CN110117326A

CN110117326A - 黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用

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Publication number: CN110117326A
Application number: CN201810115849.1A
Authority: CN
Inventors: 王国栋; 班兆男
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2019-08-13
Anticipated expiration: 2038-02-06
Also published as: CN110117326B

Abstract

本发明公开了黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用。本发明公开的黄腐醇相关蛋白为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的黄腐醇相关蛋白具有稳定黄腐醇合成途径中产物的作用，在黄酮类化合物和脱甲基黄腐醇合成生物学应用以及人类健康保健等领域有广泛的应用前景。

Description

黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用。

背景技术

啤酒花(也称作忽布、蛇麻花等，Humulus lupulus L.，是二倍体，2n＝2x＝20)属于蔷薇目大麻科葎草属，是多年生攀缘草本植物,雌雄异株，雌花是由苞片呈复瓦状排列形成的球果状花序，长3～4厘米，内层苞片下面生有大量黄色腺体腺毛。雌花主要用于酿造啤酒,是啤酒特有香味和苦味的主要来源，被认为是啤酒酿造的“绿色黄金”。2011年全球的啤酒销售收入是1500多亿美元。目前中国已经成为世界第一大啤酒生产和消费国，2011年中国的啤酒市场销收入大约1589.4亿人民币，无论国内国外，啤酒销售市场仍在不断的扩大。啤酒爽口不爽口，很大程度上取决于啤酒花风味品质(其它因素还包括大麦芽和酵母菌株等)。啤酒花作为重要的经济作物在我国中西部地区(新疆，甘肃，内蒙等地)有大面积种植，是当地农民的主要经济来源。我国酒花生产的主要问题是品种单一，风味品质较差，所以我国高档啤酒制造所需酒花仍需要进口，仅在2008年中国就进口总价值5千万美元的啤酒花。啤酒花风味品质主要是由一些酒花特有的次生代谢物(萜类，苦味酸，黄腐醇)的含量及比例决定的，这些化合物生物合成和积累主要是在啤酒花腺体腺毛中完成。酒花香味来源于其精油成分，主要包括单萜(月桂烯Myrcene)、倍半萜(石竹烯Caryophyllene和啤酒花烯Humulene)和苦味酸等。除此之外，啤酒花腺体腺毛还合成积累大量的异戊烯基化的查尔酮类化合物(Prenylchalcone)，包括黄腐醇(Xanthohumol，Xan)、脱甲基黄腐醇(Desmethylxanthohumol，DMX)，等，啤酒花中黄腐醇合成途径如图1所示。在自然条件下，脱甲基黄腐醇不稳定，会自发环化生成黄烷酮类化合物

6-Prenylnaringenin(6PN)和8-Prenylnaringenin(8PN)，但在啤酒花体内检测到的绝大多数是处于开环状态的脱甲基黄腐醇，而且有研究表明开环的脱甲基黄腐醇要比环化的黄烷酮类化合物具有更强的药理活性。最近的药理研究表明，(脱甲基)黄腐醇具有抗癌(尤其是前列腺癌)和抗氧化的功效(有效浓度低于10μM)，而且没有明显的毒副作用。黄腐醇和苦味酸的这一系列功效也是当下比较认同“适量饮用啤酒有益健康”的理论基础，从某种意义上啤酒中黄腐醇和苦味酸有些像红葡萄酒中白藜芦醇(Resveratrol)的功效。问题是啤酒中的苦味酸和黄腐醇含量很低(每500毫升啤酒含0.31毫克黄腐醇)，而为达到保健功效成人需每天至少摄入150毫克左右，所以如何在不增加生产成本(加大啤酒花的使用量理论上可行，但很不经济)的情况下增加啤酒中苦味酸和黄腐醇含量是一个比较棘手的实际生产问题。提高啤酒花中苦味酸和黄腐醇含量也是啤酒花育种行业不断追求的目标之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用。

本发明提供的黄腐醇相关蛋白，其名称为XNRP1，是如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的XNRP1蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A2)中的XNRP1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的XNRP1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的XNRP1蛋白质。

本发明还提供了与XNRP1相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码XNRP1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述生物材料中，所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码XNRP1的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码XNRP1的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码XNRP1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的XNRP1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码XNRP1蛋白质且具有XNRP1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码XNRP1蛋白质的核酸分子的表达盒(XNRP1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达XNRP1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动XNRP1基因转录的启动子，还可包括终止XNRP1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述XNRP1基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为CHS_H1-pESC-His载体或pESC-His载体。所述CHS_H1-pESC-His载体为将pESC-His载体的SpeI和Pac I识别序列间的DNA片段替换为CHS_H1基因(查尔酮合成酶基因，序列表中序列6)得到的重组载体。

所述重组载体可含有序列表中序列2。所述重组载体具体可为CHS_H1/XNRP1-pESC-His，所述CHS_H1/XNRP1-pESC-His为将CHS_H1-pESC-His的EcoRI和Not I识别序列间的DNA片段替换为XNRP1基因得到的重组载体，所述CHS_H1/XNRP1-pESC-His能表达CHS_H1和XNRP1。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为酵母细胞DD104。

所述重组微生物具体可为将所述重组载体导入所述微生物中得到的微生物。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了XNRP1或所述生物材料在提高黄腐醇合成途径中产物稳定性中的应用。

本发明还提供了XNRP1或所述生物材料在制备提高黄腐醇合成途径中产物稳定性产品中的应用。

本发明还提供了稳定黄腐醇合成途径中产物的产品，所述产品包括XNRP1或所述生物材料。

所述产品可以XNRP1或所述生物材料作为其活性成分，还可将XNRP1或所述生物材料与其他具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

本发明还提供了稳定黄腐醇合成途径中产物的方法，所述方法包括：利用XNRP1或所述生物材料实现稳定黄腐醇合成途径中产物。

本发明中，所述产物可为查尔酮和/或脱甲基黄腐醇。

实验证明，本发明的XNRP1具有稳定黄腐醇合成途径中产物的作用，在黄酮类化合物和脱甲基黄腐醇合成生物学应用以及人类健康保健等领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1为啤酒花中黄腐醇生物合成途径。其中，查尔酮为柚皮素查尔酮。

图2为XNRP2与XNRP1对NC/N和DMX的含量变化的影响。CCL1/CHS_H1/PT1L、CCL1/CHS_H1/PT1L/XNRP2和CCL1/CHS_H1/PT1L/XNRP1分别表示DD104-CK、DD104-XNRP2和DD104-XNRP1提取物。

A为LC-Q-TOF-MS分析DD104-CK，DD104-XNRP2和DD104-XNRP1三种重组酵母细胞培养48h所产生的各产物的种类和色谱图。

B和C为DD104-CK，DD104-XNRP2和DD104-XNRP1提取物中NC/N和DMX的含量变化比较图。**，P<0.01(t-test)。

图3为体外实验检测XNRP1与DMX和NC结合能力结果。

A.LC-Q-TOF-MS分析XNRP1-His和XNRP2-His纯化蛋白与黄腐醇途径中间产物DMX的结合能力。

B.DMX、6PN和8PN中DMX所占比例。

C.XNRP1与黄腐醇途径中产物DMX的结合能力检测结果。

D.XNRP1与黄腐醇途径中产物NC的结合能力检测结果。

图4为啤酒花XNRP1和XNRP2的体外酶活分析。

A.查尔酮异构酶以柚皮素查尔酮(NC)为底物催化的反应，NC通常为非豆科植物中查尔酮异构酶的底物。

B.查尔酮异构酶以异甘草素(Isoliquiritigenin,IL)为底物催化的反应，IL通常为豆科植物中查尔酮异构酶的底物。

C.LC-MS分析XNRP1和XNRP2在PH6.4情况下以NC和IL为底物催化的产物。

D.LC-MS分析XNRP1和XNRP2在PH7.5情况下以NC和IL为底物催化的产物。

图5为XNRP1和XNRP2基因在各组织中的表达情况。

图6为黄腐醇通路中各基因及XNRP1和XNRP2的亚细胞定位。绿色荧光为GFP荧光，红色荧光为叶绿体自发荧光。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的酵母细胞DD104(基因型MATαerg9-1erg20-2ura3his3leu2ade2)(Polyprenol formation in the yeast Saccharomyces cerevisiae:effect offarnesyl diphosphate synthase overexpression.Anna Szkopihska et al.，Journalof Lipid Research，38：962-668,1997)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pESC-Leu载体、pESC-His载体和pESC-Ura载体均为安捷伦科技有限公司(Catalog number 217455,Agilent Technologies Inc,USA)产品。

下述实施例中的葡萄糖缺陷型液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为6.7g/L无氨基酸的酵母氮源(YNB)，20g/L右旋葡萄糖，1.3g/L氨基酸缺失培养基。

下述实施例中的半乳糖缺陷型液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为6.7g/L无氨基酸的酵母氮源，20g/L半乳糖，1.3g/L氨基酸缺失培养基。

其中，酵母氨基酸缺失培养基为固体粉末，各组成成分及其配比为：2.5g 1-腺嘌呤半硫酸盐：1.2g L-精氨酸：6.0g L-天冬氨酸：6.0g L-谷氨酸：1.8g L-赖氨酸：1.2g L-甲硫氨酸：3.0g L-苯丙氨酸：22.5g L-丝氨酸：12g L-苏氨酸：2.4g L-色氨酸：1.8g L-酪氨酸：9.0g L-缬氨酸。

实施例1、XNRP1和XNRP2在黄腐醇合成途径中的应用

本实施例提供了两种来自于啤酒花(Freshops公司)的两种蛋白质，其名称分别为XNRP1和XNRP2，XNRP1的氨基酸序列为序列表中序列1，其在啤酒花中的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子(将该DNA分子记为XNRP1基因)；XNRP2的氨基酸序列为序列表中序列3，其在啤酒花中的编码基因为序列表中序列4所示的DNA分子(将该DNA分子记为XNRP2基因)。

一、本实施例在酵母细胞中重组了黄腐醇合成通路，以检测XNRP1和XNRP2在黄腐醇合成中的功能，具体方法如下：

1、酵母表达载体的构建

将pESC-Leu载体的Not I和Pac I识别序列间的DNA片段替换为CCL1基因(CoA连接酶基因，序列表中序列5)，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为CCL1-pESC-Leu，CCL1-pESC-Leu能表达序列8所示的CCL1；

将pESC-His载体的SpeI和Pac I识别序列间的DNA片段替换为CHS_H1基因(查尔酮合成酶基因，序列表中序列6)，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为CHS_H1-pESC-His，CHS_H1-pESC-His能表达序列9所示的CHS_H1；

将pESC-Ura载体的BamH I和Sal I识别序列间的DNA片段替换为PT1L基因(芳香类异戊烯基转移酶基因，序列表中序列7)，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为PT1L-pESC-Ura，PT1L-pESC-Ura能表达序列10所示的PT1L；

将CHS_H1-pESC-His的EcoRI和Not I识别序列间的DNA片段替换为XNRP1基因，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为CHS_H1/XNRP1-pESC-His，CHS_H1/XNRP1-pESC-His能表达CHS_H1和XNRP1；

将CCL1-pESC-Leu的BamH I和NheI识别序列间的DNA片段替换为XNRP2基因，保持其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为CCL1/XNRP2-pESC-Leu，CCL1/XNRP2-pESC-Leu能表达CCL和XNRP2。

2、重组酵母细胞的制备

将步骤1的CCL1-pESC-Leu、CHS_H1-pESC-His和PT1L-pESC-Ura导入酵母细胞DD104中，得到含有CCL1、CHS_H1和PT1L的核苷酸序列的重组酵母细胞，将该重组酵母细胞命名为DD104-CK，作为对照。

将步骤1的CCL1-pESC-Leu、CHS_H1/XNRP1-pESC-His和PT1L-pESC-Ura导入酵母细胞DD104中，得到含有XNRP1、CCL1、CHS_H1和PT1L的核苷酸序列的重组酵母细胞，将该重组酵母细胞命名为DD104-XNRP1。

将步骤1的CCL1/XNRP2-pESC-Leu、CHS_H1/XNRP1-pESC-His和PT1L-pESC-Ura导入酵母细胞DD104中，得到含有XNRP2、CCL1、CHS_H1和PT1L的核苷酸序列的重组酵母细胞，将该重组酵母细胞命名为DD104-XNRP2。

3、重组酵母细胞黄腐醇通路中物质分析

分别检测步骤1得到的重组酵母细胞DD104-CK、DD104-XNRP1和DD104-XNRP2中表达的黄腐醇通路中蛋白，具体步骤如下：

1)重组酵母细胞的诱导表达

a)将重组酵母细胞接种到5mL葡萄糖缺陷型液体培养基中，30℃,230rpm震荡培养过夜，OD600检测酵母浓度，使OD600大于1.0；

b)收集酵母细胞，用ddH₂O重悬菌体，5,000g离心5min，多次重复以洗去多余的葡萄糖缺陷型液体培养基；然后用10mL半乳糖缺陷型液体培养基重悬酵母菌体，使OD600为0.4,30℃,饲喂香豆酸(p-Coumaric acid)(香豆酸在培养基中的浓度为500μM)，230rpm震荡培养48小时，得到酵母培养液。

2)重组酵母细胞中化合物的提取

a)检测酵母菌的浓度并作记录。然后吸取5mL步骤1)得到的酵母培养液，进行超声破碎(超声30s，静止20s，重复6次)，得到破碎产物；

b)向步骤a)的破碎产物中加入5mL含有1.5μM PIVP的乙酸乙酯(PIVP作为黄腐醇通路中进行定量分析的内标)。涡旋5min，静止15min。

c)步骤b)结束后，3,000g离心10min，取上清4mL于干净的玻璃管中，常温下氮气吹干，得到沉淀。

d)步骤c)结束后，向沉淀中加入500μL甲醇复溶，经0.22μm微孔滤膜过滤(有机尼龙膜)后分别得到DD104-CK提取物、DD104-XNRP1提取物和DD104-XNRP2提取物进行LC-Q-TOF-MS分析。

3)LC-Q-TOF-MS分析

LC-Q-TOF-MS分析各重组酵母提取物，利用sigma公司的标准品N(柚皮素，Naringenin)、6PN和8PN，以及NC(柚皮素查尔酮，Naringenin chalcone，ChromaDex公司)和DMX(武汉Chemfaces公司)为标准品。

液相色谱条件：

a)进样量1μL。

b)梯度溶液：

溶液A,含有0.05％(体积百分比)甲酸、10％(体积百分比)乙腈和5mM甲酸铵的水溶液；

溶液B,含有0.05％(体积百分比)甲酸、90％(体积百分比)乙腈和5mM甲酸铵的水溶液。

c)梯度程序：总流速为0.4mL/min；

0～15min，溶液B的体积百分比由20％匀速升到90％，溶液A的体积百分比由80％匀速降至10％；

15～17min，溶液B的体积百分比为90％，溶液A的体积百分比为10％。

质谱条件：

毛细管电压:500V,225℃；鞘气温度:350℃；鞘气流量:11L/min；干燥气温度:225℃；干燥气流量:13L/min；雾化气压力:20psi。

结果如图2所示。结果显示，在体外饲喂香豆酸(p-Coumaric acid)的条件下其提取物中含有脱甲基黄腐醇(DMX)，6PN和8PN。由于DMX不稳定，会自动环化成6PN和8PN，因此需计算DMX与6PN、8PN的总和以得知DMX的量。DD104-CK提取物中DMX的含量为2.0±0.31μmol/L/OD；而DD104-XNRP2在相同条件下得到的提取物中DMX含量为4.59±0.98μmol/L/OD，为DD104-CK提取物的2.3倍；而DD104-XNRP1在相同条件下得到的提取物中DMX含量为1.38±0.32μmol/L/OD，为DD104-CK提取物的0.7倍。表明，XNRP2可以提高黄腐醇合成途径中DMX的产量，而XNRP1可以降低游离DMX含量。

另外，由于NC不稳定，会自动环化成N，因此，需测定N与NC的总含量以得知生成的NC的量。DD104-CK提取物中N/NC的含量(即N与NC的总含量)为34±3.06μmol/L/OD；而DD104-XNRP2在相同条件下得到的提取物中N/NC的含量为43.97±5.8μmol/L/OD，为DD104-CK提取物的1.4倍；而DD104-XNRP1在相同条件下得到的提取物中N/NC的含量与DD104-CK提取物没有显著差异，也就是说，DD104-XNRP2的NC的产量为DD104-CK的1.4倍，DD104-XNRP1的NC的产量与DD104-CK没有显著差异。表明，XNRP2可以提高黄腐醇合成途径中中间产物NC的产量。

二、XNRP1蛋白能够与DMX结合

为进一步检测DD104-XNRP1提取物中游离DMX产量的下降是否为XNRP1蛋白与DMX的结合引起的，具体进行了如下实验：

1、重组载体的构建

将pEasy-Blunt-E2载体(C端带有His tag，Trangen公司)与序列2所示的DNA分子(XNRP1基因)连接，得到重组载体，将该重组载体命名为XNRP1-pEasy，XNRP1-pEasy能表达XNRP1融合His tag的融合蛋白(记为XNRP1-His)。

将pEasy-Blunt-E2载体(C端带有His tag)与序列表中序列4所示的DNA分子(XNRP2基因)，得到重组载体，将该重组载体命名为XNRP2-pEasy，XNRP2-pEasy能表达XNRP2融合His tag的融合蛋白(记为XNRP2-His)。

2、蛋白的表达与纯化

将XNRP1-pEasy导入大肠杆菌BL21(+)菌株，得到重组载体BL21(+)-XNRP1；将XNRP2-pEasy导入大肠杆菌BL21(+)菌株，得到重组载体BL21(+)-XNRP2；将pEasy-Blunt-E2载体导入大肠杆菌BL21(+)菌株，得到重组载体BL21(+)-CK，作为对照。按照如下方法表达纯化蛋白质：

a)挑取单克隆菌落加入5mL含有相应抗生素的LB培养基中，37℃,230rpm过夜培养。

b)按照1:100在200mL的含有相应抗生素抗生素的LB培养基中扩摇，至OD600约0.4～0.6。

c)冰上冷却菌液，加入终浓度1mM IPTG，16℃,180rpm振荡培养12h。

d)5,000g,4℃离心15min，弃上清，收集菌体，加入12mL的Binding Buffer重悬菌体，超声波破碎(超声10s，间隔10s，超声30次；功率设定<200W)。

e)9,000g,4℃离心10min，取上清，加入800μL Ni-NTA Agarose，4℃冷室慢速旋转结合1h。

f)在4℃，将粗蛋白上清液和Ni-NTA Agarose的混合物加入空柱子(QIAGEN)中，然后用5倍柱体积的Washing Buffer冲洗柱子，使杂蛋白流出。

g)加入2mL Elution Buffer洗脱重组蛋白，用1.5mL的离心管收集重组蛋白。

h)蛋白电泳检测蛋白的浓度和纯度。

其中，Binding Buffer溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM Tris-HCl(pH7.9),500mM NaCl,10mM咪唑；

Washing Buffer溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM Tris-HCl(pH7.9),500mMNaCl,20mM咪唑；

Elution Buffer溶剂为水，溶质及其浓度分别为20mM Tris-HCl(pH7.9),500mMNaCl,250mM咪唑。

3、体外结合实验

分别检测步骤2得到的XNRP1-His和XNRP2-His与DMX的结合能力，利用BL21(+)菌株得到的蛋白质作为对照。

500μL反应体系中含有：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，methol 20％(体积百分比浓度)，8μL酵母中提取黄腐醇类化合物(步骤一中的DD104-CK提取物，包括200μMNC/N和5μMDMX)，30μg XNRP1-His或XNRP2-His(每种反应体系一种蛋白质)，余量为水。

将反应体系在4℃孵育8小时后，再用MagneHisTM蛋白纯化系统(Promega)将反应体系中的蛋白质重新纯化出来，利用乙酸乙酯将再纯化蛋白和剩余反应缓冲液中的化合物分别提取出来，进行LC-MS分析：

利用MagneHisTM蛋白纯化系统(Promega)将反应体系中的蛋白质重新纯化出来按照如下步骤进行：向反应体系中加入10μL磁珠和500μL系统中的抽提缓冲液，4℃孵育半小时，利用磁力架吸附磁珠，将缓冲液吸出后，重新加入1mL抽提缓冲液颠倒重新，重复三次后，吸出900μL缓冲液即为剩余反应溶液，磁珠上带有再纯化蛋白，利用900μL乙酸乙酯分别涡旋抽提剩余反应溶液和带有再纯化蛋白的磁珠，氮气吹干，用200μL甲醇复溶，进行LC-Q-TOF-MS分析，LC-Q-TOF-MS分析步骤同步骤一。

结果如图3中A和B所示，1表示对照反应体系得到的剩余反应溶液，2表示XNRP1反应体系得到的剩余反应溶液，3表示XNRP2反应体系得到的剩余反应溶液，4表示对照反应体系得到的带有再纯化蛋白的磁珠，5表示XNRP1反应体系得到的带有再纯化蛋白的磁珠，6表示XNRP2反应体系得到的带有再纯化蛋白的磁珠；N.D.表示无DMX。结果显示，XNRP1-His可以结合DMX，并维持DMX的高比例，表明，XNRP1-His可以提高黄腐醇合成途径中DMX的稳定性；而XNRP2-His不可以结合DMX。

三、XNRP1结合DMX、NC的亲和力的测定

用Applied Biosystems公司的Step one型号的荧光定量PCR仪测定XNRP1结合DMX、NC的亲和力。利用Thermo fisher公司的试剂盒(Protein Thermal Shift^TMDyeKit，货号4461146)进行测定。

1、XNRP1与DMX的亲和力测定

将DMX(武汉Chemfaces公司)利用DMSO溶解为DMX浓度为50mM的DMX母液，然后再利用缓冲液(50mM Tris-HCl，25mM NaCl，pH7.5)将DMX稀释，分别得到浓度为0.122μM，0.244μM，0.488μM，0.97μM，1.95μM，3.9μM，7.8μM，15.6μM，31.25μM，62.5μM，125μM，250μM的DMX工作液。

测定XNRP1与DMX的亲和力，20μL亲和力测定体系中含有：5μM步骤二得到的XNRP1-His，8μL Thermo fisher公司的试剂盒中的缓冲液，5μL染料8×ROX，2.5μLDMX工作液，得到亲和力测定体系，每种体系中一种浓度的DMX工作液。混匀后放入荧光定量PCR仪中进行测定。仪器反应程序为20至90℃，以1％的升温速率进行升温，反应结束后得到蛋白溶解曲线。利用Thermo fisher公司的软件分析出各DMX浓度下蛋白的溶解温度，再GraphPad Prism 5进行作图。

结果(图3中C)表明：XNRP1的确可以和DMX结合，平衡解离常数(K_d，也叫做亲和常数)为25.08μM。

2、XNRP1与NC的亲和力测定

将NC(ChromaDex公司)利用步骤1的MST反应缓冲液溶解为NC浓度为50mM的NC母液，然后再利用MST反应缓冲液将NC母液倍比稀释，分别得到NC浓度分别为0.244μM，0.488μM，0.97μM，1.95μM，3.9μM，7.8μM，15.6μM，31.25μM，62.5μM，125μM，250μM，500μM的NC工作液。

按照步骤1中的亲和力测定方法，将DMX工作液替换为NC工作液，其他均不变，测定XNRP1与NC的亲和力。

结果(图3中D)表明：XNRP1的确可以和NC结合，平衡解离常数(K_d，也叫做亲和常数)为43.56μM。

以上实验结果说明，XNRP2可以提高黄腐醇合成途径中DMX以及NC的产量；而XNRP1蛋白能够与DMX和NC结合，提高DMX与NC的稳定性。

实施例2、XNRP1和XNRP2的查尔酮异构酶的酶活

利用实施例1得到的XNRP1-His和XNRP2-His检测XNRP1和XNRP2是否具有查尔酮异构酶的酶活，500μL查尔酮异构酶酶活检测体系如下：

向50mM的Tris-HCl(pH为6.4或7.5，共设置两种pH值)中添加相应物质得到的反应体系，该反应体系中添加的各物质及其终浓度分别为：5％(v/v)乙醇，50μM底物(柚皮素查尔酮或异甘草素，每个反应体系一种底物，柚皮素查尔酮(ChromaDex公司，货号ASB-00014207-010 10mg)；异甘草素(sigma公司，货号I3766-10MG))，0.1mg/mL BSA及1μgXNRP1-His或XNRP2-His，每种反应体系一种蛋白，并利用不添加XNRP1-His和XNRP2-His的体系作为对照。

将上述酶活检测体系于25度孵育30分钟。之后用500μL含内标PIVP的乙酸乙酯抽提5分钟，取400μL上清，用氮吹仪吹干，再用800μL甲醇复溶，LC-MS上样检测，所使用标准品为：柚皮素查尔酮(ChromaDex公司，货号ASB-00014207-010 10mg)；异甘草素(sigma公司，货号I3766-10MG)；柚皮素(sigma公司，产品编号52186)；甘草素(Target Mol公司，T332510mg)。

结果显示，XNRP1和XNRP2均不具备查尔酮异构酶的催化活性，不能将柚皮素查尔酮(NC)环化生成查尔酮(N)，也不能将异甘草素(Isoliquiritigenin,IL)环化生成甘草素(Liquiritigenin,L)(图4)。

实施例3、XNRP1和XNRP2基因在各组织中的表达情况分析

选取啤酒花的根、茎、幼叶、老叶、苞片、球果和腺毛7个组织，用RNA提取试剂盒提取RNA，反转录成cDNA后，采用荧光定量PCR的方法，以GAPDH为内参基因，确定XNRP1基因和XNRP2基因在各组织中转录水平的相对表达量。

XNRP1基因所用引物为：5′-GGCAACTGCCCTCAACTC，3′-CCTTAATTCCCATGCCAAGT。

XNRP2基因所用引物为：5′-ACTTGGACTCCGATGTTGTGA，3′-CCGTATTGGGACCCTTTGA。

GAPDH基因所用引物为：5′-GCACTGGAGCTGCTAAGGCTG，3′-CCTGCTGTCACCAATGAAGTCG。

结果显示，XNRP1和XNRP2均在腺毛中特异高表达(图5)

实施例4、亚细胞定位分析

将pJIT163载体的BamH I和Not I识别序列间的DNA片段分别替换为XNRP1基因、XNRP2基因、OMT1基因、CHS_H1基因和CCL1基因，得到五种重组载体，这四种重组载体均能表达相应蛋白质与GFP的融合蛋白质，融合蛋白质的表达均由35S启动子驱动。

将各载体分别瞬时转化拟南芥原生质体细胞，培养12小时后在荧光显微镜下观察它们在细胞内的定位。

结果表明，与查尔酮异构酶(CHS_H1)、甲基转移酶(OMT1)、CoA连接酶(CCL1)相同，XNRP1和XNRP2也均定位于细胞质(图6)。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 黄腐醇相关蛋白及其在稳定黄腐醇合成途径中产物中的应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 啤酒花

<400> 1

Met Ala Thr Ala Leu Asn Ser Lys Asn Ala Ser Ser Asn Thr Ala Val

1 5 10 15

His Ile Glu Pro Lys Thr Gly Ile Ala Phe Pro Val Lys Leu Asp Asp

20 25 30

Gly Lys Ser Leu Asn Ser Val Gly Leu Arg Lys Lys Ser Leu Leu Gly

35 40 45

Met Gly Ile Lys Val Phe Gly Phe Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Glu Lys

50 55 60

Leu Lys Asn Leu Leu Lys Leu Lys Ile Gly Lys Ser Pro Ala Lys Pro

65 70 75 80

Thr Glu Glu Met Tyr Gln Leu Val Ile Asp Gly Asp Ile Gly Leu Thr

85 90 95

His Lys Ile Val Ile Ala Tyr Ser Gly Leu Lys Met Asn Met Phe Lys

100 105 110

Lys Ala Phe Ser Glu Ala Leu Gly Glu Ser Ile Met Lys Leu Asn Gly

115 120 125

Gly Arg Lys Asn Glu Glu Leu Ala Asn Lys Val Leu Gly Pro Ala Ser

130 135 140

Asp Gln Ile Lys Leu Ala Thr Gly Ser Glu Met Glu Ile Ser Lys Leu

145 150 155 160

Pro Gly Tyr Val Leu Glu Thr Lys Val His Gly Glu Leu Ala Ser Arg

165 170 175

Val Glu Ser Glu Leu Leu Cys Arg Ala Tyr Phe Gly Ile Tyr Leu Gly

180 185 190

Glu Ile Thr Met Glu Cys Tyr Lys Glu Ser Lys Glu Met Phe Gly Gln

195 200 205

Ser Met Leu Ser Leu Phe

210

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> 啤酒花

<400> 2

atggcaactg ccctcaactc aaagaatgca agctccaaca ccgcggttca cattgagccg 60

aagaccggca ttgcttttcc ggttaaattg gacgatggca aaagcttgaa cagtgttggc 120

ttgaggaaga aatccctact tggcatggga attaaggttt ttggttttgg gttgtatgca 180

gataatgaga agttgaaaaa tcttttgaag ttaaaaatag ggaaatcccc agcaaaacca 240

acagaggaga tgtatcagct ggtaatcgat ggtgatatag ggttgacaca caaaatagta 300

attgcctatt ctggcctgaa aatgaatatg ttcaaaaagg cctttagtga agcactggga 360

gaatctataa tgaaactcaa tggtggccga aagaacgagg agcttgcaaa caaagtttta 420

ggtcctgcat ctgatcaaat caagttagca actggttctg aaatggagat atctaaacta 480

ccaggatatg ttcttgaaac aaaagtgcat ggagaacttg cgagcagggt tgagagtgaa 540

cttctttgca gagcctattt cggaatatat ctaggagaga ttacgatgga gtgttacaag 600

gaatcgaaag agatgttcgg acagtccatg ctttctctct tctaa 645

<210> 3

<211> 209

<212> PRT

<213> 啤酒花

<400> 3

Met Glu Asn Asn Met Val Met Val His Glu Ile Pro Phe Pro Pro Glu

1 5 10 15

Ile Lys Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Leu Gly Tyr Gly Ile Thr Asp

20 25 30

Met Glu Ile His Phe Leu Gln Val Lys Phe Thr Ala Ile Gly Val Tyr

35 40 45

Leu Asp Ser Asp Val Val Lys His Leu Gln Gln Trp Lys Gly Lys Lys

50 55 60

Gly Asn Glu Leu Ala Glu Asp Asp Asp Phe Phe Asp Ala Leu Ile Ser

65 70 75 80

Ala Pro Val Glu Lys Tyr Leu Arg Ile Val Val Ile Lys Glu Ile Lys

85 90 95

Gly Ser Gln Tyr Gly Val Gln Leu Glu Ser Ser Val Arg Asp Arg Leu

100 105 110

Ala Ala Glu Asp Met Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Leu Glu Lys

115 120 125

Ile Val Glu Phe Leu Gln Ser Lys Tyr Phe Lys Lys Asp Thr Leu Ile

130 135 140

Thr Phe His Phe Pro Ala Thr Ser Pro Thr Ala Glu Ile Val Val Thr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Lys Glu Glu Ser Lys Leu Lys Val Glu Asn Lys Asn Val

165 170 175

Val Asp Met Ile Lys Lys Trp Tyr Leu Gly Gly Thr Ser Gly Val Ser

180 185 190

Pro Ser Thr Ile Ser Ser Leu Ala Asp Asn Leu Ser Ala Glu Leu Ser

195 200 205

Lys

<210> 4

<211> 630

<212> DNA

<213> 啤酒花

<400> 4

atggaaaaca acatggtgat ggtgcatgaa atcccttttc ctcctgagat caagaccacc 60

aagccattat ctctattggg ttatggtatc acagacatgg agatacactt tcttcaagtc 120

aagttcacag caattggagt gtacttggac tccgatgttg tgaaacatct acaacaatgg 180

aaagggaaaa aggggaacga actagctgaa gacgatgact tctttgatgc ccttatctca 240

gcccctgtgg agaagtattt aaggattgtg gtgatcaagg agatcaaagg gtcccaatac 300

ggagttcagc tagagagttc agtaagggat cgtttggctg cagaggacat gtatgaagaa 360

gaagaagaag ctgctttgga gaaaatcgtt gagtttctcc agtccaaata ttttaagaaa 420

gacactctta ttactttcca tttcccagct acttctccca ctgctgagat tgtggtgacg 480

ctcgaaggga aagaagagtc gaagctaaaa gtggagaata aaaatgtggt tgacatgatc 540

aaaaaatggt atctgggagg gaccagtggg gtgtctccat caaccatttc ttccttggct 600

gataacctct ctgctgagtt atctaaataa 630

<210> 5

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

atggagaaca acaagcaaga tgatcaccaa gaagaattca ttttccgatc aaagcttccg 60

gacatttaca tcccgaacca cctccctcta cactcctact gcttcgaaaa catttctcaa 120

ttcaaggacc gcccctgcct catcaacggc gccaccggag agattatcac ttacgccgat 180

gtcgatctca cgtcccgcaa agtcgccgcc ggccttgaca agctcggaat caagcaaggt 240

gacgtcatca tgctcttact ccagaacagt ccggagttcg tctacgcttt cctcgccgcg 300

tcgtacatag gcgccatcat caccaccgcc aacccgttct acaccccggc ggaggttgcc 360

aagcaagcgg cggcgtcgaa gaccaagctg gtcataactc tcgcgggata catcgacaag 420

gtgaaagagt tcaccggtgg cgaaagcggg gtgaaagtga tgtgcgtcga cgcgccacca 480

ccggagagtg agtgtctgca tttctcggag ctgacgcaag cggacgagac tgagattccg 540

gccgttaaga ttcacccaga cgacgtcgtt gcgttgcctt attcgtctgg aacgacaggg 600

cttccaaagg gtgtgatgtt gactcacaaa gggttggtca ccagtgtggc tcagcaagta 660

gatggagaca atcctaactt gtacttccac caaaacgacg tcattctctg cgttttgcct 720

ctcttccata tttattccct gaattccatt ttgctatgcg gacttcgggt cggagccgct 780

attttgatca tgcaaaagtt tgagatcagc aagttgcttg agttgatcga gaagtttaag 840

gtgaccatcg caccgttcgt tcctccgatc gtcttatcgg ttgccaagtg tcccgacctt 900

caccggtacg acttgtcgtc gattcggacc gtcatgtctg gcggagctcc gatgggtaag 960

gagcttgaag atgccgtcaa ggagaaactt cctcatgcca aacttggaca gggctatggt 1020

atgacagagg cgggaccggt actgtctatg tgcttggcct ttgcaaagga accgttcccg 1080

attaagtcag gcgcgtgtgg tacagtcgtt agaaacgctg agatgaagat tgttgatcct 1140

gacactggcg cgtcccttcc acgtaaccaa tccggggaga tttgcatcag gggtaaacaa 1200

atcatgaaag gttacattaa cgatgccgaa gccactaagg ggacaataga cgaaggagga 1260

tggctccaca caggtgacat agggttcatt gacaacgacg atgagctctt catcgtggat 1320

cgattgaagg agctcatcaa atacaaaggc ttccaagttg ccccggctga gctcgagtcc 1380

atgctcattt ctcaccccaa cattactgat gctgctgttg taccaatgaa agatgaagct 1440

gcaggagaag tccctgttgc gtttgttgtg agatcaaatg gttcaaagat cactgaggaa 1500

gatatcaagc aatatatctc taaacaggtg gtgttttaca agagaattaa caaggcattc 1560

ttcatagaag aaatccccaa aaacccttct ggcaaaatct tgaggaaaat cttgagagca 1620

aaacttgtta ctgaacaagc catttag 1647

<210> 6

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

atggttaccg tcgaggaagt tcgcaaggct caaagggctg agggccccgc taccatcttg 60

gccatcggca cggccactcc ggccaactgt atcctccaga gtgagtaccc ggattactac 120

ttccgcatca ccaacagcga gcacaaaact gagctcaagg aaaagttcaa gcgcatgtgt 180

gataaatcca tgattagaaa gcgttacatg cacttaactg aggagatcct taaggagaat 240

ccaaatcttt gtgcctacga ggcaccatcg ttggatgcca gacaagacat ggtggtggtc 300

gaggtgccta agttgggcaa agaggctgct accaaggcca tcaaggaatg gggtcagccc 360

aagtcgaaga tcacccacgt ggtcttttgc accaccagtg gtgtcgacat gcctggagct 420

gactaccagc tcaccaagct attggggctt cgaccctcgg tcaagcgttt gatgatgtac 480

caacaaggat gtttcgccgg tggcacggtc ctcagagtcg ccaaggactt ggccgagaac 540

aacaagggtg ctcgtgtttt ggtcgtctgt tctgagatca ctgccgtcac tttccgtggt 600

cctaacgaca cccacctcga cagtctcgtg ggccaggccc ttttcggtga tggttcggct 660

gctctcatca ttggtgctga cccaactcca gagatcgaaa agcccatttt tgagttggtc 720

tcggcggccc aaacaatcct tcctgatagt gatggtgcca tcgatgggca tctacgtgaa 780

gttgggctca catttcatct cctcaaggat gttcctgggc ttatttcgaa gaacattgag 840

aagagcttag tcgaggcctt taagcctttg ggcatctctg attggaactc acttttctgg 900

atcgcacacc ctggtggccc agctattttg gaccaagtag agtccaaatt ggccctcaag 960

cccgagaaac tacgagccac tagacacgtg ctcggtgagt atggtaacat gtcgagtgct 1020

tgtgtgttgt tcattttgga tgagatgaga aggaagtgtg ctgaggatgg gctcaagacc 1080

actggagaag gactcgaatg gggtgtgttg tttgggtttg ggcctgggct tactgttgag 1140

accgttgtgc ttcacagtgt gggtatttag 1170

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

atggaattgt cttctgtttc ttctttttct ttgggaacta atccttttat ttctattcct 60

cataataata ataataattt gaaggtttct tcttattgtt gtaagtctaa gtctagagtt 120

attaattcta ctaattctaa gcattgttct cctaataata ataataataa taatacttct 180

aataagacta ctcatttgtt gggattgtat ggacaatcta gatgtttgtt gaagcctttg 240

tctatttttt cttgtaagga tcaaagagga aattctatta gagcttctgc tcaaattgaa 300

gatagacctc ctgaatctgg aaatttgtct gctttgacta atgttaagga ttttgtttct 360

gtttgttggg aatatgttag accttatact gctaagggag ttattatttg ttcttcttgt 420

ttgtttggaa gagaattgtt ggaaaatcct aatttgtttt cttggccttt gatttttaga 480

gctttgttgg gaatgttggc tattttggga tcttgttttt atactgctgg aattaatcaa 540

atttttgata tggatattga tagaattaat aagcctgatt tgcctttggt ttctggaaga 600

atttctgttg aatctgcttg gttgttgact ttgtctcctg ctattattgg atttattttg 660

attttgaagt tgaattctgg acctttgttg acttctttgt attgtttggc tattttgtct 720

ggaactattt attctgttcc tccttttaga tggaagaaga atcctattac tgcttttttg 780

tgtattttga tgattcatgc tggattgaat ttttctgttt attatgcttc tagagctgct 840

ttgggattgg cttttgtttg gtctccttct ttttctttta ttactgcttt tattactttt 900

atgactttga ctttggcttc ttctaaggat ttgtctgata ttaatggaga tagaaagttt 960

ggagttgaaa cttttgctac taagttggga gctaagaata ttactttgtt gggaactgga 1020

ttgttgttgt tgaattatgt tgctgctatt tctactgcta ttatttggcc taaggctttt 1080

aagtctaata ttatgttgtt gtctcatgct attttggctt tttctttgtt ttttcaagct 1140

agagaattgg atagaactaa ttatactcct gaagcttgta agtcttttta tgaatttatt 1200

tggattttgt tttctgctga atatgttgtt tatttgttta tttaa 1245

<210> 8

<211> 548

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

Met Glu Asn Asn Lys Gln Asp Asp His Gln Glu Glu Phe Ile Phe Arg

1 5 10 15

Ser Lys Leu Pro Asp Ile Tyr Ile Pro Asn His Leu Pro Leu His Ser

20 25 30

Tyr Cys Phe Glu Asn Ile Ser Gln Phe Lys Asp Arg Pro Cys Leu Ile

35 40 45

Asn Gly Ala Thr Gly Glu Ile Ile Thr Tyr Ala Asp Val Asp Leu Thr

50 55 60

Ser Arg Lys Val Ala Ala Gly Leu Asp Lys Leu Gly Ile Lys Gln Gly

65 70 75 80

Asp Val Ile Met Leu Leu Leu Gln Asn Ser Pro Glu Phe Val Tyr Ala

85 90 95

Phe Leu Ala Ala Ser Tyr Ile Gly Ala Ile Ile Thr Thr Ala Asn Pro

100 105 110

Phe Tyr Thr Pro Ala Glu Val Ala Lys Gln Ala Ala Ala Ser Lys Thr

115 120 125

Lys Leu Val Ile Thr Leu Ala Gly Tyr Ile Asp Lys Val Lys Glu Phe

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Ser Gly Val Lys Val Met Cys Val Asp Ala Pro Pro

145 150 155 160

Pro Glu Ser Glu Cys Leu His Phe Ser Glu Leu Thr Gln Ala Asp Glu

165 170 175

Thr Glu Ile Pro Ala Val Lys Ile His Pro Asp Asp Val Val Ala Leu

180 185 190

Pro Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Leu Thr

195 200 205

His Lys Gly Leu Val Thr Ser Val Ala Gln Gln Val Asp Gly Asp Asn

210 215 220

Pro Asn Leu Tyr Phe His Gln Asn Asp Val Ile Leu Cys Val Leu Pro

225 230 235 240

Leu Phe His Ile Tyr Ser Leu Asn Ser Ile Leu Leu Cys Gly Leu Arg

245 250 255

Val Gly Ala Ala Ile Leu Ile Met Gln Lys Phe Glu Ile Ser Lys Leu

260 265 270

Leu Glu Leu Ile Glu Lys Phe Lys Val Thr Ile Ala Pro Phe Val Pro

275 280 285

Pro Ile Val Leu Ser Val Ala Lys Cys Pro Asp Leu His Arg Tyr Asp

290 295 300

Leu Ser Ser Ile Arg Thr Val Met Ser Gly Gly Ala Pro Met Gly Lys

305 310 315 320

Glu Leu Glu Asp Ala Val Lys Glu Lys Leu Pro His Ala Lys Leu Gly

325 330 335

Gln Gly Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Pro Val Leu Ser Met Cys Leu

340 345 350

Ala Phe Ala Lys Glu Pro Phe Pro Ile Lys Ser Gly Ala Cys Gly Thr

355 360 365

Val Val Arg Asn Ala Glu Met Lys Ile Val Asp Pro Asp Thr Gly Ala

370 375 380

Ser Leu Pro Arg Asn Gln Ser Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Lys Gln

385 390 395 400

Ile Met Lys Gly Tyr Ile Asn Asp Ala Glu Ala Thr Lys Gly Thr Ile

405 410 415

Asp Glu Gly Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Phe Ile Asp Asn

420 425 430

Asp Asp Glu Leu Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr

435 440 445

Lys Gly Phe Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Met Leu Ile Ser

450 455 460

His Pro Asn Ile Thr Asp Ala Ala Val Val Pro Met Lys Asp Glu Ala

465 470 475 480

Ala Gly Glu Val Pro Val Ala Phe Val Val Arg Ser Asn Gly Ser Lys

485 490 495

Ile Thr Glu Glu Asp Ile Lys Gln Tyr Ile Ser Lys Gln Val Val Phe

500 505 510

Tyr Lys Arg Ile Asn Lys Ala Phe Phe Ile Glu Glu Ile Pro Lys Asn

515 520 525

Pro Ser Gly Lys Ile Leu Arg Lys Ile Leu Arg Ala Lys Leu Val Thr

530 535 540

Glu Gln Ala Ile

545

<210> 9

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

Met Val Thr Val Glu Glu Val Arg Lys Ala Gln Arg Ala Glu Gly Pro

1 5 10 15

Ala Thr Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Ala Asn Cys Ile Leu

20 25 30

Gln Ser Glu Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Ile Thr Asn Ser Glu His

35 40 45

Lys Thr Glu Leu Lys Glu Lys Phe Lys Arg Met Cys Asp Lys Ser Met

50 55 60

Ile Arg Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu Asn

65 70 75 80

Pro Asn Leu Cys Ala Tyr Glu Ala Pro Ser Leu Asp Ala Arg Gln Asp

85 90 95

Met Val Val Val Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Thr Lys

100 105 110

Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Val Val

115 120 125

Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu

130 135 140

Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Leu Met Met Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Val Ala Lys Asp

165 170 175

Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu

180 185 190

Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Asn Asp Thr His Leu Asp Ser

195 200 205

Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ser Ala Ala Leu Ile Ile

210 215 220

Gly Ala Asp Pro Thr Pro Glu Ile Glu Lys Pro Ile Phe Glu Leu Val

225 230 235 240

Ser Ala Ala Gln Thr Ile Leu Pro Asp Ser Asp Gly Ala Ile Asp Gly

245 250 255

His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys Asp Val Pro

260 265 270

Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu Lys Ser Leu Val Glu Ala Phe Lys

275 280 285

Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Ile Ala His Pro

290 295 300

Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Ser Lys Leu Ala Leu Lys

305 310 315 320

Pro Glu Lys Leu Arg Ala Thr Arg His Val Leu Gly Glu Tyr Gly Asn

325 330 335

Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Arg Lys

340 345 350

Cys Ala Glu Asp Gly Leu Lys Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp Gly

355 360 365

Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Val Val Leu

370 375 380

His Ser Val Gly Ile

385

<210> 10

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

Met Glu Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Ser Leu Gly Thr Asn Pro Phe

1 5 10 15

Ile Ser Ile Pro His Asn Asn Asn Asn Asn Leu Lys Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Cys Cys Lys Ser Lys Ser Arg Val Ile Asn Ser Thr Asn Ser Lys His

35 40 45

Cys Ser Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Thr Ser Asn Lys Thr Thr

50 55 60

His Leu Leu Gly Leu Tyr Gly Gln Ser Arg Cys Leu Leu Lys Pro Leu

65 70 75 80

Ser Ile Phe Ser Cys Lys Asp Gln Arg Gly Asn Ser Ile Arg Ala Ser

85 90 95

Ala Gln Ile Glu Asp Arg Pro Pro Glu Ser Gly Asn Leu Ser Ala Leu

100 105 110

Thr Asn Val Lys Asp Phe Val Ser Val Cys Trp Glu Tyr Val Arg Pro

115 120 125

Tyr Thr Ala Lys Gly Val Ile Ile Cys Ser Ser Cys Leu Phe Gly Arg

130 135 140

Glu Leu Leu Glu Asn Pro Asn Leu Phe Ser Trp Pro Leu Ile Phe Arg

145 150 155 160

Ala Leu Leu Gly Met Leu Ala Ile Leu Gly Ser Cys Phe Tyr Thr Ala

165 170 175

Gly Ile Asn Gln Ile Phe Asp Met Asp Ile Asp Arg Ile Asn Lys Pro

180 185 190

Asp Leu Pro Leu Val Ser Gly Arg Ile Ser Val Glu Ser Ala Trp Leu

195 200 205

Leu Thr Leu Ser Pro Ala Ile Ile Gly Phe Ile Leu Ile Leu Lys Leu

210 215 220

Asn Ser Gly Pro Leu Leu Thr Ser Leu Tyr Cys Leu Ala Ile Leu Ser

225 230 235 240

Gly Thr Ile Tyr Ser Val Pro Pro Phe Arg Trp Lys Lys Asn Pro Ile

245 250 255

Thr Ala Phe Leu Cys Ile Leu Met Ile His Ala Gly Leu Asn Phe Ser

260 265 270

Val Tyr Tyr Ala Ser Arg Ala Ala Leu Gly Leu Ala Phe Val Trp Ser

275 280 285

Pro Ser Phe Ser Phe Ile Thr Ala Phe Ile Thr Phe Met Thr Leu Thr

290 295 300

Leu Ala Ser Ser Lys Asp Leu Ser Asp Ile Asn Gly Asp Arg Lys Phe

305 310 315 320

Gly Val Glu Thr Phe Ala Thr Lys Leu Gly Ala Lys Asn Ile Thr Leu

325 330 335

Leu Gly Thr Gly Leu Leu Leu Leu Asn Tyr Val Ala Ala Ile Ser Thr

340 345 350

Ala Ile Ile Trp Pro Lys Ala Phe Lys Ser Asn Ile Met Leu Leu Ser

355 360 365

His Ala Ile Leu Ala Phe Ser Leu Phe Phe Gln Ala Arg Glu Leu Asp

370 375 380

Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Glu Ala Cys Lys Ser Phe Tyr Glu Phe Ile

385 390 395 400

Trp Ile Leu Phe Ser Ala Glu Tyr Val Val Tyr Leu Phe Ile

405 410

Claims

1.蛋白质，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在提高黄腐醇合成途径中产物稳定性中的应用。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在制备提高黄腐醇合成途径中产物稳定性产品中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述产物为查尔酮和/或脱甲基黄腐醇。

7.稳定黄腐醇合成途径中产物的产品，包括权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述产物为查尔酮和/或脱甲基黄腐醇。

9.稳定黄腐醇合成途径中产物的方法，包括：利用权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料实现稳定黄腐醇合成途径中产物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述产物为查尔酮和/或脱甲基黄腐醇。