CN113265390B

CN113265390B - 一种罗勒烯合酶CcOS及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN113265390B
Application number: CN202110587065.0A
Authority: CN
Inventors: 杨孝廉
Original assignee: Shenzhen Tianxiong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Tianxiong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2041-05-27
Also published as: CN113265390A

Abstract

本发明提供了一种罗勒烯合酶CcOS及其编码基因与应用，涉及植物基因工程技术领域。所述罗勒烯合酶CcOS的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明得到了一种新的参与单萜化合物罗勒烯合成的罗勒烯合酶CcOS，证明其可用于合成或制备罗勒烯。

Description

一种罗勒烯合酶CcOS及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其是涉及一种罗勒烯合酶CcOS及其编码基因与应用。

背景技术

樟树(Cinnamomum camphora(L.)presl)，又称香樟树，别名：香樟、樟木、瑶人柴、栳樟、臭樟、乌樟；樟树为樟科樟属常绿乔木树种。樟树具有巨大的经济价值和药用价值。樟树全体均有樟脑香气，可提取樟油。樟油中还含有一种无环单萜类成分罗勒烯(ocimene)，可用作日化香精配方成分或别罗勒烯醇合成成分。

罗勒烯为一种无色或淡黄色油状液体，有草香、花香并伴有橙花油气息；近年来，研究发现罗勒烯一种植物通讯(plant communication)信号分子(Cascone P,Iodice L,Maffei ME,Bossi S,Arimura G,Guerrieri E.Tobacco overexpressingβ-ocimeneinduces direct and indirect responses against aphids in receiver tomatoplants[J].J Plant Physiol.2015,173:28-32；Farré-Armengol G,Filella I,LlusiàJ,

J.β-Ocimene,a Key Floral and Foliar Volatile Involved in MultipleInteractions between Plants and Other Organisms[J].Molecules.2017,22(7):E1148.)。马世平等通过小鼠慢性不可预见温和刺激抑郁模型体重外观实验、糖水偏好试验、旷场试验、强迫游泳试验等研究，证实罗勒烯具有显著的抗抑郁活性，可以用于制备抗抑郁的药物(马世平等，罗勒烯在制备抗抑郁药物中的应用:中国，CN103976984A[P].2018-08-13.)；2017-2022年中国罗勒烯行业市场需求与投资咨询报告指出罗勒烯具有巨大的市场需求。

罗勒烯属于单萜化合物(monoterpene)，在植物中，通过胞浆的甲羟戊酸途径(mevalonic acid(MVA)pathway)和质体的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐(MEP)途径生成萜类的通用底物异戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其异构体二甲基丙烯焦磷酸酯(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)。再由此生成单萜(monoterpenes)、倍半萜(sesquiterpenes)、二萜(diterpenes)、三萜(triterpenes)的底物香叶基焦磷酸(Geranyldiphosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGPP)。单萜合酶(monoterpene synthase)能够催化GPP形成各种单萜片段，被认为是合成萜类次生代谢终产物的关键酶(Chen F,Tholl D,Bohlmann J等，The family of terpene synthases in plants:a mid-size family ofgenes for specialized metabolism that is highly diversified throughout thekingdom[J].The Plant Journal,2011,66(1):212-229；Trapp SC,Croteau R.Genomicorganization of plant terpene synthases and molecular evolutionaryimplications[J].Genetics,2001,158:811-832)。

因此，有必要研究具有单萜类化合物罗勒烯合成能力的关键酶基因。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单萜类化合物罗勒烯合成的关键酶及其编码基因，以及其在合成罗勒烯中的应用。

为解决上述问题，本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一种罗勒烯合酶CcOS，所述罗勒烯合酶CcOS的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2由596个氨基酸残基组成。

本发明的罗勒烯合酶CcOS，来源于樟树(Cinnamomum camphora(L.)presl)，命名为樟树罗勒烯合酶CcOS。

进一步地，本发明包括由序列SEQ ID No.2所示的氨基酸的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。

进一步地，本发明还包含具有在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的衍生序列且具有该序列的蛋白质具有罗勒烯合酶活性。例如，所述氨基酸序列组成的蛋白的保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该蛋白的片段或蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。优选地，所述蛋白的保守性变体、生物活性片段或衍生物的氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有95％以上的同一性，例如96％、97％、98％、99％或100％。

在另一个方面，本发明提供了所述罗勒烯合酶CcOS的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述核苷酸可包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。例如，与所述核苷酸序列在严格的条件下杂交的核苷酸。利用本发明的基因编码的蛋白质序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核苷酸序列。所述严格的条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

在另一个方面，本发明还提供了一种重组载体，包含所述罗勒烯合酶CcOS的编码基因。所述载体可以为质粒载体或病毒载体。

在另一个方面，本发明提供了一种重组细胞或转基因植物细胞系，包含所述的重组载体或表达所述罗勒烯合酶CcOS。

在一个实施方案中，所述重组细胞可以为酵母、细菌或真菌。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞、寄主菌均属于本发明的保护范围。

在另一个方面，本发明还提供了所述罗勒烯合酶CcOS、所述罗勒烯合酶CcOS的编码基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备罗勒烯中的应用。

在另一个方面，本发明提供了一种生产罗勒烯合酶CcOS的方法，包括将所述罗勒烯合酶CcOS的编码基因导入到受体微生物中，得到表达所述罗勒烯合酶CcOS的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到罗勒烯合酶CcOS。

在一个实施方案中，可采用氯化钙法或电穿孔转化法将含有所述编码基因的表达载体导入受体微生物中。

在一个实施方案中，所述受体微生物为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)。

在一个具体的实施方案中，所述CcOS的编码基因可通过重组质粒pET32a::CcOS导入到大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)中；所述重组质粒pET32a::CcOS是用序列SEQ IDNo.1所示的Ccos基因构建至pET32a(+)载体的BamHI酶切位点处，且保持pET32a(+)载体其他序列不变得到的重组表达载体。

一种生产罗勒烯的方法，包括以下步骤：将所述的罗勒烯合酶CcOS的编码基因导入酿酒酵母得到重组酿酒酵母，发酵重组酿酒酵母，得到罗勒烯。

进一步地，上述方法中，所述酿酒酵母优选BY4741酵母菌株。

在一个实施方案中，所述发酵包括将所述重组酿酒酵母接种至发酵培养基，在30℃下培养48-96h；优选60-72h。优选地，所述培养为振荡培养。

进一步地，上述方法中，CcOS的编码基因可通过重组质粒pESC-Leu::CcOS导入到GPP-producing酵母菌中；所述重组质粒pESC-Leu::CcOS是用序列SEQ ID No.1所示的Ccos基因构建至pESC-Leu载体的BamHI酶切位点处，且保持pESC-Leu载体其他序列不变得到的重组表达载体。

在另一个方面，本发明提供了一种利用所述罗勒烯合酶CcOS合成罗勒烯的方法，包括以下步骤：以香叶基焦磷酸作为底物，在中性条件下，利用所述罗勒烯合酶CcOS催化合成罗勒烯。

进一步地，利用所述罗勒烯合酶CcOS催化合成罗勒烯的过程中，加入包含HEPES(浓度20-25mM)、MgCl₂(浓度5-8mM)、DTT(浓度5-8mM)的酶促缓冲液。

有益效果：

本发明克隆得到罗勒烯合酶基因Ccos，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性的罗勒烯合酶CcOS。利用本发明可以通过基因工程技术来提高植物中罗勒烯物质的含量。

本发明的罗勒烯合酶可以催化香叶基焦磷酸合成罗勒烯，催化活性较高。本发明还提供了一种合成罗勒烯的方法，每升发酵液能得到10.0mg罗勒烯，为罗勒烯的生物合成奠定基础，具有广阔的产业应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明樟树Ccos基因克隆琼脂糖凝胶电泳图；M表示Trans2K DNA Marker(核酸分子量标准，条带由上往下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)，Ccos表示Ccos基因；

图2为CcOS结构功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；

图3为CcOS系统进化树；

图4为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在大肠杆菌中表达的CcOS蛋白，其中M为PageRuler非预染宽范围蛋白分子量标准(条带由上往下分别为250、150、100、70、50KDa)，1为空载体pET32a表达的蛋白，2为重组质粒pET32a::CcOS表达的蛋白，箭头表示目的蛋白(重组蛋白CcOS)；

图5为GC-MS鉴定CcOS酶促反应产物；其中，A中a为对照菌上清的目标化合物的提取离子流图，b为pET32a::CcOS重组菌上清的目标化合物的提取离子流图，c为标准品罗勒烯的提取离子流图；B为pET32a::CcOS重组菌上清的目标化合物的质谱图；C为标准品罗勒烯的质谱图；

图6为CcOS导入酵母菌株(GPP-producing)发酵生产罗勒烯的GC-MS分析；图中，a为空载体pESC-Leu导入酵母菌株(GPP-producing)发酵产物的提取离子流图，b为CcOS导入酵母菌株(GPP-producing)发酵生产罗勒烯的提取离子流图，c为标准品罗勒烯的提取离子流图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的

High-Fidelity DNA Polymerase、BamHI限制性内切酶是New England Biolabs公司的产品；快速通用植物RNA提取试剂盒是北京华越洋生物科技有限公司的产品；

TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、Trans2KDNA Marker、pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)是北京全式金生物技术有限公司的产品；

HEPES，MgCl₂，DTT是Sigma-Aldrich公司的产品；

PageRuler非预染宽范围蛋白分子量标准是Thermo Fisher Scientific公司的产品；

pET32a(+)载体是Novagen公司的产品；

pESC-Leu载体是Agilent公司的产品；

SD-Ura、SD-Ura-Leu是北京泛基诺科技有限公司的产品；

ZYMO RESEARCH Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒Zymo Research公司的产品；

BY4741酵母菌株(基因型：MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)是北京华越洋生物科技有限公司的产品；

香叶基焦磷酸(GPP)是Sigma公司的产品，产品目录号为G6772，CAS号为763-10-0；

罗勒烯(Ocimene)是Sigma公司的产品，产品目录号为W353901，CAS号为13877-91-3。

实施例1、樟树Ccos基因全长cDNA序列克隆

1、樟树叶片总RNA的提取

参照北京华越洋生物科技有限公司快速通用植物RNA提取试剂盒说明书要求进行操作，提取樟树叶片的总RNA。

2、第一链cDNA的合成

参照北京全式金生物技术有限公司第一链cDNA合成试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书，配制如下反转录反应体系，依次完成反转录步骤，最终获得第一链cDNA。

反转录反应体系如下：

反转录的步骤如下：

(1)为获得更高的合成效率，依次吸取Total RNA、Anchored Oligo(dT)18Primer、RNase-free Water于PCR管中，轻轻混匀，稍离心，置于PCR仪中65℃反应5min；

(2)反应结束后，将上述PCR管置于冰上，依次加入10.0μL 2×TS Reaction Mix、1.0μL

RT/RI Enzyme Mix、1.0μL gDNA Remover，轻轻混匀，稍离心；

(3)置于PCR仪中，以“42℃30min，85℃5s”条件进行反转录反应，获得第一链cDNA；

(4)第一链cDNA于-20℃保存。

3、Primer 5.0设计引物

深入挖掘樟树叶片转录组数据，从中提取到樟树Ccos基因开放阅读框(ORF)序列，并基于该序列设计克隆引物CcOS-F1和CcOS-R1，引物序列如下：

CcOS-F1：5’-ATGGCTCTTTCTACAGTATCCACATTCC-3’(SEQ ID No.3)；

CcOS-R1：5’-TTATTTGACAATCAGTGGAATGGGTC-3’(SEQ ID No.4)。

4、PCR扩增

以步骤2获得的第一链cDNA为模板，采用高保真酶

High-Fidelity DNAPolymerase、CcOS-F1和CcOS-R1引物进行PCR扩增反应，切胶纯化回收得到PCR扩增产物，结果如图1所示，并对PCR扩增产物进行测序分析。

其中，PCR扩增的程序如下：

98℃预变性3min；98℃20s，55℃20s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。

测序结果表明：PCR扩增产物的序列与序列1(SEQ ID No.1)所示一致，将序列1所示的基因命名为Ccos，编码由596个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为CcOS，该蛋白的氨基酸序列为序列2(SEQ ID No.2)。

Ccos序列(SEQ ID No.1)：

ATGGCTCTTTCTACAGTATCCACATTCCCATGTTTGAAACACCCTTCCTTCTTCTTGAACGTATTTCATTCCTCTACCAAGAATTTCCTATCGGCTACAAAAGTAGTCAGGCCCGTCAACTGCATTCCAAACTCTGTAATCTATGAGCCTGAGGTTTCGAGAAGAAAAGCCAATTACAAGCCTAATATTTGGGACCATGATCTCCTACAGTCACTACGAAGTGATTACCAAGACGAAGCATATGTCAAACGAGCTGAGAAGCTGAAGGAAGAGATAAATTGCTTGCTCCAAGAAGCTGTGAACTCATTGGCTCAACTGGAGATGATTGATGCCATCGAACGTTTGGGGTTGGGCCATATCTTTGATAAGAAGATCAAGGAAGTCCTCAACACCATGTGGGTTAGTCACAACAACAATGAGAACAAAGGAGGAACAGAGAACAAAGATCTCTATGCCACTTCTCTCCTCTTTAGGCTCCTCAGAAAACATGGGTATTCTGTGTCACAAGATGTTTTCAATAAGTTCATGGACGAGAAAGGCGGTCTCAACGCAAGAGTCTGTGAAGACATCAAGGGAATCCTCAGCTTATATGAGGCTTCTCACTTTGCTCACCAAGGAGAGACTCTTTTGAGTGAATGCAGAACTTTCACATGGATGTACCTTAAAGCTTTCAAAGGGAGTGGGGACATTATACTTGCAAACAAAGTAGAACATGCCCTGGAACTTCCCATGCATTGGAGGATAGGAAGAATGGAAGCATTGTGGCATCTAAACATGTATGAGAGTGTAGAGCACATGAACCCCACTTTGCTTGAACTGGCAAAGCTTGATTTCAATATGGTGCAGGCCACACACCAAAGAGATCTTAGGAAGGCATCAAGATGGTGGAGGAGTATCGGACTTGGAGGAAAGCTGAGCTTCTCGAGAGACAGAATGATGGAATGCTTCTTTGTGGCTTTGGGGGTGATGTCTGAGCCACAATTTGGTTATCCGAGGGTAGAGCTTGCTAAAGTTTGTCAGTTGATCACAACCATAGATGATATTTACGATGTCTTTGGATCGTTGGATGAATTAGAGTGCTTCACTGATGCTGTTGACAGATGGGACATTAAATCAATAGATCTGCTCCCTGAGTACATGAAGATATGTTTCCTTGCTCTGTACAATACTACCAACGAAATGGGATATGAGATCTTAAAAGATCAGGGCATCAACATCATTCCATACCTACAGAAAGGGTGGACAGATTTCTGTAAAGCAATGTTAGTGGAGTCCAAGTGGTACTACAGTGGGTACAAACCAAGTCTAGAAGAGTATCTAAACAATGGATGGGTATCATCATCAGGACCTGTCATTCTGGTCCATGCATTTCTCCTTTCAAAGCAACCAATATCAACACAAGTGTTGGATGGTTTGGACAAAAACCCAGGTCTTATTAGATGGCCGTCAATGATTTTTCGACTATGCAATGATTTGGCAACATATAAGGACGAGAAAGTCAGAGGTGATGCACCATCTTCTATTGATTGTTATATGAAGGAAGCCAATGTTTCCGAAATGGATGCTCGCAATCATGTCGAAGACCTCATTTTTAATAGTTGGAAGAAGTTGAATGAAGAAGTGAGAACTGTATCTCCATACCCTCCTCATTTCATCAACTGTGCCTTGAATCTTGCAAGAGTAGTCCACTGCATTTACCAGCATGGTGATGGCCATACTGTTCAAGATCGCAACACGAAAGATCGACTCACATCGTTGCTGGTTCGACCCATTCCACTGATTGTCAAATAA。

CcOS序列(SEQ ID No.2)：

MALSTVSTFPCLKHPSFFLNVFHSSTKNFLSATKVVRPVNCIPNSVIYEPEVSRRKANYKPNIWDHDLLQSLRSDYQDEAYVKRAEKLKEEINCLLQEAVNSLAQLEMIDAIERLGLGHIFDKKIKEVLNTMWVSHNNNENKGGTENKDLYATSLLFRLLRKHGYSVSQDVFNKFMDEKGGLNARVCEDIKGILSLYEASHFAHQGETLLSECRTFTWMYLKAFKGSGDIILANKVEHALELPMHWRIGRMEALWHLNMYESVEHMNPTLLELAKLDFNMVQATHQRDLRKASRWWRSIGLGGKLSFSRDRMMECFFVALGVMSEPQFGYPRVELAKVCQLITTIDDIYDVFGSLDELECFTDAVDRWDIKSIDLLPEYMKICFLALYNTTNEMGYEILKDQGINIIPYLQKGWTDFCKAMLVESKWYYSGYKPSLEEYLNNGWVSSSGPVILVHAFLLSKQPISTQVLDGLDKNPGLIRWPSMIFRLCNDLATYKDEKVRGDAPSSIDCYMKEANVSEMDARNHVEDLIFNSWKKLNEEVRTVSPYPPHFINCALNLARVVHCIYQHGDGHTVQDRNTKDRLTSLLVRPIPLIVK。

实施例2、樟树Ccos基因生物信息学分析

本发明涉及的樟树Ccos基因全长cDNA由1791个核苷酸组成，详细序列如序列1(SEQ ID No.1)所示，编码序列2(SEQ ID No.2)所示的蛋白质。将樟树Ccos基因序列用NCBI数据库中的BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，该基因在氨基酸水平上与其他物种中的单萜合酶有较高的同源性，同时具有典型的Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily结构域，如图2和图3；其中图2为CcOS结构功能域预测分析(来源于NCBI数据库)，图3为CcOS系统进化树(邻接法)。

实施例3、樟树CcOS蛋白的生物表达及其功能分析

一、樟树CcOS蛋白的生物表达

1、原核表达载体的构建

参照北京全式金生物技术有限公司pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit试剂盒说明书要求进行操作，将序列1所示的Ccos基因构建至pET32a(+)载体(Novagen公司)的BamHI酶切位点处，且保持pET32a(+)载体其他序列不变，得到重组质粒pET32a::CcOS。

具体步骤如下：

1)以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，利用引物CcOS-F2和CcOS-R2进行PCR扩增反应，切胶回收获得纯化PCR产物。其中，所述引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

CcOS-F2(SEQ ID No.5)：

5’-CCATGGCTGATATCGGAATGGCTCTTTCTACAGTATCCACATTCC-3’；

CcOS-R2(SEQ ID No.6)：

5’-ACGGAGCTCGAATTCGGTTATTTGACAATCAGTGGAATGGGTC-3’。

2)取pET32a(+)载体(Novagen公司)，用限制性内切酶BamHI进行酶切，切胶纯化回收线性化的载体片段。

3)取步骤1)得到的纯化PCR产物，按北京全式金生物技术有限公司pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit说明书操作，将其克隆至步骤2)的线性化的载体片段，得到重组质粒pET32a::CcOS。

2、重组菌的获得

将重组质粒pET32a::CcOS转化至大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到pET32a::CcOS重组菌；同时用不含目的基因的pET32a(+)空载体转化大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)作为对照菌。

3、重组蛋白CcOS的获得

分别挑取pET32a::CcOS重组菌和对照菌单克隆菌落，分别接种于新鲜的LB液体培养基(含氨苄青霉素100mg/L)中，于37℃摇床中振荡培养过夜。次日按1：100比例进行稀释，接种到200mL LB液体培养基(含氨苄青霉素100mg/L)中，37℃摇床中振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时转入18℃摇床中振摇1小时，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续于18℃摇床培养24小时诱导目标蛋白表达。待诱导完成后，将菌液用8000g离心5min，弃上清，收集pET32a::CcOS重组菌和对照菌菌体，并保存在-80℃冰箱备用。

提取pET32a::CcOS重组菌和对照菌菌体中的蛋白，具体步骤如下：用事先预冷的5mL HEPES缓冲液(25mM HEPES，5mM MgCl₂，5mM DTT，pH 7.0)重悬pET32a::CcOS重组菌和对照菌菌体；置冰浴中超声破菌(30％功率，超声5s，间隔5s，持续10min)，待超声破碎后，12000g，4℃离心30min，分别得到pET32a::CcOS重组菌上清和对照菌上清，即为蛋白溶液。

将pET32a::CcOS重组菌上清和对照菌上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果如图4所示。从图中黑色箭头所示，pET32a::CcOS重组菌上清具有重组质粒pET32a::CcOS表达的重组蛋白CcOS，所述重组蛋白CcOS大小约为86kDa，大小与预期相符；对照菌上清无相应蛋白。

二、重组蛋白CcOS酶促活性检测

1、酶促活性

取pET32a::CcOS重组菌上清进行酶促反应，通过正己烷萃取，获得酶促反应产物。其中，酶促反应具体步骤如下：

酶促反应总体系为0.2mL，取pET32a::CcOS重组菌上清190μL，即HEPES缓冲液(25mM HEPES，5mM MgCl₂，5mM DTT，pH 7.0)重悬菌体并超声破碎后所得蛋白溶液，加入底物香叶基焦磷酸(GPP)10μL，混匀，稍离心，并缓慢加入200μL正己烷，覆盖在酶促反应总体系上形成液封，在30℃培养箱中静置反应2小时后，涡旋震荡，12000g，离心5min，取上清正己烷层，得到pET32a::CcOS重组菌上清酶促反应产物。

2、GC-MS检测

利用气质联用GC-MS对上述酶促反应产物进行检测：GC-MS分析系统为ThermoTRACE 1310/TSQ 8000gas chromatograph，进样量1μL，splitless模式，气相色谱柱为Thermo Scientific TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，氦气流速1.0mL/min，进样口温度220℃，离子源温度200℃，升温程序为50℃保持2min，程序升温5℃·min^-1到150℃，并保持2min，30℃·min^-1到300℃，电子能量70eV，对样品进行50-500m/z范围扫描。

将上述反应中的pET32a::CcOS重组菌上清190μL替换为对照菌上清190μL，重复上述试验，获得对照菌上清的目标化合物。

GC-MS分析结果如图5所示：对照菌上清的目标化合物中没有检测到罗勒烯(ocimene)，pET32a::CcOS重组菌上清酶促反应产物中检测到了罗勒烯(ocimene)，说明CcOS重组蛋白能够催化GPP形成罗勒烯(ocimene)，表明重组蛋白CcOS为罗勒烯合酶。

实施例4、樟树CcOS导入酵母菌株发酵生产罗勒烯

1、真核表达载体的构建

参照北京全式金生物技术有限公司pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit说明书要求进行操作，将序列1的Ccos基因构建至pESC-Leu载体(Agilent公司)的BamHI酶切位点处，且保持pESC-Leu载体其他序列不变，得到重组质粒pESC-Leu::CcOS。

具体步骤如下：

1)以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，利用引物CcOS-F3和CcOS-R3进行PCR扩增反应，切胶回收获得纯化PCR产物。其中，所述引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

CcOS-F3(SEQ ID No.7)：

5’-GGAGAAAAAACCCCGATGGCTCTTTCTACAGTATCCACATTCC-3’；

CcOS-R3(SEQ ID No.8)：

5’-GTGAGTCGTATTACGGTTATTTGACAATCAGTGGAATGGGTC-3’。

2)取pESC-Leu载体(Agilent公司)，用限制性内切酶BamHI进行酶切，切胶纯化回收线性化的载体片段。

3)取步骤1)得到的纯化PCR产物，参照北京全式金生物技术有限公司pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit说明书操作，将其构建至步骤2)所获得的线性化的载体片段上，得到重组质粒pESC-Leu::CcOS。

2、GPP-producing酵母菌株构建

YPD固体平板：1％酵母膏+2％蛋白胨+2％葡萄糖+1.5％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(YPD液体培养基)；YPL诱导培养基：1％酵母膏+2％蛋白胨+2％半乳糖；SD-Ura固体平板：SD-Ura+2％葡萄糖+2％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(SD-Ura液体培养基)；SD-Ura-Leu固体平板：SD-Ura-Leu+2％葡萄糖+2％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(SD-Ura-Leu液体培养基)。

BY4741酵母菌株(基因型：MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)涂布YPD固体平板，30℃培养箱中倒置培养48-72小时，得到新鲜活化的BY4741酵母菌菌落。按等摩尔比例将Ura3 marker、酵母来源的tHMGR1(含启动子序列P_TDH3和终止子序列T_TPI1，即P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1)、酵母来源IDI1(含启动子序列PADH1和终止子序列TPGI，即P_ADH1-IDI1-T_PGI)、酵母来源的tHMGR1(含启动子序列P_PGK1和终止子序列T_ADH1，即P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1)、酵母来源的ERG20^F96W-N127W(含启动子序列P_TEF2和终止子序列T_CYC1，即P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC1)混合，电转化整合到BY4741酵母菌株第15号染色体YPRC△15位点(chromosome XVI long_terminal_repeat and Autonomously Replicating Sequence，YPRC△15)。

1)挑取新鲜活化的BY4741酵母单菌落于5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜，至OD₆₀₀＝0.6-1.0；

2)取浸泡在乙醇中的电转杯(内径0.2cm)，超纯水清洗，倒立放置于吸水滤纸上晾干，置于超净台中灭菌30min；

3)在超净台无菌环境中，吸取1-2mL菌液置于无菌1.5mL EP管中，10000g，常温离心1min，弃上清；

4)加入预冷的无菌水1mL，重悬菌体，10000g，常温离心1min，弃上清；

5)重复步骤4)一次，加入预冷的缓冲液1mL(10mM LiAc，10mM DTT，0.6Msorbitol，10mM pH7.5 Tris-HCl)，于25℃水浴中培养20min；

6)10000g，常温离心1min，弃上清；

7)加入预冷的1mL sorbitol(1M)溶液重悬菌体，10000g，常温离心1min，弃上清；

8)重复步骤7)一次，加入预冷的100μL sorbitol(1M)溶液重悬菌体，制成电转感受态细胞；

9)将Ura3 marker、P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1、P_ADH1-IDI1-T_PGI、P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1、P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC15个DNA片段等摩尔比混合，总质量500ng(总体积不超过感受态细胞体积的1/10)，加入到上述感受态细胞中，轻轻混匀，稍离心并转移至电转杯(0.2cm)，冰浴2-5min；2.7kV、25μF、200Ω(Bio-Rad，Hercules，CA)条件下电转，电击后于超净工作台中加入1mL sorbitol(1M)溶液重悬电转液，并转移至无菌1.5mL EP管中，30℃培养箱中培养1-2h，期间上下翻转EP管混匀，2-3次；

10)10000g，常温离心1min，弃上清，余100μL溶液重悬菌体，滴在缺陷型SD-Ura固体平板中央，用涂布器涂布均匀，直至涂布的全部菌液吸收完全，置于30℃恒温箱中倒立培养2-3d，所得菌株命名为GPP-producing酵母菌株。

3、GPP-producing酵母感受态制备

GPP-producing酵母菌(基因型：MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0，YPRCΔ15Ura3-P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1-P_ADH1-IDI1-T_PGI-P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1-P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC1)。

采用ZYMO RESEARCH Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒制备酵母感受态细胞：

(1)从SD-Ura固体平板上挑取新活化的GPP-producing酵母菌单菌落，接种于10mLSD-Ura液体培养基中，30℃摇床中振荡培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0左右；

(2)室温，500g离心4min，去上清；

(3)加入10mL Frozen-EZ Solution 1重悬菌体，室温，500g离心4min，去上清；

(4)加入1mL Frozen-EZ Solution 2重悬菌体，得到GPP-producing酵母感受态细胞，分装至无菌的1.5mL EP管中，每管50μL；

(5)缓慢降温保存至-70℃冰箱(4℃，1h；-20℃，1h；-40℃，1h；-70℃保存)，禁止用液氮速冻感受态细胞，使其活性降低。

4、重组质粒pESC-Leu::CcOS转化至GPP-producing酵母感受态细胞

(1)取一支50μL GPP-producing酵母感受态细胞，冰上解冻，吸取0.2-1μg重组质粒pESC-Leu::CcOS(少于5μL)加入到酵母感受态细胞，轻轻混匀；

(2)加入500μL Frozen-EZ Solution 3，剧烈混匀；

(3)30℃培养箱中孵育1-2h，期间上下翻转EP管混匀，2-3次；

(4)取50-150μL孵育的菌液，涂布SD-Ura-Leu固体平板上，晾干后，置于30℃倒置培养48-96h，得到转入重组酵母pESC-Leu::CcOS的重组酵母，将其命名为GPP-producing/pESC-Leu::CcOS。

5、发酵

(1)在超净台无菌环境中，挑取步骤4中SD-Ura-Leu固体平板上长出来的GPP-producing/pESC-Leu::CcOS的单菌落，置于10mL SD-Ura-Leu液体培养基中，30℃200rpm振荡培养48h；

(2)室温5000g 5min离心收集菌体，加入2mL YPL诱导培养基重悬菌体，并转接至20mL YPL诱导培养基，30℃200rpm诱导培养72h。

6、发酵产物提取

目标成分为单萜类化合物，脂溶性，易溶于乙酸乙酯，因此选取乙酸乙酯为溶剂萃取目标单萜类化合物。萃取步骤如下：

(1)收集发酵完成菌液，加入等体积的乙酸乙酯；

(2)超声破菌1h，期间多次振荡混摇；

(3)室温5000g 5min，小心吸取上层有机相，加入适量的无水硫酸钠(120℃烘干30min)，边加边摇，除去萃取液的水分；

(4)旋转蒸发仪上浓缩至近干；

(5)吸取浓缩液，过0.22μm PTFE针头滤器，过滤液储存于液相小瓶中，封口膜密闭，保存于4℃冰箱。

7、发酵产物GC-MS检测

利用气质联用GC-MS对目标化合物进行检测：GC-MS分析系统为ThermoTRACE1310/TSQ 8000gas chromatograph，进样量1μL，splitless模式，气相色谱柱为Thermo Scientific TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，氦气流速1.0mL/min，进样口温度220℃，离子源温度200℃，升温程序为50℃保持2min，程序升温5℃·min^-1到150℃，并保持2min，30℃·min^-1到300℃，电子能量70eV，对样品进行50-500m/z范围扫描。

GC-MS检测结果如图6所示：含pESC-Leu::CcOS重组质粒的酵母菌株GPP-producing/pESC-Leu::CcOS能够合成罗勒烯(ocimene)。每升发酵液能得到10.0mg罗勒烯。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳天雄生物科技有限公司

<120> 一种罗勒烯合酶CcOS及其编码基因与应用

<130> PA21004853

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1791

<212> DNA

<213> Ccos序列

<400> 1

atggctcttt ctacagtatc cacattccca tgtttgaaac acccttcctt cttcttgaac 60

gtatttcatt cctctaccaa gaatttccta tcggctacaa aagtagtcag gcccgtcaac 120

tgcattccaa actctgtaat ctatgagcct gaggtttcga gaagaaaagc caattacaag 180

cctaatattt gggaccatga tctcctacag tcactacgaa gtgattacca agacgaagca 240

tatgtcaaac gagctgagaa gctgaaggaa gagataaatt gcttgctcca agaagctgtg 300

aactcattgg ctcaactgga gatgattgat gccatcgaac gtttggggtt gggccatatc 360

tttgataaga agatcaagga agtcctcaac accatgtggg ttagtcacaa caacaatgag 420

aacaaaggag gaacagagaa caaagatctc tatgccactt ctctcctctt taggctcctc 480

agaaaacatg ggtattctgt gtcacaagat gttttcaata agttcatgga cgagaaaggc 540

ggtctcaacg caagagtctg tgaagacatc aagggaatcc tcagcttata tgaggcttct 600

cactttgctc accaaggaga gactcttttg agtgaatgca gaactttcac atggatgtac 660

cttaaagctt tcaaagggag tggggacatt atacttgcaa acaaagtaga acatgccctg 720

gaacttccca tgcattggag gataggaaga atggaagcat tgtggcatct aaacatgtat 780

gagagtgtag agcacatgaa ccccactttg cttgaactgg caaagcttga tttcaatatg 840

gtgcaggcca cacaccaaag agatcttagg aaggcatcaa gatggtggag gagtatcgga 900

cttggaggaa agctgagctt ctcgagagac agaatgatgg aatgcttctt tgtggctttg 960

ggggtgatgt ctgagccaca atttggttat ccgagggtag agcttgctaa agtttgtcag 1020

ttgatcacaa ccatagatga tatttacgat gtctttggat cgttggatga attagagtgc 1080

ttcactgatg ctgttgacag atgggacatt aaatcaatag atctgctccc tgagtacatg 1140

aagatatgtt tccttgctct gtacaatact accaacgaaa tgggatatga gatcttaaaa 1200

gatcagggca tcaacatcat tccataccta cagaaagggt ggacagattt ctgtaaagca 1260

atgttagtgg agtccaagtg gtactacagt gggtacaaac caagtctaga agagtatcta 1320

aacaatggat gggtatcatc atcaggacct gtcattctgg tccatgcatt tctcctttca 1380

aagcaaccaa tatcaacaca agtgttggat ggtttggaca aaaacccagg tcttattaga 1440

tggccgtcaa tgatttttcg actatgcaat gatttggcaa catataagga cgagaaagtc 1500

agaggtgatg caccatcttc tattgattgt tatatgaagg aagccaatgt ttccgaaatg 1560

gatgctcgca atcatgtcga agacctcatt tttaatagtt ggaagaagtt gaatgaagaa 1620

gtgagaactg tatctccata ccctcctcat ttcatcaact gtgccttgaa tcttgcaaga 1680

gtagtccact gcatttacca gcatggtgat ggccatactg ttcaagatcg caacacgaaa 1740

gatcgactca catcgttgct ggttcgaccc attccactga ttgtcaaata a 1791

<210> 2

<211> 596

<212> PRT

<213> CcOS序列

<400> 2

Met Ala Leu Ser Thr Val Ser Thr Phe Pro Cys Leu Lys His Pro Ser

1 5 10 15

Phe Phe Leu Asn Val Phe His Ser Ser Thr Lys Asn Phe Leu Ser Ala

20 25 30

Thr Lys Val Val Arg Pro Val Asn Cys Ile Pro Asn Ser Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Pro Glu Val Ser Arg Arg Lys Ala Asn Tyr Lys Pro Asn Ile Trp

50 55 60

Asp His Asp Leu Leu Gln Ser Leu Arg Ser Asp Tyr Gln Asp Glu Ala

65 70 75 80

Tyr Val Lys Arg Ala Glu Lys Leu Lys Glu Glu Ile Asn Cys Leu Leu

85 90 95

Gln Glu Ala Val Asn Ser Leu Ala Gln Leu Glu Met Ile Asp Ala Ile

100 105 110

Glu Arg Leu Gly Leu Gly His Ile Phe Asp Lys Lys Ile Lys Glu Val

115 120 125

Leu Asn Thr Met Trp Val Ser His Asn Asn Asn Glu Asn Lys Gly Gly

130 135 140

Thr Glu Asn Lys Asp Leu Tyr Ala Thr Ser Leu Leu Phe Arg Leu Leu

145 150 155 160

Arg Lys His Gly Tyr Ser Val Ser Gln Asp Val Phe Asn Lys Phe Met

165 170 175

Asp Glu Lys Gly Gly Leu Asn Ala Arg Val Cys Glu Asp Ile Lys Gly

180 185 190

Ile Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser His Phe Ala His Gln Gly Glu Thr

195 200 205

Leu Leu Ser Glu Cys Arg Thr Phe Thr Trp Met Tyr Leu Lys Ala Phe

210 215 220

Lys Gly Ser Gly Asp Ile Ile Leu Ala Asn Lys Val Glu His Ala Leu

225 230 235 240

Glu Leu Pro Met His Trp Arg Ile Gly Arg Met Glu Ala Leu Trp His

245 250 255

Leu Asn Met Tyr Glu Ser Val Glu His Met Asn Pro Thr Leu Leu Glu

260 265 270

Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Met Val Gln Ala Thr His Gln Arg Asp

275 280 285

Leu Arg Lys Ala Ser Arg Trp Trp Arg Ser Ile Gly Leu Gly Gly Lys

290 295 300

Leu Ser Phe Ser Arg Asp Arg Met Met Glu Cys Phe Phe Val Ala Leu

305 310 315 320

Gly Val Met Ser Glu Pro Gln Phe Gly Tyr Pro Arg Val Glu Leu Ala

325 330 335

Lys Val Cys Gln Leu Ile Thr Thr Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Phe

340 345 350

Gly Ser Leu Asp Glu Leu Glu Cys Phe Thr Asp Ala Val Asp Arg Trp

355 360 365

Asp Ile Lys Ser Ile Asp Leu Leu Pro Glu Tyr Met Lys Ile Cys Phe

370 375 380

Leu Ala Leu Tyr Asn Thr Thr Asn Glu Met Gly Tyr Glu Ile Leu Lys

385 390 395 400

Asp Gln Gly Ile Asn Ile Ile Pro Tyr Leu Gln Lys Gly Trp Thr Asp

405 410 415

Phe Cys Lys Ala Met Leu Val Glu Ser Lys Trp Tyr Tyr Ser Gly Tyr

420 425 430

Lys Pro Ser Leu Glu Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Trp Val Ser Ser Ser

435 440 445

Gly Pro Val Ile Leu Val His Ala Phe Leu Leu Ser Lys Gln Pro Ile

450 455 460

Ser Thr Gln Val Leu Asp Gly Leu Asp Lys Asn Pro Gly Leu Ile Arg

465 470 475 480

Trp Pro Ser Met Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Thr Tyr Lys

485 490 495

Asp Glu Lys Val Arg Gly Asp Ala Pro Ser Ser Ile Asp Cys Tyr Met

500 505 510

Lys Glu Ala Asn Val Ser Glu Met Asp Ala Arg Asn His Val Glu Asp

515 520 525

Leu Ile Phe Asn Ser Trp Lys Lys Leu Asn Glu Glu Val Arg Thr Val

530 535 540

Ser Pro Tyr Pro Pro His Phe Ile Asn Cys Ala Leu Asn Leu Ala Arg

545 550 555 560

Val Val His Cys Ile Tyr Gln His Gly Asp Gly His Thr Val Gln Asp

565 570 575

Arg Asn Thr Lys Asp Arg Leu Thr Ser Leu Leu Val Arg Pro Ile Pro

580 585 590

Leu Ile Val Lys

595

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggctcttt ctacagtatc cacattcc 28

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttatttgaca atcagtggaa tgggtc 26

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccatggctga tatcggaatg gctctttcta cagtatccac attcc 45

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acggagctcg aattcggtta tttgacaatc agtggaatgg gtc 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagaaaaaa ccccgatggc tctttctaca gtatccacat tcc 43

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtgagtcgta ttacggttat ttgacaatca gtggaatggg tc 42

Claims

1.一种罗勒烯合酶CcOS，其特征在于，所述罗勒烯合酶CcOS的氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。

2.权利要求1所述的罗勒烯合酶CcOS的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的罗勒烯合酶CcOS的编码基因。

4.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体或表达权利要求1所述的罗勒烯合酶CcOS。

5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌。

6.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌表达菌株Transetta DE3。

7.权利要求1所述的罗勒烯合酶CcOS、权利要求2所述罗勒烯合酶CcOS的编码基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4-6任一项所述的重组细胞在制备罗勒烯中的应用。

8.一种生产罗勒烯合酶CcOS的方法，其特征在于，包括将权利要求2所述的罗勒烯合酶CcOS的编码基因导入到受体微生物中，得到表达权利要求1所述罗勒烯合酶CcOS的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到罗勒烯合酶CcOS。

9.一种生产罗勒烯的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2所述的罗勒烯合酶CcOS的编码基因导入酿酒酵母得到重组酿酒酵母，发酵重组酿酒酵母，得到罗勒烯。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵包括将所述重组酿酒酵母接种至发酵培养基，在30℃下培养48-96 h。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵包括将所述重组酿酒酵母接种至发酵培养基，在30℃下培养60-72 h。

12.一种利用如权利要求1所述的罗勒烯合酶CcOS合成罗勒烯的方法，其特征在于，包括以下步骤：以香叶基焦磷酸作为底物，利用所述罗勒烯合酶CcOS催化合成罗勒烯。