1，3葡聚糖酶(Glu)的序列(Isao Ishida和Norihiko Misawa撰写，Kodansha Scientific编辑，“Manualsfor Cell Engineering Experimental Operations(Saibo-Kogaku Jikken SousaNyumon)(细胞工程实验操作手册(Saibo-Kogaku Jikken Sousa Nyumon))”，Kodansha Ltd.，第119页(1992))和来自烟草铁氧化还原蛋白-结合亚基(PsaDb)的序列(Yamamoto等人，J.Biol.Chem.，270，12466-12470(1995))。进一步地，增强子的实例包括包含CaMV 35S启动子的上游序列的增强子区、SV40增强子和CMV增强子。翻译终止密码子的实例包括例如TAA、TAG或TGA的序列。

终止子的实例包括胭脂碱合酶(NOS)基因终止子、章鱼碱合酶(OCS)基因终止子、CaMV 35S终止子、大肠杆菌脂蛋白lpp 3′终止子、trp操纵子终止子、amyB终止子和ADH1基因终止子。

选择标记基因的实例包括抗药性基因(例如，四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、大观霉素抗性基因、氯霉素抗性基因和新霉素抗性基因)、荧光或发光报告基因(例如，萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶(GUS)和绿色荧光蛋白(GFP))、和酶例如新霉素磷酸转移酶II(NPT II)和二氢叶酸还原酶的基因。

[7]转化子

本发明还涉及可通过将包含上述糖基转移酶基因的重组载体引入合适宿主而产生的转化子。

只要引入的基因可在其中表达，这些宿主不受限制。宿主的实例包括细菌例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，酵母例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，和真菌例如曲霉菌(Aspergillus)、脉孢菌(Neurospora)、镰刀霉(Fusarium)和木霉菌(Trichoderma)。另外，可将单子叶植物或属于十字花科(Brassicaceae)、樟科(Lauraceae)、番荔枝科(Annonaceae)、茄科(Solanaceae)、蔷薇科(Rosaceae)和类似科的双子叶植物的植物细胞、昆虫细胞例如sf9和sf21和哺乳动物细胞例如HEK293细胞、HeLa细胞和中国仓鼠卵巢细胞用作宿主。

为引入基因或重组载体，可使用常规已知的方法例如土壤杆菌法、PEG-磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、基因枪法和微注射法。可将引入的基因整合到宿主的基因组DNA上或其可在宿主中以外源载体存在。

[8]转染有糖基转移酶基因的植物

另外，本发明涉及通过使用包含上述糖基转移酶基因的重组载体转化获得的转染有糖基转移酶基因的植物，或具有所述植物的特征的植物后代。

为制备转化的植物，可适当地使用多种已报道的且已建立的方法。这些方法的优选实例包括生物学方法例如使用病毒、土壤杆菌的Ti质粒或Ri质粒或类似物作为载体的方法，和物理学方法例如使用电穿孔、聚乙二醇、基因枪或微注射(Plant Genetic Transformation and Gene Expression；alaboratory manual(植物遗传转化和基因表达实验手册)，J.Draper等人编辑，Blackwell Scientific Publication(1988))、或硅晶须(silicon whiskers)(Euphytica，85，75-80(1995)；In Vitro Cell.Dev.Biol.，31，101-104(1995)；Plant Science，132，31-43(1998))以基因导入的方法。本领域技术人员可合理地选择和使用这些基因导入方法。

使用编码本发明的新型糖基转移酶的基因而经受转化的植物的实例包括单子叶植物例如百合、兰花和天南星科观叶植物(araceous foliageplant)和双子叶植物例如马铃薯、菊花、玫瑰、康乃馨、矮牵牛、丝石竹、仙客来、紫菀、鼠尾草和龙胆。特别优选的植物的类型是菊花、康乃馨、玫瑰、矮牵牛和类似植物。在上述植物中，使用本发明的糖基转移酶而经受转化的植物的实例包括不具有本发明的糖基转移酶活性的植物；也就是说，缺少本发明的糖基转移酶的植物和其中本发明的糖基转移酶不起作用的植物。

为产生根据发明的转化的植物，用本发明的基因转化植物材料。植物材料的实例包括生长点细胞、芽原基、分生组织、叶盘、茎盘、根盘、块茎盘、叶柄盘、原生质体、愈伤组织、花粉囊、花粉、花粉管、花梗盘、花茎盘、花瓣、花萼盘和类似材料。

当使用植物细胞作为植物材料时，转化的植物从所获得的转化细胞的再生可通过已知的组织培养方法进行。本领域技术人员可通过用于由植物细胞再生植物的常规已知方法容易地进行这一方案。关于用于由植物细胞再生植物的方法，可参考文献例如“Plant Cell Culture Manual(植物细胞培养手册)”(由Yasuyuki Yamada撰写并编辑，Kodansha Scientific Ltd.，1984)。

具体地，为形成可不定增殖的去分化的愈伤组织(下文称为“愈伤组织诱导”)，提前在已加入无机养分、维生素、碳源、用作能源的糖和植物生长调节因子(植物激素例如生长素和细胞分裂素)的用于愈伤组织形成的无菌培养基中培养转化的植物细胞。将由此形成的愈伤组织转移到包含植物生长调节因子例如生长素的新鲜培养基中以进一步增殖(继代培养)。

使用固体培养基例如琼脂进行愈伤组织诱导。通过例如液体培养进行继代培养。因此，可有效地进行每一种培养以大量增殖。接下来，在用于诱导器官再分化(下文称为“再分化诱导”)的合适条件下培养由于上述继代培养而已经增殖的愈伤组织。最后，可再生为完整的植物。可通过合理地预先确定培养基中的不同成分例如植物生长调节因子(例如，生长素或细胞分裂素)和碳源的类型和量、光强度、温度等等进行再分化诱导。由于再分化诱导的结果，形成不定胚、不定根、不定芽、不定叶/茎和类似器官。培养这些再分化的器官，从而允许完整植物的生长。可选地，保存或处理不完整植物(以胶囊化的人工种子、干胚、冻干的细胞和组织或类似物的形式)。根据需要，可由这些不完整植物通过培养或类似方法再生完整植物。进一步地，通过在包含不同类型和量的成分、光强度、温度和类似物的上述合理地预先确定的条件下培养或培育转化的植物细胞来再生转化的植物而不形成愈伤组织也是可能的。

可获得带有已转柒了本发明的糖基转移酶基因的基因组的转化植物后，可由该植物通过有性繁殖或无性繁殖获得后代。另外，使用从该植物或其后代或其无性系获得的繁殖材料(例如，种子、果实、切穗(cut ears)、块茎、块茎根、树干、愈伤组织和原生质体)大量产生该植物也是可能的。进一步地，由本发明的转化植物或其后代或其无性系产生切花也是可能的。本发明还可提供这些切花。术语“切花”通常是指没有从其去除枝或茎的已被切下的花。然而，本发明中所用的术语“切花”还指缺少枝或茎的花。

[9]糖基转移酶的产生

进一步地，本发明涉及用于产生糖基转移酶的方法。根据宿主类型，可通过在允许引入的基因表达的条件下在合适的培养基中培养来产生本发明的糖基转移酶。

培养基的实例包括LB培养基、M9培养基、YPD培养基、YPG培养基、YPM培养基、YPDM培养基和SMM培养基。根据需要，这些培养基包含碳源(例如，葡萄糖、甘油、甘露醇、果糖或乳糖)、氮源例如无机氮源(例如，硫酸铵或氯化铵)或有机氮源(例如酪蛋白消化物、酵母提取物、聚蛋白胨、Bacto胰蛋白胨或牛肉浸出物)、无机盐(例如二磷酸钠、二磷酸钾、氯化镁、硫酸镁或氯化钙)、维生素(例如维生素B1)和药物(例如，抗生素例如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)。只要其适合基因表达，培养条件并无特别限制。但是，根据需要通常在10℃至45℃下伴随通气和/或搅拌地持续数小时至数百小时进行培养。

为从培养产物(包括培养上清液或培养的转化子)获得本发明的酶，可通过已知方法提取积累在培养产物中的蛋白质且然后根据需要纯化。可藉以获得本发明的酶的这些方法的实例包括溶剂萃取法、盐析法、溶剂沉淀法、透析法、超滤法、凝胶电泳法、凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析和亲和层析。这些方法可单独使用或以合适的方式组合使用。

如上所述，本发明涉及包含式(A)化合物的糖供体试剂、包括允许这种糖供体试剂与糖基转移酶反应的用于糖基化多酚的方法和包括所述糖供体试剂和所述糖基转移酶的多酚糖基化试剂盒。根据本发明，可在没有相对昂贵的试剂糖核苷酸例如UDP-葡萄糖下进行糖基转移反应。

另外，推测本发明的新型糖供体化合物和糖基转移酶之间的糖基转移反应与常规已知的糖基转移反应将在反应机制方面有所不同。因此，预料到根据本发明可实现常规难以糖基化的底物的糖基化。通常，当脂溶性化合物被糖基化时，该化合物变得在水中可溶。此外，当水溶性化合物被糖基化时，可提高该化合物的稳定性。这些事实已经是已知的。例如，本发明可用于开发新型药物化合物或新型功能性食品材料。特别地，使用本发明的新型糖供体化合物作为糖供体催化糖基转移反应的来源于康乃馨的糖基转移酶具有相对低的最适反应pH。因此，甚至可在难以进行糖基转移反应的酸性环境中进行糖基转移反应。进一步地，除了多酚，本发明的糖基化方法可用于糖基化其他化合物。例如，本发明的糖基化方法将适用于糖链合成。

另外，本发明涉及新型糖基转移酶、编码所述糖基转移酶的糖基转移酶基因、包含所述糖基转移酶基因的重组载体、通过使用所述重组载体转化宿主细胞获得的转化子和转染了所述糖基转移酶基因的植物。当本发明的新型糖基转移酶与本发明的包含式(A)化合物的糖供体试剂组合使用时，可有效地进行前述新型糖基转移反应。

使用本发明的糖基转移酶基因可人工产生新型糖基转移酶。另外，通过例如将该基因引入到缺少本发明的糖基转移酶的植物中，使用本发明的糖基转移酶基因使得能够产生带有非常规花瓣颜色的植物。

实施例

尽管本发明的技术范围不局限于此，下文参考以下实施例更详细地描述了本发明。

[实施例1]

(1)制备糖基转移酶的粗制酶液

使用研钵和研棒将来自康乃馨(品种：“微笑樱桃”)的粉红花瓣在液氮中研磨成粉末。将该粉末以逐步的方式加入到50mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)中并通过搅拌溶解于其中以防止冻结。然后，通过离心去除不溶部分。向所获得的上清液中加入饱和硫酸铵溶液以产生80％的浓度并在冰上静置5分钟。通过离心收集沉淀在溶液中的蛋白质。向其中加入10mM磷酸钾缓冲液直到沉淀完全溶解。将所获得的溶液上样到Sephadex G-25凝胶过滤支持体(GE Healthcare)上以脱盐。因此，获得粗制酶液。

(2)提取糖供体化合物

将来自康乃馨(品种：“活性红(Red Vital)”)的红色花瓣过夜浸泡在50％的乙醇水溶液中并用滤纸过滤。使用旋转蒸发仪减压浓缩所获得的滤液。将浓缩的滤液上样到合成吸附树脂(

HP20，MitsubishiChemical Corporation)上并收集洗脱级分。进一步地，用合成吸附树脂体积的5倍体积的纯水洗涤合成吸附树脂。将所获得的洗出液加入洗脱级分。减压浓缩该级分。向其中加入醋酸以产生0.1％的终浓度。然后，将所得产物上样到已提前用0.1％醋酸水溶液平衡过的ODS柱(Wakosil C18，WakoPure Chemical Industries，Ltd.)上。用柱体积的5倍体积的0.1％醋酸水溶液洗涤柱子。收集用包含5％甲醇的0.1％醋酸水溶液洗脱的级分并减压浓缩。将产物用作分级HPLC的样品。

使用Develosil RPAQUEOUS-AR-5(粒子大小：5μm；内径×长度：10mm×250mm；Nomura Chemical)反相柱、洗脱液A(0.1％醋酸水溶液)和洗脱液B(90％甲醇水溶液)进行分级HPLC。用7％至30％的洗脱液B的线性梯度以5ml/min流速(40分钟)分离之后，将分离到的液体分级(每级分5ml)。使用粗制酶液评价每级分的糖基转移酶活性(见下述评价方法)。将已发现具有活性的级分(第21至第24级分)(活性级分)收集、浓缩并再次进行分级HPLC。

使用XTerra Prep MSC18反相柱(粒子大小：10μm；内径×长度：10×250mm；Waters)、洗脱液A(0.1％醋酸水溶液)和洗脱液B(90％甲醇水溶液)进行第二次分级HPLC。用6％至10％的洗脱液B的线性梯度以5ml/min流速(40分钟)分离之后，将分离到的液体分级(每级分5分钟)。使用粗制酶评价每级分的糖基转移酶活性(见下述评价方法)。将活性级分(第21至第25级分)收集、浓缩并再次进行分级HPLC。

使用乙腈和纯水作为洗脱液和COSMOSIL HILIC填充柱(粒子大小：5μm；内径×长度：10mm×250mm；Nacalai Tesque)进行第三次分级HPLC。用100％至75％的乙腈的线性梯度以5ml/min流速(40分钟)分离之后，将分离到的液体分级(每级分5分钟)。使用粗制酶液评价每级分的糖基转移酶活性(见下述评价方法)。将活性级分(第19至第24级分)收集并浓缩。

将上述纯化的红色康乃馨花瓣提取物上样到高分辨率HR-ESI-TOF质谱仪(AccuTOF JML-T 100LC光谱仪，JEOL Ltd.)上。通过正模式检测到m/z＝353.08313的分子离子峰且通过负模式检测到m/z＝329.29592的分子离子峰。因此，推测提取物是具有330分子量的化合物。

接下来，对上述纯化的提取物进行¹H NMR、¹³C NMR HMQC、HMBC、和NOE分析(ECX400；JEOL Ltd.)。表1示出了结果。分析结果表明，纯化的提取物是其中葡萄糖的1位(异头碳原子)的羟基由酯键与香兰酸的羧基结合的化合物。另外，在1H NMR的异头碳位置的耦合常数(J＝7.8)表明葡萄糖的酯键是β键。因此，发现纯化的提取物是1-O-β-香兰基葡萄糖。

表1

NMR化学位移(400MHz CD₃OD)

NMR；ECX400(JEOL，东京，日本)

TOF-MS；AccuTOF JML-T100LC光谱仪(JEOL，东京，日本)

(3)使用粗制酶液评价HPLC级分的糖基转移酶活性

向粗制酶液(30μl)中加入HPLC级分(3μl)、100mM柠檬酸缓冲液(pH 5.6)(5μl)和2mM矢车菊色素3-葡糖苷(3μl)。将反应溶液在30℃静置40分钟。然后，向其中加入20％的磷酸水溶液(2.5μl)以终止反应。通过离心去除不溶物质，然后HPLC分析。

使用1.5％磷酸水溶液和乙腈作为洗脱液和Chromolith PerformanceRP-18e柱(4.6×100mm；Merck)进行HPLC分析。用17％至40％的乙腈的线性梯度以3ml/min流速(4分钟)分离之后，使用紫外可见检测仪通过测量520nm波长下的吸光度确认矢车菊色素3，5-二葡糖苷的产生。

(4)使用1-O-β-香兰基葡萄糖作为糖供体检测糖基转移反应

使用研钵和研棒将康乃馨(品种：“微笑樱桃”)的粉红花瓣在液氮中研磨成粉末。将所获得的粉末以逐步的方式加入到50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)中并通过搅拌溶解于其中以防止冻结。然后，通过离心去除不溶部分。向所获得的上清液中加入饱和硫酸铵溶液以产生80％的浓度。将混合物在冰上静置5分钟。通过离心收集沉淀的蛋白质。向其中加入10mM磷酸钾缓冲液以完全溶解。将所获得的溶液上样到Sephadex G-25凝胶过滤支持体(GE Healthcare)以脱盐。因此，获得粗制酶液。

向粗制酶液(15μl)中加入500μM 1-O-β-香兰基葡萄糖(5μl)、100mM柠檬酸缓冲液(pH 5.6)(30μl)和2mM矢车菊色素3-葡糖苷(5μl)。将反应溶液在30℃静置40分钟。然后，向其中加入20％的磷酸水溶液(2.5μl)以终止反应。通过离心去除不溶物质，然后HPLC分析。

使用1.5％磷酸水溶液和乙腈作为洗脱液和ODS柱(内径×长度：4.6×250mm；Cosmosil 5C18-MS-II；Nacalai Tesque)进行HPLC分析。用17％至40％的乙腈的线性梯度以1ml/min流速(20分钟)分离之后，使用光电二极管阵列检测仪进行检测。图1中的上图表示HPLC分析结果。将该结果与通过以相同方式分析用作参照产品的市售产品获得的结果(图1中的下图)在保留时间方面比较。因此，发现反应产物是矢车菊色素3，5-O-β二葡糖苷。这意味着根据下式的糖基转移反应发生：

上述结果表明，在由来自粉红色康乃馨花瓣的酶催化的糖基转移反应中1-O-β-香兰基葡萄糖起糖供体作用。

(5)糖基转移酶的纯化和其理化性质

使用研钵和研棒将康乃馨(品种：“微笑樱桃”)的粉红花瓣在液氮中研磨成粉末。将所获得的粉末以逐步的方式加入到50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)中并通过搅拌溶解于其中以防止冻结。使用尼龙网挤压所得产物以获得溶液。从溶液中去除不溶性成分例如细胞壁。进一步地，以逐步的方式向溶液中加入硫酸铵以产生终浓度35％，然后充分搅拌以溶解。将溶液在4℃静置30分钟，然后在4℃下以15,000×g离心30分钟。然后，收集上清液。进一步以逐步的方式向其中加入硫酸铵以产生55％的最终浓度以完全溶解。将产物在4℃静置过夜，然后在4℃下以15,000×g离心30分钟。向所获得的沉淀中加入10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)以完全溶解，然后用足量的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)透析。因此，获得粗制酶液。除非另有说明，否则在冰上或在4℃进行这一实施例中的所有方案。

将透析过的溶液上样到已提前平衡过的TOYOPEARL-DEAE650M(床体积：400ml)上。用柱体积的5倍体积(即，5CV(柱体积))的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)洗涤柱子，然后用0M至0.8M的NaCl的线性梯度(5CV)洗脱。将洗脱的蛋白溶液分级(每级分25ml)。向每级分(30μl)中加入1-O-β-香兰基葡萄糖(3μl)。以上述(3)中所述的方式评价每级分的糖基转移酶活性。收集活性级分(第38至第49级分)，然后用足量的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)透析。

为了产生终浓度20％，以逐步的方式向透析级分中加入硫酸铵以完全溶解。将所得产物上样到已提前用包含20％硫酸铵的10mM磷酸缓冲液(pH 7.2)平衡过的TOYOPEARL-丁基650M(床体积：80ml)上。用包含20％硫酸铵的10mM磷酸缓冲液(pH 7.2)(5CV)洗涤柱子，然后用20％至0％的硫酸铵的线性梯度(10CV)洗脱。将洗脱的蛋白溶液分级(每级分10ml)。使用1-O-β-香兰基葡萄糖(3μl)以上述(3)中所述的方式评价每级分(30μl)的糖基转移酶活性。收集活性级分(第60至第77级分)，然后用足量的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)透析。

将透析级分上样到已提前用Bz缓冲液(10mM磷酸钾、pH 7.2、0.5MNaCl)平衡过的高流速苄脒琼脂糖凝胶4(Benzamidine Sepharose 4FastFlow)(high sub)(GE Healthcare；床体积：8ml)上。用苄脒缓冲液(5CV)洗涤柱子，然后用0mM至25mM的对苄脒(p-benzamidine)线性梯度(12.5CV)洗脱。将洗脱的蛋白溶液分级(每级分2.5ml)。使用1-O-β-香兰基葡萄糖(3μl)以上述(3)中所述的方式评价每级分(30μl)的糖基转移酶活性。收集活性级分(第25至第26级分)并用Amicon Ultra-15(10,000MWCO，Millipore)浓缩，然后用10mM磷酸钾缓冲液更换缓冲液。

将浓缩的级分上样到已提前用凝胶过滤缓冲液平衡过的Superdex 20010/300GL柱(10mM磷酸钾、pH 7.2、150mM NaCl)上。将洗脱物分级(每级分0.7ml)。使用1-O-β-香兰基葡萄糖(3μl)以上述(3)中所述的方式评价每级分(30μl)的糖基转移酶活性。收集活性级分(第22至第25级分)并用Amicon Ultra-15(10,000MWCO，Millipore)浓缩，然后用10mM磷酸钾缓冲液更换缓冲液。

将通过凝胶过滤纯化的级分上样到已提前用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)平衡过的Resource Q 1-ml柱上。用10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)(5CV)洗涤柱子，然后用0M至0.5M的NaCl的线性梯度洗脱。将洗脱的蛋白溶液分级(每级分0.2ml)。使用1-O-β-香兰基葡萄糖(3μl)以上述(3)中所述的方式评价每级分(30μl)的糖基转移酶活性。收集活性级分(第41至第48级分)。

通过SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析收集的级分。因此，发现所获得的蛋白质具有约55kDa的分子量。另外，测定酶的最适反应pH且由此发现为约5.0至5.5。该酶的这种最适反应pH比常规已知的糖基转移酶的最适反应pH(pH 7.5至8.0)低。因此，认为即使在通常不允许酶反应发生的弱酸性条件下，该酶反应也会进行。

(6)合成香兰基葡萄糖

使用苯甲基溴(Sigma-Aldrich)在二甲基甲酰胺溶剂(DMF，ThermoFisher Scientific K.K)中对市售香兰酸(Sigma-Aldrich)的4位上的羟基和羧酸的羟基进行苯甲基保护。然后，使用空心柱(硅胶60(球状)；KantoChemical Co.，Inc.)(己烷∶醋酸乙酯＝8∶1)去除未反应的产物，然后纯化。发现产率是100％：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.65(1H，dd，H-6)，7.59(1H，d，H-2)，7.41-7.26(9H，m，H-苄型CH₂)，6.88(1H，d，H-5)，5.33(2H，s，H-苄型CH₂)，5.21(1H，s，H-苄型CH₂)，和3.92(3H，s，CH₃)。

接下来，在溶剂(THF(Kanto Chemical Co.，Inc.)∶H₂O∶MeOH(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)＝3∶2∶1)中在氢氧化锂(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)存在下水解纯化的产物以去除保护羧酸的羟基的苯甲基。然后，使用空心柱(以己烷∶醋酸乙酯＝10∶1、4∶1和0∶1的不同浓度比例)纯化所得产物以去除未反应的产物和苄醇。发现产率是58％：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.68(1H，dd，H-6)，7.60(1H，d，H-2)，7.45-7.25(5H，m，H-苄型CH₂)，6.90(1H，d，H-5)，5.25(2H，s，H-苄型CH₂)，和3.92(3H，s，CH₃)。

使用以下缩合剂：1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDCI，Kokusaikagaku Co.，Ltd.)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP，Tokyo KaseiKogyo)和三乙胺(Et₃N，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，将在4位上具有苯甲基保护的羟基的香兰酸和在除了1位以外的位置上具有苯甲基保护的羟基的2，3，4，6-四苯甲基葡萄糖(Sigma-Aldrich)在DMF溶剂(在60℃的反应温度下)中缩合。所获得的缩合物是包含1∶2比例的α异头物和β异头物的混合物。使用空心柱纯化缩合物(以己烷∶醋酸乙酯＝6∶1和5∶1的不同浓度比例)。去除未反应的起始材料。发现产率是84％：分子MS[M+Na]⁺m/z 803.14，¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.60(1H，dd，H-6)，7.59(1H，d，H-2)，7.45-7.26(60H，m，H-苄型CH₂)，6.90(1H，d，H-5)，6.55(1H，d，H-Glc1α，J＝3.21)，5.84(1H，d，H-Glc1β，J＝7.65)，5.25(10H，s，H-苄型CH₂)，4.96-3.56(94H，m，CH₃，H-Glc)。

接下来，使用氢氧化钯炭催化剂(Sigma-Aldrich)进行氢化反应以脱去苯甲基保护。因此，获得α-香兰基葡萄糖和β-香兰基葡萄糖的混合物(产率81％)。通过硅藻土过滤去除氢氧化钯。对所获得的混合物进行使用包含洗脱液A(0.1％醋酸水溶液)和洗脱液B(90％甲醇水溶液)的10％液体B通过分级HPLC(Develosil C₃₀；10×250mm；Nomura Chemical)(持续40分钟)的分离。因此，分别获得1-O-α-香兰基葡萄糖(精制度：99.6％)和1-O-β-香兰基葡萄糖(精制度：98.9％)。精制度是以HLPC面积为基础计算的：分子MS[M+Na]⁺(m/z：352.9)，α-¹H NMR(400MHz，CD₃CD)：δ7.62(1H，dd，H-6)，7.58(1H，d，H-2)，6.83(1H，d，H-5)，6.28(1H，d，H-Glc1，J＝3.66)，3.89(3H，s，CH₃)，和3.83-3.33(5H，m，H-Glc)，β-¹H NMR(400MHz，CD₃CD)：δ7.62(1H，dd，H-2)，7.60(1H，d，H-6)，6.83(1H，d，H-5)，5.67(1H，d，H-Glc1，J＝7.79)，3.89(3H，s，CH₃)，和3.83-3.33(5H，m，H-Glc)。

(7)合成异香兰基葡萄糖

使用苯甲基溴在DMF溶剂中对市售异香兰酸(Sigma-Aldrich)的3位上的羟基和羧酸的羟基进行苯甲基保护。

接下来，在溶剂(THF∶H₂O∶MeOH＝3∶2∶1)中在氢氧化锂存在下通过水解去除保护羧酸的羟基的苯甲基。然后，通过使用空心柱(以己烷∶醋酸乙酯＝10∶1、4∶1和0∶1的不同浓度)纯化去除未反应的产物和苄醇。发现产率是86％：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.75(1H，dd，H-6)，7.65(1H，d，H-2)，7.45-7.25(5H，m，H-苄型CH₂)，6.90(1H，d，H-5)，5.15(2H，s，H-苄型CH₂)，3.90(3H，s，CH₃)。

使用以下缩合剂：EDCI、DMAP和Et₃N，将在3位上具有苯甲基保护的羟基的异香兰酸和在除了1位以外的位置上具有苯甲基保护的羟基的2，3，4，6-四苯甲基葡萄糖在DMF溶剂中缩合(在60℃的反应温度下)。所获得的缩合物是包含3∶2比例的α异头物和β异头物的混合物。使用空心柱纯化缩合物(以己烷∶醋酸乙酯＝6∶1和5∶1的不同浓度比例)以去除未反应的起始材料。发现产率是60％：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.82(1H，dd，H-6)，7.72(1H，d，H-2)，7.52-7.26(60H，m，H-苄型CH₂)，6.90(1H，d，H-5)，6.67(1H，d，H-Glc1α，J＝3.64)，5.96(1H，d，H-Glc1β，J＝8.16)，5.25-3.71(H，m，CH₃，H-Glc)。

接下来，使用氢氧化钯炭催化剂进行氢化反应以脱去苯甲基保护。因此，获得α-异香兰基葡萄糖和β-异香兰基葡萄糖的混合物(产率100％)。通过硅藻土过滤去除氢氧化钯。对所获得的混合物进行使用包含洗脱液A(0.1％醋酸水溶液)和洗脱液B(90％甲醇水溶液)的10％液体B通过分级HPLC(Develosil C₃₀；10×250mm)(持续40分钟)的分离。因此，分别获得1-O-α-异香兰基葡萄糖和1-O-β-异香兰基葡萄糖：分子MS[M+Na]⁺m/z 353.0，¹H NMR(300MHz，CD₃CD)：δ7.63(1H，dd，H-6)，7.60(1H，d，H-2)，7.00(1H，d，H-5)，6.30(1H，d，H-Glc1α，J＝3.60)，5.67(1H，d，H-Glc1β，J＝8.10)，3.91(3H，s，CH₃)，3.88-2.88(5H，m，H-Glc)。

(8)合成葡萄糖没食子酸酯(glucose gallate)

使用苯甲基溴在DMF溶剂中对市售没食子酸(Sigma-Aldrich)的3、4和5位上的羟基和羧酸的羟基进行苯甲基保护。然后，使用空心柱(己烷∶醋酸乙酯＝8∶1)去除未反应的产物，随后纯化。

接下来，在溶剂(THF∶H₂O∶MeOH＝3∶2∶1)中在氢氧化锂存在下通过水解去除保护羧酸的羟基的苯甲基。然后，通过使用空心柱(以己烷∶醋酸乙酯＝10∶1、4∶1和0∶1的不同浓度)纯化去除未反应的产物和苄醇。

使用以下缩合剂：EDCI、DMAP和Et₃N，将在3、4和5位上具有苯甲基保护的羟基的没食子酸和在除了1位以外的位置上具有苯甲基保护的羟基的2，3，4，6-四苯甲基葡萄糖在DMF溶剂(在60℃的反应温度下)中缩合。使用空心柱(以己烷∶醋酸乙酯＝6∶1和5∶1的不同浓度比例)纯化缩合物以去除未反应的起始材料。所获得的缩合物是包含3∶7比例的α异头物和β异头物的混合物：分子MS[M+Na]⁺m/z 985.18，¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.40-7.11(92H，m，H-2，6，5，H-苄型CH₂)，6.52(1H，d，H-Glc1α，J＝2.40)，5.85(1H，d，H-Glc1β，J＝7.50)，5.16(18H，s，H-苄型CH₂)，4.99-3.64(28H，m，H-Glc，H-苄型CH₂)。

接下来，使用氢氧化钯炭催化剂进行氢化反应以脱去苯甲基保护。因此，获得α-葡萄糖没食子酸酯和β-葡萄糖没食子酸酯的混合物。通过硅藻土过滤去除氢氧化钯。对所获得的混合物进行使用包含洗脱液A(0.1％醋酸水溶液)和洗脱液B(90％甲醇水溶液)的10％液体B通过分级HPLC(Develosil C₃₀；10×250mm；Nomura Chemical)(持续40分钟)的分离。因此，分别获得1-O-α-没食子酰葡萄糖和1-O-β-没食子酰葡萄糖：分子MS[M+Na]⁺m/z 354.9，α-¹H NMR(400MHz，CD₃CD)：δ7.10(2H，s，H-2，6)，6.25(1H，d，H-Glc1，J＝3.66)，3.82-3.32(5H，m，H-Glc)，β-¹H NMR(400MHz，CD₃CD)：δ7.10(2H，s，H-2，6)，5.63(1H，d，H-Glc1，J＝7.79)，3.84-3.32(5H，m，H-Glc)。

(8)使用每一种所获得的化合物作为糖供体验证糖基转移反应

在通过向从康乃馨(品种：“微笑樱桃”)的粉红色花瓣中获得的粗制酶(61μg)、矢车菊色素3-葡糖苷(200μM)和糖供体(从康乃馨提取的1-O-β-香兰基葡萄糖或任何合成的1-O-香兰基葡萄糖(以α或β形式)、1-O-异香兰基葡萄糖(以α或β形式)和1-O-没食子酰葡萄糖(以α或β形式))(500μM)中加入柠檬酸缓冲液(pH 5.6)直到终体积30μl而获得的反应溶液中在30℃下持续15分钟进行酶反应。通过向反应液中加入20％的磷酸水溶液以产生1％的磷酸终浓度而终止反应，然后离心。对所获得的上清液进行用包含洗脱液A(1.5％磷酸水溶液)和洗脱液B(90％甲醇水溶液)的18％至28％的液体B的线性梯度(5分钟)(流速：3.0ml/min；520nm)使用HPLC(Chromolith Speed ROD；4.6×50mm；Merck)的分离，然后分析。以反应产物(矢车菊色素3，5-O-β二葡糖苷)在505nm波长的HPLC层析图面积为基础计算酶对每一种糖供体的相对活性。下表示出了结果。

表2

[实施例2]

(1)糖基转移酶的提取

使用混合器将已迅速冷冻在液氮中并储存在-80℃下的康乃馨(品种：“微笑樱桃”)的花瓣(湿重：400g)在提取缓冲液(100mM磷酸钾、pH7.2)(1500ml)中充分破碎。除非另有说明，否则在冰上或在4℃下进行下述所有方案。使用均质仪(Polytron，KINEMATICA)以15,000rpm持续15分钟进一步进行破碎。通过在20,000×g和4℃下离心20分钟收集上清液。重复上述方案两次以从800g(总计)的花瓣获得约3,000ml的粗提液。

(2)纯化糖基转移酶

(a)通过硫酸铵沉淀分级

以逐步的方式向所获得的粗提液中加入粒状硫酸铵并通过用磁力搅拌子搅拌完全溶解于其中以产生35％的浓度。将产物在4℃静置2小时。然后，通过在4℃以20,000×g离心20分钟收集上清液。进一步以逐步的方式向收集到的上清液中加入粒状硫酸铵并通过用磁力搅拌子搅拌完全溶解于其中以产生55％的浓度。将所得产物在4℃静置过夜，然后在4℃以20,000×g离心20分钟。因此，收集到沉淀。将收集到的沉淀溶解在10mM磷酸缓冲液(pH 7.2)(3000ml)中。使产物经过透析膜，然后用10mM磷酸缓冲液(pH 7.2)(6L)透析。4至12小时之后，用新鲜的磷酸缓冲液更换磷酸缓冲液。用于透析的磷酸缓冲液的终体积是透析膜内的样品体积的4000倍。

(b)通过高流速DEAE琼脂糖凝胶(DEAE sepharose Fast Flow)分离

将在上述(a)中透析的样品溶液上样到已提前用10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)平衡过的DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换剂(GE Healthcare)填充的玻璃柱(床体积：350ml)上，然后用10mM磷酸缓冲液(pH 7.2)(1250ml)洗涤。然后，使用包含液体A(10mM磷酸缓冲液(pH 7.2))和液体B(0.8M NaCl)的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)(1000ml)以0％至100％的液体B的线性梯度进行蛋白质分离。将分离到的蛋白质溶液分级(每级分25ml)。使用矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷作为底物且1-O-β-香兰基葡萄糖作为糖供体确定每级分的糖基化酶活性。收集活性级分(第31至第45级分)并使用足够体积的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)透析。

(c)使用TOYOPEARL-丁基分离

向在上述(b)中透析的级分中逐渐加入粒状硫酸铵以产生20％的浓度并溶解于其中。将所获得的样品溶液上样到已提前用丁基平衡缓冲液(10mM磷酸钾、20％硫酸铵、pH 7.2)平衡过的TOYOPEARL-丁基-650M支持柱(Tosoh Corporation；50mm×100mm；床体积：250ml)上。用丁基平衡缓冲液(1250ml)洗涤柱子。然后，使用液体A(丁基平衡缓冲液)和液体B(10mM磷酸钾缓冲液)(pH 7.2)以0％至100％的液体B的线性梯度(1250ml)进行蛋白质分离。将分离到的蛋白质溶液分级(每级分20ml)。使用矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷作为底物且1-O-β-香兰基葡萄糖作为糖供体确定每级分的糖基化酶活性。收集活性级分(第63至第85级分)并使用Amicone-15ultra(Millipore)浓缩。然后，用10mM磷酸钾缓冲液更换缓冲液。

(d)使用苄脒琼脂糖凝胶分离

将在(c)中透析的样品上样到已提前用Bz漂洗缓冲液(10mM磷酸钾、pH 7.2、0.5M NaCl)平衡过的高流速苄脒琼脂糖凝胶4(BenzamidineSepharose 4Fast Flow)柱(床体积：8ml)上。用Bz漂洗缓冲液(40ml)洗涤柱子。然后，使用液体A(Bz漂洗缓冲液)和液体B(Bz洗脱缓冲液(10mM磷酸钾、pH 7.2、0.5M NaCl、20mM 4-氨基苄脒))以0％至100％的液体B的线性梯度(80ml)进行蛋白质分离。将分离到的蛋白质溶液分级(每级分2ml)。使用矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷作为底物且1-O-β-香兰基葡萄糖作为糖供体确定每级分的糖基化酶活性。收集活性级分(第27至第33级分)并使用Amicone-15ultra浓缩。然后，用10mM磷酸钾缓冲液更换缓冲液。

(e)通过凝胶过滤分离

将在上述(d)中获得的样品溶液上样到已提前用凝胶过滤缓冲液(10mM磷酸钾、pH 7.2、150mM NaCl)平衡过的Superdex 7510/300GL柱(GEHealthcare)上。通过允许凝胶过滤缓冲液以0.5ml/min的流速流经柱子进行蛋白质分离。将分离到的蛋白质溶液分级(每级分500μl)。使用矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷作为底物且1-O-β-香兰基葡萄糖作为糖供体确定每级分的糖基化酶活性。收集活性级分(第29至第32级分)并使用Amicone-15ultra浓缩。然后，用10mM磷酸钾缓冲液更换缓冲液。

(f)使用Resouce ETH分离

将在上述(e)中获得的蛋白质溶液上样到已提前用ETH平衡缓冲液(10mM磷酸钾、pH 7.2、35％硫酸铵)平衡过的Resouce ETH(GEHealthcare)上。用ETH平衡缓冲液洗涤柱子。然后，使用液体A(ETH平衡缓冲液)和液体B(ETH洗脱缓冲液(10mM磷酸钾、pH 7.2、15％硫酸铵))以0％至100％的液体B的线性梯度持续19分钟(流速：0.8ml/min)进行蛋白质分离。将分离到的蛋白质溶液分级(每级分300μl)。使用矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷作为底物且1-O-β-香兰基葡萄糖作为糖供体确定每级分的糖基化酶活性。收集活性级分(第20至第25级分)并使用Amicone-15ultra浓缩。然后，用10mM磷酸钾缓冲液更换缓冲液。

(g)使用HiTrap丁基分离

向在上述(f)中获得的蛋白质溶液中加入饱和硫酸铵水溶液以产生终浓度20％。将该样品溶液上样到已提前用丁基平衡缓冲液(10mM磷酸钾、20％硫酸铵、pH 7.2)平衡过的HiTrap丁基(GE Healthcare)上。用丁基平衡缓冲液(5ml)洗涤柱子。然后，使用液体A(丁基平衡缓冲液)和液体B(丁基洗脱缓冲液(10mM磷酸钾缓冲液、pH 7.2、10％乙二醇))以0％至100％的液体B的线性梯度持续19分钟(流速：1ml/min)进行蛋白质分离。将分离到的蛋白质溶液分级(每级分300μl)。使用矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷作为底物且1-O-β-香兰基葡萄糖作为糖供体确定每级分的糖基化酶活性。收集活性级分(第43至第48级分)并使用Amicone-15ultra(Millipore)浓缩。然后，用10mM磷酸钾缓冲液更换缓冲液。

通过SDS-PAGE分离精炼的蛋白质并通过银染色法使其可视化以确认。图2示出了结果。

(h)确定每级分的糖基化酶活性

使用矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷作为底物且1-O-β-香兰基葡萄糖作为糖供体以下述方式确定上述(b)至(g)中的糖基化酶活性。

使用SephadexG-25支持体(GE Healthcare)对通过分级获得的级分进行缓冲液更换(100mM柠檬酸缓冲液(pH 5.6))。向粗制酶液(30μl)中加入10mM的1-O-β-香兰基葡萄糖(3μl)和2mM的矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷(3μl)。将反应溶液在30℃静置30分钟。然后，向其中加入20％的磷酸水溶液(2μl)以终止反应。通过离心去除不溶物质，然后HPLC分析。

使用1.5％磷酸水溶液和90％甲醇水溶液作为洗脱液和ChromolithPerformance RP-18e柱(4.6×100mm；Merck)进行HPLC分析。使用90％甲醇水溶液以17％至40％的线性梯度以3ml/min流速(4分钟)进行分离。使用紫外可见检测仪以520nm波长下的吸光度为基础确认矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷的产生。

(3)糖基转移酶蛋白的氨基酸序列分析

使用由APRO Science Co.，Ltd.(鸣门市，德岛，日本)提供的高灵敏度蛋白质内部序列分析服务(经委托)和中灵敏度N端氨基酸序列分析服务(经委托)分析纯化的糖基转移酶蛋白的氨基酸序列。作为蛋白质内部序列分析的结果，发现蛋白质中存在以下三种类型的氨基酸序列：“GLEYYNNLVNA(SEQ ID NO：5)”、“GTQPHVTLLH(SEQ ID NO：6)”和“FTPXETELLTG(SEQ ID NO：7)”。另外，N端氨基酸序列分析结果表明蛋白质的氨基酸序列始于“SEFDRLDFPK(SEQ ID NO：8)”序列。另外，N端氨基酸序列分析结果还表明除了上述序列外，该蛋白质包括两种类型的氨基酸序列(“EFDRLDFPKH(SEQ ID NO：9)”和“PSEFDRLDFP(SEQ ID NO：10)”)。因此，认为N-端在纯化期间被降解或在植物中加工的酶的底物特异性低。

(4)分离编码糖基转移酶(来自康乃馨)的cDNA

通过改进的GTC/CsCl密度梯度离心法(Chirgwin等人，1979)从康乃馨(品种：“微笑樱桃”)的花瓣提取RNA。使用研钵和研棒在液氮中充分磨碎每个组织盘。将每种所得产物转移到50-ml聚丙烯离心管中，然后在-80℃下完全蒸发液氮。然后，向其中加入GTC溶液(4.23M硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、100mM 2-巯基乙醇、0.5％N-月桂酰肌氨酸钠)(3ml)，其后立即充分混合。将混合物在室温静置30分钟，然后20,000×g离心20分钟。将上清液转移至一个新的离心管中，然后再次20,000×g离心20分钟。因此，不溶物质被完全去除。将所获得的GTC提取液加入到5-ml超高速离心管(Beckman Coulter Inc.，富勒顿，加利福尼亚)中，该离心管中已分配氯化铯溶液(5.7M CsCl、0.1M EDTA、pH 7.5)(2.2ml)以在溶液相上形成液相，然后70,000rpm超高速离心(TL-100超高速离心机，TLA110转子(roter)，Beckman Coulter Inc.)3小时。将沉淀的总RNA悬浮在TE-SDS缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、0.1％SDS)(300μl)中。根据试剂盒的操作手册使用Oligotex-dT<super>(TaKaRa BioInc.，志贺，日本)从所获得的总RNA纯化Poly(A)⁺RNA。

根据试剂盒的操作手册通过寡聚加帽法使用GeneRacer(商标)试剂盒(Invitrogen corp.，加利福尼亚)由poly(A)⁺RNA合成全长cDNA。将合成的cDNA分成等份并储存在-80℃至临使用前。根据试剂盒的操作手册使用3′-Full RACE Core Set(TaKaRa Bio Inc.)由上述poly(A)⁺RNA合成3′-RACE cDNA。

使用预先合成的3′-RACE cDNA作为模板和以由糖基转移酶蛋白的氨基酸内部序列分析的结果获得的氨基酸序列(“GTQPHVTLLH”)(SEQ IDNO：6)和“FTPXETELLTG”(SEQ ID NO：7))为基础设计的简并引物(“GGN ACN CAR CCN CAY GTN AC”)(SEQ ID NO：11)和“TTY ACNCCN GAY GAR ACN GA”(SEQ ID NO：12))通过PCR(94℃，30秒，46℃，30秒，72℃，1分钟)获得DNA片段(约600bp)。使用Ligation Mix mighty(Takara Bio inc.)将所获得的cDNA片段连接到克隆载体pGEM-T easy(Promega)上，然后转化大肠杆菌DH5α菌株。从所获得的菌落提取质粒，然后使用ABI PRISM 3100基因分析仪(Applied Biosystems Japan Ltd.，东京，日本)分析DNA核苷酸序列。使用日本DNA数据库(DDBJ)的BLASTX将所获得的DNA核苷酸序列与数据库比较。使用Genetyx WIN5.0版(Genetyx Corp.，东京，日本)进行一系列的DNA核苷酸序列分析。

使用预先合成的全长cDNA作为模板、以所获得的cDNA片段的DNA核苷酸序列为基础设计的引物(“GGAAGTCGGGGGCCACCATTCTTCC”)(SEQ ID NO：13))和GeneRacer5′引物进行PCR。通过乙醇沉淀法纯化所获得的PCR产物。使用纯化的PCR产物作为模板和以cDNA片段的DNA核苷酸序列为基础设计的引物通过巢式PCR获得cDNA片段(约550bp)。通过以前述方式克隆到pGEM-Teasy载体上来确定所获得的cDNA片段的cDNA核苷酸序列。

使用预先合成的3′-RACE cDNA作为模板、为包括从确定的cDNA 5′端片段至第一个ATG范围的序列而设计的引物(“ATGAACATGTCATGCAAGTTTGAAATTG”(SEQ ID NO：14))和3位的3′接头引物(Takara Bio inc.)通过PCR获得包含起始于糖基转移酶蛋白的第一个ATG的序列的cDNA。为确定DNA核苷酸序列，用上述方式克隆所获得的cDNA。图3示出了确定的cDNA序列、预测的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)和预测的由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)。

图3中，由于纯化的糖基转移酶蛋白的氨基酸内部序列分析的结果鉴定的序列(SEQ ID NO：5至7)是加下划线的。另外，以N端氨基酸序列为基础鉴定的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)是加下划线的并以粗体表示。发现cDNA具有全长1749bp且编码包括502个氨基酸残基的蛋白质。由于cDNA核苷酸序列分析和N端氨基酸序列分析的结果，推测包括502个氨基酸残基的酶被翻译，然后通过加工去除氨基酸。另外，由于数据库搜索氨基酸基序的结果，暗示了经受加工的序列包含液泡转移信号序列。

(5)来自康乃馨的糖基转移酶基因在大肠杆菌中的表达

使用为了在由于糖基转移酶的N端氨基酸序列分析的结果已表明的N端起始翻译而加入甲硫氨酸残基而设计的有义引物(“ATGTCGGAGTTTGACCGCCTTGACTTTC”(SEQ ID NO：15))和为了缺少终止密码子而设计的反义引物(“GTAGAAGTACGTATGTG”(SEQ IDNO：16))进行PCR。使用pTrcHis2-TOPO TA表达试剂盒(Invitrogen)将PCR产物连接到pTrcHis2-TOPO载体(Invitrogen)上，然后转化大肠杆菌JM109菌株。从转化的大肠杆菌提取DNA并以上述方式分析DNA核苷酸序列。因此，确认了cDNA导入的方向和未发生PCR引起的核苷酸取代。

将转化的大肠杆菌接种在包含50μl/ml氨苄青霉素的LB培养基(5ml)上，然后在30℃振荡培养4小时。然后，向其中加入IPTG以产生1mM，然后在16℃振荡培养2小时。通过1,800×g离心收集培养的大肠杆菌。从其中去除培养基。向其中加入0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.6)(150μl)，然后充分混合。使用超声粉碎器(UD-201，TOMY SEIKO Co.，Ltd.，东京，日本)对所得产物在冰上重复进行3次持续10秒钟的超声(输出：4；功率：70)，然后20,000×g离心。将上清液转移到新的离心管中并称为粗制酶液。

在30℃下在包含粗制酶液(20μl)、0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.6)(20μl)、矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷(5μl)和1-O-β-香兰基葡萄糖(5μl)的反应液中持续3小时诱导反应。然后，向其中加入20％磷酸水溶液(2.5μl)以终止反应。通过20,000×g离心去除不溶性蛋白质。之后，通过HPLC分析确认反应产物。使用1.5％磷酸水溶液和甲醇作为洗脱液和DevelosilODS-SR-5柱(4.6×250mm；Nomura Chemical)进行HPLC分析。使用22％至60％的甲醇的线性梯度以1ml/min流速(20分钟)进行分离。使用光电二极管阵列检测仪以520nm波长下的吸光度为基础确认矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷的产生(图4)。在从已转化了由试剂盒提供的转染有LacZ基因的载体的大肠杆菌获得的作为对照的粗制酶液中，没有产物被确认。这表明包括图3中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)的基因编码能够使用香兰基葡萄糖作为糖供体将葡萄糖转移到花色苷骨架的5位的酶蛋白。

[实施例3]

(1)分离编码糖基转移酶(来自飞燕草)的cDNA

通过改进的GTC/CsCl密度梯度离心法(Chirgwin等人，1979)从飞燕草(品种：“海水蓝(Marine Blue)”)的花瓣提取RNA。使用研钵和研棒在液氮中充分磨碎每个组织盘。将所得产物转移到50-ml聚丙烯离心管中，然后在-80℃下完全蒸发液氮。然后，向其中加入GTC溶液(4.23M硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、100mM 2-巯基乙醇、0.5％N-月桂酰肌氨酸钠)(3ml)，其后立即充分混合。将混合物在室温静置30分钟，然后20,000×g离心20分钟。将上清液转移至一个新的离心管中，然后再次20,000×g离心20分钟。因此，不溶物质被完全去除。将所获得的GTC提取液加入到5-ml超高速离心管(Beckman Coulter Inc.，富勒顿，加利福尼亚)中，该离心管中已分配氯化铯溶液(5.7M CsCl、0.1M EDTA、pH 7.5)(2.2ml)以在溶液相上形成液相，然后70,000rpm超高速离心(TL-100超高速离心机，TLA110转子，Beckman Coulter Inc.)3小时。将沉淀的总RNA悬浮在TE-SDS缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、0.1％SDS)(300μl)中。根据试剂盒的操作手册使用Oligotex-dT<super>(TaKaRaBio Inc.，志贺，日本)从所获得的总RNA纯化Poly(A)⁺RNA。

根据试剂盒的操作手册通过寡聚加帽法使用GeneRacer(商标)试剂盒(Invitrogen corp.，加利福尼亚)由poly(A)⁺RNA合成全长cDNA。使用前，将合成的cDNA分成等份并即储存在-80℃至临使用前。根据试剂盒的操作手册使用3′-Full RACE Core Set(TaKaRa Bio Inc.)由上述poly(A)⁺RNA合成3′-RACE cDNA。

使用预先合成的全长cDNA作为模板、以所获得的cDNA片段的DNA核苷酸序列为基础设计的引物(“CTGGTTGCTTCAATATCTGCCCTCG”)(SEQ ID NO：17))和GeneRacer5′引物进行PCR。通过乙醇沉淀法纯化所获得的PCR产物。使用纯化的PCR产物作为模板和以cDNA片段的DNA核苷酸序列为基础设计的引物通过巢式PCR获得cDNA片段(约550bp)。通过以前述方式克隆到pGEM-Teasy载体上确定所获得的cDNA片段的cDNA核苷酸序列。

使用预先合成的3′-RACE cDNA作为模板、为包括从确定的cDNA 5′端片段至第一个ATG范围的序列而设计的引物(“ATGTGCCCCTCTTTTCTAGTGACTC”(SEQ ID NO：18))和3位的3′接头引物(Takara Bio inc.)通过PCR获得包含起始于糖基转移酶蛋白的第一个ATG的序列的cDNA。为确定DNA核苷酸序列，用上述方式克隆所获得的cDNA。图5示出了确定的cDNA序列、预测的核苷酸序列(SEQID NO：4)和预测的由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

发现以上述方式分离到的cDNA具有全长1701bp且编码包括505个氨基酸残基的蛋白质。由于数据库搜索氨基酸基序的结果，暗示了在氨基酸序列的N端的30个氨基酸残基的序列包含液泡转移信号序列。

(2)来自飞燕草的糖基转移酶基因在大肠杆菌中的表达

使用为了翻译起始而向已从其去除预测是对应于DgVA7GT的液泡转移信号的N端上的28个氨基酸残基的序列加入甲硫氨酸残基而设计的有义引物(“ATG CCC GAA TTT AAT GTC AG”(SEQ ID NO：19))和为了缺少终止密码子而设计的反义引物(“CTG TGA AGA GTA CGA TAT C”(SEQID NO：20))进行PCR。使用pTrcHis2-TOPO TA表达试剂盒(Invitrogen)将PCR产物连接到pTrcHis2-TOPO载体(Invitrogen)上，然后转化大肠杆菌JM109菌株。从转化的大肠杆菌提取DNA并以上述方式分析DNA核苷酸序列。因此，确认了cDNA导入的方向和未发生PCR引起的核苷酸取代。

在30℃下在包含粗制酶液(20μl)、0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.6)(20μl)、矢车菊色素-3-O-β-葡糖苷(5μl)和1-O-β-香兰基葡萄糖(5μl)的反应液中持续3小时诱导反应。然后，向其中加入20％磷酸水溶液(2.5μl)以终止反应。通过20,000×g离心去除不溶性蛋白质。之后，通过HPLC分析确认反应产物。使用1.5％磷酸水溶液和甲醇作为洗脱液和WakopakHandy ODS柱(4.6×250mm；Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)进行HPLC分析。使用22％至55％甲醇的线性梯度以1ml/min流速(20分钟)进行分离。使用光电二极管阵列检测仪，在不同于对矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷观察到的在520nm波长的吸光度下产生峰值的保留时间的保留时间下，确认了峰值产生(图6)。已知经由对花色素的3和7位上的修饰产生的花色苷积累在蓝色飞燕草花瓣中。因此，推测通过上述反应产生的花色苷是矢车菊色素3，7-O-β-二葡糖苷。同时，在从已转化了经试剂盒提供的转染有LacZ基因的载体的大肠杆菌获得的作为对照的粗制酶液中，没有产物被确认。这些结果表明，具有图5中所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：4)的基因编码能够使用香兰基葡萄糖作为糖供体将葡萄糖转移到花色苷骨架的7位的酶蛋白。

[实施例4]

茎、叶和四个不同发育阶段的花瓣中编码糖基转移酶的基因的表达水平、糖基转移酶活性的水平和花色苷积累的量的分析

检查了编码康乃馨(品种：“微笑樱桃”)中的糖基转移酶的基因的表达水平的时间依赖性变化和器官特异性。将在四个不同发育阶段的花瓣用作时间依赖性分析的样品。另外，将茎和叶用作器官特异性分析的样品。

进行RT-PCR以用于表达分析。通过在实施例2和3中所述的方法由从每个样品提取的总RNA(500ng)合成cDNA。本文所用的引物和逆转录酶分别是Oligo(dT)15引物(Promega)和M-MLV逆转录酶(invitrogen)。以下是用于检测相关基因的表达的引物：来源于康乃馨的UDP-葡萄糖转移酶(Dc3UGT)：5′-GGC ACC CAC GAC ACC ACC ATC CC-3′(SEQ ID NO：21)和5′-CAG GAT TGT CCA AGA TTA GAG TC-3′(SEQ ID NO：22)；来源于康乃馨的香兰基葡萄糖转移酶(DcVA5GT；本发明的酶)：5′-GAG GGAGTT TAC TCC AAA GAA G-3′(SEQ ID NO：23)和5′-CAC CAT GAG TTCGAC ATC TTC C-3′(SEQ ID NO：24)；和来源于康乃馨的肌动蛋白(DcActin)：5′-CCC TAT TGA GCA CGG TAT CGT CAC C-3′(SEQ ID NO：25)和5′-CAG CAC TTG TGG TGA GGG AGT AAC C-3′(SEQ ID NO：26)。以下是PCR条件：94℃持续2分钟和27、32或37个循环的94℃持续30秒、60℃持续30秒且72℃持续20秒。然后，对每种PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳以分离。以用于PCR产物的UV辐照的光的量为基础比较转录的样品的量。

以实施例1中所述的方式使用从每个样品提取的粗制酶检查糖基转移酶活性。矢车菊色素3-O-β-葡糖苷(终浓度：200μM)和1-O-β-香兰基葡萄糖(终浓度：1mM)分别用作受体和糖供体。用柠檬酸缓冲液将pH调节至5.6，然后在30℃下持续15分钟进行糖基转移酶反应。用磷酸(终浓度：1％)终止反应，然后离心以去除不溶性物质。然后，通过HPLC分析上清液(见实施例1(3)的HPLC条件)。使用矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷为参照物质以HPLC面积为基础计算每1mg粗制酶的pkat。

通过确定用包含1％三氟乙酸的80％甲醇持续72小时提取每一个样品(0.1g)获得的提取液在520nm下的吸光度，定量积累在花瓣中的花色苷的量。以天竺葵色素3，5-二葡糖苷的吸光度为基础计算每1g的每个样品的花色苷的量。

图7示出了分析结果。这些结果表明，在康乃馨植物中糖基化基因参与了康乃馨花色苷色素的合成。

[实施例5]

(1)合成1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖

使用以DDBJ数据库中的同源康乃馨糖基化酶基因(DcUGTA82)(DDBJ登录号AB294379)的DNA序列信息为基础设计的PCR引物(DcA82atg：ATGGAGGAGGATAAACAAAAGCC(SEQ ID NO：27)和DcA82atgrt：ATGTGAAGTAACTTCTTCAATA(SEQ ID NO：28))和以实施例2中所述的方式合成的3’-RACE cDNA为模板通过PCR扩增香兰酸糖基化酶基因。使用pTrcHis2-TOPO TA表达试剂盒(Invitrogen)将扩增的DNA连接到pTrcHis2-TOPO载体(Invitrogen)上以转化大肠杆菌JM109菌株。从转化的大肠杆菌提取DNA以用上述方式分析DNA核苷酸序列。因此，确认了cDNA导入的方向和未发生PCR引起的核苷酸取代。

将转化的大肠杆菌接种在包含50μl/ml氨苄青霉素的LB培养基(5ml)上，然后在30℃振荡培养14小时。然后，向其中加入IPTG以产生1mM，然后在16℃振荡培养2小时。通过1,800×g离心收集培养的大肠杆菌。从其中去除培养基。向其中加入粉碎缓冲液(0.1M磷酸钾、pH 7.5、7mM 2-巯基乙醇)(150μl)，然后充分混合。使用超声粉碎器(UD-201，TOMY SEIKO Co.，Ltd.，东京，日本)对所得产物在冰上重复进行3次持续10秒钟的超声(输出：4；功率：70)，然后20,000×g离心。将上清液转移到新的离心管中并称为粗制酶液。

在30℃下在包含粗制酶液(20μl)、粉碎缓冲液(0.1M磷酸钾、pH 7.5、7mM 2-巯基乙醇)(20μl)、10mM UDP-葡萄糖(5μl)和10mM香兰酸或对羟基苯甲酸(5μl)的反应液中持续3小时诱导反应。然后，向其中加入20％磷酸水溶液(2.5μl)以终止反应。通过20,000×g离心去除不溶性蛋白质。之后，通过HPLC分析确认反应产物。使用1.5％磷酸水溶液和甲醇作为洗脱液和Wakopak Handy ODS柱(4.6×250mm，Wako PureChemical Industries，Ltd.)进行HPLC分析。使用22％至60％甲醇的线性梯度以1ml/min流速(20分钟)进行分离。使用光电二极管阵列检测仪确认反应产物。

当使用香兰酸作为底物时，如果反应混合物中包含UDP-葡萄糖作为糖供体则发现一个新的峰。(在图8中，上图表示通过添加UDP-葡萄糖获得的峰，且中间图表示没有添加任何糖供体获得的峰。)发现该化合物在保留时间和DAD光谱方面与化学合成的1-O-β-香兰基葡萄糖相同。因此，表明该酶允许葡萄糖由酯键结合到芳香族有机酸例如香兰酸上以产生β形式。相似地，使用对羟基苯甲酸作为底物且使用UDP-葡萄糖作为糖供体诱导反应。因此，在HPLC层析图上检测到一个新的峰。(在图9中，上图表示通过添加UDP-葡萄糖获得的峰，且中间图表示没有添加任何糖供体获得的峰。)推测所获得的化合物是1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖。

接下来，在30℃下在LB培养基(200ml)中培养转化了DcUGTA82的大肠杆菌14小时。向其中加入IPTG以产生1mM的终浓度。在16℃进一步进行培养3小时。通过6,000×g离心收集培养的大肠杆菌细胞并在粉碎缓冲液(10ml)中悬浮。使用超声粉碎器对所得产物在冰上进行超声(输出：4；功率：70)30分钟，然后20,000×g离心。将上清液转移到新的离心管中并称为粗制酶液。在30℃下在包含粗制酶液(10ml)、对羟基苯甲酸(终浓度：1mM)和UDP-葡萄糖(终浓度：1mM)的反应液(总计30ml)中进行酶反应3小时。然后，为终止反应向其中加入磷酸以产生1％的终浓度，然后20,000×g离心以去除未溶解的蛋白质。使用ODS柱(ODS-SM，26×100mm)通过快速层析(YFLC-AI-580，YAMAZEN corp.)纯化上清液中包含的1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖。使用紫外可见光谱仪以对羟基苯甲酸在255nm下的吸光度为基础计算纯化的1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖的浓度。

(2)使用1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖为糖供体检测糖基转移反应

使用以实施例1中所述的方式从康乃馨(品种：“微笑樱桃”)的粉红色花瓣或飞燕草(品种：“海水蓝”)的花瓣提取的粗制酶检查糖基转移酶活性。矢车菊色素3-O-β-葡糖苷(终浓度：200μM)和1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖(终浓度：1mM)分别用作受体和糖供体。用柠檬酸缓冲液将pH调节至5.6，然后在30℃下持续15分钟进行糖基转移酶反应。用磷酸(终浓度：1％)终止反应，然后离心以去除不溶性物质。然后，通过HPLC分析上清液。使用1.5％磷酸水溶液和甲醇作为洗脱液和Wakopak HandyODS柱(4.6×250mm，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)进行HPLC分析。使用20％至55％甲醇的线性梯度以1ml/min流速(20分钟)进行分离。使用光电二极管阵列检测仪确认反应产物。

因此，在其中使用康乃馨或飞燕草粗制酶液的每种情况中，确认了糖基化酶对矢车菊色素3-O-β-葡糖苷的活性。(图10：上图表示通过向从康乃馨花瓣获得的酶中加入1-O-β-香兰基葡萄糖获得的峰，中间图表示通过向同样的酶中加入1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖获得的峰，且下图表示没有向同样的酶中添加任何糖供体获得的峰；图11：上图表示通过向从飞燕草花瓣获得的酶中加入1-O-β-香兰基葡萄糖获得的峰，中间图表示通过向同样的酶中加入1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖获得的峰，且下图表示没有向同样的酶中添加任何糖供体获得的峰。)上述结果表明除了1-O-β-香兰基葡萄糖，每种上述糖基化酶可识别1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖为糖供体。

(3)通过使用来源于飞燕草的糖基转移酶的反应产生的花色苷中的葡萄糖键的位置的确定

使用通过实施例3(2)中所述的方法产生的重组的来源于飞燕草的糖基转移酶，矢车菊色素3-O-β-葡糖苷为糖受体，且1-O-β-对羟基苯甲酰葡萄糖为糖供体进行糖基转移酶反应。使用ODS柱通过中压层析纯化被推测为矢车菊色素3，7-O-β-二葡糖苷的由于反应所获得的产物。将纯化的样品(干重：约5mg)溶解在重甲醇(heavy methanol)中以用于NOE差光谱。图12示出了结果。在图中所示的化学式中，每个箭头表示由NOE差光谱的结果发现的关联。发现了矢车菊色素骨架上的C8质子和葡萄糖1’质子之间存在关联，且矢车菊色素骨架的C6质子和葡萄糖1’质子之间存在关联。这些结果表明通过糖基转移反应产生的花色苷是由于葡萄糖转移到矢车菊色素3-葡糖苷的7位的羟基上形成的矢车菊色素3，7-二葡糖苷。

[实施例6]

使用从康乃馨纯化的酶和一种不同的化合物作为糖供体的糖基转移反应的验证

使用通过实施例2((1)和(2))中所述的方法从康乃馨(品种：“微笑樱桃”)的粉红色花瓣纯化的酶(135ng)、矢车菊色素3-葡糖苷(200μM)和糖供体(1-O-β-D-香兰基葡萄糖或已根据Matsuba等人，PlantBiotechnology第25卷，第4期(2008)第369-375页)中所述的方法酶促合成的1-O-β-D-对香豆基葡萄糖、1-O-β-D-咖啡基葡萄糖、1-O-β-D-阿魏酰葡萄糖和1-O-β-D-芥子酰葡萄糖的任何一种(500μM)，在通过添加柠檬酸缓冲液(pH 5.6)调整至30μl的反应溶液中在30℃下持续15分钟进行酶反应。向反应液中加入20％磷酸水溶液以产生1％的磷酸终浓度。因此，反应被终止，然后离心。对所得的上清液进行使用HPLC柱(ChromolithSpeedROD，4.6×50mm，Merck)、洗脱液A(1.5％磷酸水溶液)和洗脱液B(90％甲醇水溶液)用18％至28％液体B的线性梯度(流速3.0ml/min，520nm)(5分钟)的分离，然后分析。通过计算反应产物(矢车菊色素3，5-O-β-二葡糖苷)在505nm波长下的HPLC层析图上的面积来确定酶对每种糖供体的相对活性。下表中列出了结果。

表3

工业可应用性

使用本发明的糖供体试剂而不用糖核苷酸例如UDP-葡萄糖可进行糖基化反应。另外，使用本发明的糖基转移酶和糖基转移酶基因可提供能够使用除了糖核苷酸以外的糖供体催化糖基转移反应的酶。

本文提及的所有出版物、专利和专利申请全部通过引用并入本文。