CN112779242B - 梅片树单萜合酶CbTPS1及其相关生物材料与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种梅片树单萜合酶CbTPS1及其相关生物材料与应用。本发明首先公开了如下任一所示蛋白质：A1)由序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2)序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；A3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。本发明进一步公开了上述蛋白质相关生物材料及其应用。本发明首次从梅片树中得到单萜类成分合成关键酶基因，并证明其蛋白CbTPS1能够催化GPP形成右旋龙脑，对于调节和生产植物单萜类化合物及培育高品质的梅片树具有重要的理论及实际意义。

Description

梅片树单萜合酶CbTPS1及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及药用植物基因工程领域，具体涉及一种梅片树单萜合酶CbTPS1及其相关生物材料与应用。

背景技术

梅片树(physiolgical type of Cinnamomum burmannii)是樟科樟属常绿乔木，富含右旋龙脑((+)-borneol)，是珍稀药材，也是一种高级香料、日化美妆用品原料、化工用品，被广泛应用于医疗、美容、香料等多个行业。中国科学院华南植物园在广东境内发现的一种具有生产利用价值的天然右旋龙脑新资源，填补了我国生产天然右旋龙脑的空白。

天然冰片(右旋龙脑,(+)-borneol)是一味重要的中药，具有开窍醒神、退热止痛的作用，临床上用于治疗烧烫伤，眼疾，中风等疾病，同时具有抑菌，抗氧化，止痛消炎，退热，保护心脑血管等作用，也广泛用于烟草、日化、食品、农药等领域。由于天然龙脑价格高，许多药厂利用合成冰片替代天然龙脑，但合成冰片是由松节油通过化学方法制备，制品中含有异龙脑，随着人们安全意识的提升，市场对天然冰片(右旋龙脑)的需求不断增加。梅片树植物生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。

天然冰片(右旋龙脑,(+)-borneol)是双环单萜化合物，属于萜类成分。同时萜类成分为梅片树的主要活性成分，包括右旋龙脑((+)-borneol)、樟脑(camphor)和芳樟醇(linalool)等。通过胞浆的甲羟戊酸途径(mevalonic acid(MVA)pathway)和质体的2-methyl-D-erythritol-4-phosphate(MEP)途径生成萜类的通用底物异戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其异构体Dimethylallyl pyrophosphate(DMAPP)。再由此生成单萜(monoterpenes)、倍半萜(sesquiterpenes)、二萜(diterpenes)、三萜(triterpenes)的底物香叶基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyldiphosphate，GGPP)。单萜合酶(monoterpene synthase)，又称单萜环化酶(monoterpenecyclase)能够催化GPP形成各种单萜骨架，被认为是合成萜类次生代谢终产物的关键酶。

目前，尚未发现从梅片树可以得到具有单萜类化合物合成能力的关键酶基因的相关研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为得到新的参与单萜化合物合成的梅片树单萜合酶，以合成或制备右旋龙脑。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为CbTPS1，来源于梅片树(physiolgical type of Cinnamomum burmannii)，命名为梅片树单萜合酶CbTPS1，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由603个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

在本发明的实施例中，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

与CbTPS1的相关生物材料也在本发明的保护范围之内。

本发明提供的与CbTPS1的相关生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码CbTPS1的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下B1)-B5)任一所示：

B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

B3)序列表中序列4所示的DNA分子；

B4)编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

B5)在严格条件下与B1)或B2)或B3)或B4)限定的DNA分子杂交，且编码CcBDH3的DNA分子。

其中，序列表中的序列1由1812个核苷酸组成，编码序列2所示的蛋白质。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

其中，所述核酸分子可以为DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA，所述核酸分子也可以为RNA，如mRNA或hnRNA。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码CbTPS1的核酸分子的表达盒(Cbtps1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CbTPS1的DNA，该DNA不但可包括启动Cbtps1转录的启动子，还可包括终止Cbtps1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明进一步提供了上述蛋白质或其相关生物材料的应用。

所述应用具体如下所示：

1)上述蛋白质作为单萜合酶的应用；

2)上述相关生物材料在制备单萜合酶中的应用；

3)上述蛋白质或相关生物材料在制备或合成单萜化合物中的应用；

4)上述蛋白质或相关生物材料在催化香叶基焦磷酸形成右旋龙脑中的应用。

上述应用中，所述单萜化合物为右旋龙脑。

本发明还提供了制备CbTPS1的方法。

本发明制备CbTPS1的方法，包括将CbTPS1的编码基因导入到受体微生物中，得到表达CbTPS1的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到CbTPS1。

上述方法中，所述受体微生物为原核微生物。具体的，所述原核微生物为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)。

上述方法中，所述CbTPS1的编码基因可通过重组质粒pET32a::CbTPS1导入到大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)中；所述重组质粒pET32a::CbTPS1是用序列1所示的Cbtps1基因构建至pET32a(+)载体的BamHI酶切位点处，且保持pET32a(+)载体其他序列不变得到的重组表达载体。

本发明进一步提供了一种制备右旋龙脑的方法，所述方法包括用CbTPS1催化香叶基焦磷酸(GPP)的步骤。

上述方法中，在催化过程中还需要加入酶促缓冲液，所述酶促缓冲液由HEPES、MgCl₂、DTT组成；

所述HEPES在所述酶促缓冲液中的浓度为25mM；

所述MgCl₂在所述酶促缓冲液中的浓度为5mM；

所述DTT在所述酶促缓冲液中的浓度为5mM；

所述酶促缓冲液中的pH值为7.0。

上述方法中，所述方法还包括在用CbTPS1催化香叶基焦磷酸(GPP)后，将得到的酶促反应产物进一步进行脱磷酸化反应，得到右旋龙脑。

本发明进一步还提供了一种右旋龙脑的生物合成方法。

本发明右旋龙脑的生物合成方法包括将CbTPS1的编码基因导入酿酒酵母得到重组酿酒酵母，发酵重组酿酒酵母，得到右旋龙脑。

上述方法中，所述酿酒酵母具体为BY-Mono酵母菌。

上述方法中，CbTPS1的编码基因可通过重组质粒pESC-Leu::CbTPS1导入到BY-Mono酵母菌中；所述重组质粒pESC-Leu::CbTPS1是用序列1所示的Cbtps1基因构建至pESC-Leu载体的BamHI酶切位点处，且保持pESC-Leu载体其他序列不变得到的重组表达载体。

本发明从梅片树cDNA中克隆得到Cbtps1基因，该基因是首次从梅片树中得到的单萜类成分合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明的CbTPS1蛋白能够催化GPP形成右旋龙脑((+)-borneol)，对梅片树中的右旋龙脑等单萜类化合物的生物合成具有重要作用，为利用基因工程技术提高梅片树中活性成分右旋龙脑含量或直接生产右旋龙脑提供重要基础，进一步对于调节和生产植物单萜类化合物及培育高品质的梅片树树具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为梅片树Cbtps1基因克隆琼脂糖凝胶电泳图；M表示Trans2K DNA Marker(核酸分子量标准，条带由上往下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)，Cbtps1表示Cbtps1基因。

图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在大肠杆菌中表达的CbTPS1蛋白。其中，A中M1为Premixed Protein Marker(Low)(蛋白分子量标准，条带由上往下分别为97.2、66.4、44.3、29.0、20.1KDa)，1为对照菌上清的电泳结果，2为重组质粒pET32a::CbTPS1重组菌上清的电泳结果；B中M2为PageRuler^TMPrestained Protein Ladder(蛋白分子量标准，条带由上往下分别为180、130、100、70、55、40、35KDa)，3为重组质粒pET32a::CbTPS1纯化蛋白的电泳结果，CbTPS1箭头表示重组质粒pET32a::CbTPS1表达的目的蛋白(即重组蛋白CbTPS1)。

图3为CbTPS1酶促反应产物GC-MS分析。其中，A中a为标准品(-)-borneol和标准品(+)-borneol的提取离子流图，b为对照菌上清的目标化合物的提取离子流图，c为pET32a::CbTPS1重组菌上清的目标化合物的提取离子流图，d为pET32a::CbTPS1纯化蛋白的目标化合物的提取离子流图；B为标准品(+)-borneol的质谱图；C为pET32a::CbTPS1重组菌上清的目标化合物的质谱图；D为pET32a::CbTPS1纯化蛋白的目标化合物的质谱图。

图4为CbTPS1导入酵母菌株(BY-Mono)发酵生产(+)-borneol的GC-MS分析；图中，a为标准品(+)-borneol的提取离子流图，b为重组酵母BY-Mono/pESC-Leu发酵产物萃取后得到的目标化合物的提取离子流图，c为重组酵母BY-Mono/pESC-Leu::CbTPS1发酵产物萃取后得到的目标化合物的提取离子流图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的

High-Fidelity DNA Polymerase、BamHI限制性内切酶是New England Biolabs公司的产品；/>

快速通用植物RNA提取试剂盒是北京华越洋生物科技有限公司的产品；

TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、Trans2KDNA Marker、pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)是北京全式金生物技术有限公司的产品；

Premixed Protein Marker(Low)是Takara公司的产品；

PageRuler^TMPrestained Protein Ladder是Thermo Fisher Scientific公司的产品；

pET32a(+)载体是Novagen公司的产品；

Ni-NTAAgarose是Qiagen公司的产品(产品目录号：30210)；

蛋白纯化及SDA-PAGENa₂HPO₄、NaCl、DTT、PMSF、Imidazole、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(30％溶液)是生工生物工程(上海)股份有限公司的产品；

蛋白超滤管(Amicon-Ultra-15)是Millipore公司的产品(产品目录号：UFC903024)；

pESC-Leu载体是Agilent公司的产品；

SD-Ura、SD-Ura-Leu是北京泛基诺科技有限公司的产品；

ZYMO RESEARCH Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒Zymo Research公司的产品；

BY4741酵母菌株(基因型：MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)是北京华越洋生物科技有限公司的产品；

香叶基焦磷酸(GPP)是Sigma公司的产品，产品目录号为G6772，CAS号为763-10-0；

右旋龙脑((+)-borneol)是Sigma公司的产品，产品目录号为CRM40901，CAS号为464-43-7。

实施例1、梅片树Cbtps1基因全长cDNA序列克隆

1、总RNA的提取

根据北京华越洋生物科技有限公司快速通用植物RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取梅片树树叶片的总RNA。

2、第一链cDNA的合成

根据北京全式金生物技术有限公司第一链cDNA合成试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书进行操作，最终反转录获得cDNA。

其中，反转录反应体系如表1所示。

表1

反转录的步骤如下：

(1)为获得更高的合成效率，取Total RNA、Anchored Oligo(dT)₁₈Primer、RNase-free Water于PCR管中，混匀，65℃，5min；

(2)在上述PCR管中加入10.0μL 2×TS Reaction Mix、1.0μL

RT/RIEnzyme Mix、1.0μL gDNA Remover，轻轻混匀；

(3)以“42℃30min，85℃5s”条件进行反转录反应，获得第一链cDNA；

(4)第一链cDNA于-20℃保存。

3、引物的设计

根据梅片树叶片转录组数据，获得开放阅读框(ORF)序列，并基于此设计克隆引物CbTPS1-F1和CbTPS1-R1，引物序列如下：

CbTPS1-F1：5’-ATGGCGTTGCAAATGACTGTTCCA-3’；

CbTPS1-R1：5’-TCAGGCATATCCACCATCGACACA-3’。

4、PCR扩增

以步骤2获得的第一链cDNA为模板，采用高保真酶

High-Fidelity DNAPolymerase、CbTPS1-F1和CbTPS1-R1引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，结果如图1所示，并对PCR扩增产物进行测序。

其中，PCR扩增的程序如下：

98℃预变性3min；98℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸5min。

测序结果表明：PCR扩增产物的序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为Cbtps1，编码由603个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为CbTPS1，该蛋白的氨基酸序列为序列2。

实施例2、梅片树CbTPS1蛋白的获得及其功能分析

一、梅片树CbTPS1蛋白的获得

1、重组载体的构建

采用北京全式金生物技术有限公司pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit，将序列1所示的Cbtps1基因构建至pET32a(+)载体(Novagen公司)的BamHI酶切位点处，且保持pET32a(+)载体其他序列不变，得到重组质粒pET32a::CbTPS1(已经测序验证)。

具体步骤如下：

1)以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，利用引物CbTPS1-F2和CbTPS1-R2进行PCR扩增，回收并进行纯化获得纯化PCR产物。其中，所述引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

CbTPS1-F2：

5’-CCATGGCTGATATCGGAATGGCGTTGCAAATGACTGTTCCA-3’；

CbTPS1-R2：

5’-ACGGAGCTCGAATTCGGTCAGGCATATCCACCATCGACACA-3’。

2)取pET32a(+)载体(Novagen公司)，用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收线性化的载体骨架。

3)取步骤1)得到的纯化PCR产物，按北京全式金生物技术有限公司pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit说明书操作，将其克隆至步骤2)的线性化的载体骨架，得到重组质粒pET32a::CbTPS1。

外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列4所示的融合基因，编码序列表的序列3所示的融合蛋白。

2、重组菌的获得

将重组质粒pET32a::CbTPS1转化至大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到pET32a::CbTPS1重组菌；同时用不含目的基因的pET32a(+)载体转化大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)作为对照菌。

3、诱导表达重组蛋白CbTPS1

挑取pET32a::CbTPS1重组菌和对照菌分别接种于2mL的LB液体培养基(含氨苄青霉素100mg/L)中，于37℃振荡培养过夜。次日按1：100稀释加入到200mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时转入18℃振摇1小时，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续于18℃摇床培养24小时诱导目标蛋白表达。将菌液用8000g离心5min，弃上清，收集pET32a::CbTPS1重组菌和对照菌菌体，保存在-80℃冰箱备用。

4、重组蛋白CbTPS1提取

提取pET32a::CbTPS1重组菌和对照菌菌体中的蛋白。

具体步骤如下：将pET32a::CbTPS1重组菌和对照菌菌体用预冷的5mL HEPES缓冲液(25mM HEPES，5M MgCl₂，5M DTT，pH 7.0)重悬；置冰浴中超声破菌(30％功率，超声5s，间隔5s，持续5min，重复1次)，12000g，4℃离心30min，分别得到pET32a::CbTPS1重组菌上清和对照菌上清，即为蛋白溶液。

将pET32a::CbTPS1重组菌上清和对照菌上清进行SDS-PAGE，结果如图2A所示。从图中可以看出，pET32a::CbTPS1重组菌上清具有重组质粒pET32a::CbTPS1表达的重组蛋白CbTPS1，所述重组蛋白CbTPS1大小约为88kDa，大小与预期相符。对照菌上清无相应蛋白。

5、重组蛋白CbTPS1纯化

按表2配制试剂。

表2不同浓度蛋白洗脱液配制

具体纯化流程如下：

(1)预冷的5mL Binding buffer(20mM Na₂HPO₄，0.5mM NaCl，10mM imidazole，1mMDTT，1mM PMSF，pH 7.4)重悬pET32a::CbTPS1重组菌；

(2)置冰浴中超声破碎菌液(30％功率，超声10s，间隔10s，持续20min)，4℃，12000g离心30min；

(3)吸取200μLNi-NTAagorose于15mL离心管，用10倍体积的Elution buffer(含20mM咪唑)洗涤，4℃，500g离心5min，弃上清(除尽乙醇)，活化镍柱，重复3次；

(4)上清液(粗蛋白)与活化的镍柱混合，离心管水平放置在冰上，振荡2h，使蛋白与镍柱充分结合；

(5)4℃，500g离心5min，弃上清；

(6)加入5mL Elution buffer(含20mM咪唑)轻轻重悬，4℃，500g离心5min，弃上清，重复3次后转移到1.5mL EP管中；

(7)加入200μL Elution buffer(含50mM咪唑)，用枪头吹打混匀，4℃，500g离心5min，取上清(200μL)加入50μL 50％甘油，-80℃冰箱保存；

(8)加入200μL Elution buffer(含100mM咪唑)，用枪头吹打混匀，4℃，500g离心5min，取上清(200μL)加入50μL 50％甘油，-80℃冰箱保存；

(9)加入200μL Elution buffer(含250mM咪唑)，用枪头吹打混匀，4℃，500g离心5min，取上清(200μL)加入50μL 50％甘油，-80℃冰箱保存；

(10)加入200μL Elution buffer(含500mM咪唑)，用枪头吹打混匀，4℃，500g离心5min，取上清(200μL)加入50μL 50％甘油，-80℃冰箱保存；

(11)对不同浓度梯度的洗脱液进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，将pET32a::CbTPS1纯化蛋白进行SDS-PAGE，结果如图2B所示。从图中可以看出，所述重组蛋白CbTPS1大小约为88kDa，大小与预期相符，纯化效果很好。

(12)合并含有目的蛋白的洗脱液，并转移到蛋白超滤管中进行脱盐浓缩，收集纯酶液，置于-80℃冰箱保存。

二、重组蛋白CbTPS1酶促活性分析

1、酶促活性

(1)取pET32a::CbTPS1重组菌上清进行酶促反应，获得酶促反应产物。其中，酶促反应具体步骤如下：

酶促反应总体系为0.2mL，取pET32a::CbTPS1重组菌上清190μL(所述pET32a::CbTPS1重组菌上清包含酶促缓冲液，即HEPES缓冲液(25mM HEPES，5M MgCl₂，5M DTT，pH7.0))，加入底物香叶基焦磷酸(GPP)10μL，混匀，并将酶促反应总体系用200μL正己烷覆盖液封，在30℃放置2小时后，用氮气将水相中的正己烷彻底吹干(以免影响下一步的脱磷酸化反应)，得到pET32a::CbTPS1重组菌上清酶促反应产物。

(2)取pET32a::CbTPS1纯化蛋白进行酶促反应，获得酶促反应产物。其中，酶促反应具体步骤如下：

酶促反应总体系为0.2mL，含pET32a::CbTPS1纯化蛋白20μL(200ng/μL)、HEPES缓冲液170μL(25mM HEPES，5M MgCl₂，5M DTT，pH 7.0)、底物香叶基焦磷酸(GPP)10μL，混匀，并将酶促反应总体系用200μL正己烷覆盖液封，在30℃放置2小时后，用氮气将水相中的正己烷彻底吹干(以免影响下一步的脱磷酸化反应)，得到pET32a::CbTPS1纯化蛋白酶促反应产物。

2、脱磷酸化反应

配置脱磷酸化反应体系，充分混合(枪头吹打)，在37℃下脱磷酸化反应4h，获得脱磷酸化后的产物。

其中，所述脱磷酸化反应体系如表3所示。

表3

脱磷酸化后的产物用正己烷抽提3次，每次加入0.2mL，将抽提所得有机相汇合在一起；用氮气将提取液吹干，并加入100μL正己烷溶解，得到目标化合物(即pET32a::CbTPS1重组菌上清或纯化蛋白的目标化合物)，用于GC-MS分析。

3、GC-MS分析

利用气质联用GC-MS对pET32a::CbTPS1重组菌上清、纯化蛋白的目标化合物进行检测：GC-MS分析系统为Thermo TRACE 1310/TSQ 8000gas chromatograph，进样量1μL，splitless模式，气相色谱柱为Agilent J&W Cyclodex-B手性柱(30m×0.25mm×0.25μm)，氦气流速1.0mL/min，进样口温度220℃，离子源温度200℃，升温程序为50℃保持2min，程序升温3℃·min^-1到150℃，并保持5min，10℃·min^-1到220℃，电子能量70eV，对样品进行50-500m/z范围扫描。

将上述反应中的pET32a::CbTPS1重组菌上清190μL替换为对照菌上清190μL，重复上述试验，获得对照菌上清的目标化合物。

GC-MS分析结果如图3所示：对照菌上清的目标化合物中没有检测到右旋龙脑((+)-borneol)，pET32a::CbTPS1重组菌上清及纯化蛋白的目标化合物中均检测到了右旋龙脑((+)-borneol)，说明CbTPS1重组蛋白能够催化GPP形成右旋龙脑((+)-borneol)，表明重组蛋白CbTPS1为单萜合酶。

实施例3、梅片树CbTPS1导入酵母菌株发酵生产(+)-borneol

1、真核表达载体的构建

采用北京全式金生物技术有限公司pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit，将序列1的Cbtps1基因构建至pESC-Leu载体(Agilent公司)的BamHI酶切位点处，且保持pESC-Leu载体其他序列不变，得到重组质粒pESC-Leu::CbTPS1(已经测序验证)。

具体步骤如下：

1)以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，利用引物CbTPS1-F3和CbTPS1-R3进行PCR扩增，回收并进行纯化获得纯化PCR产物。其中，所述引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

CbTPS1-F3：

5’-CCATGGCTGATATCGGAATGGCGTTGCAAATGACTGTTCCA-3’；

CbTPS1-R3：

5’-ACGGAGCTCGAATTCGGTCAGGCATATCCACCATCGACACA-3’。

2)取pESC-Leu载体(Agilent公司)，用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收线性化的载体骨架。

3)取步骤1)得到的纯化PCR产物，按北京全式金生物技术有限公司pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit说明书操作，将其克隆至步骤2)的线性化的载体骨架，得到重组质粒pESC-Leu::CbTPS1。

2、BY-Mono酵母菌株构建

YPD固体平板：1％酵母膏+2％蛋白胨+2％葡萄糖+1.5％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(YPD液体培养基)；

YPL诱导培养基：1％酵母膏+2％蛋白胨+2％半乳糖；

SD-Ura固体平板：SD-Ura+2％葡萄糖+2％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(SD-Ura液体培养基)；

SD-Ura-Leu固体平板：SD-Ura-Leu+2％葡萄糖+2％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(SD-Ura-Leu液体培养基)。

BY4741酵母菌株(基因型：MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)涂布YPD固体平板，30℃倒置培养48-72h，得到新活化的BY4741酵母菌菌落。将Ura3marker、酵母来源的tHMGR1(含启动子序列P_TDH3和终止子序列T_TPI1，即P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1)、酵母来源IDI1(含启动子序列P_ADH1和终止子序列T_PGI，即P_ADH1-IDI1-T_PGI)、酵母来源的tHMGR1(含启动子序列P_PGK1和终止子序列T_ADH1，即P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1)、酵母来源的ERG20^F96W-N127W(含启动子序列P_TEF2和终止子序列T_CYC1，即P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC1)整合到BY4741酵母菌株YPRC△15位点(chromosome XVI long_terminal_repeat and Autonomously Replicating Sequence，YPRC△15)，具体步骤如下：

1)挑取新活化的BY4741酵母菌单菌落于5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜，至OD600＝0.6-1.0；

2)取浸泡在乙醇中的电转杯(0.2cm)，超纯水清洗并晾干，倒立放在吸水滤纸上，置于超净台中灭菌；

3)取1-2mL菌液于无菌1.5mL EP管中，10000g，常温离心1min，弃上清；

4)加入预冷的无菌水1mL重悬，10000g，常温离心1min；

5)重复步骤4)，弃上清，加入预冷的缓冲液(10mM LiAc，10mM DTT，0.6Msorbitol，10mM pH7.5Tris-HCl)，25℃培养20min；

6)10000g，常温离心1min，弃上清；

7)加入预冷的1mL sorbitol(1M)溶液重悬，10000g，常温离心1min；

8)重复步骤7)，弃上清，加入预冷的100μL sorbitol(1M)溶液重悬，制成BY4741酵母感受态细胞；

9)将Ura3marker(序列表的序列5)、P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1(序列表的序列6)、P_ADH1-IDI1-T_PGI(序列表的序列7)、P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1(序列表的序列8)、P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC1(序列表的序列9)5个DNA片段等摩尔比混合，总质量500ng(总体积不超过感受态细胞体积的1/10)，加入到上述BY4741酵母感受态细胞中，混匀并转移至电转杯(0.2cm)，冰浴2-5min；2.7kV、25μF、200Ω(Bio-Rad，Hercules，CA)条件下电转，电击后于超净工作台中加入1mL sorbitol(1M)溶液，并转移至无菌1.5mL EP管中，30℃培养1-2h，期间上下混匀2-3次；

10)10000g，常温离心1min，弃上清，余100μL溶液重悬菌体，滴在缺陷型SD-Ura固体平板中央，用涂布器涂布均匀，直至涂布的全部菌液吸收完全，置于30℃恒温箱中倒立培养2-3d，所得菌株命名为BY-Mono酵母菌株，所述BY-Mono酵母菌株的基因型：MATa his3Δ1leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0，YPRCΔ15 Ura3-P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1-P_ADH1-IDI1-T_PGI-P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1-P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC1。

3、BY-Mono酵母感受态制备

采用ZYMO RESEARCH Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒做酵母感受态细胞：

(1)从SD-Ura固体平板上挑取新活化的BY-Mono酵母菌单菌落，接种于10mL SD-Ura液体培养基中，30℃下振荡培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0左右；

(2)室温，500g离心4min，去上清；

(3)加入10mL Frozen-EZ Solution 1悬浮菌体，室温，500g离心4min，去上清；

(4)加入1mL Frozen-EZ Solution 2悬浮菌体，得到BY-Mono酵母感受态细胞，分装至灭菌的1.5mL EP管中，每管50μL；

(5)缓慢降温至-70℃(4℃，1h；-20℃，1h；-40℃，1h；-70℃保存)，禁止用液氮速冻感受态细胞。

4、重组质粒pESC-Leu::CbTPS1转化至BY-Mono酵母感受态细胞

(1)取0.2-1μg重组质粒pESC-Leu::CbTPS1(少于5μL)与50μL BY-Mono酵母感受态细胞混合；

(2)加入500μL Frozen-EZ Solution 3，剧烈混匀；

(3)30℃孵育1-2h，期间在此混匀2-3次；

(4)取50-150μL孵育的菌液，涂布SD-Ura-Leu固体平板上，晾干后，置于30℃倒置培养48-96h，得到转入重组质粒pESC-Leu::CbTPS1的重组酵母，将其命名为BY-Mono/pESC-Leu::CbTPS1。

同时以上述同样的方法将不含目的基因(即Cbtps1基因)的pESC-Leu载体转化BY-Mono酵母感受态细胞作为对照，得到转入pESC-Leu载体的重组酵母，将其命名为BY-Mono/pESC-Leu。

5、发酵

(1)挑取步骤4中SD-Ura-Leu固体平板上长出来的BY-Mono/pESC-Leu::CbTPS1的单菌落，置于10mL SD-Ura-Leu液体培养基中，30℃200rpm48h；

(2)室温5000g 5min离心收集菌体，转接入20mL YPL诱导培养基，30℃200rpm诱导培养72h，得到发酵产物。

6、发酵产物萃取

目标成分为萜类化合物，脂溶性，易溶于乙酸乙酯，因此选取乙酸乙酯为溶剂萃取发酵产物，得到目标化合物。其中，所述萃取步骤如下：

(1)收集发酵完成菌液，即发酵产物，加入等体积的乙酸乙酯；

(2)超声破菌1h，期间多次振荡混摇；

(3)室温5000g 5min取上层有机相，加入适量的无水硫酸钠(120℃烘干30min)，边加边摇，除去萃取液的水分；

(4)旋转蒸发仪上浓缩至近干，

(5)吸取浓缩液，过0.22μm PTFE针头滤器，过滤液储存于液相小瓶中，封口膜密闭，保存于4℃冰箱。

7、发酵产物GC-MS检测

利用气质联用GC-MS对目标化合物进行检测：GC-MS分析系统为Thermo TRACE1310/TSQ 8000gas chromatograph，进样量1μL，splitless模式，气相色谱柱为ThermoScientific TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，氦气流速1.0mL/min，进样口温度220℃，离子源温度200℃，升温程序为50℃保持2min，程序升温5℃·min^-1到150℃，并保持2min，30℃·min^-1到300℃，电子能量70eV，对样品进行50-500m/z范围扫描。

将将上述步骤5发酵中“挑取步骤4中SD-Ura-Leu固体平板上长出来的BY-Mono/pESC-Leu::CbTPS1单菌落”替换为“挑取步骤4中SD-Ura-Leu固体平板上长出来的BY-Mono/pESC-Leu单菌落”重复上述试验步骤5、步骤6和步骤7。

GC-MS分析结果如图4所示：含pESC-Leu::CbTPS1重组质粒的重组酵母BY-Mono/pESC-Leu::CbTPS1发酵产物萃取得到的目标化合物为右旋龙脑，即含pESC-Leu::CbTPS1重组质粒的重组酵母BY-Mono/pESC-Leu::CbTPS1能够合成右旋龙脑((+)-borneol)，经统计每升发酵液能得到3.0毫克右旋龙脑。含pESC-Leu载体的重组酵母BY-Mono/pESC-Leu发酵产物萃取得到的目标化合物中未检测到右旋龙脑((+)-borneol)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 梅片树单萜合酶CbTPS1及其相关生物材料与应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1812

<212> DNA

<213> 梅片树(Dryobalanops aromatica)

<400> 1

atggcgttgc aaatgactgt tccatttcta tcctccttcc tcccaaatcc tcgacacaga 60

cccacagccc atggtttcat accccaggaa cgtgtctcaa agcatatttc atgctccact 120

actacaccaa cctactcaac cacagtaccc agaagatcag gaaactacaa gcccagtata 180

tgggactatg attttgtgca gtcactagta agtgactaca aggtagaggc acatggaact 240

cgtgtggaga agttgaagga agttgtaaag aatttgttga aagaaacaga tagttctttg 300

gcccaaatgg aactgattga cagtctccat cgtctaggtg tgaggtggct ctttgaaaat 360

gagattaagc aagtgctata cactgtatca tcagacaaca ccagcataga aatgaagaaa 420

gatcttcatg cagtatcaac tcgatttaga cttcttagac aacatgggtt caaggtctcc 480

acagatgttt tcaatgactt cgaagatgaa aagggttgtt tcaagccaag cctttcaatg 540

gacataaagg gaatgctgag cttgtatgaa gcttcacacc ttgcctttca aggggagact 600

atattggatg aggcaagagc tttcacacac gcacatctca tgggtatcaa ggagaacata 660

gacccaatca ttcataaaaa agtagagcat gctttggata tgcctttgca ttggaggtta 720

gaaaaattag aggctaggtg gtacatggac atgtatatga gggaagaagg catgaattct 780

tctttgcttg aattggccat gcttcatttc aacattgtgc aagcaacatt ccaaacaaat 840

ttaaagagtt tgtcaaggtg gtggaaagat ttgggtcttg gagagcagtt gagcttttct 900

agagacaggt tggtggaatg tttcttttgg gcagccgcaa tgacatccga gccacaattt 960

ggacgttgcc aggaagctgt agcgaaagtt gttcaactca caacaacaat tgacgatatc 1020

tatgacgtgt atggtacggt ggatgagctg gaacttttta ctaatgcggt tgatagatgg 1080

gatcttgagg caatggagca acttcctgaa tatatgaaga cctgtttctt agctttatac 1140

aacagtatta atgaaatagg ttatggaatt ttgaaagagc aagggcgtaa tgtcatacca 1200

taccttagaa atgcgtggac agaattgtgt aaagcatact tagtggaggc caaatggtat 1260

agtagtggat atacaccaat gcttgaggag tttctgcaaa cctcatggat ttcggttgga 1320

agtctaccca tgcaaacgta tgcttttgct ttacttgggc aaaatctagc accggagagc 1380

tgtgatttcg ctgagcagat ctcagatatc ttaccattgg caggaatgct aattcgattt 1440

ccagatgatt tgggaacttc attggatgaa ctaaagagag gtgatgttcc aaaatccatt 1500

cagtgttaca tgcatgaagc aggtgttaca gaggatgttg ctcgtgacca cataatgggt 1560

ctatttagag agacatggaa gaaactcaat gaataccttg tggaaagttc tattccccat 1620

gccttcatcg atcaagctat gaatcttggg cgtgtctcct attgtactta caaacatgga 1680

gatggattta gtgatggatt tggagatcct ggcagtcaag agaaaaagat gtacatgtct 1740

ttatttgttg aacccattca agttgatgaa gccaagggta tttcattttg tgtcgatggt 1800

ggatatgcct ga 1812

<210> 2

<211> 603

<212> PRT

<213> 梅片树(Dryobalanops aromatica)

<400> 2

Met Ala Leu Gln Met Thr Val Pro Phe Leu Ser Ser Phe Leu Pro Asn

1 5 10 15

Pro Arg His Arg Pro Thr Ala His Gly Phe Ile Pro Gln Glu Arg Val

20 25 30

Ser Lys His Ile Ser Cys Ser Thr Thr Thr Pro Thr Tyr Ser Thr Thr

35 40 45

Val Pro Arg Arg Ser Gly Asn Tyr Lys Pro Ser Ile Trp Asp Tyr Asp

50 55 60

Phe Val Gln Ser Leu Val Ser Asp Tyr Lys Val Glu Ala His Gly Thr

65 70 75 80

Arg Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Val Lys Asn Leu Leu Lys Glu Thr

85 90 95

Asp Ser Ser Leu Ala Gln Met Glu Leu Ile Asp Ser Leu His Arg Leu

100 105 110

Gly Val Arg Trp Leu Phe Glu Asn Glu Ile Lys Gln Val Leu Tyr Thr

115 120 125

Val Ser Ser Asp Asn Thr Ser Ile Glu Met Lys Lys Asp Leu His Ala

130 135 140

Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Phe Lys Val Ser

145 150 155 160

Thr Asp Val Phe Asn Asp Phe Glu Asp Glu Lys Gly Cys Phe Lys Pro

165 170 175

Ser Leu Ser Met Asp Ile Lys Gly Met Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser

180 185 190

His Leu Ala Phe Gln Gly Glu Thr Ile Leu Asp Glu Ala Arg Ala Phe

195 200 205

Thr His Ala His Leu Met Gly Ile Lys Glu Asn Ile Asp Pro Ile Ile

210 215 220

His Lys Lys Val Glu His Ala Leu Asp Met Pro Leu His Trp Arg Leu

225 230 235 240

Glu Lys Leu Glu Ala Arg Trp Tyr Met Asp Met Tyr Met Arg Glu Glu

245 250 255

Gly Met Asn Ser Ser Leu Leu Glu Leu Ala Met Leu His Phe Asn Ile

260 265 270

Val Gln Ala Thr Phe Gln Thr Asn Leu Lys Ser Leu Ser Arg Trp Trp

275 280 285

Lys Asp Leu Gly Leu Gly Glu Gln Leu Ser Phe Ser Arg Asp Arg Leu

290 295 300

Val Glu Cys Phe Phe Trp Ala Ala Ala Met Thr Ser Glu Pro Gln Phe

305 310 315 320

Gly Arg Cys Gln Glu Ala Val Ala Lys Val Val Gln Leu Thr Thr Thr

325 330 335

Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Val Asp Glu Leu Glu Leu

340 345 350

Phe Thr Asn Ala Val Asp Arg Trp Asp Leu Glu Ala Met Glu Gln Leu

355 360 365

Pro Glu Tyr Met Lys Thr Cys Phe Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Ile Asn

370 375 380

Glu Ile Gly Tyr Gly Ile Leu Lys Glu Gln Gly Arg Asn Val Ile Pro

385 390 395 400

Tyr Leu Arg Asn Ala Trp Thr Glu Leu Cys Lys Ala Tyr Leu Val Glu

405 410 415

Ala Lys Trp Tyr Ser Ser Gly Tyr Thr Pro Met Leu Glu Glu Phe Leu

420 425 430

Gln Thr Ser Trp Ile Ser Val Gly Ser Leu Pro Met Gln Thr Tyr Ala

435 440 445

Phe Ala Leu Leu Gly Gln Asn Leu Ala Pro Glu Ser Cys Asp Phe Ala

450 455 460

Glu Gln Ile Ser Asp Ile Leu Pro Leu Ala Gly Met Leu Ile Arg Phe

465 470 475 480

Pro Asp Asp Leu Gly Thr Ser Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gly Asp Val

485 490 495

Pro Lys Ser Ile Gln Cys Tyr Met His Glu Ala Gly Val Thr Glu Asp

500 505 510

Val Ala Arg Asp His Ile Met Gly Leu Phe Arg Glu Thr Trp Lys Lys

515 520 525

Leu Asn Glu Tyr Leu Val Glu Ser Ser Ile Pro His Ala Phe Ile Asp

530 535 540

Gln Ala Met Asn Leu Gly Arg Val Ser Tyr Cys Thr Tyr Lys His Gly

545 550 555 560

Asp Gly Phe Ser Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gly Ser Gln Glu Lys Lys

565 570 575

Met Tyr Met Ser Leu Phe Val Glu Pro Ile Gln Val Asp Glu Ala Lys

580 585 590

Gly Ile Ser Phe Cys Val Asp Gly Gly Tyr Ala

595 600

<210> 3

<211> 767

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Met Ala Leu Gln Met Thr Val Pro Phe Leu Ser Ser

165 170 175

Phe Leu Pro Asn Pro Arg His Arg Pro Thr Ala His Gly Phe Ile Pro

180 185 190

Gln Glu Arg Val Ser Lys His Ile Ser Cys Ser Thr Thr Thr Pro Thr

195 200 205

Tyr Ser Thr Thr Val Pro Arg Arg Ser Gly Asn Tyr Lys Pro Ser Ile

210 215 220

Trp Asp Tyr Asp Phe Val Gln Ser Leu Val Ser Asp Tyr Lys Val Glu

225 230 235 240

Ala His Gly Thr Arg Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Val Lys Asn Leu

245 250 255

Leu Lys Glu Thr Asp Ser Ser Leu Ala Gln Met Glu Leu Ile Asp Ser

260 265 270

Leu His Arg Leu Gly Val Arg Trp Leu Phe Glu Asn Glu Ile Lys Gln

275 280 285

Val Leu Tyr Thr Val Ser Ser Asp Asn Thr Ser Ile Glu Met Lys Lys

290 295 300

Asp Leu His Ala Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly

305 310 315 320

Phe Lys Val Ser Thr Asp Val Phe Asn Asp Phe Glu Asp Glu Lys Gly

325 330 335

Cys Phe Lys Pro Ser Leu Ser Met Asp Ile Lys Gly Met Leu Ser Leu

340 345 350

Tyr Glu Ala Ser His Leu Ala Phe Gln Gly Glu Thr Ile Leu Asp Glu

355 360 365

Ala Arg Ala Phe Thr His Ala His Leu Met Gly Ile Lys Glu Asn Ile

370 375 380

Asp Pro Ile Ile His Lys Lys Val Glu His Ala Leu Asp Met Pro Leu

385 390 395 400

His Trp Arg Leu Glu Lys Leu Glu Ala Arg Trp Tyr Met Asp Met Tyr

405 410 415

Met Arg Glu Glu Gly Met Asn Ser Ser Leu Leu Glu Leu Ala Met Leu

420 425 430

His Phe Asn Ile Val Gln Ala Thr Phe Gln Thr Asn Leu Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Arg Trp Trp Lys Asp Leu Gly Leu Gly Glu Gln Leu Ser Phe Ser

450 455 460

Arg Asp Arg Leu Val Glu Cys Phe Phe Trp Ala Ala Ala Met Thr Ser

465 470 475 480

Glu Pro Gln Phe Gly Arg Cys Gln Glu Ala Val Ala Lys Val Val Gln

485 490 495

Leu Thr Thr Thr Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Val Asp

500 505 510

Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asn Ala Val Asp Arg Trp Asp Leu Glu Ala

515 520 525

Met Glu Gln Leu Pro Glu Tyr Met Lys Thr Cys Phe Leu Ala Leu Tyr

530 535 540

Asn Ser Ile Asn Glu Ile Gly Tyr Gly Ile Leu Lys Glu Gln Gly Arg

545 550 555 560

Asn Val Ile Pro Tyr Leu Arg Asn Ala Trp Thr Glu Leu Cys Lys Ala

565 570 575

Tyr Leu Val Glu Ala Lys Trp Tyr Ser Ser Gly Tyr Thr Pro Met Leu

580 585 590

Glu Glu Phe Leu Gln Thr Ser Trp Ile Ser Val Gly Ser Leu Pro Met

595 600 605

Gln Thr Tyr Ala Phe Ala Leu Leu Gly Gln Asn Leu Ala Pro Glu Ser

610 615 620

Cys Asp Phe Ala Glu Gln Ile Ser Asp Ile Leu Pro Leu Ala Gly Met

625 630 635 640

Leu Ile Arg Phe Pro Asp Asp Leu Gly Thr Ser Leu Asp Glu Leu Lys

645 650 655

Arg Gly Asp Val Pro Lys Ser Ile Gln Cys Tyr Met His Glu Ala Gly

660 665 670

Val Thr Glu Asp Val Ala Arg Asp His Ile Met Gly Leu Phe Arg Glu

675 680 685

Thr Trp Lys Lys Leu Asn Glu Tyr Leu Val Glu Ser Ser Ile Pro His

690 695 700

Ala Phe Ile Asp Gln Ala Met Asn Leu Gly Arg Val Ser Tyr Cys Thr

705 710 715 720

Tyr Lys His Gly Asp Gly Phe Ser Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gly Ser

725 730 735

Gln Glu Lys Lys Met Tyr Met Ser Leu Phe Val Glu Pro Ile Gln Val

740 745 750

Asp Glu Ala Lys Gly Ile Ser Phe Cys Val Asp Gly Gly Tyr Ala

755 760 765

<210> 4

<211> 2304

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gaatggcgtt gcaaatgact gttccatttc tatcctcctt cctcccaaat 540

cctcgacaca gacccacagc ccatggtttc ataccccagg aacgtgtctc aaagcatatt 600

tcatgctcca ctactacacc aacctactca accacagtac ccagaagatc aggaaactac 660

aagcccagta tatgggacta tgattttgtg cagtcactag taagtgacta caaggtagag 720

gcacatggaa ctcgtgtgga gaagttgaag gaagttgtaa agaatttgtt gaaagaaaca 780

gatagttctt tggcccaaat ggaactgatt gacagtctcc atcgtctagg tgtgaggtgg 840

ctctttgaaa atgagattaa gcaagtgcta tacactgtat catcagacaa caccagcata 900

gaaatgaaga aagatcttca tgcagtatca actcgattta gacttcttag acaacatggg 960

ttcaaggtct ccacagatgt tttcaatgac ttcgaagatg aaaagggttg tttcaagcca 1020

agcctttcaa tggacataaa gggaatgctg agcttgtatg aagcttcaca ccttgccttt 1080

caaggggaga ctatattgga tgaggcaaga gctttcacac acgcacatct catgggtatc 1140

aaggagaaca tagacccaat cattcataaa aaagtagagc atgctttgga tatgcctttg 1200

cattggaggt tagaaaaatt agaggctagg tggtacatgg acatgtatat gagggaagaa 1260

ggcatgaatt cttctttgct tgaattggcc atgcttcatt tcaacattgt gcaagcaaca 1320

ttccaaacaa atttaaagag tttgtcaagg tggtggaaag atttgggtct tggagagcag 1380

ttgagctttt ctagagacag gttggtggaa tgtttctttt gggcagccgc aatgacatcc 1440

gagccacaat ttggacgttg ccaggaagct gtagcgaaag ttgttcaact cacaacaaca 1500

attgacgata tctatgacgt gtatggtacg gtggatgagc tggaactttt tactaatgcg 1560

gttgatagat gggatcttga ggcaatggag caacttcctg aatatatgaa gacctgtttc 1620

ttagctttat acaacagtat taatgaaata ggttatggaa ttttgaaaga gcaagggcgt 1680

aatgtcatac cataccttag aaatgcgtgg acagaattgt gtaaagcata cttagtggag 1740

gccaaatggt atagtagtgg atatacacca atgcttgagg agtttctgca aacctcatgg 1800

atttcggttg gaagtctacc catgcaaacg tatgcttttg ctttacttgg gcaaaatcta 1860

gcaccggaga gctgtgattt cgctgagcag atctcagata tcttaccatt ggcaggaatg 1920

ctaattcgat ttccagatga tttgggaact tcattggatg aactaaagag aggtgatgtt 1980

ccaaaatcca ttcagtgtta catgcatgaa gcaggtgtta cagaggatgt tgctcgtgac 2040

cacataatgg gtctatttag agagacatgg aagaaactca atgaatacct tgtggaaagt 2100

tctattcccc atgccttcat cgatcaagct atgaatcttg ggcgtgtctc ctattgtact 2160

tacaaacatg gagatggatt tagtgatgga tttggagatc ctggcagtca agagaaaaag 2220

atgtacatgt ctttatttgt tgaacccatt caagttgatg aagccaaggg tatttcattt 2280

tgtgtcgatg gtggatatgc ctga 2304

<210> 5

<211> 1721

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ataaagcagc cgctaccaaa cagacaagat tcagtatgta aggtaaatac ctttttgcac 60

agttaaacta cccaaactta ttaaagcttg ataaattact gaaattccac ctttcagtta 120

gattcaggcc tcatatagat tagatatagg gtacgtaaca ttctgtcaac caagttgttg 180

gaatgaaagt ctaaaatgtc atctattcgg tagcactcat gttactagta tactgtcaca 240

tgcggtgtaa cgtggggaca taaaacagac atcaaatata atggaagctg aaatgcaaag 300

atcgataatg taataggaat gaaacatata aaacgaaagg agaagtaatg gtaatattag 360

tatgtagaaa taccgattca attttgggga ttcttatatt ctcgagagaa tttctagtat 420

aatctgtata cataatatta taggctttac caaaccacag cttttcaatt caattcatca 480

tttttttttt attctttttt ttgatttcgg tttctttgaa atttttttga ttcggtaatc 540

tccgaacaga aggaagaacg aaggaaggag cacagactta gattggtata tatacgcata 600

tgtagtgttg aagaaacatg aaattgccca gtattcttaa cccaactgca cagaacaaaa 660

acctgcagga aacgaagata aatcatgtcg aaagctacat ataaggaacg tgctgctact 720

catcctagtc ctgttgctgc caagctattt aatatcatgc acgaaaagca aacaaacttg 780

tgtgcttcat tggatgttcg taccaccaag gaattactgg agttagttga agcattaggt 840

cccaaaattt gtttactaaa aacacatgtg gatatcttga ctgatttttc catggagggc 900

acagttaagc cgctaaaggc attatccgcc aagtacaatt ttttactctt cgaagacaga 960

aaatttgctg acattggtaa tacagtcaaa ttgcagtact ctgcgggtgt atacagaata 1020

gcagaatggg cagacattac gaatgcacac ggtgtggtgg gcccaggtat tgttagcggt 1080

ttgaagcagg cggcagaaga agtaacaaag gaacctagag gccttttgat gttagcagaa 1140

ttgtcatgca agggctccct atctactgga gaatatacta agggtactgt tgacattgcg 1200

aagagcgaca aagattttgt tatcggcttt attgctcaaa gagacatggg tggaagagat 1260

gaaggttacg attggttgat tatgacaccc ggtgtgggtt tagatgacaa gggagacgca 1320

ttgggtcaac agtatagaac cgtggatgat gtggtctcta caggatctga cattattatt 1380

gttggaagag gactatttgc aaagggaagg gatgctaagg tagagggtga acgttacaga 1440

aaagcaggct gggaagcata tttgagaaga tgcggccagc aaaactaaaa aactgtatta 1500

taagtaaatg catgtatact aaactcacaa attagagctt caatttaatt atatcagtta 1560

ttaccctatg cccccggtcc gtttgttcta tacttctctc tgctatacct acaagcaagg 1620

taatcggaag tagtattacg caggaatatc ccgcgcgaag ctacaatttt tggactccaa 1680

cgtcaaagca ggggagtcag aagtcccctc taaaattgcc t 1721

<210> 6

<211> 2785

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atactagcgt tgaatgttag cgtcaacaac aagaagttta atgacgcgga ggccaaggca 60

aaaagattcc ttgattacgt aagggagtta gaatcatttt gaataaaaaa cacgcttttt 120

cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga atacgtaaat aattaatagt 180

agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc tgtaacccgt 240

acatgcccaa aatagggggc gggttacaca gaatatataa catcgtaggt gtctgggtga 300

acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg ctttttaagc tggcatccag 360

aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca gttcataggt 420

ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac 480

ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc 540

atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct gctctctctg atttggaaaa 600

agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt cccctacttg actaataagt 660

atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat 720

tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac caagaactta gtttcgaata 780

aacacacata aacaaacaaa atggctgcag accaattggt gaaaactgaa gtcaccaaga 840

agtcttttac tgctcctgta caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat aaaacagtca 900

tttctggatc gaaagtcaaa agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca ggaccttcat 960

catctagtga ggaagatgat tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa atacgtcctt 1020

tagaagaatt agaagcatta ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg 1080

tcgctgcctt ggttattcac ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg 1140

atactacgag agcggttgcg gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg 1200

tattagcatc tgatcgttta ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt 1260

gttgtgaaaa tgttataggt tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta 1320

tcgatggtac atcttatcat ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg 1380

ccatgcgtgg ctgtaaggca atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg 1440

atggtatgac aagaggccca gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta 1500

agatatggtt agactcagaa gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat 1560

caagatttgc acgtctgcaa catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga 1620

gatttagaac aactactggt gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat 1680

actcattaaa gcaaatggta gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt 1740

ctggtaacta ctgtaccgac aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta 1800

agagtgtcgt cgcagaagct actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg 1860

atgtttccgc attggttgag ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg 1920

ggtctgttgg tggatttaac gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat 1980

taggacaaga tcctgcacaa aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag 2040

tggacggtga tttgagaatt tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg 2100

gtggtactgt tctagaacca caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc 2160

atgctaccgc tcctggtacc aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct 2220

tggcaggtga attatcctta tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata 2280

tgacccacaa caggaaacct gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata 2340

taaatcgttt gaaagatggg tccgtcacct gcattaaatc ctaagattaa tataattata 2400

taaaaatatt atcttctttt ctttatatct agtgttatgt aaaataaatt gatgactacg 2460

gaaagctttt ttatattgtt tctttttcat tctgagccac ttaaatttcg tgaatgttct 2520

tgtaagggac ggtagattta caagtgatac aacaaaaagc aaggcgcttt ttctaataaa 2580

aagaagaaaa gcatttaaca attgaacacc tctatatcaa cgaagaatat tactttgtct 2640

ctaaatcctt gtaaaatgtg tacgatctct atatgggtta ctcataagtg taccgaagac 2700

tgcattgaaa gtttatgttt tttcactgga ggcgtcattt tcgcgttgag aagatgttct 2760

tatccaaatt tcaactgtta tatag 2785

<210> 7

<211> 1886

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acatgtaggt ggcggagggg agatatacaa tagaacagat accagacaag acataatggg 60

ctaaacaaga ctacaccaat tacactgcct cattgatggt ggtacataac gaactaatac 120

tgtagcccta gacttgatag ccatcatcat atcgaagttt cactaccctt tttccatttg 180

ccatctattg aagtaataat aggcgcatgc aacttctttt cttttttttt cttttctctc 240

tcccccgttg ttgtctcacc atatccgcaa tgacaaaaaa atgatggaag acactaaagg 300

aaaaaattaa cgacaaagac agcaccaaca gatgtcgttg ttccagagct gatgaggggt 360

atctcgaagc acacgaaact ttttccttcc ttcattcacg cacactactc tctaatgagc 420

aacggtatac ggccttcctt ccagttactt gaatttgaaa taaaaaaaag tttgctgtct 480

tgctatcaag tataaataga cctgcaatta ttaatctttt gtttcctcgt cattgttctc 540

gttccctttc ttccttgttt ctttttctgc acaatatttc aagctatacc aagcatacaa 600

tcaactatct catatacaat gactgccgac aacaatagta tgccccatgg tgcagtatct 660

agttacgcca aattagtgca aaaccaaaca cctgaagaca ttttggaaga gtttcctgaa 720

attattccat tacaacaaag acctaatacc cgatctagtg agacgtcaaa tgacgaaagc 780

ggagaaacat gtttttctgg tcatgatgag gagcaaatta agttaatgaa tgaaaattgt 840

attgttttgg attgggacga taatgctatt ggtgccggta ccaagaaagt ttgtcattta 900

atggaaaata ttgaaaaggg tttactacat cgtgcattct ccgtctttat tttcaatgaa 960

caaggtgaat tacttttaca acaaagagcc actgaaaaaa taactttccc tgatctttgg 1020

actaacacat gctgctctca tccactatgt attgatgacg aattaggttt gaagggtaag 1080

ctagacgata agattaaggg cgctattact gcggcggtga gaaaactaga tcatgaatta 1140

ggtattccag aagatgaaac taagacaagg ggtaagtttc actttttaaa cagaatccat 1200

tacatggcac caagcaatga accatggggt gaacatgaaa ttgattacat cctattttat 1260

aagatcaacg ctaaagaaaa cttgactgtc aacccaaacg tcaatgaagt tagagacttc 1320

aaatgggttt caccaaatga tttgaaaact atgtttgctg acccaagtta caagtttacg 1380

ccttggttta agattatttg cgagaattac ttattcaact ggtgggagca attagatgac 1440

ctttctgaag tggaaaatga caggcaaatt catagaatgc tataaaacaa atcgctctta 1500

aatatatacc taaagaacat taaagctata ttataagcaa agatacgtaa attttgctta 1560

tattattata cacatatcat atttctatat ttttaagatt tggttatata atgtacgtaa 1620

tgcaaaggaa ataaatttta tacattattg aacagcgtcc aagtaactac attatgtgca 1680

ctaatagttt agcgtcgtga agactttatt gtgtcgcgaa aagtaaaaat tttaaaaatt 1740

agagcacctt gaacttgcga aaaaggttct catcaactgt ttaaaaggag gatatcaggt 1800

cctatttctg acaaacaata tacaaattta gtttcaaaga tgaatcagtg cgcgaaggac 1860

ataactcatg aagcctccag tatacc 1886

<210> 8

<211> 2492

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60

aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120

tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180

cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240

gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300

gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360

caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420

gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480

tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540

tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600

atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660

agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720

ttatctactt tttacaacaa atataaaaca atggctgcag accaattggt gaaaactgaa 780

gtcaccaaga agtcttttac tgctcctgta caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat 840

aaaacagtca tttctggatc gaaagtcaaa agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca 900

ggaccttcat catctagtga ggaagatgat tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa 960

atacgtcctt tagaagaatt agaagcatta ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag 1020

aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa 1080

aaattaggtg atactacgag agcggttgcg gtacgtagga aggctctttc aattttggca 1140

gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta 1200

tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc 1260

cccttggtta tcgatggtac atcttatcat ataccaatgg caactacaga gggttgtttg 1320

gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt 1380

ttaactaagg atggtatgac aagaggccca gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct 1440

ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt 1500

aactctacat caagatttgc acgtctgcaa catattcaaa cttgtctagc aggagattta 1560

ctcttcatga gatttagaac aactactggt gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa 1620

ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt 1680

gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa 1740

ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg 1800

ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct 1860

gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt 1920

ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa aatgttgaaa gttccaactg tataacattg 1980

atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt 2040

accatcggtg gtggtactgt tctagaacca caaggtgcca tgttggactt attaggtgta 2100

agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc 2160

tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt 2220

caaagtcata tgacccacaa caggaaacct gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac 2280

gccactgata taaatcgttt gaaagatggg tccgtcacct gcattaaatc ctaaagttat 2340

aaaaaaaata agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt 2400

attcttgagt aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc 2460

tcttattgac cacacctcta ccggcatgcc ga 2492

<210> 9

<211> 2445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tatacttaca tatagtagat gtcaagcgta ggcgcttccc ctgccggctg tgagggcgcc 60

ataaccaagg tatctataga ccgccaatca gcaaactacc tccgtacatt catgttgcac 120

ccacacattt atacacccag accgcgacaa attacccata aggttgtttg tgacggcgtc 180

gtacaagaga acgtgggaac tttttaggct caccaaaaaa gaaagaaaaa atacgagttg 240

ctgacagaag cctcaagaaa aaaaaaattc ttcttcgact atgctggagg cagagatgat 300

cgagccggta gttaactata tatagctaaa ttggttccat caccttcttt tctggtgtcg 360

ctccttctag tgctatttct ggcttttcct attttttttt ttccattttt ctttctctct 420

ttctaatata taaattctct tgcattttct atttttctct ctatctattc tacttgttta 480

ttcccttcaa ggtttttttt taaggagtac ttgtttttag aatatacggt caacgaacta 540

taattaacta aacactagta ccatggcttc agaaaaagaa attaggagag agagattctt 600

gaacgttttc cctaaattag tagaggaatt gaacgcatcg cttttggctt acggtatgcc 660

taaggaagca tgtgactggt atgcccactc attgaactac aacactccag gcggtaagct 720

aaatagaggt ttgtccgttg tggacacgta tgctattctc tccaacaaga ccgttgaaca 780

attggggcaa gaagaatacg aaaaggttgc cattctaggt tggtgcattg agttgttgca 840

ggcttactgg ttggtcgccg atgatatgat ggacaagtcc attaccagaa gaggccaacc 900

atgttggtac aaggttcctg aagttgggga aattgccatc tgggacgcat tcatgttaga 960

ggctgctatc tacaagcttt tgaaatctca cttcagaaac gaaaaatact acatagatat 1020

caccgaattg ttccatgagg tcaccttcca aaccgaattg ggccaattga tggacttaat 1080

cactgcacct gaagacaaag tcgacttgag taagttctcc ctaaagaagc actccttcat 1140

agttactttc aagactgctt actattcttt ctacttgcct gtcgcattgg ccatgtacgt 1200

tgccggtatc acggatgaaa aggatttgaa acaagccaga gatgtcttga ttccattggg 1260

tgaatacttc caaattcaag atgactactt agactgcttc ggtaccccag aacagatcgg 1320

taagatcggt acagatatcc aagataacaa atgttcttgg gtaatcaaca aggcattgga 1380

acttgcttcc gcagaacaaa gaaagacttt agacgaaaat tacggtaaga aggactcagt 1440

cgcagaagcc aaatgcaaaa agattttcaa tgacttgaaa attgaacagc tataccacga 1500

atatgaagag tctattgcca aggatttgaa ggccaaaatt tctcaggtcg atgagtctcg 1560

tggcttcaaa gctgatgtct taactgcgtt cttgaacaaa gtttacaaga gaagcaaata 1620

gtcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 1680

gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 1740

ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 1800

tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 1860

ttaatttgca acgacggtag acgccaacta cgctgacaga ccgatttgtt taagattaga 1920

agatttttag ccgcgccgca atcggaacca gcaaactcaa ttctgggaac agtttaaaat 1980

actagtaatt acgatagccg agaaacggac taagtccgcc aatggaattt cgacaattat 2040

catattattc accaattaat cacaagttgg taatgagttt gataacaagt tactttctta 2100

acaacgttag tatcgtcaaa acactcggtt ttactcgagc ttgtagcaca ataataccgt 2160

gtagagttct gtattgttct tcttagtgct tgtatatgct catcccgacc ttccattttt 2220

tttttcttgg aatcagtaca tagcaggtat gagttgttag agctgttaca agttacggta 2280

aacatttcaa cacaccgtta tttaacgaat ttatttgaga aagtggtgta ttttaagata 2340

tatgtttggt ttcgattgtt ggcaaagact ataatattat gcatatagga tataccaaaa 2400

attctctctg aggatatagg aatctacaaa atgaatctac atttc 2445

Claims (10)

1.蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述的蛋白质的相关生物材料，为下述任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A9)-A12)所述的转基因植物细胞系为非繁殖材料。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于A1)所述核酸分子为如下B1)-B2)任一所示：

B1)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

B2)编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质作为单萜合酶的应用。

5.权利要求2所述的相关生物材料在制备单萜合酶中的应用。

6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的相关生物材料在制备或合成单萜化合物的应用。

7.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的相关生物材料在催化香叶基焦磷酸形成右旋龙脑的应用。

8.制备权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入到受体微生物中，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1所述的蛋白质。

9.一种制备右旋龙脑的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求1所述的蛋白质催化香叶基焦磷酸的步骤。

10.一种右旋龙脑的生物合成方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入酿酒酵母得到重组酿酒酵母，发酵重组酿酒酵母，得到右旋龙脑。

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