CN112409492B

CN112409492B - 龙脑樟单萜合酶CcTPS1及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN112409492B
Application number: CN201910776208.5A
Authority: CN
Inventors: 黄璐琦; 苏平; 马蕊; 崔光红; 高伟
Original assignee: Sichuan Honghe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Honghe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2039-08-21
Also published as: CN112409492A

Abstract

本发明公开了一种龙脑樟单萜合酶CcTPS1及其相关生物材料与应用。本发明首先公开了如下任一所示蛋白质：A1)由序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2)序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；A3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。本发明进一步公开了上述蛋白质相关生物材料及其应用。本发明首次从龙脑樟中得到单萜类成分合成关键酶基因，并证明其蛋白CcTPS1能够催化GPP形成右旋龙脑，对于调节和生产植物单萜类化合物及培育高品质的龙脑樟树具有重要的理论及实际意义。

Description

龙脑樟单萜合酶CcTPS1及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明属于药用植物基因工程领域，具体涉及龙脑樟单萜合酶CcTPS1及其相关生物材料与应用。

背景技术

樟树(Cinnamomum camphora(L.)presl)为樟科樟属常绿乔木树种，国家II级保护植物，是一种集材用、药用、香精香料、油用、风景园林等多用途的经济植物，具有巨大的开发利用价值。樟树有至少5个化学类型，即龙脑型、樟脑型、1.8-桉叶油型、芳樟醇型、异橙花叔醇型等(Caihui C，Yongjie Z，Yongda Z，et al.Transcriptome analysis andidentification of genes related to terpenoid biosynthesis in Cinnamomumcamphora[J].BMC Genomics，2018，19(1)：550.)。其中龙脑型-龙脑樟(Cinnamomumcamphora chvar.Bomeol)富含天然冰片(天然右旋龙脑，(+)-borneol)，是提取天然冰片的理想原料。

天然冰片(右旋龙脑，(+)-borneol)是一味重要的中药，具有开窍醒神、退热止痛的作用，临床上用于治疗烧烫伤，眼疾，中风等疾病，同时具有抑菌，抗氧化，止痛消炎，退热，保护心脑血管等作用(Wang S，Zhang D，Hu J，et al.A clinical and mechanisticstudy of topical borneol-induced analgesia[J].EMBO Molecular Medicine，2017，9(6)：802-815；Tang S，Wang A，Yan X，et al.Brain-targeted intranasal delivery ofdopamine with borneol and lactoferrin co-modified nanoparticles for treatingParkinson′s disease[J].Drug Deliv，2019，26(1)：700-707；Yu B，Zhong FM，Yao Y，etal.Synergistic protection of tetramethylpyrazine phosphate and borneol onbrain microvascular endothelium cells injured by hypoxia[J].Am J TranslRes.2019，11(4)：2168-2180.)，也广泛用于烟草、日化、食品、农药等领域(Shi S，Wu Q，SuJ，et al.Composition analysis of volatile oils from flowers，leaves andbranches of Cinnamomum camphora chvar.Borneol in China[J].Journal ofEssential Oil Research，2013，25(5)：7.)。由于天然龙脑价格高，许多药厂利用合成冰片替代天然龙脑，但合成冰片是由松节油通过化学方法制备，制品中含有异龙脑，随着人们安全意识的提升，市场对天然冰片(右旋龙脑)的需求不断增加。由于樟树传统的繁殖是采用种子育苗法，但种子繁殖最大的缺陷是后代个体变异性大，母株的诸多优良性状，如龙脑樟高含龙脑的性能在后代中很难稳定延续，导致龙脑樟植株数量不稳定(陈美兰，华永丽，黄璐琦，等.龙脑樟有性繁殖后代叶油分析[J].中国中医药信息杂志，2010，17(8).37-40.)。另外，樟树植物生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。

天然冰片(右旋龙脑，(+)-borneol)是双环单萜化合物，属于萜类成分。同时萜类成分为龙脑樟的主要活性成分，包括右旋龙脑((+)-borneol)、樟脑(camphor)和芳樟醇(linalool)等。通过胞浆的甲羟戊酸途径(mevalonic acid(MVA)pathway)和质体的2-methyl-D-erythritol-4-phosphate(MEP)途径生成萜类的通用底物异戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其异构体Dimethylallyl pyrophosphate(DMAPP)。再由此生成单萜(monoterpenes)、倍半萜(sesquiterpenes)、二萜(diterpenes)、三萜(triterpenes)的底物香叶基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyldiphosphate，GGPP)。单萜合酶(monoterpene synthase)，又称单萜环化酶(monoterpenecyclase)能够催化GPP形成各种单萜骨架，被认为是合成萜类次生代谢终产物的关键酶(Chen F，Tholl D，Bohlmann J，et al.The family of terpene synthases in plants：amid-size family of genes for specialized metabolism that is highlydiversified throughout the kingdom[J].The Plant journal：for cell andmolecular biology，2011，66(1)：212-229；Trapp SC，Croteau R.Genomic organizationof plant terpene synthases and molecular evolutionary implications[J].Genetics，2001，158：811-832)。

目前，尚未发现从龙脑樟树可以得到具有单萜类化合物合成能力的关键酶基因的相关研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为得到新的参与单萜化合物合成的龙脑樟单萜合酶，以合成或制备右旋龙脑。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为CcTPS1，来源于龙脑樟树(Cinnamomum camphora chvar.Borneol)，命名为龙脑樟单萜合酶CcTPS1，为如下A1)-A3)任一所示：

A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

A3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。

其中，序列2由611个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

与CcTPS1的相关生物材料也在本发明的保护范围之内。

本发明提供的与CcTPS1的相关生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码CcTPS1的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下B1)或B2)或B3)所示：

B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的DNA分子杂交，且编码CcTPS1的DNA分子。

其中，序列表中的序列1由1836个核苷酸组成，编码序列2所示的蛋白质。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

其中，所述核酸分子可以为DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA，所述核酸分子也可以为RNA，如mRNA或hnRNA。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码CcTPS1的核酸分子的表达盒(Cctps1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CcTPS1的DNA，该DNA不但可包括启动Cctps1转录的启动子，还可包括终止Cctps1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明进一步提供了上述蛋白质或其相关生物材料的应用。

所述应用具体如下所示：

1)上述蛋白质作为单萜合酶的应用；

2)上述相关生物材料在制备单萜合酶中的应用；

3)上述蛋白质或相关生物材料在制备或合成单萜化合物的应用；

4)上述蛋白质或相关生物材料在催化香叶基焦磷酸形成右旋龙脑的应用。

上述应用中，所述单萜化合物为右旋龙脑。

本发明还提供了制备CcTPS1的方法。

本发明制备CcTPS1的方法，包括将CcTPS1的编码基因导入到受体微生物中，得到表达CcTPS1的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到CcTPS1。

上述方法中，所述受体微生物为原核微生物。具体的，所述原核微生物为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)。

上述方法中，所述CcTPS1的编码基因可通过重组质粒pET32a：：CcTPS1导入到大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)中；所述重组质粒pET32a：：CcTPS1是用序列1所示的Cctps1基因构建至pET32a(+)载体的BamHI酶切位点处，且保持pET32a(+)载体其他序列不变得到的重组表达载体。

本发明进一步提供了一种制备右旋龙脑的方法。

本发明制备右旋龙脑的方法，包括用CcTPS1催化香叶基焦磷酸(GPP)的步骤。

上述方法中，在催化过程中还需要加入酶促缓冲液，所述酶促缓冲液由HEPES、MgCl₂、DTT组成；

所述HEPES在所述酶促缓冲液中的浓度为25mM；

所述MgCl₂在所述酶促缓冲液中的浓度为5mM；

所述DTT在所述酶促缓冲液中的浓度为5mM；

所述酶促缓冲液中的pH值为7.0。

上述方法中，所述方法还包括在用CcTPS1催化香叶基焦磷酸(GPP)后，将得到的酶促反应产物进一步进行脱磷酸化反应，得到右旋龙脑。

本发明进一步还提供了一种右旋龙脑的生物合成方法。

本发明右旋龙脑的生物合成方法，包括将CcTPS1的编码基因导入酿酒酵母得到重组酿酒酵母，发酵重组酿酒酵母，得到右旋龙脑。

上述方法中，所述酿酒酵母具体为BY-Mono酵母菌。

上述方法中，CcTPS1的编码基因可通过重组质粒pESC-Leu：：CcTPS1导入到BY-Mono酵母菌中；所述重组质粒pESC-Leu：：CcTPS1是用序列1所示的Cctps1基因构建至pESC-Leu载体的BamHI酶切位点处，且保持pESC-Leu载体其他序列不变得到的重组表达载体。

本发明从龙脑樟cDNA中克隆得到Cctps1基因，该基因是首次从龙脑樟树中得到的单萜类成分合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明的CcTPS1蛋白能够催化GPP形成右旋龙脑((+)-borneol)，对龙脑樟中的右旋龙脑等单萜类化合物的生物合成具有重要作用，为利用基因工程技术提高龙脑樟中活性成分右旋龙脑含量或直接生产右旋龙脑提供重要基础，进一步对于调节和生产植物单萜类化合物及培育高品质的龙脑樟树具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为龙脑樟Cctps1基因克隆琼脂糖凝胶电泳图；M表示Trans2K DNA Marker(核酸分子量标准，条带由上往下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)，Cctps1表示Cctps1基因。

图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在大肠杆菌中表达的CcTPS1蛋白。M为Premixed Protein Marker(Low)(蛋白分子量标准，条带由上往下分别为97.2、66.4、44.3、29.0KDa)，1为对照菌上清的电泳结果，2为重组质粒pET32a：：CcTPS1重组菌上清的电泳结果，CcTPS1箭头表示重组质粒pET32a：：CcTPS1表达的目的蛋白(即重组蛋白CcTPS1)。

图3为CcTPS1酶促反应产物GC-MS分析。其中，A中a为标准品(-)-borneol和标准品(+)-borneol的提取离子流图，b为对照菌上清的目标化合物的提取离子流图，c为pET32a：：CcTPS1重组菌上清的目标化合物的提取离子流图；B为标准品(+)-bomeol的质谱图；C为pET32a：：CcTPS1重组菌上清的目标化合物的质谱图。

图4为CcTPS1导入酵母菌株(BY-Mono)发酵生产(+)-borneol的GC-MS分析；图中，a为标准品(+)-borneol的提取离子流图，b为重组酵母BY-Mono/pESC-Leu发酵产物萃取后得到的目标化合物的提取离子流图，c为重组酵母BY-Mono/pESC-Leu：：CcTPS发酵产物萃取后得到的目标化合物的提取离子流图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的

High-Fidelity DNA Polymerase、BamHI限制性内切酶是New England Biolabs公司的产品；

快速通用植物RNA提取试剂盒是北京华越洋生物科技有限公司的产品；

TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、Trans2KDNA Marker、pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)是北京全式金生物技术有限公司的产品；

Premixed Protein Marker(Low)是Takara公司的产品；

pET32a(+)载体是Novagen公司的产品；

pESC-Leu载体是Agilent公司的产品；

SD-Ura、SD-Ura-Leu是北京泛基诺科技有限公司的产品；

ZYMO RESEARCH Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒Zymo Research公司的产品；

BY4741酵母菌株(基因型：MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)是北京华越洋生物科技有限公司的产品；

香叶基焦磷酸(GPP)是Sigma公司的产品，产品目录号为G6772，CAS号为763-10-0；

右旋龙脑((+)-borneol)是Sigma公司的产品，产品目录号为CRM40901，CAS号为464-43-7。

实施例1、龙脑樟Cctps1基因全长cDNA序列克隆

1、总RNA的提取

根据北京华越洋生物科技有限公司快速通用植物RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取龙脑樟树叶片的总RNA。

2、第一链cDNA的合成

根据北京全式金生物技术有限公司第一链cDNA合成试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书进行操作，最终反转录获得cDNA。

其中，反转录反应体系如下：

反转录的步骤如下：

(1)为获得更高的合成效率，取Total RNA、Anchored Oligo(dT)₁₈Primer、RNase-free Water于PCR管中，混匀，65℃，5min；

(2)在上述PCR管中加入10.0μL2×TS Reaction Mix、1.0μL

RT/RIEnzyme Mix、1.0μL gDNA Remover，轻轻混匀；

(3)以“42℃30min，85℃5s”条件进行反转录反应，获得第一链cDNA；

(4)第一链cDNA于-20℃保存。

3、引物的设计

根据龙脑樟叶片转录组数据，获得开放阅读框(ORF)序列，并基于此设计克隆引物CcTPS1-F1和CcTPS1-R1，引物序列如下：

CcTPS1-F1：5’-ATGTCTCTCAACCTCGTGTCGCCATC-3’；

CcTPS1-R1：5’-TCAAATGACGCTTCCCATATTGATTCCA-3’。

4、PCR扩增

以步骤2获得的第一链cDNA为模板，采用高保真酶

High-Fidelity DNAPolymerase、CcTPS1-F1和CcTPS1-R1引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，结果如图1所示，并对PCR扩增产物进行测序。

其中，PCR扩增的程序如下：

98℃预变性3min；98℃20s，55℃20s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。

测序结果表明：PCR扩增产物的序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为Cctps1，编码由611个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为CcTPS1，该蛋白的氨基酸序列为序列2。

实施例2、龙脑樟CcTPS1蛋白的获得及其功能分析

一、龙脑樟CcTPS1蛋白的获得

1、重组载体的构建

采用北京全式金生物技术有限公司pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit，将序列1所示的Cctps1基因构建至pET32a(+)载体(Novagen公司)的BamHI酶切位点处，且保持pET32a(+)载体其他序列不变，得到重组质粒pET32a：：CcTPS1。

具体步骤如下：

1)以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，利用引物CcTPS1-F2和CcTPS1-R2进行PCR扩增，回收并进行纯化获得纯化PCR产物。其中，所述引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

CcTPS1-F2：5’-CCATGGCTGATATCGGAATGTCTCTCAACCTCGTGTCGCCA-3’；

CcTPS1-R2：5’-ACGGAGCTCGAATTCGGTCAAATGACGCTTCCCATATTGAT-3’。

2)取pET32a(+)载体(Novagen公司)，用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收线性化的载体骨架。

3)取步骤1)得到的纯化PCR产物，按北京全式金生物技术有限公司pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit说明书操作，将其克隆至步骤2)的线性化的载体骨架，得到重组质粒pET32a：：CcTPS1。

2、重组菌的获得

将重组质粒pET32a：：CcTPS1转化至大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到pET32a：：CcTPS1重组菌；同时用不含目的基因的pET32a(+)载体转化大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)作为对照菌。

3、重组蛋白CcTPS1的获得

挑取pET32a：：CcTPS1重组菌和对照菌分别接种于2mL的LB液体培养基(含氨苄青霉素100mg/L)中，于37℃振荡培养过夜。次日按1∶100稀释加入到200mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时转入18℃振摇1小时，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续于18℃摇床培养24小时诱导目标蛋白表达。将菌液用8000g离心5min，弃上清，收集pET32a：：CcTPS1重组菌和对照菌菌体，保存在-80℃冰箱备用。

4、重组蛋白CcTPS1的纯化

提取pET32a：：CcTPS1重组菌和对照菌菌体中的蛋白。

具体步骤如下：将pET32a：：CcTPS1重组菌和对照菌菌体用预冷的5mL HEPES缓冲液(25mM HEPES，5M MgCl₂，5M DTT，pH 7.0)重悬；置冰浴中超声破菌(30％功率，超声5s，间隔5s，持续5min，重复1次)，12000g，4℃离心30min，分别得到pET32a：：CcTPS1重组菌上清和对照菌上清，即为蛋白溶液。

将pET32a：：CcTPS1重组菌上清和对照菌上清进行SDS-PAGE，结果如图2所示。从图中可以看出，pET32a：：CcTPS1重组菌上清具有重组质粒pET32a：：CcTPS1表达的重组蛋白CcTPS1，所述重组蛋白CcTPS1大小约为88kDa，大小与预期相符。对照菌上清无相应蛋白。

二、重组蛋白CcTPS1酶促活性分析

1、酶促活性

取pET32a：：CcTPS1重组菌上清进行酶促反应，获得酶促反应产物。其中，酶促反应具体步骤如下：

酶促反应总体系为0.2mL，取pET32a：：CcTPS1重组菌上清190μL(所述pET32a：：CcTPS1重组菌上清包含酶促缓冲液，即HEPES缓冲液(25mM HEPES，5M MgCl₂，5M DTT，pH7.0))，加入底物香叶基焦磷酸(GPP)10μL，混匀，并将酶促反应总体系用200μL正己烷覆盖液封，在30℃放置2小时后，用氮气将水相中的正己烷彻底吹干(以免影响下一步的脱磷酸化反应)，得到pET32a：：CcTPS1重组菌上清酶促反应产物。

2、脱磷酸化反应

配置脱磷酸化反应体系，充分混合(枪头吹打)，在37℃下脱磷酸化反应4h，获得脱磷酸化后的产物。

其中，所述脱磷酸化反应体系如下：

脱磷酸化后的产物用正己烷抽提3次，每次加入0.2mL，将抽提所得有机相汇合在一起；用氮气将提取液吹干，并加入100μL正己烷溶解，得到目标化合物(即pET32a：：CcTPS1重组菌上清的目标化合物)，用于GC-MS分析。

3、GC-MS分析

利用气质联用GC-MS对pET32a：：CcTPS1重组菌上清的目标化合物进行检测：GC-MS分析系统为Thermo TRACE 1310/TSQ 8000gas chromatograph，进样量1μL，splitless模式，气相色谱柱为Agilent J&W Cyclodex-B手性柱(30m×0.25mm×0.25μm)，氦气流速1.0mL/min，进样口温度220℃，离子源温度200℃，升温程序为50℃保持2min，程序升温3℃·min^-1到150℃，并保持5min，10℃·min^-1到220℃，电子能量70eV，对样品进行50-500m/z范围扫描。

将上述反应中的pET32a：：CcTPS1重组菌上清190μL替换为对照菌上清190uL，重复上述试验，获得对照菌上清的目标化合物。

GC-MS分析结果如图3所示：对照菌上清的目标化合物中没有检测到右旋龙脑((+)-borneol)，pET32a：：CcTPS1重组菌上清的目标化合物中检测到了右旋龙脑((+)-borneol)，说明CcTPS1重组蛋白能够催化GPP形成右旋龙脑((+)-borneol)，表明重组蛋白CcTPS1为单萜合酶。

实施例3、龙脑樟CcTPS1导入酵母菌株发酵生产(+)-borneol

1、真核表达载体的构建

采用北京全式金生物技术有限公司pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit，将序列1的Cctps1基因构建至pESC-Leu载体(Agilent公司)的BamHI酶切位点处，且保持pESC-Leu载体其他序列不变，得到重组质粒pESC-Leu：：CcTPS1。

具体步骤如下：

1)以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，利用引物CcTPS1-F3和CcTPS1-R3进行PCR扩增，回收并进行纯化获得纯化PCR产物。其中，所述引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

引物序列如下(下划线所示序列为载体同源区)：

CcTPS1-F3：5’-CCATGGCTGATATCGGAATGTCTCTCAACCTCGTGTCGCCA-3’；

CcTPS1-R3：5’-ACGGAGCTCGAATTCGGTCAAATGACGCTTCCCATATTGAT-3’。

2)取pESC-Leu载体(Agilent公司)，用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收线性化的载体骨架。

3)取步骤1)得到的纯化PCR产物，按北京全式金生物技术有限公司pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit说明书操作，将其克隆至步骤2)的线性化的载体骨架，得到重组质粒pESC-Leu：：CcTPS1。

2、BY-Mono酵母菌株构建

YPD固体平板：1％酵母膏+2％蛋白胨+2％葡萄糖+1.5％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(YPD液体培养基)；

YPL诱导培养基：1％酵母膏+2％蛋白胨+2％半乳糖；

SD-Ura固体平板：SD-Ura+2％葡萄糖+2％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(SD-Ura液体培养基)；

SD-Ura-Leu固体平板：SD-Ura-Leu+2％葡萄糖+2％琼脂；不加琼脂则成为相应液体培养基(SD-Ura-Leu液体培养基)。

BY4741酵母菌株(基因型：MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)涂布YPD固体平板，30℃倒置培养48-72h，得到新活化的BY4741酵母菌菌落。将Ura3 marker、酵母来源的tHMGR1(含启动子序列P_TDH3和终止子序列T_TPI1，即P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1)、酵母来源IDI1(含启动子序列P_ADH1和终止子序列T_PGI，即P_ADH1-IDI1-T_PGI)、酵母来源的tHMGR1(含启动子序列P_PGK1和终止子序列T_ADH1，即P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1)、酵母来源的ERG20^F96W-N127W(含启动子序列P_TEF2和终止子序列T_CYC1，即P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC1)整合到BY4741酵母菌株YPRCΔ15位点(chromosome XVI long_terminal_repeat and Autonomously Replicating Sequence，YPRCΔ15)，具体步骤如下：

1)挑取新活化的BY4741酵母菌单菌落于5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜，至OD600＝0.6-1.0；

2)取浸泡在乙醇中的电转杯(0.2cm)，超纯水清洗并晾干，倒立放在吸水滤纸上，置于超净台中灭菌；

3)取1-2mL菌液于无菌1.5mL EP管中，10000g，常温离心1min，弃上清；

4)加入预冷的无菌水1mL重悬，10000g，常温离心1min；

5)重复步骤4)，弃上清，加入预冷的缓冲液(10mM LiAc，10mM DTT，0.6Msorbitol，10mM pH7.5Tris-HCl)，25℃培养20min；

6)10000g，常温离心1min，弃上清；

7)加入预冷的1mL sorbitol(1M)溶液重悬，10000g，常温离心1min；

8)重复步骤7)，弃上清，加入预冷的100μL sorbitol(1M)溶液重悬，制成BY4741酵母感受态细胞；

9)将Ura3 marker、P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1、P_ADH1-IDI1-T_PGI、P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1、P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC15个DNA片段等摩尔比混合，总质量500ng(总体积不超过感受态细胞体积的1/10)，加入到上述BY4741酵母感受态细胞中，混匀并转移至电转杯(0.2cm)，冰浴2-5min；2.7kV、25μF、200Ω(Bio-Rad，Hercules，CA)条件下电转，电击后于超净工作台中加入1mL sorbitol(1M)溶液，并转移至无菌1.5mL EP管中，30℃培养1-2h，期间上下混匀2-3次；

10)10000g，常温离心1min，弃上清，余100μL溶液重悬菌体，滴在缺陷型SD-Ura固体平板中央，用涂布器涂布均匀，直至涂布的全部菌液吸收完全，置于30℃恒温箱中倒立培养2-3d，所得菌株命名为BY-Mono酵母菌株，所述BY-Mono酵母菌株的基因型：MATa his3Δ1leu2Δ0 met15Δ0 ura3A0，YPRCΔ15Ura3-P_TDH3-tHMGR1-T_TPI1-P_ADH1-IDI1-T_PGI-P_PGK1-tHMGR1-T_ADH1-P_TEF2-ERG20^F96W-N127W-T_CYC1。

3、BY-Mono酵母感受态制备

采用ZYMO RESEARCH Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒做酵母感受态细胞：

(1)从SD-Ura固体平板上挑取新活化的BY-Mono酵母菌单菌落，接种于10mL SD-Ura液体培养基中，30℃下振荡培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0左右；

(2)室温，500g离心4min，去上清；

(3)加入10mL Frozen-EZ Solution 1悬浮菌体，室温，500g离心4min，去上清；

(4)加入1mL Frozen-EZ Solution 2悬浮菌体，得到BY-Mono酵母感受态细胞，分装至灭菌的1.5mL EP管中，每管50uL；

(5)缓慢降温至-70℃(4℃，1h；-20℃，1h；-40℃，1h；-70℃保存)，禁止用液氮速冻感受态细胞。

4、重组质粒pESC-Leu：：CcTPS1转化至BY-Mono酵母感受态细胞

(1)取0.2-1μg重组质粒pESC-Leu：：CcTPS1(少于5μL)与50μLBY-Mono酵母感受态细胞混合；

(2)加入500μL Frozen-EZ Solution 3，剧烈混匀；

(3)30℃孵育1-2h，期间在此混匀2-3次；

(4)取50-150μL孵育的菌液，涂布SD-Ura-Leu固体平板上，晾干后，置于30℃倒置培养48-96h，得到转入重组质粒pESC-Leu：：CcTPS1的重组酵母，将其命名为BY-Mono/pESC-Leu：：CcTPS1。

同时以上述同样的方法将不含目的基因(即Cctps1基因)的pESC-Leu载体转化BY-Mono酵母感受态细胞作为对照，得到转入pESC-Leu载体的重组酵母，将其命名为BY-Mono/pESC-Leu。

5、发酵

(1)挑取步骤4中SD-Ura-Leu固体平板上长出来的BY-Mono/DESC-Leu：：CcTPS1的单菌落，置于10mL SD-Ura-Leu液体培养基中，30℃200rpm48h；

(2)室温5000g5min离心收集菌体，转接入20mL YPL诱导培养基，30℃200rpm诱导培养72h，得到发酵产物

6、发酵产物萃取

目标成分为萜类化合物，脂溶性，易溶于乙酸乙酯，因此选取乙酸乙酯为溶剂萃取发酵产物，得到目标化合物。其中，所述萃取步骤如下：

(1)收集发酵完成菌液，即发酵产物，加入等体积的乙酸乙酯；

(2)超声破菌1h，期间多次振荡混摇；

(3)室温5000g 5min取上层有机相，加入适量的无水硫酸钠(120℃烘干30min)，边加边摇，除去萃取液的水分；

(4)旋转蒸发仪上浓缩至近干，

(5)吸取浓缩液，过0.22μm PTFE针头滤器，过滤液储存于液相小瓶中，封口膜密闭，保存于4℃冰箱。

7、发酵产物GC-MS检测

利用气质联用GC-MS对目标化合物进行检测：GC-MS分析系统为ThermoTRACE1310/TSQ 8000gas chromatograph，进样量1μL，splitless模式，气相色谱柱为Thermo Scientific TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，氦气流速1.0mL/min，进样口温度220℃，离子源温度200℃，升温程序为50℃保持2min，程序升温5℃·min^-1到150℃，并保持2min，30℃·min^-1到300℃，电子能量70eV，对样品进行50-500m/z范围扫描。

将将上述步骤5发酵中“挑取步骤4中SD-Ura-Leu固体平板上长出来的BY-Mono/pESC-Leu：：CcTPS1单菌落”替换为“挑取步骤4中SD-Ura-Leu固体平板上长出来的BY-Mono/pESC-Leu单菌落”重复上述试验步骤5、步骤6和步骤7。

GC-MS分析结果如图4所示：含pESC-Leu：：CcTPS1重组质粒的重组酵母BY-Mono/pESC-Leu：：CcTPS1发酵产物萃取得到的目标化合物为右旋龙脑，即含pESC-Leu：：CcTPS1重组质粒的重组酵母BY-Mono/pESC-Leu：：CcTPS1能够合成右旋龙脑((+)-borneol)，经统计每升发酵液能得到1.0毫克右旋龙脑。含pESC-Leu载体的重组酵母BY-Mono/pESC-Leu发酵产物萃取得到的目标化合物中未检测到右旋龙脑((+)-borneol)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 龙脑樟单萜合酶CcTPS1及其相关生物材料与应用

<130> GNCFY191756

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1836

<212> DNA

<213> 龙脑樟树（Cinnamomum camphora chvar. Borneol)

<400> 1

atgtctctca acctcgtgtc gccatccttc ccttgctctc ttgttcgctt gttctccctg 60

gtgagcgacc acgcaccaag tttatcttac ctcaagattg aacatgtacc cctaaatcca 120

aaagcccgga gcaagaggaa tgcagctcca ccaagaaaat gtgcccttag ggcgtcaacc 180

ttggagacgg atgttgctcg gcgttcggca aattacagcc caaccgtttg ggattttgat 240

tttatacagt cactgacgag tgcctacaag gatggggcat acacccgacg ggttgaggaa 300

ctgaagaatt atgttcggag tttgcttcta gattctagtg cgccacttgc tagggtagag 360

ttgatcaacc atctccaacg tcttggggta gggtatcttt ttggcgagga gatcaagaca 420

gtgttagata ccatcgggaa aggcaaagac tttggcatgg agaaagatct gaacaccacg 480

gcactccaat ttcggatcct tagacaaaat ggttactatg catctaaaga ggtgttcaat 540

agcttcattg atgagatggg tagtttcaaa gcttgcttat gtgaagacac aaaaggacta 600

ctgagcttat acgaagcttc atacctagca tttcctggag aaactataat ggatgaggcc 660

aaggcctttg caagaagaca tctcaagaat ctaaagggcg agatagaccc taggcttgaa 720

gaacaagtgg ctcatgcctt ggagcttccc acacattata ggatgttaag gttagaagca 780

aggtggtaca tagacatgta tgagaaagaa gagagcatgg attctcttat acttgaactg 840

gctaagttgg attacaacat attgcaggcc tcatatcaga aggatgttca aaatgggtat 900

aggtggtgga ggcaactggg attgactgag aagctgccat ttactcggga ccgctggttg 960

gagtgttatt tattctctct ttcaatcaca tttgagcctc agtatggata tggtcgggaa 1020

gttcttaaca aagtcaatca gatgatcaca accattgatg atatctatga cgtctacggt 1080

actgtagaag agcttgagct ctttacagat gcagttgcta gatgggatac cagtgtcatc 1140

caacaacttc cagagtacat gaagacgtgt tttctagccc tactcaactt tggtaatgat 1200

ctagcttacg acactttaaa agaacaaggt tatgacatta taccatacct gagaaaattg 1260

tgggcagatc tatgtaaagc atacttagtg gaggcaaggt ggtaccacaa tggctatgcc 1320

ccaacacttg aggagtattt acgtaatgca tggatctcaa tatctggtcc cgttgtgctg 1380

gttcatggtt atttttctat gagacttaaa ataaccaagg aagtcttaca aggcattgag 1440

aattatgcag atctcatacg tttctcatct atgatcctcc gactttgcga tgatatggga 1500

acttcaacgc atgagcttga gagaggtgat gtcttgaagt ccattcaatg ctacatgcat 1560

gaagccaatg tctctgaagc aattgctcga gaacacataa gaagtctggc tgatgaaaca 1620

tggaagaaga tgaacaaaga atatgttact ggttgcctgt tccctcgaca tttcgcagat 1680

gcagctatag ggcttatacg aagagcagaa agtgtgtacc acaagggtga tggattcggt 1740

gctccaggct ctgagattga tggtcaagtt acgtcattgg tggtagagcc aatagtaatt 1800

aataacaatg gaatcaatat gggaagcgtc atttga 1836

<210> 2

<211> 611

<212> PRT

<213> 龙脑樟树 (Cinnamomum camphora chvar. Borneol)

<400> 2

Met Ser Leu Asn Leu Val Ser Pro Ser Phe Pro Cys Ser Leu Val Arg

1 5 10 15

Leu Phe Ser Leu Val Ser Asp His Ala Pro Ser Leu Ser Tyr Leu Lys

20 25 30

Ile Glu His Val Pro Leu Asn Pro Lys Ala Arg Ser Lys Arg Asn Ala

35 40 45

Ala Pro Pro Arg Lys Cys Ala Leu Arg Ala Ser Thr Leu Glu Thr Asp

50 55 60

Val Ala Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Ser Pro Thr Val Trp Asp Phe Asp

65 70 75 80

Phe Ile Gln Ser Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Asp Gly Ala Tyr Thr Arg

85 90 95

Arg Val Glu Glu Leu Lys Asn Tyr Val Arg Ser Leu Leu Leu Asp Ser

100 105 110

Ser Ala Pro Leu Ala Arg Val Glu Leu Ile Asn His Leu Gln Arg Leu

115 120 125

Gly Val Gly Tyr Leu Phe Gly Glu Glu Ile Lys Thr Val Leu Asp Thr

130 135 140

Ile Gly Lys Gly Lys Asp Phe Gly Met Glu Lys Asp Leu Asn Thr Thr

145 150 155 160

Ala Leu Gln Phe Arg Ile Leu Arg Gln Asn Gly Tyr Tyr Ala Ser Lys

165 170 175

Glu Val Phe Asn Ser Phe Ile Asp Glu Met Gly Ser Phe Lys Ala Cys

180 185 190

Leu Cys Glu Asp Thr Lys Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Tyr

195 200 205

Leu Ala Phe Pro Gly Glu Thr Ile Met Asp Glu Ala Lys Ala Phe Ala

210 215 220

Arg Arg His Leu Lys Asn Leu Lys Gly Glu Ile Asp Pro Arg Leu Glu

225 230 235 240

Glu Gln Val Ala His Ala Leu Glu Leu Pro Thr His Tyr Arg Met Leu

245 250 255

Arg Leu Glu Ala Arg Trp Tyr Ile Asp Met Tyr Glu Lys Glu Glu Ser

260 265 270

Met Asp Ser Leu Ile Leu Glu Leu Ala Lys Leu Asp Tyr Asn Ile Leu

275 280 285

Gln Ala Ser Tyr Gln Lys Asp Val Gln Asn Gly Tyr Arg Trp Trp Arg

290 295 300

Gln Leu Gly Leu Thr Glu Lys Leu Pro Phe Thr Arg Asp Arg Trp Leu

305 310 315 320

Glu Cys Tyr Leu Phe Ser Leu Ser Ile Thr Phe Glu Pro Gln Tyr Gly

325 330 335

Tyr Gly Arg Glu Val Leu Asn Lys Val Asn Gln Met Ile Thr Thr Ile

340 345 350

Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Val Glu Glu Leu Glu Leu Phe

355 360 365

Thr Asp Ala Val Ala Arg Trp Asp Thr Ser Val Ile Gln Gln Leu Pro

370 375 380

Glu Tyr Met Lys Thr Cys Phe Leu Ala Leu Leu Asn Phe Gly Asn Asp

385 390 395 400

Leu Ala Tyr Asp Thr Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Ile Ile Pro Tyr

405 410 415

Leu Arg Lys Leu Trp Ala Asp Leu Cys Lys Ala Tyr Leu Val Glu Ala

420 425 430

Arg Trp Tyr His Asn Gly Tyr Ala Pro Thr Leu Glu Glu Tyr Leu Arg

435 440 445

Asn Ala Trp Ile Ser Ile Ser Gly Pro Val Val Leu Val His Gly Tyr

450 455 460

Phe Ser Met Arg Leu Lys Ile Thr Lys Glu Val Leu Gln Gly Ile Glu

465 470 475 480

Asn Tyr Ala Asp Leu Ile Arg Phe Ser Ser Met Ile Leu Arg Leu Cys

485 490 495

Asp Asp Met Gly Thr Ser Thr His Glu Leu Glu Arg Gly Asp Val Leu

500 505 510

Lys Ser Ile Gln Cys Tyr Met His Glu Ala Asn Val Ser Glu Ala Ile

515 520 525

Ala Arg Glu His Ile Arg Ser Leu Ala Asp Glu Thr Trp Lys Lys Met

530 535 540

Asn Lys Glu Tyr Val Thr Gly Cys Leu Phe Pro Arg His Phe Ala Asp

545 550 555 560

Ala Ala Ile Gly Leu Ile Arg Arg Ala Glu Ser Val Tyr His Lys Gly

565 570 575

Asp Gly Phe Gly Ala Pro Gly Ser Glu Ile Asp Gly Gln Val Thr Ser

580 585 590

Leu Val Val Glu Pro Ile Val Ile Asn Asn Asn Gly Ile Asn Met Gly

595 600 605

Ser Val Ile

610

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为如下任一所示：

A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。

2.与权利要求1所述的蛋白质的相关生物材料，其特征在于，所述相关生物材料为如下任一所示：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A9)-A12)所述的转基因植物细胞系为非繁殖材料。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于，A1)所述核酸分子为如下任一所示：

B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的相关生物材料在制备或合成单萜化合物的应用，所述单萜化合物为右旋龙脑。

5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的相关生物材料在催化香叶基焦磷酸形成右旋龙脑的应用。

6.制备权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入到受体微生物中，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1所述的蛋白质。

7.一种制备右旋龙脑的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求1所述的蛋白质催化香叶基焦磷酸的步骤。

8.一种右旋龙脑的生物合成方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入酿酒酵母得到重组酿酒酵母，发酵重组酿酒酵母，得到右旋龙脑。