CN105087618B

CN105087618B - 3ggt基因及其编码蛋白在特异性糖基化花青素-3-o-葡糖苷中的应用

Info

Publication number: CN105087618B
Application number: CN201510216003.3A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 王红霞
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN105087618A

Abstract

本发明提供3GGT基因及其编码蛋白，所述基因和编码蛋白能特异性糖基化花青素‑3‑O‑葡糖苷，从而产生花青素‑3‑O‑槐糖苷。本发明还提供了特异性糖基化花青素‑3‑O‑葡糖苷，从而产生花青素‑3‑O‑槐糖苷以及制备相应转基因植物的方法。本发明揭示了不同的花青素糖基化机制以及可能的富集机制，从而为改良产花青素的植物，以及进一步的大量生产花青素或产生新的花青素种类提供了理论依据和实践基础。

Description

3GGT基因及其编码蛋白在特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及3GGT基因及其编码蛋白，以及所述基因和编码蛋白在特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷中的应用。

背景技术

花青素(anthocyanins)，又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属类黄酮化合物。花青素可以随着细胞液的酸碱改变颜色，是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。花青素为植物二级代谢产物，在生理上扮演重要的角色。花青素常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层。部分果实以颜色深浅决定果实市场价格。天然花青素的主要来源为葡萄(Vitis L)、红醋栗(Ribes rubrum)、黑醋栗(Ribesnigrum)、草莓(Fragaria ananassa Duchesne)、苹果(Malus pumila Mill)、樱桃(Cerasuspseudocerasus)等。花青素的提取物多作为纯天然无害的保健品成分。国内外已经有很多相关产品。

自然条件下游离状态的花青素极少见，常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通形成糖苷键，从而以糖苷形式存在。

刚合成的花色苷(花青素的前体，又称花色素)无色易降解，需要经过糖基化等修饰成为有色稳定的花青素，然后经内质网途径转运到液泡中储存(Poustka等.,2007；Zhao和Dixon,2010)。然而，不同植物中的糖基化过程不相同，从而得到不同的糖基化产物，例如，在紫薯(Dioscorea alata Linn)和模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，花色苷合成后的第一步都是经过糖基化形成花青素-3-O-葡糖苷(Bloor和Abrahams,2002；Tian等.,2005)，但进一步的糖基化修饰存在差异。在拟南芥中，一个木糖苷转移到花青素-3-O-葡糖苷上；而紫薯中则是一个葡糖苷转移到花青素-3-O-葡糖苷形成花青素-3-O-槐糖苷。

目前，本领域还没有对紫薯就该方面作生物学功能研究。此外，由于糖基修饰酶的含量很低、不容易被纯化获得或是表达很不稳定，对花青素糖基修饰相关基因的研究报道甚少，尤其是在紫薯中还没有报道，从而为相关研究增加了很多难度。

因此，本领域急需对紫薯中花青素的不同糖基化模式以及花青素富集的机制进行研究，以便为农业生产中改良其它花青素提供理论依据和实践可能。

发明内容

本发明的目的是揭示不同的花青素糖基化机制以及可能的富集机制，发现3GGT基因及其编码蛋白能特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷。

在此基础上，本发明提供了包含所述基因的表达载体以及包含所述表达载体的宿主细胞，包含上述基因的编码蛋白的固定化酶或体外组合物，花青素-3-O-槐糖苷的制备方法，以及制备转基因植物以及改良产花青素植物的方法，等等。

在第一方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含选自下组的多核苷酸：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性≥95％，较佳地≥98％的多核苷酸，且其编码的蛋白具有特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷的功能；

(c)在如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-6个核苷酸得到的多核苷酸，且其编码的蛋白具有特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷的功能；或者

所述表达载体包含编码以下蛋白的多核苷酸：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

(b)由(a)所述蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白。

在另一实施方式中，所述多核苷酸编码的蛋白的C末端含有PSPG序列，和/或在对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的377位的氨基酸是Gln。

在优选的实施方式中，所述几个氨基酸残基是至多20个，优选至多10个，更优选至多5个，更优选至多3个氨基酸，最优选至多1个氨基酸残基。

在优选的实施方式中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或植物细胞病毒载体、穿梭载体。

在优选的实施方式中，所述花青素-3-O-槐糖苷是矢车菊素-3-O-槐糖苷、芍药素-3-O-槐糖苷或天竺葵色素-3-O-槐糖苷。

在优选的实施方式中，所述花青素-3-O-槐糖苷是矢车菊素-3-O-槐糖苷。

在第二方面，本发明提供包含本发明第一方面所述表达载体或基因组上整合有以下多核苷酸的宿主细胞：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(c)在如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个，较佳地1-30，更佳地1-6个核苷酸得到的多核苷酸，且其编码的蛋白具有特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷的功能；

或者

基因组上整合有编码以下蛋白的多核苷酸的宿主细胞：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

在优选的实施方式中，所述宿主细胞选自低等真核细胞，例如酵母细胞，或高等真核细胞，例如植物细胞。

在进一步的优选实施方式中，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞(Pichia Pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞；所述植物细胞是以下植物的细胞：紫薯(Dioscorea alata Linn)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis L)、红醋栗(Ribes rubrum)、黑醋栗(Ribes nigrum)、草莓(Fragaria ananassa Duchesne)、苹果(Malus pumila Mill)、樱桃(Cerasus pseudocerasus)、蓝莓(Vacciniumu)、西红柿(Lycopersicon esculentum Mill)、马铃薯(Solanum tuberosum L)、木薯(Maninotesculenta crantz)。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞具有一个或多个(如1-50个，较佳地2-6个)拷贝的本发明的表达载体。

在第三方面，本发明提供一种固定化酶，所述固定化酶中包含载体材料与以下蛋白：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

在优选的实施方式中，所述载体材料为无机载体、或多孔亲水性酶载体。

在第四方面，本发明提供一种体外制备花青素-3-O-槐糖苷的组合物，所述组合物包含：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白，或，由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQID NO:2所示的蛋白功能的衍生蛋白；

(b)葡糖基供体；和

(c)任选的，花青素-3-O-葡糖苷。

在优选的实施方式中，所述葡糖基供体是UDPG、UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖。

在进一步优选的实施方式中，所述葡糖基供体是UDPG。

在第五方面，本发明提供一种制备转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供包含本发明第一方面所述表达载体或基因组上整合有以下多核苷酸的植物细胞：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

或者，提供基因组上整合有编码以下蛋白的多核苷酸的植物细胞：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

(b)由(a)所述蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白；

(2)将步骤(1)获得的植物细胞再生为植株，从而获得转基因植物。

在优选的实施方式中，所述植物细胞是以下植物的细胞：紫薯(Dioscorea alataLinn)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis L)、红醋栗(Ribes rubrum)、黑醋栗(Ribes nigrum)、草莓(Fragaria ananassa Duchesne)、苹果(Malus pumila Mill)、樱桃(Cerasus pseudocerasus)、蓝莓(Vacciniumu)、西红柿(Lycopersicon esculentumMill)、马铃薯(Solanum tuberosum L)、木薯(Maninot esculenta crantz)。

在第六方面，本发明提供以下物质在制备花青素-3-O-槐糖苷中的用途：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(d)本发明第一方面所述的表达载体；

(e)本发明第二方面所述的宿主细胞；

(f)本发明第三方面所述固定化酶；

(g)本发明第四方面所述组合物；

(h)本发明第五方面所述方法制备得到的转基因植物；

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

(j)由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白功能的衍生蛋白。

在第七方面，本发明提供以下物质在改良产花青素植物中的用途：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(d)本发明第一方面所述的表达载体；

(e)本发明第二方面所述的宿主细胞；

(f)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

(g)由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白功能的衍生蛋白。

在第八方面，本发明提供一种制备花青素-3-O-槐糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)采用本发明第五方面所述方法制备得到转基因植物；

(b)培养步骤(a)得到的转基因植物；和

(c)从步骤(b)培养的转基因植物获得花青素-3-O-槐糖苷；

或

(a)利用本发明第三方面所述固定化酶，或利用本发明第四方面所述的组合物在体外制备花青素-3-O-槐糖苷。

在第九方面，本发明提供一种改良产花青素植物的方法，所述方法通过将外源性的本发明第一方面所述表达载体或以下多核苷酸转入待改良植物来实现：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

或者，将编码以下蛋白的外源性多核苷酸转入待改良植物：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

在第十方面，本发明提供制备本发明3GGT酶的方法，包括以下步骤：

(1)将包含本发明第一方面所述表达载体或以下多核苷酸导入宿主细胞：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

或者，将编码以下蛋白的多核苷酸导入宿主细胞：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

(2)培养步骤(1)得到的宿主细胞；和

(3)从步骤(2)的培养体系中分离产生的3GGT酶。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞；优选地，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞(Pichia Pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞；更优选酿酒酵母细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了不同高等植物中花青素的糖基转移酶的进化树。其中图1a显示了Ib3GGT和Ip3GGT的氨基酸序列比对结果；图1b显示了植物中花青素糖基转移酶的进化树；图中，petunia：矮牵牛花；gentian：龙胆；forsythia：连翘；perilla：紫苏；Arabidopsis：拟南芥；strawberry：草莓；grape：葡萄；populus：杨；iris：鸢尾；Maize：玉米；verbena：马鞭草；torenia：蓝猪耳；sweet potato：甘薯；

图2显示了HPLC检测转染Ib3GGT基因的拟南芥的花青素组分。图中，sample：样品；cyanidin 3-sophoroside：矢车菊素3-槐糖苷；cyanidin 3,5-glucoside：矢车菊色素3,5-葡糖苷；

图3显示了不同pH值下3GGT蛋白的体外催化反应。图中，buffer：缓冲液；substrate：底物；cyanidin-3-soph(cyanidin-3-sophoroside)：矢车菊素3-槐糖苷；cyanidin-3-glu(cyanidin-3-glucoside)：矢车菊素-3-葡糖苷；negative control：负对照；

图4显示了不同花青素的底物3GGT蛋白体外催化反应。图中，buffer：缓冲液；substrate：底物；cyanidin：矢车菊素；enzyme：酶；GGT crude protein：GGT粗蛋白；cyanidin-3-glucoside-5-glucoside：矢车菊素-3-葡糖苷-5-葡糖苷；quercetin-3-glucoside：槲皮素-3-葡糖苷；

图5显示了Ib3GGT催化反应的模式图。图中，glucose：葡萄糖；anthocyanidin：花青素；glucoside：3-O-葡糖苷；sophoroside：槐糖苷；cyanidin：矢车菊素；pelargonidin：天竺葵素；Delphindin：翠雀素；

图6显示了在洋葱表皮中瞬时表达的Ib3GGT蛋白。图中，plasmolyzed：质壁分离。

图7显示了Ib3GGT在烟草表皮细胞及原生质体中的亚细胞定位。图中，βbrightfield：亮视野；merged：合并的；chloroplast：叶绿体。

图8显示了RNAi干扰和过表达Ib3GGT的转基因紫薯地上部分的表型。

图9显示了RNAi干扰和过表达Ib3GGT的转基因紫薯幼叶的自发荧光。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现紫薯中的3GGT基因能特异性催化底物花青素-3-O-葡糖苷产生花青素-3-O-槐糖苷，而该基因编码的蛋白能在体外特异性催化花青素-3-O-葡糖苷形成花青素-3-O-槐糖苷，从而揭示了紫薯中花青素的不同糖基化模式以及花青素富集的机制，进而为农业生产中改良其它花青素提供理论依据和实践可能。在此基础上完成了本发明。

术语定义

花青素

花青素的基本结构单元是2-苯基苯并吡喃型阳离子，即花色基元。现已知的花青素有20多种，主要存在于植物中的有：天竺葵色素(Pelargonidin)、矢车菊色素或芙蓉花色素(Cyanidin)、翠雀素或飞燕草色(Delphindin)、芍药色素(Peonidin)、牵牛花色素(Petunidin)及锦葵色素(Malvidin)。

花青素是一种强有力的抗氧化剂，能够保护人体免受自由基的损伤，其作用主要有：1.预防包括癌症、心脏病、过早衰老和关节炎在内的多种与自由基有关的疾病；2.减少心脏病和中风的发生；3.增强免疫系统；4.抗突变功能；5.抗炎；6.缓解过敏症；7.增强血管弹性；8.降血压；9.保护脑细胞；10.使皮肤光滑而富有弹性，防止过度日晒所致皮肤损伤；11.抗辐射；12.促进视网膜细胞中的视紫质再生，预防近视，增进视力。

然而，刚合成的花色苷(花青素的前体)无色，易降解，需要经过糖基化等修饰才能成为有色稳定的花青素。不同植物中的糖基化过程不相同，从而得到不同的糖基化产物，例如，在紫薯(Dioscorea alata Linn)和模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，花色苷合成后的第一步都是经过糖基化形成花青素-3-O-葡糖苷，但进一步的糖基化修饰存在差异。在拟南芥中，一个木糖苷转移到花青素-3-O-葡糖苷上；而紫薯中则是一个葡糖苷转移到花青素-3-O-葡糖苷形成花青素-3-O-槐糖苷。此外，由于糖基修饰酶的含量很低、不容易被纯化获得或是表达很不稳定，对花青素糖基修饰相关基因的研究报道甚少。

因此，如果能了解不同植物中花青素的糖基化机制，就能进一步改良产花青素的植物，稳定并富集花青素，并产生新的花青素种类。

3GGT基因及其编码的蛋白

本发明人在紫薯中成功分离到3GGT基因(SEQ ID NO:1)，并发现该基因编码的蛋白，即，糖基化转移酶能特异性催化底物花青素-3-O-葡糖苷产生花青素-3-O-槐糖苷。

在本发明中，“特异性”是指本发明的基因或其编码的蛋白能够将葡糖基特异性地结合在底物，花青素-3-O-葡糖苷的特定位置，从而形成花青素-3-O-槐糖苷。在具体的实施方式中，所述花青素-3-O-槐糖苷是矢车菊素-3-O-槐糖苷、芍药素-3-O-槐糖苷或天竺葵色素-3-O-槐糖苷。

本发明还提供了本发明“3GGT基因”的变异体形式。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示编码序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2所示成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离所述多核苷酸。

因此，在本发明中，术语“3GGT基因”、“本发明基因”或“本发明多核苷酸”具有相同的含义。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员应理解，尽管本发明的实施例中提供的3GGT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，但本发明还应包括与本发明的3GGT基因(SEQ ID NO:1)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，只要所述核酸编码的蛋白具有特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即，序列相似性或同一性)。

对于本领域普通技术人员而言，在获得具体的基因后，在该基因的5’端和/或3’端截短或增加若干核苷酸而仍能得到与原基因功能相同或相似的变体是容易做到的。例如，在具体的实施方式中，本发明包括在SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个，较佳地1-30，更佳地1-6个核苷酸得到的多核苷酸，只要其编码的蛋白具有特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷的功能。

在本发明中，术语“3GGT酶”、“3GGT蛋白”、“本发明蛋白”或“3GGT基因编码的蛋白”具有相同的含义，均是指本发明的3GGT基因编码得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白或其变体，所述蛋白具有特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷的功能。

鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白“3GGT蛋白”还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式具有与“3GGT蛋白”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。在优选的实施方式中，所述3GGT蛋白的变异形式在蛋白的C末端含有PSPG序列，和/或在对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的377位的氨基酸是Gln。本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的377位”而言，如果在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的一端加上6-His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的377位点就可能是383位；而如果删除SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的少数氨基酸残基，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第377位就可能是第371位，等等。再例如，如果一条具有409个氨基酸残基的序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第51-459位具有较高的同源性或序列相同性，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第377位就可能是第327位。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“3GGT蛋白”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗“3GGT蛋白”的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“3GGT蛋白”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“3GGT蛋白”的可溶性片段。通常，该片段具有“3GGT蛋白”序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供“3GGT蛋白”的类似物。这些类似物与天然“3GGT蛋白”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，“3GGT蛋白”的保守性变异多肽指与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，有至多20个，优选至多10个，更优选至多5个，更优选至多3个氨基酸，最优选至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从真核宿主(例如，酵母、高等植物)中产生。

本领域技术人员明白，本发明的“3GGT蛋白”还包括的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“3GGT蛋白”相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种“3GGT蛋白”的生物活性片段都可以应用于本发明。在本文中，“3GGT蛋白”的生物活性片段是指“3GGT蛋白”的片段，但其仍然能保持全长“3GGT蛋白”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“3GGT蛋白”的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“3GGT蛋白”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明的表达载体和宿主细胞

在本发明的3GGT基因或多核苷酸的基础上，本发明还提供了包含本发明核苷酸序列的表达载体，以及用本发明的表达载体或本发明多核苷酸经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的“3GGT蛋白”。一般来说有以下步骤：

1.用本发明的编码“3GGT蛋白”的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

2.在合适的培养基中培养的宿主细胞；

3.从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，“3GGT蛋白”的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体。术语“重组表达载体”指本领域熟知的酵母质粒、植物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员可采用熟知的方法构建含“3GGT蛋白”编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本文所述的宿主细胞包括包含表达载体或基因组上整合了本发明“3GGT蛋白”编码序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞或菌株能够特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在具体的实施方式中，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞(Pichia Pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞；所述植物细胞是以下植物的细胞：紫薯(Dioscorea alata Linn)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis L)、红醋栗(Ribes rubrum)、黑醋栗(Ribes nigrum)、草莓(Fragaria ananassa Duchesne)、苹果(Malus pumila Mill)、樱桃(Cerasus pseudocerasus)、蓝莓(Vacciniumu)、西红柿(Lycopersicon esculentum Mill)、马铃薯(Solanum tuberosum L)、木薯(Maninotesculenta crantz)。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。例如，当宿主是真核生物时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

固定化酶

本文所用的术语“固定化酶”具有本领域普通技术人员常规理解的含义。具体地说，该术语表示水溶性酶经物理或化学方法处理后，使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。

固定化的酶仍具有酶活性，在催化反应中以固相状态作用于底物。酶经固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。

本领域普通技术人员鉴于本文的教导，不难将本发明的3GGT蛋白制成固定化酶，进而用于催化花青素-3-O-葡糖苷形成花青素-3-O-槐糖苷，利用固定化酶的方法操作简单，产物和酶均易于回收。

在具体的实施方式中，本发明提供的固定化酶中包含载体材料与以下蛋白：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；或

在一优选例中，所述载体材料为无机载体、或多孔亲水性酶载体。

体外制备花青素-3-O-槐糖苷的组合物

基于本发明的3GGT蛋白，本发明人还提供了一种体外制备花青素-3-O-槐糖苷的组合物，所述组合物包含：

(a)本发明的3GGT蛋白；

(b)葡糖基供体；和

(c)任选的，花青素-3-O-葡糖苷。

在本发明中，术语“葡糖基供体”是指能将其自身的葡糖基供给其它分子，从而使得其它分子，例如本发明的花青素-3-O-葡糖苷被糖基化的物质。

在具体的实施方式中，所述葡糖基供体是UDPG、UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖、和UDP-木糖。在优选的实施方式中，所述葡糖基供体是UDPG。

鉴于本发明的以上发明内容，本领域技术人员可以理解，本发明的3GGT基因或蛋白，本发明的表达载体、宿主细胞、固定化酶、组合物等可以用于制备花青素-3-O-槐糖苷或改良产花青素植物。例如，可在植物中导入外源性的本发明3GGT基因，从而在该植物中产生原本不存在的花青素-3-O-槐糖苷，或者在该植物中增加花青素-3-O-葡糖苷的产量，或者在该植物中产生结构全新的花青素-3-O-槐糖苷。再例如，还可利用本发明3GGT基因的抑制剂，例如3GGT基因的反义RNA等，或3GGT蛋白的抑制剂，例如抗血清或抗体来抑制相应基因或蛋白的功能，以便使得改造后的植物不产特定的花青素-3-O-槐糖苷。

制备转基因植物

在本发明的以上内容的基础上，本发明人还提供了制备转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供包含本发明的表达载体或基因组上整合有本发明多核苷酸的植物细胞：

在具体的实施方式中，所述植物细胞是以下植物的细胞：紫薯(Dioscorea alataLinn)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis L)、红醋栗(Ribes rubrum)、黑醋栗(Ribes nigrum)、草莓(Fragaria ananassa Duchesne)、苹果(Malus pumila Mill)、樱桃(Cerasus pseudocerasus)、蓝莓(Vacciniumu)、西红柿(Lycopersicon esculentumMill)、马铃薯(Solanum tuberosum L)、木薯(Maninot esculenta crantz)。

在本发明基因和本发明蛋白的基础上，本发明还提供了制备花青素-3-O-槐糖苷的方法。在具体的实施方式中，所述方法包括培养本发明的转基因植物；并从该转基因植物中获得花青素-3-O-槐糖苷。在另一实施方式中，所述方法包括利用本发明提供的固定化酶或组合物在体外直接制备花青素-3-O-槐糖苷。

在本发明基因和本发明蛋白的基础上，本发明还提供了改良产花青素植物的方法。在具体的实施方式中，所述方法通过将外源性的本发明表达载体或本发明多核苷酸转入待改良植物来实现。

进一步地，本发明还提供了制备本发明3GGT蛋白的方法，包括：将本发明的多核苷酸导入宿主细胞；培养得到的宿主细胞；和培养体系中分离本发明3GGT蛋白。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞，例如毕赤酵母(PichiaPastoris)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。

本发明的优点

1.本发明首次揭示了紫薯中花青素-3-O-葡糖苷糖基化的机制；

2.本发明的3GGT基因及其编码蛋白能特异性糖基化花青素-3-O-葡糖苷，从而产生花青素-3-O-槐糖苷；

3.本发明揭示的花青素糖基化机制以及可能的富集机制为改良产花青素的植物，以及进一步的大量生产花青素或产生全新结构的花青素种类提供了理论依据和实践基础；

4.本发明提供的3GGT固定化酶或组合物为体外制备花青素-3-O-槐糖苷提供了操作简单，产物和酶易于回收的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料与方法

Ib3GGT基因的克隆

以紫薯cDNA为模板，采用Clontech GenomeWalker^TMUniversal Kit的方法，利用正向引物(ATGGGTTCTCAAGCAACAAC；SEQ ID NO:3)和反向引物(TCATCCAAGGAGATCCTGCA；SEQID NO:4)克隆Ib3GGT基因。

在拟南芥中过表达Ib3GGT

构建在拟南芥中过表达Ib3GGT的表达载体，包括：

1. 37℃，利用KpnⅠ和SalI(Takara公司)对PCR产物(正向引物：GGGGTACCATGGGTTCTCAAGCAACAAC，SEQ ID NO:5；反向引物：ACGCGTCGACTCATCCAAGGAGATCCTGCA，SEQ ID NO:6)和测序用pMD18T载体(Takara公司)作双酶切2小时，测序正确后，再酶切连接到pCAMBIA1301(Takara公司)。

2.载体连接

利用T4连接酶(Takara公司)连接载体和PCR产物获得连接产物，反应条件如下所示：连接载体和PCR产物以1:3～1:10的分子数连接，16℃，过夜连接。

3.连接产物转化感受态细胞DH5α(Takara公司购买)

(1)取200mL感受态细胞，加入10μL连接产物，冰浴30min；

(2)42℃水浴72秒，冰浴3～5min，然后加入800μL新鲜的液体培养基；

(3)37℃，150rpm振荡培养1h，4000rpm离心5min，弃上清液，在沉淀中加入200mL新鲜的LB液体培养基；

(4)涂平板(含100μg/ml Kan)，37℃培养12小时，观察结果。

4.克隆验证

挑取10个克隆并编号。用菌落PCR验证克隆是否为阳性。PCR扩增条件如上所述。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，有目的的条带编号的克隆可以初步确定为阳性克隆。

5.重组载体验证

(1)对重组质粒进行KpnⅠ和SalI双酶切验证，条件同上。

(2)对重组质粒进行PCR验证，引物同上。

转化根瘤农杆菌(LB4404，Invitrogen，Carlsbad,CA)，具体包括：

(1)取200mL感受态细胞，加入1μg重组质粒，冰浴30min；

(2)液氮冷冻1-2min，放于37℃水浴中融化，或迅速放入37℃轻摇5～6min，然后加入800μL新鲜的液体培养基；

(3)28℃，180rpm振荡培养2-4h，5000rpm离心5min，弃上清液，在沉淀中加入200mL新鲜的YEP液体培养基；

(4)涂平板(含100μg/ml Kan,100μg/ml Rif，75μg/ml Strep)。28℃培养2-3天，观察结果。

在拟南芥中过量表达

利用GV3101(Agrobacterium tumefaciens)介导的浸花法[Clough SJ,BentAF.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J,1998,16:735-743]完成对拟南芥Col-0(参见，例如，习雨琳等:拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价，作物学报，2012,38(9):1561-1569；或者CN102215667 A)的转化以便在野生型Col-0中过表达Ib3GGT。

HPLC分析仪器及条件为：

HPLC 1200(安捷伦公司)；520nm检测；

C18柱(4.6x 100mm，3.5μm)，柱温45℃；

流动相：流动相A是100％的乙腈，流动相B是三氟乙酸0.1％(v/v)；流速为0.8mL/min；

洗脱梯度为：0分钟时A为10％，B为90％，30分钟时A为22％，B为78％，35分钟时A为10％，B为90％，每次注射5μL样品。

质谱分析的仪器和条件：

6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS(安捷伦公司)

正离子模式下采用m/z 121.0509(质子化嘌呤)和m/z 922.0098(质子化六(1H,1H,3H-四氟丙氧基)磷嗪或HP-921)信号；负离子模式下采用m/z 119.0362(去质子嘌呤)和m/z 980.0164(HP-921醋酸加合物)；

LC运行条件：

色谱柱c，2.1x 100mm，1.8μm，柱温40℃，进样量2μl，自动进样器温度4℃；

流动相正离子模式：A＝5mM甲酸胺，B＝甲醇

负离子模式：A＝5mM甲酸胺，B＝甲醇

流速梯度运行时0.3mL/min，柱平衡时0.5mL/min

梯度程序：B＝5％-65％，0-13分钟；B＝65％-100％，13-16分钟；B＝100％，16-20分钟；B＝5％，20-24分钟

(柱平衡)分析时间20分钟

MS条件：

离子模式正离子和负离子模式，ESI+APCI多模式电离

干燥气温度300℃，气化温度170℃，干燥气流速11L/min，雾化器压力40psi，毛细管电压正离子模式4500v，负离子模式3000v，锥孔电压65v，八极杆DC1 47v，八极杆RF750v，碎裂电压125v，谱图采集速率每秒1.4张谱图

MS/MS条件：

离子模式正离子

分离窗4amu

谱图采集速率每秒1.4张谱图

体外表达3GGT及酶功能验证

表达载体的构建

以紫薯cDNA为模板，PCR扩增Ib3GGT基因，将HIS标签设计到引物中(正向引物：CCCAAGCTTATGGGTTCTCAAGCAACAAC，SEQ ID NO:7；反向引物：CGCGGATCCTCACATCACCATCACCATCACTCCAAGGAGATCCTGCA，SEQ ID NO:8)。PCR产物连接到测序用pMD18-T载体中，序列经测序验证后，基因由HindⅢ/BamHⅠ酶切位点连接到pYES2酵母表达载体(Invitrogen，USA)上，形成终表达载体pYES2::Ib3GGT。

以Ex-Taq(TaKaRa，Dalian，China)扩增目的片段为例，反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环数；72℃延伸10min；16℃保温。

酿酒酵母转化

具体方法参照Clotech说明书进行。

酿酒酵母pYES2-Ib3GGT诱导表达

1)接种一个酵母转化子菌落到10mL SC-glucose培养基(参见PYES2Cat.no.V825-20 Protocal，第10页，Version K，5 December 2008，28-0053，Invitrogen)中，30℃200rpm培养24h至OD₆₀₀到2.0～3.5；

2)测定OD₆₀₀，计算转接到50mL诱导培养基SC-galactose(参见PYES2Cat.no.V825-20 Protocal，第10页，Version K，5 December 2008，28-0053，Invitrogen)中需要的菌液体积，使诱导培养基中OD₆₀₀为0.4左右(0.4×50ml/OD₆₀₀，SC-glucose培养基中)；

3)5000g离心5min收集菌体，弃上清。将菌体重悬于1～2mL SC-galactose培养基中，清洗，5000g离心5min收集菌体，弃上清，转接入50mL SC-galactose培养基中。30℃200rpm诱导培养20～24h；

4)5000g离心5min收集菌体，ddH₂O洗涤一次，5000g离心5min，弃上清冻存于-70℃，或者重悬于600μL Yeast Breaking Buffer(2％TritonX-100,1％SDS,100mM NaCl,10mM Tris-HCl pH8.0,l mM EDTA)中，开始瓷珠震荡破碎。使用fastprep-24功率6M/s，40s/次，震荡5次可以破碎，取总蛋白做anti-6×His Western Blotting。

Ib3GGT体外酶活反应及测定

酵母中表达Ib3GGT粗提蛋白在100mM磷酸缓冲液中反应，底物为0.6mM的矢车菊素或矢车菊素-3-O-葡糖苷或矢车菊素-3，5-O-葡糖苷，1mM UDP-葡萄糖，37℃反应2小时。加入花青素开始反应，离心终止反应。HPLC 1200在520nm检测的条件为C18柱(4.6x 100mm，3.5μm)，柱温45℃。流动相分离的条件是流速0.8mL/min，流动相A是100％的乙腈，流动相B是三氟乙酸0.1％(v/v)。0分钟时A为10％，B为90％，30分钟时A为22％，B为78％，35分钟时A为10％，B为90％，每次注射5μL的样品。

3GGT的亚细胞定位

1.载体构建

带有GFP基因的商业化PA7载体(购自TAKARA)，Xho I和Spe I双酶切后将片段和载体连接，3GGT基因的全长去除终止子，使其能和GFP编码的蛋白融合。

所用正向引物：CCGCTCGAGATGGGTTCTCAAGCAACAAC，SEQ ID NO:9；反向引物：GGACTAGTTCCAAGGAGATCCTGCAGT，SEQ ID NO:10。

转化大肠杆菌后提取质粒。

2.基因枪轰击洋葱表皮观察GFP瞬时表达

1)实验材料准备

撕取洋葱内表皮，置于高渗培养液(MS无机盐、40g/L甘露醇)中，室温100rpm处理4小时；然后转入高渗固体培养基(MS无机盐、40g/L甘露醇、0.7％琼脂)；

2)金粉准备

a.称取60mg金粉放入1.5ml Ep管(最好烷硅化以减少金粉沾壁)；

b.加入1ml的无水乙醇，涡旋振荡1-2min；

c.冰上静置5min后，10,000rpm离心1min，去上清；

d.重复a，b步骤重新清洗金粉三次；

e.室温，10,000rpm离心1min，去上清；

f.加入1ml无菌去离子水，涡旋振荡1-2min，冰上静置5min；

g.室温，10,000rpm.离心1min，去上清；

h.重复g步聚两次；

i.加入1ml无菌去离子水，按50ul每份分装到己灭菌的1.5-ml Ep管中备用(分装时应在无菌条件下边涡旋振荡，以保证分装均匀)

3)DNA包裹金粉微粒

a.取50ul金粉悬浮液，在连续涡旋振荡下按顺序加入5ul质粒DNA(1ug/ul)、50X12.5M CaCl₂、20ul 0.1M亚精胺；

b.涡旋振荡3min；

c.室温下离心10,000rpm 10sec，尽可能取出上清液；

d.加入250ul无水乙醇，涡旋振荡1-2min；

e.室温下离心10,000rpm 10sec，尽可能取出上清液；

f.加入60ul无水乙醇(可进行4-8次轰击)。

4)基因枪轰击操作(无菌条件下)

a.超净台紫外灯灭菌20min；

b.载体膜、可裂膜、阻拦网等事先置于70％乙醇中1min，灭菌滤纸上自然风干；将气瓶调节压力到1300psi；

c.取8-9ul已用DNA包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰击；

d.将可裂膜、阻拦网、涂有微粒载体膜安装进固体装置中，射击参数为：轰击微粒运行距离为12cm，压力1110psi，真空度25mmHg；

e.轰击结束后的材料，转移到等渗培养基(MS培养基)中培养一天一夜；

f.使用激光共聚焦显微镜(OLYMPUS FV1000)488nm波长激发下，观察GFP的表达。

实施例

实施例1.Ib3GGT的克隆及序列分析

发明人利用同源克隆的方法克隆出花青素的糖基转移酶基因(Genbank的序列号：ABL74480)，命名为Ib3GGT(SEQ ID NO:1，atgggttctcaagcaacaactcatcacatggctatgtatccctggtttggcgtcggccacctcaccgctttcttccgcctcgccaacaaactagccagtaagggtcatcgcatctccttcttgatccccaaaaacacccaatccaagctcgcatctttcaaccttcacccacacctcgtttcctttgttcccatcaccgtaccctccatccccggcctccctcccggcgccgagaccacctccgatgtccccttctcctccacccatctcctcatggaggccatggacaaaacccagaccgacattgagatcatcctcaaaaacctcgaagtggatgtcgtgttctttgatttcacccactggctacccggcctagcacgaaagatcgggatcaaatcagtattttacagtaccataagtccgctcatgcatggcttcgctttatccccggagcggagagttgccgggaaacagttaaccgaagctgatatgatgaaagctccggccagtttcccggacccgtccattaagctccacgcgcacgaggcgcgtgggtttacagccaggactgtgatgaagtttggtggggatataaccttctttgaccggatttttactgcggttagtgaaagtgatggtttggcgtatagtacatgccgggagattgaaggccaattctgcgactacatagaaacgcagtttaaaaaacccgtcctactcgccggcccagctttacccgtcccatcaaaatccaccatggaacaaaaatggtcggattggctggggaaattcaaggaaggctctgttatatactgcgcattcgggagcgaatgcaccctacgcaaggaacaattccaggaattactctggggattagagctcacaggaatgccattcttcgccgccctaaaagccccattcggaaccgattcaatcgaagccgccatccccgaggagctgagggagaaaatacacggaaaagggatcgtccatggcggatgggttcaacagcaattgtttctccagcacccatctgtgggctgctttgtgagccactgcgggtgggcttctttatctgaagcactggtaaatgattgccaaatcgtgcttttgccgcaggttggggatcagattatcaacgcaagaatcatgagtgtgagcctgaaagttggggtggaggtggagaaaggggaagaagatggggtgttttcaagagagagtgtgtgcaaggcagtaaaagctgtgatggatgaaaagagtgagattggaagagaagttagaggcaaccatgataagttaagaggtttcttgttgaatgcagatctggattcaaagtacatggactctttcaatcagaaactgcaggatctccttggatga)。

Ib3GGT编码区核苷酸长1380bp，编码459个氨基酸(SEQ ID NO:2，mgsqatthhmamypwfgvghltaffrlanklaskghrisflipkntqsklasfnlhphlvsfvpitvpsipglppgaettsdvpfssthllmeamdktqtdieiilknlevdvvffdfthwlpglarkigiksvfystisplmhgfalsperrvagkqlteadmmkapasfpdpsiklhaheargftartvmkfggditffdriftavsesdglaystcreiegqfcdyietqfkkp vllagpalpvpskstmeqkwsdwlgkfkegsviycafgsectlrkeqfqellwgleltgmpffaalkapfgtdsieaaipeelrekihgkgivhggwvqqqlflqhpsvgcfvshcgwaslsealvndcqivllpqvgdqiinarimsvslkvgvevekgeedgvfsresvckavkavmdekseigrevrgnhdklrgfllnadldskymdsfnqklqdllg*)，预测的分子量为50.87KDa，等电点为6.537。进一步分析序列发现Ib3GGT的C末端含有一个保守的PSPG序列(图1a)，这个保守序列用来连接UDPG上的糖基元件。另外，PSPG序列的最后一个氨基酸部分决定糖基供体的特异性，Ib3GGT基因上的PSPG序列的最后一个氨基酸是Gln(377位)，它是一个UDP-葡萄糖保守的糖基转移酶位点。

因此，发明人在紫薯中克隆了一个新的糖基转移酶基因。图1b显示不同高等植物中花青素的糖基转移酶的进化树，根据进化树的分析显示Ib3GGT不属于UF3GTs或UF5GTs，但是它和Ip3GGT很靠近,他们的氨基酸序列同源性达到93％。

实施例2在模式植物拟南芥中过表达Ib3GGT

在克隆到实施例1所述基因的基础上，发明人在野生型Col-0(参见，例如，习雨琳等:拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价，作物学报，2012,38(9):1561-1569；或者CN102215667A)中过表达Ib3GGT。

HPLC分析比较野生型和转基因拟南芥的花青素组分发现转基因拟南芥中产生一个明显的新峰(如图2红色箭头指示)，即，新的物质。收集该物质，对此组分进行质谱分析后预测该物种可能是矢车菊素-3-O-槐糖苷或矢车菊素-3-葡糖苷-5-葡糖苷，进一步研究发现该物质的保留时间和矢车菊素-3-O-槐糖苷的标准品的保留时间一致，因此，证明在拟南芥中过表达紫薯中发现的基因产生了新的花青素组分，矢车菊素-3-O-槐糖苷。从而在拟南芥中证实了Ib3GGT酶的功能，即，催化花青素-3-O-葡糖苷形成花青素-3-O-槐糖苷(图2)。这与拟南芥中特有的矢车菊素-3-O-葡糖苷进一步糖基化成矢车菊素-3-O-葡糖苷-木糖不同。

实施例3.体外表达3GGT及酶功能的验证

发明人利用真核菌株酵母(酿酒酵母BY4742，获自美国Open Biosystems公司)表达该重组蛋白。在不同的pH值下，以矢车菊素-3-O-葡糖苷和UDPG为底物，用酵母中该蛋白的粗提物催化该反应后都能生成新的物质花青素-3-O-槐糖苷(图3)。

发明人换用不同的花青素类底物矢车菊素或矢车菊素-3-葡糖苷-5-葡糖苷或黄酮醇类底物槲皮素-3-O-葡糖苷后该酶催化都没有新的物质生成，Ib3GGT仅特异性催化底物矢车菊素-3-O-葡糖苷(图4)。因此，体外实验证明3GGT可以催化以花青素-3-O-葡糖苷为受体以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为供体生成花青素-3-O-魁糖苷的糖基化修饰反应(图5)。

发明人进一步换用其它花青素-3-O-葡糖苷作为底物，发现本发明的3GGT酶催化产生了花青素-3-O-槐糖苷。

实施例4. 3GGT的亚细胞定位

发明人在成功分离到紫薯中3GGT基因的基础上，对该基因的具体作用位置进行了进一步研究。在洋葱的表皮细胞异源瞬时表达3GGT和GFP的融合蛋白，荧光显微镜下观察蛋白的定位在细胞质中(图6)。

发明人进一步将3GGT和GFP的融合蛋白的载体用农杆菌转化紫薯愈伤组织或转基因植株，从而在紫薯中进一步确认了3GGT蛋白的定位。

实施例5.Ib3GGT的亚细胞定位

发明人在烟草的表皮细胞中瞬时表达Ib3GGT和GFP的融合蛋白，在激光共聚焦显微镜下观察该蛋白的定位，以确定Ib3GGT蛋白在细胞中的定位，从而有助于推测其功能。

实验结果显示：在烟草的表皮细胞和原生质体中都发现该蛋白部分定位在内质网(图7A、7B)及高尔基体上(图7C、7D)。具体为：图7A显示Ib3GGT和GFP的融合蛋白在烟草表皮细胞中部分定位在内质网上；图7B显示Ib3GGT和GFP的融合蛋白在烟草原生质体中部分定位在内质网上，其中，ER-mCherry是内质网定位的标记物，chloroplast代表叶绿体自发荧光；图7C显示Ib3GGT和GFP的融合蛋白在烟草表皮细胞中部分定位在高尔基体上；图7D显示Ib3GGT和GFP的融合蛋白在烟草原生质体中部分定位在高尔基体上，其中，Gi-mCherry是高尔基体定位的标记物。

由于花青素也是通过内质网-高尔基体的途径运输到液泡中储藏，这提示Ib3GGT蛋白可能也参与花青素的运输过程或Ib3GGT蛋白是在花青素一边运输的过程中一边糖基化修饰。后期实验通过酵母双杂交、双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)验证了与Ib3GGT相互作用的蛋白。

实施例6.RNAi干扰和过表达Ib3GGT的转基因紫薯

发明人进一步通过干扰和过表达Ib3GGT基因，通过农杆菌转化紫薯愈伤的方法，获得转基因紫薯。

实验结果如图8所示，从中可以看出RNAi干扰Ib3GGT转基因的植株幼叶紫色被明显抑制，花青素含量减少；而过表达Ib3GGT的转基因紫薯幼叶花青素含量相比野生型有所提高，表明Ib3GGT基因对花青素的富集起很重要的作用(图8)。

实施例7.通过花青素自发荧光检测转基因植株中花青素的聚集

发明人通过花青素自发荧光进一步检测了转基因植株中花青素的聚集。

实验结果如图9所示。花青素在激发光488nm或561nm下会激发出红色荧光，在共聚焦荧光显微镜下，观察到干扰或超表达Ib3GGT的转基因植株幼叶花青素自发荧光在表皮细胞的液泡中，说明花青素主要在液泡中聚集储藏(图9)。但RNAiIb3GGT干扰的转基因植株在液泡中的花青素荧光成点状分布，活细胞的动态观察发现点状的花青素一直在运动，但不能融合到一起而聚集成稳定的花青素。而WT和OEIb3GGT过表达的植株中花青素能聚集到一起，在液泡中储藏。因此，推测Ib3GGT基因影响紫薯花青素在液泡中的聚集，从而影响到花青素的富集。

本发明初步证明了Ib3GGT可能在细胞质中催化花青素-3-O-葡糖苷生成花青素-3-O-槐糖苷的糖基化修饰反应，且影响花青素的富集。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种体外制备花青素-3-O-槐糖苷的组合物，所述组合物包含：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；

(b)葡糖基供体；和

(c)花青素-3-O-葡糖苷。

2.以下物质在制备花青素-3-O-槐糖苷中的用途：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(b)包含(a)所述多核苷酸的表达载体；

(c)包含(b)所述表达载体或基因组上整合有(a)所述多核苷酸的宿主细胞；

(d)包含载体材料和(a)所述多核苷酸编码的蛋白的固定化酶；

(e)权利要求1所述组合物；

(f)以下方法制备得到的转基因植物，所述方法包括以下步骤：

(1)提供包含以下多核苷酸的表达载体或基因组上整合有以下多核苷酸的植物细胞：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；

(2)将步骤(1)获得的植物细胞再生为植株，从而获得转基因植物；

(g)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。

3.一种制备花青素-3-O-槐糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)采用以下方法制备得到转基因植物，所述方法包括以下步骤：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白；

(b)培养步骤(a)得到的转基因植物；和

(c)从步骤(b)培养的转基因植物获得花青素-3-O-槐糖苷；

或者

(a)利用包含载体材料和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白的固定化酶，或利用权利要求1所述的组合物在体外制备花青素-3-O-槐糖苷。